CN115838792A

CN115838792A - 一种用于精神分裂症诊断的环状rna标志物及试剂盒

Info

Publication number: CN115838792A
Application number: CN202210813406.6A
Authority: CN
Inventors: 贺宽军; 郭闯; 郭猛; 吕海冰
Original assignee: Inner Mongolia University for Nationlities
Current assignee: Inner Mongolia University for Nationlities
Priority date: 2022-07-12
Filing date: 2022-07-12
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明公开了一种精神分裂症早期诊断标志物的组合物，所述标志物的组合物包括hsa_circ_0004442、hsa_circ_MYO9A‑66和hsa_circ_CDR1as三种circRNA。根据AUC、灵敏度和特异度等指标，本发明标志物的组合表现出更好的判别性能，可作为精神分裂症诊断的潜在生物标志物。同时，本发明还证实了服用利培酮4周后患者血清细胞外囊泡中标志物的表达发生显著改变，可见三者的表达水平与治疗过程存在相关性。本发明为血清细胞外囊泡中异常表达的circRNAs参与精神分裂症的发病提供了进一步的证据，也证实异常表达的circRNAs有成为精神分裂症诊断和治疗的生物标志物的潜力。

Description

一种用于精神分裂症诊断的环状RNA标志物及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种用于精神分裂症诊断的环状RNA标志物及试剂盒。

背景技术

精神分裂症影响全球约1％人口，精神病院80％～90％以上的住院病人为精神分裂症患者。精神分裂症的病因非常复杂，截止目前也没有明确的结论。不论精神分裂症的遗传学研究还是神经影像学研究，均无法解释该疾病的所有病理生理现象。除了精神分裂症的病因尚不清楚之外，其诊断也存在争议。同其他主要精神疾病一样，精神分裂症的诊断标准主要基于症状和体征，而非病理和生理基础，也无相关的生理、生化诊断指标。因此，探究精神分裂症的生物标志物和发病机制已成为精神疾病研究的热点。

细胞外囊泡是活细胞分泌到细胞外基质中的一种直径约30～150nm的膜性囊泡，广泛存在于血液等各种体液之中。细胞外囊泡具有膜性囊泡结构，所以可以保护其内含物在通过长时间、远距离的运输不受降解，仍能保持其生物活性。细胞外囊泡能够整合到细胞膜上，也可以通过血脑屏障。

细胞外囊泡包含许多种类的RNAs，例如miRNA、mRNA和circRNAs等。circRNAs是mRNA在剪接过程中形成的一类的闭合环状RNA分子，其不具有5‘末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，多数属于非编码RNA分子，少数也能够翻译成蛋白。circRNAs因其特殊结构，不易被核酸外切酶降解，要比血液中的线性RNA更加稳定。circRNAs在真核细胞和组织中特异性表达，与相应的miRNA结合，通过充当miRNA的海绵，从而调节mRNA的表达。随着下一代测序技术的发展，已证实circRNAs在细胞增殖、凋亡、转移和炎症等关键生物学过程中发挥特定的生物学作用。CircRNAs在哺乳动物的大脑中尤其丰富，可能在参与神经发育和功能的发挥、维持大脑健康和预防神经精神疾病的发生中扮演重要角色。多项研究证实，circRNAs是正常的发育过程、生理和疾病状态，包括癌症、精神疾病和心血管疾病发生中的重要调节因子。同时，也有研究揭示了circRNAs与神经系统疾病之间的关系。目前已证实circRNAs参与多种神经精神疾病，如精神分裂症、抑郁症、阿尔茨海默病(AD)、癫痫和帕金森病(PD)等疾病的发生和发展。

有研究表明，在精神分裂症患者的外周血中发现了异常表达的circRNAs，可能参与了精神分裂症的发病过程。姚等人(2019)证实，hsa_circRNA_104597在精神分裂症患者外周血单核细胞(PBMC)中的表达水平显着下调；经抗精神病药物治疗8周后，hsa_circRNA_104597的表达水平变为显着上调；因此，揭示了hsa_circRNA_104597可以作为精神分裂症诊断和治疗潜在的生物标志物。

尽管现有技术中存在利用circRNAs作为标志物来诊断精神分裂症的技术方案，但其效果却不尽如人意，主要体现在特异性和灵敏度等相关指标偏低。因此，寻找一种更好的circRNAs标志物已成为当务之急。

发明内容

本发明的一个方面，是针对现有技术中精神分裂症的诊断标志物存在特异性和灵敏度等相关指标偏低的缺陷，提供了一种用于精神分裂症诊断的环状RNA标志物及试剂盒。

本发明选择了20个候选circRNAs，利用RT-qPCR检查了它们在96名未用药物治疗的精神分裂症患者和120名性别和年龄匹配的健康对照者的血清细胞外囊泡中的表达。结果表明，有11个circRNAs在未用药物治疗的精神分裂症患者血清细胞外囊泡中存在异常表达。与96名未用药的精神分裂症患者比较，8个circRNAs在经利培酮治疗4周后的48例精神分裂症患者的血清细胞外囊泡中的表达显著改变(P<0.01)，可见利培酮对其表达是有影响的，可能参与了精神分裂症的发生、发展过程。

本发明提供的技术方案为：

一种标志物的组合物，所述标志物的组合物包括hsa_circ_0004442、hsa_circ_MYO9A-66和hsa_circ_CDR1as三种circRNA；

所述标志物的组合物为血清细胞外囊泡来源的circRNA。

在本发明的某些实施方式中，为了提高所述标志物的组合物的某些性能，所述组合物还可以包含其他标志物。但只要包含上述hsa_circ_0004442、hsa_circ_MYO9A-66和hsa_circ_CDR1as三种circRNA，即可以实现本发明的目的。

作为优选，在本发明的某些实施方式中，上述标志物的组合物还可以包括选自hsa_circ_0001495,hsa_circ_0042174,has_circRNA_101836,hsa_circ_0004669,hsa_circ_HP1BP3-7,hsa_circ_TOP1-10,hsa_circ_ZNF236_2或hsa_circ_GPR137B中的一种或几种。

作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述标志物的组合物由hsa_circ_0004442、hsa_circ_MYO9A-66和hsa_circ_CDR1as三种circRNA组成。

在本发明中，本发明人发现，检测受试者血清细胞外囊泡中的上述标志物组合物，更可以准确反映脑部异常的病理状态，是非常合适的神经精神疾病的生物标志物，并且具有更好的准确性、特异性和敏感性。

因此，在本发明的实施方式中，上述标志物的组合物为血清细胞外囊泡来源的circRNA。

本发明的另一个方面，是提供了一种产品，所述产品的功能为能够检测上述标志物的组合物的存在和/或水平。

本发明的另一个方面，是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含直接或间接检测上述标志物的组合物的产品。同时，上述试剂盒中还包括了必要的组件，例如，buffer、试剂盒说明书，等。

作为优选，在本发明的某些实施方式中，上述产品可以包括检测所述标志物的组合物的引物或探针；

更优选地，在本发明的一个实施方式中，上述引物为如SEQ ID No.1-2所示的引物对、如SEQ ID No.3-4所示的引物对和如SEQ ID No.5-6所示的引物对。

本发明的另一个方面，是提供了上述标志物的组合物、上述试剂盒或上述RNA芯片在制备研究、预测、检测、诊断或辅助诊断精神分裂症的产品中的用途。

本发明的另一个方面，是提供了一种诊断精神分裂症的方法，包括以下步骤：

步骤1)获取未用药的精神分裂症患者的血清细胞外囊泡样本；

步骤2)检测所述血清细胞外囊泡样本中如权利要求1～4任意一项中所述标志物的组合物的存在和/或水平；

步骤3)评价精神分裂症早期诊断效果。

本发明的另一个方面，是提供了上述标志物的组合物、上述试剂盒在评估抗精神分裂症药物的疗效中的用途。

在本发明的某些实施方式中，患者所用的治疗药物为利培酮。

本发明的另一个方面，是提供了一种评估抗精神分裂症药物的疗效的方法，包括以下步骤：

步骤1)获取经抗精神分裂症药物治疗患者的血清细胞外囊泡样本；

步骤2)检测所述血清细胞外囊泡样本中上述标志物的组合物的存在和/或水平；

步骤3)评价所述抗精神分裂症药物的疗效。

本发明的另一个方面，是提供了一种确定患者是否存在精神分裂症风险的方法，包括以下步骤：

步骤1)获取待测对象的血清细胞外囊泡样本；

步骤2)检测所述对象血清细胞外囊泡样本中上述标志物的组合物的存在和/或水平；

步骤3)确定患者是否存在精神分裂症风险。

本发明的有益效果为：

根据AUC、灵敏度和特异度等指标，本发明标志物的组合表现出更好的判别性能，可作为精神分裂症诊断的潜在生物标志物。同时，本发明还证实了服用利培酮4周后患者血清细胞外囊泡中标志物的表达发生显著改变，可见三者的表达水平与治疗过程存在相关性。本发明为血清细胞外囊泡中异常表达的circRNAs参与精神分裂症的发病提供了进一步的证据，也证实异常表达的circRNAs有成为精神分裂症诊断和治疗的生物标志物的潜力。

附图说明

图1为本发明实施例中细胞外囊泡鉴定结果图，其中，A为通过TEM观察到的囊泡形态结果图，B为囊泡的NanoSight定量结果图，C为外泌体标志蛋白蛋白质印迹鉴定结果图，CON为健康对照，SCZ为未用药的精神分裂症患者，SCZ-4W为利培酮治疗4周后的精神分裂症患者；

图2为本发明实施例中20个circRNAs在未用药的精神分裂患者与健康对照血清细胞外囊泡中相对表达量结果图，筛选出的11个差异表达circRNAs(P<0.01or P<0.05)；其中，y轴显示RT-qPCR结果中候选circRNAs在96名未用药的精神分裂症患者和120名正常对照血清细胞外囊泡中的log₁₀2^-ΔΔCt相对表达量；x轴CON为健康对照，SCZ为未用药的精神分裂症患者；

图3为本发明实施例中筛选出的差异表达的3个circRNAs和组合的诊断价值ROC曲线分析结果图；

图4为本发明实施例中筛选出的3个circRNAs(hsa_circ_0004442、hsa_circ_MYO9A-66和hsa_circ_CDR1as)在三组研究对象的血清细胞外囊泡中的相对表达差异结果图；其中，y轴显示RT-qPCR结果中异常表达的circRNAs的log₁₀2^-ΔΔCt相对表达量，使用Kruskal-Wallis test检验分析统计差异，使用R version 4.1.2软件绘图，差异显著性水平设置为P<0.05；x轴CON为健康对照，SCZ为精神分裂症患者，SCZ-4W为经抗精神病药物-利培酮治疗4周后的精神分裂症患者。

序列说明

SEQ ID No.1-2依次为扩增本发明中标志物has_circ_0004442的正向和反向引物序列；

SEQ ID No.3-4依次为扩增本发明中标志物hsa_circ_CDR1as的正向和反向引物序列；

SEQ ID No.5-6依次为扩增本发明中标志物hsa_circ_MYO9A-66的正向和反向引物序列。

具体实施方式

本发明公开了一种用于精神分裂症诊断的环状RNA标志物及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。

下面就本发明中出现的部分术语作以解释。

术语“标志物”，即生物标志物(biomarker)，是指其变化和/或检测可以与特定身体状况或状态相关联的生物分子、生物分子片段或临床变量。在整个发明公开中，术语“标志物”和“生物标志物”是可互换使用的。这些生物标志物包括任何适合的分析物，但不限于生物分子，其包括核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、类固醇、代谢产物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、激素、抗体、用作生物大分子的替代物的所关心的区域及其组合(例如，糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)。该术语还涵盖circRNA、miRNA和miRNA的部分或片段。

术语“组”是指包含一个或多个生物标志物的组合物，如阵列或集合。该术语也可以表示本文所述的一个或多个生物标志物的表达模式谱或指数。对于生物标志物组有用的生物标志物数目基于生物标志物值的特定组合的灵敏度和特异性值。

术语“细胞外囊泡”，是活细胞分泌到细胞外基质中的一种直径约30～150nm的膜性囊泡，广泛存在于血液等各种体液之中。细胞外囊泡具有膜性囊泡结构，所以可以保护其内含物在通过长时间、远距离的运输不受降解，仍能保持其生物活性。细胞外囊泡能够整合到细胞膜上，也可以通过血脑屏障。细胞外囊泡包含许多种类的RNAs，例如miRNA、mRNA和circRNAs等。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

本实施例中的研究对象：

所有血液样本均采集于通辽市精神卫生中心，采集的整个过程均符合伦理原则，患者均签署了知情同意书。实验样本来自于96名未用药的精神分裂症患者和120名正常对照、48名利培酮治疗一个月的精神分裂症患者外周血样本。实验人口统计信息数据，如表1所示。

表1 人口统计信息数据表

注：年龄是平均值±标准差

本实施例中使用的主要试验设备：如表2所示

表2 研究用到的实验设备列表

实施例1：样本的获取

1、样本的收集

清晨空腹采取精神分裂患者和健康对照组外周静脉血10mL。采集的新鲜血液于普通管中，在4℃静置30min后，吸出上清液；在4℃条件下，先以1800g离心10min，吸取上层液体；再以12000g离心10min，做好标记，所得到的上清即为血清。将分离得到的血清分别置于-80℃冰箱保存待用。

2、血清细胞外囊泡抽提

(1)在2mL管中吸取处理干净的血清200μL，加入100μL1×PBS后悬涡振荡混匀。

(2)添加15μL蛋白酶K到样本当中。

(3)悬涡振荡混匀后，37℃孵育10min。

(4)添加0.2倍总体积，60μL的Reagent，此时溶液呈云雾状。

(5)悬涡振荡混匀后，4℃孵育30min。

(6)室温10000g离心5min，用移液枪吸掉所有上清，保留沉淀。

(7)再用移液枪吸取遗留的所有上清，当心不要碰到沉淀。该沉淀即为包含细胞外囊泡的沉淀。

(8)加入1×PBS 100μL，悬涡振荡或用枪吹打沉淀，直至所有沉淀彻底消失。

分离的细胞外囊泡可以在4℃放置一周，或在-20℃中长期保存。

3、血清细胞外囊泡的鉴定

使用血清细胞外囊泡分离试剂盒(Invitrogen 4478360)从血清中分离细胞外囊泡。使用透射电子显微镜(TEM)(JEOL JEM-1200EXII，日本JEOL公司)、NanoSight分析和Western blot方法鉴定从血清中分离到的细胞外囊泡。

用TEM和NanoSight分析仪分别对细胞外囊泡在形态、大小分布上的典型特征进行分析；利用Western Blot鉴定CD63外泌体标记蛋白的表达。具体结果见图1。TEM结果显示，囊泡的直径为10至120nm；分离出的粒径的主峰为115nm，超过99％的粒径为11.8至115nm；证实囊泡蛋白中，有CD63的表达。这些发现证实，从血清中分离的囊泡具有外泌体的典型特征。

4、血清细胞外囊泡总RNA抽提

(1)在分离的细胞外囊泡中加入900μL TRIZOL LS试剂抽提RNA，剧烈震荡使其完全裂解，室温静置5min，再次剧烈震荡涡旋，室温静置5min；

(2)加200μL氯仿，摇匀，室温静置15min；

(3)4℃12000g离心15min。小心吸取水相于另一干净的EP管，使每管样品吸取相近体积，不要吸到下层有机相；

(4)每管加入4μL糖原(2μg/μl)，摇匀，加入样同体积的异丙醇，摇匀，静置20min(-20℃)；

(5)12000g 4℃离心10min，此时管底出现少量白色沉淀，小心去除上清，保留沉淀；

(6)加入1m L新鲜配制的75％乙醇，颠倒混匀；

(7)12000g 4℃离心5min，去除上清；

(8)极短时间离心，使管壁上的溶液聚在底部，倾斜EP管，用黄色枪头吸尽残留液体，超净台开抽风，晾干；

(9)当沉淀由白色变成无色时，加入10μL RNA Free H₂O溶解；

(10)所得RNA立即进行下步反应。

5、RNA反转录为cDNA

使用快速反转录试剂盒获得第一链cDNA。

建立20μL反应体系需要50ng～2μg总RNA。操作步骤如下：

(1)将实验所用试剂在室温解冻，解冻之后马上放在冰盒上。实验开始之前将各个溶液混匀，短时间离心，使管壁上的液体聚在管底。

以下操作步骤在冰上进行。应先配制成Mix，再将混合液分装到每个反应管中。

(2)按照表3配制反应液，充分混匀。短时间离心，在42℃条件下孵育3min。然后放在冰盒中。

表3 gDNA去除反应体系

(3)按照表4的反转录反应体系所需试剂配制混合液。

表4 反转录反应体系

(4)将Mix与gDNA去除反应液混合均匀。

(5)在42℃的条件下，将反应液孵育15min。

(6)在95℃的条件下，将反应液孵育3min后放置在于冰上，用反应得到cDNA进行后续实验，或放冰箱中保存。

实施例2：circRNAs的相对表达水平分析

本实施例中选取表达异常的20个circRNAs作为候选circRNAs进行RT-qPCR验证。20个候选circRNAs是hsa_circ_0077837,hsa_circ_0001495,chr3_196488683_196483770_-4913,hsa_circ_0074371,hsa_circ_0042174,hsa_circ_0004442,hsa_circ_0004669,hsa_circ_Homer1a,hsa_circ_CDR1as,hsa_circ_HP1BP3-7,hsa_circ_LONP2-6,hsa_circ_TOP1-10,hsa_circ_VCAN-2,hsa_circ_ZNF236-2,hsa_circ_GPR137B-3,hsa_circ_MYO9A-66,hsa_circRNA_101836,hsa_circRNA_103102,hsa_circRNA_103704,hsa_circRNA_103636和hsa_circRNA_104597。

利用RT-qPCR，分析20个候选circRNAs在264名研究对象血清细胞外囊泡样品中的表达水平。RT-qPCR是在ECO48实时定量PCR系统(Illumina，San Diego，CA，USA)上，使用FastSYBR Mixture(Cwbio IT Group，江苏，中国)和特异性引物完成的。选择GAPDH作为内参基因，以标准化circRNAs表达。每个样品检测三次，使用2^-ΔΔCt方法分析表达数据。具体实验方法如下：

(1)实时定量PCR所用到的引物序列信息，见表5。

表5.实时定量PCR所用到的引物序列信息

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(2)Real-Time PCR反应体系，见表6。

表6 Real Time PCR反应体系

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(3)Real Time PCR反应条件：

(4)数据分析

卡方检验用于比较人口的分类统计学变量，T检验用于比较人口的定量统计学变量。使用Mann-Whitney U检验分析circRNAs的相对表达量，并使用Bonferroni校正法对所有P值进行校正，P<0.05认为具有统计学意义。使用二元逻辑回归对差异表达circRNAs组合进行建模。接收者操作特征(ROC)曲线用于评估所有差异表达circRNAs对精神分裂症的诊断性能。使用SPSS 26.0版、GraphPad Prism 8.0版和MedCalc 18.2.1版统计软件和Rversion 4.1.2进行统计分析和可视化做图。

(5)结果

利用RT-qPCR，分析了20个候选circRNAs在所有参与者的血清细胞外囊泡样本中的表达水平。研究证实11个circRNAs(hsa_circ_0001495,hsa_circ_0042174,has_circ_0004442,has_circRNA_101836,hsa_circ_0004669,hsa_circ_HP1BP3-7,hsa_circ_TOP1-10,hsa_circ_ZNF236-2,hsa_circ_CDR1as,hsa_circ_MYO9A-66和hsa_circ_GPR137B-3)在未用药精神分裂症患者血清细胞外囊泡中的表达存在显著差异(P<0.01或P<0.05)。其中，3个差异表达circRNAs的相对表达水平结果见图2。结果表明，与120个CON相比，有11个circRNAs在未用药物治疗的96名精神分裂症患者血清细胞外囊泡中表达存在显著差异，其中3个circRNAs在96个SCZ中的表达差异极显著。使用Mann-Whitney U检验分析统计差异，使用GraphPad Prism 8.0版软件绘图。差异显著性水平设置为P<0.05。

实施例3：接收者操作特征(ROC)曲线分析

通过构建ROC曲线，进一步评估11个显著性差异表达的circRNAs的诊断价值。结果如图3和表7所示。ROC分析显示，hsa_circ_0004442的AUC值为0.949，灵敏度为84％，特异度为93％；hsa_circ_MYO9A-66的AUC值为0.877，灵敏度为92％，特异度为71％；hsa_circ_CDR1as的AUC值为0.805，灵敏度为86％，特异度为74％。同时，利用二元回归分析将3个异常表达的circRNAs(hsa_circ_0004442、hsa_circ_MYO9A-66和hsa_circ_CDR1as)看成一个组合进行联合诊断，ROC分析揭示了组合的AUC为0.980，灵敏度为99％，特异度为88％。根据AUC、灵敏度和特异度等指标，hsa_circ_0004442、hsa_circ_MYO9A-66和hsa_circ_CDR1as的组合表现出更好的判别性能，可作为精神分裂症诊断的潜在生物标志物。

表7 3个差异表达circRNAs及其组合对精神分裂症的诊断价值(1)

circRNA ID	AUC	SE	95％CI	z statistic	P value
						hsa_circ_0004442	0.949	0.0139	0.910～0.974	32.348	<0.0001
hsa_circ_CDR1as	0.805	0.0327	0.746～0.856	9.341	<0.0001
						hsa_circ_MYO9A-66	0.877	0.0229	0.826～0.918	16.46	<0.0001
combination	0.98	0.0071	0.951～0.994	67.579	<0.0001

表7 3个差异表达circRNAs及其组合对精神分裂症的诊断价值(2)

注：combination:hsa_circ_0004442+hsa_circ_MYO9A-66+hsa_circ_CDR1as；表(1)接表(2)。

实施例4：利培酮对差异表达circRNAs的影响

与96名未用药的精神分裂症患者比较，3个circRNAs(hsa_circ_0004442，hsa_circ_CDR1as，hsa_circ_MYO9A-66)在48例经利培酮治疗4周后的精神分裂症患者的血清细胞外囊泡中的表达发生显著改变(P<0.01)，结果如图4所示。可见利培酮对其表达是有影响的，因而，hsa_circ_0004442，hsa_circ_CDR1as，hsa_circ_MYO9A-66的表达水平与治疗过程相关。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种标志物的组合物，其特征在于，所述标志物的组合物包括hsa_circ_0004442、hsa_circ_MYO9A-66和hsa_circ_CDR1as三种circRNA；

所述标志物的组合物为血清细胞外囊泡来源的circRNA。

2.根据权利要求1所述的标志物的组合物，其特征在于，所述标志物的组合物还包括选自hsa_circ_0001495,hsa_circ_0042174,has_circRNA_101836,hsa_circ_0004669,hsa_circ_HP1BP3-7,hsa_circ_TOP1-10,hsa_circ_ZNF236_2或hsa_circ_GPR137B中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的标志物的组合物，其特征在于，所述标志物的组合物由hsa_circ_0004442、hsa_circ_MYO9A-66和hsa_circ_CDR1as三种circRNA组成。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含直接或间接检测如权利要求1～3任意一项中所述标志物的组合物的产品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述产品包括检测所述标志物的组合物的引物或探针；

优选地，所述引物为如SEQ ID No.1-2所示的引物对、如SEQ ID No.3-4所示的引物对和如SEQ ID No.5-6所示的引物对。

6.一种RNA芯片，其特征在于，所述RNA芯片包含检测如权利要求1～3任意一项中所述标志物的组合物的探针。

7.如权利要求1～3任意一项中所述标志物的组合物、如权利要求4或5所述的试剂盒或如权利要求6所述的RNA芯片在制备研究、预测、检测、诊断或辅助诊断精神分裂症的产品中的用途。

8.如权利要求1～3任意一项中所述标志物的组合物、如权利要求4或5所述的试剂盒或如权利要求6所述的RNA芯片在评估抗精神分裂症药物的疗效中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物为利培酮。

10.一种评估抗精神分裂症药物的疗效的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2)检测所述血清细胞外囊泡样本中如权利要求1～3任意一项中所述标志物的组合物的存在和/或水平；

步骤3)评价所述抗精神分裂症药物的疗效。