CN111154879A

CN111154879A - 用于膀胱癌诊断或复发监控的生物标志物及试剂盒

Info

Publication number: CN111154879A
Application number: CN202010150403.XA
Authority: CN
Inventors: 秦宏亮; 陈亚庆; 李鸿艳; 秦伟伟; 刘翔; 陈苏红; 孔关义; 赵立波
Original assignee: Beijing Echo Biotech Co ltd
Current assignee: Beijing Echo Biotech Co ltd
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明提供一种用于检测膀胱癌生物标志物的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于检测膀胱癌生物标志物的引物和探针，所述膀胱癌生物标志物为选自基因CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13中的至少一种。进一步地，所述检测试剂盒还包括用于检测内参基因的引物和探针，所述内参基因选自SLC25A6、ACTB或GAPDH。本发明还提供一种包括所述检测试剂盒的用于诊断膀胱癌的诊断试剂盒。本发明的诊断试剂盒能够准确地确诊个体是否患有膀胱癌以及是否有复发的可能，具有较高的灵敏性，而且实现了非侵入性膀胱癌辅助诊断和复发监控的功能。

Description

用于膀胱癌诊断或复发监控的生物标志物及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地，涉及用于膀胱癌诊断及复发监控的生物标志物和试剂盒，更具体地，涉及用于检测膀胱癌生物标志物的检测试剂盒以及用于诊断膀胱癌的诊断试剂盒。

背景技术

膀胱癌(Bladder Cancer，BC)是指发生在膀胱粘膜上的恶性肿瘤，是我国泌尿生殖系统肿瘤中最常见的肿瘤，近些年来随着空气污染和个人饮食，吸烟等生活习惯的改变，其发病呈现逐年递增及年轻化趋势。膀胱癌按疾病的浸润深度可以分为肌层浸润性膀胱癌(MIBC)和肌层非浸润性膀胱癌(NMIBC)，MIBC具有更高的疾病进展风险而NMIBC则更容易复发。

膀胱镜检查和细胞学检查仍然是目前膀胱癌诊断的主要技术，但前者是有创检查而且费用高，而后者的敏感性低。经尿道膀胱肿瘤切除术(TUR-BT)可同时做到膀胱癌的诊断和治疗，并且可明确病理分期，是治疗膀胱癌的首选术式，但患者TUR-BT术后复发率极高，有10-70％的患者会在1年内复发，术后5年内有24-84％的病人复发，其中部分病例伴有肿瘤恶性程度增加或浸润能力增强，严重影响患者的生存期。因此如何降低膀胱癌患者术后复发风险、延长其生存期，一直是临床关注的重点。

目前医院预防复发的手段，普遍采取术后随访检查，其手段包括B超，膀胱内窥镜和脱落细胞检查。B超易受膀胱其他疾病如膀胱息肉、膀胱粘膜下出血等的影响，并且容易漏检大小在5mm以下的肿瘤或平铺在黏膜表面不向腔内突出的病例；而膀胱内窥镜为侵入性检查，同时对操作者技术依赖较高，且价格较贵；尿脱落细胞形态学检查检出率较低，且对早期Ta、T1期膀胱癌检出率为0。因此，需要发展一种新的无创、有效且可用于膀胱癌诊断及复发监测的诊断试剂盒及诊断方法，以便于早期发现是否患有膀胱癌，且在患者膀胱癌发现后就能对患者膀胱癌复发的可能性提供早期判断，从而对膀胱癌复发风险高的患者和低风险患者提供针对性的手术和化疗，并分别对不同患者进行不同密度的跟踪随访。这将大大提高膀胱癌高复发患者人群的治疗效果，减少其复发的可能性，延长其术后生存时间；对膀胱癌低复发患者人群，在提高其治疗效果的同时，将减少某些不必的治疗步骤，减少其术后随访的密度，大大降低其经济上的负担。

无创尿液检查替代膀胱镜诊断膀胱癌、监测复发及判断预后，一直是研究的热点。除尿细胞学外，目前通过尿液检查诊断和检测膀胱癌复发主要有尿核基质蛋白22、膀胱癌肿瘤抗原、免疫-细胞检查等方法，但敏感性和特异性均不理想。目前Pacific Egde公司推出的CxBladder Monitor，利用qRT-PCR技术来测定5个mRNA(IGFBP5,HOXA13,MDK,CDK1,CXCR2)的表达量，灵敏度达93％，NPV 97％。Cepheid公司推出的Xpert Bladder cancertest利用qRT-PCR检测五个基因CRH,IGF2,UPK1B,ANXA10和ABL1的表达水平，灵敏度77％，NPV为93％。因此，可以通过检测脱落细胞中特定RNA的表达水平来获得一种无创尿液膀胱癌诊断和复发监控的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供用于膀胱癌诊断及复发监控的生物标志物和试剂盒，具体地，本发明提供用于检测膀胱癌生物标志物的检测试剂盒以及用于诊断膀胱癌的诊断试剂盒。

本发明的用于检测膀胱癌生物标志物的检测试剂盒以及用于诊断膀胱癌的诊断试剂盒能够准确地确诊个体是否患有膀胱癌以及是否有复发的可能，具有较高的灵敏性，其复发监控模型性能的AUC达0.84，灵敏度为75％且NPV为80％时，特异性为82％；其诊断模型性能的AUC达0.90，灵敏度为75％且NPV为76％时，特异性为90％。此外，本发明基于尿液脱落细胞进行生物标志物检测，实现了非侵入性膀胱癌辅助诊断和复发监控的功能，可有效避免患者频繁使用膀胱镜所遭受的痛苦。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物，所述生物标志物为基因CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13中的至少一种。

第二方面，本发明提供用于检测所述生物标志物的引物：

用于检测CA9的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示；

用于检测CRH的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5；

用于检测HOXA13的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示；

用于检测IGF2的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10和SEQID NO:11所示；

用于检测RPS21的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQID NO:14所示；

用于检测CDK1的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16和SEQID NO:17所示；

用于检测UBE2C的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQID NO:20所示。

第三方面，本发明提供用于检测所述生物标志物的探针，对应于CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1和UBE2C，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21所示。

第四方面，本发明提供包含所述引物和/或所述探针的检测试剂或检测试剂盒。

进一步地，所述检测试剂或检测试剂盒还包含用于检测内参基因的引物和/或探针，所述内参基因为SLC25A6、ACTB或GAPDH，优选SLC25A6。

用于检测SLC25A6的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示；

用于检测ACTB的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25和SEQID NO:26所示；

用于检测GAPDH的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:28和SEQID NO:29所示。

对应于SLC25A6、ACTB和GAPDH，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:24、SEQID NO:27和SEQ ID NO:30所示。

引物和探针序列见表1。

表1

引物编号	引物名称	引物序列(5'--3')	碱基数
				SEQ ID NO:1	CA9-F	AGAAATCGCTGAGGAAGGCT	20
SEQ ID NO:2	CA9-R	AGGGCGGTGTAGTCAGAGA	19
				SEQ ID NO:3	CA9-P	AAGTAGCGGCTGAAGTCAGAGGGCAGGA	28
SEQ ID NO:4	CRH-F	CGCCTGGGAAGCGAGT	16
				SEQ ID NO:5	CRH-R	GGGCAGGAGAGCCACCA	17
SEQ ID NO:6	CRH-P	ACTCCCGCGGACACAAGCA	19
				SEQ ID NO:7	HOXA13-F	AAGTCCACTCTGCCCGAC	18
SEQ ID NO:8	HOXA13-R	TCGTGGCGTATTCCCGTT	18
				SEQ ID NO:9	HOXA13-P	TAGGAGGGGGAGAAAGAAGCGCGT	24
SEQ ID NO:10	IGF2-F	CGCGGCTTCTACTTCAGC	18
				SEQ ID NO:11	IGF2-R	CGGAAACAGCACTCCTCAAC	20
SEQ ID NO:12	IGF2-P	AAGCCGTGTGAGCCGTCGCA	20
				SEQ ID NO:13	RPS21-F	CATTCGTAGGATGGGTGAGT	20
SEQ ID NO:14	RPS21-R	TCCACATCTGTGATTCTCTCCA	22
				SEQ ID NO:15	RPS21-P	AAGGCCGATGGCATCGTCTCAAA	23
SEQ ID NO:16	CDK1-F	GATCTACCATACCCATTGACTAACT	25
				SEQ ID NO:17	CDK1-R	ACCTGTAGTTTTGTGTCTACCC	22
SEQ ID NO:18	CDK1-P	CTCCATAG+GTAC+CTT+CTCCAATTTTCTC	31
				SEQ ID NO:19	UBE2C-F	GTCGTGTTCTCCGAGTTCCTGT	22
SEQ ID NO:20	UBE2C-R	CTCCTGCTGTAGCCTTTTGCC	21
				SEQ ID NO:21	UBE2C-P	ACCCAGCCGCCACTAGCGTCGC	22
SEQ ID NO:22	SLC25A6-F	GGCCTACTTCGGCGTGTAC	19
				SEQ ID NO:23	SLC25A6-R	CGAAGGGGTAGGACACCACG	20
SEQ ID NO:24	SLC25A6-P	TCACGGTCTGCGCGATCATCCA	22
				SEQ ID NO:25	ACTB-F	CCTCGCCTTTGCCGATCC	18
SEQ ID NO:26	ACTB-R	CATGCCCACCATCACGC	17
				SEQ ID NO:27	ACTB-P	ACCCGCCGCCAGCTCACCA	19
SEQ ID NO:28	GAPDH-F	TCAGCCGCATCTTCTTTTGC	20
				SEQ ID NO:29	GAPDH-R	GCCCAATACGACCAAATCCG	20
SEQ ID NO:30	GAPDH-P	TCGCCAGCCGAGCCACATC	19

第五方面，本发明提供与所述检测试剂盒配套的反转录体系和qPCR反应体系，所述反应体系如下：

反转录反应体系：

以上试剂来源于Takara公司的Primer Script^TM RT reagent Kit(Perfect RealTime)试剂盒。配制好的反转录体系混合均匀，短暂低速离心后，置于PCR仪器中，37℃30min，85℃5s后取出备用。

荧光定量PCR扩增体系：

以上试剂来自Takara公司的Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)试剂盒。配制好的qPCR扩增体系混合均匀，短暂低速离心后，置于ABI7500 qPCR仪器中，按照如下条件进行扩增：

第六方面，本发明提供所述膀胱癌生物标志物检测试剂盒用于诊断膀胱癌中的使用方法，包括以下步骤：

a)采集受试者的随机尿液样本；b)从尿液样本中分离脱落细胞；c)提取脱落细胞中一种或者多种RNA；d)检测标志物RNA的表达水平；e)利用内参基因对标志物RNA的表达水平进行归一化；f)使用逻辑回归模型得到判定分数；g)根据判定分数和阈值判断受试者是否患有膀胱癌或是否为膀胱癌复发。

进一步地，步骤a)中所述的随机尿液样本为晨尿或者憋尿2小时以上的尿液，体积>20ml。

进一步地，步骤b)中所述脱落细胞分离方法为低速离心。

进一步地，步骤d)中检测标志物表达水平的方法为实时荧光PCR法。

进一步地，步骤e)中所述的内参基因为SLC25A6、ACTB和GAPDH中的至少一种。优选地，内参基因为SLC25A6。

附图说明

图1-图10示出本发明实施例3中CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21、HOXA13、SLC25A6、ACTB和GAPDH引物扩增曲线。

图11-图17示出本发明实施例4中CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13用于复发监控的性能评估ROC曲线。

图18示出本发明实施例4中CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13基因组合用于复发监控的性能评估ROC曲线。

图19-图25示出本发明实施例4中CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13用于诊断的性能评估ROC曲线。

图26示出本发明实施例4中CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13基因组合用于诊断的性能评估ROC曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明，但不限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sam brook等分子克隆实验手册(Sam brookJ&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行。

实施例1尿液脱落细胞的分离方法

将40ml人晨尿样本转移到50ml无菌的离心管中，2000g室温离心20min，小心取出离心管，缓慢倒掉上清液，注意不要倒掉下层的脱落细胞。加入15ml的1×PBS中，倒转离心管3-4次混匀样品，2000g室温离心20min，小心取出离心管，缓慢倒掉上清液，注意不要倒掉下层的脱落细胞，加入约100μl的1×PBS重悬混匀后转移到1.5ml EP管中。

实施例2差异表达基因的筛选

为了筛选到与膀胱癌诊断相关的生物标志物，通过分析TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)中公布的转录组数据以及通过NCBI的pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)中查阅相关文献获得的候选标志物如下：CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1、UBE2C。另外选取了三个内参基因SLC25A6、ACTB和GAPDH中的至少一种作为内参来归一化上述7种基因。

实施例3通过实时荧光PCR验证所选基因标志物的引物

1、引物探针的设计和合成

结合Primer Premier 5软件和Primer-BLAST(NCBI)设计了CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1和UBE2C共7种膀胱癌标志物和SLC25A6、ACTB和GAPDH共3种内参基因的引物和探针。设计原则如下：1)扩增片段小于150bp；2)扩增的片段至少跨越一个外显子；3)探针的Tm值比引物至少高5℃。将设计好的引物和探针序列交由公司合成，其中探针5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ1。

设计的引物探针的核苷酸序列即为SEQ ID NO:1-30所示的序列。

2、反转录和qPCR检测

采用Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)和Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)试剂盒进行反转录和qPCR检测。

按下列组份配制反转录反应体系(反应液配制在冰上进行)，然后放入PCR仪进行反应，反应条件为：37℃60min，85℃5s，12℃∞，反转录结束后加入50ul DEPC-H₂O稀释，取3ul作为模板，进行PCR反应。

反转录反应体系：

按下列组分配制qPCR反应体系(反应液配制在冰上进行)，设置无模板对照作为阴性对照，1ng/ul的gDNA作为模板验证设计的引物探针不扩增基因组序列，并以3个梯度稀释的细胞系RNA反转录的cDNA和1个由20个膀胱癌患者和20个健康人尿液脱落细胞RNA反转录的cDNA混合而成的样本作为阳性对照。然后放入实时荧光PCR仪(ABI7500)按如下反应条件进行扩增检测。

荧光定量PCR扩增体系：

按照如下反应条件进行扩增：

扩增结束后，分析获得各个基因对应不同模板的Ct值，结果显示各个引物均能够有效扩增，并具备高于0.98的扩增效率。其中不同基因引物在阴性对照、gDNA和阳性对照下的扩增曲线如图1～图10所示。结合起始RNA的浓度及拷贝数，得出各对引物探针的检测线为5至10个拷贝。

实施例4膀胱癌诊断和复发监测的多基因检测实验方案及性能评估

1、样本的采集

用无菌的采尿杯采集晨尿或憋尿超过2小时的随机尿>30ml，并密封盖好。采集后及时送检，室温下保存时间不应超过2小时，如不能及时运送，可在4℃暂时保存(不超过24小时)，长期保存在低温冰箱(<-80℃)。长途运输采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

2、样本的处理

取尿液30ml，2000g离心20min收集脱落细胞，使用Qiagen的RNeasy Mini Kit、miRNeasy Mini Kit等RNA提取试剂盒提取总RNA，并用30ul无核酸酶水洗脱备用。

3、RT-PCR扩增

按下表配制RT-PCR反应液，用无核酸酶的水作为阴性对照，扩增引物为SEQ IDNO:1-30所示的序列。

采用Takara公司的One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒进行RT-qPCR检测。

RT-PCR反应体系配制：

按如下反应条件进行qPCR扩增

4、数据分析

实验结束后，根据仪器的软件进行分析，调节阈值，相同基因需采用相同的阈值，记录仪器分析后计算出的样本Ct值。检测结果为未检出或高于40的Ct视为低于检测限，将其转变为40，然后计算ΔCt(ΔCt＝检测基因的Ct-内参基因SLC25A6的Ct)。

用各个基因ΔCt进行逻辑回归建模。利用glmulti包(R版本)，包括相互作用项，筛选所有可能的模型，以发现最佳模型，并以AUC、灵敏度和NPV等评估模型的诊断性能。

5、膀胱癌复发监控模型性能评估

为了验证上述标志物在膀胱癌复发监控的性能，在116例膀胱癌术后患者尿液中分别进行金标准膀胱镜病理检测(结果显示其中51例复发，65例未复发)和上述标志物检测，其效能评估如下：

(1)基于CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1、UBE2C基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1、UBE2C基因的ROC曲线分别如图11～图17所示。

(2)基于CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1、UBE2C基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到7种基因组合的AUC为0.84，灵敏度为75％，特异性为82％，ROC曲线如图18所示。

6、膀胱癌诊断模型性能评估

对73例初诊膀胱癌患者、29例正常人和33例非膀胱癌的泌尿系统疾病患者的尿液进行检测，验证上述标志物在膀胱癌诊断应用中的性能：

(1)基于CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1、UBE2C基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1、UBE2C基因的ROC曲线分别如图19～图25所示。

(2)基于CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1、UBE2C基因Ct值，并根据内参SLC25A6计算ΔCt，根据逻辑回归得到7种基因组合的AUC为0.90，灵敏度为75％，特异性为90％，ROC曲线如图26所示。

实施例5膀胱癌诊断和复发监测的诊断试剂盒及在膀胱癌诊断中的应用

1、诊断试剂盒

诊断试剂盒由尿液样本采集试剂盒、RNA提取试剂盒和膀胱癌生物标志物检测试剂盒组成。

尿液采集试剂盒由已经预先加入RNA保护剂的无菌采尿管和一次性采尿杯组成。尿液采集管可以在常温下运输尿液并保持样品的稳定性。

RNA提取试剂盒可以有效的提取尿液脱落细胞中的RNA，提取的RNA满足于后续的RT-qPCR检测。

膀胱癌生物标志物检测试剂盒包括了RNA反转录试剂和qPCR检测试剂，所述试剂预制于反应管或反应板中，大大减少了检测人员的操作时间且可减少可能的误差或错误，同时包括了阳性质控品和阴性质控品，质控RT-qPCR整个过程。

2、尿液样本采集

(1)收集晨尿样本，弃去前段尿，收集中段尿。将尿液排入无盖的尿液采集杯中，排入尽量多的尿液。

(2)将尿液采集管放正后轻甩使得里面的尿液保存剂置于尿液保存管底部，小心打开尿液保存管盖，使尿液保存管盖内测朝上，缓慢倒入尿液采集杯中的尿液约40ml，最少不低于30ml，最多不高于50ml。

(3)盖好尿液保存管的管盖后上下颠倒混匀五次，使得尿液和尿液保存剂充分混合。

(4)尿液采集后迅速运送到专业实验室进行处理，若不能立即处理则应暂存于4℃，超过两天不能检测的应将尿液转移到50ml无菌的离心管中，2000g离心20min，完全弃去上清后，获得的沉渣加700μL QIAzol涡旋混匀后室温放置5min后置于-80℃长期保存，但尽量避免反复冻融。

(5)尿液沉渣即为待检测样本。

3、尿脱落细胞RNA提取

需自备氯仿，无水乙醇，并提前于Buffer II中加入30ml无水乙醇，Buffer I中加入44ml无水乙醇。

(1)取40ml尿液于50ml无菌的离心管中，2000g离心20min，缓慢倒掉上清，用枪头吸净未完全弃去的上清。

(2)向沉淀中加入700μL的QIAzol裂解液，枪头吹打重悬，再涡旋混匀，然后室温(15-25℃)下孵育5分钟。

(3)每管样本中加入140μL的氯仿(三氯甲烷)，并盖紧盖，大力晃动15s，室温下孵育2-3分钟，4℃离心15分钟(12000g)。

(4)将上层清液转移到一个新的EP管中，注意避免不要混入下层液相，加入1.5倍体积的无水乙醇，然后混匀。

(5)吸取700μL的上一步骤的混合液，转移到已放入2ml的收集管的吸附柱内。室温离心8000g，15秒。弃掉收集管中的液体。

(6)向吸附柱内加入700μL的Buffer II，8000g离心，15s，弃滤液。

(7)吸取500μL的Buffer I于离心柱内，8000g离心，15s，弃滤液。

(8)吸取500μL的Buffer I于离心柱内，8000g离心，15s，弃滤液。

(9)将吸附柱移入一个新的2ml收集管内，12000xg离心2min。

(10)将吸附柱转移到新的1.5ml的EP管内，开盖室温静置5min。

(11)向吸附柱加入30μL RNA free water，盖上盖子室温静置2min，然后室温12000xg离心1min。

(12)弃掉离心柱，提取的RNA立即检测或-80℃长期保存。

4、尿脱落细胞RNA反转录

(1)根据检测样品数量n取出n+2个反转录管，室温解冻后，快速离心15秒后置于冰上。

(2)取出逆转录酶快速离心15秒，置于冰上。

(3)移取0.5μL逆转录酶至每个反转录管中。

(4)上述反转录管中分别加入5μL待测样品RNA、阴性质控品(NTC)和阳性质控品(PC)，混匀后快速离心15s，37℃，30min，85℃，5s，4℃保持。

(5)反转录结束后，取出反转录产物4℃备用或-80℃长期保存。

5、qPCR扩增

(1)取出n+2个已经预制了CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1、UBE2C和内参SLC25A6的引物探针的BCa qPCR8联管，避光解冻，充分融化后颠倒混匀、瞬时低速离心数秒后，放置于PCR板架上待用。所有8联管应按照①号管排在第一行方式放置于PCR板架上。

建议每次检测按照如下方式排布：

管号

检测对象

样本1

样本2

样本3

样本4

样本5

样本6

样本7

样本8

样本9

样本10

NTC

PC

①

SLC25A6

②

CA9

③

CRH

④

HOXA13

⑤

IGF2

⑥

RPS21

⑦

CDK1

⑧

UBE2C

(2)取出qPCR混合反应液和无核酸酶水室温解冻，将步骤4中的反转录反应管取出离心后，每个反转录反应管中分别加入85μL qPCR混合反应液、41μL无核酸酶水，充分混匀后离心。

(3)将每个反转录管中上述混合液分装到BCa qPCR 8联管，每孔分装16μL，盖上新的8联管盖，盖紧后充分混合后短暂离心。

(4)反应条件设定：

反应体积设为20μL，设置收集FAM荧光，淬灭基团为TAMRA，参比荧光为none。

(5)设置完成后保存程序并开始运行，实验结束后，手动设定阈值(Threshold)为24000后，读取各孔对应Ct值。

(6)读取各样本对应的Ct值后，带入模型后得到患膀胱癌或复发的风险评分。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京恩泽康泰生物科技有限公司

<120> 用于膀胱癌诊断或复发监控的生物标志物及试剂盒

<130> AJ201937-恩泽康泰

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

agaaatcgct gaggaaggct 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

agggcggtgt agtcagaga 19

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

aagtagcggc tgaagtcaga gggcagga 28

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcctgggaa gcgagt 16

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

gggcaggaga gccacca 17

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 6

actcccgcgg acacaagca 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 7

aagtccactc tgcccgac 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgtggcgta ttcccgtt 18

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 9

taggaggggg agaaagaagc gcgt 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 10

cgcggcttct acttcagc 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 11

cggaaacagc actcctcaac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 12

aagccgtgtg agccgtcgca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 13

cattcgtagg atgggtgagt 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 14

tccacatctg tgattctctc ca 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 15

aaggccgatg gcatcgtctc aaa 23

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 16

gatctaccat acccattgac taact 25

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 17

acctgtagtt ttgtgtctac cc 22

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 18

ctccataggt accttctcca attttctc 28

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcgtgttct ccgagttcct gt 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 20

ctcctgctgt agccttttgc c 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 21

acccagccgc cactagcgtc gc 22

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 22

ggcctacttc ggcgtgtac 19

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 23

cgaaggggta ggacaccacg 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 24

tcacggtctg cgcgatcatc ca 22

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 25

cctcgccttt gccgatcc 18

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 26

catgcccacc atcacgc 17

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 27

acccgccgcc agctcacca 19

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 28

tcagccgcat cttcttttgc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 29

gcccaatacg accaaatccg 20

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 30

tcgccagccg agccacatc 19

Claims

1.一种用于检测膀胱癌生物标志物的检测试剂盒，包括用于检测所述膀胱癌生物标志物的引物和探针，其特征在于，所述膀胱癌生物标志物为选自基因CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13中的至少一种，其中

用于检测CA9的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，

用于检测CRH的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，

用于检测HOXA13的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示，

用于检测IGF2的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11所示，

用于检测RPS21的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14所示，

用于检测CDK1的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:17所示，

用于检测UBE2C的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20所示，并且

其中，对应于CA9、CRH、HOXA13、IGF2、RPS21、CDK1和UBE2C，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21所示。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其还包括用于检测内参基因的引物和探针，其特征在于，所述内参基因选自SLC25A6、ACTB或GAPDH，其中

用于检测SLC25A6的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22和SEQ IDNO:23所示，

用于检测ACTB的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26所示，

用于检测GAPDH的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:28和SEQ IDNO:29所示，并且

其中，对应于SLC25A6、ACTB和GAPDH，所述探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:24、SEQID NO:27和SEQ ID NO:30所示。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其中所述内参基因为SLC25A6。

4.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其还包括反转录体系和qPCR反应体系。

5.一种用于膀胱癌诊断或复发监控的诊断试剂盒，包括尿液样本采集试剂盒、RNA提取试剂盒和根据权利要求1至4中的任一项所述的检测试剂盒。

6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒在膀胱癌诊断或复发监控中的应用，其中所述应用按如下程序进行：

a)采集受试者的随机尿液样本；

b)从所述尿液样本中分离脱落细胞；

c)提取所述脱落细胞中一种或者多种RNA；

d)检测膀胱癌标志物RNA的表达水平；

e)利用内参基因对所述膀胱癌标志物RNA的表达水平进行归一化；

f)使用逻辑回归模型得到判定分数；以及

g)根据判定分数和阈值判断受试者是否患有膀胱癌或是否复发。