CN114657253A - 一种膀胱癌检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种膀胱癌检测试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种膀胱癌检测试剂盒，所述试剂盒包括检测circZFR的检测试剂。本发明先通过环状RNA表达谱分析发现环状RNA cZFR为在膀胱癌干细胞中表达量升高最显著的环状RNA，并且和患者预后显著相关，然后通路离心检测膀胱癌病人尿液外泌体相比正常人尿液外泌体中环状RNA cZFR表达显著升高。可见，本发明确定环状RNA cZFR作为膀胱癌复发的临床诊断与治疗靶标的潜在应用价值，为预防膀胱癌复发提供新的理论依据。

Description

一种膀胱癌检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种膀胱癌检测试剂盒及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
膀胱癌(Bladder Cancer，BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，是世界范围内严重危及生命健康的恶性肿瘤之一。膀胱镜检查和细胞学检查是目前膀胱癌诊断的主要技术，但前者是有创检查且费用高，后者的敏感性低。经尿道膀胱肿瘤切除术(TUR-BT)可同时做到膀胱癌的诊断、治疗，并明确病理分期，是治疗膀胱癌的首选术式，但患者TUR-BT术后复发率极高，有10～70％的患者会在1年内复发，术后5年内有24～84％的病人复发，其中部分病例伴有肿瘤恶性程度增加或浸润能力增强，严重影响患者的生存期。因此，如何降低膀胱癌患者术后复发风险、延长其生存期，一直是临床关注的重点。
已有研究表明膀胱癌组织中存在肿瘤干细胞亚群在肿瘤复发中发挥重要作用，肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell,CSC)又称为肿瘤起始细胞(Tumor Initiative Cell，TIC)，是肿瘤中的一少部分细胞，这类细胞具有自我更新和分化为肿瘤全部亚群的能力。因此，通过对膀胱癌干细胞干性调节机制的研究，正确认识膀胱癌干性维持的条件，对于监测膀胱癌复发，以及时采取针对性的干预措施预防膀胱癌复发，提高膀胱癌患者生存率至关重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种膀胱癌检测试剂盒，所述试剂盒包括检测circZFR的检测试剂。
在本发明的一种实施方式中，所述circZFR的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
在本发明的一种实施方式中，所述检测circZFR的检测试剂包括靶向circZFR的特异性引物对；所述靶向circZFR的特异性引物对由核苷酸序列为SEQ ID NO.2的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.3的下游引物组成。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的检测对象为尿液外泌体。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒用于膀胱癌的诊断和复发监控。
本发明还提供了检测circZFR的检测试剂在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述circZFR的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
在本发明的一种实施方式中，所述检测circZFR的检测试剂包括靶向circZFR的特异性引物对；所述靶向circZFR的特异性引物对由核苷酸序列为SEQ ID NO.2的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.3的下游引物组成。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的检测对象为尿液外泌体。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒用于膀胱癌的诊断和复发监控。
本发明还提供了一种在膀胱癌病人尿液中检测膀胱癌相关标志物的方法，包括如下步骤：
步骤一：从膀胱癌病人尿液中提取尿液外泌体；
步骤二：提取尿液外泌体的RNA；
步骤三：将外泌体RNA逆转录成cDNA；
步骤四：通过PCR检测cDNA中膀胱癌相关标志物的表达量；
所述肿瘤相关标志物为circZFR。
在本发明的一种实施方式中，所述circZFR的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
在本发明的一种实施方式中，所述检测circZFR的检测试剂包括靶向circZFR的特异性引物对；所述靶向circZFR的特异性引物对由核苷酸序列为SEQ ID NO.2的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.3的下游引物组成。
在本发明的一种实施方式中，所述方法用于膀胱癌的诊断和复发监控。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种膀胱癌检测试剂盒，所述试剂盒包括检测circZFR的检测试剂。本发明先通过环状RNA表达谱分析发现环状RNA cZFR为在膀胱癌干细胞中表达量升高最显著的环状RNA，并且和患者预后显著相关，然后通过通路离心检测膀胱癌病人尿液外泌体相比正常人尿液外泌体中环状RNA cZFR表达显著升高。可见，本发明确定环状RNA cZFR作为膀胱癌复发的临床诊断与治疗靶标的潜在应用价值，为预防膀胱癌复发提供新的理论依据。
附图说明
图1：差异circRNA的散点图。图中，X和Y轴分别代表非干细胞和干细胞，绿线为倍数变化线，在顶部绿线上方和底部绿线下方的circRNA指比较的两个样品之间的circRNA的变化超过2倍差异circRNA。
图2：差异circRNA的火山图。图中，log2(fold change)为横坐标，T检验显著性检验P值的负对数-log10(pvalue)为纵坐标，红色显示为差异倍数大于2倍，且p值小于0.05的circRNA，箭头所示为cZFR(锌指样RNA结合蛋白，zinc finger RNA binding protein，circZFR)。
图3：肿瘤干细胞差异circRNA聚类热图。图中显示fold change变化前10位的circRNA。
图4：cZFR在肿瘤组织中高表达与病人预后相关。图中，(A)RNA原位杂交检测cZFR在组织芯片中表达情况；(B)cZFR在肿瘤中高表达；(C)cZFR在不同分期膀胱癌病人中表达情况；(D)cZFR表达与病人预后相关。
图5：cZFR在膀胱癌患者尿液外泌体中高表达。图中，(A)膀胱癌患者尿液来源外泌体电镜图片(scale bar，200nm)；(B)NAT分析尿液外泌体粒径范围；(C)免疫印迹检测外泌体及尿液上清中marker：CD63，CD81；
(D)qPCR检测两例膀胱癌及正常人尿液外泌体cZFR表达。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1
(一)实验材料及方法
1.实验材料
1.1主要仪器及生产公司
NanoFCM仪器：福流生物Flow NanoAnalyzer；Attune NxT流式细胞仪：中国赛默飞世尔科技公司；4℃和-20℃电冰箱：青岛海尔股份有限公司；-80℃低温电冰箱：青岛海尔股份有限公司；超纯水仪：Millipore公司；制冰机：美国Scotsman公司；CO2培养箱：Thermo公司；电子天平：Sartorius公司；高速低温离心机：Eppendorf公司；高速离心机：Eppendorf公司；高速台式低温离心机：Heraeus公司；大容量低温低速离心机：BECKMAN公司；超高速离心机：BECKMAN公司；pH计：Sartorius公司；X射线摄影暗匣：汕头市粤华医疗器械厂有限公司；去离子水机：Millipore公司；手压封口机：温州鹿城松山焊接设备厂；磁力搅拌器：江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；水平脱色摇床：北京鼎国生物技术发展中心；倒置显微镜：Leica公司；正置显微镜：Leica公司；金属浴：Eppendorf公司；酶标仪：Bio-Rad公司；恒温摇床：New Brunswich Scientific公司；手掌型离心机：江苏海门市其林贝尔仪器制造公司；组织匀浆器：杭州市仪表电机厂静音混合器：科尔德实验仪器厂紫外凝胶成像分析系统：Thermo公司组织切片机：Eppendorf公司；Odyssey红外荧光扫描成像系统：Gene有限公司；超净工作台：天津市泰斯特仪器有限公司；超声破碎仪：ColeParmer公司；电泳、电泳仪、电转仪：Bio-Rad公司；转移脱色摇床：江苏海门市其林贝尔仪器制造公司；细胞计数仪：Bio-Rad公司；全自动酶标仪：美国BioTek Instrument公司。
1.2主要试剂及生产公司
脱脂奶粉：内蒙古伊利实业集团股份有限公司；DEPC水：上海生工生物工程有限公司；Loading dye(蛋白上样缓冲液)：北京博大泰克生物基因技术公司；BSA(牛血清白蛋白组分Ⅴ)：Maverick；Agarose(琼脂糖)：Regular公司；HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸)：北京博大泰克生物基因技术公司；Tris(三羟甲基氨基甲烷)：上海生工生物工程有限公司；SDS(十二烷基磺酸钠)：上海生工生物工程有限公司；Tween20(吐温20)：Sigma Aldrich公司；TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)：美国Sigma Aldrich Aldrich公司；Bromophenol blue(溴酚兰)：北京化工厂；Ammonium bicarbonate(碳酸氢铵)：Sigma Aldrich公司；DTT(二硫苏糖醇)：Sigma Aldrich公司；预染蛋白Maker：百汇中源公司；Methanol(甲醇)：北京化工厂；Glycerin(丙三醇)：北京科华特种试剂联合开发中心；Isopropyl alcohol(异丙醇)：北京现代东方精细化学品有限公司；Ethanol(无水乙醇)：北京现代东方精细化学品有限公司；Calcium chloride(无水氯化钙)：中国医药公司北京采购供应站经销；Monosodiumphosphate(磷酸二氢钠)：北京红星化工厂；Disodium phosphate(磷酸氢二钠)：北京益利精细化学品有限公司；Sodium chloride(氯化钠)：北京化学试剂公司；Benzamidine(苯甲脒盐酸盐)：华美生物工程公司；Kanamycin(卡那霉素)：Sigma Aldrich公司；Ampicillin(氨苄霉素)：美国Genview公司；HifectinⅡ(真核转染试剂)：北京普利莱基因技术有限公司；Lipofectamine 2000(真核转染试剂)：Invitrogen公司；L-谷氨酰胺(L-谷氨酰胺)：Hyclone公司；DMEM培养基：Hyclone公司；RPMI-1640培养基：Hyclone公司；Fetal BovineSerum(胎牛血清)：Hyclone公司；DMSO(二甲基亚砜)：SERVA公司；Trypsin(胰蛋白酶)：北京鼎国生物技术有限责任公司；Penicillin/Streptomycin(青/链霉素)：北京鼎国生物技术有限责任公司；G418(新霉素)：日本CALBIOCHEM公司；Puromycin(嘌呤霉素)：美国SigmaAldrich Aldrich公司；Acrylamide(丙烯酰胺)：Genview公司；N,N’-Methylenebisacrylamide(甲叉丙烯酰胺)：Genview公司；APS(过硫酸铵)：北京益利精细化学品有限公司；TEMED(四甲基乙二胺)：Serva公司；Nitrocellulose filter membrane(NC膜，硝酸纤维素膜)：Millipore公司；Polyvinylidene fluoride membrane(PVDF膜，聚偏二氟乙烯膜)：Millipore公司。
2.实验相关试剂的配制及实验方法
2.1实验相关试剂的配制
(1)Puromycin溶液
称取10mg Puromycin药品，用8mL去离子水充分溶解，然后用去离子水定容至10mL。经0.22μm滤器过滤除菌后，分装成每支1mL，-20℃贮存备用。
(2)细胞消化液
称取0.25g胰蛋白酶，用80mL PBS缓冲液溶解，加入2.5mL浓度为0.5mol/L的EDTA，再用PBS缓冲液定容至100mL。用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，-20℃贮存备用。
(3)细胞冻存液
60mL DMEM培养基中加入30mL FBS及10mL DMSO，使用时新鲜配制，混匀使用。细胞冻存液需要新鲜配制，不宜长时间放置。
(4)细胞(组织)裂解液
HEPES 10mmol/L、NaCl 50mmol/L、EDTA 5mmol/L、Triton X-100 1％、Benzamidine 1mmol/L，加去离子水定容，Benzamidine组分在使用时加入。
(5)PBS缓冲液(0.15mol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)
NaCl 3.2g、KH2PO4 0.08g、Na2HPO4·12H2O 1.16g、KCl 0.08g，将以上试剂按次序加入到烧杯中，加适量去离子水溶解后，定容至400mL，调整pH至7.4，高压灭菌后超净台内放置，冷却后保存于4℃。
(6)50×TAE(核酸电泳缓冲液)
Tris碱242g、EDTA 37.2g，将称取的试剂放入烧杯中，加入800mL的去离子水，在磁力搅拌器上充分搅拌溶解。在通风橱内加入57.1mL的醋酸，充分混匀后加入去离子水定容至1L，室温(25℃)保存。使用时用去离子水稀释成1×TAE工作液。
(7)0.1％琼脂糖凝胶
称取0.2g琼脂糖粉末加入到锥形瓶中，加1×TAE工作液20mL，将锥形瓶放入微波炉中加热以融化琼脂糖粉末。待琼脂糖完全融化后取出，冷却至40℃。加入0.7μL Gold-View染料，摇晃均匀，快速倒入制胶槽中，并按照需要插入所需梳孔的梳子。
(8)30％丙烯酰胺
丙烯酰胺29g、N，N-亚甲双丙烯酰胺1g，加入到60mL去离子水中，37℃溶解，补加水至100mL，滤纸过滤后，放于棕色瓶中，4℃保存。
(9)10％APS
过硫酸铵0.1g、去离子水1mL，4℃保存，1周内使用。
(10)10％SDS
SDS 5g、去离子水40mL，加热至68℃助溶，加浓HCl调pH至7.2，加去离水定容至50mL。
(11)1.5mol/L Tris·HCl缓冲液(pH＝8.8)
Tris碱45.43g、去离子水200mL，溶解后，用浓HCl调节pH值至8.8，最后用去离子水定容至250mL，4℃保存。
(12)1.0mol/L Tris·HCl缓冲液(pH＝6.8)
Tris碱30.29g、去离子水200mL，溶解后，用浓HCl调节pH值至6.8，最后用去离子水定容至250mL，4℃保存。
(13)10×电泳缓冲液(使用时稀释至1×)
Tris碱30.5g、甘氨酸144.8g、SDS 10g，去离子水定容至1L。
(14)1×电转缓冲液
Tris碱2.9g、甘氨酸14.4g、甲醇400mL，去离子水定容至2L，4℃保存，可反复使用3次。
(15)1.0mol/L Tris·HCl缓冲液(pH＝7.5)
Tris碱30.29g、去离子水200mL，溶解后，用浓HCl调节pH值至7.5，最后用去离子水定容至250mL，4℃保存。
(16)TBS缓冲液
1.0mol/LTris·HCl(pH＝7.5)20mL、NaCl 29.22g，去离子水定容至1L。
(17)TBST缓冲液
Tween 20(0.1％)1.0mL、TBS 1L。
(18)blot buffer
脱脂奶粉2％、NaCl 50mmol/L、Tris(pH＝7.4)10mmol/L、Tween 20 0.1％。
(19)封闭液(10％脱脂乳)
脱脂奶粉5g，加TBST缓冲液至50mL。
(20)抗体稀释液(1％脱脂乳)
脱脂奶粉0.1g，加TBST缓冲液至10mL。
(21)Matrigel 8mg/mL
将1mL预冷的RPMI-1640培养基注入matrigel瓶中(8mg包装)，充分混匀后，分装，-20℃贮存备用。溶解时注意使用预冷的枪头盒EP管，防止matrigel凝固。使用前将matrigel置于4℃融化过夜，再进行实验。
(22)4％多聚甲醛固定液
60mL D-PBS中加入4g多聚甲醛，在80℃水浴中滴加1mol/mL的NaOH至溶解透明。待溶液冷却至15℃时用HCl将PH调至7.0。最后用D-PBS定容至100mL，滤纸过滤，室温(25℃)避光保存。
(23)苏木精
苏木精1g、一氧化汞0.5g、硫酸铝钾20g、无水乙醇10mL、蒸馏水20mL，苏木精溶解于无水乙醇中，硫酸铝钾溶于蒸馏水中，二者混合后煮沸，加入一氧化汞用玻璃棒搅拌，试剂颜色变成深紫色，移入冷水快速冷却，静置16h。滤纸过滤，棕色瓶避光保存。
(24)0.5％伊红
伊红0.5g、95％乙醇25mL、蒸馏水75mL，将伊红加入少量蒸馏水，用玻璃棒将伊红碾碎并搅拌，继续加入蒸馏水，完全溶解后再加入乙醇，最后加冰醋酸1滴。
(25)抗原修复液
A液：0.1M枸橼酸溶液
枸橼酸(C6H8O7·H2O)21.01g，加入蒸馏水定容至1000mL；
B液：0.1M枸橼酸钠溶液
枸橼酸钠(C6H5Na3O7·H2O)29.41g，加入蒸馏水定容至1000mL；
0.01M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)
A液9mL、B液41mL、去离子水450mL，调至pH 6.0±0.2(用A，B液调)。
(26)二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色剂
称取2mg DAB溶于6.8mL 0.05mol/L Tris·HCl(pH7.6)中，用磁力搅拌器搅拌30min，过滤到青霉素瓶中(避光)。现用现配，用前加22μL的3％H2O2。
2.2实验方法
2.2.1.膀胱癌干细胞分选和鉴定
3例膀胱癌病人的原代肿瘤组织分别用200U I型胶原酶，20U IV型胶原酶(Sigma，C-0130，C-5138)和DNA酶在37℃消化6小时。然后，将癌细胞用FITC耦合的BCMab1抗体和PE耦合的抗CD44抗体或相同的同型FITC/PE耦合的抗体在冰上染色30分钟。标记的细胞通过流式细胞术(BD FACSAria III)进行分析和分选肿瘤干细胞及非干细胞。
2.2.2.环状RNA和mRNA聚类分析
将分离的3例膀胱癌组织干细胞及非癌干细胞提取总RNA，采用Arraystar芯片进行环状RNA及mRNA表达谱检测。进一步通过差异性分析得到差异性表达P值与倍数变化FC(fold change)值，筛选表达差异显著基因。进一步绘制差异表达circRNA的散点图和火山图，分层聚类结果显示circRNA和mRNA在膀胱癌干细胞及非干细胞表达情况。
2.2.3.RNA原位杂交
1)培养细胞在30min内固定；
2)多聚甲醛固定30min；
3)增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：杂交前标本可用0.25％乙酸酐处理10min；
4)杂交缓冲液孵育：杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2小时，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的；
5)双链DNA探针和靶DNA的变性：杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的；如果用双链DNA探针进行杂交(包括检测RNA时)，双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。
2.2.4.尿液外泌体的鉴定
提取尿液外泌体后需要对其在其形态学的鉴定，但目前没有统一的鉴定金标准。外泌体鉴定方法有：透射电子显微镜(TEM)、纳米粒径分析。
1)透射电子显微镜法
(1)将尿液外泌体从-80℃冰箱中取出，并室温放置融化；
(2)从尿液外泌体样品中取出浓缩液的样品，稀释一定的倍数；
(3)用移液枪取10μL的尿液外泌体样品滴在铜网碳膜面上，然后用滤纸从铜网侧位吸干过多的液体；
(4)移液枪取5μL的多聚甲醛固定液滴定在铜网上；
(5)移液枪取5μL的PBS溶液滴加在铜网上，5min之后用滤纸吸去多余的PBS液体，重复三遍；
(6)移液枪取5μL的戊二醛固定液滴加在铜网上，待10min之后用滤纸吸去多余的液体；
(7)重复步骤(5)；
(8)移液枪取5μL的磷钨酸染液滴加在铜网上，然后将铜网烤干；
(9)将铜网放在透射电镜上寻找外泌体并拍照保存。
2)纳米粒子跟踪分析
(1)从-80℃电冰箱中取出上述提取的尿液外泌体样品放置室温融化；
(2)从尿液外泌体样品中取出浓缩液5μL稀释到30μL，再送样检测；
(3)检测前用标准品对仪器进行性能测试，待合格后方可进行尿液外泌体样品上样，注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针；
(4)按照标准操作流程操作仪器检测，上样并完成检测即可获得NanoFCM仪器对其检测的尿液外泌体的粒径和浓度信息。
2.2.5.统计分析
通过使用统计学软件SPSS 13.0(IBM，美国)制作ROC曲线和GraphPad Prism 7(美国GraphPad软件)制作散点图。除非特别说明，否则分析统计差异均通过Student’s t检验。当数据不是正态分布时，使用The Mann-Whitney U检验。当差异P<0.05时，被认为具有统计学意义。
(二)实验结果及分析
1.膀胱癌干细胞相关基因筛选及生信分析
1.1.膀胱癌干细胞差异表达基因分析
从3例膀胱癌病人癌组织中利用BCMab1与CD44双抗分离出膀胱癌组织中的肿瘤干细胞(BCMab1+CD44+)和膀胱癌非干细胞(BCMab1-CD44-)，进一步将分选的膀胱癌干细胞与非干细胞进行lncRNA，circRNA及mRNA芯片表达谱分析，并进一步通过火山图评估膀胱癌干细胞和膀胱癌非干细胞之间的基因表达差异，总共发现差异表达的2849个mRNA，2698个lncRNA和127个circRNA(P值<0.05且倍数变化>2.0)。与膀胱癌非干细胞相比，膀胱癌干细胞高表达1685个mRNA，1309个lncRNA和113个circRNA，低表达1164个mRNA，1389个lncRNA和14个circRNA。层次聚类分析显示样品中这些RNA的表达存在系统差异，表明膀胱癌干细胞中的mRNA，lncRNA和circRNA的表达与膀胱癌非干细胞中的不同。
1.2.差异表达的lncRNA和circRNA的特征分析
从膀胱癌干细胞样本中总共鉴定出12261个带注释的lncRNA和4451个新的circRNA。为了展示膀胱癌干细胞中这两种非编码转录本的结构特征，继续对在该微阵列测定法中检测到的lncRNA和circRNA的基因结构和序列保守性进行了分析。结果表明，基因间和天然反义lncRNA占据了结果中大部分lncRNA种类。外显子和内含子circRNA在所有表达的circRNA中构成最多。此外，分析circRNA在24条染色体(22个常染色体和2条性染色体)上的分布表明，在膀胱癌干细胞中表达的circRNA主要分布在chr1和chr17上。
2.环状RNA分子调节靶基因UBE2V1参与膀胱癌干细胞干性维持及其机制研究
2.1.筛选膀胱癌干细胞显著相关环状RNA
通过芯片筛选发现共有127个显著差异表达的circRNA和2849个显著差异表达的mRNA(Fold Change>2.0，P<0.05)；其中，膀胱癌干细胞表达上调的circRNA有113个，mRNA有1685个，表达下调的circRNA有14个，mRNA有1164个。上调最显著的环状RNA为cZFR(锌指样RNA结合蛋白，zinc finger RNA binding protein，circZFR)(图1～3)。
2.2.cZFR在膀胱癌表达量及预后分析
以上通过分析发现cZFR在膀胱癌干细胞中表达显著升高，进一步为了判断cZFR与膀胱癌患者预后的关系，收集56例带有预后信息的膀胱癌病人组织，通过原位杂交的方法发现cZFR在肿瘤病人中高表达并且与患者不良预后显著相关(图4)。
2.3.膀胱癌患者尿液外泌体检测cZFR表达
通过分离膀胱癌病人及正常人尿液中的外泌体，进行电镜检测及粒径分析发现尿液外泌体呈现“茶托”样形态并且直径在50～100nm之间。进一步，通过western blot对尿液外泌体marker进行了检测。最后，通过qPCR发现cZFR在膀胱癌患者尿液外泌体相比正常尿液外泌体表达显著增加(图5)。
综上，本实验例通过分选膀胱癌组织干细胞，筛选关键环状RNA及线性RNA，从分子、细胞、组织以及动物水平等层次进行研究最终明确膀胱癌干细胞中的关键环状RNAcZFR并验证其特性，确定环状RNA cZFR作为膀胱癌复发的临床诊断与治疗靶标的潜在应用价值，为预防膀胱癌复发提供新的理论依据。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 深圳市众循精准医学研究院
<120> 一种膀胱癌检测试剂盒及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccttacgtc gtcctgactc atctgatgac cgttatgtaa tgacaaaaca tgccaccatt 60
tatccaactg aagaggagtt acaggcagtt cagaaaattg tttctattac tgaacgtgct 120
ttaaaactcg tttcagacag tttgtctgaa catgagaaga acaagaacaa agagggagat 180
gataagaaag agggaggtaa agacagagct ttgaaaggag ttttgcgagt gggagtattg 240
gcaaaaggat tacttctccg aggagataga aatgtcaacc ttgttttgct gtgctcagag 300
aaaccttcaa agacattatt aagccgtatt gcagaaaacc tacccaaaca gcttgctgtt 360
ataagccctg agaagtatga cataaaatgt gctgtatctg aagcggcaat aattttgaat 420
tcatgtgtgg aacccaaaat gcaagtcact atcacactga catctccaat tattcgagaa 480
gagaacatga gggaaggaga tgtaacctcg ggtatggtga aagacccacc ggacgtcttg 540
gacaggcaaa aatgccttga cgctctggct gctctacgcc acgctaagtg gttccaggct 600
agagctaatg gtctgcagtc ctgtgtgatt atcatacgca ttcttcgaga cctctgtcag 660
cgagttccaa cttggtctga ttttccaagc tgg 693
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgagacctc tgtcagcgag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gccaatactc ccactcgcaa 20

Claims (10)

1.一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测circZFR的检测试剂。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述circZFR的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测circZFR的检测试剂包括靶向circZFR的特异性引物对；所述靶向circZFR的特异性引物对由核苷酸序列为SEQ ID NO.2的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.3的下游引物组成。
4.如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为尿液外泌体。
5.检测circZFR的检测试剂在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述circZFR的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测circZFR的检测试剂包括靶向circZFR的特异性引物对；所述靶向circZFR的特异性引物对由核苷酸序列为SEQ ID NO.2的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.3的下游引物组成。
8.如权利要求5～7任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为尿液外泌体。
9.一种在膀胱癌病人尿液中检测膀胱癌相关标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：从膀胱癌病人尿液中提取尿液外泌体；
步骤二：提取尿液外泌体的RNA；
步骤三：将外泌体RNA逆转录成cDNA；
步骤四：通过PCR检测cDNA中膀胱癌相关标志物的表达量；
所述肿瘤相关标志物为circZFR。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述circZFR的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；所述检测circZFR的检测试剂包括靶向circZFR的特异性引物对；所述靶向circZFR的特异性引物对由核苷酸序列为SEQ ID NO.2的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.3的下游引物组成。
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