CN117987527A - 用于糖尿病慢性肾功能损伤检测的基因生物标志物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于检测糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物的检测试剂盒,包括用于检测慢性肾功能损伤基因生物标志物的引物和探针,标志物为选自基因Mu‑GST,Clusterin,WT‑1,COL4A4和Podocin中的至少一种。还公开了对应基因生物标志物的引物,基因生物标志物的探针,包含引物和/或探针的检测试剂或检测试剂盒;用于糖尿病慢性肾功能损伤诊断或修复后再损伤监控的诊断试剂盒,包括尿液样本采集盒、RNA提取试剂盒和检测试剂盒;与检测试剂盒配套的反转录体系和RT‑PCT反应体系以及慢性肾功能损伤基因生物标志物检测试剂盒用于诊断慢性肾功能损伤中的使用方法。可快速灵敏地同时检测一系列慢性肾损伤相关标记物,尿液取样简单无损伤,易被病人接受;成本低,益于临床推广。
Description
技术领域
本发明涉及医学和生物技术领域,尤其涉及用于糖尿病慢性肾功能损伤检测的基因生物标志物及试剂盒。
背景技术
糖尿病,特别是II型糖尿病(T2DM)并发高血压很容易引起慢性肾功能损伤。
由于肾脏的巨大代偿功能,早期阶段的慢性肾功能损伤是隐匿性的,病人没有明显的不适感觉,常规临床检测也无异常表现,只有发展到超过50%的肾功能丧失,才会出现临床症状和常规实验室检测异常。当肾小球滤过率(eGFR)<30mL/min-1/1.73m-2肾功能损伤是不可逆的。随着II型糖尿病(T2DM)患病率的增加,如何早期发现慢性肾损伤,采取措施治疗或延缓病情的发展,对广大群体的糖尿病病人和其他原因造成的慢性肾损伤病人的健康,是极为需要的。
目前对糖尿病肾病(DKD)的诊断及筛查通常是基于尿白蛋白肌酐比和/或肾小球过滤率(eGFR),且没有其他肾脏损害的迹象或征兆而做出的临床诊断。由于尿液成分(尤其是蛋白质)检测的标准化工作尚未完成,故不同检测系统间检测结果可能存在差异,可能会出现假阴性或假阳性的测定结果。肾小球滤过率操作繁琐,并且只提供一个估算的结果。总之,目前DKD的临床诊断缺乏特异性的标准和指标。
研究发现,早期隐匿性的DKD肾功能损伤主要表现在肾脏的肾小球和肾小管,尽早开始药物等干预,可以延缓出现器质性肾脏病变。慢性肾损伤标志物的检测有助于及时发现早期肾小球、肾小管和肾间质病变,同时对监测DKD的病情进展、判断肾脏损伤的程度和预后以及判断治疗干预效果等具有重要的临床价值。研究显示,早期诊断DKD可使患者进展为终末期肾病的危险性减少80%。
然而,目前还没有成熟的通过早期发现和及时治疗来预防慢性肾功能损伤的方法以及对应的基因生物标志物。
本发明是通过检测尿液脱离细胞中与慢性肾功能损伤相关的肾小球、肾小管和肾间质细胞的基因生物标志物升高指数,来早期发现慢性肾功能损伤出现,及时预警病人,并施以有效处理和治疗,避免或延缓不可逆的严重后果。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题,提供了一种糖尿病慢性肾功能损伤检测/监控的检测试剂盒。通过无创的尿液取样,检测尿液脱落细胞中特定的与慢性肾损伤相关的基因生物标记物的升高指数,来获得对早期慢性肾功能损伤的发现和疗效的监控。
近年来,一系列与慢性肾损伤相关的蛋白质和基因生物标记物被发现和报道,在动物实验和临床实验中得到证实。这些标志物分别产生于肾脏不同部位的细胞(参见图1(a)和图1(b)),在肾脏受损的较早期就会出现在尿液中。病变累及部位的受损上皮细胞会脱落在尿液中,所以在慢性肾脏受损的病人尿液中,往往会有较多量的脱落细胞和细胞碎片。通过采用现代分子诊断学的手段和自行设计的PCR引物和探针,发展一种在尿液脱落细胞中检测一系列与慢性肾损伤相关的基因标志物的方法和试剂盒,如Mu-GST,Clusterin,WT-1,Podocin和COL4A4等等,只要在样本中汲取1.5毫升尿液,采用荧光定量RT-PCR技术,可快速灵敏地同时检测上述一系列慢性肾损伤相关标记物,对慢性肾损伤作出早期判定,根据脱落细胞中各个标记物表达量的变异,提示慢性肾损伤的可能累及部位。尿液取样简单无损伤,容易被病人接受。成本低,益于临床推广。
本发明一方面提供了一种用于检测糖尿病慢性肾功能损伤生物标志物的检测试剂盒,慢性肾功能损伤多由II型糖尿病或并发高血压引起,包括用于检测尿液脱落细胞和细胞碎片中的所述慢性肾功能损伤生物标志物的引物和探针,所述慢性肾功能损伤生物标志物为选自基因Mu-GST,Clusterin,WT-1,Podocin和COL4A4中的至少一种;
用于检测所述糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物的引物包括:
用于检测Mu-GST的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示;
用于检测Clusterin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;
用于检测WT-1的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示;
用于检测COL4A4的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示;
用于检测Pododin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示;
引物序列:
用于检测所述生物标志物的探针,对应于Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin,所述探针的核苷酸序列分别为探针SEQ ID NO:1、探针SEQ ID NO:3、探针SEQ IDNO:5、探针SEQ ID NO:7、和探针SEQ ID NO:10;
探针序列
本发明的第二方面提供包含所述引物和/或所述探针的检测试剂或检测试剂盒。
本发明的第三方面提供一种用于糖尿病慢性肾功能损伤诊断或修复后再损伤监控的诊断试剂盒,包括尿液样本采集试剂盒、RNA提取试剂盒和如第二方面所述的检测试剂盒。
本发明的第四方面用于提供与所述测试试剂盒配套的反转录反应体系和荧光定量PCR扩增体系构成的反应体系,所述反应体系如下:
反转录反应体系:
试剂 | 使用量 |
5×gDNAEraserBuffer | 2.0μl |
gDNAEraser | 1.0μl |
TotalRNA | 7uL |
RNaseFreedH2O | 10μl |
以上试剂来源于Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒;配制好的反向转录体系以DNase去除其中的DNA(42℃2min),转于4℃,短暂低速离心后,置于PCR仪器中,37℃15min,85℃5s后取出备用;
所述荧光定量PCR扩增体系为:
以上试剂来自Takara公司的Probe qPCR Mix,with UNG试剂盒。配制好的qPCR扩增体系混合均匀,短暂低速离心后,置于博日荧光定量PCR仪器中,按照如下条件进行扩增:
本发明的第五方面提供所述糖尿病慢性肾功能损伤生物标志物检测试剂盒用于诊断糖尿病慢性肾功能损伤中的使用方法,包括以下步骤:
a)采集受试者的随机尿液样本;
b)从所述尿液样本中分离脱落细胞;
c)提取所述脱落细胞中的RNA;
d)检测肾功能损伤相关基因生物标记物的表达水平;
e)对所述糖尿病慢性肾功能损伤相关基因生物标志物的表达水平进行归一化;
f)使用逻辑回归模型得到判定分数;以及
g)根据判定分数和阈值判断受试者是否患有糖尿病慢性肾功能损伤或是否修复后再损伤。
进一步地,步骤a)中所述的随机尿液样本为晨尿或者憋尿2小时以上的尿液,尿液量>20ml。
进一步地,步骤b)中所述脱落细胞分离方法为低速离心。
进一步地,步骤d)中检测标志物表达水平的方法为荧光定量RT-PCR探针法。
本发明的第六方面提供一种电子设备,包括处理器和存储器,所述存储器存储有多条指令,所述处理器用于读取所述指令并执行如第五方面所述的方法。
本发明的第七方面提供一种计算机可读存储介质,所述计算机可读存储介质存储有多条指令,所述多条指令可被处理器读取并执行如第五方面所述的方法。
附图说明
图1(a)为本发明提供的用于慢性肾功能损伤监控的生物标志物分布类型图;
图1(b)为针对Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin共5个基因设计的引物,和GAPDH对照的电泳图示意,其中PCR片段在电泳图中均能显示。
图2所示是临床诊断、实验室肾功能检测和慢性肾功能损伤监控的生物标志物RT-PCR检测结果对比图。
图3表示糖尿病肾病(DKD)组与非糖尿病肾病组(Non-DKD)之间基因生物标记物组(5个基因)的1-特异性与敏感度关系图。
图4(a)所示为Clusterin等5个基因生物标记物检测结果的ΔCT值标准阈值计算。
图4(b)所示为针对生物标记物(靶向基因Clusterin)在尿液样本荧光PCR探针法测试,糖尿病肾病(DKD)及糖尿病合并高血压肾病(MDEH),非增殖型肾功能损伤(NP)及增殖型肾功能损伤(P)的检测结果ΔCT值及P值显示。
图5所示为不同基因引物在对照组、患者组对照下的扩增曲线图;分别为针对Mu-GST,Clusterin,WT-1,Podocin和COL4A45个基因设计的引物。
图6为本发明提供的电子设备一种实施例的结构示意图。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案,下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案做详细的说明。
本发明提供的方法可以在如下的终端环境中实施,该终端可以包括一个或多个如下部件:处理器、存储器和显示屏。其中,存储器中存储有至少一条指令,所述指令由处理器加载并执行以实现下述实施例所述的方法。
处理器可以包括一个或者多个处理核心。处理器利用各种接口和线路连接整个终端内的各个部分,通过运行或执行存储在存储器内的指令、程序、代码集或指令集,以及调用存储在存储器内的数据,执行终端的各种功能和处理数据。
存储器可以包括随机存储器(Random Access Memory,RAM),也可以包括只读存储器(Read-Only Memory,ROM)。存储器可用于存储指令、程序、代码、代码集或指令。
显示屏用于显示各个应用程序的用户界面。
除此之外,本领域技术人员可以理解,上述终端的结构并不构成对终端的限定,终端可以包括更多或更少的部件,或者组合某些部件,或者不同的部件布置。比如,终端中还包括射频电路、输入单元、传感器、音频电路、电源等部件,在此不再赘述。
提高慢性肾病防治率的前提是必须提高其认知率和诊断率。由于大多数慢性肾病病人早期没有症状或症状较轻,因此,早期筛查、定期检查,提高筛查的质量,对提高诊断率十分重要。
慢性肾脏疾病(CKD)的定义遵循K/DOQI指南,CKD根据肾小球滤过率(eGFR)进行分期。
eGFR利用MDRD公式进行计算。
eGFR≥90慢性肾病(CKD)第一期
90>eGFR≥60慢性肾病(CKD)第二期
60>eGFR≥30慢性肾病(CKD)第三期
30>eGFR≥15慢性肾病(CKD)第四期
15>eGFR终末期肾病(ESRD),
糖尿病诊断依据2023年美国糖尿病协会(ADA)指南推荐标准。
糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD),指由糖尿病引起的CKD,主要指标包括eGFR<60ml-min-1*(1.73m2)-1和(或)UACR高于30mg/g持续超过3个月。
本实施例中应用的缩写包括:
糖尿病肾病(DKD);慢性肾脏病(CKD);2型糖尿病(T2DM)、糖尿病合并高血压肾病(DMEH);肾小球滤过率估算值(eGFR);尿白蛋白排泄率(UAER)。非糖尿病肾病(non-DKD),非糖尿病(non-DM)
非增值性肾功能损伤(NP),增值性肾功能损伤(P)
检测对象的选择和取样:以下叙述中,n代表样本数。
如图1(a)所示,这些靶向基因能够根据损伤部位(近曲小管,远曲小管和集管)针对临床肾功能不全患者肾损伤及损伤部位做早期诊断。
图1(b)为针对Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin共5个基因设计的引物,和GAPDH对照的电泳图示意,其中PCR片段在电泳图中均能显示。
实施例1尿液脱落细胞的分离方法
将尿液样本直接尿于100ml无菌的尿液收集罐中。取1.5毫升尿液置离心管中,2000g离心10min,移去上清液,留下管底沉淀的脱落细胞待用。
实施例2差异表达基因的筛选
为了筛选到与慢性肾功能损伤诊断相关的生物标志物,通过分析TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)中公布的转录组数据以及通过NCBI的pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)中查阅相关文献获得的候选标志物如下:Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin。
实施例3通过荧光定量RT-PCR验证所选基因标志物的引物
1、引物探针的设计和合成
结合Primer 5软件和Primer-BLAST(NCBI)设计了Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin共5种标志物的引物和探针。引物和探针的设计原则如下:1)扩增片段小于150bp;2)扩增的片段尽可能跨越一个内含子;3)探针的Tm值比引物至少高5℃。将设计好的引物和探针序列交由公司合成,其中探针5’端标记FAM基团,3’端标记BHQ1。
设计的引物探针的核苷酸序列即为SEQ ID NO:1-10所示的序列。
所述慢性肾功能损伤基因生物标志物为选自表达基因Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin中的至少一种;
所述用于检测糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物的引物包括:
用于检测Mu-GST的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示;
用于检测Clusterin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;
用于检测WT-1的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示;
用于检测COL4A4的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示;
用于检测Pododin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示;
引物为:
用于检测所述生物标志物的探针,对应于Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin,所述探针的核苷酸序列分别为探针SEQ ID NO:1、探针SEQ ID NO:3、探针SEQ IDNO:5、探针SEQ ID NO:7、和探针SEQ ID NO:10;
探针序列为:
2、反转录和qPCR检测
采用Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time和Probe qPCR Mix,with UNG)试剂盒进行反转录和qPCR检测。
配制好的反向转录体系以DNase去除其中的DNA(42℃2min),转于4℃,短暂低速离心后,置于PCR仪器中,37℃15min,85℃5s后取出用于随后的qPCR扩增反应。
取2ul作为模板,进行PCR反应。
反转录反应体系:
试剂 | 使用量 |
5×gDNA Eraser Buffer | 2.0μl |
gDNA Eraser | 1.0μl |
Total RNA | 7uL |
RNase Free dH2O | 10μl |
按下列组分配制qPCR反应体系(反应液配制在冰上进行),由20个肾病患者和20个健康人尿液脱落细胞样本作为对照。放入实时荧光PCR仪(ABI7500、博日FQD-96A)按如下反应条件进行扩增检测。
荧光定量PCR扩增体系:
试剂 | 使用量 | 终浓度 |
Probe qPCR Mix(2×) | 12.5μl | 1× |
PCR Forward Primer(10μM) | 0.5μl | 0.2μΜ |
PCR Reverse Primer(10μM) | 0.5μl | 0.2μΜ |
Probe | 1μl | 0.2μΜ |
模板 | 2μl(RT) | |
灭菌水 | 8.5μl | |
试剂使用总量 | 25μl |
按照如下反应条件进行扩增:
扩增结束后,分析获得各个基因对应不同样本的CT值,结果显示各个引物均能够有效扩增,并具备高于0.98的扩增效率。其中,临床诊断、实验室检测和RT-PCR检测结果对比图如图2所示。
图2中显示临床诊断的糖尿病肾病、糖尿病合并高血压肾病及慢性肾病(第三期),肾功能常规检查(如尿素、肌酐检测)往往在正常值范围,而糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标记物RT-PCR检测能显示早期肾功能损伤。
材料和试剂
仪器和设备
电泳仪 | 北京六一公司 |
艾本德离心机 | 德国ependoff公司 |
PCR机 | 美国ABI公司 |
涡旋振荡器 | 实维公司 |
台式紫外透射仪 | 美国精骐 |
离心机(D1008E) | 拓赫机电公司 |
WR-18B-M灭菌器 | 宁波万瑞公司 |
荧光定量聚合酶链(PCR) | ABI7500 |
32通道核酸提取仪 | 杭州博日公司 |
干式恒温器 | 杭州佑宁公司 |
微孔板封膜仪 | 杭州奥盛公司 |
紫外可见分光光度计 | OLABO公司 |
电子天平 | 博科公司 |
冷藏柜 | 博津公司 |
混合器(VORTEX-5) | 美国VORTEX公司 |
实施例4糖尿病肾功能损伤监测的多基因检测实验方案及性能评估
1、样本的采集
用无菌的一次性采尿杯采集晨尿或憋尿超过2小时的随机中段尿>20ml,并密封盖好。采集后及时送检,室温下保存时间不应超过2小时,如不能及时处理,可在4℃暂时保存(不超过12小时),长期保存在低温冰箱(低于-80℃)。长途运输(24小时)采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
2、样本的处理
取尿液1.5ml,2000g离心10min收集脱落细胞,使用磁珠法提取样本中的RNA。
3、RT-PCR扩增
按下表配制RT-PCR反应液,用无核酸酶的水作为阴性对照,扩增引物为SEQ IDNO:1-27所示的序列。
采用Takara公司的One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒进行RT-qPCR检测。
RT-PCR反应体系配制:
按如下反应条件进行qPCR扩增:
4、数据分析
实验结束后,根据仪器的软件进行分析,调节阈值,相同基因需采用相同的阈值,记录仪器分析后计算出的样本Ct值。检测结果为未检出或高于的Ct视为低于检测限,将其转变后计算ΔCt(ΔCt=检测基因的Ct-内参基因GAPDH的Ct)。
5、糖尿病肾功能损伤监控诊断模型性能评估
为了验证上述标志物在肾功能损伤的性能,在84例糖尿病肾功能损伤患者尿液中分别进行标准肾功能损伤评估及上述标志物检测,其效能评估如下:
(1)基于Mu-GST,Clusterin,WT-1,Podocin和COL4A4基因Ct值,并计算ΔCt,根据逻辑回归得到,Mu-GST,Clusterin,WT-1,Podocin和COL4A4基因的ROC曲线。
(2)基于Mu-GST,Clusterin,WT-1,Podocin和COL4A4基因Ct值,并计算ΔCt,根据逻辑回归得到5种基因组合的AUC为0.914,灵敏度为85%,特异性为83%。该评估结论基于图3获得。图3表示在DKD组与Non DKD组间5种基因组合的AUC为0.914(P=0.005,95%CI0.87-0.959),特异性83%及敏感性85%都取得好的结果。
检测试剂盒以及与检测试剂盒配套的反转录反应体系和荧光定量PCR扩增体系构成的反应体系
1、诊断试剂盒
诊断试剂盒由尿液样本采集试剂盒、RNA提取试剂盒和肾功能损伤生物标志物检测试剂盒组成。
尿液采集试剂盒为一次性带盖无核酸酶的尿液采集罐,直接将尿液尿于采集罐内。采集后的尿液保存于4℃。
RNA提取试剂盒可以有效的提取尿液脱落细胞中的RNA,提取的RNA满足于后续的RT-qPCR检测。
肾功能损伤生物标志物检测试剂盒包括了RNA反转录试剂和qPCR检测试剂,所述试剂预制于反应管或反应板中,大大减少了检测人员的操作时间且可减少可能的误差或错误,同时包括了阳性质控品和阴性质控品,质控RT-qPCR整个过程。
2、尿液样本采集
(1)收集晨尿样本,弃去前段尿,收集中段尿。尿液收集于一次性带盖无核酸酶的尿液采集罐,直接将尿液尿于采集罐内,尿液量>20ml。采集后的尿液保存于4℃。
(2)取尿液1.5ml,2000g离心10min收集脱落细胞,移去上清液,使用磁珠法提取沉淀细胞中的RNA。
3、尿脱落细胞RNA反转录
(1)根据检测样品数量n取出n+2个反转录管,室温解冻后,快速离心15秒后置于冰上。
(2)取出逆转录酶快速离心15秒,置于冰上。
(3)移取0.5μL逆转录酶至每个反转录管中。
(4)上述反转录管中分别加入5μL待测样品RNA、阴性质控品(NTC)和阳性质控品(PC),混匀后快速离心15s,37℃,30min,85℃,5s,4℃保持。
(5)反转录结束后,取出反转录产物4℃备用或-20℃长期保存。
4、qPCR扩增
(1)取出n+2个已经预制了Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin的引物探针的BCa qPCR8联管,避光解冻,充分融化后颠倒混匀、瞬时低速离心数秒后,放置于PCR板架上待用。
(2)取出qPCR混合反应液和无核酸酶水室温解冻,将步骤4中的反转录反应管取出离心后,每个反转录反应管中分别加入85μL qPCR混合反应液、41μL无核酸酶水,充分混匀后离心。
(3)将每个反转录管中上述混合液分装到BCa-qPCR-8联管,每孔分装16μL,盖上新的8联管盖,盖紧后充分混合后短暂离心。
(4)反应条件设定:
反应体积设为20μL,设置收集FAM荧光,淬灭基团为BHQ1,参比荧光为none。
(5)设置完成后保存程序并开始运行,实验结束后,读取各孔对应Ct值。
(6)读取各样本对应的Ct值后,带入模型后得到患肾功能损伤的风险评分。
如图4(a)和4(b)所示,针对生物标记物(靶向基因组)在尿液样本荧光PCR探针法测试无糖尿病无肾功能损伤、糖尿病无肾功能损伤检测结果P值没有明显差异。糖尿病肾功能损伤无增殖型及糖尿病肾损伤增殖型的检测结果ΔCT值显示,P值有明显差异,说明该基因组能测试慢性肾功能损伤不同类型。
图5所示为不同基因引物在对照组、患者组对照下的扩增曲线图;分别为针对Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin5个基因设计的引物。
实施例5临床试验,用于比较糖尿病肾功能损伤患者尿液中基因生物标志物的变化水平。
1、实验主要步骤包括:
(1)确定实验时间为2022年10月至2023年5月,确定涉及45-65岁的II型糖尿病患者。使用Power and sample size Calculation软件3.1.2版本计算样本量。
本实施例共纳入84例II型糖尿病患者(T2DM)和22例非糖尿病患者,共计106例。病例来自全国两家3甲医院。糖尿病患者组中包括糖尿病无肾功能损伤(non-DKD)患者23例;肾功能损伤61例,其中糖尿病合并高血压肾病患者(DMEH)34例;糖尿病肾病(DKD)患者27例;对照组为非糖尿病(non-DM)患者22例。
在确定患者时,标准为排除有癌前病变、做过应激手术的患者;有全身性炎症标志物上调的患者,如自身免疫性疾病、恶性肿瘤、类风湿关节炎或炎症性肠病。肾功能损伤的分类依据国际糖尿病视网膜病变严重程度量表,其中肾功能损伤严重程度分为无肾功能损伤、非增殖性肾功能损伤(non-prolifative,NP)和增殖型肾功能损伤(prolifative,P),肾功能损伤的分类主要是针对糖尿病的不同分期。符合研究条件的患者被要求收集尿液样本。糖尿病肾功能损伤患者中NP,32例;P,25例,总共57例。选择的病例情况以及数量如下表所示。
(2)对照组为年龄匹配的非糖尿病患者。对照组(非糖尿病组)采用与糖尿病组相似的排除标准。在数据收集前获得患者的书面知情同意。
(3)收集尿液样本:尿液样本由未参与研究的指定工作人员收集。每位患者采集约20ml中段尿液。采集后的尿液样本在-4℃保存,然后运输到实验室进行离心;取尿液1.5ml,2000g离心10min收集脱落细胞,移去上清液,使用磁珠法提取沉淀细胞中的RNA;
(4)基因生物标志物的定量测定并检测其中的各基因生物标志物水平:
对每个样本进行重复检验,取平均值进行数据分析和统计分析。数据分析使用社会科学统计软件包(SPSS)软件版本26。使用卡方检验和Fisher精确检验比较分类变量,而使用t检验比较DKD和非DKD之间的数值变量。使用单因素方差分析(ANOVA)比较不同阶段慢性肾功能损伤组之间的数值变量。
采用协方差分析(ANCOVA)检验比较各组尿液基因生物标记物基因组、基因生物标记物基因组水平与协变量的差异。采用Bonferroni事后比较法比较协方差分析(ANCOVA)结果的显著性。根据年龄、种族、性别、合并症、以及糖尿病和非糖尿病患者之间的基因生物标志物水平进行调整。在不同阶段的慢性肾功能损伤组之间,额外的II型糖尿病持续时间和HbA1c水平被纳入协变量。p<0.05为差异有统计学意义。
采用简单和多元线性回归分析确定尿液基因生物标志物水平及其相关因素的关系。单线性回归p值<0.25,多元线性回归p值<0.05为显著性。
2、糖尿病患者和非糖尿病患者的人口学特征和临床概况的比较
84名临床例数作为研究人群包括T2DM患者(无肾功能损伤),23例;DMEH,34例;DKD,27例;非DM组和T2DM组的平均年龄分别为53.1±6.3岁和54.8±4.9岁,两组间差异无统计学意义。糖尿病组平均病程8.1±2.2年,平均HbA1c水平为7.2±1.2%。表1显示了糖尿病患者和非糖尿病患者的人口学特征和临床概况的比较。
表1糖尿病和非糖尿病的人口学数据和临床概况
a表示独立t检验。b表示卡方检验。C表示Fisher精确检验,p<0.05,显著。*表示平均值±SD。
3、基因组水平分析结果:
(1)不同分期糖尿病患者尿液中基因生物标记物基因组、基因生物标记物基因组水平的比较。
在调整协变量(年龄、种族、并发症、糖尿病病程、HbA1c控制和尿液基因生物标记物基因组水平)前后,无肾功能损伤、NP肾功能损伤和P肾功能损伤组尿液中平均基因生物标记物基因组水平有显著差异(p<0.001和p<0.001),如表2所示。采用Bonferroni检验的事后比较显示,NP肾功能损伤患者尿液中基因生物标记物基因组的平均水平(p<0.001)和P肾功能损伤患者尿液中基因生物标记物基因组的平均水平显著高于无肾功能损伤患者(p<0.001)。
表2不同分期糖尿病患者尿液中基因生物标记物基因组、基因生物标记物基因组水平的比较
单因素方差分析,p<0.05,显著。
B表示经协变量调整的ANCOVA检验:年龄、种族、性别、是否存在合并症、糖尿病病程、HbA1c控制、基因生物标记物基因组水平,p<0.05,显著。
C表示经协变量调整的ANCOVA检验:年龄、种族、性别、是否存在合并症、糖尿病和糖化血红蛋白控制时间、基因生物标记物基因组水平,p<0.05,显著。
以上作为第一个比较糖尿病肾功能损伤不同阶段尿液中基因生物标记物基因组水平的研究实验,其中,评估了DM患者和非DM患者尿液中基因生物标记物基因组水平。尿液是系统生物标志物的宝贵来源,易于非侵入性采集,特别是在困难组。糖尿病患者尿液中基因生物标记物基因组水平明显高于非糖尿病患者。本发明的实验发现:调整协变量前后,DM组尿液中基因生物标记物基因组水平明显高于非DM组。这一发现与以往比较T2DM和非DM患者尿液中基因生物标记物基因组水平的研究结果相当。
因此,尿液中的基因生物标记物基因组与糖尿病患者的肾功能损伤严重程度之间存在关联,尿液生物标志物是筛查、监测和预测肾功能损伤进展的潜在生物标志物。
糖尿病组尿液基因组(ΔCT 5)显著高于非糖尿病组(ΔCT 2)(校正协变量后p<0.005)。NP肾功能损伤组尿液基因生物标记物基因组平均值(ΔCT 5)和P肾功能损伤组尿液基因生物标记物基因组平均值(ΔCT 6.3)(p<0.001)显著高于无肾功能损伤组(ΔCT1.5(p<0.001)。NP肾功能损伤组尿液中基因生物标记物基因组均值(p=0.007)和P肾功能损伤组尿液中基因生物标记物基因组均值显著高于无肾功能损伤组(p=0.005)。
结论:
尿液中的基因生物标志物与糖尿病患者的慢性肾功能损伤严重程度之间存在关联,表明这些尿液基因生物标志物是筛查、监测和预测肾功能损伤进展的潜在生物标志物。
本发明还提供了一种存储器,存储有多条指令,指令用于实现如实施例一的方法。
如图6所示,本发明还提供了一种电子设备,包括处理器301和与处理器301连接的存储器302,存储器302存储有多条指令,指令可被处理器加载并执行,以使处理器能够执行如实施例一的方法。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种用于检测糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物的检测试剂盒,所述慢性肾功能损伤由II型糖尿病或并发高血压引起,其特征在于,包括用于检测尿液脱落细胞和细胞碎片中的所述慢性肾功能损伤基因生物标志物的引物和探针,所述慢性肾功能损伤基因生物标志物为选自表达基因Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin中的至少一种;
所述用于检测糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物的引物包括:
用于检测Mu-GST的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示;
用于检测Clusterin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示;
用于检测WT-1的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;
用于检测COL4A4的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示;
用于检测Pododin的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示;
引物为:
用于检测所述生物标志物的探针,对应于Mu-GST,Clusterin,WT-1,COL4A4和Podocin,所述探针的核苷酸序列分别为探针SEQ ID NO:1、探针SEQ ID NO:3、探针SEQ ID NO:5、探针SEQ ID NO:7、和探针SEQ ID NO:10;
探针序列为:
2.一种包含权利要求1所述探针的检测试剂或检测试剂盒。
3.一种用于糖尿病慢性肾功能损伤诊断或修复后再损伤监控的诊断试剂盒,其特征在于,包括尿液样本采集盒、RNA提取试剂盒和如权利要求2所述的检测试剂盒。
4.一种与权利要求2所述检测试剂盒配套的反转录反应体系和荧光定量PCR扩增体系构成的反应体系,其特征在于,所述反应体系如下:
反转录反应体系:
以上试剂来源于Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒;配制好的反向转录体系以DNase去除其中的DNA(42℃2min),转于(4℃),短暂低速离心后,置于PCR仪器中,37℃ 15min,85℃ 5s后取出待用;
所述荧光定量PCR扩增体系为:
以上试剂来自Takara公司的Probe qPCR Mix,with UNG试剂盒;配制好的qPCR扩增体系混合均匀,短暂低速离心后,置于博日荧光定量PCR仪器中,按照如下条件进行扩增:
5.一种权利要求1所述糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物检测试剂盒用于诊断糖尿病慢性肾功能损伤中的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
a)采集受试者的随机尿液样本;
b)从所述尿液样本中离心沉淀脱落细胞;
c)提取沉淀细胞中RNA;
d)检测肾功能损伤基因生物标志物的表达水平;
e)对所述糖尿病慢性肾功能损伤基因生物标志物的表达水平进行归一化;
f)使用逻辑回归模型得到判定分数;以及
g)根据判定分数和阈值判断受试者是否患有糖尿病慢性肾功能损伤或是否修复后再损伤。
6.根据权利要求5所述的使用方法,其特征在于,所述步骤a)中所述的随机尿液样本为晨尿或者憋尿2小时以上的尿液,尿液量>20ml。
7.根据权利要求5所述的使用方法,其特征在于,步骤b)中所述脱落细胞分离方法为低速离心。
8.根据权利要求5所述的使用方法,其特征在于,步骤d)中检测标志物表达水平的方法为荧光定量RT-PCR探针法。
9.一种电子,其特征在于,包括处理器和存储器,所述存储器存储有多条指令,所述处理器用于读取所述指令并执行如权利要求5-8任一所述的使用方法。
10.一种计算机可读存储介质,其特征在于,所述计算机可读存储介质存储有多条指令,所述多条指令可被处理器读取并执行如权利要求5-8任一所述的使用方法。
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2023
- 2023-07-06 CN CN202310827393.2A patent/CN117987527A/zh active Pending
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