CN102140507A - 用于感染性腹泻的检测型基因芯片及检测用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种关于引起人类感染性腹泻的主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒，其主要针对致泻性大肠杆菌/志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、亲水气单胞菌、邻单胞菌、霍利斯弧菌、河流弧菌、拟态弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、少女鱼弧菌、弗尼斯弧菌等13种细菌。该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，上述寡聚核苷酸探针包含从具有明显生物进化优势的gyrB基因、ITS基因及dnaJ、toxR等基因上选取的DNA片段或其互补的DNA片段。利用本发明的基因芯片及检测试剂盒可以检测引起人类感染性腹泻的主要病原微生物，且操作简便，高通量，准确性高，重复性强等特点，可用于医院检验部门的临床检测。
Description
技术领域
本发明属于基因芯片应用技术领域，涉及一种基因芯片及包含该芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及一种引起人类感染性腹泻的主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒。
背景技术
感染性腹泻是全球发病率高和流行广泛的传染病之一，对人类尤其是儿童健康危害严重，是发展中国家的重要公共卫生问题。据WHO估计，全世界每天约有数千万人发病，每年腹泻病例高达30～50亿例次，有500～1000万病例因严重腹泻而死亡，平均每天死亡2.5万人，儿童所占比例尤其突出，发达国家成人每年发生腹泻至少1～2次，发展中国家的发生率更高。亚、非、拉地区5岁以下儿童每年因腹泻而死亡者约500万以上，年发病数约7.5～10亿人次。WHO报告的1992～2000年调查结果显示腹泻病处于较高的发病水平，特别是5岁以下儿童的发病率达3.2次/人年，尽管死亡率从1954～1979年的13.6‰下降到1992～2000年的4.9‰，每年仍然有250万儿童死亡。在我国，感染性腹泻病的发病率一直位居肠道传染病的首位。2005年全国法定报告的全部传染病中腹泻病例共计1042 181例，占全部传染病的22.49％。2006～2007年我国其它感染性腹泻报告年均发病率为56.69/10万，细菌性痢疾报告年均发病率为30.05/10万。我国于1988年开展21个省(市)腹泻病防治现状的入户调查，根据调查结果推算全国每年约有8.36亿人次发病，其中5岁以下小儿约有2.09亿人次，全国平均发病率0.70次/人年，死亡率约为0.15‰。
根据中国卫生机构统计数据，确定引起人类感染性腹泻的主要病原微生物可能为大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、亲水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、邻单胞菌(Plesiomonas)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)等。
在微生物检测领域，传统的病原微生物检测技术大都是建立在染色镜检、培养、生化鉴定、免疫血清学试验的基础上的。微生物培养是指利用选择性培养基对目的病原微生物进行分类，以确定其是否存在。这种方法虽然比较准确，但由于细菌的生长繁殖需要较长的时间，不能进行快速诊断；而且，一次培养实验一般只能检测一种或者一类病原微生物，要完成对样品中多个项目的检测是十分繁琐的。
微生物所表现出来的独特的生化性质(如乳糖发酵、降解烷烃等)是由于其细胞内具有相对应的酶而产生的(如能发酵乳糖的细菌具有半乳糖苷酶活性)，因此生化方法检测病原微生物实际上是对微生物细胞内特异性酶的测定，也就是利用不同底物在酶的催化下能产生的不同代谢产物来间接检测该酶的存在，进而实现对该微生物的鉴定和检测。传统的生化方法由于检验项目多、操作复杂、费时等因素影响而使鉴定速度减慢，而且其灵敏性与特异性也受到限制。
免疫血清学方法是利用细菌抗原的独特性及抗原抗体结合的特异性建立起来的现代检测技术，具有特异性强等特点。许多临床疾病已经开始使用这种方法进行病原体检测，如利用HBV表面抗原检测HBV病毒。然而，由于这种方法需要经过至少48小时的细菌培养、扩增和单菌落的分析，并需要对每一个样品的大量单菌落进行抗血清凝聚反应，耗时长且可能出现假阴性。另外，世界上没有一家公司或单位能生产全部细菌的抗血清，即使是最常用的大肠杆菌的抗血清，也只有少数几个公司和单位有全部血清型的抗血清，而国内没有一家单位获得过全套的抗血清。
随着分子生物学和微生物基因组学的迅速发展，越来越多的微生物全基因组核酸序列被公布，人们对病原微生物的认识已经从外部形态结构及生化特性深入到核酸、基因水平。在此基础上，人们建立了许多新的检测技术，如核酸探针(Nuclear acid probe)和聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)等，由于具有灵敏度高、特异性强、操作简便、反应快速等特点，已逐步应用于病原菌的检测。在这样的背景下，生物芯片技术应运而生。
分子生物学检测技术的发展，已为致病菌的快速检测提供了良好的技术平台，PCR技术和生物芯片技术是目前公认的在病原微生物检测领域最有效和最有潜力的两种技术，尤其是在细菌数较低的情况下更是最适合的方法。在病原菌检测领域，目前国内外均建立了许多基于PCR方法的检测技术，但由于PCR技术只能针对某一种或几种致病菌，而水体中存在的致病菌种类很多，这就需要同时对大多数常见致病菌进行检测，PCR的这种局限性大大增加了检测的工作量，不适用于水质检测、水栖致病菌流行病学分析等领域大量样品的快速检测。而基因芯片技术以其高通量、高特异性、高敏感、操作简便、反应快速的特点为微生物检测提供了一种强有力的技术平台。如今，越来越多的微生物检测芯片已经面世，诸如大肠杆菌检测芯片，幽门螺杆菌检测芯片，食品病源菌检测芯片等，微生物检测芯片已成为微生物检测技术的重要发展趋势。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测引起人类感染性腹泻的主要病原微生物的新型基因芯片，以弥补传统腹泻致病菌检测技术存在的费时、耗力，分辨能力差的缺陷，扩展病原微生物检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。
本发明的另一个目的是提供一种采用该基因芯片检测感染性腹泻的试剂盒。
为实现上述目的本发明提供如下的技术方案：
一种用于感染性腹泻的检测型基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述的寡聚核苷酸探针包含从具有明显生物进化优势的gyrB基因、ITS基因及dnaJ、toxR等基因上选取的DNA片段或其互补的DNA片段。
本发明所述的基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种：：
①大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)及亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)gyrB基因中所选取的至少一种DNA片段；
②沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ITS基因中选取的至少一种DNA片段；
③河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)的dnaJ基因中选取的DNA片段；
④霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)toxR基因中选取的DNA片段；
⑤邻单胞菌hugA基因中选取的DNA片段；
⑥志贺氏菌ipaH基因中选取的DNA片段；
⑦①或②或③或④或⑤或⑥中选取的DNA片段的互补DNA片段
所述寡聚核苷酸探针优选具有SEQ ID NO：1-31所示的核苷酸序列，或不同于SEQ IDNO：1-31但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1-31所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；本发明所述的基因芯片，还包括正对照探针和负对照探针。
上述的优选序列及功能如下所示：
SEQ ID(5’-3’)
NO：1 GAGGTTCTGACTACACGATGGGGCTAT 用于检测沙门氏菌；
NO：2 CCGATTAGCTCCACCACTGACTTCCT 用于检测副溶血弧菌；
NO：3 GATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCC 用于检测志贺氏菌；
NO：4 AGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCA 用于检测志贺氏菌；
NO：5 AGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCG 用于检测志贺氏菌；
NO：6 ACCATGGCATGCTGTACTGAAGCGTAC 用于检测志贺氏菌；
NO：7 CGGTGGTTAGCACGGCGTAGGTGTATCCGT 用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌；
NO：8 ATTGAAAGTGGTGCGCGAAACCGATCAAACC 用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌；
NO：9 GTGTCGGCGTCTCCGTGGTAAACGCCCT 用于检测亲水气单胞菌；
NO：10 CTCCATCCGCCTGCTGGATGACCGTGA 用于检测亲水气单胞菌；
NO：11 GGTTCTTCCCTTCCCGCTCGCCTTG 用于检测邻单胞菌；
NO：12 GACAGGTGATCTTCGCTACGCTCGGAG 用于检测邻单胞菌；
NO：13 TCAGTCAGGTGCTCGCCATTGCCC 用于检测邻单胞菌；
NO：14 AGATAGCCCCCCACACTCTGATCACCGT 用于检测邻单胞菌；
NO：15 CCCAGACACTCCCTCTTCCTGACGCT 用于检测霍利斯弧菌；
NO：16 AGCCCAAAGTCTCCACCAACGCCA 用于检测霍利斯弧菌；
NO：17 TATCCCTGTGACGAACGCACGCATT 用于检测霍利斯弧菌；
NO：18 GCACCTCGGCTCAAACCTGTGGCACCTGTC 用于检测河流弧菌；
NO：19 TTTGGTTCACTGTGATACCTGTGATGGCAGC 用于检测河流弧菌；
NO：20 ATGGGCATGCGGCGTTTGAACAAGGCGCTG 用于检测拟态弧菌；
NO：21 TCCCAACTTTGGTTCACTGCGATGCTTGTG 用于检测拟态弧菌；
NO：22 GAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATA 用于检测志贺氏菌/大肠杆菌；
NO：23 GGAGCTGGTTATTCAGCGCGAGGGTAAA 用于检测志贺氏菌/大肠杆菌；
NO：24 GGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAAC 用于检测志贺氏菌/大肠杆菌；
NO：25 AGACAGTGCCCTTGTTACCGCTCCTCA 用于检测少女鱼弧菌；
NO：26 TATTCAGCAGCCACAACAGCCTATAAGCA 用于检测少女鱼弧菌；
NO：27 CGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT 用于检测霍乱弧菌；
NO：28 CTTTAAGCGTTTTCGCTGAGAATGTTT 用于检测霍乱弧菌；
NO：29 CGGATCCGCAGAAAAAAGCCGCTTATGACC 用于检测弗尼斯弧菌；
NO：30 TCCCAACACTGGTGCACTGTGAAGCATGTG 用于检测弗尼斯弧菌；
NO：31 AAAGGTACGTCGGCGCAAACTTGTGGCACC 用于检测弗尼斯弧菌；
本发明所述基因芯片还包括正对照探针、负对照探针和荧光探针；其中正对照探针具有SEQ ID NO：46核苷酸序列；负对照探针具有SEQ ID NO：47核苷酸序列；荧光探针具有SEQ ID NO：48核苷酸序列。
SEQ ID NO：46TTTTTTTTTTTTTTTTTGTACACACCGCCCGTCACACCAT为正对照探针
SEQ ID NO：47TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT为负对照探针
本发明的基因芯片，可用于可能引起人类感染性腹泻的大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、邻单胞菌(Plesiomonas)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibriomimicus)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的至少一种致病菌的检测。
本发明所述的基因芯片的制备方法，主要包含步骤：
1)根据病原菌的gyrB基因、ITS基因、dnaJ基因及toxR基因、hugA基因、ipaH基因保守区设计并制备出用于PCR扩增的引物；
2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，对待测样品基因组DNA进行PCR扩增，得到靶序列；
3)标记步骤2)中得到的靶序列；
4)将标记后的靶序列与上述的基因芯片杂交；
5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。
其中，步骤1)中所述的引物包括SEQ ID NO：32-45所示的核苷酸序列的至少一种，各条引物探针的寡核苷酸序列由5’端至3’端的组成及其对应扩增作用是：
P1(SEQ ID NO：32)WCVGGTYTGCAYCAYATG用于扩增大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)gyrB基因的上游引物；
P2(SEQ ID NO：33)GTCTGBGAKGARAAYTTVGG用于扩增大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)gyrB基因的下游引物；
P3(SEQ ID NO：34)TGTACACACCGCCCGTC用于扩增沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ITS的上游引物；
P4(SEQ ID NO：35)GGTACTTAGATGTTTCAGTTC用于扩增沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ITS的下游引物；
P5(SEQ ID NO：36)TTTTAYGAAGTDYTDGGYGT河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)的dnaJ基因的上游引物；
P6(SEQ ID NO：37)GACAVGTWGGACAGGYYTGYTG河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)的dnaJ基因的下游引物；
P7(SEQ ID NO：38)CAATCCATTTCCACCCTTC用于扩增霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)toxR基因的上游引物；
P8(SEQ ID NO：39)TCCCTTGTTGGCTGGTTAG用于霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)toxR基因的下游引物；
P9(SEQ ID NO：40)ACTGGCTATTACAGCAACCG用于扩增少女鱼弧菌(Vibrio damsela)toxR基因的上游引物；
P10(SEQ ID NO：41)GGTGGCAATAACTTTAACTGG用于扩增少女鱼弧菌(Vibrio damsela)toxR基因的下游引物；
P11(SEQ ID NO：42)CAAACGCTAACTCATCATC用于扩增邻单胞菌(Plesiomonas)hugA基因的上游引物；
P12(SEQ ID NO：43)AATGAAGTCCTGGTTACGG用于扩增邻单胞菌(Plesiomonas)hugA基因的下游引物；
P13(SEQ ID NO：44)TTCCTTGACCGCCTTTC用于扩增志贺氏菌(Shigella)ipaH基因的上游引物；
P14(SEQ ID NO：45)GCCAGTACCTCGTCAGTCA用于扩增志贺氏菌(Shigella)ipaH基因的下游游引物；
其中的B表示C或G或T；R表示A或G；W表示A或T；Y表示C或T；K表示G或T；R表示A或G；V表示A或C或G。
本发明的另一目的是提供一种检测引起人类感染性腹泻的主要病原菌的试剂盒，该试剂盒包括上述的基因芯片，所述的基因芯片包含SEQ ID NO：1-31的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的至少一种；还包含PCR扩增的引物，该引物具有SEQ ID NO：32-45的核苷酸序列的至少一种，其中，用于大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB PCR扩增的引物序列根据大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB基因序列设计，用于沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ITS PCR扩增的引物序列根据沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ITS基因序列设计，用于河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)dnaJ PCR扩增的引物序列根据河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)dnaJ基因序列设计，用于霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)toxR基因PCR扩增的引物序列根据霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)toxR基因基因序列设计。
本发明所述的试剂盒还包括杂交盒、杂交液等。
本发明所述的试剂盒，可用于可能引起人类感染性腹泻的大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、邻单胞菌(Plesiomonas)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)、弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的至少一种致病菌的检测。
本发明的基因芯片及试剂盒与现有技术相比，所具有积极效果在于：
(1)现有芯片技术研究所设计的引物和探针基本都位于16srRNA基因，本发明将在具有明显进化优势的gyrB/ITS基因上，设计特异探针和引物，有效的避免了分辨能力较低，无法区分到种的弊端，同时，本发明的检测范围已基本涵盖了引起人类感染性腹泻的主要病原微生，大大弥补了现有技术中检测芯片的检测范围的欠缺。
(2)本发明所述的基因芯片可特异地检测12种病原微生物，包括大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、邻单胞菌(Plesiomonas)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)、弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。该检测方法大约需24小时。在一张片基上可同时检测8个样品，减少了成本，实现高通量，同时检测多个样品的目的，特别适合于检测那些多重感染的样品。
(3)本发明将芯片技术引入到引起感染性腹泻病原微生物的快速检测中，建立了一种快速、灵敏、高通量、准确性高、重复性强的全新的感染性腹泻病原微生物检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到对12种主要的病原微生物进行检测的目的，由于操作简便，准确性高，能一次完成多种型别的检测，重复性强，因此对于医院和检验检疫机构具有重要的应用价值，实现对感染性病原微生物的快速准确的检测。
附图说明
图1为本发明的基因芯片结构外形示意图；
图2为本发明芯片的单一点阵结构示意图；
图3-1为利用本发明的基因芯片检测沙门氏菌的一个实施例的杂交结果示意图；
图3-2为利用本发明的基因芯片检测副溶血弧菌的一个实施例的杂交结果示意图；
图3-3为利用本发明的基因芯片检测大肠杆菌/志贺氏菌的杂交结果示意图；
图3-4利用本发明的基因芯片检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的杂交结果示意图；
图3-5用本发明的基因芯片检测亲水气单胞菌的杂交结果示意图；
图3-6用本发明的基因芯片检测的邻单胞菌的杂交结果示意图；
图3-7用本发明的基因芯片检测霍利斯弧菌的杂交结果示意图；
图3-8用本发明的基因芯片检测河流弧菌的杂交结果示意图；
图3-9用本发明的基因芯片检测拟态弧菌的杂交结果示意图。
图3-10用本发明的基因芯片检测少女鱼弧菌的杂交结果示意图；
图3-11用本发明的基因芯片检测霍乱弧菌的杂交结果示意图；
图3-12用本发明的基因芯片检测弗尼斯弧菌的杂交结果示意图。
图3-13用本发明的基因芯片检测的负对照杂交结果示意图。
图3-14用本发明的基因芯片检测的范围内近缘菌杂交结果示意图。
图3-15用本发明的基因芯片检测的粪便样品部分杂交结果示意图。
图3-16用本发明的基因芯片检测的粪便样品部分杂交结果示意图。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的基因芯片及试剂盒的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
实施例1探针的设计和制备
1.序列获得：
(1)细菌gyrB：从GenBank公共数据库下载得到大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的全部gyrB基因序列及其近缘菌的全部gyrB基因序列。
(2)ITS基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的全部ITS基因序列及其近缘菌的全部ITS基因序列。
(3)dnaJ基因基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到河流弧菌(Vibriofluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)的全部dnaJ基因序列及其近缘菌的全部dnaJ基因序列。
(4)toxR基因基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到霍利斯弧菌(Vibriohollisae)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)的全部toxR基因序列及其近缘菌的全部toxR基因序列。
(5)hugA基因基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到邻单胞菌(Plesiomonas)的全部hugA基因序列及其近缘菌的全部hugA基因序列。
(6)ipaH基因基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到志贺氏菌(Shigella)的全部ipaH基因序列及其近缘菌的全部ipaH基因序列。
2.探针设计举例：
(1)小肠结肠炎耶尔森氏菌探针：将小肠结肠炎耶尔森氏菌的gyrB基因序列导入Glustal X软件中，选取一条代表序列在公共数据NCBI中作blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。将序列导入0ligoArray2.0软件中。参数设定如下：-n 20；-l 30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-mGGGGG CCCCC TTTTT AAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。
3.探针合成：将下表1中的探针序列的5’端延长10T并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。
4.探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异的探针。
其它探针的设计方法与小肠结肠炎耶尔森氏菌探针设计方法相同，使用的设计参数也相同。
本发明通过多次杂交实验进行探针筛选，得到的优选的探针如表1所示：
表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的病原体
| SEQ ID | 探针编号 | 序列(5’-3’) | |
| NO：1 | NO.1 | GAGGTTCTGACTACACGATGGGGCTAT | 用于检测沙门氏菌； |
| NO：2 | NO.2 | CCGATTAGCTCCACCACTGACTTCCT | 用于检测副溶血弧菌； |
| NO：3 | NO.3 | GATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCC | 用于检测检测志贺氏菌； |
| NO：4 | NO.4 | AGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCA | 用于检测志贺氏菌； |
| NO：5 | NO.5 | AGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCG | 用于检测检测志贺氏菌； |
| NO：6 | NO.6 | ACCATGGCATGCTGTACTGAAGCGTAC | 用于检测检测志贺氏菌； |
| NO：7 | NO.7 | CGGTGGTTAGCACGGCGTAGGTGTATCCGT | 用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌； |
| NO：8 | NO.8 | ATTGAAAGTGGTGCGCGAAACCGATCAAACC | 用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌； |
| NO：9 | NO.9 | GTGTCGGCGTCTCCGTGGTAAACGCCCT | 用于检测亲水气单胞菌； |
| NO：10 | NO.10 | CTCCATCCGCCTGCTGGATGACCGTGA | 用于检测亲水气单胞菌； |
| NO：11 | NO.11 | GGTTCTTCCCTTCCCGCTCGCCTTG | 用于检测邻单胞菌； |
| NO：12 | NO.12 | GACAGGTGATCTTCGCTACGCTCGGAG | 用于检测邻单胞菌； |
| NO：13 | NO.13 | TCAGTCAGGTGCTCGCCATTGCCC | 用于检测邻单胞菌； |
| NO：14 | NO.14 | AGATAGCCCCCCACACTCTGATCACCGT | 用于检测邻单胞菌； |
| NO：15 | NO.15 | CCCAGACACTCCCTCTTCCTGACGCT | 用于检测霍利斯弧菌； |
| NO：16 | NO.16 | AGCCCAAAGTCTCCACCAACGCCA | 用于检测霍利斯弧菌； |
| NO：17 | NO.17 | TATCCCTGTGACGAACGCACGCATT | 用于检测霍利斯弧菌； |
| NO：18 | NO.18 | GCACCTCGGCTCAAACCTGTGGCACCTGTC | 用于检测河流弧菌； |
| NO：19 | NO.19 | TTTGGTTCACTGTGATACCTGTGATGGCAGC | 用于检测河流弧菌； |
| NO：20 | NO.20 | ATGGGCATGCGGCGTTTGAACAAGGCGCTG | 用于检测拟态弧菌； |
| NO：21 | NO.21 | TCCCAACTTTGGTTCACTGCGATGCTTGTG | 用于检测拟态弧菌； |
| NO：22 | NO.22 | GAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATA | 用于检测志贺氏菌/大肠杆菌； |
| NO：23 | NO.23 | GGAGCTGGTTATTCAGCGCGAGGGTAAA | 用于检测志贺氏菌/大肠杆菌； |
| NO：24 | NO.24 | GGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAAC | 用于检测志贺氏菌/大肠杆菌； |
| NO：25 | NO.25 | AGACAGTGCCCTTGTTACCGCTCCTCA | 用于检测少女鱼弧菌； |
| NO：26 | NO.26 | TATTCAGCAGCCACAACAGCCTATAAGCA | 用于检测少女鱼弧菌； |
| NO：27 | NO.27 | CGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT | 用于检测霍乱弧菌； |
| NO：28 | NO.28 | CTTTAAGCGTTTTCGCTGAGAATGTTT | 用于检测霍乱弧菌； |
| NO：29 | NO.29 | CGGATCCGCAGAAAAAAGCCGCTTATGACC | 用于检测弗尼斯弧菌； |
| NO：30 | NO.30 | TCCCAACACTGGTGCACTGTGAAGCATGTG | 用于检测弗尼斯弧菌； |
| NO：31 | NO.31 | AAAGGTACGTCGGCGCAAACTTGTGGCACC | 用于检测弗尼斯弧菌； |
参照图1，是本发明的基因芯片结构外形示意图，该基因芯片的上部是点样区，下部是标签区域，其中点样区内规则分布有点阵区。探针在玻璃片基上的点阵位置为：第一横排点阵区的上端距离玻璃片基的上方为9.25mm，左侧点阵区距离玻璃片基的左侧、右侧点阵区距离玻璃片基的右侧均为4.5mm，两个点阵区间的横向距离与竖向距离均为13.5mm，第三横排点阵区与第四横排点阵区之间的距离是13.5mm。
参照图2，是本发明芯片的单一点阵列结构示意图，其中的Cy3表示荧光探针，OA532为正对照探针，其中的编号对应的数字表示的核苷酸序列与表1中示出的核苷酸序列一致。
实施例2引物的设计和制备
1.引物设计举例：
(1)大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB基因通用扩增引物：将大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)全部的gyrB基因序列导入Glustal X软件中，从中选取一条有代表性的序列导入Primer Primier 5.0软件中，设定长度70bp～10bp，G+C％值40％～60％，Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、Cross Dimer：NONE。并寻找出适合通用引物设计的核苷酸序列区，其特点基本满足以下条件：1，该恒定区应包括大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的gyrB；2，该区域应包含有易于特异性探针设计的可变区，保证探针间核苷酸的差异大于4个以上；3，该区域两侧为恒定区能满足引物的设计；4，所设计的引物扩增产物不宜过大，否则影响PCR的灵敏性。设计的gyrB引物扩增产物大小为906bp。
(2)沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ITS基因中的引物设计方法与(1)相同。
(3)河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)的dnaJ基因中的引物设计方法与(1)相同。
(4)霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)toxR基因中的引物设计方法与(1)相同。
(5)邻单胞菌(Plesiomonas)的hugA基因中的引物设计方法与(1)相同。
(6)志贺氏菌(Shigella)的ipaH基因中的引物设计方法与(1)相同。
其它引物的设计方法与上述探针引物方法相同，使用的设计参数也相同。
2.引物合成：将表2中的引物序列委托探针合成公司(英俊生物技术公司)合成(PAGE纯化)，备用。其中用于扩增大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB基因通用扩增引物：将大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB的通用引物为简并引物，W代表A/T，V代表A/C/G，Y代表G/C，B代表C/G/T，K代表G/T，R代表A/G。
表2用于引起人类感染性腹泻病原菌检测的PCR扩增引物序列
| 编号 | SEQ ID | 序列(5’-3’) | 引物作用 |
| P1 | NO：32 | WCVGGTYTGCAYCAYATG | 用于扩增gyrB的通用上游引物 |
| P2 | NO：33 | TCTGBGAKGARAAYTTVGG | 用于扩增gyrB的通用下游引物 |
| P3 | NO：34 | TGTACACACCGCCCGTC | 用于扩增ITS的上游引物 |
| P4 | NO：35 | GGTACTTAGATGTTTCAGTTC | 用于扩增ITS的下游引物 |
| P5 | NO：36 | TTTTAYGAAGTDYTDGGYGT | 用于扩增dnaJ的上游引物 |
| P6 | NO：37 | GACAVGTWGGACAGGYYTGYTG | 用于扩增dnaJ的下游引物 |
| P7 | NO：38 | CAATCCATTTCCACCCTTC | 用于扩增霍利斯弧菌toxR的上游引物 |
| P8 | NO：39 | TCCCTTGTTGGCTGGTTAG | 用于扩增霍利斯弧菌toxR的下游引物 |
| P9 | NO：40 | ACTGGCTATTACAGCAACCG | 用于扩增少女鱼弧菌toxR的上游引物 |
| P10 | NO：41 | GGTGGCAATAACTTTAACTGG | 用于扩增少女鱼弧菌toxR的下游引物 |
| P11 | NO：42 | CAAACGCTAACTCATCATC | 用于扩增邻单胞菌hugA的上游引物 |
| P12 | NO：43 | AATGAAGTCCTGGTTACGG | 用于扩增邻单胞菌hugA的下游引物 |
| P13 | NO：44 | TTCCTTGACCGCCTTTC | 用于扩增志贺氏菌ipaH的上游引物 |
| P14 | NO：45 | GCCAGTACCTCGTCAGTCA | 用于扩增志贺氏菌ipaH的下游游引物 |
(1)P1/P2用于扩增大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB基因通用扩增引物：将大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的gyrB基因。
(2)P3/P4用于扩增沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的ITS基因。
(3)P5/P6用于扩增河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)的dnaJ基因。
(4)P7/P8用于扩增霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)的toxR基因基因。
(5)P9/P10用于扩增少女鱼弧菌(Vibrio damsela)的toxR基因基因
(6)P11/P12用于扩增邻单胞菌(Plesiomonas)的hugA基因。
(7)P13/P14用于扩增志贺氏菌(Shigella)的ipaH基因。
实施例3对该基因芯片的特异性鉴定
1.目的菌DNA的提取：
将搜集到的基因芯片所检测的目的菌及其近缘菌株过夜培养24h；用裂解液进行基因组DNA的提取。
2.扩增靶序列：
取上述基因组提取方法提取的3ul上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表3，4所示。(注：以下表3，4-表5，6中的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均购自Takara公司)
表3PCR反应混合液AI配方
注：①引物混合物I中各引物的浓度为：P1，P2，P5，P6为0.4μmolL-1；P13，P14为0.2μmolL-1。
表4PCR反应混合液BI配方
注：①引物混合物I中各引物的浓度为：P3，P4，P7，P8，P9，P10为0.2μmolL-1；P11，P12为0.32μmolL-1。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃5分钟；94℃30秒；50℃30秒；72℃40秒回到第三步，共35个循环；
72℃5分钟
3.荧光标记靶序列：取AI10μl扩增产物和BI10μl扩增产物分别加入到AII和BII体系中，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表5，6所示。取AI10μl扩增产物和BI10μl扩增产物分别加入到AII和BII体系中，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表5，6所示。
表5标记反应混合液AII配方
注：①引物混合物I中各引物的浓度为：P2，P6为0.4μmolL-1；P14为0.2μmolL-1。
表6标记反应混合液BII配方
注：①引物混合物I中各引物的浓度为：P4，P8，P10为0.2μmolL-1；P12为0.32μmolL-1。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：94℃5分钟；94℃30秒；50℃30秒；72℃40秒回到第三步，共35个循环；72℃5分钟
4.杂交：将对应编号的AII和BII充分混匀后放65℃烘箱烘干，向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH2O以保持湿度。取18μl-2杂交液与烘干标记产物混合均匀，并加在实施例一中制备的饮用水常见病原微生物检测基因芯片的探针阵列区域，盖上盖片(博奥公司产品，产品号430042)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，44℃水浴锅中杂交12小时。
杂交液配方：25％formamide，0.1％SDS，6×SSPE。
5.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。
洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
6.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXON instrument)扫描，所用参数如下：软件及版本：GenePix Pro 6.0
official name：575DF35
PMT Gain：550
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
用本发明的基因芯片分别检测本发明所涉及引起人类感染性腹泻的病原微生物的检测时的杂交扫描结果分别如图3所示。
7.杂交结果的分析判读：本芯片为低密度芯片，探针数量较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以荧光探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出病原体。其中OA532为阳性对照探针，有两方面作用：1显示PCR反应体系是否正常，有无抑制物存在；2临床样品取样量是否足够及样品处理是否正确。
8.该芯片检测所用菌种范围：
| 菌名 | 数量 | 来源 |
| 志贺氏菌 | 20 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 致泻性大肠杆菌 | 20 | 中国医学细菌保藏管理中心 |
| 沙门氏菌 | 20 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 副溶血弧菌 | 20 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 小肠结肠炎耶尔森氏菌 | 4 | 美国典型微生物保藏中心 |
| 亲水单胞菌 | 3 | 中国医学细菌保藏管理中心 |
| 霍乱弧菌 | 3 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 空肠弯曲杆菌 | 1 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 拟态弧菌 | 3 | 美国典型微生物保藏中心 |
| 河弧菌 | 3 | 美国典型微生物保藏中心 |
| 弗尼斯弧菌 | 4 | 美国典型微生物保藏中心 |
| 霍利斯弧菌 | 1 | 美国典型微生物保藏中心 |
| 少女鱼弧菌 | 1 | 美国典型微生物保藏中心 |
| 邻单胞菌 | 1 | 美国典型微生物保藏中心 |
| 嗜矿泉气单胞菌 | 1 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 弗劳地枸橼酸杆菌 | 1 | 中国医学细菌保藏管理中心 |
| 肺炎克雷伯氏菌 | 1 | 中国医学细菌保藏管理中心 |
| 铜绿假单胞菌 | 1 | 中国普通微生物保藏管理中心 |
| 肺炎链球菌 | 1 | 美国典型微生物保藏中心 |
| 金黄色葡萄球菌 | 1 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 卡他莫拉氏菌 | 1 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 鲍曼不动杆菌 | 1 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 嗜麦芽寡养单胞菌 | 1 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 阴沟肠杆菌 | 1 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 表皮葡萄球菌 | 1 | 上海市疾病预防控制中心 |
| 溶血葡萄球菌 | 1 | 上海市疾病预防控制中心 |
实施例4
利用基因芯片快速检测引起人类感染性腹泻的主要病原微生物及试剂盒的制备
本实施例仅以粪便为例介绍试剂盒的使用方法：
1.样品处理：
取腹泻病人的粪便作为研究样品。
(1)将收集得到的180-220mg临床粪便样品置于缓冲液中悬浮；
(2)12000g离心3min，沉淀粪便颗粒，取1ml上清，12000g离心3min；
(3)弃上清，加入100μl裂解液，混匀，100℃水浴10min；
(4)上一步得到的裂解产物15000g离心5min；
(5)收集上清，上清中即含有基因组DNA，即可用于检测或-20℃保存。
附：裂解液配方：
50m molL-1NaOH；10m molL-1Tris-HCl(pH 8.0)；0.5％Tween-20；0.5％NP-40；0.5m molL-1EDTA(pH 8.0)；5％chelex-100
2.扩增靶序列：
取上述基因组提取方法提取的3ul上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表3，4所示。(注：以下表3，4-表5，6中的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均购自Takara公司)
表7PCR反应混合液AI配方
注：①引物混合物I中各引物的浓度为：P1，P2，P5，P6为0.4μmolL-1；P13，P14为0.2μmolL-1。
表8PCR反应混合液BI配方
注：①引物混合物1中各引物的浓度为：P3，P4，P7，P8，P9，P10为0.2μmolL；P11，P12为0.32μmolL-1。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃5分钟；94℃30秒；50℃30秒；72℃40秒回到第三步，共35个循环；
72℃5分钟
3.荧光标记靶序列：取AI10μl扩增产物和BI10μl扩增产物分别加入到AII和BII体系中，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表5，6所示。
表9标记反应混合液AII配方
注：①引物混合物I中各引物的浓度为：P2，P6为0.4μmolL-1；P14为0.2μmolL-1。
表10标记反应混合液BII配方
注：①引物混合物I中各引物的浓度为：P4，P8，P10为0.2μmolL-1；P12为0.32μmolL-1。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃5分钟；94℃30秒；50℃30秒；72℃40秒回到第三步，共35个循环；
72℃5分钟
4.杂交：将对应编号的AII和BII充分混匀后放65℃烘箱烘干，向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH2O以保持湿度。取18μl-2杂交液与烘干标记产物混合均匀，并加在实施例一中制备的饮用水常见病原微生物检测基因芯片的探针阵列区域，盖上盖片(博奥公司产品，产品号430042)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，44℃水浴锅中杂交12小时。
杂交液配方：25％formamide，0.1％SDS，6×SSPE。
5.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。
洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
6.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXON instrument)扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro 6.0
official name：575DF35
PMT Gain：550
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
用本发明的基因芯片分别检测本发明所涉及引起人类感染性腹泻的病原微生物的检测时的杂交扫描结果分别如图3所示。
7.杂交结果的分析判读：本芯片为低密度芯片，探针数量较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以荧光探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出病原体。其中OA532为阳性对照探针，有两方面作用：1显示PCR反应体系是否正常，有无抑制物存在；2临床样品取样量是否足够及样品处理是否正确。
利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测的引起人类感染性腹泻的病原微生物至少包括大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、邻单胞菌(Plesiomonas)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、少女鱼弧菌(Vibriodamsela)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)至少一种的检测，其中该试剂盒还带有使用此试剂盒的说明书等。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种用于感染性腹泻的检测型基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述的寡聚核苷酸探针包含从具有明显生物进化优势的gyrB基因、ITS基因及dnaJ、toxR等基因上选取的DNA片段或其互补的DNA片段。
2.权利要求1所述的基因芯片，其中的寡聚核苷酸探针为下述DNA片段中的至少一种：
①大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)及亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)gyrB基因中所选取的至少一种DNA片段；
②沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ITS基因中选取的至少一种DNA片段；
③河流弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、弗尼斯弧菌(Vibriofrnissii)的dnaJ基因中选取的DNA片段；
④霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、少女鱼弧菌(Vibrio damsela)toxR基因中选取的DNA片段；
⑤邻单胞菌hugA基因中选取的DNA片段；
⑥志贺氏菌ipaH基因中选取的DNA片段；
⑦①或②或③或④或⑤或⑥中选取的DNA片段的互补DNA片段。
3.权利要求1所述的基因芯片，其中所述寡聚核苷酸探针具有SEQ ID NO：1-31所示的核苷酸序列或不同于SEQ ID NO：1-31但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1-31所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的基因芯片，其中所述的感染性腹泻为：引起人类感染性腹泻的大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、亲水气单胞菌、邻单胞菌、霍利斯弧菌、河流弧菌、拟态弧菌、少女鱼弧菌、弗尼斯弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌。
5.权利要求1所述用于感染性腹泻的检测型基因芯片的制备方法，其特征在于：按如下的步骤进行：
1)根据病原菌的gyrB基因、ITS基因、dnaJ基因及toxR基因、hugA基因、ipaH基因保守区设计并制备出用于PCR扩增的引物；
2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，对待测样品基因组DNA进行PCR扩增，得到靶序列；
3)标记步骤2)中得到的靶序列；
4)将标记后的靶序列与上述的基因芯片杂交；
5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。
其中，步骤1)中所述的引物包括SEQ ID NO：32-45所示的核苷酸序列的至少一种。
6.一种采用权利要求1所述基因芯片检测感染性腹泻的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括SEQ ID NO：1-31的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的至少一种；还包含PCR扩增的引物，该引物具有SEQ ID NO：32-45的核苷酸序列的至少一种；
7.权利要求6所述的试剂盒的应用，其特征在于，可用于引起人类感染性腹泻的大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、亲水气单胞菌、邻单胞菌、霍利斯弧菌、河流弧菌、拟态弧菌、少女鱼弧菌、弗尼斯弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的至少一种致病菌的检测。
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