CN116024345B - 膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 - Google Patents

膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 Download PDF

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CN116024345B CN202310041301.8A CN202310041301A CN116024345B CN 116024345 B CN116024345 B CN 116024345B CN 202310041301 A CN202310041301 A CN 202310041301A CN 116024345 B CN116024345 B CN 116024345B
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Abstract

本发明公开一种膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于肿瘤诊断技术领域。提供的试剂盒包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下检测基因的试剂：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT，以及任选的HOXA13、IGFBP5、CXCR2、CRH和ANXA10，以及作为检测内参基因的GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1，该试剂盒能够采用实时荧光核酸恒温扩增方法并以患者随机尿液作为待测样本高敏感性检出膀胱癌(包括初诊和复发患者)，并具有较高的阴性预测值，因此能够有效避免阴性对象进行不必要的膀胱镜检查，且可以降低检测成本。

Description

膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和 探针
技术领域
本发明属于肿瘤诊断技术领域，具体涉及一种适用于实时荧光核酸恒温扩增检测体系的膀胱癌检测试剂盒及其专用引物和探针。
背景技术
膀胱尿路上皮癌(Bladeder urothelial carcinoma，BUC)，亦称膀胱癌(BladderCancer，BC)，是指在膀胱粘膜上发生恶变的肿瘤，是泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤之一，膀胱癌新发在泌尿生殖肿瘤中位居第二。
膀胱癌分为非肌层浸润型膀胱癌(NMIBC)及肌层浸润型膀胱癌(MIBC)。其中，NMIBC(新发率75％-85％)包括Tis，Ta，T1期，局限于粘膜和粘膜下层。NMIBC虽然具有多发性及较高的复发性，但一般预后较好，患者的五年生存率极高；MIBC(新发率15％-25％)包括T2-T4期，侵犯至肌层以上，导致一些患者发生局部或远端转移，预后较差，五年生存率明显下降。因此，对于膀胱癌的诊断(初诊)和复发监测具有重要的意义。
目前，临床上对膀胱癌诊断和复发监测的金标准是膀胱镜检查，但由于其具有侵袭性，给患者的精神及肉体造成了巨大痛苦，尤其是进行复发监测时，定期进行膀胱镜检查更是对患者造成极大的痛苦。无创尿液检查(尿细胞学检查)替代膀胱镜诊断膀胱癌、监测复发及判断预后，一直是研究的热点。除尿细胞学检查外，目前通过尿液检查诊断和监测膀胱癌复发还主要有尿核基质蛋白22、膀胱癌肿瘤抗原、免疫-细胞检测等方法，但以上这些方法的敏感性和特异性均不理想。
为了提高膀胱癌检测(诊断和复发监测)的特异性和敏感性，并实现无创检测，专利文献CN109576370A(以下称文献1)公开一种用于膀胱癌诊断和复发监控的生物标志物及检测试剂盒，其以尿液为检测样本，并采用生物标志物基因BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1和UCA1的组合对膀胱癌进行诊断和复发的监测，具有较高的检测敏感性、阴性预测值(NPV)和特异性。专利文献CN111154879A(以下称文献2)公开一种用于膀胱癌诊断或复发监控的生物标志物及试剂盒，其以尿液为检测样本，并采用生物标志物基因CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13的组合对膀胱癌进行诊断和复发的监测，也具有较高的检测敏感性、阴性预测值(NPV)和特异性。然而，上述文献1和2公开的均是适用于PCR反应体系的检测膀胱癌标志物的组合，PCR反应过程中需要温度的升降和循环，因此所需检测时间较长，效率较低，同时需要使用荧光定量PCR仪，增加了检测成本和患者的经济负担；另外，PCR的反应产物为DNA，不易降解，容易导致样本交叉污染和实验环境的污染。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下检测基因的试剂：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT；
所述试剂盒还包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的特异性检测GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1的试剂，所述GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1作为检测内参基因。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下检测基因的试剂：HOXA13、IGFBP5、CXCR2、CRH和IANXA10。
在一些实施方式中，针对每一种基因(包括检测基因和检测内参基因)的特异性检测试剂包括与该种基因对应的：
(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述特异性捕获探针用于捕获基因序列，所述第一引物用于与基因序列中的靶标序列特异性结合；
(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；
(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
任选的，试剂盒中还包括：
(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶。
在一些实施方式中，特异性检测以下基因的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1。
在一些实施方式中，特异性检测以下基因的第一引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:16-SEQ ID NO:30所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1。
在一些实施方式中，特异性检测以下基因的第二引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:31-SEQ ID NO:45所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1。
在一些实施方式中，特异性检测以下基因的靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:46-SEQ ID NO:60所示：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1，在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括外源内标，其核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示；可选地，所述试剂盒还包括特异性检测所述外源内标的内标捕获探针、第一内标引物、第二内标引物和内标检测探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:92-SEQ ID NO:95所示，且在所述内标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：
(5)洗涤液：其含有NaCl和SDS，可选地含有5-50mM HEPES、50-500mM NaCl、0.5-1.5％ SDS、1-10mM EDTA；和/或
(6)矿物油；和/或
(7)阳性对照：分别含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1；和/或
(8)阴性对照：一不含有以下基因核酸的体系：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1；和/或
(9)阳性标准品：浓度梯度分别为102-107拷贝/μL的分别含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1；和/或
(10)标准曲线：分别针对以下基因的纵坐标为靶标dt值/内标dt值、横坐标为浓度log值的标准曲线：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1。
在一些实施方式中，所述核酸提取液的组分包括：250-800mM HEPES、4-10％十二烷基硫酸锂、1-50μΜ所述的特异性捕获探针、50-500mg/L磁珠、25-150pmol/mL所述的第一引物；可选地，所述核酸提取液的组分还包括所述的外源内标、1-50μΜ所述的内标捕获探针和25-150pmol/mL所述的第一内标引物。
在一些实施方式中，所述检测液a的组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mM NTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％ PVP40、100-750pmol/mL所述的第二引物；可选地，所述检测液a的组分还包括100-750pmol/mL所述的第二内标引物。
在一些实施方式中，所述检测液b的组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mM NTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％ PVP40、40-857pmol/mL所述的第一引物、40-857pmol/mL所述的靶标检测探针；可选地，所述检测液b的组分还包括40-857pmol/mL所述的第一内标引物和40-857pmol/mL所述的内标检测探针。
在一些实施方式中，所述SAT酶液的组分包括：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
本发明另一方面提供一种根据上述的试剂盒的膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测的序列组合，其包括：
核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、3、7、8、10，以及SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:15中之一所示的特异性捕获探针，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16、18、22、23、25，以及SEQ IDNO:26-SEQ ID NO:30中之一所示的第一引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:31、33、37、38、40，以及SEQ ID NO:41-SEQ ID NO:45中之一所示的第二引物，和核苷酸序列分别如SEQ IDNO:46、48、52、53、55，以及SEQ ID NO:56-SEQ ID NO:60中之一所示的靶标检测探针；
可选地，所述序列组合还包括：核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2、4、5、6、9所示的特异性捕获探针，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17、19、20、21、24所示的第一引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:32、34、35、36、39所示的第二引物，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:47、49、50、51、54所示的靶标检测探针；
进一步可选地，所述序列组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示的外源内标，SEQ ID NO:92所示的内标捕获探针，SEQ ID NO:93所示的第一内标引物，SEQ ID NO:94所示的第二内标引物和SEQ ID NO:95所示的内标检测探针。
本发明再一方面还提供一种基于实时荧光核酸恒温扩增检测原理的用于检测膀胱癌的生物标志物，其为以下基因的组合：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT，以及任选的GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1；或所述生物标志物为以下基因的组合：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及任选的GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1。
在一些实施方式中，上述的生物标志物在制备检测膀胱癌的试剂中的用途也属于本发明的内容，其中所述试剂用于分别特异性检测样本中CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT，以及任选的GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1；或所述试剂用于分别特异性检测样本中CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT，以及任选的GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1；可选地，所述样本包括尿液。
基于以上技术方案提供的膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒通过对CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT的mRNA(5个检测基因组合，简称5G组合)，或在以上5G组合基础上增加HOXA13、IGFBP5、CXCR2、CRH和ANXA10的mRNA(即10个检测基因组合，简称10G组合)，以及作为检测内参基因的GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1的mRNA分别进行定量检测，并对以上多个靶标基因(包括检测基因和检测内参基因，也统称基因)的检测结果进行综合分析，能够高敏感性(10G组合可达77.27％，5G组合可达94.91％)地对膀胱癌患者(包括膀胱癌初诊患者或膀胱癌复发患者)进行检测和筛查，并且阴性预测值可高达90.6％(10G组合)，优选可达96.4％(5G组合)，因此本发明的试剂盒可以检测和筛查出77.27％，甚至94.91％的阳性患者(阳性漏检少)，且在实际阴性对象中有高达90.6％，甚至96.4％的检测对象被判定为真阴性，使得这部分对象可以避免不必要的膀胱镜检查。另外，本发明试剂盒的检测样本可以为尿液(例如检测对象的随机尿液)，因此使用本发明的试剂盒对膀胱癌患者进行检测和筛查时可以采用无创采样的方式，而无需进行膀胱镜检查，进而可以避免对患者造成膀胱镜检查痛苦。另一方面，相对于上述文献1和文献2公开的PCR检测方法，本发明提供的膀胱癌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒还具有以下优点：(1)本发明确定了可适用于实时荧光核酸恒温扩增检测方法的特定检测基因组合和检测内参基因，从而能通过使用特异性的探针和引物，将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有升温、降温过程，大大缩短了扩增及检测时间(40分钟内可完成检测，甚至30分钟内可完成检测)，提高了检测效率；同时降低了对所用PCR仪的设计和生产成本；(2)本发明扩增产物为RNA，RNA在自然界中极易降解，相对PCR扩增的DNA而言，污染易控，交叉影响小。
附图说明
图1-图15分别为针对以下15个基因的组1和组2引物和探针的SAT扩增曲线：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1；其中图1-15中A幅分别表示组1的引物和探针的SAT扩增曲线，B幅分别表示组2引物和探针的SAT扩增曲线；
图16为15个基因的标准曲线，其中A-O幅分别针对以下基因：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1；
图17为15个基因的6个浓度阳性标准品中外源内标的SAT扩增曲线，其中A-O幅分别针对以下基因：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1；
图18为膀胱镜检查阳性组和阴性组中CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT的相对表达量散点图；
图19为以GAPDH为检测内参基因时，CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT分别对膀胱癌初诊患者血尿样本进行检测的ROC曲线；
图20为以GAPDH为检测内参基因时，CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT分别对膀胱癌复发患者尿液样本进行检测的ROC曲线；
图21为以GAPDH为检测内参基因时，CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT分别对膀胱癌初诊患者血尿样本和膀胱癌复发患者尿液样本进行检测的ROC曲线；
图22为以GAPDH为检测内参基因时，包含CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT的10个基因组合的诊断模型的ROC曲线；
图23为以GAPDH为检测内参基因时，包含CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT的5个基因组合的诊断模型的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明提及的所有引物、探针和体外转录RNA产物用已有技术合成。
实施例1：基于实时荧光核酸恒温扩增检测原理的用于检测膀胱癌的生物标志物的确定
为获得适于基于实时荧光核酸恒温扩增检测原理的用于检测膀胱癌的生物标志物，本发明人首先尝试利用上述文献2公开的生物标志物基因CA9、IGF2、CDK1、UBE2C、CRH、RPS21和HOXA13的组合，并基于实时荧光核酸恒温扩增检测方法对膀胱癌进行诊断和复发监测(具体方法参见以下实施例5)，然而结果表明其检测敏感性(低于70％)和阴性预测值(低于80％)均较低，可见虽然上述文献2公开的生物标志物基因的组合在基于PCR方法对膀胱癌进行诊断和复发监测时具有较高的检测敏感性和阴性预测值，但是当将这些生物标志物基因的组合用于实时荧光核酸恒温扩增检测方法中对膀胱癌进行诊断和复发监测时，不能获得令人满意的检测敏感性和阴性预测值。
为了采用实时荧光核酸恒温扩增检测方法对膀胱癌进行诊断和复发监测，并获得令人满意的诊断和复发监测结果，在该实施例中，本发明人收集了大量的临床病例信息(通过TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)中公布的转录组数据以及通过NCBI的pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)中查阅相关文献)，并从大量的与膀胱癌检测可能相关的生物标志物(例如CA9、CDK1、CTSE、DMBT1、ERBB2、HOXA13、IGF2、CXCR2、MAGEA3、MDK、MMP1、MMP12、RBP2、CCL18、SNAI2、VEGFA、MFAP5、SGK2、WFDC2、POSTN、NPFFR2、ANXA10、CTAG2、ZDHHC2、KRT20、PPP1R14D、FGD3、AHNAK2、SEMA3D、ZNF707、LOC100652931、LINC00565、BIRC5、UBE2C、CDK1、MMP11、TPX2、CDC20、MYBL2、TK1、FOXM1、CCNB1、UCA1、CRH、RPS21、CTSE、KLF9、SLC1A6、TERT、ASAM、MCM10、EBF1、CFH、CDC2、IGFBP5、和UPK1B等)中筛选出可适用于实时荧光核酸恒温扩增检测体系的、并以尿液作为样本检测膀胱癌的生物标志物，进而确定可以较高敏感性(指阳性漏检率低)地检出膀胱癌，且具有较高的阴性预测值的生物标志物组合，最终确定以CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT共10个基因为检测基因并进行适配组合，同时利用常用的GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1(即其中的任一种)作为检测内参基因(以下将检测基因和检测内参基因统称靶标基因或基因)。在适配组合中，发明人惊讶发现，如果仅使用上述10个检测基因中的5个检测基因(MDK、TERT、CDC2、IGF2、UPK1B)进行组合，可以进一步显著提高检测敏感性和阴性预测值，同时还进一步降低了检测成本。
本实施例针对检测基因(包括CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10和TERT)和检测内参基因(GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1)对待测尿液样本进行基因检测的步骤如下所示：
1.1、待测样本(检测对象的随机尿前段尿液)的收集
收集22例膀胱癌阳性患者和23例膀胱癌阴性对象的20mL随机尿中段尿液，以1:1比例加入样本保存液(其含有高浓度去垢剂，为上海仁度生物科技股份有限公司市售商品)，混匀作为待测样本，-70℃冷冻保藏。
1.2、检测样准备
分别取400μL CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1基因阳性对照(见下面详述)、上述每个基因的六个浓度阳性标准品(见下面详述)400μL、400μL阴性对照(样本保存液)、和400μL待测样本(每个待测样本取15管)分别置于样品处理管中，共781管(阳性对照15管，阳性标准品90管，阴性对照1管，待测样本675管)，备用。
1.3、核酸提取
针对1.2备用的每个样品处理管，分别进行以下操作：
(1)在样品处理管中加入100μL核酸提取液：HEPES 500mM、LLS 8％、与靶标基因对应的特异性捕获探针(见实施例2)25μΜ、105拷贝/μL外源内标(见下面详述)、内标捕获探针(见下面详述)15μΜ、磁珠150mg/L、与靶标基因对应的第一引物50pmol/mL(见实施例2)、第一内标引物(见下面详述)50pmol/mL，混匀。60℃保温10分钟，室温放置5-10分钟；
(2)将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置2-5分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES 25mM、NaCl150mM、1％SDS、EDTA 2.5mM)振荡均匀后静置2-5分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μL洗涤液和150μL矿物油，振荡均匀后静置2-5分钟，弃液体，保留磁珠；
(3)将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用。
1.4、SAT扩增检测
针对1.3备用的每个样品处理管，分别进行以下操作：
(1)向装有磁珠-核酸复合物的样品处理管中各加入40μL检测液a：Tris 15mM、MgCl2 15mM、dNTP 2.5mM、NTP 3mM、PVP40 1％、KCl 10mM、与靶标基因对应的第二引物(见实施例2)100pmol/mL、第二内标引物(见下面详述)100pmol/mL，振荡重悬磁珠；
(2)取振荡混匀的上述40μL反应检测液a加至洁净微量反应管，向每个反应管中加入50μL矿物油，42℃5-10min。向微量反应管中加入25μL SAT酶液(事先42℃条件下预热，含有M-MLV反转录酶60000U/mL、T7 RNA聚合酶40000U/mL、10mM HEPES pH7.5、15mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mM zinc acetate(乙酸锌)、20mMtrehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0、80mM KCl、0.25mM EDTA、0.5％(v/v)TritonX-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇))，42℃5-10min；
(3)向微量反应管中加入35μL的检测液b：Tris 15mM、MgCl2 15mM、dNTP 2.5mM、NTP 3mM、PVP40 1％、KCl 10mM、与靶标基因对应的第一引物45pmol/mL、第一内标引物45pmol/mL、与靶标基因对应的靶标检测探针(见实施例2)45pmol/mL、内标检测探针(见下面详述)45pmol/mL，将反应管快速转至恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；荧光素通道选择FAM、HEX通道。
上述步骤1.3和1.4中涉及的分别针对各靶标基因的各特异性捕获探针、第一引物、第二引物和靶标检测探针为以下实施例2中确定的，参见实施例2的详细描述。
该实施例中梯度浓度的阳性标准品和阳性对照的制备方式包括以下步骤：
(a)用化学合成法分别合成CDC2(GenBank：NM_033379.5)、HOXA13(GenBank：NM000522.5)、MDK(GenBank：NM002391.6)、IGFBP5(GenBank：NM000599.4)、CXCR2(GenBank：NM_001168298.2)、CRH(GenBank：NM_000756.4)、IGF2(GenBank：NM_001007139.6)、UPK1B(GenBank：NM_006952.4)、ANXA10(GenBank：NM_007193.5)、TERT(GenBank：NM_001193376.3)、GAPDH(GenBank：NM_001289745.3)、PKG1(GenBank：NM_001374782.1)、PPIA(GenBank：NM_001300981.2)、UBC(GenBank：NM_021009.7)和ABL1(GenBank：NM_005157.6)基因片段；
(b)将步骤(2.1)合成的各基因片段分别克隆到-T载体中，构建各自的阳性质粒；
(c)将各个阳性质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为-T-BCA菌株，贮存于-70℃；
(d)从对应各个基因的-T-HBV菌株中提取/>-T-BCA质粒，将提取的质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定体外转录RNA。RNA浓度用NanoDrop 2000分光光度计分析，其OD260值在1.8-2.0之间表示RNA纯度较好；
(e)将CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1各个基因转录RNA的高浓度标准品进行紫外分光光度计定量后，分别稀释至102-107拷贝/μL的浓度，作为阳性标准品，上述步骤1.3中以105拷贝/μL阳性标准品作为阳性对照。
外源内标及其引物和探针：
比照以上步骤(a)-(e)制备外源内标，该外源内标的核苷酸序列如SEQ ID NO：91所示。基于该外源内标的序列，设计了针对该外源内标的适用于实时荧光核酸恒温扩增检测体系的引物和探针，包括内标捕获探针、第一内标引物、第二内标引物和内标检测探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：92-SEQ ID NO：95所示。该外源内标是体外转录的RNA，其不具有生物学活性，可以用于质控检测样在提取、扩增和检测期间的变化差异(外源内标扩增一致性越好，说明检测样在提取、扩增过程中一致性越高)。
1.5、结果判定
1.5.1、标准曲线的绘制
如图1-图15中的A幅分别示出了CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1的六个浓度阳性标准品的SAT(实时荧光核酸恒温)扩增曲线，横坐标表示时间，纵坐标表示相对荧光强度，可见针对每个基因的每个浓度阳性标准品的扩增效果均良好，根据这些扩增曲线由仪器自动读取dt值。横坐标为浓度的log值分别绘制针对每个基因(CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1)的标准曲线，结果如图16所示，其中A-O幅分别表示针对CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1的标准曲线。图17中A-O幅分别表示针对外源内标的SAT扩增曲线，可见外源内标在每个浓度的标准品中的扩增一致性良好，且重复性好，表明每个浓度的阳性标准品在提取、扩增过程中一致性良好。
1.5.2、待测样本中CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT的相对表达量的计算
根据以上步骤1.5.1绘制的标准曲线，计算待测样本中CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT与内参基因的相对表达量。需要去除其中任一内参基因定量值小于1000拷贝/反应(相当于2500拷贝/mL)的待测样本，以确保待测样本中具有足够的脱落细胞。在该实施例中有效待测样本为45例，分别计算阳性样本(22例)和阴性样本(23例)中CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT的相对表达量，结果分别在图18中A-J幅中示出(内参基因以GAPDH为例)，可见以上10种检测基因的相对表达量在阳性样本和阴性样本中均具有显著性差异，证实这10种检测基因对膀胱癌检测和诊断均具有临床意义，因此可用于对膀胱癌进行诊断和复发监测。
实施例2：用于实时荧光核酸恒温扩增检测膀胱癌的专用引物和探针的设计
基于以上实施例1确定的用于检测前列腺癌的生物标志物(包括CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT共10个检测基因，以及作为检测内参基因的GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1)，该实施例设计并确定了针对以上这些生物标志物基因的且适用于实时荧光核酸恒温扩增检测体系的引物和探针。其中针对以上每个基因共设计了15组引物和探针组合，并分别以CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1mRNA的阳性标准品(每个基因的核酸体外转录RNA标准品，浓度分别为：102-107拷贝/μL，共六个浓度梯度，以上实施例1制备获得)为模板验证这15组引物探针的检测敏感性和特异性效果，从中确定分别用于检测以上15个基因的对应的最佳引物和探针组合。作为示例，以下表1和表2针对每个基因列出了其中的2组，组1(表1)列出的是针对各基因的最佳引物和探针组合，组2(表2)显示针对各基因的对照组合(在组1和组2中，针对相同的基因使用相同的捕获探针和靶标检测探针)，并分别以CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1mRNA的阳性标准品为模板验证这2组引物探针的检测敏感性效果。
表1：组1针对不同检测膀胱癌的生物标志物基因的引物和探针
基因 特异性捕获探针的核苷酸序列 序列编号
CDC2 ATCATAGATTAACATTTTCGATTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:1
HOXA13 TAACCCTCCTGTTCTGGAACTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:2
MDK GGAGGGCGTGGGCCAGGCCTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:3
IGFBP5 GTTGCTGCTGTCGAAGGTGTGGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:4
CXCR2 TCCAGCCATTCACCTTGGAGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:5
CRH GGCGGGCGAAAGGGGAGCGGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:6
IGF2 TTGGAAGAACTTGCCCACTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:7
UPK1B GCAAATCCAAACCAGGCAACTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:8
ANXA10 GAATTGCACTATATAATCTATATTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:9
TERT GTGGCTCTTGAAGGCCTTGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:10
GAPDH TTGACTCCGACCTTCACCTTCCCCATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:11
PKG1 CATGGCTGAGATCCTGGATGTCTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:12
PPIA CGGCGGTGGCGTCTGCAAAACTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:13
UBC TGCAGGGTAGACTCTTTCTGGATTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:14
ABL1 CTCTTTTCGAGGGAGCAATGGAGACATTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:15
第一引物的核苷酸序列 序列编号
CDC2 CCTCCTGGTCAGTACATGGATTC SEQ ID NO:16
HOXA13 CCCCACCTCTGGAAGTCCACTCT SEQ ID NO:17
MDK CACCCTGAAGAAGGCGCGCTACA SEQ ID NO:18
IGFBP5 CAGCCCACGCATGGTGCCCCGTG SEQ ID NO:19
CXCR2 ACATCGGTGGCCACTCCAATAAC SEQ ID NO:20
CRH TCAGAGACCAAGTCCATTGA SEQ ID NO:21
IGF2 ATGCAGACACCAATGGGAATCC SEQ ID NO:22
UPK1B GCCTCGTCAATGCTGTGTTA SEQ ID NO:23
ANXA10 GGAGTAGGCACTGATGAGAA SEQ ID NO:24
TERT TGTACTTTGTCAAGGTGGATGTG SEQ ID NO:25
GAPDH TGACCCCTTCATTGACCTCAAC SEQ ID NO:26
PKG1 GGACAGGACTCATCAAGCATA SEQ ID NO:27
PPIA TAACAGATTGGAGGTAGTAGCA SEQ ID NO:28
UBC CGTGAAGACTCTGACTGGTAA SEQ ID NO:29
ABL1 AGGTCTATGAACTCATGCGA SEQ ID NO:30
第二引物的核苷酸序列 序列编号
CDC2 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAAAAGTGGTTTCTTAGTTGCT SEQ ID NO:31
HOXA13 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGTCCTTAGTAATGAATTTATTC SEQ ID NO:32
MDK AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGTCCTTTCCCTTCCCTTTCTT SEQ ID NO:33
IGFBP5 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAAGGTTTGCACTGCTTTCTCTT SEQ ID NO:34
CXCR2 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATCCATTTTTGAGGTAAACTTAAA SEQ ID NO:35
CRH AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGAGGTTGTCTTCCTTTCT SEQ ID NO:36
IGF2 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAATGCAGCACGAGGCGAAG SEQ ID NO:37
UPK1B AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTGGACCAGAGATCAGTTCAT SEQ ID NO:38
ANXA10 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCTTGGAGGTTATTGCTGT SEQ ID NO:39
TERT AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAACGCAGTACGTGTTCTGG SEQ ID NO:40
GAPDH AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGGA SEQ ID NO:41
PKG1 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTCAAGGACATCAGCAAGCT SEQ ID NO:42
PPIA AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATCTAAGGAACAGCAAGCACT SEQ ID NO:43
UBC AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCTTGACATTCTCGATGGT SEQ ID NO:44
ABL1 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATACTGGATTCCTGGAACATT SEQ ID NO:45
靶标检测探针的核苷酸序列 序列编号
CDC2 GGGCUCUCCAGAAGUAUUGCCC SEQ ID NO:46
HOXA13 CGUGGUCUCCCAUCCCUCGCCACG SEQ ID NO:47
MDK GAGGUGCGUGUGAUGGGGGCCUC SEQ ID NO:48
IGFBP5 GGUGGAGAGAAAGCAGUGCAAACCACC SEQ ID NO:49
CXCR2 GGACCACCACUCCAAUAACAGCAGGUCC SEQ ID NO:50
CRH GGAGGAAGAGAGGAGAGAAAGACCUCC SEQ ID NO:51
IGF2 CGACGAUGCUGGUGCUUCUCGUCG SEQ ID NO:52
UPK1B CCUCCUGGAGGCUUGUAAACUAGGAGG SEQ ID NO:53
ANXA10 CCACCAAGAACAAAUGGAGAAAUGGUGG SEQ ID NO:54
TERT CCAGGUGACGGGCGCGUACCUGG SEQ ID NO:55
GAPDH CCCUUGUUCCAAUAUGAUUCCACCCAAGGG SEQ ID NO:56
PKG1 CCUCCUUCCAACAUUCCAGAGGAGG SEQ ID NO:57
PPIA CCUCCAUUACAAGUGACUAAGGAGG SEQ ID NO:58
UBC CCUCCUCGAGGUUGAGCCCAGGAGG SEQ ID NO:59
ABL1 CCUCCUGACCGGCCCUCCUUGGAGG SEQ ID NO:60
表2：组2针对不同检测膀胱癌的生物标志物基因的引物和探针
第一引物的核苷酸序列 序列编号
CDC2 TTAAGGTAGTAACACTCTGGTA SEQ ID NO:61
HOXA13 CGCTGCCCAACGGCTGGAAC SEQ ID NO:62
MDK GGCGCGCTACAATGCTCAGTGCC SEQ ID NO:63
IGFBP5 CCGTGCTGTGTACCTGCCCAATTG SEQ ID NO:64
CXCR2 TTTCCTGTCTAACAGCTCTGACT SEQ ID NO:65
CRH GAGAAACTCAGAGACCAAGT SEQ ID NO:66
IGF2 AGACGCACCCCGGTGAG SEQ ID NO:67
UPK1B GATGCTGACTATCCCTGGCCTC SEQ ID NO:68
ANXA10 TGATGCTCATGAGCTCTGGCA SEQ ID NO:69
TERT TGTACTTTGTCAAGGTGGATGTG SEQ ID NO:70
GAPDH TTGCCATCAATGACCCCTTCATTGACC SEQ ID NO:71
PKG1 AAACAATAATGATGAGGA SEQ ID NO:72
PPIA AGCTATGTTAACAGATTG SEQ ID NO:73
UBC GATCGTCACTTGACAATGC SEQ ID NO:74
ABL1 CGAGCATGTTGGCAGTGGAA SEQ ID NO:75
第二引物的核苷酸序列 序列编号
CDC2 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGTTGCTAGTTCAGCAAATATG SEQ ID NO:76
HOXA13 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCTCCTATAGGAGCTGGC SEQ ID NO:77
MDK AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGCTTTGGCCTTTGCTTTGGT SEQ ID NO:78
IGFBP5 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCACGGGAAGGTTTGCACTGCT SEQ ID NO:79
CXCR2 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGTCGCTGGGCTTTTCACCTGT SEQ ID NO:80
CRH AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGCACTCGCTTCCCAGGC SEQ ID NO:81
IGF2 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGTCTCACTGGGGCGGT SEQ ID NO:82
UPK1B AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAGGCGTGTCGGTTCATTG SEQ ID NO:83
ANXA10 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTTATTCAGAGACCTCAG SEQ ID NO:84
TERT AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTCATCGCCAGCATCATCAAACCC SEQ ID NO:85
GAPDH AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTTGGAGGGATCTCGCTCCTGGAAG SEQ ID NO:86
PKG1 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGTCTCTTCAAGGACA SEQ ID NO:87
PPIA AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCAAACAGAAGGCAA SEQ ID NO:88
UBC AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGCCTCTGCTGGTCAGGAG SEQ ID NO:89
ABL1 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTGTTTCAAAGGCTTGGTGGATT SEQ ID NO:90
利用上述表1和表2的两组引物和探针(组1和组2)分别对上述实施例1制备的各个基因的阳性标准品(浓度分别为107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL)进行实时荧光核酸恒温扩增检测(具体检测方法如以上实施例1所述)。
结果如图1-图15所示，其中图1-图15中A幅分别表示针对CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1的组1的引物和探针的扩增曲线(“S”型曲线从左到右分别表示浓度107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL)，图1-图15中的B幅分别表示针对CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1的组2的引物和探针的扩增曲线。可见，针对CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1中任一个基因，组1的引物和探针的检测敏感性均明显优于组2的引物和探针的检测敏感性，随后还对组1的引物和探针的特异性进行检测，结果均表明特异性良好，因此针对上述的15个基因，均确定组1所示的引物和探针分别用于对各个基因进行实时荧光核酸恒温扩增检测。以上实施例1使用的是组1的引物和探针，以下实施例中也均使用组1的引物和探针。
实施例3：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT检测基因与膀胱癌初诊患者的相关性分析
该实施例利用上述实施例1确定的用于检测膀胱癌的检测基因(10G组合)和实施例2确定的分别针对每一基因的引物和探针(组1的引物和探针)对膀胱癌临床尿液样本(53例膀胱癌初诊血尿患者(10例阳性，43例阴性))进行SAT定量检测，获得每个检测基因在临床尿液样本中的相对表达量。具体检测方法如上述实施例1所述，一个尿液样本分成11份分别检测，并分别按照以下方法计算每个检测基因的评分值(以GAPDH作为检测内参基因作为示例)，以分析以上10个检测基因与膀胱癌初诊患者的相关性：
CDC2评分＝CDC2拷贝数/GAPDH拷贝数；HOXA13评分＝HOXA13拷贝数/GAPDH拷贝数；MDK评分＝MDK拷贝数/GAPDH拷贝数；IGFBP5评分＝IGFBP5拷贝数/GAPDH拷贝数；CXCR2评分＝CXCR2拷贝数/GAPDH拷贝数；CRH评分＝CRH拷贝数/GAPDH拷贝数；IGF2评分＝IGF2拷贝数/GAPDH拷贝数；UPK1B评分＝UPK1B拷贝数/GAPDH拷贝数；ANXA10评分＝ANXA10拷贝数/GAPDH拷贝数；TERT评分＝TERT拷贝数/GAPDH拷贝数。
结果如下表3所示，为利用以上10个检测基因对膀胱癌初诊血尿样本(临床尿液样本)检测的相关性分析结果，图19中A-J示出了每个检测基因的ROC曲线，显示出以上10个检测基因对膀胱癌均具有显著的诊断价值，其中，当以GAPDH内参时：CDC2、HOXA13、MDK、CRH、IGF2、UPK1B、TERT与膀胱癌相关性呈高表达量；其中，MDK基因具有90％敏感性及93.3％的阴性预测值；CDC2、HOXA13、IGF2、TERT0基因也具备80％的敏感性及90％以上的阴性预测值；UPK1B虽然仅有50％的敏感性，但其具有93％的高特异性，可以搭配高敏感性基因进行组合，进而提高整体的诊断效果。而IGFBP5、CXCR2、ANXA10与膀胱癌相关性呈低表达量，敏感性和阴性预测值均可达70％以上。因此，在膀胱癌初诊患者中，CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT这10个检测基因组合时，可具备良好的综合诊断效果。
表3：10个检测基因对膀胱癌初诊的相关性分析结果
实施例4：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT检测基因与膀胱癌复发监测的相关性分析
该实施例利用上述实施例1确定的用于检测膀胱癌的检测基因(10G组合)和实施例2确定的分别针对每一基因的引物和探针(组1的引物和探针)对57例膀胱癌复发监测患者(12例阳性(复发)，45例阴性(未复发))进行SAT定量检测，获得每个检测基因在临床尿液样本中的相对表达量。具体检测方法如上述实施例1所述，一个尿液样本分成11份分别检测，具体评分方法参见实施例3(以GAPDH作为检测内参基因作为示例)，以分析以上10个检测基因与膀胱癌复发患者的相关性。
结果如下表4所示，为利用以上10个检测基因对膀胱癌复发监测的相关性分析结果，图20中A-J示出了每个检测基因的ROC曲线，显示出以上10个检测基因对膀胱癌复发均具有显著的诊断价值，其中，当以GAPDH内参时：CDC2、HOXA13、MDK、CRH、IGF2、UPK1B、TERT与膀胱癌相关性呈高表达量；其中，MDK基因具有91.67％敏感性及91.7％的阴性预测值；CDC2、HOXA13、IGF2、TERT基因也具备约80％的敏感性及90％以上的阴性预测值；UPK1B虽然仅有41.67％的敏感性，但其具有91.1％的高特异性，可以搭配高敏感性基因进行组合，进而提高整体的监测效果。而IGFBP5、CXCR2、ANXA10与膀胱癌相关性呈低表达量，虽然敏感性较低，但阴性预测值较高。因此，在膀胱癌监测复发患者中，CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT这10个检测基因组合时，可具备良好的复发监测效果。
表4：10个检测基因对膀胱癌复发监测的相关性分析结果
实施例5：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT检测基因对膀胱癌(包括初诊和复发监测)的诊断模型的建立和优化
该实施例利用上述实施例1确定的用于检测膀胱癌的检测基因(10G组合)和实施例2确定的分别针对每一检测基因的引物和探针(组1的引物和探针)对实施例3使用的膀胱癌初诊尿液样本(包括53例膀胱癌初诊血尿患者(10例阳性，43例阴性)和实施例4使用的57例膀胱癌复发监测尿液样本(12例阳性，45例阴性)进行SAT定量检测，获得每个检测基因在临床尿液样本中的相对表达量。上述文献1和文献2公开了CA9 mRNA也可以作为检测膀胱癌的生物标志物基因，因此在该实施例中也使用针对该基因(CA9)的引物和探针对其在临床样本(膀胱癌初诊尿液样本和膀胱癌复发监测尿液样本)中的相对表达量进行检测，针对CA9(GenBank：NM_001216.3)的特异性捕获探针、第一引物、第二引物和靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：96-99所示。具体检测方法如上述实施例1所述，一个尿液样本分成12份分别检测，具体评分方法参见实施例3，以分析以上11个检测基因与膀胱癌初诊和复发监测的相关性，结果如图21(A-J示例性示出了检测基因(CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT)的ROC曲线)和下表5所示，显示出以上11个检测基因对膀胱癌初诊和复发监测均具有显著的诊断价值。
表5：11个检测基因对膀胱癌初诊和复发监测的相关性分析结果
利用Logistic回归法建立以上11个检测基因的评分值回归模型，利用综合评分公式计算综合评分值。其中：
(1)联合CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT这10个检测基因(以GAPDH作为内参基因为例)(命名为诊断模型1)的综合评分计算公式为：
0.048*MDK+0.051*TERT-0.049*HOXA13+CDC2*0.039-0.004*IGFBP5+0.03*CRH+0.049*IGF2-0.018*ANXA10+0.033*UPK1B+0.012*CXCX2-5.103。
(2)联合CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、CA9这10个检测基因(以GAPDH作为内参基因为例)(命名为诊断模型2)的综合评分计算公式为：
0.063*MDK-0.13*CA9-0.05*HOXA13+CDC2*0.039-0.021*IGFBP5+0.032*CRH+0.05*IGF2-0.027*ANXA10+0.001*UPK1B+0.004*CXCX2-4.828。
利用SPSS(版本21.0)进行统计分析。将临床金标准膀胱镜检测结果和以上11个检测基因的综合评分值通过受试者工作特征(ROC)曲线用来评估上述两个诊断模型的敏感性、特异性、阴性预测值及阳性预测值，确定最终cutoff值。cutoff值能作为膀胱癌患者的诊断数值。其中：
敏感度(SE)＝肿瘤患者中高于截断值的样本例数/患者样本例数；
特异度(SP)＝肿瘤患者中低于截断值的样本例数/对照样本例数；
阳性预测值(PPV)＝肿瘤患者中高于截断值的样本例数/高于截断值的所有样本例数；
阴性预测值(NPV)＝肿瘤患者中低于截断值的样本例数/低于截断值的所有样本例数；
准确度＝(肿瘤患者中高于截断值的样本例数+肿瘤患者中低于截断值的样本例数)/所有样本例数。
结果如下表6所示，为诊断模型1和诊断模型2的统计分析结果，可见相对于诊断模型2，诊断模型1中10个检测基因的组合的诊断模型最佳，其示例性ROC曲线如图22所示，可见该诊断模型1的AUC为0.777(95％CI：0.688-0.851)，诊断膀胱癌的敏感性(Sensitivity，SE)、特异性(Specificity，SP)、阳性预测值(positive predictive value，PPV)、阴性预测值(negetive predictive value，NPV)分别为77.27％、54.55％、29.8％和90.6％，具有较高的检测敏感性和阴性预测值，可以检测出77.27％的阳性患者，并且可在所有实际阴性对象中判定90.6％的检测对象为真阴性结果，从而避免绝大多数阴性对象经历不必要的膀胱镜检查。然而，诊断模型2中的10个检测基因模型会导致AUC面积有所降低(0.771(95％CI：0.681-0.846))，敏感性(72.73％)、特异性(46.59％)、阳性预测值(25.4％)和阴性预测值(87.2％)也均明显下降，导致整体诊断效果明显下降。因此，本发明确定使用上述诊断模型1中的10个检测基因(包括CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT)的组合模型对膀胱癌进行检测和筛查，其具有较高的敏感性和阴性预测值，可以检出77.27％的阳性患者，并且可以避免实际阴性对象中90.6％的检测对象经历不必要的膀胱镜检查，而且这些检测基因的组合(10G组合)适用于实时荧光恒温扩增检测体系，能够快速获得检测结果，且能够有效降低检测成本，降低患者的经济负担。依据该诊断模型1确定其最佳截断值(cutoff)为0.08246，即：大于0.08246时为阳性样本；小于等于0.08246时为阴性样本。
表6：不同检测基因组合对膀胱癌诊断的综合统计分析结果
实施例6：联合MDK、TERT、CDC2、IGF2、UPK1B检测基因对膀胱癌(初诊和复发)进行诊断的模型的优化
该实施例中，为了进一步提高膀胱癌诊断模型的检测敏感性和阴性预测值，发明人还利用Logistic回归法对上述实施例5中确定的诊断模型1中包括的10个检测基因(CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT)进行了不同的组合和综合统计分析，结果惊讶发现当仅组合使用MDK、TERT、CDC2、IGF2、UPK1B这5个检测基因时(利用Logistic回归法建立以上5个检测基因的评分值回归模型如下：0.051*MDK+0.048*TERT+0.022*CDC2+0.067*IGF2+0.011*UPK1B-1.05)，得到的膀胱癌诊断模型(命名为诊断模型3)对膀胱癌的诊断和复发监测效果显著提高，其统计分析结果如下表7所示，示例性ROC曲线如图23所示，可见该诊断模型3具有94.91％的敏感性和96.4％的阴性预测值，可以检出94.91％的阳性患者，并且可在所有实际阴性对象中判定96.4％的检测对象为真阴性结果，从而更有利于避免绝大多数阴性对象经历不必要的膀胱镜检查。如下表7所示，还示出了另外一组包括5个检测基因(HOXA13、IGFBP5、CXCR2、CRH、ANXA10)的诊断模型(命名为诊断模型4)的综合统计分析结果(利用Logistic回归法建立以上5个生物标志物基因的评分值回归模型如下：
-0.07*HOXA13-0.59*IGFBP5-0.03*CXCR2+0.36*CRH-0.3*ANXA10-1.094)
然而，该诊断模型4的诊断效果(敏感性为77.27％，阴性预测值为87.2％)不仅相对于诊断模型1略有下降，更是明显差于诊断模型3的诊断效果。因此，本发明确定使用上述诊断模型3中的5个检测基因(包括MDK、TERT、CDC2、IGF2、UPK1B)的组合模型对膀胱癌进行检测和筛查，其具有较高的敏感性和阴性预测值，可以检出94.91％的阳性患者，并且可以避免实际阴性对象中96.4％的检测对象经历不必要的膀胱镜检查，而且相对于上述实施例5确定的包括10个检测基因的诊断模型1，该诊断模型3中仅包括5个检测基因，因此可以进一步降低检测成本。依据该模型确定其最佳截断值(cutoff)为0.15783，即：大于0.15783时为阳性样本；小于等于0.15783时为阴性样本。
表7：诊断模型3和诊断模型4对膀胱癌诊断的综合统计分析结果
实施例7：实时荧光核酸恒温扩增检测膀胱癌的试剂盒
根据以上实施例5和6的结果可知，包括10个检测基因(CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT)的诊断模型1和包括5个检测基因(MDK、TERT、CDC2、IGF2、UPK1B)的诊断模型3均可以用于对膀胱癌进行诊断和复发监测，且均具有较好的诊断效果。并且联合应用以上这些生物标志物检测膀胱癌时，可以使用尿液(例如随机尿液前段尿)作为检测样本，而无需对患者进行膀胱镜检查，从而便于大规模人群体检，并减轻或避免由膀胱镜等检查手段带来的疼痛。基于此，该实施例提供了一种基于实时荧光核酸恒温扩增检测原理的膀胱癌检测试剂盒，其可包括：
(5.1)基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测以下检测基因的试剂：MDK、TERT、CDC2、IGF2、UPK1B，或还包括进一步特异性检测以下检测基因的试剂：HOXA13、IGFBP5、CXCR2、CRH、ANXA10；任选地，所述试剂盒还包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的特异性检测人GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1基因的试剂，所述人GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1基因作为检测内参基因。具体地，针对以上每一种基因的特异性检测试剂包括与该种基因对应的：
(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获基因序列，所述第一引物用于与基因序列中的靶标序列特异性结合；
(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；
(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
还可包括：
(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶。
更具体地，特异性检测CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1基因的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15所示，第一引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:16-SEQ ID NO:30所示，第二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:45所示，靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:46-SEQ ID NO:60所示，且在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团；
更进一步具体地，该实施例提供的针对以上每一种基因的特异性检测试剂包括：
(1)核酸提取液，其组分包括：250-800mM HEPES、4-10％十二烷基硫酸锂、1-50μΜ所述的特异性捕获探针、50-500mg/L磁珠、25-150pmol/mL所述的第一引物；可选地，所述核酸提取液的组分还包括所述的外源内标、1-50μΜ所述的内标捕获探针和25-150pmol/mL所述的第一内标引物；
(2)检测液a，其组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mMNTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％ PVP40、100-750pmol/mL所述的第二引物；可选地，所述检测液a的组分还包括100-750pmol/mL所述的第二内标引物；
(3)检测液b，其组分包括：10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mMNTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％ PVP40、40-857pmol/mL所述的第一引物、40-857pmol/mL所述的靶标检测探针；可选地，所述检测液b的组分还包括40-857pmol/mL所述的第一内标引物和40-857pmol/mL所述的内标检测探针；
(4)SAT酶液，其组分包括：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
其中涉及的外源内标的核苷酸序列可如SEQ ID NO:91所示，特异性检测所述外源内标的内标捕获探针、第一内标引物、第二内标引物和内标检测探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:92-95所示，且在所述内标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
为了检测方便和/或准确，该实施例提供的试剂盒还包括以下成分(5.2)-(5.8)中的一种或多种：
(5.2)洗涤液：其含有NaCl和SDS，可选地含有5-50mM HEPES、50-500mM NaCl、0.5-1.5％ SDS、1-10mM EDTA。
(5.3)矿物油：用于磁珠有机相清洗。
(5.4)阳性对照：含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1，如实施例1制备。
(5.5)阴性对照：一不含有以下基因核酸的体系：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT、GAPDH、PKG1、PPIA、UBC和ABL1，例如去离子水或样本保存液(其含有高浓度去垢剂和生理盐水)。
(5.6)阳性标准品：浓度梯度分别为102-107拷贝/μL的分别含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1，如实施例1制备。
(5.7)标准曲线：分别针对以下基因的纵坐标为靶标dt值/内标dt值、横坐标为浓度的log值的标准曲线：CDC2、HOXA13、MDK、IGFBP5、CXCR2、CRH、IGF2、UPK1B、ANXA10、TERT，以及GAPDH、PKG1、PPIA、UBC或ABL1，如实施例1绘制。
(5.8)结果判定说明书
若以GAPDH为检测内参基因时，当使用本发明提供的试剂盒检测临床尿液样本获得的10基因联合综合评分大于0.08246时，判定为膀胱癌阳性样本；综合评分小于或等于0.08246时，判定为膀胱癌阴性样本。
若以GAPDH为检测内参基因时，当使用本发明提供的试剂盒检测临床尿液样本获得的5基因联合综合评分大于0.15783时，判定为膀胱癌阳性样本；综合评分小于或等于0.15783时，判定为膀胱癌阴性样本。
实施例8：临床样本验证
利用上述实施例7提供的试剂盒和判定标准，分别对30份膀胱癌初诊(血尿)或复发监测患者临床尿液样本(膀胱镜检查显示这些样本包括6例阳性样本和24例阴性样本)进行实时荧光核酸恒温扩增检测，以验证本发明提供的试剂盒的可靠性。具体检测方法参见实施例1，对每一生物标志物基因分别进行检测，检测结果如下表8所示(仅示例性示出了以GAPDH为检测内参基因的5检测基因(MDK、TERT、CDC2、IGF2、UPK1B)组合的检测结果)，表9为对表8检测结果的统计分析结果。可见本发明提供的试剂盒对膀胱癌临床实际检测的敏感性为100％(6/6)，特异性为75％(18/24)，阴性预测值为100％(18/18)，阳性预测值为50％(6/12)，表明本发明提供的试剂盒在临床实际检测膀胱癌方面具有极高的敏感性和阴性预测值，可以大大减少膀胱癌初诊阴性患者不必要的膀胱镜检测或降低复发监测患者的膀胱镜检查频率，降低了检查患者的经济压力和身心负担。
表8：30份膀胱癌初诊(血尿)或复发监测患者临床样本的检测结果
表9：临床样本验证结果
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应属于本发明的内容。

Claims (9)

1.一种检测生物标志物组合的试剂在制备检测膀胱癌的试剂盒中的用途，其特征在于，所述生物标志物组合为以下基因的组合：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B 和TERT，以及GAPDH；其中所述GAPDH作为检测内参基因。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括基于实时荧光核酸恒温扩增方法的分别特异性检测所述生物标志物组合中各基因的试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，针对每一种基因的特异性检测试剂包括与该种基因对应的：
（1）核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述特异性捕获探针用于捕获基因序列，所述第一引物用于与基因序列中的靶标序列特异性结合；
（2）检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；
（3）检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒中还包括：
（4）SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，
特异性检测以下基因的特异性捕获探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO: 11所示：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B、TERT和GAPDH；
特异性检测以下基因的第一引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO: 26所示：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B、TERT和GAPDH；
特异性检测以下基因的第二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO: 41所示：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B、TERT和GAPDH；
特异性检测以下基因的靶标检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 46、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO: 56所示：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B、TERT和GAPDH，在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括外源内标，其核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示；
所述试剂盒还包括特异性检测所述外源内标的内标捕获探针、第一内标引物、第二内标引物和内标检测探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 92-SEQ ID NO: 95所示，且在所述内标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括：
（5）洗涤液：其含有5-50 mM HEPES、50-500 mM NaCl、0.5-1.5% SDS、1-10 mM EDTA；和/或
（6）矿物油；和/或
（7）阳性对照：分别含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT，以及GAPDH；和/或
（8）阴性对照：一不含有以下基因核酸的体系：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT，以及GAPDH；和/或
（9）阳性标准品：浓度梯度分别为102-107拷贝/μL的分别含有以下基因核酸的体外转录RNA的体系：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT，以及GAPDH；和/或
（10）标准曲线：分别针对以下基因的纵坐标为靶标dt值/内标dt值、横坐标为浓度log值的标准曲线：CDC2、MDK、IGF2、UPK1B和TERT，以及GAPDH。
8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，
所述核酸提取液的组分包括：250-800 mM HEPES、4-10% 十二烷基硫酸锂、1-50 μΜ所述的特异性捕获探针、50-500 mg/L磁珠、25-150 pmol/mL所述的第一引物；
所述检测液a的组分包括：10-50 mM Tris、5-40 mM KCl、10-40 mM MgCl2、1-20 mMNTP、0.1-10 mM dNTPs、1-10% PVP40、100-750 pmol/mL所述的第二引物；
所述检测液b的组分包括：10-50 mM Tris、5-40 mM KCl、10-40 mM MgCl2、1-20 mMNTP、0.1-10 mM dNTPs、1-10% PVP40、40-857 pmol/mL所述的第一引物、40-857 pmol/mL所述的靶标检测探针；
SAT酶液的组分包括：16000-160000 U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000 U/mL的RNA聚合酶、2-10 mM HEPES pH7.5、10-100 mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4 mM乙酸锌、10-100 mM海藻糖、40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40-200 mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、v/v为0.1-1%的Triton X-100和v/v为20-50%的甘油。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述核酸提取液的组分还包括：外源内标、1-50 μΜ内标捕获探针和25-150 pmol/mL第一内标引物；
所述检测液a的组分还包括：100-750 pmol/mL第二内标引物；
所述检测液b的组分还包括：40-857 pmol/mL第一内标引物和40-857 pmol/mL内标检测探针；
其中所述外源内标、内标捕获探针、第一内标引物、第二内标引物和内标检测探针均为权利要求6中所述及的。
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