JP2024504613A - 分泌性ペイロード調節 - Google Patents
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Abstract
本明細書中に記載されるのは、膜切断可能なキメラタンパク質及びデグロン融合キメラタンパク質を含むキメラタンパク質である。また、本明細書中に記載されるのは、それに関する核酸、医薬組成物、方法、及び治療の方法である。【選択図】図1
Description
関連出願
本出願は、2021年1月14日に出願された米国仮特許出願第63/137,419号の利益を主張し、それは、全ての目的のためにその全体において参照により本明細書中に組み入れられる。
本出願は、2021年1月14日に出願された米国仮特許出願第63/137,419号の利益を主張し、それは、全ての目的のためにその全体において参照により本明細書中に組み入れられる。
配列表
本出願には、EFS-Webを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。当該ASCIIコピーは、2022年1月13日に作成されたが、STB-019WO_SL.txt,と名付けられ、サイズは183,806バイトである。
本出願には、EFS-Webを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。当該ASCIIコピーは、2022年1月13日に作成されたが、STB-019WO_SL.txt,と名付けられ、サイズは183,806バイトである。
背景
癌は、世界のすべての国において、主要な死亡の原因であり、増加する平均余命に対する重要な障壁としてランク付けされている。世界中で、推定1,930万人の新規癌症例及びほぼ1,000万人の癌死が2020年に生じた。さらに、2019年の世界保健機関(WHO)のGlobel Health Estimatesによれば、癌は、分析された183ヶ国の112ヶ国において年齢70歳以前での第一又は第二の死亡の原因であり、分析されたさらに23ヶ国において第三位又は第四位にランク付けされた。その後、癌を伴う個人及び社会全体の両方に対して、癌の顕著な財政的負担もある。米国単独でも、癌ケアのための費用は、2020年には2,089億ドルと推定されている。当技術分野では、癌を治療するための改善された組成物及び方法についてのニーズが依然として存在する。
癌は、世界のすべての国において、主要な死亡の原因であり、増加する平均余命に対する重要な障壁としてランク付けされている。世界中で、推定1,930万人の新規癌症例及びほぼ1,000万人の癌死が2020年に生じた。さらに、2019年の世界保健機関(WHO)のGlobel Health Estimatesによれば、癌は、分析された183ヶ国の112ヶ国において年齢70歳以前での第一又は第二の死亡の原因であり、分析されたさらに23ヶ国において第三位又は第四位にランク付けされた。その後、癌を伴う個人及び社会全体の両方に対して、癌の顕著な財政的負担もある。米国単独でも、癌ケアのための費用は、2020年には2,089億ドルと推定されている。当技術分野では、癌を治療するための改善された組成物及び方法についてのニーズが依然として存在する。
概要
本明細書中で提供されるのは、一部の実施形態では、癌、例えば卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、及び膵臓癌などの標的化治療のための組み合わせの細胞ベースの免疫療法である。免疫療法は、腫瘍内及び/又は腫瘍の近く(「腫瘍微小環境(TME)」)で多因子調節を可能にする、操作された細胞回路に頼る。免疫療法の興奮させる進歩にもかかわらず、癌に対するその有効性は、限定されてきた。
本明細書中で提供されるのは、一部の実施形態では、癌、例えば卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、及び膵臓癌などの標的化治療のための組み合わせの細胞ベースの免疫療法である。免疫療法は、腫瘍内及び/又は腫瘍の近く(「腫瘍微小環境(TME)」)で多因子調節を可能にする、操作された細胞回路に頼る。免疫療法の興奮させる進歩にもかかわらず、癌に対するその有効性は、限定されてきた。
本明細書中で提供される免疫療法は、しかし、腫瘍特異的であり、有効的であるが、しかし、全身毒性を限定する。この免疫療法は、調節された様式において、目的の腫瘍微小環境タンパク質、例えば免疫調節エフェクター分子などに送達される。送達媒体の設計は、癌治療における全体的な機能を改善させるために最適化されており、限定されないが、プロモーター、リンカー、シグナルペプチド、送達方法、免疫調節エフェクター分子の組み合わせ、調節、及び順序の最適化を含む。
腫瘍が、腫瘍細胞と周囲の間質の間での複雑な相互作用であることがますます認識されており、それは、細胞外マトリックス、癌関連間質細胞(MSC及び線維芽細胞)、腫瘍血管系、及び免疫系を含む。TMEは、患者の自然免疫系及び適応免疫系の両方を標的化する複数の機構を通じて、抗腫瘍免疫応答を抑制する。例えば、腫瘍は、特定のケモカイン、例えばCCL22などを産生することにより、従来のT細胞の抗腫瘍活性を抑制する調節性T細胞を動員及び誘導することができる。腫瘍はまた、T細胞及びNK細胞の活性を阻害する分子、例えば免疫チェックポイント、例えばPD-L1などを発現することができる。このように、単一の経路を標的化することは、固形腫瘍に対して頑強な有効性を達成するために不十分である可能性が高い。
本開示により包含されるエフェクター分子の非限定的な例は、サイトカイン、抗体、ケモカイン、ヌクレオチド、ペプチド、酵素、及び腫瘍溶解性ウイルスを含む。例えば、細胞は、以下のエフェクター分子の少なくとも一つ、二つ、三つ又はそれ以上を、調節された様式において発現及び分泌するように操作され得る:IL-12、IL-16、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、IL-21、OX40リガンド、CD40L、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TGFβ抗体、抗TNFR2、MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)、CCL21、CpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び抗腫瘍ペプチド(例、抗腫瘍活性を有する抗菌ペプチド。例えば、Gaspar,D.et al.FrontMicrobiol.2013;4:294;Chu,H.et al.PLoS One.2015;10(5):e0126390、及びwebsite:aps.unmc.edu/AP/main.phpを参照のこと)。
本明細書中で提供されるのは、プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含む、操作された核酸であって、N末端からC末端に向かって配向されており、式:S-C-MT-Dを有し、それにおいて、Sは分泌性エフェクター分子を含み、Cはプロテアーゼ切断部位を含み、MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつDはデグロンを含み、それにおいて、プロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつ、それにおいて、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている。一部の態様では、操作された核酸は、以下からなる群から選択される:DNA、cDNA、RNA、mRNA、及びネイキッドプラスミド。
一部の態様では、プロモーターは、構成的プロモーターである。一部の態様では、構成的プロモーターは、以下からなる群から選択される:CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb、及びhUBIb。一部の態様では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の態様では、誘導性プロモーターは、以下からなる群から選択される:minP、NFkB応答エレメント、CREB応答エレメント、NFAT応答エレメント、SRF応答エレメント1、SRF応答エレメント2、AP1応答エレメント、TCF-LEF応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答性エレメント、SMAD結合エレメント、STAT3結合部位、minCMV、YB_TATA、minTK、インデューサー分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピート。一部の態様では、プロモーターは、合成プロモーターである。一部の態様では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
一部の態様では、分泌性エフェクター分子は、分泌性エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む。一部の態様では、分泌性エフェクター分子は、分泌性エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む。一部の態様では、非天然シグナルペプチドは、以下からなる群から選択される:IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSF。
一部の態様では、分泌性エフェクター分子は治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、以下からなる群から選択される:サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ペプチド、及び酵素。一部の態様では、分泌性エフェクター分子は、ヒト由来エフェクター分子である。一部の態様では、サイトカインは、以下からなる群から選択される:IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファ。一部の態様では、ケモカインは、以下からなる群から選択される:CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1。一部の態様では、ホーミング分子は、以下からなる群から選択される:抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2。一部の態様では、成長因子は、以下からなる群から選択される:FLT3L及びGM-CSF。一部の態様では、共活性化分子は、以下からなる群から選択される:4-1BBL及びCD40L。一部の態様では、腫瘍微小環境修飾因子は、以下からなる群から選択される:アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2。一部の態様では、TGFベータインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせ。一部の態様では、免疫チェックポイントインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体。一部の態様では、VEGFインヒビターは、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。
一部の態様では、プロテアーゼ切断部位は、以下からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である:1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位。一部の態様では、細胞膜係留ドメインは、膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む。一部の態様では、膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインは、PDGFRベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する。一部の態様では、細胞膜係留ドメインは、細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む。一部の態様では、細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子は、細胞の細胞膜に係留される。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを発現する細胞中で発現される場合、分泌性エフェクター分子は、細胞膜から放出される。一部の態様では、細胞膜上に発現されるプロテアーゼは、細胞に対して内因性である。一部の態様では、プロテアーゼは、以下からなる群から選択される:1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼ。一部の態様では、細胞膜上に発現されるプロテアーゼは、細胞に対して異種である。一部の態様では、プロテアーゼは、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位は、NS3プロテアーゼ切断部位を含む。一部の態様では、NS3プロテアーゼ切断部位は、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合点切断部位を含む。一部の態様では、プロテアーゼは、プロテアーゼインヒビターによって抑制され得る。一部の態様では、プロテアーゼインヒビターは、以下からなる群から選択される:シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビル。一部の態様では、プロテアーゼの発現は、調節が可能である。
一部の態様では、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンは含む。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、以下からなる群から選択される:IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である。一部の態様では、IMiDはFDA承認薬物であり、それにおいて、IMiDは、以下からなる群から選択される:サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミド。一部の態様では、デグロンは、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される。一部の態様では、デグロンは、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかを含む発現ベクターである。一部の態様では、発現ベクターはウイルスベクターである。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかによりコードされる膜切断可能なキメラタンパク質である。
また、本明細書中で提供されるのは、N末端からC末端に配向された膜切断可能なキメラタンパク質であって、式:S-C-MT-Dを有し、それにおいて、Sは分泌性エフェクター分子を含み、Cはプロテアーゼ切断部位を含み、MTは細胞膜係留ドメインを含み、Dはデグロンを含み、それにおいて、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか、又は本明細書中に記載される発現ベクターのいずれか、又は本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質のいずれかを含む単離細胞である。一部の態様では、細胞は、以下からなる群から選択される自己細胞又は同種細胞である:T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマデルタT細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、調節性T細胞、ウイルス特異的T細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞(ESC)、ESC由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞(MSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、及びiPSC由来細胞。
また、本明細書中で提供されるのは、操作された核酸を含む単離細胞であって、それにおいて、操作された核酸は、プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含み、N末端からC末端に配向されており、式:S-C-MT-Dを有し、それにおいて、Sは分泌性エフェクター分子を含み、Cはプロテアーゼ切断部位を含み、MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつDはデグロンを含み、それにおいて、プロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつ、それにおいて、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている。一部の態様では、細胞は、以下からなる群から選択される自己細胞又は同種細胞である:T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマデルタT細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、調節性T細胞、ウイルス特異的T細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞(ESC)、ESC由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞(MSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、及びiPSC由来細胞。
一部の態様では、細胞は、抗原認識受容体をさらに含む。一部の態様では、抗原認識受容体は、以下からなる群から選択される抗原を認識する:5T4、ADAM9、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、カドヘリン3、カドヘリン6、CCR4、CD123、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD30、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CEA、CEACAM5、クローディン18.2、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、ENPP3、EpCAM、EphA2、エフリンA4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRアルファ、FRb、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、インテグリンaV、KIT、L1CAM、LAMP1、ルイスY、LeY、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、メソテリン、MUC1、MUC16、MUC1C、NaPi2B、ネクチン4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、オバリン、Pカドヘリン、pan-Erb2、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLITRK6、SSTR2、STEAP1、サバイビン、TDGF1、TIM1、TROP2、及びWT1。一部の態様では、抗原認識受容体は、抗原結合ドメインを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、抗体、抗体の抗原結合断片、F(ab)断片、F(ab’)断片、一本鎖可変断片(scFv)、又は単一ドメイン抗体(sdAb)を含む。一部の態様では、scFvは、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の態様では、VH及びVLは、ペプチドリンカーにより分離される。一部の態様では、scFvは、構造VH-L-VL又はVL-L-VHを含み、それにおいて、VHは重鎖可変ドメインであり、Lはペプチドリンカーであり、かつVLは軽鎖可変ドメインである。一部の態様では、抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体(CAR)である。一部の態様では、CARは、一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、以下からなる群から選択される:CD3ゼータ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、CD97細胞内シグナル伝達ドメイン、CD11a-CD18細胞内シグナル伝達ドメイン、CD2細胞内シグナル伝達ドメイン、ICOS細胞内シグナル伝達ドメイン、CD27細胞内シグナル伝達ドメイン、CD154細胞内シグナル伝達ドメイン、CD8細胞内シグナル伝達ドメイン、OX40細胞内シグナル伝達ドメイン、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD28細胞内シグナル伝達ドメイン、ZAP40細胞内シグナル伝達ドメイン、CD30細胞内シグナル伝達ドメイン、GITR細胞内シグナル伝達ドメイン、HVEM細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP10細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP12細胞内シグナル伝達ドメイン、及びMyD88細胞内シグナル伝達ドメイン。一部の態様では、CARは、膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、以下からなる群から選択される:CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、OX40膜貫通ドメイン、ICOS膜貫通ドメイン、CTLA-4膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、LAG-3膜貫通ドメイン、2B4膜貫通ドメイン、及びBTLA膜貫通ドメイン。一部の態様では、CARは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサー領域を含む。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか、本明細書中に記載される発現ベクターのいずれか、本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか、又は本明細書中に記載される単離細胞いずれか、及び医薬的に許容可能な担体、医薬的に許容可能な賦形剤、又はその組み合わせを含む組成物である。
また、本明細書中で提供されるのは、それを必要とする対象を治療する方法であって、この方法は、本明細書中に記載される操作された核酸のいずれか、本明細書中に記載される発現ベクターのいずれか、本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか、本明細書中に記載される単離細胞のいずれか、又は本明細書中に記載される組成物のいずれかを投与することを含む。
本明細書中で提供されるのは、プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含む、操作された核酸であって、N末端からC末端に向かって配向されており、式:S-C-MT-Dを有し、それにおいて、Sは分泌性エフェクター分子を含み、Cはプロテアーゼ切断部位を含み、MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつDはデグロンを含み、それにおいて、プロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつ、それにおいて、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている。
一部の態様では、プロモーターは、構成的プロモーターである。一部の態様では、構成的プロモーターは、以下からなる群から選択される:CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb、及びhUBIb。一部の態様では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の態様では、誘導性プロモーターは、以下からなる群から選択される:minP、NFkB応答エレメント、CREB応答エレメント、NFAT応答エレメント、SRF応答エレメント1、SRF応答エレメント2、AP1応答エレメント、TCF-LEF応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答性エレメント、SMAD結合エレメント、STAT3結合部位、minCMV、YB_TATA、minTK、インデューサー分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピート。一部の態様では、プロモーターは、合成プロモーターである。一部の態様では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
一部の態様では、分泌性エフェクター分子は、シグナルペプチドを含む。一部の態様では、シグナルペプチドは、分泌性エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む。一部の態様では、シグナルペプチドは、分泌性エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む。一部の態様では、非天然シグナルペプチドは、以下からなる群から選択される:IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSF。
一部の態様では、分泌性エフェクター分子は治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、以下からなる群から選択される:サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ペプチド、及び酵素。一部の態様では、サイトカインは、以下からなる群から選択される:IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファ。一部の態様では、ケモカインは、以下からなる群から選択される:CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1。一部の態様では、ホーミング分子は、以下からなる群から選択される:抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2。一部の態様では、成長因子は、以下からなる群から選択される:FLT3L及びGM-CSF。一部の態様では、共活性化分子は、以下からなる群から選択される:4-1BBL及びCD40L。一部の態様では、腫瘍微小環境修飾因子は、以下からなる群から選択される:アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2。一部の態様では、TGFベータインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせ。一部の態様では、免疫チェックポイントインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体。一部の態様では、VEGFインヒビターは、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。一部の態様では、分泌性エフェクター分子は、ヒト由来エフェクター分子である。
一部の態様では、プロテアーゼ切断部位は、以下からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である:1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位。
一部の態様では、細胞膜係留ドメインは、膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む。一部の態様では、膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインは、PDGFR ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する。一部の態様では、細胞膜係留ドメインは、細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む。
一部の態様では、細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子は、細胞の細胞膜に係留される。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを発現する細胞中で発現される場合、分泌性エフェクター分子は、細胞膜から放出される。一部の態様では、細胞膜上に発現されるプロテアーゼは、細胞に対して内因性である。一部の態様では、プロテアーゼは、以下からなる群から選択される:1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼ。一部の態様では、細胞膜上に発現されるプロテアーゼは、細胞に対して異種である。一部の態様では、プロテアーゼは、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位は、NS3プロテアーゼ切断部位を含む。一部の態様では、NS3プロテアーゼ切断部位は、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合点切断部位を含む。一部の態様では、プロテアーゼは、プロテアーゼインヒビターによって抑制され得る。一部の態様では、プロテアーゼインヒビターは、以下からなる群から選択される:シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビル。一部の態様では、プロテアーゼの発現は、調節が可能である。
一部の態様では、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンは含む。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、以下からなる群から選択される:IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である。一部の態様では、IMiDは、FDA承認薬物である。一部の態様では、IMiDは、以下からなる群から選択される:サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミド。
一部の態様では、デグロンは、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される。一部の態様では、デグロンは、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている。
一部の態様では、操作された核酸は、以下からなる群から選択される:DNA、cDNA、RNA、mRNA、及びネイキッドプラスミド。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかを含む発現ベクターである。一部の態様では、発現ベクターはウイルスベクターである。一部の態様では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
また、本明細書中で提供されるのは、N末端からC末端に配向された膜切断可能なキメラタンパク質であって、式:S-C-MT-Dを有し、それにおいて、Sは分泌性エフェクター分子を含み、Cはプロテアーゼ切断部位を含み、MTは細胞膜係留ドメインを含み、Dはデグロンを含み、それにおいて、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている。
一部の態様では、分泌性エフェクター分子は、シグナルペプチドを含む。一部の態様では、シグナルペプチドは、分泌性エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む。一部の態様では、シグナルペプチドは、分泌性エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む。一部の態様では、非天然シグナルペプチドは、以下からなる群から選択される:IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSF。
一部の態様では、分泌性エフェクター分子は治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、以下からなる群から選択される:サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ペプチド、及び酵素。一部の態様では、サイトカインは、以下からなる群から選択される:IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファ。一部の態様では、ケモカインは、以下からなる群から選択される:CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1。一部の態様では、ホーミング分子は、以下からなる群から選択される:抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2。一部の態様では、成長因子は、以下からなる群から選択される:FLT3L及びGM-CSF。一部の態様では、共活性化分子は、以下からなる群から選択される:4-1BBL及びCD40L。一部の態様では、腫瘍微小環境修飾因子は、以下からなる群から選択される:アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2。一部の態様では、TGFベータインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせ。一部の態様では、免疫チェックポイントインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体。一部の態様では、VEGFインヒビターは、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。一部の態様では、分泌性エフェクター分子は、ヒト由来エフェクター分子である。
一部の態様では、プロテアーゼ切断部位は、以下からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である:1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位。
一部の態様では、細胞膜係留ドメインは、膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む。一部の態様では、膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインは、PDGFR ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する。一部の態様では、細胞膜係留ドメインは、細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む。一部の態様では、細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子は、細胞の細胞膜に係留される。
一部の態様では、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを発現する細胞中で発現される場合、分泌性エフェクター分子は、細胞膜から放出される。一部の態様では、細胞膜上に発現されるプロテアーゼは、細胞に対して内因性である。一部の態様では、プロテアーゼは、以下からなる群から選択される:1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼ。一部の態様では、細胞膜上に発現されるプロテアーゼは、細胞に対して異種である。一部の態様では、プロテアーゼは、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位は、NS3プロテアーゼ切断部位を含む。一部の態様では、NS3プロテアーゼ切断部位は、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合点切断部位を含む。
一部の態様では、プロテアーゼは、プロテアーゼインヒビターによって抑制され得る。一部の態様では、プロテアーゼインヒビターは、以下からなる群から選択される:シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビル。
一部の態様では、プロテアーゼは、デグロンをさらに含む。一部の態様では、プロテアーゼの発現は、調節が可能である。
一部の態様では、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンは含む。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、以下からなる群から選択される:IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である。一部の態様では、IMiDは、FDA承認薬物である。一部の態様では、IMiDは、以下からなる群から選択される:サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミド。
一部の態様では、デグロンは、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される。一部の態様では、デグロンは、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか、又は本明細書中に記載される発現ベクターのいずれか、又は本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物である。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか、又は本明細書中に記載される発現ベクターのいずれか、又は本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質のいずれかを含む単離細胞である。
また、本明細書中で提供されるのは、操作された核酸を含む単離細胞であって、それにおいて、操作された核酸は、プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含み、N末端からC末端に配向されており、式:S-C-MT-Dを有し、それにおいて、Sは分泌性エフェクター分子を含み、Cはプロテアーゼ切断部位を含み、MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつDはデグロンを含み、それにおいて、プロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつ、それにおいて、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている。
一部の態様では、操作された核酸を、組換え発現させる。一部の態様では、操作された核酸を、ベクター、又は細胞のゲノムからの選択された遺伝子座から発現させる。
また、本明細書中で提供されるのは、膜切断可能なキメラタンパク質を含む単離細胞であって、それにおいて、N末端からC末端に配向された膜切断可能なキメラタンパク質は、式:S-C-MT-Dを有し、それにおいて、Sは分泌性エフェクター分子を含み、Cはプロテアーゼ切断部位を含み、MTは細胞膜係留ドメインを含み、Dはデグロンを含み、ならびに、それにおいて、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている。
一部の態様では、細胞は、以下からなる群から選択される:T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマデルタT細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、調節性T細胞、ウイルス特異的T細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞(ESC)、ESC由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞(MSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、及びiPSC由来細胞。一部の態様では、細胞は、自家である。一部の態様では、細胞は、同種である。一部の態様では、細胞は、以下からなる群から選択される腫瘍細胞である:膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、子宮頸部腫瘍細胞、結腸直腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、神経膠腫細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、及び子宮腫瘍細胞。
一部の態様では、細胞を、腫瘍溶解性ウイルスを用いた形質導入を介して操作した。一部の態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、以下からなる群から選択される:腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアント又は誘導体。一部の態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスである。
一部の態様では、細胞は、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼをさらに含む。一部の態様では、プロテアーゼは、内因性プロテアーゼを含む。一部の態様では、内因性プロテアーゼは、以下からなる群から選択される:1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼ。一部の態様では、プロテアーゼは、異種プロテアーゼである。一部の態様では、異種プロテアーゼは、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である。一部の態様では、プロテアーゼは、細胞の細胞膜上に発現される。一部の態様では、プロテアーゼは、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能である。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位の切断によって、細胞の細胞膜から分泌性エフェクター分子が放出される。
一部の態様では、細胞は、抗原認識受容体をさらに含む。一部の態様では、抗原認識受容体は、以下からなる群から選択される抗原を認識する:5T4、ADAM9、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、カドヘリン3、カドヘリン6、CCR4、CD123、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD30、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CEA、CEACAM5、クローディン18.2、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、ENPP3、EpCAM、EphA2、エフリンA4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRアルファ、FRb、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、インテグリンaV、KIT、L1CAM、LAMP1、ルイスY、LeY、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、メソテリン、MUC1、MUC16、MUC1C、NaPi2B、ネクチン4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、オバリン、Pカドヘリン、pan-Erb2、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLITRK6、SSTR2、STEAP1、サバイビン、TDGF1、TIM1、TROP2、及びWT1。一部の態様では、抗原認識受容体は、抗原結合ドメインを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、抗体、抗体の抗原結合断片、F(ab)断片、F(ab’)断片、一本鎖可変断片(scFv)、又は単一ドメイン抗体(sdAb)を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、一本鎖可変断片(scFv)を含む。一部の態様では、scFvは、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。一部の態様では、VH及びVLは、ペプチドリンカーにより分離される。一部の態様では、scFvは、構造VH-L-VL又はVL-L-VHを含み、それにおいて、VHは重鎖可変ドメインであり、Lはペプチドリンカーであり、かつVLは軽鎖可変ドメインである。一部の態様では、抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)である。一部の態様では、抗原認識受容体が、PF-06263507、ASN004、GEN1044、MGA021、YW327.6S2、D9、E8、Mab173、オブリダタマブ、mAb378.96、XMT-1660、ルパルツマブ アマドチン、HKT288、モガムリズマブ、CSL362、AC133、AC141、VIS832、CX-2009、ダクリズマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、SGN-CD352A、IMGN529、リロトマブ、ダラツムマブ、ビバツズマブ、m900、m906、ラベツズマブ、RO6958688、MFE-23、ARGX-110、ボルセツズマブ マホドチン、INA01、ミラツズマブ、ポラツズマブ ベドチン、ガリキシマブ、ポラツズマブ ベドチン、ガリキシマブ、クラウディキシマブ、ゾルベツキシマブ、アミバンタマブ、オナルツズマブ、エミベツズマブ、ARGX-111、YYB-101、TP41.2、イピリムマブ、AK104、ロバルピツズマブ テシリン、TRA-8、ザパジシン-1、セツキシマブ、パニツムマブ、アデカツムマブ、DS-8895a、PF-06647263、DEDN6526A、BAY 1179470、ベマリツズマブ、MORAb-003、IMGN853、MLN0264、TAK-264、ジヌツキシマブ、MGD007、A33scFv-Fc、コドリツズマブ、ERY974、グレンバツムマブ(CR011)、タケタマブ、トラスツズマブ、ASLAN004、ABX-IL8、BMS-986253、KD033、KTN0158、m3s193BsAb、hu3S193、SGN-LIV1A、DLYE5953A、MMOT0530A、BMS-986148、アネツマブ ラヴタシン、ペムツモマブ、ガチポツズマブ、オレゴボマブ、アバゴボマブ、Mab-AR-9.6、XMT-1592、ウピフィタマブ リルソドチン、リファツズマブ ベドチン、エフォルツマブ ベドチン、NNC0142-0002、PF-03732010、AGS-1C4D4、KM2777、KM2812、MT112、コフェツズマブペリドチン、ジロベルタマブ ベドチン、エロツズマブ、ASG-15ME、チデュタマブ、バンドルツズマブ ベドチン、AMG509、BIIB015、RMT1-10、サシツズマブ ゴビテカン-hziy、又はF7AK3から由来する抗原結合ドメインを含む。
一部の態様では、抗原認識受容体は、CARである。一部の態様では、CARは、一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、以下からなる群から選択される:CD3ゼータ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、CD97細胞内シグナル伝達ドメイン、CD11a-CD18細胞内シグナル伝達ドメイン、CD2細胞内シグナル伝達ドメイン、ICOS細胞内シグナル伝達ドメイン、CD27細胞内シグナル伝達ドメイン、CD154細胞内シグナル伝達ドメイン、CD8細胞内シグナル伝達ドメイン、OX40細胞内シグナル伝達ドメイン、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD28細胞内シグナル伝達ドメイン、ZAP40細胞内シグナル伝達ドメイン、CD30細胞内シグナル伝達ドメイン、GITR細胞内シグナル伝達ドメイン、HVEM細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP10細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP12細胞内シグナル伝達ドメイン、及びMyD88細胞内シグナル伝達ドメイン。一部の態様では、CARは、膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、以下からなる群から選択される:CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、OX40膜貫通ドメイン、ICOS膜貫通ドメイン、CTLA-4膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、LAG-3膜貫通ドメイン、2B4膜貫通ドメイン、及びBTLA膜貫通ドメイン。一部の態様では、CARは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサー領域を含む。
また、本明細書中で提供されているのは、本明細書中に記載されている、単離細胞のいずれか、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物である。
また、本明細書中で提供されているのは、それを必要とする対象を治療する方法であって、この方法は、本明細書中に記載されている、治療有効用量の単離細胞又は本明細書中に記載されている組成物のいずれかを投与することを含む。一部の態様では、単離細胞は、対象から由来する。一部の態様では、単離細胞は、対象に関して同種である。一部の態様では、方法は、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む。一部の態様では、このチェックポイントインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体。一部の態様では、方法は、抗CD40抗体を投与することをさらに含む。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか、又は本明細書中に記載される発現ベクターのいずれか、又は本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質のいずれかを含む脂質ベースの構造体である。一部の態様では、脂質ベースの構造体は、細胞外小胞を含む。一部の態様では、細胞外小胞は、以下からなる群から選択される:ナノ小胞及びエキソソーム。一部の態様では、脂質ベースの構造は、脂質ナノ粒子又はミセルを含む。一部の態様では、脂質ベースの構造は、リポソームを含む。
また、本明細書中で提供されているのは、、本明細書中に記載される脂質ベースの構造のいずれか、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物である。
また、本明細書中で提供されているのは、それを必要とする対象を治療する方法であって、この方法は、本明細書中に記載される、治療有効用量の脂質ベースの構造のいずれか又は本明細書中に記載される組成物のいずれかを投与することを含む。一部の態様では、投与は、全身投与を含む。一部の態様では、脂質ベースの構造は、対象において細胞を操作することが可能である。一部の態様では、方法は、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む。一部の態様では、このチェックポイントインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体。一部の態様では、方法は、抗CD40抗体を投与することをさらに含む。
また、本明細書中で提供されているのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか、又は本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質のいずれかを含むナノ粒子である。一部の態様では、ナノ粒子は無機材料を含む。
また、本明細書中で提供されているのは、本明細書中に記載されるナノ粒子のいずれかを含む組成物である。
また、本明細書中で提供されているのは、それを必要とする対象を治療する方法であって、この方法は、本明細書中に記載される、治療有効用量のナノ粒子のいずれか、又は本明細書中に記載される組成物のいずれかを投与することを含む。一部の態様では、投与は、全身投与を含む。一部の態様では、このナノ粒子は、対象において細胞を改変することが可能である。一部の態様では、方法は、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む。一部の態様では、このチェックポイントインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体。一部の態様では、方法は、抗CD40抗体を投与することをさらに含む。
また、本明細書中で提供されているのは、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか、又は本明細書中に記載される発現ベクターのいずれかを含むように操作されたウイルスである。一部の態様では、ウイルスは、以下からなる群から選択される:レンチウイルス、レトロウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、及びウイルス様粒子(VLP)。
また、本明細書中で提供されているのは、本明細書中に記載される、操作されたウイルスのいずれか、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物である。
また、本明細書中で提供されているのは、それを必要とする対象を治療する方法であって、この方法は、本明細書中に記載される操作されたウイルスのいずれか、又は本明細書中に記載される組成物のいずれかの治療有効用量を投与することを含む。一部の態様では、投与は、全身投与を含む。一部の態様では、操作されたウイルスは、対象において細胞に感染して、発現カセットを発現する。一部の態様では、方法は、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む。一部の態様では、このチェックポイントインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体。一部の態様では、方法は、抗CD40抗体を投与することをさらに含む。
また、本明細書中で提供されるのは、膜係留エフェクター分子の放出を誘導する方法であって、以下を含む:a)細胞を提供することであって、それにおいて、細胞は、膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質を含み、N末端からC末端に配向されており、式:S-C-MT-Dを有し、それにおいて、Sはエフェクター分子を含み、Cは同族膜結合プロテアーゼ切断部位を含み、MTは細胞膜係留ドメインを含み、Dはデグロンを含み、それにおいて、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、提供すること;ならびにb)膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質の発現のために適切な条件下で細胞を培養することであって、それにおいて、発現時に、膜切断可能なキメラタンパク質は、細胞の細胞膜に係留され、それにおいて、発現時に、膜結合プロテアーゼは、膜切断可能なキメラタンパク質の同族膜結合プロテアーゼ切断部位を切断し、それにより、エフェクター分子を細胞膜から放出する、培養すること。一部の態様では、デグロンは、薬物誘導性デグロンである。一部の態様では、方法は、細胞に、デグロンを誘導する薬物を接触させることをさらに含む。一部の態様では、デグロンの誘導によって、膜切断可能なキメラタンパク質が分解される。
また、本明細書中で提供されるのは、膜係留エフェクター分子を分解する方法であって、以下を含む:a)細胞を提供することであって、それにおいて、細胞は、膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質を含み、N末端からC末端に配向されており、式:S-C-MT-Dを有し、それにおいて、Sはエフェクター分子を含み、Cは同族膜結合プロテアーゼ切断部位を含み、MTは細胞膜係留ドメインを含み、Dは薬物誘導性デグロンを含み、それにおいて、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、提供すること;b)膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質の発現のために適切な条件下で細胞を培養することであって、それにおいて、発現時に、膜切断可能なキメラタンパク質は、細胞の細胞膜に係留される、培養すること;ならびにc)細胞を薬物と接触させることによりデグロンを誘導することであって、それにおいて、デグロンのデグロン誘導によって、膜切断可能なキメラタンパク質が分解される、誘導すること。一部の態様では、エフェクター分子は、シグナルペプチドを含む。
一部の態様では、シグナルペプチドは、エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む。一部の態様では、シグナルペプチドは、エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む。一部の態様では、非天然シグナルペプチドは、以下からなる群から選択される:IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSF。
一部の態様では、エフェクター分子は治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、以下からなる群から選択される:サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素。一部の態様では、サイトカインは、以下からなる群から選択される:IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファ。一部の態様では、ケモカインは、以下からなる群から選択される:CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1。一部の態様では、ホーミング分子は、以下からなる群から選択される:抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2。一部の態様では、成長因子は、以下からなる群から選択される:FLT3L及びGM-CSF。一部の態様では、共活性化分子は、以下からなる群から選択される:4-1BBL及びCD40L。一部の態様では、腫瘍微小環境修飾因子は、以下からなる群から選択される:アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2。一部の態様では、TGFベータインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせ。一部の態様では、免疫チェックポイントインヒビターは、以下からなる群から選択される:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体。一部の態様では、VEGFインヒビターは、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。一部の態様では、エフェクター分子は、ヒト由来エフェクター分子である。
一部の態様では、同族プロテアーゼ切断部位は、以下からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である:1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位。
一部の態様では、細胞膜係留ドメインは、膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む。一部の態様では、膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインは、PDGFR ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する。一部の態様では、細胞膜係留ドメインは、細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む。
一部の態様では、プロテアーゼは、細胞に対して内因性である。一部の態様では、プロテアーゼは、以下からなる群から選択される:1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼ。一部の態様では、プロテアーゼは、細胞に対して異種である。一部の態様では、プロテアーゼは、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位は、NS3プロテアーゼ切断部位を含む。一部の態様では、NS3プロテアーゼ切断部位は、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合点切断部位を含む。
一部の態様では、プロテアーゼは、プロテアーゼインヒビターによって抑制され得る。一部の態様では、プロテアーゼインヒビターは、以下からなる群から選択される:シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビル。
一部の態様では、プロテアーゼは、デグロンをさらに含む。一部の態様では、プロテアーゼの発現は、調節が可能である。
一部の態様では、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンは含む。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、以下からなる群から選択される:IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である。一部の態様では、IMiDは、FDA承認薬物である。一部の態様では、IMiDは、以下からなる群から選択される:サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミド。
一部の態様では、デグロンは、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される。一部の態様では、デグロンは、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている。
また、本明細書中で提供されるのは、異種核酸を発現するように操作されたアデノ随伴ウイルス(AAV)であって、それにおいて、異種核酸は、デグロン融合キメラタンパク質をコードし、それにおいて、デグロン融合キメラタンパク質は、目的のタンパク質に融合されたデグロンを含む。
一部の態様では、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより目的のタンパク質のユビキチン経路媒介性の分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンは含む。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、以下からなる群から選択される:IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である。一部の態様では、IMiDは、FDA承認薬物である。一部の態様では、IMiDは、以下からなる群から選択される:サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミド。一部の態様では、デグロンは、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される。
一部の態様では、AAVは、以下からなる群から選択される:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11、及びそれらのバリアント。
一部の態様では、目的のタンパク質は治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、以下からなる群から選択される:サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素。
また、本明細書中で提供されるのは、異種核酸を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであって、それにおいて、異種核酸は、デグロン融合キメラタンパク質をコードし、それにおいて、デグロン融合キメラタンパク質は、目的のタンパク質に融合されたデグロンを含む。
一部の態様では、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより目的のタンパク質のユビキチン経路媒介性の分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンは含む。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、以下からなる群から選択される:IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である。一部の態様では、CRBNポリペプチド基質ドメインは、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である。一部の態様では、IMiDは、FDA承認薬物である。一部の態様では、IMiDは、以下からなる群から選択される:サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミド。一部の態様では、デグロンは、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される。
一部の態様では、AAVは、以下からなる群から選択される:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11、及びそれらのバリアント。
一部の態様では、目的のタンパク質は治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、以下からなる群から選択される:サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作されたAAVウイルスのいずれか又は本明細書中に記載されるAAVベクターのいずれか、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作されたAAVウイルスのいずれか又は本明細書中に記載されるAAVベクターのいずれかを含む単離細胞である。
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される、操作されたAAVウイルス又は本明細書中に記載されるAAVベクターのいずれかを、それを必要とする対象に投与することを含む、インビボで調節されたタンパク質発現のための方法である。
また、本明細書中で提供されるのは、タンパク質発現を調節するための方法であって、操作されたAAVウイルス又はAAVベクターの発現のための適切な条件下で、細胞を、本明細書中に記載される任意の操作されたAAVウイルス又は本明細書中に記載されるAAVベクターのいずれかと接触させることを含む。
詳細な説明
本明細書中で提供されるのは、腫瘍内及び/又は近傍(腫瘍微小環境(TME))で異なる腫瘍媒介性免疫抑制機構を調節することを対象とする免疫療法組成物及び方法である。
本明細書中で提供されるのは、腫瘍内及び/又は近傍(腫瘍微小環境(TME))で異なる腫瘍媒介性免疫抑制機構を調節することを対象とする免疫療法組成物及び方法である。
キメラタンパク質(又はキメラタンパク質をコードする操作された核酸)が、本明細書中で提供され、デグロンドメインを有する。
一部の態様では、膜切断可能なキメラタンパク質(又はキメラタンパク質をコードする操作された核酸)が本明細書中で提供され、N末端からC末端に配向され、単一ポリペプチドとして発現される式S-C-MT-Dを有する。Sは分泌性エフェクター分子を指す。Cはプロテアーゼ切断部位を指す。MTは細胞膜係留ドメインを指す。Dはデグロンを指す。膜切断可能なキメラタンパク質が操作され、エフェクター分子の分泌が、薬物依存的な様式において調節されることができるようにする。具体的には、膜切断可能なキメラタンパク質を操作して、エフェクター分子の分泌が、「膜切断可能なデグロン」系の一部として調節され得るようにし、ここで、プロテアーゼ切断部位(「C」)、細胞膜係留ドメイン(「MT」)、及びデグロン(「D」)の組み入れによって、薬物依存的な様式においてエフェクター分子の調節された分泌が可能になる。理論により拘束されることを望まないが、膜切断可能なキメラタンパク質中に存在する膜切断可能なデグロン系の構成要素によって、一般的に、以下の細胞過程を通して分泌が調節される:
-MT:細胞膜係留ドメインは、細胞膜中に挿入されるように、又は細胞膜と会合される(係留される)ように、キメラタンパク質の細胞輸送を方向付ける膜貫通ドメイン(又は膜貫通-細胞内ドメイン)を含む。
-D:免疫調節薬物(IMiD)の存在において、デグロンは、キメラタンパク質のユビキチン媒介性分解を方向付け、エフェクター分子の分泌が低下又は排除されるようにする。一般的に、細胞膜中へのキメラタンパク質の発現及び局在化によって、デグロン/ユビキチン媒介性分解が促進される。
-C:IMiDの非存在において、キメラタンパク質のデグロン/ユビキチン媒介性分解は生じない。細胞膜中へのキメラタンパク質の発現及び局在化に続いて、プロテアーゼ切断部位によって、キメラタンパク質の切断が方向付けられ、エフェクター分子が細胞外空間中に放出(「分泌」)されるようにする。
-MT:細胞膜係留ドメインは、細胞膜中に挿入されるように、又は細胞膜と会合される(係留される)ように、キメラタンパク質の細胞輸送を方向付ける膜貫通ドメイン(又は膜貫通-細胞内ドメイン)を含む。
-D:免疫調節薬物(IMiD)の存在において、デグロンは、キメラタンパク質のユビキチン媒介性分解を方向付け、エフェクター分子の分泌が低下又は排除されるようにする。一般的に、細胞膜中へのキメラタンパク質の発現及び局在化によって、デグロン/ユビキチン媒介性分解が促進される。
-C:IMiDの非存在において、キメラタンパク質のデグロン/ユビキチン媒介性分解は生じない。細胞膜中へのキメラタンパク質の発現及び局在化に続いて、プロテアーゼ切断部位によって、キメラタンパク質の切断が方向付けられ、エフェクター分子が細胞外空間中に放出(「分泌」)されるようにする。
一部の態様では、デグロン融合キメラタンパク質(又はデグロン融合キメラタンパク質をコードする操作された核酸)が本明細書中で提供され、目的のタンパク質(例、本明細書中に記載されるエフェクター分子のいずれか)及びデグロンを有する。
「エフェクター分子」は、別の分子と結合し、それが結合するその分子の生物学的活性を調節する分子(例、核酸、例えばDNAもしくはRNAなど、又はタンパク質(ポリペプチド)もしくはペプチド)を指す。例えば、エフェクター分子は、酵素活性、遺伝子発現、又は細胞シグナル伝達を増加又は減少させるためのリガンドとして作用し得る。このように、一部の実施形態では、エフェクター分子は、異なる免疫調節機構を調節(活性化又は阻害)する。分子と直接的に結合して調節することにより、エフェクター分子はまた、第二の、下流分子を間接的に調節し得る。
本明細書中に記載される特定の実施形態では(例、一般的に、本明細書中に記載される全ての膜切断可能なキメラタンパク質について)、エフェクター分子は、分泌性エフェクター分子(例、本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質について、式S-C-MT-D中で「S」として言及される)である。エフェクター分子の非限定的な例は、サイトカイン、ケモカイン、代謝物レベルを調節する酵素、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、ペプチド、酵素、抗体、サイトカイン、ホーミング分子、及び/又はインテグリンを調節する抗体又はデコイ分子を含む。
用語「調節する」は、生物学的活性の維持、生物学的活性の阻害(部分的又は完全)、及び生物学的活性の刺激/活性化(部分的又は完全)を包含する。この用語はまた、生物学的活性を減少又は増加させる(例、増強させる)ことを包含する。二つの異なるエフェクター分子は、一つのエフェクター分子が、他のエフェクター分子(例、抗原提示及び/又はプロセシングを刺激する)により調節される腫瘍媒介性の免疫抑制機構とは異なる腫瘍媒介性の免疫抑制機構(例、T細胞シグナル伝達を刺激する)を調節する場合、「異なる腫瘍媒介性の免疫抑制機構を調節する」と考えられる。
エフェクター分子による調節は、直接的又は間接的であり得る。直接的な調節は、エフェクター分子が別の分子と結合して、その分子の活性を調節する場合に生じる。間接的な調節は、エフェクター分子が別の分子と結合して、その分子の活性を調節し、その調節の結果として、さらに別の分子(エフェクター分子が結合されていない)の活性を調節する場合に生じる。
一部の実施形態では、少なくとも一つのエフェクター分子による腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫刺激性及び/又は抗腫瘍免疫応答(例、全身的又は腫瘍微小環境における)における少なくとも10%(例、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、又は200%)だけの増加をもたらす。例えば、腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫刺激性及び/又は抗腫瘍免疫応答において少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%だけの増加をもたらし得る。一部の実施形態では、腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫刺激性及び/又は抗腫瘍免疫応答における10~20%、10~30%、10~40%、10~50%、10~60%、10~70%、10~80%、10~90%、10~100%、10~200%、20~30%、20~40%、20~50%、20~60%、20~70%、20~80%、20~90%、20~100%、20~200%、50~60%、50~70%、50~80%、50~90%、50~100%、又は50~200%の増加をもたらす。免疫刺激性及び/又は抗腫瘍免疫応答における「増加」は、例えば、全身的に又は腫瘍微小環境において、エフェクター分子の非存在において、そうでなければ生じるであろう免疫刺激性及び/又は抗腫瘍性免疫応答と関連することを理解すべきである。
一部の実施形態では、少なくとも一つのエフェクター分子による腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫刺激性及び/又は抗腫瘍免疫応答(例、全身的又は腫瘍微小環境における)において少なくとも2倍(例、2、3、4、5、10、25、20、25、50、又は100倍)だけの増加をもたらす。例えば、腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫刺激性及び/又は抗腫瘍免疫応答において少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、又は少なくとも100倍だけの増加をもたらし得る。一部の実施形態では、腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫刺激性及び/又は抗腫瘍免疫応答において2~10、2~20、2~30、2~40、2~50、2~60、2~70、2~80、2~90、又は2~100倍だけの増加をもたらす。
免疫刺激性及び/又は抗腫瘍免疫機構の非限定的な例は、T細胞シグナル伝達、活性及び/又は動員、抗原提示及び/又はプロセシング、ナチュラルキラー細胞媒介性の細胞傷害性シグナル伝達、活性及び/又は動員、樹状細胞の分化及び/又は成熟、免疫細胞動員、炎症誘発性マクロファージシグナル伝達、活性及び/又は動員、間質分解、免疫刺激性代謝物の産生、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)シグナル伝達(それは、IFN及びTh1分極の分泌を増加させ、抗腫瘍免疫応答を促進する)、及び/又はI型インターフェロンシグナル伝達を含む。エフェクター分子は、前述の免疫刺激機構の少なくとも一つ(一つ又は複数)を刺激し得るが、このように、免疫刺激性応答における増加をもたらし得る。前述の免疫刺激性及び/又は抗腫瘍免疫機構における変化は、例えば、T細胞増殖又は細胞傷害性についてのインビトロアッセイ、インビトロ抗原提示アッセイ、発現アッセイ(例、特定のマーカーの)、及び/又は細胞分泌アッセイ(例、サイトカインの)を使用して評価され得る。
一部の実施形態では、少なくとも一つのエフェクター分子による腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫抑制応答(例、全身的又は腫瘍微小環境における)において少なくとも10%(例、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、又は200%)だけの減少をもたらす。例えば、腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫抑制応答において少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%だけの減少をもたらし得る。一部の実施形態では、腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫抑制応答において10~20%、10~30%、10~40%、10~50%、10~60%、10~70%、10~80%、10~90%、10~100%、10~200%、20~30%、20~40%、20~50%、20~60%、20~70%、20~80%、20~90%、20~100%、20~200%、50~60%、50~70%、50~80%、50~90%、50~100%、又は50~200%の減少をもたらす。免疫抑制応答における「減少」は、例えば、全身的又は腫瘍微小環境において、エフェクター分子の非存在において、そうでなければ生じるであろう免疫抑制応答に関連していることを理解すべきである。
一部の実施形態では、少なくとも一つのエフェクター分子による腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫抑制応答(例、全身的又は腫瘍微小環境における)において少なくとも2倍(例、2、3、4、5、10、25、20、25、50、又は100倍)だけの減少をもたらす。例えば、腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫抑制応答において少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、又は少なくとも100倍だけの減少をもたらし得る。一部の実施形態では、腫瘍媒介性免疫抑制機構の調節は、免疫抑制応答において2~10、2~20、2~30、2~40、2~50、2~60、2~70、2~80、2~90、又は2~100倍だけの減少をもたらす。
免疫抑制機構の非限定的な例は、負の共刺激シグナル伝達、細胞傷害性細胞(例、T細胞及び/又はNK細胞)のアポトーシス促進性シグナル伝達、T調節性(Treg)細胞シグナル伝達、腫瘍チェックポイント分子の産生/維持、骨髄由来サプレッサー細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員、免疫抑制因子/代謝物産生、及び/又は血管内皮成長因子のシグナル伝達を含む。エフェクター分子は、前述の免疫抑制機構の少なくとも一つ(一つ又は複数)を阻害し、このように、免疫抑制応答における減少をもたらし得る。前述の免疫抑制機構における変化は、例えば、T細胞増殖における増加及び/又はIFNγ産生における増加(負の共刺激シグナル伝達、Treg細胞シグナル伝達、及び/又はMDSC);アネキシンV/PIフロー染色(アポトーシス促進シグナル伝達);発現についてのフロー染色、例えば、PDL1発現(腫瘍チェックポイント分子の産生/維持);ELISA、LUMINEX(登録商標)、qPCRを介したRNA、酵素アッセイ、例えば、IDOトリプトファン異化作用(免疫抑制因子/代謝物産生);及びPI3K、Akt、p38のリン酸化(VEGFシグナル伝達)についてアッセイすることにより評価され得る。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、相加的に機能する:二つのエフェクター分子の効果が、例えば、別々に機能する二つのエフェクター分子の効果の合計に等しくなり得る。他の実施形態では、エフェクター分子は相乗的に機能する:二つのエフェクター分子の効果が、例えば、二つのエフェクター分子の組み合わされた機能よりも大きくなり得る。
腫瘍媒介性免疫抑制機構を調節し、及び/又は腫瘍微小環境を修飾するエフェクター分子は、例えば、分泌因子(例、免疫系において含まれる細胞外機構を調節するサイトカイン、ケモカイン、抗体、及び/又はデコイ受容体)、インヒビター(例、抗体、抗体断片、リガンドTRAP、及び/又は小遮断ペプチド)、細胞状態を制御する細胞内因子(例、炎症誘発性を増強するために細胞の状態を調節するマイクロRNA及び/又は転写因子)、エキソソーム中にパッケージングされた因子(例、マイクロRNA、サイトゾル因子、及び/又は細胞外因子)、表面に呈示される因子(例、チェックポイントインヒビター、TRAIL)、ならびに、及び/又は代謝遺伝子(例、代謝物もしくはアミノ酸を産生/調節又は分解する酵素)であり得る。
一部の実施形態では、エフェクター分子の少なくとも一つは、腫瘍微小環境において免疫刺激機構を刺激し、及び/又は腫瘍微小環境における免疫抑制機構を阻害する。
一部の実施形態では、エフェクター分子の少なくとも一つは、(a)T細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員を刺激し、(b)抗原提示及び/又はプロセシングを刺激し、(c)ナチュラルキラー細胞媒介性の細胞傷害性シグナル伝達、活性、及び/又は動員を刺激し、(d)樹状細胞分化及び/又は成熟を刺激し、(e)免疫細胞動員を刺激し、(f)炎症誘発性マクロファージシグナル伝達、活性、及び/又は動員を刺激する、あるいは抗炎症性マクロファージシグナル伝達、活性、及び/又は動員を阻害し、(g)間質分解を刺激し、(h)免疫刺激性代謝物産生を刺激し、(i)I型インターフェロンシグナル伝達を刺激し、(j)負の共刺激シグナル伝達を阻害し、(k)抗腫瘍免疫細胞のアポトーシス促進性シグナル伝達を阻害し、(l)調節性T(Treg)細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員を阻害し、(m)腫瘍チェックポイント分子を阻害し、(n)インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)シグナル伝達を刺激し、(o)骨髄由来のサプレッサー細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員を阻害し、(p)免疫抑制因子/代謝物を分解し、(q)血管内皮成長因子シグナル伝達を阻害し、ならびに/あるいは(r)腫瘍細胞を直接的に殺傷する。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、以下の非限定的なクラスの分子から選択され得る:サイトカイン、抗体、ケモカイン、ヌクレオチド、ペプチド、及び酵素。前述のクラスのエフェクター分子の非限定的な例を表1中に列挙し、例示的なエフェクター分子をコードする特定の配列を表2中に列挙する。エフェクター分子は、ヒト、表1もしくは表2中に列挙されるものなど、又は表1もしくは表2中に列挙されるマウスエフェクター分子のヒト等価物であり得る。エフェクター分子はヒト由来であり得るが、例えば内因性ヒトエフェクター分子又は機能について修飾及び/又は最適化されたエフェクター分子、例えば、発現を改善するために最適化された、安定性を改善するために修飾された、又はそのシグナル配列で修飾されたコドンなどである(以下を参照のこと)。機能を最適化するための様々なプログラム及びアルゴリズムが、当業者に公知であり、所望される改善、例えば、特定の種(例、ヒト、マウス、細菌など)についてのコドン最適化などに基づいて選択することができる。
分泌シグナル
本明細書中で提供されるキメラタンパク質の一つ又は複数のエフェクター分子は、分泌又は膜局在化(また、膜挿入として言及される)が運命づけられた、新たに合成されたタンパク質を、適したタンパク質プロセシング経路に方向付ける、エフェクター分子のN末端に分泌シグナルペプチド(また、シグナルペプチド又はシグナル配列として言及される)を有する分泌性エフェクター分子であり得る。一般的に、本明細書中に記載される全ての膜切断可能なキメラタンパク質について、一つ又は複数のエフェクター分子は、分泌性エフェクター分子(式S-C-MT-D中で「S」として言及される)である。二つ以上のエフェクター分子を伴う実施形態では、各エフェクター分子は分泌シグナルを含むことができる。二つ以上のエフェクター分子を伴う実施形態では、各エフェクター分子は分泌シグナルを含むことができ、各エフェクター分子が、操作された細胞から分泌されるようにする。
本明細書中で提供されるキメラタンパク質の一つ又は複数のエフェクター分子は、分泌又は膜局在化(また、膜挿入として言及される)が運命づけられた、新たに合成されたタンパク質を、適したタンパク質プロセシング経路に方向付ける、エフェクター分子のN末端に分泌シグナルペプチド(また、シグナルペプチド又はシグナル配列として言及される)を有する分泌性エフェクター分子であり得る。一般的に、本明細書中に記載される全ての膜切断可能なキメラタンパク質について、一つ又は複数のエフェクター分子は、分泌性エフェクター分子(式S-C-MT-D中で「S」として言及される)である。二つ以上のエフェクター分子を伴う実施形態では、各エフェクター分子は分泌シグナルを含むことができる。二つ以上のエフェクター分子を伴う実施形態では、各エフェクター分子は分泌シグナルを含むことができ、各エフェクター分子が、操作された細胞から分泌されるようにする。
エフェクター分子と動作可能に関連する分泌シグナルペプチドは、天然分泌シグナルペプチド天然分泌シグナルペプチド(例、所与のエフェクター分子と一般的に内在的に関連する分泌シグナルペプチド)であり得る。エフェクター分子と動作可能に関連する分泌シグナルペプチドは、非天然分泌シグナルペプチド天然分泌シグナルペプチドであり得る。非天然分泌シグナルペプチドは、特定の環境、例えば腫瘍微小環境などにおいて、改善された発現及び機能、例えば、維持された分泌などを促進することができる。非天然分泌シグナルペプチドの非限定的な例を表3中に示す。
プロテアーゼ切断部位
特定の実施形態では、本明細書中で提供されるキメラタンパク質(例、一般的に、本明細書中に記載される全ての膜切断可能なキメラタンパク質について)は、プロテアーゼ切断部位(例、本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質について、式S-C-MT-Dにおいて「C」として言及される)を含む。一般的に、プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼにより切断されることが可能な任意のアミノ酸配列モチーフであることができる。プロテアーゼ切断部位の例は、限定されないが、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、又はNS3プロテアーゼ切断部位を含む。プロテアーゼ切断部位の特定の例は、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造的タンパク質3(NS3)プロテアーゼ切断部位であり、限定されないが、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B切断部位を含む。HCVの様々な株についてのNS3プロテアーゼ及びその切断部位の代表的な配列の説明については、例えば、Hepatitis C Viruses:Genomes andMolecular Biology(S.L.Tan ed.,Taylor &Francis,2006),Chapter 6,pp.163-206を参照のこと;その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。例えば、HCV NS4A/4Bプロテアーゼ切断部位;HCV NS5A/5Bプロテアーゼ切断部位;NS4A/4Bプロテアーゼ切断部位を伴うC末端デグロン;HCV NS5A/5Bプロテアーゼ切断部位を伴うN末端デグロンの配列が提供される。代表的なNS3配列は、アメリカ国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information(NCBI))データベース中に列挙されている。例えば、NCBIエントリー:受託番号:YP_001491553、YP_001469631、YP_001469632、NP_803144、NP_671491、YP_001469634、YP_001469630、YP_001469633、ADA68311、ADA68307、AFP99000、AFP98987、ADA68322、AFP99033、ADA68330、AFP99056、AFP99041、CBF60982、CBF60817、AHH29575、AIZ00747、AIZ00744、ABI36969、ABN05226、KF516075、KF516074、KF516056、AB826684、AB826683、JX171009、JX171008、JX171000、EU847455、EF154714、GU085487、JX171065、JX171063を参照のこと;それらの配列の全て(本出願の出願日までに入力されるとおり)が、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、本明細書中で提供されるキメラタンパク質(例、一般的に、本明細書中に記載される全ての膜切断可能なキメラタンパク質について)は、プロテアーゼ切断部位(例、本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質について、式S-C-MT-Dにおいて「C」として言及される)を含む。一般的に、プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼにより切断されることが可能な任意のアミノ酸配列モチーフであることができる。プロテアーゼ切断部位の例は、限定されないが、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、又はNS3プロテアーゼ切断部位を含む。プロテアーゼ切断部位の特定の例は、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造的タンパク質3(NS3)プロテアーゼ切断部位であり、限定されないが、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B切断部位を含む。HCVの様々な株についてのNS3プロテアーゼ及びその切断部位の代表的な配列の説明については、例えば、Hepatitis C Viruses:Genomes andMolecular Biology(S.L.Tan ed.,Taylor &Francis,2006),Chapter 6,pp.163-206を参照のこと;その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。例えば、HCV NS4A/4Bプロテアーゼ切断部位;HCV NS5A/5Bプロテアーゼ切断部位;NS4A/4Bプロテアーゼ切断部位を伴うC末端デグロン;HCV NS5A/5Bプロテアーゼ切断部位を伴うN末端デグロンの配列が提供される。代表的なNS3配列は、アメリカ国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information(NCBI))データベース中に列挙されている。例えば、NCBIエントリー:受託番号:YP_001491553、YP_001469631、YP_001469632、NP_803144、NP_671491、YP_001469634、YP_001469630、YP_001469633、ADA68311、ADA68307、AFP99000、AFP98987、ADA68322、AFP99033、ADA68330、AFP99056、AFP99041、CBF60982、CBF60817、AHH29575、AIZ00747、AIZ00744、ABI36969、ABN05226、KF516075、KF516074、KF516056、AB826684、AB826683、JX171009、JX171008、JX171000、EU847455、EF154714、GU085487、JX171065、JX171063を参照のこと;それらの配列の全て(本出願の出願日までに入力されるとおり)が、参照により本明細書中に組み入れられる。
プロテアーゼ切断部位は、分泌性エフェクター分子のC末端であり得る。プロテアーゼ切断部位は、分泌性エフェクター分子のN末端であり得る。一般的に、本明細書中に記載される全ての膜切断可能なキメラタンパク質について、プロテアーゼ切断部位は、分泌性エフェクター分子のC末端及び細胞膜係留ドメインのN末端である(言い換えれば、プロテアーゼ切断部位は、分泌性エフェクター分子と細胞膜係留ドメインの間にある)。プロテアーゼ切断部位は、ポリペプチドリンカー、即ち、一般的にはエフェクター分子又はプロテアーゼ切断部位の一部とは考えられないポリペプチド配列により、分泌性エフェクター分子に接続されることができる。プロテアーゼ切断部位は、ポリペプチドリンカー、即ち、一般的には細胞膜係留ドメイン又はプロテアーゼ切断部位の一部とは考えられないポリペプチド配列により、細胞膜係留ドメインに接続されることができる。ポリペプチドリンカーは、第一のポリペプチド配列及び第二のポリペプチド配列を接続する任意のアミノ酸配列であり得る。ポリペプチドリンカーは、可動性リンカー(例、Gly-Ser-Gly配列)であり得る。ポリペプチドリンカーの例は、限定されないが、GSGリンカー(例、[GS]4GG[配列番号182])、A(EAAAK)3A(配列番号183)、及びWhitlowリンカー(例、「KEGS」リンカー、例えばアミノ酸配列KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号184)など、EGKリンカー、例えばアミノ酸配列EGKSSGSGSESKST(配列番号185)、及び、参照により本明細書中に組み入れられる、発行された米国特許第5,990,275号においてより詳細に記載されているリンカー)を含む。他のポリペプチドリンカーは、所望の特性(例、長さ、可動性、アミノ酸組成物など)に基づいて選択されてもよく、当業者に公知である。
膜切断可能なデグロン系では、細胞膜中へのキメラタンパク質の発現及び局在化に続いて、プロテアーゼ切断部位によって、キメラタンパク質の切断が方向付けられて、エフェクター分子が、細胞の細胞外空間中に放出される(「分泌される」)ようにする。
一般的に、プロテアーゼ切断部位を切断するプロテアーゼは、その特定のプロテアーゼ切断部位について特異的なプロテアーゼである。例えば、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ(ADAM)ファミリープロテアーゼの場合では、特定のADAMプロテアーゼ切断部位を切断するプロテアーゼは、一般的に、特定のADAMプロテアーゼ切断部位モチーフを特異的に認識するADAMプロテアーゼに限定される。プロテアーゼは、膜結合又は膜会合し得る。プロテアーゼは、例えば、特定の細胞環境、例えば腫瘍微小環境(「TME」)などにおいて分泌され得る。
キメラタンパク質のプロテアーゼ切断部位を切断するプロテアーゼは、キメラタンパク質を発現する同じ細胞において発現され得る。キメラタンパク質のプロテアーゼ切断部位を切断するプロテアーゼは、キメラタンパク質を発現する細胞に対して内因性であり得る。言い換えれば、キメラタンパク質を発現するように操作された細胞は、キメラタンパク質中に存在するプロテアーゼ切断部位について特異的なプロテアーゼを内因性に発現することができる。プロテアーゼの内因性発現は、一般的に、恒常性条件下(例、一般的に健康であると考えられる細胞)での発現、及び、また、非恒常性条件下(例、腫瘍細胞における上方調節された発現)での差次的発現の両方を指す。プロテアーゼ切断部位は、所望の細胞集団により内因性に発現される公知のプロテアーゼに基づいて選択することができる。例えば、プロテアーゼ切断部位は、目的の特定の腫瘍集団において(例、キメラタンパク質を発現するように操作された特定の腫瘍細胞において)発現されることが公知である特定の腫瘍関連プロテアーゼについて選択され得る。プロテアーゼ及び/又は発現データベースを使用して、適したプロテアーゼ切断部位を選択し、例えば、Oncomine(www.oncomine.org)、欧州バイオインフォマティクス研究所(www.ebi.ac.uk)、特に(www.ebi.ac.uk/gxa),PMAP(www.proteolysis.org)、ExPASy Peptide Cutter(ca.expasy.org/tools/peptide cutter)及びPMAP.CutDB(cutdb.burnham.org)に相談することを通じて、腫瘍関連プロテアーゼにより切断されるプロテアーゼ切断部位を選択するなど、それらの各々が、全ての目的のために参照により組み入れられる。
キメラタンパク質のプロテアーゼ切断部位を切断するプロテアーゼは、キメラタンパク質を発現する細胞に対して異種であり得る。例えば、キメラタンパク質を発現するように操作された細胞は、キメラタンパク質中に存在するプロテアーゼ切断部位について特異的である細胞により一般的に発現されないプロテアーゼを発現するように操作され得る。キメラタンパク質及びプロテアーゼの両方を発現するように操作された細胞は、別々の操作された核酸から又はマルチシストロン系から各々を発現するように操作することができる(マルチシストロン系及びマルチプロモーター系は、「マルチシストロン及びマルチプロモーター系」と表題の付けられた、本明細書中のセクションにおいてより詳細に記載されている)。異種プロテアーゼ及びそれらの対応するプロテアーゼ切断部位は、内因性プロテアーゼを参照して、上に記載されるように選択することができる。
キメラタンパク質のプロテアーゼ切断部位を切断するプロテアーゼは、キメラタンパク質を発現する細胞よりも、別々の異なる細胞上に発現され得る。例えば、プロテアーゼは、一般的に、特定の細胞環境、例えば腫瘍微小環境などにおいて発現され得る。そのような場合では、一般的に、プロテアーゼ切断部位の切断は、プロテアーゼ切断部位と接触する必要がある環境制限プロテアーゼに起因して、目的の細胞環境(例、腫瘍微小環境)のみに制限され得る。膜切断可能なキメラタンパク質を有する実施形態では、一般的に、エフェクター分子の分泌は、プロテアーゼ切断部位と接触する必要がある環境限定プロテアーゼに起因して、目的の細胞環境(例、腫瘍微小環境)のみに制限され得る。キメラタンパク質のプロテアーゼ切断部位を切断するプロテアーゼは、別々の異なる細胞に対して内因性であり得る。キメラタンパク質のプロテアーゼ切断部位を切断するプロテアーゼは、別々の異なる細胞に対して異種であり得る。例えば、別々の異なる細胞は、別々の異なる細胞により一般的に発現されないプロテアーゼを発現するように操作することができる。
プロテアーゼは、限定されないが、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼを含む。プロテアーゼは、NS3プロテアーゼであり得る。
プロテアーゼは、腫瘍関連プロテアーゼ、例えばカテプシン、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、又はメタロプロテアーゼなどであり得る。腫瘍関連プロテアーゼの具体的な例は、カテプシンB、カテプシンL、カテプシンS、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンA、カテプシンG、トロンビン、プラスミン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、メタロプロテイナーゼ1(MMP1)、MMP2、MMP3、MMP4、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP20、MMP21、MMP23、MMP24、MMP25、MMP26、MMP28、ADAM、ADAMTS、CD10(CALLA)、又は前立腺特異抗原を含む。プロテアーゼはまた、限定されないが、以下の表4中に列挙されるプロテアーゼを含む。特定のプロテアーゼについての例示的な同族プロテアーゼ切断部位がまた、表4中に列挙されている。
プロテアーゼは、以下のヒトプロテアーゼのいずれかであり得る(括弧中に提供されるMEROPSペプチダーゼデータベース番号;Rawlings N.D.,Morton F.R.,Kok,C.Y.,Kong,J.&Barrett A.J.(2008)MEROPS:the peptidaseDatabase.Nucleic Acids Res.36Database issue,D320-325;全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる):ペプシンA(MER000885)、ガストリシン(MER000894)、メマプシン-2(MER005870)、レニン(MER000917)、カテプシンD(MER000911)、カテプシンE(MER000944)、メマプシン-1(MER005534)、ナプシン A(MER004981)、Mername-AA034ペプチダーゼ(MER014038)、ペプシンA4(MER037290)、ペプシンA5(ホモサピエンス)(MER037291)、hCG1733572(ホモサピエンス)型推定ペプチダーゼ(MER107386)、ナプシンB偽遺伝子(MER004982)、CYMP g.p.(ホモサピエンス)(MER002929)、サブファミリーA1A未割り当てペプチダーゼs(MER181559)、マウス乳房腫瘍ウイルスレトロペプシン(MER048030)、ウサギ内因性レトロウイルスエンドペプチダーゼ(MER043650)、S71関連ヒト内因性レトロペプシン(MER001812)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047117)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047133)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047160)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047206)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047253)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047260)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047291)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047418)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047440)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047479)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047559)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER047583)、RTVL-H型推定ペプチダーゼ(MER015446)、ヒト内因性レトロウイルスレトロペプシンホモログ1(MER015479)、ヒト内因性レトロウイルスレトロペプシンホモログ2(MER015481)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子1(ホモサピエンス染色体14)(MER029977)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子2(ホモサピエンス染色体8)(MER029665)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子3(ホモサピエンス染色体17)(MER002660)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子3(ホモサピエンス染色体17)(MER030286)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子3(ホモサピエンス染色体17)(MER047144)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子5(ホモサピエンス染色体12)(MER029664)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子6(ホモサピエンス染色体7)(MER002094)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子7(ホモサピエンス染色体6)(MER029776)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子8(ホモサピエンス染色体Y)(MER030291)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子9(ホモサピエンス染色体19)(MER029680)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子10(ホモサピエンス染色体12)(MER002848)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子11(ホモサピエンス染色体17)(MER004378)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子12(ホモサピエンス染色体11)(MER003344)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子13(ホモサピエンス染色体2及び同様のもの)(MER029779)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子14(ホモサピエンス染色体2)(MER029778)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子15(ホモサピエンス染色体4)(MER047158)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子15(ホモサピエンス染色体4)(MER047332)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子15(ホモサピエンス染色体4)(MER003182)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子16(MER047165)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子16(MER047178)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子16(MER047200)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子16(MER047315)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子16(MER047405)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子16(MER030292)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子17(ホモサピエンス染色体8)(MER005305)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子18(ホモサピエンス染色体4)(MER030288)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子19(ホモサピエンス染色体16)(MER001740)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子21(ホモサピエンス)(MER047222)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子21(ホモサピエンス)(MER047454)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子21(ホモサピエンス)(MER047477)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子21(ホモサピエンス)(MER004403)、内因性レトロウイルスレトロペプシン偽遺伝子22(ホモサピエンス染色体X)(MER030287)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047046)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047052)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047076)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047080)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047088)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047089)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047091)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047092)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047093)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047094)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047097)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047099)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログMER047101)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047102)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047107)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047108)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047109)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047110)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログMER047111)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047114)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047118)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047121)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047122)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047126)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047129)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047130)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047134)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047135)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047137)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047140)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047141)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047142)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047148)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047149)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047151)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047154)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047155)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047156)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047157)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047159)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047161)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047163)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047166)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047171)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047173)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047174)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047179)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047183)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047186)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047190)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047191)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047196)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047198)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047199)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047201)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047202)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047203)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047204)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047205)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047207)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047208)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047210)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047211)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047212)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047213)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047215)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047216)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047218)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047219)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047221)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047224)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047225)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047226)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047227)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047230)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047232)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047233)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047234)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼ
ホモログ(MER047236)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047238)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047239)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047240)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047242)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047243)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047249)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047251)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047252)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047254)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047255)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047263)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047265)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047266)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047267)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047268)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047269)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047272)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047273)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047274)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047275)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047276)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047279)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047280)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047281)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047282)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047284)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047285)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047289)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047290)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047294)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047295)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047298)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047300)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047302)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047304)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047305)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047306)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047307)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047310)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047311)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047314)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047318)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047320)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047321)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047322)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047326)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047327)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047330)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047333)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047362)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047366)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047369)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047370)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047371)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047375)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047376)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047381)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047383)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047384)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047385)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047388)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047389)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047391)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047394)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047396)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047400)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047401)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047403)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047406)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047407)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047410)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047411)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047413)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047414)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047416)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047417)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047420)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047423)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047424)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047428)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047429)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047431)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047434)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047439)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047442)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047445)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047449)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047450)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047452)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047455)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047457)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047458)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047459)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047463)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047468)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047469)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047470)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047476)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047478)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047483)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047488)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047489)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047490)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047493)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047494)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047495)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047496)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047497)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047499)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047502)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047504)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047511)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047513)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047514)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047515)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047516)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047520)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047533)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047537)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047569)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047570)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047584)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047603)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047604)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047606)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047609)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047616)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047619)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047648)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047649)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047662)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048004)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048018)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048019)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048023)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048037)、サブファミリーA2A未割り当てペプチダーゼs(MER047164)、サブファミリーA2A未割り当てペプチダーゼ(MER047231)、サブファミリーA2A未割り当てペプチダーゼs(MER047386)、皮膚アスパラギン酸プロテアーゼ(MER057097)、プレセニリン1(MER005221)、プレセニリン2(MER005223)、impas1ペプチダーゼ(MER019701)、impas1ペプチダーゼ(MER184722)、impas4ペプチダーゼ(MER019715)、impas2ペプチダーゼ(MER019708)、impas5ペプチダーゼ(MER019712)、impas3ペプチダーゼ(MER019711)、可能なファミリーA22偽遺伝子(ホモサピエンス染色体18)(MER029974)、可能なファミリーA22偽遺伝子(ホモサピエンス染色体11)(MER023159)、カテプシンV(MER004437)、カテプシンX(MER004508)、カテプシンF(MER004980)、カテプシンL(MER000622)、カテプシンS(MER000633)、カテプシンO(MER0016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マトリックスメタロペプチダーゼ-1(MER001077)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-2(MER002383)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-3(MER002384)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-4(MER002595)、マトリックスメタロペプチダーゼ-20(MER003021)、マトリックスメタロペプチダーゼ-19(MER002076)、マトリックスメタロペプチダーゼ-23B(MER004766)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-5(MER005638)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-6(MER012071)、マトリックスメタロペプチダーゼ-21(MER006101)、マトリックスメタロペプチダーゼ-22(MER014098)、マトリックスメタロペプチダーゼ-26(MER012072)、マトリックスメタロペプチダーゼ-28(MER013587)、マトリックスメタロペプチダーゼ-23A(MER037217)、マクロファージエラスターゼホモログ(第8染色体、ホモサピエンス)(MER030035)、Mername-AA156タンパク質(MER021309)、マトリックスメタロペプチダーゼ様1(MER045280)、サブファミリーM10A非ペプチダーゼホモログ(MER175912)、サブファミリーM10A非ペプチダーゼホモログ(MER187997)、サブファミリーM10A非ペプチダーゼホモログ(MER187998)、サブファミリーM10A非ペプチダーゼホモログ(MER180000)、メプリン アルファ サブユニット(MER001111)、メプリンベータサブユニット(MER005213)、プロコラーゲンC-ペプチダーゼ(MER001113)、哺乳動物トロイド様1タンパク質(MER005124)、哺乳動物型トロイド様 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N-ペプチダーゼ(MER004985)、ADAM2タンパク質(MER003090)、ADAM6タンパク質(MER047044)、ADAM7タンパク質(MER005109)、ADAM18タンパク質(MER012230)、ADAM32タンパク質(MER026938)、非ペプチダーゼホモログ(ホモサピエンス染色体4)(MER029973)、ファミリーM12非ペプチダーゼホモログ(ホモサピエンス染色体16)(MER047654)、ファミリーM12非ペプチダーゼホモログ(ホモサピエンス染色体15)(MER047250)、ADAM3Bタンパク質(ホモサピエンス型)(MER005199)、ADAM11タンパク質(MER001146)、ADAM22タンパク質(MER005102)、ADAM23タンパク質(MER005103)、ADAM29タンパク質(MER006267)、ADAM21ペプチダーゼプレプロタンパク質(ホモサピエンス)(MER026944)に類似のタンパク質、Mername-AA225ペプチダーゼホモログ(ホモサピエンス)(MER047474)、推定ADAM偽遺伝子(染色体4、ホモサピエンス)(MER029975)、ADAM3A g.p.(ホモサピエンス)(MER005200)、ADAM1 g.p.(ホモサピエンス)(MER003912)、サブファミリーM12B非ペプチダーゼホモログ(MER188210)、サブファミリーM12B非ペプチダーゼホモログ(MER188211)、サブファミリーM12B非ペプチダーゼホモログ(MER188212)、サブファミリーM12B非ペプチダーゼホモログ(MER188220)、ネプリライシン(MER001050)、エンドセリン変換酵素1(MER001057)、エンドセリン変換酵素2(MER004776)、DINEペプチダーゼ(MER005197)、ネプリライシン-2(MER013406)、Kell血液型タンパク質(MER001054)、PHEXペプチダーゼ(MER002062)、i-AAAペプチダーゼ(MER001246)、i-AAAペプチダーゼ(MER005755)、パラプレギン(MER004454)、Afg3様タンパク質2(MER005496)、Afg3様タンパク質1A(MER014306)、パパリシン-1(MER002217)、パパリシン-2(MER014521)、ファルネシル化タンパク質変換酵素1(MER002646)、メタロプロテアーゼ関連タンパク質-1(MER030873)、アミノペプチダーゼAMZ2(MER011907)、アミノペプチダーゼAMZ1(MER058242)、カルボキシペプチダーゼA1(MER001190)、カルボキシペプチダーゼA2(MER001608)、カルボキシペプチダーゼB(MER001194)、カルボキシペプチダーゼN(MER001198)、カルボキシペプチダーゼE(MER001199)、カルボキシペプチダーゼM(MER001205)、カルボキシペプチダーゼU(MER001193)、カルボキシペプチダーゼA3(MER001187)、メタロカルボキシペプチダーゼDペプチダーゼユニット1(MER003781)、メタロカルボキシペプチダーゼZ(MER003428)、メタロカルボキシペプチダーゼDペプチダーゼユニット2(MER004963)、カルボキシペプチダーゼA4(MER013421)、カルボキシペプチダーゼA6(MER013456)、カルボキシペプチダーゼA5(MER017121)、メタロカルボキシペプチダーゼO(MER016044)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ様タンパク質5(MER033174)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ3(MER033176)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ6(MER033178)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ1(MER033179)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ2(MER037713)、メタロカルボキシペプチダーゼD非ペプチダーゼユニット(MER004964)、脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1(MER003889)、カルボキシペプチダーゼ様タンパク質X1(MER013404)、カルボキシペプチダーゼ様タンパク質X2(MER078764)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ(MER026952)、ファミリーM14非ペプチダーゼホモログ(MER199530)、インスリシン(MER001214)、ミトコンドリア 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’-一リン酸シンターゼ(MER043387)、カルバモイルリン酸シンターゼ(ホモサピエンス型)(MER078640)、ジヒドロオロターゼ(N末端ユニット)(ホモサピエンス型)(MER060647)、DJ-1推定ペプチダーゼ(MER003390)、Mername-AA100推定ペプチダーゼ(MER014802)、Mername-AA101非ペプチダーゼホモログ(MER014803)、KIAA0361タンパク質(ホモサピエンス型)(MER042827)、F1134283タンパク質(ホモサピエンス)(MER044553)、非ペプチダーゼホモログ染色体21オープンリーディングフレーム33(ホモサピエンス)(MER160094)、ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER177016)、ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER176613)、ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER176918)、ムチン様ホルモン受容体様2(MER037230)を含むEGF様モジュール、CD97抗原(ヒト型)(MER037286)、ムチン様ホルモン受容体様3を含むEGF様モジュール(MER037288)、ムチン様ホルモン受容体様1を含むEGF様モジュール(MER037278)、ムチン様ホルモン受容体様4を含むEGF様モジュール(MER037294)、カドヘリンEGFLAG7パスG型受容体2前駆体(ホモサピエンス)(MER045397)、Gpr64(ハツカネズミ)型タンパク質(MER123205)、GPR56(ホモサピエンス)型タンパク質(MER122057)、ラトロフィリン2(MER122199)、ラトロフィリン-1(MER126380)、ラトロフィリン3(MER124612)、プロトカドヘリンフラミンゴ2(MER124239)、ETLタンパク質(MER126267)、Gタンパク質共役型受容体112(MER126114)、7回膜貫通ヘリックス受容体(MER125448)、Gpr114タンパク質(MER159320)、GPR126血管誘導性Gタンパク質共役型受容体(MER140015)、GPR125(ホモサピエンス)型タンパク質(MER159279)、GPR116(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役型受容体(MER159280)、GPR128(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役型受容体(MER162015)、GPR133(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役型受容体(MER159334)、GPR110Gタンパク質共役型受容体(MER159277)、GPR97タンパク質(MER159322)、KPG_006タンパク質(MER161773)、KPG_008タンパク質(MER161835)、KPG_009タンパク質(MER159335)、未割り当てホモログ(MER166269)、GPR113タンパク質(MER159352)、脳特異的血管新生インヒビター2(MER159746)、PIDD自動処理タンパク質ユニット1(MER020001)、PIDD自動処理タンパク質ユニット2(MER063690)、MUC1自己切断性ムチン(MER074260)、ジストログリカン(MER054741)、プロタンパク質転換酵素9(MER022416)、サイト1ペプチダーゼ(MER001948)、フリン(MER000375)、プロタンパク質転換酵素1(MER000376)、プロタンパク質転換酵素2(MER000377)、プロタンパク質転換酵素4(MER028255)、PACE4プロタンパク質転換酵素(MER000383)、プロタンパク質転換酵素5(MER002578)、プロタンパク質転換酵素7(MER002984)、トリペプチジルペプチダーゼII(MER000355)、サブファミリーS8A非ペプチダーゼホモログ(MER201339)、サブファミリーS8A非ペプチダーゼホモログ(MER191613)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191611)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191612)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191614)、トリペプチジルペプチダーゼI(MER003575)、プロリルオリゴペプチダーゼ(MER000393)、ジペプチジルペプチダーゼIV(真核生物)(MER000401)、アシルアミノアシルペプチダーゼ(MER000408)、線維芽細胞活性化タンパク質アルファサブユニット(MER000399)、PREPLAタンパク質(MER004227)、ジペプチジルペプチダーゼ8(MER013484)、ジペプチジルペプチダーゼ9(MER004923)、FLJ1推定ペプチダーゼ(MER017240)、Mername-AA194推定ペプチダーゼ(MER017353)、Mername-AA195推定ペプチダーゼ(MER017367)、Mername-AA196推定ペプチダーゼ(MER017368)、Mername-AA197推定ペプチダーゼ(MER017371)、C14orf29タンパク質(MER033244)、仮想タンパク質(MER033245)、仮想エステラーゼ/リパーゼ/チオエステラーゼ(MER047309)、タンパク質bat5(MER037840)、仮想タンパク質flj40219(MER033212)、仮想タンパク質flj37464(MER033240)、仮想タンパク質flj33678(MER033241)、ジペプチジルペプチダーゼホモログDPP6(MER000403)、ジペプチジルペプチダーゼホモログDPP10(MER005988)、ハツカネズミ染色体20オープンリーディングフレーム135に類似したタンパク質(MER037845)、キヌレニンホルムアミダーゼ(MER046020)、チログロブリン前駆体(MER011604)、アセチルコリンエステラーゼ(MER033188)、コリンエステラーゼ(MER033198)、カルボキシルエステラーゼD1(MER033213)、肝臓カルボキシルエステラーゼ(MER033220)、カルボキシルエステラーゼ3(MER033224)、カルボキシルエステラーゼ2(MER033226)、胆汁酸塩依存的リパーゼ(MER033227)、カルボキシルエステラーゼ関連タンパク質(MER033231)、ニューロリギン3(MER033232)、ニューロリギン4、X結合型(MER033235)、ニューロリギン4、Y結合(MER033236)、エステラーゼD(MER043126)、アリールアセトアミドデアセチラーゼ(MER033237)、KIAA1363様タンパク質(MER033242)、ホルモン感受性リパーゼ(MER033274)、ニューロリギン1(MER033280)、ニューロリギン2(MER033283)、ファミリーS9非ペプチダーゼホモログ(MER212939)、ファミリーS9非ペプチダーゼホモログ(MER211490)、サブファミリーS9C未割り当てペプチダーゼ(MER192341)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209181)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER200434)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209507)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209142)、セリンカルボキシペプチダーゼA(MER000430)、卵黄形成性カルボキシペプチダーゼ様タンパク質(MER005492)、RISCペプチダーゼ(MER010960)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER199442)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER200437)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER212825)、リソソームPro-Xaaカルボキシペプチダーゼ(MER000446)、ジペプチジルペプチダーゼII(MER004952)、胸腺特異的セリンペプチダーゼ(MER005538)、エポキシドヒドロラーゼ様推定ペプチダーゼ(MER031614)、Loc328574様タンパク質(MER033246)、アブヒドロラーゼドメイン含有タンパク質4(MER031616)、エポキシド加水分解酵素(MER000432)、中胚葉特異的転写タンパク質(MER199890)、中胚葉特異的転写タンパク質(MER017123)、サイトゾルエポキシド加水分解酵素(MER029997)、仮想タンパク質FLJ22408(MER031608)に類似した細胞質エポキシドヒドロラーゼ(MER213866)、CGI-58推定ペプチダーゼ(MER030163)、ウィリアムズ・ビューレン症候群臨界領域タンパク質21エポキシド加水分解酵素(MER031610)、エポキシド加水分解酵素(MER031612)、仮想タンパク質922408(エポキシドヒドロラーゼ)(MER031617)、モノグリセリドリパーゼ(MER033247)、仮想タンパク質(MER033249)、バラシクロビル加水分解酵素(MER033259)、Ccg1相互作用因子b(MER210738)、グリコシルアスパラギナーゼ前駆体(MER003299)、イソアスパルチルジペプチダーゼ(スレオニン型)(MER031622)。タスパーゼ-1(MER016969)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ5(哺乳動物型)(MER001977)、ガンマ-グルタミルトランス
フェラーゼ1(哺乳動物型)(MER001629)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ2(ヒト)(MER001976)、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ様タンパク質4(MER002721)。ガンマグルタミルトランスフェラーゼ様タンパク質3(MER016970)。ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ1前駆体(ホモサピエンス)(MER026204)に類似。ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ1前駆体(ホモサピエンス)(MER026205)に類似。Mername-AA211推定ペプチダーゼ(MER026207)。ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ6(MER159283)。ガンマ-グルタミルトランスペプチダーゼホモログ(第2染色体、ホモサピエンス)(MER037241)。ポリシスチン-1(MER126824)、KIAA1879タンパク質(MER159329)。多発性嚢胞腎1様3(MER172554)。ガンマ-グルタミルヒドロラーゼ(MER002963)。グアニン5″一リン酸シンテターゼ(MER043387)。カルバモイルリン酸シンターゼ(ホモサピエンス型)(MER078640)。ジヒドロオロターゼ(N末端ユニット)(ホモサピエンス型)(MER060647)。DJ-1推定ペプチダーゼ(MER003390)。Mername-AA100推定ペプチダーゼ(MER014802)。Mername-AA101非ペプチダーゼホモログ(MER014803)。KIAA0361タンパク質(ホモサピエンス型)(MER042827)。F1134283タンパク質(ホモサピエンス)(MER044553)。非ペプチダーゼホモログ染色体21オープンリーディングフレーム33(ホモサピエンス)(MER160094)。ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER177016)、ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER176613)。ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER176918)。ムチン様ホルモン受容体様2を含むEGF様モジュール(MER037230)。CD97抗原(ヒト型)(MER037286)。ムチン様ホルモン受容体様3を含むEGF様モジュール(MER037288)。ムチン様ホルモン受容体様1を含むEGF様モジュール(MER037278)。ムチン様ホルモン受容体様4を含むEGF様モジュール(MER037294)。カドヘリンEGF LAGの7回膜貫通G型受容体2前駆体(ホモサピエンス)(MER045397)、Gpr64(ハツカネズミ)型タンパク質(MER123205)。GPR56(ホモサピエンス)型タンパク質(MER122057)、ラトロフィリン2(MER122199)、ラトロフィリン-1(MER126380)、ラトロフィリン3(MER124612)、プロトカドヘリンFlamingo 2(MER124239)。ETLタンパク質(MER126267)。Gタンパク質共役受容体112(MER126114)。7回膜貫通ヘリックス受容体(MER125448)。Gpr114タンパク質(MER159320)。GPR126血管誘導性Gタンパク質共役受容体(MER140015)。GPR125(ホモサピエンス)型タンパク質(MER159279)。GPR116(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役受容体(MER159280)。GPR128(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役受容体(MER162015)。GPR133(ホモサピエンス)型タンパク質(MER159334)GPR110Gタンパク質共役型受容体(MER159277)、GPR97タンパク質(MER159322)、KPG_006タンパク質(MER161773)、KPG_008タンパク質(MER161835)、KPG_009タンパク質(MER159335)、未割り当てホモログ(MER166269)、GPR113タンパク質(MER159352)、脳特異的血管新生インヒビター2(MER159746)、PIDD自動プロセシングタンパク質ユニット1(MER020001)、PIDD自動プロセシングタンパク質ユニット2(MER063690)、MUC1自己切断ムチン(MER074260)、ジストログリカン(MER054741)、プロタンパク質コンバターゼ9(MER022416)、サイト1ペプチダーゼ(MER001948)、フリン(MER000375)、プロタンパク質コンバターゼ1(MER000376)、プロタンパク質コンバターゼ2(MER000377)、プロタンパク質コンバターゼ4(MER028255)、PACE4プロタンパク質コンバターゼ(MER000383)、プロプロテインコンバターゼ5(MER002578)、プロプロテインコンバターゼ7(MER002984)、トリペプチジルペプチダーゼII(MER000355)、サブファミリーS8A非ペプチダーゼホモログ(MER201339)、サブファミリーS8A非ペプチダーゼホモログ(MER191613)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191611)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191612)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191614)、トリペプチジルペプチダーゼI(MER003575)、プロリルオリゴペプチダーゼ(MER000393)、ジペプチジルペプチダーゼIV(真核生物)(MER000401)、アシルアミノアシルペプチダーゼ(MER000408)、線維芽細胞活性化タンパク質アルファサブユニット(MER000399)、PREPL Aタンパク質(MER004227)、ジペプチジルペプチダーゼ8(MER013484)、ジペプチジルペプチダーゼ9(MER004923)、FLJ1推定ペプチダーゼ(MER017240)、Mername-AA194推定ペプチダーゼ(MER017353)、Mername-AA195推定ペプチダーゼ(MER017367)、Mername-AA196推定ペプチダーゼ(MER017368)、Mername-AA197推定ペプチダーゼ(MER017371)、C14orf29タンパク質(MER033244)、仮想タンパク質(MER033245)、仮想エステラーゼ/リパーゼ/チオエステラーゼ(MER047309)、プロテインバット5(MER037840)、仮説タンパク質flj40219(MER033212)、仮説タンパク質flj37464(MER033240)、仮説タンパク質flj33678(MER033241)、ジペプチジルペプチダーゼホモログDPP6(MER000403)、ジペプチジルペプチダーゼホモログDPP10(MER005988)、ハツカネズミ染色体20オープンリーディングフレーム135に類似したタンパク質(MER037845)、キヌレニンホルムアミダーゼ(MER046020)、チログロブリン前駆体(MER011604)、アセチルコリンエステラーゼ(MER033188)、コリンエステラーゼ(MER033198)、カルボキシルエステラーゼD1(MER033213)、肝臓カルボキシルエステラーゼ(MER033220)、カルボキシルエステラーゼ3(MER033224)、カルボキシルエステラーゼ2(MER033226)、胆汁酸塩依存的リパーゼ(MER033227)、カルボキシルエステラーゼ関連タンパク質(MER033231)、ニューロリジン3(MER033232)、ニューロリギン4、X連鎖(MER033235)、ニューロリギン4、Y連鎖(MER033236)、エステラーゼD(MER043126)、アリールアセトアミドデアセチラーゼ(MER033237)、KIAA1363様タンパク質(MER033242)、ホルモン感受性リパーゼ(MER033274)、ニューロリギン1(MER033280)、ニューロリギン2(MER033283)、ファミリーS9非ペプチダーゼホモログ(MER212939)、ファミリーS9非ペプチダーゼホモログ(MER211490)、サブファミリーS9C未割り当てペプチダーゼ(MER192341)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209181)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER200434)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209507)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209142)、セリンカルボキシペプチダーゼA(MER000430)、卵黄形成性カルボキシペプチダーゼ様タンパク質(MER005492)、RISCペプチダーゼ(MER010960)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER199442)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER200437)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER212825)、リソソームPro-Xaaカルボキシペプチダーゼ(MER000446)、ジペプチジルペプチダーゼII(MER004952)、胸腺特異的セリンペプチダーゼ(MER005538)、エポキシドヒドロラーゼ様推定ペプチダーゼ(MER031614)、Loc328574様タンパク質(MER033246)、アブヒドロラーゼドメイン含有タンパク質4(MER031616)、エポキシドヒドロラーゼ(MER000432)、中胚葉特異的転写タンパク質(MER199890)、中胚葉特異的転写タンパク質(MER017123)、サイトゾルエポキシドヒドロラーゼ(MER029997)、サイトゾルエポキシドヒドロラーゼ(MER213866)、仮想タンパク質FLJ22408(MER031608)に類似、CGI-58推定ペプチダーゼ(MER030163)、ウィリアムズ・ビューレン症候群臨界領域タンパク質21エポキシドヒドロラーゼ(MER031610)、エポキシドヒドロラーゼ(MER031612)、仮説タンパク質flj22408(エポキシドヒドロラーゼ)(MER031617)、モノグリセリドリパーゼ(MER033247)、仮想タンパク質(MER033249)、バラシクロビルヒドロラーゼ(MER033259)、Ccg1相互作用因子b(MER210738)。
ホモログ(MER047236)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047238)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047239)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047240)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047242)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047243)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047249)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047251)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047252)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047254)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047255)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047263)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047265)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047266)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047267)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047268)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047269)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047272)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047273)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047274)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047275)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047276)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047279)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047280)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047281)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047282)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047284)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047285)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047289)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047290)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047294)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047295)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047298)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047300)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047302)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047304)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047305)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047306)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047307)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047310)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047311)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047314)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047318)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047320)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047321)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047322)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047326)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047327)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047330)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047333)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047362)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047366)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047369)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047370)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047371)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047375)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047376)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047381)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047383)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047384)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047385)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047388)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047389)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047391)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047394)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047396)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047400)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047401)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047403)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047406)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047407)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047410)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047411)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047413)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047414)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047416)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047417)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047420)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047423)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047424)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047428)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047429)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047431)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047434)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047439)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047442)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047445)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047449)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047450)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047452)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047455)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047457)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047458)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047459)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047463)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047468)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047469)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047470)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047476)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047478)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047483)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047488)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047489)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047490)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047493)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047494)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047495)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047496)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047497)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047499)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047502)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047504)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047511)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047513)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047514)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047515)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047516)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047520)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047533)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047537)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047569)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047570)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047584)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047603)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047604)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047606)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047609)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047616)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047619)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047648)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047649)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER047662)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048004)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048018)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048019)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048023)、サブファミリーA2A非ペプチダーゼホモログ(MER048037)、サブファミリーA2A未割り当てペプチダーゼs(MER047164)、サブファミリーA2A未割り当てペプチダーゼ(MER047231)、サブファミリーA2A未割り当てペプチダーゼs(MER047386)、皮膚アスパラギン酸プロテアーゼ(MER057097)、プレセニリン1(MER005221)、プレセニリン2(MER005223)、impas1ペプチダーゼ(MER019701)、impas1ペプチダーゼ(MER184722)、impas4ペプチダーゼ(MER019715)、impas2ペプチダーゼ(MER019708)、impas5ペプチダーゼ(MER019712)、impas3ペプチダーゼ(MER019711)、可能なファミリーA22偽遺伝子(ホモサピエンス染色体18)(MER029974)、可能なファミリーA22偽遺伝子(ホモサピエンス染色体11)(MER023159)、カテプシンV(MER004437)、カテプシンX(MER004508)、カテプシンF(MER004980)、カテプシンL(MER000622)、カテプシンS(MER000633)、カテプシンO(MER0016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マトリックスメタロペプチダーゼ-1(MER001077)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-2(MER002383)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-3(MER002384)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-4(MER002595)、マトリックスメタロペプチダーゼ-20(MER003021)、マトリックスメタロペプチダーゼ-19(MER002076)、マトリックスメタロペプチダーゼ-23B(MER004766)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-5(MER005638)、膜型マトリックスメタロペプチダーゼ-6(MER012071)、マトリックスメタロペプチダーゼ-21(MER006101)、マトリックスメタロペプチダーゼ-22(MER014098)、マトリックスメタロペプチダーゼ-26(MER012072)、マトリックスメタロペプチダーゼ-28(MER013587)、マトリックスメタロペプチダーゼ-23A(MER037217)、マクロファージエラスターゼホモログ(第8染色体、ホモサピエンス)(MER030035)、Mername-AA156タンパク質(MER021309)、マトリックスメタロペプチダーゼ様1(MER045280)、サブファミリーM10A非ペプチダーゼホモログ(MER175912)、サブファミリーM10A非ペプチダーゼホモログ(MER187997)、サブファミリーM10A非ペプチダーゼホモログ(MER187998)、サブファミリーM10A非ペプチダーゼホモログ(MER180000)、メプリン アルファ サブユニット(MER001111)、メプリンベータサブユニット(MER005213)、プロコラーゲンC-ペプチダーゼ(MER001113)、哺乳動物トロイド様1タンパク質(MER005124)、哺乳動物型トロイド様 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N-ペプチダーゼ(MER004985)、ADAM2タンパク質(MER003090)、ADAM6タンパク質(MER047044)、ADAM7タンパク質(MER005109)、ADAM18タンパク質(MER012230)、ADAM32タンパク質(MER026938)、非ペプチダーゼホモログ(ホモサピエンス染色体4)(MER029973)、ファミリーM12非ペプチダーゼホモログ(ホモサピエンス染色体16)(MER047654)、ファミリーM12非ペプチダーゼホモログ(ホモサピエンス染色体15)(MER047250)、ADAM3Bタンパク質(ホモサピエンス型)(MER005199)、ADAM11タンパク質(MER001146)、ADAM22タンパク質(MER005102)、ADAM23タンパク質(MER005103)、ADAM29タンパク質(MER006267)、ADAM21ペプチダーゼプレプロタンパク質(ホモサピエンス)(MER026944)に類似のタンパク質、Mername-AA225ペプチダーゼホモログ(ホモサピエンス)(MER047474)、推定ADAM偽遺伝子(染色体4、ホモサピエンス)(MER029975)、ADAM3A g.p.(ホモサピエンス)(MER005200)、ADAM1 g.p.(ホモサピエンス)(MER003912)、サブファミリーM12B非ペプチダーゼホモログ(MER188210)、サブファミリーM12B非ペプチダーゼホモログ(MER188211)、サブファミリーM12B非ペプチダーゼホモログ(MER188212)、サブファミリーM12B非ペプチダーゼホモログ(MER188220)、ネプリライシン(MER001050)、エンドセリン変換酵素1(MER001057)、エンドセリン変換酵素2(MER004776)、DINEペプチダーゼ(MER005197)、ネプリライシン-2(MER013406)、Kell血液型タンパク質(MER001054)、PHEXペプチダーゼ(MER002062)、i-AAAペプチダーゼ(MER001246)、i-AAAペプチダーゼ(MER005755)、パラプレギン(MER004454)、Afg3様タンパク質2(MER005496)、Afg3様タンパク質1A(MER014306)、パパリシン-1(MER002217)、パパリシン-2(MER014521)、ファルネシル化タンパク質変換酵素1(MER002646)、メタロプロテアーゼ関連タンパク質-1(MER030873)、アミノペプチダーゼAMZ2(MER011907)、アミノペプチダーゼAMZ1(MER058242)、カルボキシペプチダーゼA1(MER001190)、カルボキシペプチダーゼA2(MER001608)、カルボキシペプチダーゼB(MER001194)、カルボキシペプチダーゼN(MER001198)、カルボキシペプチダーゼE(MER001199)、カルボキシペプチダーゼM(MER001205)、カルボキシペプチダーゼU(MER001193)、カルボキシペプチダーゼA3(MER001187)、メタロカルボキシペプチダーゼDペプチダーゼユニット1(MER003781)、メタロカルボキシペプチダーゼZ(MER003428)、メタロカルボキシペプチダーゼDペプチダーゼユニット2(MER004963)、カルボキシペプチダーゼA4(MER013421)、カルボキシペプチダーゼA6(MER013456)、カルボキシペプチダーゼA5(MER017121)、メタロカルボキシペプチダーゼO(MER016044)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ様タンパク質5(MER033174)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ3(MER033176)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ6(MER033178)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ1(MER033179)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ2(MER037713)、メタロカルボキシペプチダーゼD非ペプチダーゼユニット(MER004964)、脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質1(MER003889)、カルボキシペプチダーゼ様タンパク質X1(MER013404)、カルボキシペプチダーゼ様タンパク質X2(MER078764)、サイトゾルカルボキシペプチダーゼ(MER026952)、ファミリーM14非ペプチダーゼホモログ(MER199530)、インスリシン(MER001214)、ミトコンドリア 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サブユニット2i(MER001515)、プロテアソーム触媒サブユニット3i(MER000555)、プロテアソーム触媒サブユニット5t(MER026203)、プロテインセリンキナーゼc17(MER026497)、プロテアソームサブユニットアルファ6(MER000557)、プロテアソームサブユニットアルファ2(MER000550)、プロテアソームサブユニットアルファ4(MER000554)、プロテアソームサブユニットアルファ7(MER033250)、プロテアソームサブユニットアルファ5(MER000558)、プロテアソームサブユニットアルファ1(MER000549)、プロテアソームサブユニットアルファ3(MER000553)、プロテアソームサブユニットXAPC7(MER004372)、プロテアソームサブユニットベータ3(MER001710)、プロテアソームサブユニットベータ2(MER002676)、プロテアソームサブユニットベータ1(MER000551)、プロテアソームサブユニットベータ4(MER001711)、Mername-AA230ペプチダーゼホモログ(ホモサピエンス)(MER047329)、Mername-AA231偽遺伝子(ホモサピエンス)(MER047172)、Mername-AA232偽遺伝子(ホモサピエンス)(MER047316)、グリコシルアスパラギナーゼ前駆体(MER003299)、イソアスパルチルジペプチダーゼ(スレオニン型)(MER031622)、タスパーゼ-1(MER016969)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ5(哺乳動物型)(MER001977)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ1(哺乳動物型)(MER001629)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ2(ホモサピエンス)(MER001976)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ様タンパク質4(MER002721)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ様タンパク質3(MER016970)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ1前駆体(ホモサピエンス)(MER026204)に類似、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ1前駆体(ホモサピエンス)(MER026205)に類似、Mername-AA211推定ペプチダーゼ(MER026207)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ6(MER159283)、ガンマ-グルタミルトランスペプチダーゼホモログ(染色体2、ホモサピエンス)(MER037241)、ポリシスチン-1(MER126824)、KIAA1879タンパク質(MER159329)、多発性嚢胞腎1様3(MER172554)、ガンマ-グルタミルヒドロラーゼ(MER002963)、グアニン5’ ’-一リン酸シンターゼ(MER043387)、カルバモイルリン酸シンターゼ(ホモサピエンス型)(MER078640)、ジヒドロオロターゼ(N末端ユニット)(ホモサピエンス型)(MER060647)、DJ-1推定ペプチダーゼ(MER003390)、Mername-AA100推定ペプチダーゼ(MER014802)、Mername-AA101非ペプチダーゼホモログ(MER014803)、KIAA0361タンパク質(ホモサピエンス型)(MER042827)、F1134283タンパク質(ホモサピエンス)(MER044553)、非ペプチダーゼホモログ染色体21オープンリーディングフレーム33(ホモサピエンス)(MER160094)、ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER177016)、ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER176613)、ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER176918)、ムチン様ホルモン受容体様2(MER037230)を含むEGF様モジュール、CD97抗原(ヒト型)(MER037286)、ムチン様ホルモン受容体様3を含むEGF様モジュール(MER037288)、ムチン様ホルモン受容体様1を含むEGF様モジュール(MER037278)、ムチン様ホルモン受容体様4を含むEGF様モジュール(MER037294)、カドヘリンEGFLAG7パスG型受容体2前駆体(ホモサピエンス)(MER045397)、Gpr64(ハツカネズミ)型タンパク質(MER123205)、GPR56(ホモサピエンス)型タンパク質(MER122057)、ラトロフィリン2(MER122199)、ラトロフィリン-1(MER126380)、ラトロフィリン3(MER124612)、プロトカドヘリンフラミンゴ2(MER124239)、ETLタンパク質(MER126267)、Gタンパク質共役型受容体112(MER126114)、7回膜貫通ヘリックス受容体(MER125448)、Gpr114タンパク質(MER159320)、GPR126血管誘導性Gタンパク質共役型受容体(MER140015)、GPR125(ホモサピエンス)型タンパク質(MER159279)、GPR116(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役型受容体(MER159280)、GPR128(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役型受容体(MER162015)、GPR133(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役型受容体(MER159334)、GPR110Gタンパク質共役型受容体(MER159277)、GPR97タンパク質(MER159322)、KPG_006タンパク質(MER161773)、KPG_008タンパク質(MER161835)、KPG_009タンパク質(MER159335)、未割り当てホモログ(MER166269)、GPR113タンパク質(MER159352)、脳特異的血管新生インヒビター2(MER159746)、PIDD自動処理タンパク質ユニット1(MER020001)、PIDD自動処理タンパク質ユニット2(MER063690)、MUC1自己切断性ムチン(MER074260)、ジストログリカン(MER054741)、プロタンパク質転換酵素9(MER022416)、サイト1ペプチダーゼ(MER001948)、フリン(MER000375)、プロタンパク質転換酵素1(MER000376)、プロタンパク質転換酵素2(MER000377)、プロタンパク質転換酵素4(MER028255)、PACE4プロタンパク質転換酵素(MER000383)、プロタンパク質転換酵素5(MER002578)、プロタンパク質転換酵素7(MER002984)、トリペプチジルペプチダーゼII(MER000355)、サブファミリーS8A非ペプチダーゼホモログ(MER201339)、サブファミリーS8A非ペプチダーゼホモログ(MER191613)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191611)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191612)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191614)、トリペプチジルペプチダーゼI(MER003575)、プロリルオリゴペプチダーゼ(MER000393)、ジペプチジルペプチダーゼIV(真核生物)(MER000401)、アシルアミノアシルペプチダーゼ(MER000408)、線維芽細胞活性化タンパク質アルファサブユニット(MER000399)、PREPLAタンパク質(MER004227)、ジペプチジルペプチダーゼ8(MER013484)、ジペプチジルペプチダーゼ9(MER004923)、FLJ1推定ペプチダーゼ(MER017240)、Mername-AA194推定ペプチダーゼ(MER017353)、Mername-AA195推定ペプチダーゼ(MER017367)、Mername-AA196推定ペプチダーゼ(MER017368)、Mername-AA197推定ペプチダーゼ(MER017371)、C14orf29タンパク質(MER033244)、仮想タンパク質(MER033245)、仮想エステラーゼ/リパーゼ/チオエステラーゼ(MER047309)、タンパク質bat5(MER037840)、仮想タンパク質flj40219(MER033212)、仮想タンパク質flj37464(MER033240)、仮想タンパク質flj33678(MER033241)、ジペプチジルペプチダーゼホモログDPP6(MER000403)、ジペプチジルペプチダーゼホモログDPP10(MER005988)、ハツカネズミ染色体20オープンリーディングフレーム135に類似したタンパク質(MER037845)、キヌレニンホルムアミダーゼ(MER046020)、チログロブリン前駆体(MER011604)、アセチルコリンエステラーゼ(MER033188)、コリンエステラーゼ(MER033198)、カルボキシルエステラーゼD1(MER033213)、肝臓カルボキシルエステラーゼ(MER033220)、カルボキシルエステラーゼ3(MER033224)、カルボキシルエステラーゼ2(MER033226)、胆汁酸塩依存的リパーゼ(MER033227)、カルボキシルエステラーゼ関連タンパク質(MER033231)、ニューロリギン3(MER033232)、ニューロリギン4、X結合型(MER033235)、ニューロリギン4、Y結合(MER033236)、エステラーゼD(MER043126)、アリールアセトアミドデアセチラーゼ(MER033237)、KIAA1363様タンパク質(MER033242)、ホルモン感受性リパーゼ(MER033274)、ニューロリギン1(MER033280)、ニューロリギン2(MER033283)、ファミリーS9非ペプチダーゼホモログ(MER212939)、ファミリーS9非ペプチダーゼホモログ(MER211490)、サブファミリーS9C未割り当てペプチダーゼ(MER192341)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209181)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER200434)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209507)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209142)、セリンカルボキシペプチダーゼA(MER000430)、卵黄形成性カルボキシペプチダーゼ様タンパク質(MER005492)、RISCペプチダーゼ(MER010960)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER199442)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER200437)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER212825)、リソソームPro-Xaaカルボキシペプチダーゼ(MER000446)、ジペプチジルペプチダーゼII(MER004952)、胸腺特異的セリンペプチダーゼ(MER005538)、エポキシドヒドロラーゼ様推定ペプチダーゼ(MER031614)、Loc328574様タンパク質(MER033246)、アブヒドロラーゼドメイン含有タンパク質4(MER031616)、エポキシド加水分解酵素(MER000432)、中胚葉特異的転写タンパク質(MER199890)、中胚葉特異的転写タンパク質(MER017123)、サイトゾルエポキシド加水分解酵素(MER029997)、仮想タンパク質FLJ22408(MER031608)に類似した細胞質エポキシドヒドロラーゼ(MER213866)、CGI-58推定ペプチダーゼ(MER030163)、ウィリアムズ・ビューレン症候群臨界領域タンパク質21エポキシド加水分解酵素(MER031610)、エポキシド加水分解酵素(MER031612)、仮想タンパク質922408(エポキシドヒドロラーゼ)(MER031617)、モノグリセリドリパーゼ(MER033247)、仮想タンパク質(MER033249)、バラシクロビル加水分解酵素(MER033259)、Ccg1相互作用因子b(MER210738)、グリコシルアスパラギナーゼ前駆体(MER003299)、イソアスパルチルジペプチダーゼ(スレオニン型)(MER031622)。タスパーゼ-1(MER016969)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ5(哺乳動物型)(MER001977)、ガンマ-グルタミルトランス
フェラーゼ1(哺乳動物型)(MER001629)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ2(ヒト)(MER001976)、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ様タンパク質4(MER002721)。ガンマグルタミルトランスフェラーゼ様タンパク質3(MER016970)。ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ1前駆体(ホモサピエンス)(MER026204)に類似。ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ1前駆体(ホモサピエンス)(MER026205)に類似。Mername-AA211推定ペプチダーゼ(MER026207)。ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ6(MER159283)。ガンマ-グルタミルトランスペプチダーゼホモログ(第2染色体、ホモサピエンス)(MER037241)。ポリシスチン-1(MER126824)、KIAA1879タンパク質(MER159329)。多発性嚢胞腎1様3(MER172554)。ガンマ-グルタミルヒドロラーゼ(MER002963)。グアニン5″一リン酸シンテターゼ(MER043387)。カルバモイルリン酸シンターゼ(ホモサピエンス型)(MER078640)。ジヒドロオロターゼ(N末端ユニット)(ホモサピエンス型)(MER060647)。DJ-1推定ペプチダーゼ(MER003390)。Mername-AA100推定ペプチダーゼ(MER014802)。Mername-AA101非ペプチダーゼホモログ(MER014803)。KIAA0361タンパク質(ホモサピエンス型)(MER042827)。F1134283タンパク質(ホモサピエンス)(MER044553)。非ペプチダーゼホモログ染色体21オープンリーディングフレーム33(ホモサピエンス)(MER160094)。ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER177016)、ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER176613)。ファミリーC56非ペプチダーゼホモログ(MER176918)。ムチン様ホルモン受容体様2を含むEGF様モジュール(MER037230)。CD97抗原(ヒト型)(MER037286)。ムチン様ホルモン受容体様3を含むEGF様モジュール(MER037288)。ムチン様ホルモン受容体様1を含むEGF様モジュール(MER037278)。ムチン様ホルモン受容体様4を含むEGF様モジュール(MER037294)。カドヘリンEGF LAGの7回膜貫通G型受容体2前駆体(ホモサピエンス)(MER045397)、Gpr64(ハツカネズミ)型タンパク質(MER123205)。GPR56(ホモサピエンス)型タンパク質(MER122057)、ラトロフィリン2(MER122199)、ラトロフィリン-1(MER126380)、ラトロフィリン3(MER124612)、プロトカドヘリンFlamingo 2(MER124239)。ETLタンパク質(MER126267)。Gタンパク質共役受容体112(MER126114)。7回膜貫通ヘリックス受容体(MER125448)。Gpr114タンパク質(MER159320)。GPR126血管誘導性Gタンパク質共役受容体(MER140015)。GPR125(ホモサピエンス)型タンパク質(MER159279)。GPR116(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役受容体(MER159280)。GPR128(ホモサピエンス)型Gタンパク質共役受容体(MER162015)。GPR133(ホモサピエンス)型タンパク質(MER159334)GPR110Gタンパク質共役型受容体(MER159277)、GPR97タンパク質(MER159322)、KPG_006タンパク質(MER161773)、KPG_008タンパク質(MER161835)、KPG_009タンパク質(MER159335)、未割り当てホモログ(MER166269)、GPR113タンパク質(MER159352)、脳特異的血管新生インヒビター2(MER159746)、PIDD自動プロセシングタンパク質ユニット1(MER020001)、PIDD自動プロセシングタンパク質ユニット2(MER063690)、MUC1自己切断ムチン(MER074260)、ジストログリカン(MER054741)、プロタンパク質コンバターゼ9(MER022416)、サイト1ペプチダーゼ(MER001948)、フリン(MER000375)、プロタンパク質コンバターゼ1(MER000376)、プロタンパク質コンバターゼ2(MER000377)、プロタンパク質コンバターゼ4(MER028255)、PACE4プロタンパク質コンバターゼ(MER000383)、プロプロテインコンバターゼ5(MER002578)、プロプロテインコンバターゼ7(MER002984)、トリペプチジルペプチダーゼII(MER000355)、サブファミリーS8A非ペプチダーゼホモログ(MER201339)、サブファミリーS8A非ペプチダーゼホモログ(MER191613)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191611)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191612)、サブファミリーS8A未割り当てペプチダーゼ(MER191614)、トリペプチジルペプチダーゼI(MER003575)、プロリルオリゴペプチダーゼ(MER000393)、ジペプチジルペプチダーゼIV(真核生物)(MER000401)、アシルアミノアシルペプチダーゼ(MER000408)、線維芽細胞活性化タンパク質アルファサブユニット(MER000399)、PREPL Aタンパク質(MER004227)、ジペプチジルペプチダーゼ8(MER013484)、ジペプチジルペプチダーゼ9(MER004923)、FLJ1推定ペプチダーゼ(MER017240)、Mername-AA194推定ペプチダーゼ(MER017353)、Mername-AA195推定ペプチダーゼ(MER017367)、Mername-AA196推定ペプチダーゼ(MER017368)、Mername-AA197推定ペプチダーゼ(MER017371)、C14orf29タンパク質(MER033244)、仮想タンパク質(MER033245)、仮想エステラーゼ/リパーゼ/チオエステラーゼ(MER047309)、プロテインバット5(MER037840)、仮説タンパク質flj40219(MER033212)、仮説タンパク質flj37464(MER033240)、仮説タンパク質flj33678(MER033241)、ジペプチジルペプチダーゼホモログDPP6(MER000403)、ジペプチジルペプチダーゼホモログDPP10(MER005988)、ハツカネズミ染色体20オープンリーディングフレーム135に類似したタンパク質(MER037845)、キヌレニンホルムアミダーゼ(MER046020)、チログロブリン前駆体(MER011604)、アセチルコリンエステラーゼ(MER033188)、コリンエステラーゼ(MER033198)、カルボキシルエステラーゼD1(MER033213)、肝臓カルボキシルエステラーゼ(MER033220)、カルボキシルエステラーゼ3(MER033224)、カルボキシルエステラーゼ2(MER033226)、胆汁酸塩依存的リパーゼ(MER033227)、カルボキシルエステラーゼ関連タンパク質(MER033231)、ニューロリジン3(MER033232)、ニューロリギン4、X連鎖(MER033235)、ニューロリギン4、Y連鎖(MER033236)、エステラーゼD(MER043126)、アリールアセトアミドデアセチラーゼ(MER033237)、KIAA1363様タンパク質(MER033242)、ホルモン感受性リパーゼ(MER033274)、ニューロリギン1(MER033280)、ニューロリギン2(MER033283)、ファミリーS9非ペプチダーゼホモログ(MER212939)、ファミリーS9非ペプチダーゼホモログ(MER211490)、サブファミリーS9C未割り当てペプチダーゼ(MER192341)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209181)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER200434)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209507)、ファミリーS9未割り当てペプチダーゼ(MER209142)、セリンカルボキシペプチダーゼA(MER000430)、卵黄形成性カルボキシペプチダーゼ様タンパク質(MER005492)、RISCペプチダーゼ(MER010960)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER199442)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER200437)、ファミリーS15未割り当てペプチダーゼ(MER212825)、リソソームPro-Xaaカルボキシペプチダーゼ(MER000446)、ジペプチジルペプチダーゼII(MER004952)、胸腺特異的セリンペプチダーゼ(MER005538)、エポキシドヒドロラーゼ様推定ペプチダーゼ(MER031614)、Loc328574様タンパク質(MER033246)、アブヒドロラーゼドメイン含有タンパク質4(MER031616)、エポキシドヒドロラーゼ(MER000432)、中胚葉特異的転写タンパク質(MER199890)、中胚葉特異的転写タンパク質(MER017123)、サイトゾルエポキシドヒドロラーゼ(MER029997)、サイトゾルエポキシドヒドロラーゼ(MER213866)、仮想タンパク質FLJ22408(MER031608)に類似、CGI-58推定ペプチダーゼ(MER030163)、ウィリアムズ・ビューレン症候群臨界領域タンパク質21エポキシドヒドロラーゼ(MER031610)、エポキシドヒドロラーゼ(MER031612)、仮説タンパク質flj22408(エポキシドヒドロラーゼ)(MER031617)、モノグリセリドリパーゼ(MER033247)、仮想タンパク質(MER033249)、バラシクロビルヒドロラーゼ(MER033259)、Ccg1相互作用因子b(MER210738)。
プロテアーゼ酵素活性は調節することができる。例えば、特定のプロテアーゼは、特定のインヒビター、例えば特定の小分子インヒビターなどにより阻害される。特定のプロテアーゼについての例示的なインヒビターを、表4中に列挙する。例えば、限定されないが、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルを含むプロテアーゼインヒビターにより、NS3プロテアーゼを抑制することができる。別の実施例では、プロテアーゼ活性は、プロテアーゼ自体の発現を調節することを通じて調節することができ、例えば、誘導性プロモーター系(例、Tet On/Off系)又は細胞特異的プロモーター(異種プロテアーゼを発現するために使用することができるプロモーターは、本明細書中の項に「プロモーター」と題してより詳細に記載されている)を使用して、プロテアーゼを発現するように細胞を操作することなどである。プロテアーゼはまた、デグロン、例えば本明細書中に記載されるデグロンのいずれかなどを含むことができ、本明細書中に記載されるデグロン系のいずれかを使用して調節することができる。
細胞膜係留ドメイン
本明細書中で提供される膜切断可能なキメラタンパク質は、細胞膜係留ドメイン(式S-C-MT-D中で「MT」として言及される)を含む。一般的に、細胞膜係留ドメインは、キメラタンパク質を発現する細胞の細胞膜に局在化される(例、その中に挿入される)、又はそうでなければ、それと会合するようにキメラタンパク質を方向付けることが可能な任意のアミノ酸配列モチーフであり得る。細胞膜係留ドメインは、膜貫通-細胞内ドメインであり得る。細胞膜係留ドメインは、膜貫通ドメインであり得る。細胞膜係留ドメインは、内因性タンパク質ドメイン(例、膜貫通ドメイン)であり得る。細胞膜係留ドメインの例は、限定されないが、PDGFRベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する膜貫通‐細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインを含む。細胞膜係留ドメインは、細胞表面受容体又はその細胞膜結合部分であり得る。
本明細書中で提供される膜切断可能なキメラタンパク質は、細胞膜係留ドメイン(式S-C-MT-D中で「MT」として言及される)を含む。一般的に、細胞膜係留ドメインは、キメラタンパク質を発現する細胞の細胞膜に局在化される(例、その中に挿入される)、又はそうでなければ、それと会合するようにキメラタンパク質を方向付けることが可能な任意のアミノ酸配列モチーフであり得る。細胞膜係留ドメインは、膜貫通-細胞内ドメインであり得る。細胞膜係留ドメインは、膜貫通ドメインであり得る。細胞膜係留ドメインは、内因性タンパク質ドメイン(例、膜貫通ドメイン)であり得る。細胞膜係留ドメインの例は、限定されないが、PDGFRベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する膜貫通‐細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインを含む。細胞膜係留ドメインは、細胞表面受容体又はその細胞膜結合部分であり得る。
一般的に、本明細書中に記載される全ての膜切断可能なキメラタンパク質について、細胞膜係留ドメインは、プロテアーゼ切断部位のC末端及びデグロンのN末端である(言い換えれば、細胞膜係留ドメインは、プロテアーゼ切断部位とデグロンの間にある)。細胞膜係留ドメインは、ポリペプチドリンカー、即ち、一般的に細胞膜係留ドメイン又はプロテアーゼ切断部位の一部とは考えられないポリペプチド配列により、プロテアーゼ切断部位に接続することができる。細胞膜係留ドメインは、ポリペプチドリンカー、即ち、一般的に細胞膜係留ドメイン又はデグロンの一部とは考えられないポリペプチド配列により、デグロンに接続することができる。ポリペプチドリンカーは、第一のポリペプチド配列及び第二のポリペプチド配列を接続する任意のアミノ酸配列であり得る。ポリペプチドリンカーは、可動性リンカー(例、Gly-Ser-Gly配列)であり得る。ポリペプチドリンカーの例は、限定されないが、GSGリンカー(例、[GS]4GG[配列番号182])、A(EAAAK)3A(配列番号183)、及びWhitlowリンカー(例、「KEGS」リンカー、例えばアミノ酸配列KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号184)など、EGKリンカー、例えばアミノ酸配列EGKSSGSGSESKST(配列番号185)、及び、参照により本明細書中に組み入れられる、発行された米国特許第5,990,275号においてより詳細に記載されているリンカー)を含む。他のポリペプチドリンカーは、所望の特性(例、長さ、可動性、アミノ酸組成物など)に基づいて選択されてもよく、当業者に公知である。
一般的に、細胞膜係留ドメインは、分泌されたエフェクター分子及びプロテアーゼ切断部位が、細胞膜中への挿入又はそれとの会合の後に細胞外に曝露されるように配向され、プロテアーゼ切断部位は、そのそれぞれのプロテアーゼにより切断され、エフェクター分子を細胞外空間中に放出(分泌)することが可能であるようにする。
デグロン
本明細書中に提供されるキメラタンパク質は、デグロン(例、本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質について、式S-C-MT-D中で「D」として言及される)を含む。一般的に、デグロンは、キメラタンパク質の調節された分解、例えばユビキチン媒介性経路を通じた調節された分解などを通じて方向付けることが可能な任意のアミノ酸配列モチーフであり得る。デグロンは、限定されないが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能であるその断片を含む、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能なセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインであり得る。CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物、例えばFNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物などであり得る。デグロンドメイン、及び特にCRBNデグロン系は、国際出願公開第WO2019/089592Al号においてより詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。デグロンドメインの他の例は、限定されないが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277-307の二つのコピー;配列番号161)、GRR(ヒトp105の残基352~408;配列番号162)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295;配列番号163)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(インフルエンザA又はインフルエンザBのSP2-NB-SP2、例、配列番号164)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー;配列番号165)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2;配列番号166)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー;配列番号167)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142;配列番号168)、Nek2A、マウスODC(残基422~461、配列番号169)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン酸依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、又はPCNA結合PIPボックスを含む。
本明細書中に提供されるキメラタンパク質は、デグロン(例、本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質について、式S-C-MT-D中で「D」として言及される)を含む。一般的に、デグロンは、キメラタンパク質の調節された分解、例えばユビキチン媒介性経路を通じた調節された分解などを通じて方向付けることが可能な任意のアミノ酸配列モチーフであり得る。デグロンは、限定されないが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能であるその断片を含む、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能なセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインであり得る。CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物、例えばFNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物などであり得る。デグロンドメイン、及び特にCRBNデグロン系は、国際出願公開第WO2019/089592Al号においてより詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。デグロンドメインの他の例は、限定されないが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277-307の二つのコピー;配列番号161)、GRR(ヒトp105の残基352~408;配列番号162)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295;配列番号163)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(インフルエンザA又はインフルエンザBのSP2-NB-SP2、例、配列番号164)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー;配列番号165)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2;配列番号166)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー;配列番号167)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142;配列番号168)、Nek2A、マウスODC(残基422~461、配列番号169)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン酸依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、又はPCNA結合PIPボックスを含む。
調節された分解は、薬物誘導性であり得る。分解を媒介/調節することが可能な薬物は、小分子化合物であり得る。分解を媒介/調節することが可能な薬物は、「免疫調節薬物」(IMiD)を含み得る。一般的に、本明細書中で使用されるように、IMiDは、イミド基を含む小分子免疫調節薬物のクラスを指す。セレブロン(CRBN)は、IMiDの公知の標的であり、CRBN又はCRBNポリペプチド基質ドメインへのIMiDの結合によって、CRBN E3ユビキチンリガーゼ複合体の基質特異性が変化して、CRBNポリペプチド基質ドメインを有するタンパク質(例、本明細書中に記載される分泌性エフェクター分子又は目的の他のタンパク質)の分解に導く。CRBNポリペプチド基質ドメインを有するデグロンについては、イミド含有IMiDの例は、限定されないが、サリドマイド、レナリドミド、又はポマリドミドを含む。IMiDは、FDA承認薬物であり得る。
一般的に、本明細書中に記載される全ての膜切断可能なキメラタンパク質について、デグロンは、細胞膜係留ドメインのC末端である。デグロンは、ポリペプチドリンカー、即ち、一般的に細胞膜係留ドメイン又はデグロンの一部とは考えられないポリペプチド配列により、細胞膜係留ドメインに接続することができる。ポリペプチドリンカーは、第一のポリペプチド配列及び第二のポリペプチド配列を接続する任意のアミノ酸配列であり得る。ポリペプチドリンカーは、可動性リンカー(例、Gly-Ser-Gly配列)であり得る。ポリペプチドリンカーの例は、限定されないが、GSGリンカー(例、[GS]4GG[配列番号182])、A(EAAAK)3A(配列番号183)、及びWhitlowリンカー(例、「KEGS」リンカー、例えばアミノ酸配列KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号184)など、EGKリンカー、例えばアミノ酸配列EGKSSGSGSESKST(配列番号185)、及び、参照により本明細書中に組み入れられる、発行された米国特許第5,990,275号においてより詳細に記載されているリンカー)を含む。他のポリペプチドリンカーは、所望の特性(例、長さ、可動性、アミノ酸組成物など)に基づいて選択されてもよく、当業者に公知である。一般的に、デグロンは、細胞膜係留ドメインに関連して配向され、デグロンは、細胞膜への局在化後にサイトゾルに曝露されるようにし、デグロンが、分解(例、サイトゾル及びサイトゾルへの曝露)を媒介することが可能であり、ユビキチン媒介性分解を媒介することが可能であるようにする。
デグロン融合キメラタンパク質については、デグロンは、目的のタンパク質のN末端又はC末端、例えば、エフェクター分子であることができる。デグロンは、ポリペプチドリンカー、即ち、一般的に目的のタンパク質又はデグロンの一部とは考えられないポリペプチド配列により、目的のタンパク質に接続することができる。ポリペプチドリンカーは、第一のポリペプチド配列及び第二のポリペプチド配列を接続する任意のアミノ酸配列であり得る。ポリペプチドリンカーは、可動性リンカー(例、Gly-Ser-Gly配列)であり得る。ポリペプチドリンカーの例は、限定されないが、GSGリンカー(例、[GS]4GG[配列番号182])、A(EAAAK)3A(配列番号183)、及びWhitlowリンカー(例、「KEGS」リンカー、例えばアミノ酸配列KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号184)など、EGKリンカー、例えばアミノ酸配列EGKSSGSGSESKST(配列番号185)、及び、参照により本明細書中に組み入れられる、発行された米国特許第5,990,275号においてより詳細に記載されているリンカー)を含む。他のポリペプチドリンカーは、所望の特性(例、長さ、可動性、アミノ酸組成物など)に基づいて選択されてもよく、当業者に公知である。ポリペプチドリンカーは、切断可能、例えば、本明細書中に記載されるプロテアーゼ切断部位のいずれかであり得る。
ホーミング分子
「腫瘍微小環境」は、腫瘍が存在する細胞環境であって、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症性細胞、リンパ球、シグナル伝達分子、及び細胞外マトリックス(ECM)を含む、(例、Pattabiraman,D.R.&Weinberg,R.A.Nature ReviewsDrugDiscovery13,497-512(2014);Balkwill,F.R.et al.J Cell Sci 125,5591-5596,2012;及びLi,H.et al.J Cell Biochem 101(4),805-15,2007を参照のこと)。
「腫瘍微小環境」は、腫瘍が存在する細胞環境であって、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症性細胞、リンパ球、シグナル伝達分子、及び細胞外マトリックス(ECM)を含む、(例、Pattabiraman,D.R.&Weinberg,R.A.Nature ReviewsDrugDiscovery13,497-512(2014);Balkwill,F.R.et al.J Cell Sci 125,5591-5596,2012;及びLi,H.et al.J Cell Biochem 101(4),805-15,2007を参照のこと)。
一部の実施形態では、操作された核酸は、少なくとも一つのホーミング分子を産生するように構成される。例えば、デグロンドメインに融合された目的のタンパク質を含む、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質(例、本明細書中で他に記載される、操作されたAAVベクター及びウイルスに関連する融合タンパク質を参照のこと)において、目的のタンパク質は、ホーミング分子であり得る。「ホーミング」は、標的部位(例、細胞、組織(例、腫瘍)、又は器官)への細胞の能動的ナビゲーション(遊走)を指す。「ホーミング分子」は、細胞を標的部位に向かわせる分子を指す。一部の実施形態では、ホーミング分子は、標的部位への、操作された細胞の相互作用を認識及び/又は開始するように機能する。ホーミング分子の非限定的な例は、CXCR1、CCR9、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7、及びPDGFRを含む。
一部の実施形態では、ホーミング分子は、ケモカイン受容体(ケモカインに結合する細胞表面分子)である。ケモカインは、細胞により分泌される小さなサイトカイン又はシグナル伝達タンパク質であり、それらは、細胞中で定向性の走化性を誘導することができる。ケモカインは、四つの主なサブファミリー中に分類することができる:CXC、CC、CX3C、及びXCは、それらの全てが、標的細胞の表面上に位置するケモカイン受容体に選択的に結合することにより生物学的効果を発揮する。一部の実施形態では、操作された核酸は、CXCR4、間質細胞由来因子1(また、SDF1、C-X-Cモチーフケモカイン12、及びCXCL12として公知である)発現細胞、組織、又は腫瘍に向かうケモカイン勾配に沿って、操作された細胞がホーミングすることを可能にするケモカイン受容体を産生するように構成される。本開示の操作された核酸によりコードされ得るケモカイン受容体の非限定的な例は、以下を含む:CXCケモカイン受容体(例、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、及びCXCR7)、CCケモカイン受容体(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、及びCCR11)、CX3Cケモカイン受容体(例、CX3CL1に結合するCX3CR1)、及びXCケモカイン受容体(例、XCR1)。一部の実施形態では、ケモカイン受容体は、Gタンパク質連結膜貫通受容体、又は腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(限定されないが、TNFRSF1A、TNFRSF1Bを含む)のメンバーである。一部の実施形態では、操作された核酸は、CXCL8,CXCL9、及び/又はCXCL10(T細胞動員を促進する)、CCL3及び/又はCXCL5,CCL21(Th1動員及び極性化)を産生するように構成される。
一部の実施形態では、操作された核酸は、N-ホルミル化含有オリゴペプチド(限定されないが、FPR2及びFPRL1を含む)を検出するGタンパク質共役受容体(GPCR)を産生するように構成されている。
一部の実施形態では、操作された核酸は、インターロイキン(限定されないが、IL6Rを含む)を検出する受容体を産生するように構成されている。
一部の実施形態では、操作された核酸は、他の細胞、組織、又は腫瘍から分泌された成長因子を検出する受容体(限定されないが、FGFR、PDGFR、EGFRを含み、ならびにVEGFファミリーの受容体、限定されないが、VEGF-C及びVEGF-Dを含む)を産生するように構成されている。
一部の実施形態では、ホーミング分子はインテグリンである。インテグリンは、細胞外マトリックス(ECM)接着を促進する膜貫通型受容体である。インテグリンは、二つのサブユニット:α(アルファ)及びβ(ベータ)を有する必須のヘテロ二量体である。インテグリンのαサブユニットは、限定されないが、以下であり得る:ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGA2B、ITGAX。インテグリンのβサブユニットは、限定されないが、以下であり得る:ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、及びITGB8。操作された核酸は、インテグリンα及びβサブユニットの任意の組み合わせを産生するように構成され得る。
一部の実施形態では、ホーミング分子は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)である。MMPは、内皮細胞壁の基礎となる基底膜の成分を切断する酵素である。MMPの非限定的な例は、MMP-2、MMP-9、及びMMPを含む。一部の実施形態では、操作された核酸は、MMPを阻害する分子(例、タンパク質)のインヒビターを産生するように構成される。例えば、操作された核酸は、膜1型MMP(MT1-MMP)のインヒビター(例、RNAi分子)又はTIMPメタロペプチダーゼインヒビター1(TIMP-1)を発現するように構成され得る。
一部の実施形態では、ホーミング分子は、例えば、標的組織の内皮上のセレクチンに結合するリガンド(例、造血細胞 E-/L-セレクチンリガンド(HCELL)、Dykstra et al.,Stem Cells.2016 Oct;34(10):2501-2511)である。
用語「ホーミング分子」はまた、細胞のホーミングを改善/増強する分子の産生を調節する転写因子を包含する。
操作された核酸
本明細書中で提供されるのは、本開示の少なくとも一つのキメラタンパク質、例えば、例えば本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などをコードする、操作された核酸である。本明細書中で提供されるのは、二つ以上のキメラタンパク質をコードする、操作された核酸である。
本明細書中で提供されるのは、本開示の少なくとも一つのキメラタンパク質、例えば、例えば本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などをコードする、操作された核酸である。本明細書中で提供されるのは、二つ以上のキメラタンパク質をコードする、操作された核酸である。
本明細書中に記載される特定の実施形態では、操作された核酸は、プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットをコードし、N末端からC末端に配向されており、式:S-C-MT-Dを有する。Sは、分泌性エフェクター分子を指す。Cはプロテアーゼ切断部位を指す。MTは細胞膜係留ドメインを指す。Dはデグロンを指す。このプロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるよう構成される。
本明細書中に記載される特定の実施形態では、操作された核酸は、プロモーター、ならびに目的のタンパク質(例、本明細書中に記載されるエフェクター分子のいずれか)及びデグロンを有するデグロン融合キメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットをコードする。このプロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、デグロン融合キメラタンパク質は、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている。
「操作された核酸」は、自然において生じない核酸である。しかし、操作された核酸は、全体として非天然である一方で、それは、天然において生じるヌクレオチド配列を含み得ることを理解すべきである。一部の実施形態では、操作された核酸は、異なる生物からの(例、異なる種からの)ヌクレオチド配列を含む。例えば、一部の実施形態では、操作された核酸は、マウスヌクレオチド配列、細菌ヌクレオチド配列、ヒトヌクレオチド配列、及び/又はウイルスヌクレオチド配列を含む。用語「操作された核酸」は、組換え核酸及び合成核酸を含む。「組換え核酸」は、核酸分子を連結することにより構築され、一部の実施形態では、生細胞中で複製することができる分子を指す。「合成核酸」は、増幅される、又は化学的に、もしくは他の手段により合成される分子を指す。合成核酸は、化学的に修飾された、又は他の方法で修飾されたものを含むが、しかし、天然核酸分子と塩基対合することができる。修飾は、限定されないが、一つ又は複数の修飾されたヌクレオチド間連結及び非天然核酸を含む。修飾は、米国特許第6,673,611号及び米国特許出願公開2004/0019001においてさらに詳細に記載されており、それらの各々が、それらの全体において参照により組み入れられる。修飾されたヌクレオチド間連結は、ホスホロジチオエート又はホスホロチオエート連結であり得る。非天然核酸は、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、グリコール核酸(GNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO又は「モルホリノ」)、及びトレオース核酸(TNA)であり得る。非天然核酸は、国際出願WO1998/039352、米国出願公開第2013/0156849号、及び米国特許第6,670,461号;第5,539,082号;第5,185,444号においてさらに詳細に記載されており、各々が、それらの全体において参照により本明細書中に組み入れられる。組換え核酸及び合成核酸はまた、前述のいずれかの複製から起因する分子を含む。本開示の操作された核酸は、単一の分子(例、同じプラスミド又は他のベクター中に含まれる)により、又は複数の異なる分子(例、複数の異なる独立して複製する分子)によりコードされ得る。操作された核酸は、単離された核酸であり得る。単離核酸は、限定されないが、cDNAポリヌクレオチド、RNAポリヌクレオチド、RNAiオリゴヌクレオチド(例、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、shRNAなど)、mRNAポリヌクレオチド、環状プラスミド、直線状DNA断片、ベクター、ミニサークル、ssDNA、及びオリゴヌクレオチドを含む。
本開示の操作された核酸は、標準的な分子生物学方法(例、Green and Sambrook,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2012,Cold Spring Harbor Pressを参照のこと)を使用して産生され得る。一部の実施形態では、操作された核酸構築物は、GIBSON ASSEMBLY(登録商標)クローニング(例、Gibson,D.G.et al.NatureMethods,343-345,2009;及びGibson,D.G.et al.NatureMethods,901-903,2010を参照のこと。それらの各々が、参照により本明細書中に組み入れられる)を使用して産生される。GIBSON ASSEMBLY(登録商標)は、典型的には、単一チューブ反応において三つの酵素活性を使用する:5’エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼのγ伸長活性、及びDNAリガーゼ活性。5’エキソヌクレアーゼ活性は、5’末端配列を噛み返し、アニーリングのために相補配列を露出させる。ポリメラーゼ活性は次に、アニーリングされた領域上のギャップを埋める。DNAリガーゼは次に、ニックを密閉し、DNA断片を一緒に共有結合的に連結させる。隣接する断片の重複する配列は、Golden Gate Assemblyにおいて使用されるものよりもずっと長く、従って、正しい組み立ての高いパーセンテージがもたらされる。一部の実施形態では、操作された核酸構築物は、IN-FUSION(登録商標)クローニング(Clontech)を使用して産生される。
プロモーター
一般的に、本明細書中に記載される全ての実施形態では、一つ又は複数のキメラタンパク質をコードする操作された核酸は、プロモーターを含む発現カセットをコードする。一部の実施形態では、操作された核酸(例、発現カセットを含む操作された核酸)は、少なくとも2つのキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列(例、外因性ポリヌクレオチド配列)に動作可能に連結されたプロモーターを含む。例えば、操作された核酸は、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、又は少なくとも10のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含み得る。一部の実施形態では、操作された核酸は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、又はそれ以上のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む。
一般的に、本明細書中に記載される全ての実施形態では、一つ又は複数のキメラタンパク質をコードする操作された核酸は、プロモーターを含む発現カセットをコードする。一部の実施形態では、操作された核酸(例、発現カセットを含む操作された核酸)は、少なくとも2つのキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列(例、外因性ポリヌクレオチド配列)に動作可能に連結されたプロモーターを含む。例えば、操作された核酸は、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、又は少なくとも10のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含み得る。一部の実施形態では、操作された核酸は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、又はそれ以上のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む。
「プロモーター」は、核酸配列の残りの転写の開始及び速度が制御される核酸配列の制御領域を指す。プロモーターはまた、調節タンパク質及び分子、例えばRNAポリメラーゼ及び他の転写因子などが結合し得る小領域を含み得る。プロモーターは、構成的、誘導的、抑制的、組織特異的、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する又は転写を駆動する。本明細書中では、プロモーターは、それが調節する核酸配列に関係して、正しい機能的位置及び配向にある場合、その配列の転写開始及び/又は発現を制御する(駆動する)ために、「動作可能に連結されている」と考えられる。
プロモーターは、所与の遺伝子又は配列のコードセグメントの上流に位置する5’非コード配列を単離することにより得られ得るように、遺伝子又は配列と天然に関連付けられるプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは「内因性」として言及され得る。一部の実施形態では、コード核酸配列は、組換え又は異種プロモーターの制御下に配置され得るが、それは、その天然の環境においてコード化された配列と通常は関連付けられないプロモーターを指す。そのようなプロモーターは、他の遺伝子のプロモーター;任意の他の細胞から単離されたプロモーター;ならびに「天然」ではない合成プロモーター又はエンハンサー、例えば、当技術分野において公知である遺伝子操作の方法を通じて発現を改変する異なる転写調節領域の異なるエレメント及び/又は変異を含むものなどを含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、配列は、組換えクローニング及び/又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む核酸増幅技術を使用して産生され得る(例、米国特許第4,683,202号及び米国特許第5,928,906号を参照のこと)。
操作された核酸のプロモーターは、「誘導性プロモーター」であり得るが、それは、シグナルの存在において、シグナルにより影響される、又はシグナルにより接触される場合に、転写活性を調節する(例、開始又は活性化する)ことにより特徴付けられるプロモーターを指す。このシグナルは、誘導性プロモーターからの転写活性を調節する際に活性であるような方法において、誘導性プロモーターと接触する内因性又は通常は外因性の状態(例、光)、化合物(例、化学的又は非化学的化合物)、又はタンパク質(例、サイトカイン)であり得る。転写の活性化は、プロモーターに直接的に作用して転写を駆動すること、又はプロモーターが転写を駆動することを防止しているリプレッサーの不活化によりプロモーターに間接的に作用することを含み得る。逆に、転写の不活化は、転写を防止するためにプロモーターに直接的に作用すること、又は、次にプロモーターに作用するリプレッサーを活性化することによりプロモーターに間接的に作用することを含み得る。
プロモーターは、局所的な腫瘍状態(例、炎症又は低酸素)、あるいは、その状態又はシグナルの存在において、プロモーターからの転写が活性化、不活化、増加、又は減少する場合にはシグナルに「応答性」である又は「により調節」される。一部の実施形態では、プロモーターは応答エレメントを含む。「応答エレメント」は、プロモーター領域内のDNAの短い配列であり、それは、プロモーターから遺伝子発現を調節する(modulate)(調節する(regulate))特定の分子(例、転写因子)に結合する。本開示に従って使用され得る応答エレメントは、限定されないが、フロレチン調整可能制御要素(PEACE)、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン(DBD)、インターフェロンガンマ活性化配列(GAS)(Decker,T.et al.J Interferon Cytokine Res.1997Mar;17(3):121-34、参照により本明細書中に組み入れられる)、インターフェロン刺激応答エレメント(IRE)(Han,K.J.et al.J Biol Chem.2004 Apr 9;279(15):15652-61、参照により本明細書中に組み入れられる)、NF-カッパB応答エレメント(Wang,V.et al.Cell Reports.2012;2(4):824-839、参照により本明細書中に組み入れられる)、及びSTAT3応答エレメント(Zhang,D.et al.J of Biol Chem.1996;271:9503-9509、参照により本明細書中に組み入れられる)を含む。他の応答エレメントが本明細書中に包含される。応答エレメントはまた、その同族結合分子に対する応答エレメントの感受性を一般的に増加させるために、タンデムリピート(例、応答エレメントをコードする同じヌクレオチド配列の連続リピート)を含むことができる。タンデムリピートは、2×、3×、4×、5×などとラベル付けして、存在するリピートの数を表示することができる。
応答性プロモーター(また、「誘導性プロモーター」として言及される)の非限定的な例(例、TGF-ベータ応答性プロモーター)を表5A中に列挙し、それは、プロモーター及び転写因子の設計を示し、ならびに転写因子(TF)及び導入遺伝子転写(T)に向かうインデューサー分子の効果が示されている(B、結合;D、解離;n.d.、未決定)(A、活性化;DA、非活性化;DR、抑制)(Horner,M.&Weber,W.FEBS Letters 586(2012)20784-2096m、及びそれにおいて引用される参考文献を参照のこと)。誘導性プロモーターの他の非限定的な例は、表5B中に提示されるものを含む。
プロモーターの他の非限定的な例は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、伸長因子1-アルファ(EF1a)プロモーター、伸長因子(EFS)プロモーター、MNDプロモーター(骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを伴う修飾MoMuLV LTRのU3領域を含む合成プロモーター)、ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーター、シミアンウイルス40(SV40)プロモーター、及びユビキチンC(UbC)プロモーターを含む(表5Cを参照のこと)。
プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。一般的に、組織特異的プロモーターは、核酸(例、キメラタンパク質、例えば式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などをコードする操作された核酸)の転写を方向付けて、発現が特定の細胞型、オルガネラ、又は組織に限定されるようにする。組織特異的プロモーターは、限定されないが、アルブミン(肝臓特異的、Pinkert et al.,(1987))、リンパ球特異的プロモーター(Calame and Eaton,1988)、T細胞受容体の特定のプロモーター(Winoto and Baltimore,(1989))、及びイムノグロブリン;Banerji et al.,(1983);Queen and Baltimore,1983)、ニューロン特異的プロモーター(例、神経フィラメントプロモーター;Byrne and Ruddle,1989)、膵臓特異的プロモーター(Edlund et al.,(1985))、又は乳腺特異的プロモーター(乳白色プロモーター、米国特許第4,873,316号及び欧州出願公開第264,166号)、ならびに発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスホックスプロモーター(Kessel and Gruss,Science 249:374-379(1990))、又はα-フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman,GenesDev.3:537-546(1989))などを含み、それら各々の内容が、参照により本明細書中に完全に組み入れられる。プロモーターは、それぞれの特定の細胞型、オルガネラ、又は組織において構成的であり得る。組織特異的プロモーター及び/又は調節エレメントはまた、結腸上皮細胞について特異的な肝臓脂肪酸結合(FAB)タンパク質遺伝子;膵臓細胞について特異的なインスリン遺伝子;肝細胞についての特異的なトランスフィレチン、アルファ1-アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター1型(PAI-I)、アポリポタンパク質AI及びLDL受容体遺伝子;オリゴデンドロサイトについて特異的なミエリン塩基性タンパク質(MBP)遺伝子;グリア細胞について特異的なグリア原線維性酸性タンパク質(GFAP)遺伝子;眼を標的化するために特異的なOPSINからのプロモーター;ならびに神経細胞について特異的である神経特異的エノラーゼ(NSE)プロモーターを含むことができる。組織特異的プロモーターの例は、限定されないが、クレアチンキナーゼについてのプロモーターを含み、それは、筋肉及び心臓組織における発現ならびにB細胞における発現についてのイムノグロブリン重鎖又は軽鎖プロモーターを方向付けるために使用されている。他の組織特異的プロモーターは、ヒト平滑筋アルファ-アクチンプロモーターを含む。肝臓についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、HMG-COAレダクターゼプロモーター、ステロール調節エレメント1、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)プロモーター、ヒトC反応性タンパク質(CRP)プロモーター、ヒトグルコキナーゼプロモーター、コレステロールL7-アルファヒドロイラーゼ(CYP-7)プロモーター、ベータ-ガラクトシダーゼアルファ-2,6シアリルカンスフェラーゼプロモーター、インスリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP-I)プロモーター、アルドラーゼBプロモーター、ヒトトランスフェリンプロモーター、及びコラーゲンI型プロモーターを含む。前立腺についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、前立腺酸ホスファターゼ(PAP)プロモーター、94(SPS94)プロモーターの前立腺分泌タンパク質、前立腺特異的抗原複合体プロモーター、及びヒト腺性カリクレイン遺伝子プロモーター(hgt-1)を含む。胃組織についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、ヒトH+/K+-ATPaseアルファサブユニットプロモーターを含む。膵臓についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、膵炎関連タンパク質プロモーター(PAP)、エラスターゼ1転写エンハンサー、膵臓特異的アミラーゼ及びエラスターゼエンハンサープロモーター、ならびに膵臓コレステロールエステラーゼ遺伝子プロモーターを含む。子宮内膜についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、子宮グロビンプロモーターを含む。副腎細胞についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、コレステロール側鎖切断(SCC)プロモーターを含む。一般的な神経系についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、ガンマ-ガンマエノラーゼ(ニューロン特異的エノラーゼ、NSE)プロモーターを含む。脳についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、神経フィラメント重鎖(NF-H)プロモーターを含む。リンパ球についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、ヒトCGL-1/グランザイムBプロモーター、末端デオキシトランスフェラーゼ(TdT)、ラムダ5、VpreB、及びlck(リンパ球特異的チロシンタンパク質キナーゼp561ck)プロモーター、ヒトCD2プロモーター及びその3’転写エンハンサー、ならびにヒトNK及びT細胞特異的活性化(NKG5)プロモーターを含む。結腸についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、pp60c-srcチロシンキナーゼプロモーター、器官特異的ネオ抗原(OSN)プロモーター、及び結腸特異的抗原-Pプロモーターを含む。乳房細胞についての組織特異的発現エレメントは、例えば、限定されないが、ヒトアルファ-ラクトアルブミンプロモーターである。肺についての例示的な組織特異的発現エレメントは、限定されないが、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)遺伝子プロモーターを含む。
一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、腫瘍微小環境内のシグナルにより調節される。腫瘍微小環境は、腫瘍微小環境の存在において、腫瘍微小環境の非存在におけるプロモーターの活性と比べて、プロモーターの活性が少なくとも10%だけ増加又は減少する場合に、プロモーターを調節すると考えられる。一部の実施形態では、プロモーターの活性は、腫瘍微小環境の非存在におけるプロモーターの活性と比べて、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%だけ増加又は減少する。例えば、プロモーターの活性は、腫瘍微小環境の非存在におけるプロモーターの活性と比べて、10~20%、10~30%、10~40%、10~50%、10~60%、10~70%、10~80%、10~90%、10~100%、10~200%、20~30%、20~40%、20~50%、20~60%、20~70%、20~80%、20~90%、20~100%、20~200%、50~60%、50~70%、50~80%、50~90%、50~100%、又は50~200%だけ増加又は減少する。
一部の実施形態では、プロモーターの活性は、腫瘍微小環境の非存在におけるプロモーターの活性と比べて、少なくとも2倍(例、2、3、4、5、10、25、20、25、50、又は100倍)増加又は減少する。例えば、プロモーターの活性は、腫瘍微小環境の非存在におけるプロモーターの活性と比べて、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、又は少なくとも100倍増加又は減少する。一部の実施形態では、プロモーターの活性は、腫瘍微小環境の非存在におけるプロモーターの活性と比べて、2~10、2~20、2~30、2~40、2~50、2~60、2~70、2~80、2~90、又は2~100倍増加又は減少する。
一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、低酸素状態下で活性化される。「低酸素状態」は、身体又は身体の領域が、組織レベルで十分な酸素供給を欠乏する状態である。低酸素状態は、炎症を起こし得る(例、炎症性サイトカインのレベルは、低酸素状態下で増加する)。一部の実施形態では、低酸素状態下で活性化されるプロモーターは、炎症性サイトカインの活性の発現を減少させるキメラタンパク質をコードするヌクレオチドと動作可能に連結され、このように、低酸素状態により起こされる炎症を低下させる。一部の実施形態では、低酸素状態下で活性化されるプロモーターは、低酸素応答エレメント(HRE)を含む。「低酸素応答エレメント(HRE)」は、低酸素誘導因子(HIF)に応答する応答エレメントである。HREは、一部の実施形態では、コンセンサスモチーフNCGTG(ここで、NはA又はGのいずれかである)を含む。
マルチシストロン系及び複数のプロモーター系
一部の実施形態では、操作された核酸(例、発現カセットを含む、操作された核酸)は、複数のキメラタンパク質を産生するように構成される。例えば、核酸を、2~20の異なるキメラタンパク質を産生するように構成してもよい。一部の実施形態では、核酸は、2~20、2~19、2~18、2~17、2~16、2~15、2~14、2~13、2~12、2~11、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~20、3~19、3~18、3~17、3~16、3~15、3~14、3~13、3~12、3~11、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~20、4~19、4~18、4~17、4~16、4~15、4~14、4~13、4~12、4~11、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~20、5~19、5~18、5~17、5~16、5~15、5~14、5~13、5~12、5~11、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~20、6~19、6~18、6~17、6~16、6~15、6~14、6~13、6~12、6~11、6~10、6~9、6~8、6~7、7~20、7~19、7~18、7~17、7~16、7~15、7~14、7~13、7~12、7~11、7~10、7~9、7~8、8~20、8~19、8~18、8~17、8~16、8~15、8~14、8~13、8~12、8~11、8~10、8~9、9~20、9~19、9~18、9~17、9~16、9~15、9~14、9~13、9~12、9~11、9~10、10~20、10~19、10~18、10~17、10~16、10~15、10~14、10~13、10~12、10~11、11~20、11~19、11~18、11~17、11~16、11~15、11~14、11~13、11~12、12~20、12~19、12~18、12~17、12~16、12~15、12~14、12~13、13~20、13~19、13~18、13~17、13~16、13~15、13~14、14~20、14~19、14~18、14~17、14~16、14~15、15~20、15~19、15~18、15~17、15~16、16~20、16~19、16~18、16~17、17~20、17~19、17~18、18~20、18~19、又は19~20のキメラタンパク質を産生するように構成される。一部の実施形態では、核酸は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20のキメラタンパク質を産生するように構成される。
一部の実施形態では、操作された核酸(例、発現カセットを含む、操作された核酸)は、複数のキメラタンパク質を産生するように構成される。例えば、核酸を、2~20の異なるキメラタンパク質を産生するように構成してもよい。一部の実施形態では、核酸は、2~20、2~19、2~18、2~17、2~16、2~15、2~14、2~13、2~12、2~11、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~20、3~19、3~18、3~17、3~16、3~15、3~14、3~13、3~12、3~11、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~20、4~19、4~18、4~17、4~16、4~15、4~14、4~13、4~12、4~11、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~20、5~19、5~18、5~17、5~16、5~15、5~14、5~13、5~12、5~11、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~20、6~19、6~18、6~17、6~16、6~15、6~14、6~13、6~12、6~11、6~10、6~9、6~8、6~7、7~20、7~19、7~18、7~17、7~16、7~15、7~14、7~13、7~12、7~11、7~10、7~9、7~8、8~20、8~19、8~18、8~17、8~16、8~15、8~14、8~13、8~12、8~11、8~10、8~9、9~20、9~19、9~18、9~17、9~16、9~15、9~14、9~13、9~12、9~11、9~10、10~20、10~19、10~18、10~17、10~16、10~15、10~14、10~13、10~12、10~11、11~20、11~19、11~18、11~17、11~16、11~15、11~14、11~13、11~12、12~20、12~19、12~18、12~17、12~16、12~15、12~14、12~13、13~20、13~19、13~18、13~17、13~16、13~15、13~14、14~20、14~19、14~18、14~17、14~16、14~15、15~20、15~19、15~18、15~17、15~16、16~20、16~19、16~18、16~17、17~20、17~19、17~18、18~20、18~19、又は19~20のキメラタンパク質を産生するように構成される。一部の実施形態では、核酸は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20のキメラタンパク質を産生するように構成される。
一部の実施形態では、操作された核酸は、マルチシストロンであり得、即ち、二つ以上の別々のポリペプチド(例、複数のキメラタンパク質)が単一のmRNA転写物から産生され得る。操作された核酸は、様々なリンカーの使用を通じてマルチシストロンであることができ、例えば、第一のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、第二のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結することができる(例えば、5’から3’方向に、第一の遺伝子:リンカー:第二の遺伝子など)。リンカーは、2Aリボソームスキッピングエレメント、例えばT2Aなどをコードすることができる。他の2Aリボソームスキッピングエレメントは、限定されないが、E2A、P2A、及びF2Aを含む。2Aリボソームスキッピングエレメントによって、第一及び第二の遺伝子によりコードされる別々のポリペプチドの産生が翻訳中に可能になる。リンカーは、切断可能なリンカーポリペプチド配列、例えばフリン切断部位又はTEV切断部位などをコードすることができ、それにおいて、発現に続いて、切断可能なリンカーポリペプチドは、第一及び第二の遺伝子によりコードされる別々のポリペプチドが産生されるように切断される。切断可能リンカーは、切断をさらに促進する、ポリペプチド配列、例えば可動性リンカー(例、Gly-Ser-Gly配列)などを含むことができる。
リンカーは、配列内リボソーム進入部位(IRES)をコードすることができ、第一及び第二の遺伝子によりコードされる別々のポリペプチドが、翻訳中に産生されるようにする。リンカーは、スプライスアクセプター、例えばウイルススプライスアクセプターなどをコードすることができる。
リンカーは、2Aリボソームスキッピング、それに続く、2A残基の完全な除去を可能にするフリン部位のさらなる切断を通じて別々のポリペプチドを産生することができるリンカー、例えばフリン-2Aリンカーなどの組み合わせであり得る。一部の実施形態では、リンカーの組み合わせは、フリン配列、可動性リンカー、及び2Aリンカーを含むことができる。したがって、一部の実施形態では、リンカーは、フリン-Gly-Ser-Gly-2A融合ポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示のリンカーは、フリン-Gly-Ser-Gly-T2A融合ポリペプチドである。
一般的に、マルチシストロン系は、任意の数又は組み合わせのリンカーを使用して、任意の数の遺伝子又はその部分を発現することができる(例、操作された核酸は、第一、第二、及び第三のキメラタンパク質によりコードされる別々のポリペプチドが産生されるように、各々がリンカーにより分けられている、第一、第二、及び第三のキメラタンパク質をコードすることができる)。
操作された核酸は、複数のプロモーターを使用して、複数のORFからの遺伝子を発現することができ、即ち、二つ以上の別々のmRNA転写物を、単一の操作された核酸から産生することができる。例えば、第一のプロモーターは、第一のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と動作可能に連結することができ、第二のプロモーターは、第二のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と動作可能に連結することができる。一般的に、任意の数のプロモーターを使用して、任意の数のキメラタンパク質を発現することができる。一部の実施形態では、複数のプロモーターから発現されるORFの少なくとも一つは、マルチシストロンであり得る。
本明細書中で使用される「リンカー」は、第一のポリペプチド配列及び第二のポリペプチド配列を連結するポリペプチド、上に記載されるマルチシストロンリンカー、又は上に記載される追加のORFと動作可能に連結される追加のプロモーターを指すことができる。
操作された細胞
本明細書中で提供されるのは、異なる腫瘍媒介性免疫抑制機構を調節するキメラタンパク質を産生する操作された細胞、及び操作された細胞を産生する方法である。一般的に、本開示の操作された細胞は、本明細書中で提供されるキメラタンパク質、例えば本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などを発現するように操作されてもよい。これらの細胞は、本明細書中では「操作された細胞」として言及される。これらの細胞は、典型的には、操作された核酸を含み、自然において生じない。一部の実施形態では、細胞は、キメラタンパク質、例えば、免疫応答を刺激するものをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む、核酸を含むように操作される。本開示の操作された細胞は、細胞のゲノム中に組み込まれた、操作された核酸を含み得る。操作された細胞は、例えば、一過性発現系、例えばプラスミド又はmRNAなどで改変された、細胞のゲノム中に組み込まれることなく発現が可能な、操作された核酸を含み得る。
本明細書中で提供されるのは、異なる腫瘍媒介性免疫抑制機構を調節するキメラタンパク質を産生する操作された細胞、及び操作された細胞を産生する方法である。一般的に、本開示の操作された細胞は、本明細書中で提供されるキメラタンパク質、例えば本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などを発現するように操作されてもよい。これらの細胞は、本明細書中では「操作された細胞」として言及される。これらの細胞は、典型的には、操作された核酸を含み、自然において生じない。一部の実施形態では、細胞は、キメラタンパク質、例えば、免疫応答を刺激するものをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む、核酸を含むように操作される。本開示の操作された細胞は、細胞のゲノム中に組み込まれた、操作された核酸を含み得る。操作された細胞は、例えば、一過性発現系、例えばプラスミド又はmRNAなどで改変された、細胞のゲノム中に組み込まれることなく発現が可能な、操作された核酸を含み得る。
本開示はまた、キメラタンパク質と、それらが産生される、操作された細胞の間の相加性及び相乗性を包含する。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも二つ(例、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又はそれ以上)のキメラタンパク質を産生するように操作され、それらの各々が、異なる腫瘍媒介性免疫抑制機構を調節する。他の実施形態では、細胞は、細胞により天然に産生されないエフェクター分子を有する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。そのようなエフェクター分子は、例えば、細胞により天然に産生されるエフェクター分子の機能を補完し得る。
一部の実施形態では、細胞は、膜に係留される抗CD3及び/又は抗CD28アゴニストの細胞外ドメインを発現するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、複数のキメラタンパク質を産生するように操作される。例えば、細胞は、2~20の異なるキメラタンパク質を産生するように操作され得る。一部の実施形態では、2~20、2~19、2~18、2~17、2~16、2~15、2~14、2~13、2~12、2~11、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~20、3~19、3~18、3~17、3~16、3~15、3~14、3~13、3~12、3~11、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~20、4~19、4~18、4~17、4~16、4~15、4~14、4~13、4~12、4~11、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~20、5~19、5~18、5~17、5~16、5~15、5~14、5~13、5~12、5~11、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~20、6~19、6~18、6~17、6~16、6~15、6~14、6~13、6~12、6~11、6~10、6~9、6~8、6~7、7~20、7~19、7~18、7~17、7~16、7~15、7~14、7~13、7~12、7~11、7~10、7~9、7~8、8~20、8~19、8~18、8~17、8~16、8~15、8~14、8~13、8~12、8~11、8~10、8~9、9~20、9~19、9~18、9~17、9~16、9~15、9~14、9~13、9~12、9~11、9~10、10~20、10~19、10~18、10~17、10~16、10~15、10~14、10~13、10~12、10~11、11~20、11~19、11~18、11~17、11~16、11~15、11~14、11~13、11~12、12~20、12~19、12~18、12~17、12~16、12~15、12~14、12~13、13~20、13~19、13~18、13~17、13~16、13~15、13~14、14~20、14~19、14~18、14~17、14~16、14~15、15~20、15~19、15~18、15~17、15~16、16~20、16~19、16~18、16~17、17~20、17~19、17~18、18~20、18~19、又は19~20のキメラタンパク質を産生するように操作された細胞。一部の実施形態では、細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20のキメラタンパク質を産生するように操作される。
一部の実施形態では、操作された細胞は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターをコードする、一つ又は複数の操作された核酸を含む。一部の実施形態では、細胞は、複数の操作された核酸、例えば、少なくとも二つの操作された核酸を含むように操作され、各々が、少なくとも一つの(例、1、2、又は3)キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターをコードする。例えば、細胞は、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、又は少なくとも10の操作された核酸を含むように操作され得るが、各々が、少なくとも一つ(例、1つ、2つ、又は3つ)のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結されたプロモーターをコードする。一部の実施形態では、細胞は、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10又はそれ以上の操作された核酸を含むように操作され、各々が、少なくとも一つ(例、1つ、2つ、又は3つ)のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーターをコードする。操作された細胞は、上に記載されるリンカーの少なくとも一つをコードする操作された核酸、例えば、第一のポリペプチド配列と第二のポリペプチド配列を連結するポリペプチド、上に記載される一つ又は複数のマルチシストロンリンカー、追加のORFに動作可能に連結された一つ又は複数の追加のプロモーター、又はそれらの組み合わせを含み得る。
本開示の操作された細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、典型的には複数のキメラタンパク質を産生し、それらの少なくとも二つが、異なる腫瘍媒介性免疫抑制機構を調節する。一部の実施形態では、キメラタンパク質の少なくとも一つが、腫瘍微小環境における炎症性経路を刺激し、キメラタンパク質の少なくとも一つが、腫瘍微小環境における炎症の負のレギュレーターを阻害する。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、少なくとも一つのホーミング分子を産生するように操作される。「ホーミング」は、標的部位(例、細胞、組織(例、腫瘍)、又は器官)への細胞の能動的ナビゲーション(遊走)を指す。「ホーミング分子」は、細胞を標的部位に向かわせる分子を指す。一部の実施形態では、ホーミング分子は、標的部位への、操作された細胞の相互作用を認識及び/又は開始するように機能する。ホーミング分子の非限定的な例は、CXCR1、CCR9、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CCR2、CCR4、FPR2、VEGFR、IL6R、CXCR1、CSCR7、及びPDGFRを含む。
一部の実施形態では、ホーミング分子は、ケモカイン受容体(ケモカインに結合する細胞表面分子)である。本開示の操作された細胞により産生され得るケモカイン受容体の非限定的な例は、以下を含む:CXCケモカイン受容体(例、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、及びCXCR7)、CCケモカイン受容体(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、及びCCR11)、CX3Cケモカイン受容体(例、CX3CL1に結合するCX3CR1)、及びXCケモカイン受容体(例、XCR1)。一部の実施形態では、ケモカイン受容体は、Gタンパク質連結膜貫通受容体、又は腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリー(限定されないが、TNFRSF1A、TNFRSF1Bを含む)のメンバーである。一部の実施形態では、細胞は、CXCL8、CXCL9、及び/又はCXCL10(T細胞動員を促進する)、CCL3及び/又はCXCL5、CCL21(Th1動員及び分極)を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCR4を産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、N-ホルミル化含有オリゴペプチド(限定されないが、FPR2及びFPRL1を含む)を検出するGタンパク質共役受容体(GPCR)を産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、インターロイキン(限定されないが、IL6Rを含む)を検出する受容体を産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、他の細胞、組織、又は腫瘍から分泌される成長因子を検出する受容体(限定されないが、FGFR、PDGFR、EGFR、ならびに限定されないがVEGF-C及びVEGF-Dを含むVEGFファミリーの受容体を含む)を産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、一つ又は複数のインテグリンを産生するように操作される。本開示の細胞は、インテグリンα及びβサブユニットの任意の組み合わせを産生するように操作され得る。インテグリンのαサブユニットは、限定されないが、以下であり得る:ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGA2B、ITGAX。インテグリンのβサブユニットは、限定されないが、以下であり得る:ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、及びITGB8。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、一つ又は複数のマトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)を産生するように操作される。MMPの非限定的な例は、MMP-2、MMP-9、及びMMPを含む。一部の実施形態では、細胞は、MMPを阻害する分子(例、タンパク質)のインヒビターを産生するように操作される。例えば、細胞は、膜1型MMP(MT1-MMP)のインヒビター(例、RNAi分子)又はTIMPメタロペプチダーゼインヒビター1(TIMP-1)を発現するように操作され得る。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、例えば、標的組織の内皮上でセレクチン(例、造血細胞E-/L-セレクチンリガンド(HCELL)、Dykstra et al.,Stem Cells.2016 Oct;34(10):2501-2511)に結合するリガンドを産生するように操作される。
用語「ホーミング分子」はまた、細胞のホーミングを改善/増強する分子の産生を調節する転写因子を包含する。
また、本明細書中で提供されるのは、複数のキメラタンパク質を産生するように操作された、操作された細胞(例、腫瘍細胞、赤血球、血小板細胞、又は細菌細胞)であって、それらの少なくとも二つは、異なる腫瘍媒介性免疫抑制機構を調節する。一部の実施形態では、少なくとも一つ(例、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上)のキメラタンパク質は、腫瘍微小環境において少なくとも一つの免疫刺激機構を刺激する、又は腫瘍微小環境において少なくとも一つの免疫抑制機構を阻害する。一部の実施形態では、少なくとも一つ(例、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上)のキメラタンパク質は、腫瘍微小環境において少なくとも一つの免疫抑制機構を阻害し、少なくとも一つのキメラタンパク質(例、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上)は、腫瘍微小環境において少なくとも一つの免疫抑制機構を阻害する。さらに他の実施形態では、少なくとも二つ(例、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上)のキメラタンパク質は、腫瘍微小環境において少なくとも一つの免疫刺激機構を刺激する。さらに他の実施形態では、少なくとも二つ(例、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上)のキメラタンパク質は、腫瘍微小環境において少なくとも一つの免疫抑制機構を阻害する。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、T細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員を刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗原提示及び/又はプロセシングを刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー細胞媒介性の細胞傷害性シグナル伝達、活性、及び/又は動員を刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞分化及び/又は成熟を刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞動員を刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、M1マクロファージシグナル伝達、活性、及び/又は動員を刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、Th1分極を刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、間質分解を刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、免疫刺激性代謝物産生を刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、I型インターフェロンシグナル伝達を刺激する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、負の共刺激シグナル伝達を阻害する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗腫瘍免疫細胞のアポトーシス促進性シグナル伝達(例、TRAILを介する)を阻害する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、T調節性(Treg)細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員を阻害する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍チェックポイント分子を阻害する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)シグナル伝達を活性化する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、骨髄由来のサプレッサー細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員を阻害する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、免疫抑制因子/代謝物を分解する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、血管内皮成長因子シグナル伝達を阻害する少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞を直接的に殺傷する少なくとも一つのキメラタンパク質(例、グランザイム、パーフォリン、腫瘍溶解性ウイルス、細胞溶解性ペプチド、及び酵素、例えば、ADCCを誘発する抗腫瘍抗体)を産生するように操作される。
一部の実施形態では、少なくとも一つのキメラタンパク質は、T細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員を刺激し、抗原提示及び/又はプロセシングを刺激し、ナチュラルキラー細胞媒介性細胞傷害性シグナル伝達、活性、及び/又は動員を刺激し、樹状細胞分化及び/又は成熟を刺激し、免疫細胞動員を刺激し、マクロファージシグナル伝達を刺激し、間質分解を刺激し、免疫刺激性代謝物産生を刺激し、又はI型インターフェロンシグナル伝達を刺激し;ならびに、少なくとも一つのキメラタンパク質は、負の共刺激シグナル伝達を阻害し、抗腫瘍免疫細胞のアポトーシス促進性シグナル伝達を阻害し、調節性T(Treg)細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員を阻害し、腫瘍チェックポイント分子を阻害し、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)シグナル伝達を活性化し、骨髄由来のサプレッサー細胞シグナル伝達、活性、及び/又は動員を阻害し、免疫抑制因子/代謝物を分解し、血管内皮成長因子シグナル伝達を阻害し、又は腫瘍細胞を直接的に殺傷する。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18,IL-1β、OX40リガンド、及びCD40Lから選択される少なくとも一つのキメラタンパク質;ならびに/あるいはチェックポイントインヒビターから選択される少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。遮断又は阻害のために標的化することができる例証的な免疫チェックポイント分子は、限定されないが、CTLA-4、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4(CD2ファミリーの分子に属し、全てのNK、γδT、及びメモリーCD8+(αβ)T細胞上で発現される)、CD160(また、BY55として言及される)、及びCGEN-15049を含む。免疫チェックポイントインヒビターは、CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160、及びCGEN-15049の一つ又は複数に結合して、その活性を遮断又は阻害する抗体、又はその抗原結合断片、又は他の結合タンパク質を含む。例示的なチェックポイントインヒビターは、限定されないが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体を含む。例証的な免疫チェックポイントインヒビターは、ペムブロリズマブ(抗PD-1;MK-3475/Keytruda(登録商標)-Merck)、ニボルマブ(抗PD-1;Opdivo(登録商標)-BMS)、ピディリズマブ(抗PD-1抗体;CT-011-Teva/CureTech)、AMP224(抗PD-1;NCI)、アベルマブ(抗PD-L1;Bavencio(登録商標)-Pfizer)、デュルバルマブ(抗PD-L1;MEDI4736/Imfinzi(登録商標)-Medimmune/AstraZeneca)、アテゾリズマブ(抗PD-L1);Tecentriq(登録商標)-Roche/Genentech)、BMS-936559(抗PD-L1-BMS)、トレメリムマブ(抗CTLA-4;Medimmune/AstraZeneca)、イピリムマブ(抗CTLA-4;Yervoy(登録商標)-BMS)、リリルマブ(抗KIR;BMS)、モナリズマブ(抗NKG2A;Innate Pharma/AstraZeneca)を含む。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IL-12、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40リガンド、及びCD40Lから選択される少なくとも一つのキメラタンパク質;ならびに/あるいは抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、及び抗IL-35抗体から選択される少なくとも一つのキメラタンパク質;ならびに/あるいはMIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)、及びCCL21から選択される少なくとも一つのキメラタンパク質;ならびに/あるいはCpGオリゴデオキシヌクレオチドから選択される少なくとも一つのキメラタンパク質;ならびに/あるいは微生物ペプチドから選択される少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-β、ならびにサイトカイン、抗体、ケモカイン、ヌクレオチド、ペプチド、酵素、及びインターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)から選択される少なくとも一つのキメラタンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及び少なくとも一つのサイトカイン又は受容体/リガンド(例、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-リガンド、及び/又はCD40L)を産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-β及び少なくとも一つのサイトカイン又は受容体/リガンド(例、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-7、IL-36γ、IL-18、IL-1β、OX40-リガンド、及び/又はCD40L)を産生するように操作される。
一部の実施形態では、サイトカインは、サイトカインと自己結合して、例えば抗体断片と融合されたIL-2などとの細胞特異的な標的化結合を誘導し、それがTreg細胞と結合することを防止し、CD8及びNK細胞と優先的に結合する、抗体、抗体断片、又は受容体を伴う、操作された融合タンパク質として産生される。一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-β及び少なくとも一つの抗体(例、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗VEGF、抗TGF-β、抗IL-10、抗TNF-α、及び/又は抗IL-35抗体)を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及び少なくとも一つのケモカイン(MIP1α(CCL3)、MIP1β(CCL5)、及び/又はCCL21)を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及び少なくとも一つのヌクレオチド(例、CpGオリゴデオキシヌクレオチド)を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及び少なくとも一つのペプチド(例、抗腫瘍ペプチド)を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及び少なくとも一つの酵素を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及び少なくとも一つのSTINGアクチベーターを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β、及び直接的な抗腫瘍活性を伴う少なくとも一つのエフェクター(例、腫瘍溶解性ウイルス)を産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-α及びMIP1-αを発現するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びMIP1-βを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びCXCL9を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びCXCL10を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びCXCL11を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びCCL21を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-β及びMIP1-αを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びMIP1-βを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びCXCL9を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びCXCL10を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びCXCL11を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びCCL21を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IL-12及びMIP1-αを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12及びMIP1-βを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12及びCXCL9を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12及びCXCL10を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12及びCXCL11を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12及びCCL21を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)及びMIP1-αを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びMIP1-βを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びCXCL9を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びCXCL10を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びCXCL11を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びCCL21を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)、及びMIP1-αを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びMIP1-βを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びCXCL9を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びCXCL10を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びCXCL11を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びCCL21を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CD40L及びMIP1-αを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びMIP1-βを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びCXCL9を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びCXCL10を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びCXCL11を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びCCL21を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、シトシンデアミナーゼ及びMIP1-αを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びMIP1-βを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びCXCL9を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びCXCL10を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びCXCL11を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びCCL21を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL36-γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-α及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-β及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、インターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CD40L及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、シトシンデアミナーゼ及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、MIP1-α及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及びMIP1-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、MIP1-β及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及びMIP1-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CXCL9及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CXCL10及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CXCL11及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CCL21及びIL-12を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及びIFN-γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及びIL-2を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及びIL-7を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及びIL-15を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及びIL-36γを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及びIL-18を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及びCD40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及び41BB-Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、抗CD40抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、及び/又はOX40Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-α及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCXCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-β及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-β及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCXCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、TRAIL及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、TRAIL及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCXCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、STING及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、STING及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCXCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CD40L及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCXCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、シトシンデアミナーゼ及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、シトシンデアミナーゼ及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCXCL21をさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、MIP1-α及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、MIP1-β及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-β及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CXCL9及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL9及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CXCL10及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL10及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CXCL11及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CXCL11及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CCL21及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CCL21及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-36γ、IL-18、CD40L、及び/又は41BB-Lをさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IL-12及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-12及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IFN-γ及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-γ及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-γ及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-γ及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IL-2及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-2及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-2及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-2及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IL-7及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-7及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-7及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-7及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IL-15及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-15及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-15及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-15及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IL-36-γ及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-36-γ及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-36-γ及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-36-γ及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、IL-18及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-18及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-18及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IL-18及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、CD40L及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、CD40L及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。
一部の実施形態では、細胞(例、免疫細胞又は幹細胞)は、41BB-L及び抗PD-L1抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、41BB-L及びOX40Lを産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、41BB-L及び抗CTLA4抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、41BB-L及び抗CD47抗体を産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、IFN-α、IFN-β、TRAIL、STING、CD40L、及び/又はシトシンデアミナーゼをさらに産生するように操作される。一部の実施形態では、細胞は、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及び/又はCCL21をさらに産生するように操作される。
細胞はまた、本明細書中に記載されるキメラタンパク質(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質)、目的のタンパク質、又はエフェクター分子に加えて、追加のタンパク質を発現するようにさらに操作することができる。細胞をさらに操作して、抗原認識受容体を発現させることができる。抗原認識受容体の例は、限定されないが、5T4、ADAM9、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、カドヘリン3、カドヘリン6、CCR4、CD123、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD30、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CEA、CEACAM5、クローディン18.2、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、ENPP3、EpCAM、EphA2、エフリンA4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRアルファ、FRb、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、インテグリンaV、KIT、L1CAM、LAMP1、ルイスY、LeY、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、メソテリン、MUC1、MUC16、MUC1C、NaPi2B、ネクチン4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、オバリン、Pカドヘリン、pan-Erb2、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLITRK6、SSTR2、STEAP1、サバイビン、TDGF1、TIM1、TROP2、及びWT1を含む。
抗原認識受容体は、抗原結合ドメイン、例えば、抗体、抗体の抗原結合断片、F(ab)断片、F(ab’)断片、一本鎖可変断片(scFv)、又は単一ドメイン抗体(sdAb)を含み得る。抗原認識受容体は、scFvを含み得る。scFvは、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含み得るが、それらは、ペプチドリンカーにより分離され得る。例えば、scFvは、構造VH-L-VL又はVL-L-VHを含み得るが、それにおいて、VHは重鎖可変ドメインであり、Lはペプチドリンカーであり、かつVLは軽鎖可変ドメインである。
抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体(CAR)であり得る。CARは、一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ゼータ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、CD97細胞内シグナル伝達ドメイン、CD11a-CD18細胞内シグナル伝達ドメイン、CD2細胞内シグナル伝達ドメイン、ICOS細胞内シグナル伝達ドメイン、CD27細胞内シグナル伝達ドメイン、CD154細胞内シグナル伝達ドメイン、CD8細胞内シグナル伝達ドメイン、OX40細胞内シグナル伝達ドメイン、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD28細胞内シグナル伝達ドメイン、ZAP40細胞内シグナル伝達ドメイン、CD30細胞内シグナル伝達ドメイン、GITR細胞内シグナル伝達ドメイン、HVEM細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP10細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP12細胞内シグナル伝達ドメイン、MyD88細胞内シグナル伝達ドメイン、それらの断片、それらの組み合わせ、又はそれらの断片の組み合わせなどを有し得る。CARは、膜貫通ドメイン、例えばCD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、OX40膜貫通ドメイン、ICOS膜貫通ドメイン、CTLA-4膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、LAG-3膜貫通ドメイン、2B4膜貫通ドメイン、BTLA膜貫通ドメイン、それらの断片、それらの組み合わせ、又はそれらの断片の組み合わせなどを有し得る。CARは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサー領域を有することができる。
抗原認識受容体は、T細胞受容体(TCR)であり得る。
操作された細胞型
また、本明細書中で提供されるのは、操作された細胞である。細胞は、本明細書中に記載される操作された核酸のいずれか(例、本明細書中に記載されるキメラタンパク質をコードする操作された核酸のいずれか)を含むように操作することができる。細胞は、本明細書中に記載される操作された細胞のいずれかの特色のいずれかを持つように操作され得る。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、一つ又は複数のキメラタンパク質を産生するように操作された細胞であって、それにおいて、一つ又は複数のキメラタンパク質は、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、二つ以上のキメラタンパク質を産生するように操作された細胞である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の二つ以上を産生するように操作された細胞であり、ここで、各キメラタンパク質は、異なる目的のタンパク質又はエフェクター分子である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質のいずれかを産生するように操作され、異なるエフェクター分子又は目的のタンパク質(例、ホーミング分子、抗原受容体など)を別々に産生するように操作された細胞である。
また、本明細書中で提供されるのは、操作された細胞である。細胞は、本明細書中に記載される操作された核酸のいずれか(例、本明細書中に記載されるキメラタンパク質をコードする操作された核酸のいずれか)を含むように操作することができる。細胞は、本明細書中に記載される操作された細胞のいずれかの特色のいずれかを持つように操作され得る。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、一つ又は複数のキメラタンパク質を産生するように操作された細胞であって、それにおいて、一つ又は複数のキメラタンパク質は、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、二つ以上のキメラタンパク質を産生するように操作された細胞である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の二つ以上を産生するように操作された細胞であり、ここで、各キメラタンパク質は、異なる目的のタンパク質又はエフェクター分子である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質のいずれかを産生するように操作され、異なるエフェクター分子又は目的のタンパク質(例、ホーミング分子、抗原受容体など)を別々に産生するように操作された細胞である。
操作された細胞は、限定されないが、T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマデルタ(γδ)T細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、調節性T細胞、ウイルス特異的T細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、又は樹状細胞を含む、免疫細胞であり得る。
操作された細胞は、限定されないが、ヒト胚性幹細胞(ESC)、ESC由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞(MSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、又はiPSC由来細胞を含む、幹細胞であり得る。
操作された細胞は、腫瘍由来細胞であり得る。腫瘍細胞の例は、限定されないが、膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、子宮頸部腫瘍細胞、結腸直腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、神経膠腫細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、及び子宮腫瘍細胞を含む。
細胞を操作して、当業者に公知の方法を使用してキメラタンパク質を産生することができる。例えば、細胞を形質導入して腫瘍を操作することができる。一実施形態では、細胞は、ウイルスを使用して形質導入される。
特定の実施形態では、細胞は、腫瘍溶解性ウイルスを使用して形質導入される。腫瘍溶解性ウイルスの例は、限定されないが、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアント又は誘導体を含む。
ウイルスは、本明細書中に記載される腫瘍溶解性ウイルスのいずれかを含み、一つ又は複数のキメラタンパク質、例えば本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかなどをコードするもう一つの導入遺伝子をコードする組換えウイルスであり得る。ウイルスは、本明細書中に記載される腫瘍溶解性ウイルスのいずれかを含み、二つ以上のキメラタンパク質、例えば本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかなどの一つ又は複数をコードするもう一つの導入遺伝子をコードする組換えウイルスであり得る。
また、本明細書中で提供されるのは、操作された赤血球である。赤血球は、本明細書中に記載される操作された核酸のいずれかを含むように操作され得る。赤血球は、本明細書中に記載される操作された細胞のいずれかの特徴のいずれかを持つように操作され得る。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の一つ又は複数を産生するように操作された赤血球である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の二つ以上を産生するように操作された赤血球である。
また、本明細書中で提供されるのは、操作された血小板細胞である。血小板細胞は、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかを含むように操作することができる。血小板細胞は、本明細書中に記載される、操作された細胞のいずれかの特徴のいずれかを持つように操作することができる。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の一つ又は複数を産生するように操作された血小板細胞である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の二つ以上を産生するように操作された血小板細胞である。
また、本明細書中で提供されるのは、操作された細菌細胞である。細菌細胞は、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかを含むように操作することができる。細菌細胞は、本明細書中に記載される、操作された細胞のいずれかの特徴のいずれかを持つように操作することができる。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の二つ以上を産生するように操作された細菌細胞である。細菌細胞は、一つ又は複数の哺乳動物由来のキメラタンパク質を産生するように操作することができる。細菌細胞は、二つ以上の哺乳動物由来のキメラタンパク質を産生するように操作することができる。細菌細胞の例は、限定されないが、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・スポロジェネス、クロストリジウム・ノヴィ、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・エルジノーサ、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・チフィリウム、及びサルモネラ・コレラエスイスを含む。
操作された細胞は、ヒト細胞であり得る。操作された細胞は、ヒト初代細胞であり得る。操作された初代細胞は、腫瘍浸潤性初代細胞であり得る。操作された初代細胞は、初代T細胞であり得る。操作された初代細胞は、造血幹細胞(HSC)であり得る。操作された初代細胞は、ナチュラルキラー細胞であり得る。操作された初代細胞は、任意の体細胞であり得る。操作された初代細胞は、MSCであり得る。ヒト細胞(例、免疫細胞)は、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかを含むように操作することができる。ヒト細胞(例、免疫細胞)は、本明細書中に記載される、操作された細胞のいずれかの特徴のいずれかを持つように操作することができる。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の一つ又は複数を産生するように操作されたヒト細胞(例、免疫細胞)である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の二つ以上を産生するように操作されたヒト細胞(例、免疫細胞)である。
操作された細胞は、対象(自己)、例えば、癌を有することが公知である、又は疑われる対象などから単離することができる。細胞単離方法は当業者に公知であり、限定されないが、細胞表面マーカー発現に基づくソーティング技術、例えば、FACSソーティング、ポジティブ単離技術、及びネガティブ単離、磁気単離、ならびにそれらの組み合わせを含む。操作された細胞は、治療が施されている対象に関して同種であり得る。同種改変細胞は、治療が施されている対象にHLA適合させることができる。操作された細胞は、培養細胞、例えばエクスビボ培養細胞などであり得る。操作された細胞は、エクスビボ培養細胞、例えば対象から単離された初代細胞などであり得る。培養細胞は、一つ又は複数のサイトカインと培養することができる。
また、本明細書中で提供されるのは、本開示の操作された細胞を培養することを含む方法である。本明細書中に記載される、操作された細胞を培養する方法は、公知である。当業者は、培養条件が、目的の特定の操作された細胞に依存することを認識するであろう。当業者は、培養条件が、操作された細胞の特定の下流の使用、例えば、対象への、操作された細胞のその後の投与のための特定の培養条件に依存することを認識するであろう。
細胞を操作する方法
また、本明細書中で提供されるのは、一つ又は複数の目的のタンパク質又はエフェクター分子(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質)を産生するために細胞を操作するための組成物及び方法である。
また、本明細書中で提供されるのは、一つ又は複数の目的のタンパク質又はエフェクター分子(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質)を産生するために細胞を操作するための組成物及び方法である。
一般的に、細胞は、細胞のサイトゾル及び/又は核中への、一つ又は複数の目的のタンパク質又はエフェクター分子、例えば、目的のタンパク質又はエフェクター分子を有する、本明細書中に記載されているキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入(即ち、送達)を通じて、目的のタンパク質又はエフェクター分子を産生するように操作される。例えば、一つ又は複数のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質をコードする操作された核酸のいずれかであることができる。送達方法は、限定されないが、ウイルス媒介性送達、脂質媒介性トランスフェクション、ナノ粒子送達、エレクトロポレーション、超音波処理、及び物理的手段による細胞膜変形を含む。当業者は、送達方法の選択が、操作しようとする特定の細胞型に依存し得ることを理解するであろう。
ウイルス媒介性送達
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームを使用して、細胞を操作することができる。一般的に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームによって、宿主細胞中へ導入する(即ち、送達する)ことを通じて細胞が操作される。例えば、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、本明細書中に記載される操作された核酸のいずれか(例、本明細書中に記載されるキメラタンパク質、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などをコードする外因性ポリヌクレオチド配列のいずれか、ならびに/あるいは、N末端からC末端に配向された、プロモーターとキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む、本明細書中に記載される発現カセットのいずれか)を導入することにより細胞を操作することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは核酸であり得るが、そのようなものとして、操作された核酸はまた、操作されたウイルス由来の核酸を包含し得る。そのような操作されたウイルス由来の核酸はまた、組換えウイルス又は操作されたウイルスとして言及され得る。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームを使用して、細胞を操作することができる。一般的に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームによって、宿主細胞中へ導入する(即ち、送達する)ことを通じて細胞が操作される。例えば、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、本明細書中に記載される操作された核酸のいずれか(例、本明細書中に記載されるキメラタンパク質、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質又は本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などをコードする外因性ポリヌクレオチド配列のいずれか、ならびに/あるいは、N末端からC末端に配向された、プロモーターとキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む、本明細書中に記載される発現カセットのいずれか)を導入することにより細胞を操作することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは核酸であり得るが、そのようなものとして、操作された核酸はまた、操作されたウイルス由来の核酸を包含し得る。そのような操作されたウイルス由来の核酸はまた、組換えウイルス又は操作されたウイルスとして言及され得る。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、同じ核酸内に二つ以上の操作された核酸、遺伝子、又は導入遺伝子をコードし得る。例えば、操作されたウイルス由来の核酸、例えば、組換えウイルス又は操作されたウイルスは、限定されないが、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の一つ又は複数をコードする本明細書中に記載される操作された核酸のいずれかを含む、一つ又は複数の導入遺伝子をコードし得る。一つ又は複数のキメラタンパク質をコードする一つ又は複数の導入遺伝子は、一つ又は複数のキメラタンパク質及び/又は目的の他のタンパク質を発現するように構成され得る。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、一つ又は複数の導入遺伝子(例、一つ又は複数のキメラタンパク質及び/又は他の目的のタンパク質をコードする導入遺伝子)に加えて、シス作用性エレメント又は遺伝子として言及される、一つ又は複数の遺伝子、例えば、ウイルス感染性及び/又はウイルス産生のために必要とされるウイルス遺伝子(例、キャプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、ウイルス転写酵素など)をコードすることができる。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、二つ以上のウイルスベクター、例えば、本明細書中に記載され、トランス作用性エレメント又は遺伝子として言及される、操作された核酸、遺伝子、又は導入遺伝子をコードする別々のウイルスベクターなどを含むことができる。例えば、ヘルパー依存的ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、一つ又は複数のキメラタンパク質及び/又は他の目的のタンパク質をコードするベクターに加えて、一つ又は複数の追加の別々のベクター上にウイルス感染性及び/又はウイルス産生のために必要とされる追加の遺伝子を提供することができる。一つのウイルスベクターによって、二つ以上の操作された核酸を送達することができ、例えば、二つ以上のキメラタンパク質及び/又は他の目的のタンパク質を産生するように構成された、操作された核酸を送達する一つのベクターなどである。二つ以上のウイルスベクターによって、二つ以上の操作された核酸を送達することができ、例えば、一つ又は複数のキメラタンパク質及び/又は他の目的のタンパク質を産生するように構成された一つ又は複数の操作された核酸を送達する二つ以上のベクターなどである。使用されるウイルスベクターの数は、上で言及されるウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング容量に依存し得るが、当業者は、適した数のウイルスベクターを選択することができる。
一般的に、ウイルスベクターベースの系のいずれかは、分子、例えば、本明細書中に記載されるキメラタンパク質、エフェクター分子、及び/又は他の目的のタンパク質などのインビトロ生産のために使用することができる、あるいは、例えば、一つ又は複数のキメラタンパク質及び/又は他の目的のタンパク質をコードする操作された核酸のインビボ送達のために、インビボ及びエクスビボ遺伝子治療手順において使用することができる。適したウイルスベクターベースの系の選択は、様々な要因、例えばカーゴ/ペイロードのサイズ、ウイルス系の免疫原性、目的の標的細胞、遺伝子発現の強度及びタイミング、及び当業者により認識される他の要因などに依存する。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、RNAベースのウイルス又はDNAベースのウイルスであり得る。例示的なウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、限定されないが、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、インディアナベシクロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ムンプスウイルス、マラバウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肝炎ウイルス、風疹ウイルス、デングウイルス、チクングニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、モルビリウイルス、レンチウイルス、複製レトロウイルス、ラブドウイルス、セネカバレーウイルス、シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアント又は誘導体を含む。他の例示的なウイルスベクターベースの送達プラットフォームが、当技術分野において記載されており、例えばワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス(例、Tatsis et al.,Adenoviruses,Molecular Therapy(2004)10,616-629を参照のこと)、又はレンチウイルスなどであり、限定されないが、特定の細胞型又は受容体を標的化するように設計された第二、第三又はハイブリッド第二/第三世代レンチウイルス及び任意の世代の組換えレンチウイルスを含む(例、Hu et al.,ImmunizationDelivered by Lentiviral Vectors for Cancer and InfectiousDiseases,Immunol Rev.(2011)239(1):45-61、Sakuman et al.,Lentiviral vectors:basic to translational,Biochem J.(2012)443(3):603-18、Cooper et al.,Rescue of splicing-mediated intron lossMaximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl.Acids Res.(2015)43(1):682-690、Zufferey et al.,Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In vivo GeneDelivery,J.Virol.(1998)72(12):9873-9880を参照のこと)。
この配列は、細胞内コンパートメントを標的化する一つ又は複数の配列で先行されてもよい。宿主細胞中への導入(即ち、送達)時に、感染細胞(即ち、操作された細胞)は、目的のキメラタンパク質及び/又は他のタンパク質を発現することができる。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法が、例えば、米国特許第4,722,848号において記載されている。別のベクターはBCG(Bacille Calmette Guerin)である。BCGベクターは、Stover et al.(Nature 351:456-460(1991))において記載されている。操作された核酸の導入(即ち、送達)のために有用な多種多様な他のベクター、例えば、サルモネラ・チフィベクター、及び同様のものが、本明細書中の記載から当業者に明らかであろう。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、細胞を標的化するウイルスであり得るが、本明細書中では腫瘍溶解性ウイルスとして言及される。腫瘍溶解性ウイルスの例は、限定されないが、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアント又は誘導体を含む。本明細書中に記載される腫瘍溶解性ウイルスのいずれも、目的の一つ又は複数のキメラタンパク質及び/又は他のタンパク質をコードする一つのさらなる導入遺伝子(例、操作された核酸)を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスであり得る。目的の一つ又は複数のキメラタンパク質及び/又は他のタンパク質をコードする導入遺伝子は、目的のキメラタンパク質及び/又は他のタンパク質を発現するように構成され得る。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、レトロウイルスベースであり得る。一般的に、レトロウイルスベクターは、6~10kbまでの外来配列についてのパッケージング能力を伴う、シス作用性の長い末端反復で構成されている。最小のシス作用性LTRは、ベクターの複製及びパッケージングのために十分であり、それは次に、一つ又は複数の操作された核酸(例、一つ又は複数のキメラタンパク質及び/又は他の目的のタンパク質をコードする導入遺伝子)を標的細胞中に組み込んで、永続的な導入遺伝子の発現を提供するために使用される。レトロウイルスベースの送達系は、限定されないが、マウス白血病、ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、及びそれらの組み合わせに基づく送達系を含む(例、Buchscher et al.,J.Virol.66:2731-2739(1992);Johann et ah,J.Virol.66:1635-1640(1992);Sommnerfelt et al.,Virol.176:58-59(1990);Wilson et ah,J.Virol.63:2374-2378(1989);Miller et al,J,Virol.65:2220-2224(1991);PCT/US94/05700を参照のこと)。他のレトロウイルス系は、Phoenixレトロウイルス系を含む。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、レンチウイルスベースであり得る。一般的に、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入させる又は感染させることができ、典型的には、高いウイルス力価を産生するレトロウイルスベクターである。レンチウイルスベースの送達プラットフォームは、HIVベース、例えばViraPower系(ThermoFisher)又はpLenti系(Cell Biolabs)などであり得る。レンチウイルスベースの送達プラットフォームは、SIV又はFIVベースであり得る。他の例示的なレンチウイルスベースの送達プラットフォームが、米国特許第7,311,907号;第7,262,049号;第7,250,299号;第7,226,780号;第7,220,578号;第7,211,247号;第7,160,721号;第7,078,031号;第7,070,993号;第7,056,699号;第6,955,919号においてさらに詳細に記載されており、各々が、参照により全ての目的のために本明細書中に組み入れられる。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、アデノウイルスベースであり得る。一般的に、アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要求せず、高い力価及び発現のレベルを達成し、比較的単純な系において大量に産生することができる。一般的に、アデノウイルスは、感染細胞内での導入遺伝子の一過性発現のために使用することができる。なぜなら、アデノウイルスは、典型的には、宿主のゲノム中に組み込まれないためである。アデノウイルスベースの送達プラットフォームが、Li et al.,Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549,1994;Borras et al.,Gene Ther 6:515 524,1999;Li andDavidson,PNAS 92:7700 7704,1995;Sakamoto et al.,H Gene Ther 5:1088 1097,1999;WO94/12649、WO93/03769;WO93/19191;WO94/28938;WO95/11984及びWO95/00655においてより詳細に記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。他の例示的なアデノウイルスベースの送達プラットフォームが、米国特許第5585362号;第6,083,716号、第7,371,570号;第7,348,178号;第7,323,177号;第7,319,033号;第7,318,919号;及び第7,306,793号ならびに国際特許出願WO96/13597においてより詳細に記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベースであり得る。アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用して、操作された核酸(例、本明細書中に記載される操作された核酸のいずれか)で細胞を形質導入してもよい。AAV系は、目的のタンパク質、例えば本明細書中に記載されるキメラタンパク質及び/又はエフェクター分子などのインビトロ産生のために使用することができ、あるいは、例えば、一つ又は複数のキメラタンパク質及び/又は他の目的のタンパク質をコードする操作された核酸のインビボ送達のために、インビボ及びエクスビボ遺伝子治療手順において使用することができる(例、West et al.,Virology 160:38-47(1987);米国特許第4,797,368号;第5,436,146号;第6,632,670号;第6,642,051号;第7,078,387号;第7,314,912号;第6,498,244号;第7,906,111号;米国特許公開US2003-0138772、US 2007/0036760、及びUS 2009/0197338;Gao,et al.,J.Virol,78(12):6381-6388(2004年6月);Gao,et al,Proc Natl Acad Sci USA,100(10):6081-6086(2003年5月13日);ならびに国際特許出願WO2010/138263及びWO93/24641;Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994);Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)、各々が、全ての目的のために、参照により本明細書中に組み入れられる)。組換えAAVベクターを構築するための例示的な方法が、米国特許第5,173,414号;Tratschin et ah,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985);Tratschin,et ah,Mol.Cell,Biol.4:2072-2081(1984);Hermonat &amp;Muzyczka,PNAS 81:64666470(1984);及びSamuiski et ah,J.Virol.63:03822-3828(1989)においてさらに詳細に記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。一般的に、AAVベースのベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11及びそれらのバリアントのいずれか一つに対応するアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。特定の例では、AAVベースのベクターは、AAV2に対応するアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を有する。特定の例では、AAVベースのベクターは、AAV8に対応するアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を有する。
AAVベクターは、式:S-C-MT-Dを有する、本明細書中に記載される膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列のいずれかを有するように操作することができる。
AAVベクターは、異種核酸を発現するように操作することができ、それにおいて、異種核酸は、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質のいずれかをコードする。デグロン融合キメラタンパク質中の目的のタンパク質は、分泌性であることができる。デグロン融合キメラタンパク質中の目的のタンパク質は、非分泌性であることができる。デグロンドメインは、本明細書中の他でより詳細に記載されるデグロンドメインのいずれか、例えば、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより目的のタンパク質のユビキチン経路媒介性分解を促進する、セレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインなどであることができる。CRBNポリペプチド基質ドメインは、本明細書中の他でより詳細に記載されているCRBNポリペプチド基質ドメインのいずれかであることができ、例えばIKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827など、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能であるその断片であり得る。CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物、例えばFNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物などであり得る。調節された分解は、薬物誘導性であり得る。分解を媒介/調節することが可能な薬物は、小分子インヒビターであり得る。分解を媒介/調節することが可能な薬物は、本明細書中の他でより詳細に記載されるように、IMiDを含み得る。CRBNポリペプチド基質ドメインを有するデグロンについては、イミド含有IMiDの例は、限定されないが、サリドマイド、レナリドミド、又はポマリドミドを含む。IMiDは、FDA承認薬物であり得る。融合タンパク質中のデグロンの他の例は、限定されないが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスを含む。融合タンパク質中の目的のタンパク質の例は、限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、又は酵素を含む治療クラスから選択されるタンパク質であることができる。
本明細書中に記載されるのは、異種核酸を発現するように操作されたAAVであって、それにおいて、異種核酸は、デグロン融合キメラタンパク質をコードし、それにおいて、デグロン融合キメラタンパク質は、目的のタンパク質に融合されたデグロンを含む。例えば、デグロン融合キメラタンパク質(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラのいずれか)を発現するように操作されたAAVは、本明細書中に記載されるAAVベクターのいずれかを使用して産生することができる。AAVベクター及び/又は操作されたAAVウイルスは、医薬的に許容可能な担体と組み合わせることができる。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ウイルス様粒子(VLP)プラットフォームであり得る。一般的に、VLPは、ウイルス構造タンパク質を産生し、結果として得られたウイルス粒子を精製することにより構築される。次に、精製後、カーゴ/ペイロード(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)を、精製した粒子内にエクスビボでカプセル化する。したがって、VLPの産生によって、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸及びカーゴ/ペイロードをコードする核酸の分離が維持される。VLP産生において使用されるウイルス構造タンパク質は、哺乳動物、酵母、昆虫、細菌、又はインビボ翻訳発現の系を含む、様々な発現系において産生することができる。精製されたウイルス粒子を、当業者に公知の方法を使用して、所望のカーゴの存在において変性及び再形成して、VLPを産生することができる。VLPの産生は、Seow et al.(Mol Ther.2009May;17(5):767-777)においてより詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、ある範囲の細胞を標的化する(即ち、感染させる)、狭いサブセットの細胞を標的化する、又は特定の細胞を標的化するように操作することができる。一般的に、ウイルスベクターベースの送達プラットフォーム用に選ばれたエンベロープタンパク質によって、ウイルスの向性が決定される。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームにおいて使用されるウイルスは、目的の特定の細胞を標的化するようにシュードタイプ化することができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、汎親和性であり、ある範囲の細胞に感染することができる。例えば、汎親和性ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、VSV-Gエンベロープを含むことができる。ウイルスベクターベースの送達プラットフォームは、両種指向性であり、哺乳動物細胞に感染することができる。したがって、当業者は、所望の細胞型を標的化するための適した向性、シュードタイプ、及び/又はエンベロープタンパク質を選択することができる。
脂質構造体送達系
操作された核酸(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)は、脂質媒介性送達系を使用して細胞中に導入することができる。一般的に、脂質媒介性送達系は、内部コンパートメントを包む外部脂質膜で構成される構造を使用する。脂質ベースの構造体の例は、限定されないが、脂質ベースのナノ粒子、リポソーム、ミセル、エキソソーム、小胞、細胞外小胞、細胞、又は組織を含む。脂質構造体送達系は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで、カーゴ/ペイロード(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)を送達することができる。
操作された核酸(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)は、脂質媒介性送達系を使用して細胞中に導入することができる。一般的に、脂質媒介性送達系は、内部コンパートメントを包む外部脂質膜で構成される構造を使用する。脂質ベースの構造体の例は、限定されないが、脂質ベースのナノ粒子、リポソーム、ミセル、エキソソーム、小胞、細胞外小胞、細胞、又は組織を含む。脂質構造体送達系は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで、カーゴ/ペイロード(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)を送達することができる。
脂質ベースのナノ粒子は、限定されないが、単層リポソーム、多層リポソーム、及び脂質調製物を含むことができる。本明細書中で使用されるように、「リポソーム」は、所望のカーゴ、例えば、操作された核酸、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかなどを、脂質シェル又は脂質凝集体内に封入することにより形成される脂質媒体のインビトロ調製物を包含する一般名である。リポソームは、一般的にリン脂質を含む二分子膜を伴う小胞構造、及び一般的に水性組成物を含む内部媒質を有するとして特徴付けられ得る。リポソームは、限定されないが、エマルジョン、発泡体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、層状層及び同様のものを含む。リポソームは単層リポソームであり得る。リポソームは多層リポソームであり得る。リポソームは多胞性リポソームであり得る。リポソームは、正に荷電し得る、負に荷電し得る、又は中性に荷電し得る。特定の実施形態では、リポソームは中性に荷電している。リポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成することができ、それは、一般的に、中性及び負に荷電したリン脂質ならびにステロール、例えばコレステロールなどを含む。脂質の選択は、一般的に、所望の目的、例えば、インビボ送達についての基準、例えばリポソームのサイズ、酸の不安定性、及び血流中でのリポソームの安定性などの考慮により導かれる。多様な方法が、リポソームを調製するために利用可能であり、例えば、Szokan et al.,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9;467(1980)、米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,501,728号、第4,837,028号、及び第5,019,369号において記載されているとおりであり、各々が、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
多重層リポソームが、一般的に、リン脂質を含む脂質を過剰の水溶液中に懸濁した場合に自発的に生成されて、複数の脂質層が水性媒質により分離されるようになる。水及び溶解された溶質は、脂質成分の自己再構成後に、脂質二重層の間の閉じた構造中に封入される。所望のカーゴ(例、ポリペプチド、核酸、小分子薬、操作された核酸、例えば、本明細書中に記載される操作された核酸のいずれかなど、ウイルスベクター、ウイルスベースの送達系など)を、リポソームの水性内部中にカプセル化するか、リポソーム及びポリペプチド/核酸の両方に会合する連結分子を介してリポソームに付着させるか、リポソームの脂質二重層内に散在させるか、リポソーム中に封入するか、リポソームと複合体を形成させるか、又は、そうでなければ、リポソームと会合させることができ、それを標的実体に送達できるようにする。親油性分子又は親油性領域を伴う分子がまた、脂質二重層中に溶解し得る又はそれと会合し得る。
本実施形態に従って使用されるリポソームは、当業者に公知であり得るように、異なる方法により作製することができる。リポソームの調製は、WO2016/201323、国際出願PCT/US85/01161及びPCT/US89/05040、ならびに米国特許4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505、及び4,921,706においてさらに詳細に記載されており;各々が、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
リポソームはカチオン性リポソームであり得る。カチオン性リポソームの例は、米国特許第5,962,016号;第5,030,453号;第6,680,068号、米国出願2004/0208921、ならびに国際特許出願WO03/015757A1、WO04029213A2、及びWO02/100435A1においてさらに詳細に記載されており、各々が、それらの全体において、参照により本明細書により組み入れられる。
脂質媒介性遺伝子送達方法は、例えば、WO96/18372;WO93/24640;Mannino &Gould-Fogerite,BioTechniques 6(7):682-691(1988);米国特許第5,279,833号 Rose 米国特許第5,279,833号;WO91/06309;及びFelgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7414(1987)において記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
エキソソームは、エンドサイトーシス起源の小さな膜小胞であり、それは、多小胞体と原形質膜との融合後に細胞外環境中に放出される。エキソソームのサイズは、直径30~100nmの間の範囲である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二重層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含み、表面上に親細胞からの膜タンパク質を示す。核酸の送達のために有用なエキソソームは、当業者に公知であり、例えば、米国特許第9,889,210号においてより詳細に記載されているエキソソームであり、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
本明細書中で使用されるように、用語「細胞外小胞」又は「EV」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞を指す。一般的に、細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さな直径を有する全ての膜結合小胞を含む。一般的に、細胞外小胞は、直径20nm~1000nmの範囲であり、細胞外小胞の外面上に呈される内部空間内で、及び/又は膜にわたるかのいずれかの、様々な高分子カーゴを含み得る。カーゴは、核酸(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び/又はそれらの組み合わせを含み得る。例として、限定されないが、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接又は間接操作(例、連続的な押し出し又はアルカリ溶液での処理による)による細胞から由来する小胞、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞(例、直接的な原形質膜の出芽又は後期エンドソームと原形質膜との融合による)を含む。細胞外小胞は、生存生物又は死滅生物、外植された組織もしくは器官、及び/又は培養細胞に由来し得る。
本明細書中で使用されるように、用語「エキソソーム」は、内部空間を取り囲む膜を含み、直接的な原形質膜の出芽又は後期エンドソームと原形質膜との融合により細胞から生成される細胞由来の小さな(直径20~300nm、より好ましくは直径40~200nmの)小胞を指す。エキソソームは、脂質又は脂肪酸及びポリペプチドを含み、場合により、ペイロード(例、治療薬剤)、レシーバ(例、標的化部分)、ポリヌクレオチド(例、核酸、RNA、又はDNA、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかなど)、糖(例、単糖、多糖、又はグリカン)、又は他の分子を含む。エキソソームは、産生細胞から由来し、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、又はそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離することができる。エキソソームは、細胞外小胞の一種である。一般的に、エキソソーム産生/生合成は、産生細胞の破壊をもたらさない。エキソソーム及びエキソソームの調製は、WO2016/201323においてさらに詳細に記載されており、それは、その全体において参照により本明細書により組み入れられる。
本明細書中で使用されるように、用語「ナノ小胞」(また、「マイクロ小胞」として言及される)は、内部空間を取り囲む膜を含み、直接又は間接操作により細胞から生成される、細胞由来の小さな(直径20~250nm、より好ましくは直径30~150nmの間の)小胞を指し、当該ナノ小胞は、当該操作を伴うことなく、当該産生細胞により産生されないようにする。一般的に、ナノ小胞は、細胞外小胞の亜種である。産生細胞の適した操作は、限定されないが、連続押出し、アルカリ性溶液での処理、超音波処理、又はそれらの組み合わせを含む。ナノ小胞の産生は、一部の例では、当該産生細胞の破壊をもたらし得る。好ましくは、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽又は後期エンドソームと原形質膜との融合により産生細胞から由来する小胞を実質的に含まない。ナノ小胞は、脂質又は脂肪酸及びポリペプチドを含み、場合により、ペイロード(例、治療薬剤)、レシーバ(例、標的化部分)、ポリヌクレオチド(例、核酸、RNA、又はDNA、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかなど)、糖(例、単糖、多糖、又はグリカン)、又は他の分子を含む。ナノ小胞は、一度、それが当該操作に従って産生細胞から誘導されると、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、又はそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。
脂質ナノ粒子(LNP)は、一般的に、脂質の両親媒性の性質に依存して膜及び小胞様の構造を形成する合成脂質構造である(Riley 2017)。一般的に、これらの小胞は、標的細胞の膜中に吸収され、カーゴをサイトゾル中に放出することにより、カーゴ/ペイロード、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸又はウイルス系のいずれかなどを送達する。LNP形成において使用される脂質は、カチオン性、アニオン性、又は中性であり得る。脂質は、合成又は天然由来、一部の例では生分解性であり得る。脂質は、脂肪、コレステロール、リン脂質、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)コンジュゲート(PEG化脂質)を含む脂質コンジュゲート、ワックス、油、グリセリド、及び脂溶性ビタミンを含み得る。脂質組成物は、一般的に、材料の定義された混合物、例えばカチオン性、中性、アニオン性、及び両親媒性脂質などを含む。一部の例では、特定の脂質を含めて、LNP凝集を防止する、脂質酸化を防止する、又は追加部分の付着を促進する機能的な化学基を提供する。脂質組成は、全体的なLNPサイズ及び安定性に影響し得る。一例では、脂質組成物は、ジリノレイルメチル-4-ジメチルアミノブチレート(MC3)又はMC3様分子を含む。MC3及びMC3様脂質組成物は、一つ又は複数の他の脂質、例えばPEG又はPEGコンジュゲート脂質、ステロール、又は中性脂質などを含むように製剤化することができる。また、LNPをさらに操作又は機能化して、特定の細胞型の標的化を促進することができる。LNP設計における別の考慮事項は、標的化効率と細胞傷害性のバランスである。
ミセルは、一般的に、単鎖脂質を使用して形成される球状の合成脂質構造であり、ここで、単鎖脂質の親水性の頭部が外層又は膜を形成し、単鎖脂質の疎水性の尾部がミセル中心を形成する。ミセルは、典型的には、脂質単層のみを含む脂質構造を指す。ミセルは、Quader et al.(Mol Ther.2017 Jul 5;25(7):1501-1513)においてさらに詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
核酸ベクター、例えば、血清に直接曝露された発現ベクターなどは、血清ヌクレアーゼによる核酸の分解又は遊離核酸による免疫系のオフターゲット刺激を含む、いくつかの望ましくない結果を有し得る。同様に、血清に直接曝露されたウイルス送達系は、望ましくない免疫応答及び/又はウイルス送達系の中和を誘発し得る。従って、操作された核酸及び/又はウイルス送達系のカプセル化を使用して、分解を回避する一方で、また、潜在的なオフターゲットの影響を回避することができる。特定の例では、操作された核酸及び/又はウイルス送達系は、送達媒体内、例えばLNPの水性内部内に完全にカプセル化される。LNP内での操作された核酸及び/又はウイルス送達系のカプセル化は、当業者に周知の技術、例えば、マイクロ流体混合及びマイクロ流体液滴生成デバイス上で行われる液滴生成などにより行うことができる。そのようなデバイスは、限定されないが、標準的なTジャンクションデバイス又はフローフォーカシングデバイスを含む。一例では、所望の脂質製剤、例えばMC3又はMC3様含有組成物が、操作された核酸又はウイルス送達系及び任意の他の所望の薬剤と並行して液滴生成デバイスに提供され、送達ベクター及び所望の薬剤を、MC3又はMC3様ベースのLNPの内部内に完全にカプセル化するようにする。一例では、液滴生成デバイスは、産生されるLNPのサイズ範囲及びサイズ分布を制御することができる。例えば、LNPは、直径1~1000ナノメートルの範囲のサイズ、例えば、1、10、50、100、500、又は1000ナノメートルを有し得る。液滴生成に続いて、カーゴ/ペイロードをカプセル化する送達媒体(例、操作された核酸及び/又はウイルス送達系)をさらに処理又は操作して、投与用にそれらを調製することができる。
ナノ粒子送達
ナノ材料を使用して、操作された核酸(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)を送達することができる。ナノ材料媒体は、重要なことに、非免疫原性材料で作ることができ、一般的に、その送達ベクター自体に対する免疫を誘発することを回避することができる。これらの材料は、限定されないが、脂質(以前に記載されたとおり)、無機ナノ材料、及び他の高分子材料を含む。ナノ材料粒子は、Riley et al.(Recent Advances in Nanomaterials for GeneDelivery-A Review.Nanomaterials 2017,7(5),94)において詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
ナノ材料を使用して、操作された核酸(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)を送達することができる。ナノ材料媒体は、重要なことに、非免疫原性材料で作ることができ、一般的に、その送達ベクター自体に対する免疫を誘発することを回避することができる。これらの材料は、限定されないが、脂質(以前に記載されたとおり)、無機ナノ材料、及び他の高分子材料を含む。ナノ材料粒子は、Riley et al.(Recent Advances in Nanomaterials for GeneDelivery-A Review.Nanomaterials 2017,7(5),94)において詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
ゲノム編集系
ゲノム編集系は、操作された核酸、例えばキメラタンパク質(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか)の一つ又は複数をコードする操作された核酸などをコードするように、宿主ゲノムを操作するために使用することができる。一般的に、「ゲノム編集系」は、外来性遺伝子を宿主細胞のゲノム中に組み込むための任意の系を指す。ゲノム編集系は、限定されないが、トランスポゾン系、ヌクレアーゼゲノム編集系、及びウイルスベクターベースの送達プラットフォームを含む。
ゲノム編集系は、操作された核酸、例えばキメラタンパク質(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか)の一つ又は複数をコードする操作された核酸などをコードするように、宿主ゲノムを操作するために使用することができる。一般的に、「ゲノム編集系」は、外来性遺伝子を宿主細胞のゲノム中に組み込むための任意の系を指す。ゲノム編集系は、限定されないが、トランスポゾン系、ヌクレアーゼゲノム編集系、及びウイルスベクターベースの送達プラットフォームを含む。
トランスポゾン系を使用して、操作された核酸、例えばキメラタンパク質(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか)の一つ又は複数をコードする操作された核酸などを宿主ゲノム中に組み込むことができる。トランスポゾンは、一般的に、カーゴ/ペイロード核酸及びトランスポザーゼに隣接する末端逆位反復(TIR)を含む。トランスポゾン系は、TIR隣接カーゴを伴って、シスにおいて又はトランスにおいてトランスポゾンを提供することができる。トランスポゾン系は、レトロトランスポゾン系又はDNAトランスポゾン系であり得る。一般的に、トランスポゾン系は、カーゴ/ペイロード(例、操作された核酸)をランダムに宿主ゲノム中に組み込む。トランスポゾン系の例は、Tc1/marinerトランスポゾンスーパーファミリーのトランスポゾン、例えばSleeping Beautyトランスポゾン系などを使用した系を含み、Hudecek et al.(Crit Rev BiochemMol Biol.2017 Aug;52(4):355-380)、ならびに米国特許第6,489,458号、第6,613,752号、及び第7,985,739号においてさらに詳細に記載されており、それらの各々が、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。トランスポゾン系の別の例は、PiggyBacトランスポゾン系を含み、米国特許第6,218,185号及び第6,962,810号においてさらに詳細に記載されており、それらの各々が、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
ヌクレアーゼゲノム編集系は、操作された核酸、例えばキメラタンパク質(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか)の一つ又は複数をコードする操作された核酸などをコードするように、宿主ゲノムを操作するために使用することができる。理論に拘泥することを望まないが、一般的に、外来性遺伝子を導入するために使用されるヌクレアーゼ媒介性遺伝子編集系は、細胞の天然DNA修復機構、特に相同組換え(HR)修復経路を利用する。簡単には、ゲノムDNAへの損傷(典型的には二本鎖切断)に続いて、細胞は、損傷を修復するためのDNA合成時に、その5’と3’の両方の末端に同一又は実質的に同一の配列を有する別のDNA供給源をテンプレートとして使用することにより、損傷を解消することができる。天然の状況では、HDRは、細胞中に存在する他の染色体をテンプレートとして使用することができる。遺伝子編集系では、外来性ポリヌクレオチドを細胞中に導入し、相同組換えテンプレート(HRT又はHRテンプレート)として使用する。一般的に、HRT(例、遺伝子又は遺伝子の一部)内の5’及び3’相補的末端の間に含まれる損傷を伴う、染色体に本来は見出されない任意の追加の外来性配列を、テンプレート化されたHDR中に所与のゲノム遺伝子座中に組み入れる(即ち、組み込む)ことができる。このように、所与のゲノム遺伝子座についての典型的なHRテンプレートは、内因性ゲノム標的遺伝子座の第一領域と同一のヌクレオチド配列、内因性ゲノム標的遺伝子座の第二領域と同一のヌクレオチド配列、及びカーゴ/ペイロードヌクレオチド配列(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか、例えば、一つ又は複数のキメラタンパク質をコードする操作された核酸のいずれか(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか))をコードするヌクレオチド配列を有する。
一部の例では、HRテンプレートは直線状であり得る。直線状HRテンプレートの例は、限定されないが、直線化したプラスミドベクター、ssDNA、合成DNA、及びPCR増幅DNAを含む。特定の例では、HRテンプレートは環状であり得る、例えばプラスミドなど。環状テンプレートは、スーパーコイル状のテンプレートを含み得る。
HRテンプレートの5’及び3’末端で見出される同一又は実質的に同一の配列は、導入される外来性配列に関して、一般的にアーム(HRアーム)として言及される。HRアームは、内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一(即ち、100%同一)であり得る。HRアームは、一部の例では、内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と実質的に同一であり得る。実質的に同一のHRアームを使用することができる一方で、HRアームが同一であることが有利であり得るが、なぜなら、HDR経路の効率は、100%未満の同一性を有するHRアームにより影響され得るためである。
各HRアーム、即ち5’及び3’HRアームは、同じサイズ又は異なるサイズであり得る。各HRアームの長さは、各々が、50、100、200、300、400、もしくは500塩基を上回る又はそれと等しくすることができる。HRアームは、一般的に、任意の長さとすることができるが、実際的な考慮事項、例えば全体的な編集効率に対するHRアームの長さ及び全体的なテンプレートサイズの影響なども考慮に入れることができる。HRアームは、切断部位に直に隣接する内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一、又は実質的に同一であり得る。各HRアームは、切断部位に直に隣接する内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一、又は実質的に同一であり得る。各HRアームは、切断部位からある特定の距離内、例えば、互いに1塩基対、10塩基対未満もしくはそれと等しい、50塩基対未満もしくはそれと等しい、又は100塩基対未満もしくはそれと等しい、などにある内因性ゲノム標的遺伝子座の領域と同一、又は実質的に同一であり得る。
ヌクレアーゼゲノム編集系は、限定されないが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)ファミリーヌクレアーゼ又はその誘導体、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)又はその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)又はその誘導体、及びホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)又はその誘導体を含む、様々なヌクレアーゼを使用して、標的ゲノム遺伝子座を切断することができる。
CRISPR媒介性遺伝子編集系は、操作された核酸、例えばキメラタンパク質(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか)の一つ又は複数をコードする操作された核酸などをコードするように、宿主ゲノムを操作するために使用することができる。CRISPR系は、M.Adli(“The CRISPR tool kit for genome editing and beyond” Nature Communications;volume 9(2018),Article number:1911)においてさらに詳細に記載されており、それが教示する全てについて、参照により本明細書中に組み入れられる。一般的に、CRISPR媒介性の遺伝子編集系は、CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼ及び特定の標的配列に切断を方向付けるRNAを含む。例示的なCRISPR媒介性の遺伝子編集系は、Cas9ヌクレアーゼならびにCRISPR RNA(crRNA)ドメイン及びトランス活性化CRISPR(tracrRNA)ドメインを有するRNAで構成されるCRISPR/Cas9系である。crRNAは、典型的には、二つのRNAドメイン:塩基対ハイブリダイゼーションを通じて標的配列(「定義されたヌクレオチド配列」)、例えば、ゲノム配列に特異性を方向付けるガイドRNA配列(gRNA);及びtracrRNAにハイブリダイズするRNAドメインを有する。tracrRNAは、ヌクレアーゼ(例、Cas9)と相互作用し、それにより、ゲノム遺伝子座への動員を促進することができる。crRNA及びtracrRNAポリヌクレオチドは、別々のポリヌクレオチドであり得る。crRNA及びtracrRNAポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドであり得るが、単一のガイドRNA(sgRNA)としても言及される。Cas9系を本明細書中に例証する一方で、他のCRISPR系を使用することができ、例えばCpf1系などである。ヌクレアーゼは、その誘導体、例えばCas9機能性変異体など、例えば、Cas9酵素により典型的に産生される完全な二本鎖切断とは対照的に、一般的に、定義されたヌクレオチド配列の一本鎖のみの切断を媒介するCas9「ニッカーゼ」変異体を含み得る。
一般的に、CRISPR系の成分は、互いに相互作用してリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成し、配列特異的な切断を媒介する。一部のCRISPR系では、各成分を別々に産生し、使用して、RNP複合体を形成することができる。一部のCRISPR系では、各成分をインビトロで別々に産生し、インビトロで互いに接触させて(即ち、「複合体化させて」)RNP複合体を形成することができる。インビトロで産生されたRNPを次に、細胞のサイトゾル及び/又は核、例えば、T細胞のサイトゾル及び/又は核中に導入(即ち、「送達」)することができる。限定されないが、エレクトロポレーション、脂質媒介性トランスフェクション、物理的手段による細胞膜変形、脂質ナノ粒子(LNP)、ウイルス様粒子(VLP)、及び超音波処理を含む、様々な手段により、インビトロで産生されたRNP複合体は細胞に送達することができる。特定の例では、インビトロで産生されたRNP複合体を、Nucleofactor/Nucleofection(登録商標)エレクトロポレーションベースの送達系(Lonza(登録商標))を使用して細胞に送達することができる。他のエレクトロポレーション系は、限定されないが、MaxCyteエレクトロポレーション系、Miltenyi CliniMACSエレクトロポレーション系、Neonエレクトロポレーション系、及びBTXエレクトロポレーション系を含む。CRISPRヌクレアーゼ、例えば、Cas9は、当技術分野において公知の様々なタンパク質産生技術を使用して、インビトロで産生(即ち、合成及び精製)することができる。CRISPR系RNA、例えば、sgRNAは、当業者に公知の様々なRNA生成技術、例えばインビトロ転写又は化学合成などを使用して、インビトロで産生(即ち、合成及び精製)することができる。
インビトロで産生されたRNP複合体は、ヌクレアーゼとgRNAの異なる比率で複合体化することができる。インビトロで産生されたRNP複合体はまた、CRISPR媒介性の編集系において異なる量で使用することができる。例えば、編集されることが望まれる細胞の数に依存して、加えられるRNPの総量を調整することができ、例えば、反応において多数の細胞を編集する場合に加えられるRNP複合体の量における低下などである。
一部のCRISPR系では、各成分(例、Cas9及びsgRNA)は、ポリヌクレオチドにより別々にコードされ、各ポリヌクレオチドは一緒に又は別々に細胞中に導入することができる。一部のCRISPR系では、各成分は、単一のポリヌクレオチド(即ち、マルチプロモーター又はマルチシストロンベクター、以下の例示的なマルチシストロン系の説明を参照のこと)によりコードされ、細胞中に導入することができる。細胞内での各ポリヌクレオチドにコードされたCRISPR成分の発現(例、ヌクレアーゼの翻訳及びCRISPR RNAの転写)後、RNP複合体を細胞内で形成させることができ、次に、部位特異的切断に方向付けることができる。
一部のRNPは、核中へのRNPの送達を促進する部分を有するように操作することができる。例えば、Cas9ヌクレアーゼは、核局在化シグナル(NLS)ドメインを有し得るが、Cas9 RNP複合体が、細胞のサイトゾル中に送達される場合、又はCas9の翻訳及びその後のRNP形成後に、NLSは、核中へのCas9 RNPのさらなる輸送を促進することができる。
本明細書中に記載されている、操作された細胞は、非ウイルス方法を使用して操作することができ、例えば、本明細書中に記載されるヌクレアーゼ及び/又はCRISPR媒介性の遺伝子編集系は、非ウイルス方法を使用して細胞に送達することができる。本明細書中に記載されている、操作された細胞は、ウイルス方法を使用して操作することができ、例えば、本明細書中に記載されるヌクレアーゼ及び/又はCRISPR媒介性の遺伝子編集系は、ウイルス方法、例えばアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又は本明細書中に記載される他のウイルスベースの送達方法のいずれかを使用して細胞に送達することができる。
一部のCRISPR系では、二つ以上のCRISPR組成物を提供することができ、各々が、同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座を、二つ以上の標的ヌクレオチド配列で別々に標的化するようにする。例えば、二つの別々のCRISPR組成物を提供して、互いの特定の距離内の二つの異なる標的ヌクレオチド配列での切断に方向付けることができる。一部のCRISPR系では、二つ以上のCRISPR組成物を提供することができ、各々が、同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座の逆ストランドを別々に標的化するようにする。例えば、二つの別々のCRISPR「ニッカーゼ」組成物を提供して、逆ストランド上の同じ遺伝子又は一般的なゲノム遺伝子座で切断に方向付けることができる。
一般的に、本明細書中に記載されるCRISPR媒介性の編集系の特色を、他のヌクレアーゼベースのゲノム編集系に適用することができる。TALENは、操作された部位特異的ヌクレアーゼであって、それは、TALE(転写アクチベーター様エフェクター)のDNA結合ドメイン及び制限エンドヌクレアーゼFoklの触媒ドメインで構成される。DNA結合ドメインの単量体の高度に可変的な残基領域中に存在するアミノ酸を変化させることにより、異なる人工TALENを作製して様々なヌクレオチド配列を標的化することができる。DNA結合ドメインによって、その後、ヌクレアーゼが標的配列に方向付けられ、二本鎖切断が作製される。TALENベースの系は、米国通し番号第12/965,590号;米国特許第8,450,471号;米国特許第8,440,431号;米国特許第8,440,432号;米国特許第10,172,880号;及び米国通し番号第13/738,381号においてより詳細に記載されており、それらの全てが、それらの全体において参照により本明細書中に組み入れられる。TALENベースの編集系は、米国特許第6,453,242号;第6,534,261号;第6,599,692号;第6,503,717号;第6,689,558号;第7,030,215号;第6,794,136号;第7,067,317号;第7,262,054号;第7,070,934号;第7,361,635号;第7,253,273号;及び米国特許公開第2005/0064474号;第2007/0218528号;第2005/0267061号においてさらに詳細に記載されており、全てが、それらの全体において、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
他の改変送達系
操作された核酸(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)を細胞又は他の標的レシピエント実体、例えば、本明細書中に記載される脂質構造のいずれかなどの中に導入するための様々な追加の手段。
操作された核酸(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)を細胞又は他の標的レシピエント実体、例えば、本明細書中に記載される脂質構造のいずれかなどの中に導入するための様々な追加の手段。
エレクトロポレーションを使用して、ポリヌクレオチドをレシピエント実体に送達することができる。エレクトロポレーションは、電界を適用して、標的細胞又は実体の外膜又はシェルを一時的に透過させることを通じて、カーゴ/ペイロードを標的細胞又は実体の内部コンパートメント中に内在化させる方法である。一般的に、この方法は、目的のカーゴ(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)を含む溶液中の二つの電極の間に細胞又は標的実体を配置することを含む。細胞の脂質膜を次に、一過性の設定電圧を適用することにより破壊、即ち、透過させ、それによって、カーゴが、実体の内部、例えば、細胞の細胞質に進入することが可能になる。細胞の例では、細胞の大部分ではないが、少なくとも一部は生存可能なままである。細胞及び他の実体を、インビトロ、インビボ、又はエクスビボでエレクトロポレーションすることができる。エレクトロポレーション条件(例、細胞の数、カーゴの濃度、回復条件、電圧、時間、容量、パルスタイプ、パルス長、容積、キュベット長、エレクトロポレーション溶液の組成など)は、限定されないが、細胞又は他のレシピエント実体の種類、送達されるカーゴ、所望の内在化の効率、及び所望の生存率を含む、いくつかの要因に依存して変動する。そのような基準の最適化は、当業者の技術の範囲内である。様々なデバイス及びプロトコールをエレクトロポレーションのために使用することができる。例は、限定されないが、Neon(登録商標)トランスフェクション系、MaxCyte(登録商標)Flow Electroporation(商標)、Lonza(登録商標)Nucleofector(商標)系、及びBio-Rad(登録商標)エレクトロポレーション系を含む。
操作された核酸(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか)を細胞又は他の標的レシピエント実体中に導入するための他の手段は、限定されないが、超音波処理、遺伝子銃、流体力学的注射、及び物理的手段による細胞膜変形を含む。
操作されたmRNA、例えばネイキッドプラスミド又はmRNAなどをインビボで送達するための組成物及び方法が、Kowalski et al.(Mol Ther.2019 Apr 10;27(4):710-728)及びKaczmarek et al.(GenomeMed.2017;9:60)において詳細に記載されており、各々が、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
送達媒体
また、本明細書中で提供されるのは、カーゴ/ペイロード(「送達媒体」)を送達するための組成物である。
また、本明細書中で提供されるのは、カーゴ/ペイロード(「送達媒体」)を送達するための組成物である。
カーゴは、上に記載されるように、核酸(例、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれか、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質を含むキメラタンパク質をコードする、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかなど)を含み得る。カーゴは、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び/又はそれらの組み合わせを含み得る。カーゴは、本明細書中で提供されるキメラタンパク質のいずれか(例、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質のいずれか)であることができる。カーゴは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質、例えば、本明細書中に記載されるキメラタンパク質の二つ以上の組み合わせであることができる。カーゴは、本明細書中に記載されるキメラタンパク質と、目的の別のカーゴ、例えば別のタンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び/又はそれらの組み合わせなどとの組み合わせであることができる。
送達媒体は、カーゴを送達するために適切な任意の組成物を含み得る。送達媒体は、タンパク質(例、本明細書中に記載されるキメラタンパク質のいずれか)を送達するために適切な任意の組成物を含み得る。送達媒体は、本明細書中に記載される脂質構造送達系のいずれかであることができる。例えば、送達媒体は、限定されないが、脂質ベースのナノ粒子、リポソーム、ミセル、エキソソーム、小胞、細胞外小胞、細胞、又は組織を含む、脂質ベースの構造体であることができる。送達媒体は、本明細書中に記載されるナノ粒子、例えば脂質(以前に記載されたとおり)、無機ナノ材料、及び他の高分子材料を含むナノ粒子などのいずれかであることができる。
送達媒体は、カーゴを細胞に送達する、例えば、本明細書中に記載されるキメラタンパク質のいずれかを細胞に送達するなど、が可能であり得る。送達媒体は、カーゴを細胞に送達する、例えば、本明細書中に記載されるキメラタンパク質のいずれかを細胞に送達するなど、が可能であり得る。送達媒体は、特定の細胞を標的化するよう構成する、例えば、特定の細胞を標的化するための再配向抗体を用いて構成する、などができる。送達媒体は、カーゴを細胞にインビボで送達することが可能であり得る。
送達媒体は、組織又は組織環境(例、腫瘍微小環境)にカーゴを送達する、本明細書中に記載されるキメラタンパク質のいずれかを組織又は組織環境にインビボで送達する、などが可能であり得る。カーゴを送達することは、カーゴを分泌すること、例えば、本明細書中に記載されるキメラタンパク質のいずれかを分泌することなどを含み得る。したがって、送達媒体は、カーゴを分泌すること、例えば、本明細書中に記載されるキメラタンパク質のいずれかを分泌すること、などが可能であり得る。送達媒体は、組織又は組織環境(例、腫瘍微小環境)にカーゴを分泌すること、例えば、本明細書中に記載されるキメラタンパク質のいずれかを組織又は組織環境中に分泌すること、などが可能であり得る。送達媒体は、特定の組織又は組織環境(例、腫瘍微小環境)を標的化するように構成され得る、例えば、特定の組織又は組織環境を標的化するように再配向抗体を用いて構成され得る。
治療の方法
さらに本明細書中で提供されるのは、操作された細胞により産生される、少なくとも一つの目的のタンパク質(例、本明細書中で提供されるキメラタンパク質のいずれか、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質など、あるいはキメラタンパク質のプロテアーゼ切断後に本明細書中で提供される分泌エフェクター分子)をインビボで産生するために、本明細書中で提供される操作された細胞を対象(例、ヒト対象)に送達する、又は投与することを含む方法である。本明細書中でさらに提供されるのは、操作された細胞により産生される、目的の少なくとも二つのタンパク質、例えば、本明細書中で提供されるキメラタンパク質の少なくとも二つ、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などをインビボで産生するために、本明細書中で提供される、操作された細胞を対象(例、ヒト対象)に送達する、又は投与することを含む方法である。
さらに本明細書中で提供されるのは、操作された細胞により産生される、少なくとも一つの目的のタンパク質(例、本明細書中で提供されるキメラタンパク質のいずれか、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質など、あるいはキメラタンパク質のプロテアーゼ切断後に本明細書中で提供される分泌エフェクター分子)をインビボで産生するために、本明細書中で提供される操作された細胞を対象(例、ヒト対象)に送達する、又は投与することを含む方法である。本明細書中でさらに提供されるのは、操作された細胞により産生される、目的の少なくとも二つのタンパク質、例えば、本明細書中で提供されるキメラタンパク質の少なくとも二つ、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などをインビボで産生するために、本明細書中で提供される、操作された細胞を対象(例、ヒト対象)に送達する、又は投与することを含む方法である。
本明細書中でさらに提供されるのは、本明細書中に記載される送達媒体のいずれか、例えば、本明細書中に記載される目的のタンパク質のいずれか、例えば、本明細書中で提供されるキメラタンパク質のいずれか、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などを含む、本明細書中に記載される送達媒体のいずれかなどを対象(例、ヒト対象)に送達する、又は投与することを含む方法である。本明細書中でさらに提供されるのは、本明細書中に記載される送達媒体のいずれか、例えば、本明細書中で提供されるキメラタンパク質、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などの二つ以上のタンパク質、例えば、少なくとも二つを含む、本明細書中に記載される送達媒体のいずれかなどを対象(例、ヒト対象)に送達する、又は投与することを含む方法。
一部の実施形態では、操作された細胞又は送達媒体は、静脈内、腹腔内、気管内、皮下、腫瘍内、経口、肛門、鼻腔内(例、送達粒子中に封入される)、又は動脈(例、内頸動脈)経路を介して投与される。このよに、操作された細胞又は送達媒体は、全身的又は局所的に(例、TMEに、又は腫瘍内投与を介して)投与され得る。操作された細胞は、対象、例えば、癌を有することが公知である又は疑われる対象などから単離することができる。操作された細胞は、治療が施されている対象に関して同種であり得る。同種改変細胞は、治療が施されている対象にHLA適合させることができる。送達媒体は、本明細書中に記載される脂質構造送達系のいずれかであることができる。送達媒体は、本明細書中に記載されるナノ粒子のいずれかであることができる。
操作された細胞又は送達媒体は、治療すべき状態に依存的に、単独で、又は他の治療との組み合わせにおいて、同時投与又は連続的のいずれかで投与することができる。例えば、操作された細胞又は送達媒体は、本明細書中に記載される一つ又は複数のIMiDとの組み合わせにおいて投与することができる。FDA承認済みIMiDは、それらの承認された様式において投与することができる。別の実施例では、操作された細胞又は送達媒体は、チェックポイントインヒビター治療との組み合わせにおいて投与することができる。例示的なチェックポイントインヒビターは、限定されないが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体を含む。例証的な免疫チェックポイントインヒビターは、ペムブロリズマブ(抗PD-1;MK-3475/Keytruda(登録商標)-Merck)、ニボルマブ(抗PD-1;Opdivo(登録商標)-BMS)、ピディリズマブ(抗PD-1抗体;CT-011-Teva/CureTech)、AMP224(抗PD-1;NCI)、アベルマブ(抗PD-L1;Bavencio(登録商標)-Pfizer)、デュルバルマブ(抗PD-L1;MEDI4736/Imfinzi(登録商標)-Medimmune/AstraZeneca)、アテゾリズマブ(抗PD-L1);Tecentriq(登録商標)-Roche/Genentech)、BMS-936559(抗PD-L1-BMS)、トレメリムマブ(抗CTLA-4;Medimmune/AstraZeneca)、イピリムマブ(抗CTLA-4;Yervoy(登録商標)-BMS)、リリルマブ(抗KIR;BMS)、モナリズマブ(抗NKG2A;Innate Pharma/AstraZeneca)を含む。他の例では、操作された細胞又は送達媒体は、TGFベータインヒビター、VEGFインヒビター、又はHPGE2との組み合わせにおいて投与することができる。別の例では、操作された細胞又は送達媒体は、抗CD40抗体との組み合わせにおいて投与することができる。
一部の方法は、腫瘍(又は癌)を有する対象(又は患者集団)を選択すること、及び、その対象を、腫瘍媒介性免疫抑制機構を調節する、操作された細胞又は送達媒体で治療することを含む。
本開示の操作された細胞又は送達媒体は、一部の例では、癌、例えば卵巣癌などを治療するために使用され得る。他の癌が本明細書中に記載されている。例えば、操作された細胞は、膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、食道腫瘍、神経膠腫、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、メラノーマ、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、甲状腺腫瘍、及び/又は子宮腫瘍を治療するために使用され得る。本開示の操作された細胞又は送達媒体は、対象の腹膜腔中に位置する腫瘍を伴う癌を治療するために使用することができる。
本明細書中で提供される方法はまた、操作された細胞又は送達媒体の調製物を送達することを含む。調製物は、一部の実施形態では、例えば、操作された細胞以外の細胞を5%未満(例、4%、3%、2%、又は1%未満)で含む、実質的に純粋な調製物である。調製物は、1×105細胞/kgから1×107細胞/kgの細胞を含み得る。操作された細胞又は送達媒体の調製は、一つ又は複数の医薬的に許容可能な担体を有する医薬組成物を含むことができる。例えば、操作された細胞又は送達媒体の調製物は、操作されたウイルス、例えば操作されたAAVウイルスなどのいずれか、又は操作されたウイルスベクター、例えば本明細書中に記載されるAAVベクターなどのいずれかを含むことができる。
インビボ発現
本明細書中で提供される方法はまた、本明細書中に記載される、操作された細胞を産生することが可能である、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかをインビボで細胞に送達することが可能である組成物をインビボで送達することを含む。そのような組成物は、ウイルス媒介性送達プラットフォームのいずれか、脂質構造送達系のいずれか、ナノ粒子送達系のいずれか、ゲノム編集系のいずれか、又は細胞をインビボで操作することが可能である、本明細書中に記載される他の操作送達系のいずれかを含む。
本明細書中で提供される方法はまた、本明細書中に記載される、操作された細胞を産生することが可能である、例えば、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかをインビボで細胞に送達することが可能である組成物をインビボで送達することを含む。そのような組成物は、ウイルス媒介性送達プラットフォームのいずれか、脂質構造送達系のいずれか、ナノ粒子送達系のいずれか、ゲノム編集系のいずれか、又は細胞をインビボで操作することが可能である、本明細書中に記載される他の操作送達系のいずれかを含む。
本明細書中で提供される方法はまた、本明細書中に記載される目的のタンパク質のいずれか、例えば、本明細書中で提供されるキメラタンパク質、例えば、本明細書中に記載されるデグロン融合キメラタンパク質あるいは本明細書中に記載される式S-C-MT-Dを有する膜切断可能なキメラタンパク質などのいずれかを産生することが可能な組成物をインビボで送達することを含む。本明細書中で提供される方法はまた、本明細書中に記載される、目的のタンパク質の二つ以上を産生することが可能な組成物をインビボで送達することを含む。目的のタンパク質のインビボ産生が可能な組成物は、限定されないが、本明細書中に記載される、操作された核酸のいずれかを含む。目的のタンパク質のインビボ産生が可能な組成物は、ネイキッドmRNA又はネイキッドプラスミドであり得る。
追加の実施形態
以下の段落は、追加の列挙される実施形態を提供する。
1.プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含む操作された核酸であって、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつ
Dはデグロンを含み、
プロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつS-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、操作された核酸。
2.プロモーターが構成的プロモーターである、段落1の操作された核酸。
3.構成的プロモーターが、CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb、及びhUBIbからなる群から選択される、段落2の操作された核酸。
4.プロモーターが誘導性プロモーターである、段落1~3のいずれか一つの操作された核酸。
5.誘導性プロモーターが、minP、NFkB応答エレメント、CREB応答エレメント、NFAT応答エレメント、SRF応答エレメント1、SRF応答エレメント2、AP1応答エレメント、TCF-LEF応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答エレメント、SMAD結合エレメント、STAT3結合部位、minCMV、YB_TATA、minTK、誘導因子分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピートからなる群から選択される、段落4の操作された核酸。
6.プロモーターが合成プロモーターを含む、段落1~3のいずれか一つの操作された核酸。
7.プロモーターが組織特異的プロモーターである、段落1~3のいずれか一つの操作された核酸。
8.分泌性エフェクター分子がシグナルペプチドを含む、段落1~7のいずれか一つの操作された核酸。
9.シグナルペプチドが、分泌性エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む、段落8の操作された核酸。
10.シグナルペプチドが、分泌性エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む、段落8の操作された核酸。
11.非天然シグナルペプチドが、IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSFからなる群から選択される、段落10の操作された核酸。
12.分泌性エフェクター分子が治療クラスから選択され、治療クラスが、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落1~11のいずれか一つの操作された核酸。
13.サイトカインが、IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファからなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
14.ケモカインが、CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1からなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
15.ホーミング分子が、抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2からなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
16.成長因子が、FLT3L及びGM-CSFからなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
17.共活性化分子が、4-1BBL及びCD40Lからなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
18.腫瘍微小環境修飾因子が、アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2からなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
19.TGFベータインヒビターが、抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、段落18の操作された核酸。
20.免疫チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落18の操作された核酸。
21.VEGFインヒビターが、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む、段落18の操作された核酸。
22.分泌性エフェクター分子がヒト由来エフェクター分子である、段落1~18のいずれか一つの操作された核酸。
23.プロテアーゼ切断部位が、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である、段落1~22のいずれか一つの操作された核酸。
24.細胞膜係留ドメインが膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む、段落1~23のいずれか一つの操作された核酸。
25.膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインが、PDGFR-ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する、段落24の操作された核酸。
26.細胞膜係留ドメインが細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む、段落1~23のいずれか一つの操作された核酸。
27.細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子が、細胞の細胞膜に係留される、段落1~26のいずれか一つの操作された核酸。
28.プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを発現する細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子が細胞膜から放出される、段落27の操作された核酸。
29.細胞膜上に発現されるプロテアーゼが、細胞に対して内因性である、段落28の操作された核酸。
30.プロテアーゼが、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択される、段落29の操作された核酸。
31.細胞膜上に発現されるプロテアーゼが、細胞に対して異種である、段落28の操作された核酸。
32.プロテアーゼがC型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である、段落31の操作された核酸。
33.プロテアーゼ切断部位がNS3プロテアーゼ切断部位を含む、段落32の操作された核酸。
34.NS3プロテアーゼ切断部位が、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合部切断部位を含む、段落33の操作された核酸。
35.プロテアーゼが、プロテアーゼインヒビターにより抑制され得る、段落28~34のいずれか一つの操作された核酸。
36.プロテアーゼインヒビターが、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される、段落35の操作された核酸。
37.プロテアーゼの発現が、調節が可能である、段落28~36のいずれか一つの操作された核酸。
38.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落1~37のいずれか一つの操作された核酸。
39.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落38の操作された核酸。
40.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落38の操作された核酸。
41. CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落38の操作された核酸。
42.IMiDがFDA承認薬物である、段落38~41のいずれか一つの操作された核酸。
43.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落38~42のいずれか一つの操作された核酸。
44.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落1~36のいずれか一つの操作された核酸。
45.デグロンが、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている、段落1~44のいずれか一つの操作された核酸。
46.操作された核酸が、DNA、cDNA、RNA、mRNA、及びネイキッドプラスミドからなる群から選択される、段落1~45のいずれか一つの操作された核酸。
47.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸を含む発現ベクター。
48.発現ベクターがウイルスベクターである、段落47の発現ベクター。
49.ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、段落48の発現ベクター。
50.N末端からC末端に配向された膜切断可能なキメラタンパク質であって、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dはデグロンを含み、かつ
S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、膜切断可能なキメラタンパク質。
51.分泌性エフェクター分子がシグナルペプチドを含む、段落50のキメラタンパク質。
52.シグナルペプチドが、分泌性エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む、段落51のキメラタンパク質。
53.シグナルペプチドが、分泌性エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む、段落51のキメラタンパク質。
54.非天然シグナルペプチドが、IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSFからなる群から選択される、段落53のキメラタンパク質。
55.分泌性エフェクター分子が治療クラスから選択され、治療クラスが、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落50~54のいずれか一つのキメラタンパク質。
56.サイトカインが、IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファからなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
57.ケモカインが、CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1からなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
58.ホーミング分子が、抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2からなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
59.成長因子が、FLT3L及びGM-CSFからなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
60.共活性化分子が、4-1BBL及びCD40Lからなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
61.腫瘍微小環境修飾因子が、アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2からなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
62.TGFベータインヒビターが、抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、段落61のキメラタンパク質。
63.免疫チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落61のキメラタンパク質。
64.VEGFインヒビターが、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む、段落61のキメラタンパク質。
65.分泌性エフェクター分子がヒト由来エフェクター分子である、段落50~61のいずれか一つのキメラタンパク質。
66.プロテアーゼ切断部位が、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である、段落50~65のいずれか一つのキメラタンパク質。
67.細胞膜係留ドメインが膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む、段落50~66のいずれか一つのキメラタンパク質。
68.膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインが、PDGFR-ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する、段落67のキメラタンパク質。
69.細胞膜係留ドメインが細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む、段落50~66のいずれか一つのキメラタンパク質。
70.細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子が、細胞の細胞膜に係留される、段落50~69のいずれか一つのキメラタンパク質。
71.プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを発現する細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子が細胞膜から放出される、段落70のキメラタンパク質。
72.細胞膜上に発現されるプロテアーゼが、細胞に対して内因性である、段落71のキメラタンパク質。
73.プロテアーゼが、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択される、段落72のキメラタンパク質。
74.細胞膜上に発現されるプロテアーゼが、細胞に対して異種である、段落71のキメラタンパク質。
75.プロテアーゼがC型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である、段落74のキメラタンパク質。
76.プロテアーゼ切断部位がNS3プロテアーゼ切断部位を含む、段落75のキメラタンパク質。
77.NS3プロテアーゼ切断部位がNS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合部切断部位を含む、段落76のキメラタンパク質。
78.プロテアーゼが、プロテアーゼインヒビターにより抑制され得る、段落71~77のいずれか一つのキメラタンパク質。
79.プロテアーゼインヒビターが、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される、段落78のキメラタンパク質。
80.プロテアーゼがデグロンをさらに含む、段落71~79のいずれか一つのキメラタンパク質。
81.プロテアーゼの発現が調節が可能である、段落71~80のいずれか一つのキメラタンパク質。
82.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落50~81のキメラタンパク質。
83.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落82のキメラタンパク質。
84.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落82のキメラタンパク質。
85.CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落82のキメラタンパク質。
86.IMiDがFDA承認薬物である、段落82~85のいずれか一つのキメラタンパク質。
87.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落82~86のいずれか一つのキメラタンパク質。
88.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落50~80のいずれか一つのキメラタンパク質。
89.デグロンが、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている、段落50~88のいずれか一つのキメラタンパク質。
90.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸、又は段落47~49のいずれか一つの発現ベクター、又は段落50~89のいずれか一つの膜切断可能なキメラタンパク質、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
91.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸、又は段落47~49のいずれか一つの発現ベクター、又は段落50~89のいずれか一つの膜切断可能なキメラタンパク質を含む単離細胞。
92.操作された核酸を含む単離細胞であって、操作された核酸は、プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含み、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつ
Dはデグロンを含み、
プロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつS-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、単離細胞。
93.操作された核酸を組換え発現させる、段落91又は段落92の単離細胞。
94.操作された核酸を、ベクター又は細胞のゲノムからの選択された遺伝子座から発現させる、段落91~93のいずれか一つの単離細胞。
95.N末端からC末端に配向された膜切断可能なキメラタンパク質が、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dはデグロンを含み、かつ
ならびにS-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、膜切断可能なキメラタンパク質を含む単離細胞。
96.細胞が、T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマデルタT細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、調節性T細胞、ウイルス特異的T細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞(ESC)、ESC由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞(MSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、及びiPSC由来細胞からなる群から選択される、段落91~95のいずれか一つの単離細胞。
97.細胞が自家である、段落91~96のいずれか一つの単離細胞。
98.細胞が同種である、段落91~96のいずれか一つの単離細胞。
99.細胞が、膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、子宮頸部腫瘍細胞、結腸直腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、神経膠腫細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、及び子宮腫瘍細胞からなる群から選択される腫瘍細胞である、段落91~95のいずれか一つの単離細胞。
100.細胞が、腫瘍溶解性ウイルスでの形質導入を介して操作された、段落99の単離細胞。
101.腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアント又は誘導体からなる群から選択される、段落100の単離細胞。
102.腫瘍溶解性ウイルスが、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスである、段落100又は段落101の単離細胞。
103.細胞が、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼをさらに含む、段落91~102のいずれか一つの単離細胞。
104.プロテアーゼが内因性プロテアーゼである、段落103の単離細胞。
105.内因性プロテアーゼが、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択される、段落104の単離細胞。
106.プロテアーゼが異種プロテアーゼである、段落103の単離細胞。
107.異種プロテアーゼがC型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である、段落106の単離細胞。
108.プロテアーゼが、細胞の細胞膜上に発現される、実施形態103~107のいずれか一つの単離細胞。
109.プロテアーゼが、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能である、段落108の単離細胞。
110.プロテアーゼ切断部位の切断によって、細胞の細胞膜から分泌性エフェクター分子が放出される、段落109の単離細胞。
111.細胞が抗原認識受容体をさらに含む、段落91~110のいずれか一つの単離細胞。
112.抗原認識受容体が、5T4、ADAM9、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、カドヘリン3、カドヘリン6、CCR4、CD123、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD30、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CEA、CEACAM5、クローディン18.2、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、ENPP3、EpCAM、EphA2、エフリンA4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRアルファ、FRb、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、インテグリンaV、KIT、L1CAM、LAMP1、ルイスY、LeY、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、メソテリン、MUC1、MUC16、MUC1C、NaPi2B、ネクチン4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、オバリン、Pカドヘリン、pan-Erb2、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLITRK6、SSTR2、STEAP1、サバイビン、TDGF1、TIM1、TROP2、及びWT1からなる群から選択される抗原を認識する、段落111の単離細胞。
113.抗原認識受容体が抗原結合ドメインを含む、段落111又は段落112の単離細胞。
114.抗原結合ドメインが、抗体、抗体の抗原結合断片、F(ab)断片、F(ab’)断片、一本鎖可変断片(scFv)、又は単一ドメイン抗体(sdAb)を含む、段落113の単離細胞。
115.抗原結合ドメインが一本鎖可変断片(scFv)を含む、段落113の単離細胞。
116.scFvが、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、段落115の単離細胞。
117.VH及びVLが、ペプチドリンカーにより分離される、段落116の単離細胞。
118.scFvが、構造VH-L-VL又はVL-L-VHを含み、VHが重鎖可変ドメインであり、Lがペプチドリンカーであり、VLが軽鎖可変ドメインである、段落117の単離細胞。
119.抗原認識受容体がキメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)である、段落111~118のいずれか一つの単離細胞。
120.抗原認識受容体がCARである、段落111~118のいずれか一つの単離細胞。
121.CARが一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、CD97細胞内シグナル伝達ドメイン、CD11a-CD18細胞内シグナル伝達ドメイン、CD2細胞内シグナル伝達ドメイン、ICOS細胞内シグナル伝達ドメイン、CD27細胞内シグナル伝達ドメイン、CD154細胞内シグナル伝達ドメイン、CD8細胞内シグナル伝達ドメイン、OX40細胞内シグナル伝達ドメイン、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD28細胞内シグナル伝達ドメイン、ZAP40細胞内シグナル伝達ドメイン、CD30細胞内シグナル伝達ドメイン、GITR細胞内シグナル伝達ドメイン、HVEM細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP10細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP12細胞内シグナル伝達ドメイン、及びMyD88細胞内シグナル伝達ドメインからなる群から選択される、段落120の単離細胞。
122.CARが膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、OX40膜貫通ドメイン、ICOS膜貫通ドメイン、CTLA-4膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、LAG-3膜貫通ドメイン、2B4膜貫通ドメイン、及びBTLA膜貫通ドメインからなる群から選択される、段落120又は段落121の単離細胞。
123.CARが、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサー領域を含む、段落120~122のいずれか一つの単離細胞。
124.段落91~123のいずれか一つの単離細胞、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
125.段落91~123のいずれか一つの単離細胞又は段落124の組成物のいずれかの治療有効用量を投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法。
126.単離細胞が対象から由来する、段落125の方法。
127.単離細胞が、対象に関して同種である、段落125又は段落126の方法。
128.方法が、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む、段落125~127のいずれか一つの方法。
129.チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落128の方法。
130.方法が、抗CD40抗体を投与することをさらに含む、段落125~129のいずれか一つの方法。
131.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸、又は段落47~49のいずれか一つの発現ベクター、又は段落50~89のいずれか一つの膜切断可能なキメラタンパク質を含む脂質ベースの構造体。
132.脂質ベースの構造体が、細胞外小胞を含む、段落131の脂質ベースの構造体。
133.細胞外小胞が、ナノ小胞及びエキソソームからなる群から選択される、段落132の脂質ベースの構造体。
134.脂質ベースの構造体が、脂質ナノ粒子又はミセルを含む、段落131の脂質ベースの構造体。
135.脂質ベースの構造体が、リポソームを含む、段落131の脂質ベースの構造体。
136.段落131~135のいずれか一つの脂質ベースの構造体、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
137.段落131~135のいずれか一つの治療有効用量の脂質ベースの構造体のいずれか又は段落136の組成物を投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法。
138.投与することが全身投与を含む、段落137の方法。
139.脂質ベースの構造体によって、対象において細胞を操作することが可能である、段落137又は段落138の方法。
140.方法が、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む、段落137~139のいずれか一つの方法。
141.チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落140の方法。
142.方法が、抗CD40抗体を投与することをさらに含む、段落137~141のいずれか一つの方法。
143.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸又は段落50~89のいずれか一つの膜切断可能なキメラタンパク質を含むナノ粒子。
144.ナノ粒子が無機材料を含む、段落143のナノ粒子。
145.段落143又は段落144のナノ粒子を含む組成物。
146.段落143もしくは段落144のナノ粒子のいずれか、又は段落145の組成物の治療有効用量を投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法。
147.投与することが全身投与を含む、段落146の方法。
148.ナノ粒子によって、対象において細胞を操作することが可能である、段落146又は段落147の方法。
149.方法が、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む、段落146~148のいずれか一つの方法。
150.チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落149の方法。
151.方法が、抗CD40抗体を投与することをさらに含む、段落146~150のいずれか一つの方法。
152.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸、又は段落47~49のいずれか一つの発現ベクターを含むように操作されたウイルス。
153.ウイルスが、レンチウイルス、レトロウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、及びウイルス様粒子(VLP)からなる群から選択される、段落152の操作されたウイルス。
154.段落152又は段落153の操作されたウイルス、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
155.段落152もしくは段落153の操作されたウイルス、又は段落154の組成物の治療有効用量を投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法。
156.投与することが全身投与を含む、段落155の方法。
157.操作されたウイルスが、対象において細胞に感染し、発現カセットを発現する、段落155又は段落156の方法。
158.方法が、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む、段落155~157のいずれか一つの方法。
159.チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落158の方法。
160.方法が、抗CD40抗体を投与することをさらに含む、段落155~159のいずれか一つの方法。
161.膜係留エフェクター分子の放出を誘導する方法であって、
a)細胞を提供すること、それにおいて、細胞は、膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質を含み、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sはエフェクター分子を含み、
Cは同族膜結合プロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dはデグロンを含み、かつ
S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成され;ならびに
b)膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質の発現のために適切な条件下で細胞を培養すること、
それにおいて、発現時に、膜切断可能なキメラタンパク質は、細胞の細胞膜に係留され、かつ
それにおいて、発現時に、膜結合プロテアーゼは、膜切断可能なキメラタンパク質の同族膜結合プロテアーゼ切断部位を切断し、それにより、エフェクター分子を細胞膜から放出する、ことを含む方法。
162.デグロンが薬物誘導性デグロンである、段落161の方法。
163.細胞に、デグロンを誘導する薬物を接触させることをさらに含む、段落162の方法。
164.デグロンの誘導によって、膜切断可能なキメラタンパク質が分解される、段落163の方法。
165.膜係留エフェクター分子を分解する方法であって、
a)細胞を提供すること、それにおいて、細胞は、膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質を含み、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sはエフェクター分子を含み、
Cは同族膜結合プロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dは薬物誘導性デグロンを含み、かつ
S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成され;
b)膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質の発現のために適切な条件下で前記細胞を培養すること、それにおいて、発現時に、膜切断可能なキメラタンパク質が、細胞の前記細胞膜に係留され;ならびに
c)細胞を薬物と接触させることによりデグロンを誘導すること、それにおいて、デグロンのデグロン誘導によって、膜切断可能なキメラタンパク質が分解される、方法。
166.エフェクター分子がシグナルペプチドを含む、段落161~165のいずれか一つの方法。
167.シグナルペプチドが、エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む、段落166の方法。
168.シグナルペプチドが、エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む、段落166の方法。
169.非天然シグナルペプチドが、IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSFからなる群から選択される、段落168の方法。
170.エフェクター分子が治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落161~169のいずれか一つの方法。
171.サイトカインが、IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファからなる群から選択される、段落170の方法。
172.ケモカインが、CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1からなる群から選択される、段落170の方法。
173.ホーミング分子が、抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2からなる群から選択される、段落170の方法。
174.成長因子が、FLT3L及びGM-CSFからなる群から選択される、段落170の方法。
175.共活性化分子が、4-1BBL及びCD40Lからなる群から選択される、段落170の方法。
176.腫瘍微小環境修飾因子が、アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2からなる群から選択される、段落170の方法。
177.TGFベータインヒビターが、抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、段落176の方法。
178.免疫チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落176の方法。
179.VEGFインヒビターが、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む、段落176の方法。
180.エフェクター分子がヒト由来エフェクター分子である、段落161~175のいずれか一つの方法。
181.同族プロテアーゼ切断部位が、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である、段落161~180のいずれか一つの方法。
182.細胞膜係留ドメインが膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む、段落161~181のいずれか一つの方法。
183.膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインが、PDGFR-ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する、段落182の方法。
184.細胞膜係留ドメインが、細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む、段落161~181のいずれか一つの方法。
185.プロテアーゼが、細胞に対して内因性である、段落161~184のいずれか一つの方法。
186.プロテアーゼが、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択される、段落185の方法。
187.プロテアーゼが、細胞に対して異種である、段落161~184のいずれか一つの方法。
188.プロテアーゼが、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である、段落187の方法。
189.プロテアーゼ切断部位が、NS3プロテアーゼ切断部位を含む、段落188の方法。
190.NS3プロテアーゼ切断部位が、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合部切断部位を含む、段落189の方法。
191.プロテアーゼが、プロテアーゼインヒビターにより抑制され得る、段落161~190のいずれか一つの方法。
192.プロテアーゼインヒビターが、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される、段落191の方法。
193.プロテアーゼがデグロンをさらに含む、段落161~192のいずれか一つの方法。
194.プロテアーゼの発現が、調節が可能である、段落161~193のいずれか一つの方法。
195.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落161~194のいずれか一つの方法。
196.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落195の方法。
197.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落195の方法。
198.CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落195の方法。
199.IMiDがFDA承認薬物である、段落195~198のいずれか一つの方法。
200.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落195~199のいずれか一つの方法。
201.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落161~193のいずれか一つの方法。
202.デグロンが、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている、段落161~201のいずれか一つの方法。
203.異種核酸が、デグロン融合キメラタンパク質をコードし、それにおいて、デグロン融合キメラタンパク質は、目的のタンパク質に融合されたデグロンを含む、異種核酸を発現するように操作されたアデノ随伴ウイルス(AAV)。
204.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより目的のタンパク質のユビキチン経路媒介性の分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落203の操作されたウイルス。
205.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落204の操作されたウイルス。
206.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落204の操作されたウイルス。
207.CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落204の操作されたウイルス。
208.IMiDがFDA承認薬物である、段落204~207のいずれか一つの操作されたウイルス。
209.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落204~208のいずれか一つの操作されたウイルス。
210.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落203の操作されたウイルス。
211.AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、段落203~210のいずれか一つの操作されたウイルス。
212.目的のタンパク質が治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落203~211のいずれか一つの操作されたウイルス。
213.異種核酸が、デグロン融合キメラタンパク質をコードし、それにおいて、デグロン融合キメラタンパク質は、目的のタンパク質に融合されたデグロンを含む、異種核酸を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター。
214.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより目的のタンパク質のユビキチン経路媒介性の分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落213のAAVベクター。
215.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落214のAAVベクター。
216.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落214のAAVベクター。
217.CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落214のAAVベクター。
218.IMiDがFDA承認薬物である、段落213~217のいずれか一つのAAVベクター。
219.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落213~218のいずれか一つのAAVベクター。
220.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落213のAAVベクター。
221.AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、段落213~220のいずれか一つのAAVベクター。
222.目的のタンパク質が治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落213~221のいずれか一つのAAVベクター。
223.段落203~212のいずれか一つの操作されたウイルス、又は段落213~222のいずれか一つのAAVベクター、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
224.段落203~212のいずれか一つの操作されたウイルス又は段落213~222のいずれか一つのAAVベクターを含む単離細胞。
225.それを必要とする対象に、段落203~212のいずれか一つの操作されたウイルス又は段落213~222のいずれか一つのAAVベクターを投与することを含む、インビボで調節されたタンパク質発現のための方法。
226.細胞を、段落203~212のいずれか一つの操作されたウイルス又は段落213~222のいずれか一つのAAVベクターと、操作されたウイルス又はAAVベクターの発現のために適切な条件下で接触させることを含む、タンパク質発現を調節するための方法。
以下の段落は、追加の列挙される実施形態を提供する。
1.プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含む操作された核酸であって、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつ
Dはデグロンを含み、
プロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつS-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、操作された核酸。
2.プロモーターが構成的プロモーターである、段落1の操作された核酸。
3.構成的プロモーターが、CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb、及びhUBIbからなる群から選択される、段落2の操作された核酸。
4.プロモーターが誘導性プロモーターである、段落1~3のいずれか一つの操作された核酸。
5.誘導性プロモーターが、minP、NFkB応答エレメント、CREB応答エレメント、NFAT応答エレメント、SRF応答エレメント1、SRF応答エレメント2、AP1応答エレメント、TCF-LEF応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答エレメント、SMAD結合エレメント、STAT3結合部位、minCMV、YB_TATA、minTK、誘導因子分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピートからなる群から選択される、段落4の操作された核酸。
6.プロモーターが合成プロモーターを含む、段落1~3のいずれか一つの操作された核酸。
7.プロモーターが組織特異的プロモーターである、段落1~3のいずれか一つの操作された核酸。
8.分泌性エフェクター分子がシグナルペプチドを含む、段落1~7のいずれか一つの操作された核酸。
9.シグナルペプチドが、分泌性エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む、段落8の操作された核酸。
10.シグナルペプチドが、分泌性エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む、段落8の操作された核酸。
11.非天然シグナルペプチドが、IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSFからなる群から選択される、段落10の操作された核酸。
12.分泌性エフェクター分子が治療クラスから選択され、治療クラスが、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落1~11のいずれか一つの操作された核酸。
13.サイトカインが、IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファからなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
14.ケモカインが、CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1からなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
15.ホーミング分子が、抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2からなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
16.成長因子が、FLT3L及びGM-CSFからなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
17.共活性化分子が、4-1BBL及びCD40Lからなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
18.腫瘍微小環境修飾因子が、アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2からなる群から選択される、段落12の操作された核酸。
19.TGFベータインヒビターが、抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、段落18の操作された核酸。
20.免疫チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落18の操作された核酸。
21.VEGFインヒビターが、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む、段落18の操作された核酸。
22.分泌性エフェクター分子がヒト由来エフェクター分子である、段落1~18のいずれか一つの操作された核酸。
23.プロテアーゼ切断部位が、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である、段落1~22のいずれか一つの操作された核酸。
24.細胞膜係留ドメインが膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む、段落1~23のいずれか一つの操作された核酸。
25.膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインが、PDGFR-ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する、段落24の操作された核酸。
26.細胞膜係留ドメインが細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む、段落1~23のいずれか一つの操作された核酸。
27.細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子が、細胞の細胞膜に係留される、段落1~26のいずれか一つの操作された核酸。
28.プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを発現する細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子が細胞膜から放出される、段落27の操作された核酸。
29.細胞膜上に発現されるプロテアーゼが、細胞に対して内因性である、段落28の操作された核酸。
30.プロテアーゼが、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択される、段落29の操作された核酸。
31.細胞膜上に発現されるプロテアーゼが、細胞に対して異種である、段落28の操作された核酸。
32.プロテアーゼがC型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である、段落31の操作された核酸。
33.プロテアーゼ切断部位がNS3プロテアーゼ切断部位を含む、段落32の操作された核酸。
34.NS3プロテアーゼ切断部位が、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合部切断部位を含む、段落33の操作された核酸。
35.プロテアーゼが、プロテアーゼインヒビターにより抑制され得る、段落28~34のいずれか一つの操作された核酸。
36.プロテアーゼインヒビターが、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される、段落35の操作された核酸。
37.プロテアーゼの発現が、調節が可能である、段落28~36のいずれか一つの操作された核酸。
38.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落1~37のいずれか一つの操作された核酸。
39.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落38の操作された核酸。
40.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落38の操作された核酸。
41. CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落38の操作された核酸。
42.IMiDがFDA承認薬物である、段落38~41のいずれか一つの操作された核酸。
43.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落38~42のいずれか一つの操作された核酸。
44.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落1~36のいずれか一つの操作された核酸。
45.デグロンが、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている、段落1~44のいずれか一つの操作された核酸。
46.操作された核酸が、DNA、cDNA、RNA、mRNA、及びネイキッドプラスミドからなる群から選択される、段落1~45のいずれか一つの操作された核酸。
47.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸を含む発現ベクター。
48.発現ベクターがウイルスベクターである、段落47の発現ベクター。
49.ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、段落48の発現ベクター。
50.N末端からC末端に配向された膜切断可能なキメラタンパク質であって、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dはデグロンを含み、かつ
S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、膜切断可能なキメラタンパク質。
51.分泌性エフェクター分子がシグナルペプチドを含む、段落50のキメラタンパク質。
52.シグナルペプチドが、分泌性エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む、段落51のキメラタンパク質。
53.シグナルペプチドが、分泌性エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む、段落51のキメラタンパク質。
54.非天然シグナルペプチドが、IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSFからなる群から選択される、段落53のキメラタンパク質。
55.分泌性エフェクター分子が治療クラスから選択され、治療クラスが、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落50~54のいずれか一つのキメラタンパク質。
56.サイトカインが、IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファからなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
57.ケモカインが、CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1からなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
58.ホーミング分子が、抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2からなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
59.成長因子が、FLT3L及びGM-CSFからなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
60.共活性化分子が、4-1BBL及びCD40Lからなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
61.腫瘍微小環境修飾因子が、アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2からなる群から選択される、段落55のキメラタンパク質。
62.TGFベータインヒビターが、抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、段落61のキメラタンパク質。
63.免疫チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落61のキメラタンパク質。
64.VEGFインヒビターが、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む、段落61のキメラタンパク質。
65.分泌性エフェクター分子がヒト由来エフェクター分子である、段落50~61のいずれか一つのキメラタンパク質。
66.プロテアーゼ切断部位が、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である、段落50~65のいずれか一つのキメラタンパク質。
67.細胞膜係留ドメインが膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む、段落50~66のいずれか一つのキメラタンパク質。
68.膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインが、PDGFR-ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する、段落67のキメラタンパク質。
69.細胞膜係留ドメインが細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む、段落50~66のいずれか一つのキメラタンパク質。
70.細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子が、細胞の細胞膜に係留される、段落50~69のいずれか一つのキメラタンパク質。
71.プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを発現する細胞中で発現された場合、分泌性エフェクター分子が細胞膜から放出される、段落70のキメラタンパク質。
72.細胞膜上に発現されるプロテアーゼが、細胞に対して内因性である、段落71のキメラタンパク質。
73.プロテアーゼが、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択される、段落72のキメラタンパク質。
74.細胞膜上に発現されるプロテアーゼが、細胞に対して異種である、段落71のキメラタンパク質。
75.プロテアーゼがC型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である、段落74のキメラタンパク質。
76.プロテアーゼ切断部位がNS3プロテアーゼ切断部位を含む、段落75のキメラタンパク質。
77.NS3プロテアーゼ切断部位がNS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合部切断部位を含む、段落76のキメラタンパク質。
78.プロテアーゼが、プロテアーゼインヒビターにより抑制され得る、段落71~77のいずれか一つのキメラタンパク質。
79.プロテアーゼインヒビターが、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される、段落78のキメラタンパク質。
80.プロテアーゼがデグロンをさらに含む、段落71~79のいずれか一つのキメラタンパク質。
81.プロテアーゼの発現が調節が可能である、段落71~80のいずれか一つのキメラタンパク質。
82.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落50~81のキメラタンパク質。
83.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落82のキメラタンパク質。
84.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落82のキメラタンパク質。
85.CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落82のキメラタンパク質。
86.IMiDがFDA承認薬物である、段落82~85のいずれか一つのキメラタンパク質。
87.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落82~86のいずれか一つのキメラタンパク質。
88.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落50~80のいずれか一つのキメラタンパク質。
89.デグロンが、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている、段落50~88のいずれか一つのキメラタンパク質。
90.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸、又は段落47~49のいずれか一つの発現ベクター、又は段落50~89のいずれか一つの膜切断可能なキメラタンパク質、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
91.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸、又は段落47~49のいずれか一つの発現ベクター、又は段落50~89のいずれか一つの膜切断可能なキメラタンパク質を含む単離細胞。
92.操作された核酸を含む単離細胞であって、操作された核酸は、プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含み、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつ
Dはデグロンを含み、
プロモーターは、外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつS-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、単離細胞。
93.操作された核酸を組換え発現させる、段落91又は段落92の単離細胞。
94.操作された核酸を、ベクター又は細胞のゲノムからの選択された遺伝子座から発現させる、段落91~93のいずれか一つの単離細胞。
95.N末端からC末端に配向された膜切断可能なキメラタンパク質が、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dはデグロンを含み、かつ
ならびにS-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、膜切断可能なキメラタンパク質を含む単離細胞。
96.細胞が、T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマデルタT細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、調節性T細胞、ウイルス特異的T細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞(ESC)、ESC由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞(MSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、及びiPSC由来細胞からなる群から選択される、段落91~95のいずれか一つの単離細胞。
97.細胞が自家である、段落91~96のいずれか一つの単離細胞。
98.細胞が同種である、段落91~96のいずれか一つの単離細胞。
99.細胞が、膀胱腫瘍細胞、脳腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、子宮頸部腫瘍細胞、結腸直腸腫瘍細胞、食道腫瘍細胞、神経膠腫細胞、腎臓腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、メラノーマ細胞、卵巣腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、及び子宮腫瘍細胞からなる群から選択される腫瘍細胞である、段落91~95のいずれか一つの単離細胞。
100.細胞が、腫瘍溶解性ウイルスでの形質導入を介して操作された、段落99の単離細胞。
101.腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス、腫瘍溶解性インディアナベシクロウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性ポリオウイルス、腫瘍溶解性粘液腫ウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性マラバウイルス、腫瘍溶解性狂犬病ウイルス、腫瘍溶解性ロタウイルス、腫瘍溶解性肝炎ウイルス、腫瘍溶解性ルベラウイルス、腫瘍溶解性デングウイルス、腫瘍溶解性チクングニアウイルス、腫瘍溶解性呼吸器合胞体ウイルス、腫瘍溶解性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、腫瘍溶解性モルビリウイルス、腫瘍溶解性レンチウイルス、腫瘍溶解性複製レトロウイルス、腫瘍溶解性ラブドウイルス、腫瘍溶解性セネカバレーウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、及びそれらの任意のバリアント又は誘導体からなる群から選択される、段落100の単離細胞。
102.腫瘍溶解性ウイルスが、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性ウイルスである、段落100又は段落101の単離細胞。
103.細胞が、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼをさらに含む、段落91~102のいずれか一つの単離細胞。
104.プロテアーゼが内因性プロテアーゼである、段落103の単離細胞。
105.内因性プロテアーゼが、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択される、段落104の単離細胞。
106.プロテアーゼが異種プロテアーゼである、段落103の単離細胞。
107.異種プロテアーゼがC型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である、段落106の単離細胞。
108.プロテアーゼが、細胞の細胞膜上に発現される、実施形態103~107のいずれか一つの単離細胞。
109.プロテアーゼが、プロテアーゼ切断部位を切断することが可能である、段落108の単離細胞。
110.プロテアーゼ切断部位の切断によって、細胞の細胞膜から分泌性エフェクター分子が放出される、段落109の単離細胞。
111.細胞が抗原認識受容体をさらに含む、段落91~110のいずれか一つの単離細胞。
112.抗原認識受容体が、5T4、ADAM9、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、カドヘリン3、カドヘリン6、CCR4、CD123、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD30、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CEA、CEACAM5、クローディン18.2、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、ENPP3、EpCAM、EphA2、エフリンA4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRアルファ、FRb、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、インテグリンaV、KIT、L1CAM、LAMP1、ルイスY、LeY、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、メソテリン、MUC1、MUC16、MUC1C、NaPi2B、ネクチン4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、オバリン、Pカドヘリン、pan-Erb2、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLITRK6、SSTR2、STEAP1、サバイビン、TDGF1、TIM1、TROP2、及びWT1からなる群から選択される抗原を認識する、段落111の単離細胞。
113.抗原認識受容体が抗原結合ドメインを含む、段落111又は段落112の単離細胞。
114.抗原結合ドメインが、抗体、抗体の抗原結合断片、F(ab)断片、F(ab’)断片、一本鎖可変断片(scFv)、又は単一ドメイン抗体(sdAb)を含む、段落113の単離細胞。
115.抗原結合ドメインが一本鎖可変断片(scFv)を含む、段落113の単離細胞。
116.scFvが、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、段落115の単離細胞。
117.VH及びVLが、ペプチドリンカーにより分離される、段落116の単離細胞。
118.scFvが、構造VH-L-VL又はVL-L-VHを含み、VHが重鎖可変ドメインであり、Lがペプチドリンカーであり、VLが軽鎖可変ドメインである、段落117の単離細胞。
119.抗原認識受容体がキメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)である、段落111~118のいずれか一つの単離細胞。
120.抗原認識受容体がCARである、段落111~118のいずれか一つの単離細胞。
121.CARが一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3ゼータ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、CD97細胞内シグナル伝達ドメイン、CD11a-CD18細胞内シグナル伝達ドメイン、CD2細胞内シグナル伝達ドメイン、ICOS細胞内シグナル伝達ドメイン、CD27細胞内シグナル伝達ドメイン、CD154細胞内シグナル伝達ドメイン、CD8細胞内シグナル伝達ドメイン、OX40細胞内シグナル伝達ドメイン、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD28細胞内シグナル伝達ドメイン、ZAP40細胞内シグナル伝達ドメイン、CD30細胞内シグナル伝達ドメイン、GITR細胞内シグナル伝達ドメイン、HVEM細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP10細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP12細胞内シグナル伝達ドメイン、及びMyD88細胞内シグナル伝達ドメインからなる群から選択される、段落120の単離細胞。
122.CARが膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、OX40膜貫通ドメイン、ICOS膜貫通ドメイン、CTLA-4膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、LAG-3膜貫通ドメイン、2B4膜貫通ドメイン、及びBTLA膜貫通ドメインからなる群から選択される、段落120又は段落121の単離細胞。
123.CARが、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサー領域を含む、段落120~122のいずれか一つの単離細胞。
124.段落91~123のいずれか一つの単離細胞、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
125.段落91~123のいずれか一つの単離細胞又は段落124の組成物のいずれかの治療有効用量を投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法。
126.単離細胞が対象から由来する、段落125の方法。
127.単離細胞が、対象に関して同種である、段落125又は段落126の方法。
128.方法が、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む、段落125~127のいずれか一つの方法。
129.チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落128の方法。
130.方法が、抗CD40抗体を投与することをさらに含む、段落125~129のいずれか一つの方法。
131.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸、又は段落47~49のいずれか一つの発現ベクター、又は段落50~89のいずれか一つの膜切断可能なキメラタンパク質を含む脂質ベースの構造体。
132.脂質ベースの構造体が、細胞外小胞を含む、段落131の脂質ベースの構造体。
133.細胞外小胞が、ナノ小胞及びエキソソームからなる群から選択される、段落132の脂質ベースの構造体。
134.脂質ベースの構造体が、脂質ナノ粒子又はミセルを含む、段落131の脂質ベースの構造体。
135.脂質ベースの構造体が、リポソームを含む、段落131の脂質ベースの構造体。
136.段落131~135のいずれか一つの脂質ベースの構造体、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
137.段落131~135のいずれか一つの治療有効用量の脂質ベースの構造体のいずれか又は段落136の組成物を投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法。
138.投与することが全身投与を含む、段落137の方法。
139.脂質ベースの構造体によって、対象において細胞を操作することが可能である、段落137又は段落138の方法。
140.方法が、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む、段落137~139のいずれか一つの方法。
141.チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落140の方法。
142.方法が、抗CD40抗体を投与することをさらに含む、段落137~141のいずれか一つの方法。
143.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸又は段落50~89のいずれか一つの膜切断可能なキメラタンパク質を含むナノ粒子。
144.ナノ粒子が無機材料を含む、段落143のナノ粒子。
145.段落143又は段落144のナノ粒子を含む組成物。
146.段落143もしくは段落144のナノ粒子のいずれか、又は段落145の組成物の治療有効用量を投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法。
147.投与することが全身投与を含む、段落146の方法。
148.ナノ粒子によって、対象において細胞を操作することが可能である、段落146又は段落147の方法。
149.方法が、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む、段落146~148のいずれか一つの方法。
150.チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落149の方法。
151.方法が、抗CD40抗体を投与することをさらに含む、段落146~150のいずれか一つの方法。
152.段落1~46のいずれか一つの操作された核酸、又は段落47~49のいずれか一つの発現ベクターを含むように操作されたウイルス。
153.ウイルスが、レンチウイルス、レトロウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、及びウイルス様粒子(VLP)からなる群から選択される、段落152の操作されたウイルス。
154.段落152又は段落153の操作されたウイルス、及び医薬的に許容可能な担体を含む組成物。
155.段落152もしくは段落153の操作されたウイルス、又は段落154の組成物の治療有効用量を投与することを含む、治療を必要とする対象を治療する方法。
156.投与することが全身投与を含む、段落155の方法。
157.操作されたウイルスが、対象において細胞に感染し、発現カセットを発現する、段落155又は段落156の方法。
158.方法が、チェックポイントインヒビターを投与することをさらに含む、段落155~157のいずれか一つの方法。
159.チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落158の方法。
160.方法が、抗CD40抗体を投与することをさらに含む、段落155~159のいずれか一つの方法。
161.膜係留エフェクター分子の放出を誘導する方法であって、
a)細胞を提供すること、それにおいて、細胞は、膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質を含み、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sはエフェクター分子を含み、
Cは同族膜結合プロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dはデグロンを含み、かつ
S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成され;ならびに
b)膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質の発現のために適切な条件下で細胞を培養すること、
それにおいて、発現時に、膜切断可能なキメラタンパク質は、細胞の細胞膜に係留され、かつ
それにおいて、発現時に、膜結合プロテアーゼは、膜切断可能なキメラタンパク質の同族膜結合プロテアーゼ切断部位を切断し、それにより、エフェクター分子を細胞膜から放出する、ことを含む方法。
162.デグロンが薬物誘導性デグロンである、段落161の方法。
163.細胞に、デグロンを誘導する薬物を接触させることをさらに含む、段落162の方法。
164.デグロンの誘導によって、膜切断可能なキメラタンパク質が分解される、段落163の方法。
165.膜係留エフェクター分子を分解する方法であって、
a)細胞を提供すること、それにおいて、細胞は、膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質を含み、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sはエフェクター分子を含み、
Cは同族膜結合プロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dは薬物誘導性デグロンを含み、かつ
S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成され;
b)膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質の発現のために適切な条件下で前記細胞を培養すること、それにおいて、発現時に、膜切断可能なキメラタンパク質が、細胞の前記細胞膜に係留され;ならびに
c)細胞を薬物と接触させることによりデグロンを誘導すること、それにおいて、デグロンのデグロン誘導によって、膜切断可能なキメラタンパク質が分解される、方法。
166.エフェクター分子がシグナルペプチドを含む、段落161~165のいずれか一つの方法。
167.シグナルペプチドが、エフェクター分子に対して天然である天然シグナルペプチドを含む、段落166の方法。
168.シグナルペプチドが、エフェクター分子に対して非天然である非天然シグナルペプチドを含む、段落166の方法。
169.非天然シグナルペプチドが、IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSFからなる群から選択される、段落168の方法。
170.エフェクター分子が治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落161~169のいずれか一つの方法。
171.サイトカインが、IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファからなる群から選択される、段落170の方法。
172.ケモカインが、CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1からなる群から選択される、段落170の方法。
173.ホーミング分子が、抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2からなる群から選択される、段落170の方法。
174.成長因子が、FLT3L及びGM-CSFからなる群から選択される、段落170の方法。
175.共活性化分子が、4-1BBL及びCD40Lからなる群から選択される、段落170の方法。
176.腫瘍微小環境修飾因子が、アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2からなる群から選択される、段落170の方法。
177.TGFベータインヒビターが、抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、段落176の方法。
178.免疫チェックポイントインヒビターが、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択される、段落176の方法。
179.VEGFインヒビターが、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む、段落176の方法。
180.エフェクター分子がヒト由来エフェクター分子である、段落161~175のいずれか一つの方法。
181.同族プロテアーゼ切断部位が、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能である、段落161~180のいずれか一つの方法。
182.細胞膜係留ドメインが膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含む、段落161~181のいずれか一つの方法。
183.膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインが、PDGFR-ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来する、段落182の方法。
184.細胞膜係留ドメインが、細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含む、段落161~181のいずれか一つの方法。
185.プロテアーゼが、細胞に対して内因性である、段落161~184のいずれか一つの方法。
186.プロテアーゼが、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択される、段落185の方法。
187.プロテアーゼが、細胞に対して異種である、段落161~184のいずれか一つの方法。
188.プロテアーゼが、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)である、段落187の方法。
189.プロテアーゼ切断部位が、NS3プロテアーゼ切断部位を含む、段落188の方法。
190.NS3プロテアーゼ切断部位が、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合部切断部位を含む、段落189の方法。
191.プロテアーゼが、プロテアーゼインヒビターにより抑制され得る、段落161~190のいずれか一つの方法。
192.プロテアーゼインヒビターが、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択される、段落191の方法。
193.プロテアーゼがデグロンをさらに含む、段落161~192のいずれか一つの方法。
194.プロテアーゼの発現が、調節が可能である、段落161~193のいずれか一つの方法。
195.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落161~194のいずれか一つの方法。
196.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落195の方法。
197.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落195の方法。
198.CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落195の方法。
199.IMiDがFDA承認薬物である、段落195~198のいずれか一つの方法。
200.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落195~199のいずれか一つの方法。
201.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落161~193のいずれか一つの方法。
202.デグロンが、細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている、段落161~201のいずれか一つの方法。
203.異種核酸が、デグロン融合キメラタンパク質をコードし、それにおいて、デグロン融合キメラタンパク質は、目的のタンパク質に融合されたデグロンを含む、異種核酸を発現するように操作されたアデノ随伴ウイルス(AAV)。
204.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより目的のタンパク質のユビキチン経路媒介性の分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落203の操作されたウイルス。
205.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落204の操作されたウイルス。
206.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落204の操作されたウイルス。
207.CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落204の操作されたウイルス。
208.IMiDがFDA承認薬物である、段落204~207のいずれか一つの操作されたウイルス。
209.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落204~208のいずれか一つの操作されたウイルス。
210.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落203の操作されたウイルス。
211.AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、段落203~210のいずれか一つの操作されたウイルス。
212.目的のタンパク質が治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落203~211のいずれか一つの操作されたウイルス。
213.異種核酸が、デグロン融合キメラタンパク質をコードし、それにおいて、デグロン融合キメラタンパク質は、目的のタンパク質に融合されたデグロンを含む、異種核酸を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター。
214.免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより目的のタンパク質のユビキチン経路媒介性の分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、デグロンが含む、段落213のAAVベクター。
215.CRBNポリペプチド基質ドメインが、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択される、段落214のAAVベクター。
216.CRBNポリペプチド基質ドメインが、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物である、段落214のAAVベクター。
217.CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物である、段落214のAAVベクター。
218.IMiDがFDA承認薬物である、段落213~217のいずれか一つのAAVベクター。
219.IMiDが、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択される、段落213~218のいずれか一つのAAVベクター。
220.デグロンが、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択される、段落213のAAVベクター。
221.AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV.Rh10、AAV11、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、段落213~220のいずれか一つのAAVベクター。
222.目的のタンパク質が治療クラスから選択され、それにおいて、治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ポリヌクレオチド、ペプチド、及び酵素からなる群から選択される、段落213~221のいずれか一つのAAVベクター。
223.段落203~212のいずれか一つの操作されたウイルス、又は段落213~222のいずれか一つのAAVベクター、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
224.段落203~212のいずれか一つの操作されたウイルス又は段落213~222のいずれか一つのAAVベクターを含む単離細胞。
225.それを必要とする対象に、段落203~212のいずれか一つの操作されたウイルス又は段落213~222のいずれか一つのAAVベクターを投与することを含む、インビボで調節されたタンパク質発現のための方法。
226.細胞を、段落203~212のいずれか一つの操作されたウイルス又は段落213~222のいずれか一つのAAVベクターと、操作されたウイルス又はAAVベクターの発現のために適切な条件下で接触させることを含む、タンパク質発現を調節するための方法。
以下は、本開示を行うための特定の実施形態の実施例である。実施例は、例証的な目的のみのために与えられており、任意の方法において本発明の範囲を限定することを意図しない。例えば、以下に記載及び実施される実験によって、ペイロード(例、エフェクター分子)を分泌するように細胞を操作すること、及びそれらの細胞を送達して腫瘍に対する免疫原性応答を誘導することの一般的な有用性が実証される。具体的には、以下に記載される実施例は、本明細書中に記載される様々なエフェクター分子を分泌する操作された間葉系幹細胞(MSC)の送達を通じた、腫瘍に対する免疫原性応答を誘導する能力を実証する。MSCの使用は、本明細書中に記載される細胞を操作することに関する、本発明の範囲を限定することを意図しない。
努力が、使用される数(例、量、温度など)に関する正確さを確実にするためになされてきたが、しかし、一部の実験誤差及び偏差が、無論、許容されるべきである。
実施例1-デグロンドメイン単独によって、分泌は調節されない。
デグロンドメインの付着を通じて分子の分泌を調節する能力を評価した。
デグロンドメインの付着を通じて分子の分泌を調節する能力を評価した。
方法
一連のpL17dベースのウイルスベクター構築物が、表6B中に列挙される配列を伴う表6A中に記載されるように、様々なリンカーを使用して、デグロン(d913スーパーデグロン)に融合された分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)を使用して生成された。d913スーパーデグロンが、国際出願公開 WO2019/089592Al号においてより詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
一連のpL17dベースのウイルスベクター構築物が、表6B中に列挙される配列を伴う表6A中に記載されるように、様々なリンカーを使用して、デグロン(d913スーパーデグロン)に融合された分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)を使用して生成された。d913スーパーデグロンが、国際出願公開 WO2019/089592Al号においてより詳細に記載されており、全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れられる。
SEAPアッセイを、QuantiBlueキット(Invivogen;rep-qb1)を使用して実施した。HEK293Ft細胞において実施された実験については、以下のプロトコールに従った:
- 細胞を2e5細胞/ウェルで12ウェルプレート中に0日目に播種した。
- 1日目に、細胞に300K GS単位のウイルスで形質導入した。
- 2日目に、細胞を6ウェルプレート+/-1μMレナリドミド中の2つのウェル中に分割した。
- 4日目に、細胞を継代し、レナリドミド処理を継続した。
- 7日目に、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invivogen)で1時間にわたり37℃でインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で、655nmで読み取った(細胞は接着性であるため、培地からペレット化する必要はない)。
- 細胞を2e5細胞/ウェルで12ウェルプレート中に0日目に播種した。
- 1日目に、細胞に300K GS単位のウイルスで形質導入した。
- 2日目に、細胞を6ウェルプレート+/-1μMレナリドミド中の2つのウェル中に分割した。
- 4日目に、細胞を継代し、レナリドミド処理を継続した。
- 7日目に、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invivogen)で1時間にわたり37℃でインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で、655nmで読み取った(細胞は接着性であるため、培地からペレット化する必要はない)。
ドナー由来T細胞において実施された実験については、以下のプロトコールに従った:
- T細胞を、抗CD4及び抗CD8磁気ビーズを使用して、Miltenyi Biotec CliniMACS Prodigy機器上で標的1:1の比率で、白血球アフェレーシス材料から濃縮した。CliniMACS Prodigyでは、多くの異なる細胞型について、閉鎖系の使い捨て使い捨てキットが利用される。自動プログラムによって、血小板洗浄、CD4+&CD8+ビーズ標識、及び磁石上でのポジティブ選択が実施され、高純度を伴う細胞懸濁液がもたらされる。ポジティブ選択されたT細胞を次にサンプリングし、フローサイトメトリーを介して細胞表面表現型について分析し、制御速度の冷凍庫を介して凍結保存した。
- 細胞を次に解凍し、0日目に活性化した(24ウェルプレート中の1e6細胞/mLを、CD3/CD28Dynabeadsで3:1活性化した)。
- 1日目に、100K GS単位のウイルスを細胞に加えた。
- 2日目に、新鮮な培地をT細胞に加えた。
- 4日目に、各ウェルを、+/-1μMのレナリドミドを伴う6ウェルプレートの2ウェル中に分割した。
- 7日目に、細胞をペレット化し、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invitrogen)と37度で1時間にわたりインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で、655nmで読み取った。
- T細胞を、抗CD4及び抗CD8磁気ビーズを使用して、Miltenyi Biotec CliniMACS Prodigy機器上で標的1:1の比率で、白血球アフェレーシス材料から濃縮した。CliniMACS Prodigyでは、多くの異なる細胞型について、閉鎖系の使い捨て使い捨てキットが利用される。自動プログラムによって、血小板洗浄、CD4+&CD8+ビーズ標識、及び磁石上でのポジティブ選択が実施され、高純度を伴う細胞懸濁液がもたらされる。ポジティブ選択されたT細胞を次にサンプリングし、フローサイトメトリーを介して細胞表面表現型について分析し、制御速度の冷凍庫を介して凍結保存した。
- 細胞を次に解凍し、0日目に活性化した(24ウェルプレート中の1e6細胞/mLを、CD3/CD28Dynabeadsで3:1活性化した)。
- 1日目に、100K GS単位のウイルスを細胞に加えた。
- 2日目に、新鮮な培地をT細胞に加えた。
- 4日目に、各ウェルを、+/-1μMのレナリドミドを伴う6ウェルプレートの2ウェル中に分割した。
- 7日目に、細胞をペレット化し、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invitrogen)と37度で1時間にわたりインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で、655nmで読み取った。
結果
SEAPアッセイを、条件付けされた培地(細胞を含まない)中の分泌SEAP活性を評価することを通じて、分子の分泌を調節するデグロンドメインの能力の有効性をテストするように設計した。CRBNベースのデグロン系が使用されたが、それにおいて、レナリドミド依存的分解が、膜関連タンパク質の調節された分解において示されている(WO2019/089592Al)。図1中に示すように、SEAP酵素活性を、HEK293Ft細胞(左パネル)及びドナー由来T細胞(右パネル)の両方からの上清中で決定した。SEAP酵素活性を、「オン」(レナリドミドなし)に対する「オフ」(+レナリドミド)のパーセンテージとして定量化し、表7A(HEK)及び表7B(T細胞)中に提示した。加えて、SEAP酵素活性の定量化を、また、SEAP吸光度を、ウェル当たりの細胞カウント(Countessから)により割ることにより、細胞数に対して標準化した。表7A及び表7Bを参照のこと。注目すべきことに、レナリドミドの添加によって、テストされた構築物のいずれにおいてもSEAPの低下分泌はもたらされなかった。結果は、デグロンドメイン単独を分泌分子に加えることによって、薬物依存的分解/調節が可能にならないことを示す。
SEAPアッセイを、条件付けされた培地(細胞を含まない)中の分泌SEAP活性を評価することを通じて、分子の分泌を調節するデグロンドメインの能力の有効性をテストするように設計した。CRBNベースのデグロン系が使用されたが、それにおいて、レナリドミド依存的分解が、膜関連タンパク質の調節された分解において示されている(WO2019/089592Al)。図1中に示すように、SEAP酵素活性を、HEK293Ft細胞(左パネル)及びドナー由来T細胞(右パネル)の両方からの上清中で決定した。SEAP酵素活性を、「オン」(レナリドミドなし)に対する「オフ」(+レナリドミド)のパーセンテージとして定量化し、表7A(HEK)及び表7B(T細胞)中に提示した。加えて、SEAP酵素活性の定量化を、また、SEAP吸光度を、ウェル当たりの細胞カウント(Countessから)により割ることにより、細胞数に対して標準化した。表7A及び表7Bを参照のこと。注目すべきことに、レナリドミドの添加によって、テストされた構築物のいずれにおいてもSEAPの低下分泌はもたらされなかった。結果は、デグロンドメイン単独を分泌分子に加えることによって、薬物依存的分解/調節が可能にならないことを示す。
実施例2-膜切断可能なデグロン系
切断可能な膜係留ドメインと併せたデグロンドメインの付着を通じた分子の分泌を調節する能力を評価した。
切断可能な膜係留ドメインと併せたデグロンドメインの付着を通じた分子の分泌を調節する能力を評価した。
方法
一連のpL17dベースのウイルスベクター構築物が、表8B中に列挙される配列を伴う表8A中に記載されるように、リンカーを含む膜貫通ドメインを含む様々なリンカーを使用して、デグロン(d913スーパーデグロン)に融合された分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)を使用して生成された。
一連のpL17dベースのウイルスベクター構築物が、表8B中に列挙される配列を伴う表8A中に記載されるように、リンカーを含む膜貫通ドメインを含む様々なリンカーを使用して、デグロン(d913スーパーデグロン)に融合された分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)を使用して生成された。
SEAPアッセイを、QuantiBlueキット(Invivogen;rep-qb1)を使用して実施した。HEK293Ft細胞において実施された実験については、以下のプロトコールに従った:
- 細胞を1e5細胞/ウェルで24ウェルプレート中に0日目に播種した。
- 1日目に、細胞に100K GS単位のウイルスで形質導入した。
- 2日目に、細胞を12ウェルプレート+/-1μMレナリドミド中の2ウェル中に分割した。
- 4日目に、細胞を三通りに、24ウェルプレート中に継代し、レナリドミド処理を継続した。
- 7日目に、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invivogen)で1時間にわたり37℃でインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で、655nmで読み取った(細胞は接着性であるため、培地からペレット化する必要はない)。
- 細胞を1e5細胞/ウェルで24ウェルプレート中に0日目に播種した。
- 1日目に、細胞に100K GS単位のウイルスで形質導入した。
- 2日目に、細胞を12ウェルプレート+/-1μMレナリドミド中の2ウェル中に分割した。
- 4日目に、細胞を三通りに、24ウェルプレート中に継代し、レナリドミド処理を継続した。
- 7日目に、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invivogen)で1時間にわたり37℃でインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で、655nmで読み取った(細胞は接着性であるため、培地からペレット化する必要はない)。
ドナー由来T細胞において実施された実験については、以下のプロトコールに従った:
- T細胞を、抗CD4及び抗CD8磁気ビーズを使用して、Miltenyi Biotec CliniMACS Prodigy機器上で標的1:1の比率で、白血球アフェレーシス材料から濃縮した。CliniMACS Prodigyでは、多くの異なる細胞型について、閉鎖系の使い捨て使い捨てキットが利用される。自動プログラムによって、血小板洗浄、CD4+&CD8+ビーズ標識、及び磁石上でのポジティブ選択が実施され、高純度を伴う細胞懸濁液がもたらされる。ポジティブ選択されたT細胞を次にサンプリングし、フローサイトメトリーを介して細胞表面表現型について分析し、制御速度の冷凍庫を介して凍結保存した。
- 細胞を次に解凍し、0日目に活性化した(24ウェルプレート中の1e6細胞/mLを、CD3/CD28Dynabeadsで3:1活性化した)。
- 1日目に、100K GS単位のウイルスを細胞に加えた。
- 2日目に、新鮮な培地をT細胞に加えた。
- 4日目に、各ウェルを、+/- 1μMのレナリドミドを伴う48ウェルプレートの6ウェル中に分割した(薬物を伴う3ウェル、伴わない3ウェル)。
- 7日目に、細胞をペレット化し、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invitrogen)と37度で1時間にわたりインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で、655nmで読み取った。
- T細胞を、抗CD4及び抗CD8磁気ビーズを使用して、Miltenyi Biotec CliniMACS Prodigy機器上で標的1:1の比率で、白血球アフェレーシス材料から濃縮した。CliniMACS Prodigyでは、多くの異なる細胞型について、閉鎖系の使い捨て使い捨てキットが利用される。自動プログラムによって、血小板洗浄、CD4+&CD8+ビーズ標識、及び磁石上でのポジティブ選択が実施され、高純度を伴う細胞懸濁液がもたらされる。ポジティブ選択されたT細胞を次にサンプリングし、フローサイトメトリーを介して細胞表面表現型について分析し、制御速度の冷凍庫を介して凍結保存した。
- 細胞を次に解凍し、0日目に活性化した(24ウェルプレート中の1e6細胞/mLを、CD3/CD28Dynabeadsで3:1活性化した)。
- 1日目に、100K GS単位のウイルスを細胞に加えた。
- 2日目に、新鮮な培地をT細胞に加えた。
- 4日目に、各ウェルを、+/- 1μMのレナリドミドを伴う48ウェルプレートの6ウェル中に分割した(薬物を伴う3ウェル、伴わない3ウェル)。
- 7日目に、細胞をペレット化し、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invitrogen)と37度で1時間にわたりインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で、655nmで読み取った。
結果
分子の分泌を調節するために、デグロンドメインと切断可能な膜結合ドメインを組み合わせることを評価した。一般的に、この系(「膜切断可能デグロン」系として言及される)では、式S-C-MT-D(N末端からC末端に配向)を有するキメラタンパク質が使用され、それにおいて、Sは分泌性ペイロード(例、エフェクター分子)を指し、Cはプロテアーゼ切断部位を指し、MTは細胞膜係留ドメインを指し、及びDはデグロンを指す。図2は、切断可能な膜係留ドメイン(例、PDGFRb膜貫通ドメインに融合されたADAM10/17切断部位)がペイロードとデグロンドメインの間に挿入されている、所望のペイロードがキメラタンパク質として発現される代表的な膜切断可能なデグロン系を例証する。
分子の分泌を調節するために、デグロンドメインと切断可能な膜結合ドメインを組み合わせることを評価した。一般的に、この系(「膜切断可能デグロン」系として言及される)では、式S-C-MT-D(N末端からC末端に配向)を有するキメラタンパク質が使用され、それにおいて、Sは分泌性ペイロード(例、エフェクター分子)を指し、Cはプロテアーゼ切断部位を指し、MTは細胞膜係留ドメインを指し、及びDはデグロンを指す。図2は、切断可能な膜係留ドメイン(例、PDGFRb膜貫通ドメインに融合されたADAM10/17切断部位)がペイロードとデグロンドメインの間に挿入されている、所望のペイロードがキメラタンパク質として発現される代表的な膜切断可能なデグロン系を例証する。
SEAPアッセイを、条件付けされた培地(細胞を含まない)中の分泌SEAP活性を評価することを通じて、膜切断可能なデグロン系の有効性をテストするように設計した。テストされた構築物についてのドメインを以下に概説する:
SB01208(D-MT-C-S配向):
-SはSEAPである。
-CはADAM10/17切断部位である。
-MTはII型膜貫通ドメイン(ヒトFasL)である。
-DはCRBNベースのデグロン(d913)である。
SB01209(S-C-MT-D配向):
-SはSEAPである。
-CはADAM10/17切断部位である。
-MTはPDGFRb膜貫通ドメインである。
-DはCRBNベースのデグロン(d913)である。
SB01208(D-MT-C-S配向):
-SはSEAPである。
-CはADAM10/17切断部位である。
-MTはII型膜貫通ドメイン(ヒトFasL)である。
-DはCRBNベースのデグロン(d913)である。
SB01209(S-C-MT-D配向):
-SはSEAPである。
-CはADAM10/17切断部位である。
-MTはPDGFRb膜貫通ドメインである。
-DはCRBNベースのデグロン(d913)である。
図3中に示すように、SEAP酵素活性を、HEK293Ft細胞(「HEK293T」)及びドナー由来T細胞(「T細胞」)の両方からの上清中で決定した。SEAP酵素活性を、「オン」(レナリドミドなし)に対する「オフ」(+レナリドミド)のパーセンテージとして定量化し、表9A(HEK)及び表9B(T細胞)中に提示する。SEAP分泌が、S-C-MT-D配向を有する膜切断可能なデグロン構築物(「1209」)についてのHEK293Ft細胞及びドナー由来T細胞におけるレナリドミドの添加時に低下した。図4中に示し、表9A中で定量化しているように、SEAP酵素活性を、また、HEK293Ft細胞における細胞数に対して標準化した。標準化を、SEAP吸光度をウェル当たりの細胞カウント(Countessから)で割ることにより実施した。SEAP分泌を、HEK293Ft細胞において、デグロンを伴わない構築物(「419」)についてのSEAP活性と比べて、S-C-MT-D配向構築物(1209)について、レナリドミド依存的に低下させた。この結果は、膜係留SEAPの分解が、免疫調節薬物(IMiD)レナリドミドの存在において生じたことを示唆する。配向D-MT-C-S(「1208」)を有する膜切断可能なデグロン構築物によって、SEAPの機能的分泌はもたらされなかった。結果は、S-C-MT-D配向におけるキメラタンパク質を使用した膜切断可能なデグロン系によって、分泌分子の薬物依存的分解/調節が可能となることを示す。
実施例3-Jurkatにおける膜切断可能なデグロン系
膜切断可能なデグロン系をJurkat T細胞株においてさらに評価した。
膜切断可能なデグロン系をJurkat T細胞株においてさらに評価した。
方法
ウイルスベクター構築物を、上に記載するように、リンカーを含む膜貫通ドメインを含む、様々なリンカーを伴うデグロン(d913スーパーデグロン)に融合された分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)を使用して生成した。調べた構築物を表10中に記載する。
ウイルスベクター構築物を、上に記載するように、リンカーを含む膜貫通ドメインを含む、様々なリンカーを伴うデグロン(d913スーパーデグロン)に融合された分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)を使用して生成した。調べた構築物を表10中に記載する。
SEAPアッセイを、QuantiBlueキット(Invivogen;rep-qb1)を使用して実施した。Jurkat細胞において実施された実験については、以下のプロトコールに従った:
- 1日目に、細胞を1mL中の1e6細胞で24ウェルプレート中に播種し、300k GS単位のウイルスを加えた。
- 3日目に、細胞を48ウェルプレートの6つのウェル中に分割し(0.5mL中の1e5細胞)、薬物をこれらのウェルの3つに加えた(1Mレナリドミド)。
- 6日目に、細胞をペレット化し、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invitrogen)と37度で1時間にわたりインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で655nmで読み取った。
- 1日目に、細胞を1mL中の1e6細胞で24ウェルプレート中に播種し、300k GS単位のウイルスを加えた。
- 3日目に、細胞を48ウェルプレートの6つのウェル中に分割し(0.5mL中の1e5細胞)、薬物をこれらのウェルの3つに加えた(1Mレナリドミド)。
- 6日目に、細胞をペレット化し、各ウェルからの20uLの上清を回収し、180uLのQuantiBlue(Invitrogen)と37度で1時間にわたりインキュベートし、SEAP活性をプレートリーダー上で655nmで読み取った。
結果
膜切断可能なデグロン系を、SEAP活性アッセイを使用して、Jurkat T細胞株においてさらに評価した。テストされた構築物は、デグロンなし(「419」)、様々なリンカーのみを伴うC末端デグロン(「1118」、「1141」、「1143」、「1144」)、感染対照として使用される無関係なウイルス構築物(「1321」)を有した、又は以下の膜切断可能なデグロン系であった:
SB01209(S-C-MT-D配向):
- SはSEAPである。
-CはADAM10/17切断部位である。
-MTはPDGFRb膜貫通ドメインである。
-DはCRBNベースのデグロン(d913)である。
膜切断可能なデグロン系を、SEAP活性アッセイを使用して、Jurkat T細胞株においてさらに評価した。テストされた構築物は、デグロンなし(「419」)、様々なリンカーのみを伴うC末端デグロン(「1118」、「1141」、「1143」、「1144」)、感染対照として使用される無関係なウイルス構築物(「1321」)を有した、又は以下の膜切断可能なデグロン系であった:
SB01209(S-C-MT-D配向):
- SはSEAPである。
-CはADAM10/17切断部位である。
-MTはPDGFRb膜貫通ドメインである。
-DはCRBNベースのデグロン(d913)である。
図5中に示すように、SEAP酵素活性を、Jurkat T細胞からの上清中で決定した。SEAP酵素活性を、「オン」(レナリドミドなし)に対する「オフ」(+レナリドミド)のパーセンテージとして定量化し、表11中に提示した。SEAP分泌が、S-C-MT-D配向を有する膜切断可能なデグロン構築物(「1209」)についてのJurkat T細胞におけるレナリドミドの添加時に有意に低下した。SEAP分泌はまた、デグロンを伴わない構築物(「419」)についてのSEAP活性と比べて、S-C-MT-D配向構築物(「1209」)について、レナリドミド依存的に低下した。結果は、膜係留SEAPの分解が、免疫調節薬物(IMiD)レナリドミドの存在において生じたことを示唆し、S-C-MT-D配向においてキメラタンパク質を使用した膜切断可能なデグロン系によって、分泌分子の薬物依存的分解/調節が可能になることを示す。
実施例4-膜切断可能なデグロン系を使用した、調節されたサイトカイン分泌
膜切断可能なデグロン系を、サイトカインの分泌を調節する能力についてさらに評価した。
膜切断可能なデグロン系を、サイトカインの分泌を調節する能力についてさらに評価した。
方法
図6中に例証するように、pL17dウイルスベクター構築物を生成し、それは、その天然形態(「1584」)において、又は膜切断可能なデグロンに融合されたキメラタンパク質(「1585」)として、ヒトIL-10(hIL-10)を発現した。ウイルスベクターはまた、細胞数、生存率、及び形質導入効率についての標準化対照として、別々のプロモーターからヒトIL-12(hIL-12)を発現した。調べられた構築物を、表12B中に列挙される関連配列を伴って、表12A中に記載する。
図6中に例証するように、pL17dウイルスベクター構築物を生成し、それは、その天然形態(「1584」)において、又は膜切断可能なデグロンに融合されたキメラタンパク質(「1585」)として、ヒトIL-10(hIL-10)を発現した。ウイルスベクターはまた、細胞数、生存率、及び形質導入効率についての標準化対照として、別々のプロモーターからヒトIL-12(hIL-12)を発現した。調べられた構築物を、表12B中に列挙される関連配列を伴って、表12A中に記載する。
サイトカイン分泌を、以下の全般的プロトコールに従って評価した:
-0日目:ドナーT細胞(以前に、上に記載されたように濃縮された)を解凍し、CD3/CD28Dynabeadsで活性化した。
-1日目:T細胞をウイルス構築物で形質導入した(1e6細胞当たり100kのGoStix値)。
-2日目:培地を変えた。
-4日目:細胞を継代した。
-7日目:細胞をスピンダウンし、培地で3回洗浄し、次に培地+/- 1μMのレナリドミド中に再懸濁した。
-9日目:上清を回収し、LuminexアッセイによりhIL10及びhIL12濃度について評価した。
-0日目:ドナーT細胞(以前に、上に記載されたように濃縮された)を解凍し、CD3/CD28Dynabeadsで活性化した。
-1日目:T細胞をウイルス構築物で形質導入した(1e6細胞当たり100kのGoStix値)。
-2日目:培地を変えた。
-4日目:細胞を継代した。
-7日目:細胞をスピンダウンし、培地で3回洗浄し、次に培地+/- 1μMのレナリドミド中に再懸濁した。
-9日目:上清を回収し、LuminexアッセイによりhIL10及びhIL12濃度について評価した。
結果
膜切断可能なデグロン系を、サイトカインの分泌を調節する能力についてさらに評価する。テストされた構築物は、以下に記載される膜切断可能なデグロン系において、デグロンを伴わない天然hIL-10(「1584」)を発現し、デグロンを伴わない陰性対照タンパク質(「1043」)を発現し、又はhIL-10キメラタンパク質を発現した:
1585(S-C-MT-D配向):
-SはhIL-12である。
-CはADAM10/17切断部位である。
-MTはPDGFRb膜貫通ドメインである。
-DはCRBNベースのデグロン(d913)である。
膜切断可能なデグロン系を、サイトカインの分泌を調節する能力についてさらに評価する。テストされた構築物は、以下に記載される膜切断可能なデグロン系において、デグロンを伴わない天然hIL-10(「1584」)を発現し、デグロンを伴わない陰性対照タンパク質(「1043」)を発現し、又はhIL-10キメラタンパク質を発現した:
1585(S-C-MT-D配向):
-SはhIL-12である。
-CはADAM10/17切断部位である。
-MTはPDGFRb膜貫通ドメインである。
-DはCRBNベースのデグロン(d913)である。
図7中に示すように、hIL-10分泌を、IL-12発現に対して標準化されたように、ドナー由来T細胞からの上清中で決定し、表13中に提示する。hIL-10は、無関係なタンパク質を発現する構築物で形質導入されたT細胞(「1043」)については検出されなかった。レナリドミドの添加によって、天然hIL-10を発現するウイルス構築物(「1584」)の低下分泌はもたらされなかった。対照的に、レナリドミドの添加によって、上清中で検出されたhIL-10における約50%減少がもたらされ、膜切断可能なデグロンフォーマットによって、初代T細胞からのhIL-10分泌の調節が可能になったことを示している。
実施例5-AAVデグロン系
デグロン媒介性調節を、AAVベースの送達系を使用して評価した。
デグロン媒介性調節を、AAVベースの送達系を使用して評価した。
方法
AAV2及びAAV8ウイルスベクター構築物を生成したが、それらは、A(EAAK)3Aリンカー(配列番号193)を使用して、C末端デグロンに融合されたキメラタンパク質としてナノルシフェラーゼを発現した。構築物は、AAV2又はAAV8キャプシドタンパク質のいずれかを用いたパッケージングベクターを使用して生成した。構築物ナノルシフェラーゼ/デグロン融合体の配列を表14中に列挙する。
AAV2及びAAV8ウイルスベクター構築物を生成したが、それらは、A(EAAK)3Aリンカー(配列番号193)を使用して、C末端デグロンに融合されたキメラタンパク質としてナノルシフェラーゼを発現した。構築物は、AAV2又はAAV8キャプシドタンパク質のいずれかを用いたパッケージングベクターを使用して生成した。構築物ナノルシフェラーゼ/デグロン融合体の配列を表14中に列挙する。
ルシフェラーゼ活性を、以下の一般的なプロトコールに従って評価した:
-0日目:Hep3b細胞を、96ウェルプレート中のウェル当たり50,000個の細胞で播種した。
-1日目:1e6vg/細胞AAV2又は3e6vg/細胞AAV8を、1μMのレナリドミド(又は1μM~.01μMのレナリドミド又はポマリドミド)の存在又は非存在において細胞に加えた。
-3日目:細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、Promega Nanogloキットを用いて測定した。
-0日目:Hep3b細胞を、96ウェルプレート中のウェル当たり50,000個の細胞で播種した。
-1日目:1e6vg/細胞AAV2又は3e6vg/細胞AAV8を、1μMのレナリドミド(又は1μM~.01μMのレナリドミド又はポマリドミド)の存在又は非存在において細胞に加えた。
-3日目:細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、Promega Nanogloキットを用いて測定した。
結果
AAVベースの送達系を、タンパク質発現のデグロン媒介性調節について評価した。テストされた構築物は、デグロンドメインを含むナノルシフェラーゼキメラタンパク質を発現した。図8中に示すように、AAV2ベースの(左パネル)又はAAV8ベースの(右パネル)構築物のいずれかで形質導入され、レナリドミドで処理されたHep3B細胞によって、レナリドミドで処理されていない細胞と比べて、ルシフェラーゼ活性における有意な減少(約40~80倍)がもたらされたが、デグロン系が、タンパク質発現の制御を可能にするAAVベースのフォーマットにおいて機能的であったことを示す。
AAVベースの送達系を、タンパク質発現のデグロン媒介性調節について評価した。テストされた構築物は、デグロンドメインを含むナノルシフェラーゼキメラタンパク質を発現した。図8中に示すように、AAV2ベースの(左パネル)又はAAV8ベースの(右パネル)構築物のいずれかで形質導入され、レナリドミドで処理されたHep3B細胞によって、レナリドミドで処理されていない細胞と比べて、ルシフェラーゼ活性における有意な減少(約40~80倍)がもたらされたが、デグロン系が、タンパク質発現の制御を可能にするAAVベースのフォーマットにおいて機能的であったことを示す。
デグロン系の薬剤反応性を、AAVベースのフォーマットにおいてさらに評価した。AAV2ベースの構築物を使用して、二つのIMiD(レナリドミド及びポマリドミド)を滴定し、インビトロで最小有効量を決定した。図9中に示すように、表15中で定量化したように、AAV2構築物で形質導入され、1~0.01μMレナリドミド(左パネル)又はポマリドミド(左パネル)のいずれかで処理されたHep3B細胞によって、レナリドミドで処理されなかった細胞と比べて、テストした全ての濃度でルシフェラーゼ活性における有意な減少がもたらされた。注目すべきことに、ナノルシフェラーゼシグナルは、いずれの薬物でも0.05から0.01μMに増加し、(マウスにおけるPK試験に基づく)薬物の生理学的濃度で有効性を実証し、0.01μM濃度が最小有効用量に近づき得ることを示している。
他の配列
HIV-1プロテアーゼ(配列番号144):PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMSLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF
アンジオテンシン変換酵素(ACE)(配列番号156):
MGAASGRRGPGLLLPLPLLLLLPPQPALALDPGLQPGNFSADEAGAQLFAQSYNSSAEQVLFQSVAASWAHDTNITAENARRQEEAALLSQEFAEAWGQKAKELYEPIWQNFTDPQLRRIIGAVRTLGSANLPLAKRQQYNALLSNMSRIYSTAKVCLPNKTATCWSLDPDLTNILASSRSYAMLLFAWEGWHNAAGIPLKPLYEDFTALSNEAYKQDGFTDTGAYWRSWYNSPTFEDDLEHLYQQLEPLYLNLHAFVRRALHRRYGDRYINLRGPIPAHLLGDMWAQSWENIYDMVVPFPDKPNLDVTSTMLQQGWNATHMFRVAEEFFTSLELSPMPPEFWEGSMLEKPADGREVVCHASAWDFYNRKDFRIKQCTRVTMDQLSTVHHEMGHIQYYLQYKDLPVSLRRGANPGFHEAIGDVLALSVSTPEHLHKIGLLDRVTNDTESDINYLLKMALEKIAFLPFGYLVDQWRWGVFSGRTPPSRYNFDWWYLRTKYQGICPPVTRNETHFDAGAKFHVPNVTPYIRYFVSFVLQFQFHEALCKEAGYEGPLHQCDIYRSTKAGAKLRKVLQAGSSRPWQEVLKDMVGLDALDAQPLLKYFQPVTQWLQEQNQQNGEVLGWPEYQWHPPLPDNYPEGIDLVTDEAEASKFVEEYDRTSQVVWNEYAEANWNYNTNITTETSKILLQKNMQIANHTLKYGTQARKFDVNQLQNTTIKRIIKKVQDLERAALPAQELEEYNKILLDMETTYSVATVCHPNGSCLQLEPDLTNVMATSRKYEDLLWAWEGWRDKAGRAILQFYPKYVELINQAARLNGYVDAGDSWRSMYETPSLEQDLERLFQELQPLYLNLHAYVRRALHRHYGAQHINLEGPIPAHLLGNMWAQTWSNIYDLVVPFPSAPSMDTTEAMLKQGWTPRRMFKEADDFFTSLGLLPVPPEFWNKSMLEKPTDGREVVCHASAWDFYNGKDFRIKQCTTVNLEDLVVAHHEMGHIQYFMQYKDLPVALREGANPGFHEAIGDVLALSVSTPKHLHSLNLLSSEGGSDEHDINFLMKMALDKIAFIPFSYLVDQWRWRVFDGSITKENYNQEWWSLRLKYQGLCPPVPRTQGDFDPGAKFHIPSSVPYIRYFVSFIIQFQFHEALCQAAGHTGPLHKCDIYQSKEAGQRLATAMKLGFSRPWPEAMQLITGQPNMSASAMLSYFKPLLDWLRTENELHGEKLGWPQYNWTPNSARSEGPLPDSGRVSFLGLDLDAQQARVGQWLLLFLGIALLVATLGLSQRLFSIRHRSLHRHSHGPQFGSEVELRHS
DENV NS3pro(NS2B/NS3)>sp|P33478|1475-2093(配列番号157):
SGVLWDTPSPPEVERAVLDDGIYRIMQRGLLGRSQVGVGVFQDGVFHTMWHVTRGAVLMYQGKRLEPSWASVKKDLISYGGGWRFQGSWNTGEEVQVIAVEPGKNPKNVQTAPGTFKTPEGEVGAIALDFKPGTSGSPIVNREGKIVGLYGNGVVTTSGTYVSAIAQAKASQEGPLPEIEDEVFRKRNLTIMDLHPGSGKTRRYLPAIVREAIRRNVRTLILAPTRVVASEMAEALKGMPIRYQTTAVKSEHTGKEIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNMIIMDEAHFTDPASIARRGYISTRVGMGEAAAIFMTATPPGSVEAFPQSNAVIQDEERDIPERSWNSGYEWITDFPGKTVWFVPSIKSGNDIANCLRKNGKRVIQLSRKTFDTEYQKTKNNDWDYVVTTDISEMGANFRADRVIDPRRCLKPVILKDGPERVILAGPMPVTVASAAQRRGRIGRNQNKEGDQYVYMGQPLNNDEDHAHWTEAKMLLDNINTPEGIIPALFEPEREKSAAIDGEYRLRGEARKTFVELMRRGDLPVWLSYKVASEGFQYSDRRWCFDGERNNQVLEENMDVEMWTKEGERKKLRPRWLDARTYSDPLALREFKEFAAGRR
DENV NS3pro(NS2B/NS3)>sp|P14340|1476-2093(配列番号158):
AGVLWDVPSPPPVGKAELEDGAYRIKQKGILGYSQIGAGVYKEGTFHTMWHVTRGAVLMHKGKRIEPSWADVKKDLISYGGGWKLEGEWKEGEEVQVLALEPGKNPRAVQTKPGLFKTNAGTIGAVSLDFSPGTSGSPIIDKKGKVVGLYGNGVVTRSGAYVSAIAQTEKSIEDNPEIEDDIFRKRKLTIMDLHPGAGKTKRYLPAIVREAIKRGLRTLILAPTRVVAAEMEEALRGLPIRYQTPAIRAEHTGREIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVEMGEAAGIFMTATPPGSRDPFPQSNAPIMDEEREIPERSWSSGHEWVTDFKGKTVWFVPSIKAGNDIAACLRKNGKKVIQLSRKTFDSEYVKTRTNDWDFVVTTDISEMGANFKAERVIDPRRCMKPVILTDGEERVILAGPMPVTHSSAAQRRGRIGRNPKNENDQYIYMGEPLENDEDCAHWKEAKMLLDNINTPEGIIPSMFEPEREKVDAIDGEYRLRGEARKTFVDLMRRGDLPVWLAYRVAAEGINYADRRWCFDGIKNNQILEENVEVEIWTKEGERKKLKPRWLDAKIYSDPLALKEFKEFAAGRK
DENV NS3pro(NS2B/NS3)>sp|Q99D35|1474-2092(配列番号159):
SGVLWDVPSPPETQKAELEEGVYRIKQQGIFGKTQVGVGVQKEGVFHTMWHVTRGAVLTHNGKRLEPNWASVKKDLISYGGGWRLSAQWQKGEEVQVIAVEPGKNPKNFQTMPGIFQTTTGEIGAIALDFKPGTSGSPIINREGKVVGLYGNGVVTKNGGYVSGIAQTNAEPDGPTPELEEEMFKKRNLTIMDLHPGSGKTRKYLPAIVREAIKRRLRTLILAPTRVVAAEMEEALKGLPIRYQTTATKSEHTGREIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVGMGEAAAIFMTATPPGTADAFPQSNAPIQDEERDIPERSWNSGNEWITDFVGKTVWFVPSIKAGNDIANCLRKNGKKVIQLSRKTFDTEYQKTKLNDWDFVVTTDISEMGANFKADRVIDPRRCLKPVILTDGPERVILAGPMPVTVASAAQRRGRVGRNPQKENDQYIFMGQPLNKDEDHAHWTEAKMLLDNINTPEGIIPALFEPEREKSAAIDGEYRLKGESRKTFVELMRRGDLPVWLAHKVASEGIKYTDRKWCFDGERNNQILEENMDVEIWTKEGEKKKLRPRWLDARTYSDPLALKEFKDFAAGRK
DENV NS3pro(NS2B/NS3)>sp|Q5UCB8|1475-2092(配列番号160):
SGALWDVPSPAATQKAALSEGVYRIMQRGLFGKTQVGVGIHIEGVFHTMWHVTRGSVICHETGRLEPSWADVRNDMISYGGGWRLGDKWDKEEDVQVLAIEPGKNPKHVQTKPGLFKTLTGEIGAVTLDFKPGTSGSPIINRKGKVIGLYGNGVVTKSGDYVSAITQAERIGEPDYEVDEDIFRKKRLTIMDLHPGAGKTKRILPSIVREALKRRLRTLILAPTRVVAAEMEEALRGLPIRYQTPAVKSEHTGREIVDLMCHATFTTRLLSSTRVPNYNLIVMDEAHFTDPSSVAARGYISTRVEMGEAAAIFMTATPPGTTDPFPQSNSPIEDIEREIPERSWNTGFDWITDYQGKTVWFVPSIKAGNDIANCLRKSGKKVIQLSRKTFDTEYPKTKLTDWDFVVTTDISEMGANFRAGRVIDPRRCLKPVILPDGPERVILAGPIPVTPASAAQRRGRIGRNPAQEDDQYVFSGDPLKNDEDHAHWTEAKMLLDNIYTPEGIIPTLFGPEREKTQAIDGEFRLRGEQRKTFVELMRRGDLPVWLSYKVASAGISYKDREWCFTGERNNQILEENMEVEIWTREGEKKKLRPKWLDARVYADPMALKDFKEFASGRK
PEST(ヒトIκBαの残基277-307の二つのコピー;配列番号161):
LQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDDGSLQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDD
GRR(ヒトp105の残基352-408;配列番号162):
EIKDKEEVQRKRQKLMPNFSDSFGGGSGAGAGGGGMFGSGGGGGGTGSTGPGYSFPH
DRR(酵母Cdc34の残基210-295;配列番号163):
IDDENGSVILQDDDYDDGNNHIPFEDDDVYNYNDNDDDDERIEFEDDDDDDDDSIDNDSVMDRKQPHKAEDESEDVEDVERVSKKD
SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(インフルエンザA又はインフルエンザBのSP2-NB-SP2;例、配列番号164):
PESMREEYRKEGSKRIKCPDCEPFCNKRGSPESMREEYRKE
RPB(酵母RPBの残基1688-1702の四つのコピー;配列番号165):
RSYSPTSPNYSPTSPSGSYSPTSPNYSPTSPSGGSRSYSPTSPNYSPTSPSGSYSPTSPNYSPTSPSG
SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(インフルエンザAウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2;配列番号166):
PESMREEYRKEGSSLLTEVETPGSPESMREEYRKEGSSLLTEVETPGSPESMREEYRKE
NS2(インフルエンザAウイルスNSタンパク質の残基79-93の三つのコピー;配列番号167):
LIEEVRHRLKTTENSGSLIEEVRHRLKTTENSGSLIEEVRHRLKTTENSGS
ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106-142、配列番号168):
FPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV
マウスODC(残基422-461;配列番号169):
SHGFPPEVEEQAAGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV
HIV-1プロテアーゼ(配列番号144):PQVTLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMSLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF
アンジオテンシン変換酵素(ACE)(配列番号156):
MGAASGRRGPGLLLPLPLLLLLPPQPALALDPGLQPGNFSADEAGAQLFAQSYNSSAEQVLFQSVAASWAHDTNITAENARRQEEAALLSQEFAEAWGQKAKELYEPIWQNFTDPQLRRIIGAVRTLGSANLPLAKRQQYNALLSNMSRIYSTAKVCLPNKTATCWSLDPDLTNILASSRSYAMLLFAWEGWHNAAGIPLKPLYEDFTALSNEAYKQDGFTDTGAYWRSWYNSPTFEDDLEHLYQQLEPLYLNLHAFVRRALHRRYGDRYINLRGPIPAHLLGDMWAQSWENIYDMVVPFPDKPNLDVTSTMLQQGWNATHMFRVAEEFFTSLELSPMPPEFWEGSMLEKPADGREVVCHASAWDFYNRKDFRIKQCTRVTMDQLSTVHHEMGHIQYYLQYKDLPVSLRRGANPGFHEAIGDVLALSVSTPEHLHKIGLLDRVTNDTESDINYLLKMALEKIAFLPFGYLVDQWRWGVFSGRTPPSRYNFDWWYLRTKYQGICPPVTRNETHFDAGAKFHVPNVTPYIRYFVSFVLQFQFHEALCKEAGYEGPLHQCDIYRSTKAGAKLRKVLQAGSSRPWQEVLKDMVGLDALDAQPLLKYFQPVTQWLQEQNQQNGEVLGWPEYQWHPPLPDNYPEGIDLVTDEAEASKFVEEYDRTSQVVWNEYAEANWNYNTNITTETSKILLQKNMQIANHTLKYGTQARKFDVNQLQNTTIKRIIKKVQDLERAALPAQELEEYNKILLDMETTYSVATVCHPNGSCLQLEPDLTNVMATSRKYEDLLWAWEGWRDKAGRAILQFYPKYVELINQAARLNGYVDAGDSWRSMYETPSLEQDLERLFQELQPLYLNLHAYVRRALHRHYGAQHINLEGPIPAHLLGNMWAQTWSNIYDLVVPFPSAPSMDTTEAMLKQGWTPRRMFKEADDFFTSLGLLPVPPEFWNKSMLEKPTDGREVVCHASAWDFYNGKDFRIKQCTTVNLEDLVVAHHEMGHIQYFMQYKDLPVALREGANPGFHEAIGDVLALSVSTPKHLHSLNLLSSEGGSDEHDINFLMKMALDKIAFIPFSYLVDQWRWRVFDGSITKENYNQEWWSLRLKYQGLCPPVPRTQGDFDPGAKFHIPSSVPYIRYFVSFIIQFQFHEALCQAAGHTGPLHKCDIYQSKEAGQRLATAMKLGFSRPWPEAMQLITGQPNMSASAMLSYFKPLLDWLRTENELHGEKLGWPQYNWTPNSARSEGPLPDSGRVSFLGLDLDAQQARVGQWLLLFLGIALLVATLGLSQRLFSIRHRSLHRHSHGPQFGSEVELRHS
DENV NS3pro(NS2B/NS3)>sp|P33478|1475-2093(配列番号157):
SGVLWDTPSPPEVERAVLDDGIYRIMQRGLLGRSQVGVGVFQDGVFHTMWHVTRGAVLMYQGKRLEPSWASVKKDLISYGGGWRFQGSWNTGEEVQVIAVEPGKNPKNVQTAPGTFKTPEGEVGAIALDFKPGTSGSPIVNREGKIVGLYGNGVVTTSGTYVSAIAQAKASQEGPLPEIEDEVFRKRNLTIMDLHPGSGKTRRYLPAIVREAIRRNVRTLILAPTRVVASEMAEALKGMPIRYQTTAVKSEHTGKEIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNMIIMDEAHFTDPASIARRGYISTRVGMGEAAAIFMTATPPGSVEAFPQSNAVIQDEERDIPERSWNSGYEWITDFPGKTVWFVPSIKSGNDIANCLRKNGKRVIQLSRKTFDTEYQKTKNNDWDYVVTTDISEMGANFRADRVIDPRRCLKPVILKDGPERVILAGPMPVTVASAAQRRGRIGRNQNKEGDQYVYMGQPLNNDEDHAHWTEAKMLLDNINTPEGIIPALFEPEREKSAAIDGEYRLRGEARKTFVELMRRGDLPVWLSYKVASEGFQYSDRRWCFDGERNNQVLEENMDVEMWTKEGERKKLRPRWLDARTYSDPLALREFKEFAAGRR
DENV NS3pro(NS2B/NS3)>sp|P14340|1476-2093(配列番号158):
AGVLWDVPSPPPVGKAELEDGAYRIKQKGILGYSQIGAGVYKEGTFHTMWHVTRGAVLMHKGKRIEPSWADVKKDLISYGGGWKLEGEWKEGEEVQVLALEPGKNPRAVQTKPGLFKTNAGTIGAVSLDFSPGTSGSPIIDKKGKVVGLYGNGVVTRSGAYVSAIAQTEKSIEDNPEIEDDIFRKRKLTIMDLHPGAGKTKRYLPAIVREAIKRGLRTLILAPTRVVAAEMEEALRGLPIRYQTPAIRAEHTGREIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVEMGEAAGIFMTATPPGSRDPFPQSNAPIMDEEREIPERSWSSGHEWVTDFKGKTVWFVPSIKAGNDIAACLRKNGKKVIQLSRKTFDSEYVKTRTNDWDFVVTTDISEMGANFKAERVIDPRRCMKPVILTDGEERVILAGPMPVTHSSAAQRRGRIGRNPKNENDQYIYMGEPLENDEDCAHWKEAKMLLDNINTPEGIIPSMFEPEREKVDAIDGEYRLRGEARKTFVDLMRRGDLPVWLAYRVAAEGINYADRRWCFDGIKNNQILEENVEVEIWTKEGERKKLKPRWLDAKIYSDPLALKEFKEFAAGRK
DENV NS3pro(NS2B/NS3)>sp|Q99D35|1474-2092(配列番号159):
SGVLWDVPSPPETQKAELEEGVYRIKQQGIFGKTQVGVGVQKEGVFHTMWHVTRGAVLTHNGKRLEPNWASVKKDLISYGGGWRLSAQWQKGEEVQVIAVEPGKNPKNFQTMPGIFQTTTGEIGAIALDFKPGTSGSPIINREGKVVGLYGNGVVTKNGGYVSGIAQTNAEPDGPTPELEEEMFKKRNLTIMDLHPGSGKTRKYLPAIVREAIKRRLRTLILAPTRVVAAEMEEALKGLPIRYQTTATKSEHTGREIVDLMCHATFTMRLLSPVRVPNYNLIIMDEAHFTDPASIAARGYISTRVGMGEAAAIFMTATPPGTADAFPQSNAPIQDEERDIPERSWNSGNEWITDFVGKTVWFVPSIKAGNDIANCLRKNGKKVIQLSRKTFDTEYQKTKLNDWDFVVTTDISEMGANFKADRVIDPRRCLKPVILTDGPERVILAGPMPVTVASAAQRRGRVGRNPQKENDQYIFMGQPLNKDEDHAHWTEAKMLLDNINTPEGIIPALFEPEREKSAAIDGEYRLKGESRKTFVELMRRGDLPVWLAHKVASEGIKYTDRKWCFDGERNNQILEENMDVEIWTKEGEKKKLRPRWLDARTYSDPLALKEFKDFAAGRK
DENV NS3pro(NS2B/NS3)>sp|Q5UCB8|1475-2092(配列番号160):
SGALWDVPSPAATQKAALSEGVYRIMQRGLFGKTQVGVGIHIEGVFHTMWHVTRGSVICHETGRLEPSWADVRNDMISYGGGWRLGDKWDKEEDVQVLAIEPGKNPKHVQTKPGLFKTLTGEIGAVTLDFKPGTSGSPIINRKGKVIGLYGNGVVTKSGDYVSAITQAERIGEPDYEVDEDIFRKKRLTIMDLHPGAGKTKRILPSIVREALKRRLRTLILAPTRVVAAEMEEALRGLPIRYQTPAVKSEHTGREIVDLMCHATFTTRLLSSTRVPNYNLIVMDEAHFTDPSSVAARGYISTRVEMGEAAAIFMTATPPGTTDPFPQSNSPIEDIEREIPERSWNTGFDWITDYQGKTVWFVPSIKAGNDIANCLRKSGKKVIQLSRKTFDTEYPKTKLTDWDFVVTTDISEMGANFRAGRVIDPRRCLKPVILPDGPERVILAGPIPVTPASAAQRRGRIGRNPAQEDDQYVFSGDPLKNDEDHAHWTEAKMLLDNIYTPEGIIPTLFGPEREKTQAIDGEFRLRGEQRKTFVELMRRGDLPVWLSYKVASAGISYKDREWCFTGERNNQILEENMEVEIWTREGEKKKLRPKWLDARVYADPMALKDFKEFASGRK
PEST(ヒトIκBαの残基277-307の二つのコピー;配列番号161):
LQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDDGSLQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDD
GRR(ヒトp105の残基352-408;配列番号162):
EIKDKEEVQRKRQKLMPNFSDSFGGGSGAGAGGGGMFGSGGGGGGTGSTGPGYSFPH
DRR(酵母Cdc34の残基210-295;配列番号163):
IDDENGSVILQDDDYDDGNNHIPFEDDDVYNYNDNDDDDERIEFEDDDDDDDDSIDNDSVMDRKQPHKAEDESEDVEDVERVSKKD
SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(インフルエンザA又はインフルエンザBのSP2-NB-SP2;例、配列番号164):
PESMREEYRKEGSKRIKCPDCEPFCNKRGSPESMREEYRKE
RPB(酵母RPBの残基1688-1702の四つのコピー;配列番号165):
RSYSPTSPNYSPTSPSGSYSPTSPNYSPTSPSGGSRSYSPTSPNYSPTSPSGSYSPTSPNYSPTSPSG
SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(インフルエンザAウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2;配列番号166):
PESMREEYRKEGSSLLTEVETPGSPESMREEYRKEGSSLLTEVETPGSPESMREEYRKE
NS2(インフルエンザAウイルスNSタンパク質の残基79-93の三つのコピー;配列番号167):
LIEEVRHRLKTTENSGSLIEEVRHRLKTTENSGSLIEEVRHRLKTTENSGS
ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106-142、配列番号168):
FPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV
マウスODC(残基422-461;配列番号169):
SHGFPPEVEEQAAGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV
解釈
本明細書中に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、その各々が引用される主題に関して参照により組み入れられ、それらは、一部の場合では、文書の全体を包含し得る。
本明細書中に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、その各々が引用される主題に関して参照により組み入れられ、それらは、一部の場合では、文書の全体を包含し得る。
本明細書及び特許請求の範囲において本明細書中で使用される不定冠詞「a」及び「an」は、反対に明確に示されない場合、「少なくとも一つ」を意味すると理解されるべきである。
反対に明確に示されない場合、二つ以上の工程又は行為を含む、本明細書中で請求される任意の方法において、方法の工程又は行為の順序が、方法の工程又は行為が、記載されている順序に必ずしも限定されないことも理解すべきである。
特許請求の範囲において、ならびに上の明細書において、全ての移行句、例えば「含む(comprising)」、「含む(including)」、「運ぶ(carrying)」、「有する(having)」、「含む(containing)」、「含む(involving)」、「保持する(holding)」、「で構成される(composed of)」など、及び同様のものが、無制限である、即ち、含むが、限定されないことを意味すると理解すべきである。移行句「consisting of」(からなる)及び「consisting essentially of」(から本質的になる)のみが、米国特許庁特許審査手続マニュアルのセクション2111.03において記載されているように、それぞれクローズド又はセミクローズドの移行句であるものとする。
Claims (18)
- プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含む操作された核酸であって、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつ
Dはデグロンを含み、
前記プロモーターは、前記外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつS-C-MT-Dが、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されており、
場合により、前記操作された核酸は、DNA、cDNA、RNA、mRNA、及びネイキッドプラスミドからなる群から選択される、
操作された核酸。 - a)前記プロモーターは構成的プロモーターであり、
場合により、前記構成的プロモーターは、CAG、HLP、CMV、EFS、SFFV、SV40、MND、PGK、UbC、hEF1aV1、hCAGG、hEF1aV2、hACTb、heIF4A1、hGAPDH、hGRP78、hGRP94、hHSP70、hKINb、及びhUBIbからなる群から選択され;ならびに/あるいは
b)前記プロモーターは誘導性プロモーターであり、
場合により、前記誘導性プロモーターは、minP、NFkB応答エレメント、CREB応答エレメント、NFAT応答エレメント、SRF応答エレメント1、SRF応答エレメント2、AP1応答エレメント、TCF-LEF応答エレメントプロモーター融合体、低酸素応答性エレメント、SMAD結合エレメント、STAT3結合部位、minCMV、YB_TATA、minTK、インデューサー分子応答性プロモーター、及びそれらのタンデムリピートからなる群から選択され;ならびに/あるいは
c)前記プロモーターは合成プロモーターであり;ならびに/あるいは
d)前記プロモーターは組織特異的プロモーターである、
請求項1に記載の操作された核酸。 - a)前記分泌性エフェクター分子は、前記分泌性エフェクター分子に対して天然の天然シグナルペプチドを含み;あるいは
b)前記分泌性エフェクター分子は、前記分泌性エフェクター分子に対して非天然の非天然シグナルペプチドを含み、
場合により、前記非天然シグナルペプチドは、IL12、IL2、最適化IL2、トリプシオンゲン-2、ガウシアルシフェラーゼ、CD5、ヒトIgKVII、マウスIgKVII、VSV-G、プロラクチン、血清アルブミンプレタンパク質、アズロシジンプレタンパク質、オステオネクチン、CD33、IL6、IL8、CCL2、TIMP2、VEGFB、オステオプロテゲリン、セルピンE1、GROアルファ、CXCL12、IL21、CD8、及びGMCSFからなる群から選択される、
請求項1又は請求項2に記載の操作された核酸。 - 前記分泌性エフェクター分子は、治療クラスから選択され、
前記治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ペプチド、及び酵素からなる群から選択され、
場合により、前記分泌性エフェクター分子は、ヒト由来エフェクター分子であり、
場合により、前記サイトカインは、IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファからなる群から選択され、
場合により、前記ケモカインは、CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1からなる群から選択され、
場合により、前記ホーミング分子は、抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2からなる群から選択され、
場合により、前記成長因子は、FLT3L及びGM-CSFからなる群から選択され、
場合により、前記共活性化分子は、4-1BBL及びCD40Lからなる群から選択され、
場合により、前記腫瘍微小環境修飾因子は、アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2からなる群から選択され、
場合により、前記TGFベータインヒビターは、抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、
場合により、前記免疫チェックポイントインヒビターは、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREM1抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択され、ならびに
場合により、前記VEGFインヒビターは、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む、
請求項1~3のいずれか一項に記載の操作された核酸。 - a)前記プロテアーゼ切断部位は、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能であり;ならびに/あるいは
b)前記細胞膜係留ドメインは、膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含み;ならびに/あるいは
c)前記膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインは、PDGFR-ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来し;ならびに/あるいは
d)前記細胞膜係留ドメインは、細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含み;ならびに/あるいは
e)細胞中で発現された場合、前記分泌性エフェクター分子は、前記細胞の細胞膜に係留され;ならびに/あるいは
f)前記プロテアーゼ切断部位を切断することが可能なプロテアーゼを発現する細胞中で発現された場合、前記分泌性エフェクター分子が前記細胞膜から放出され;ならびに/あるいは
g)前記細胞膜上に発現される前記プロテアーゼは、前記細胞に対して内因性であり;ならびに/あるいは
h)前記プロテアーゼは、1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択され;ならびに/あるいは
i)前記細胞膜上に発現される前記プロテアーゼは、前記細胞に対して異種であり;
j)前記プロテアーゼは、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)であり;ならびに/あるいは
k)前記プロテアーゼ切断部位は、NS3プロテアーゼ切断部位を含み;ならびに/あるいは
l)前記NS3プロテアーゼ切断部位は、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合点切断部位を含み;ならびに/あるいは
m)前記プロテアーゼは、プロテアーゼインヒビターにより抑制され得、
場合により、前記プロテアーゼインヒビターは、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択され;ならびに/あるいは
n)前記プロテアーゼの発現は、調節が可能である、
請求項1~4のいずれか一項に記載の操作された核酸。 - 免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより前記分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、前記デグロンは含み、
場合により、前記CRBNポリペプチド基質ドメインは、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択され、
場合により、前記CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物であり、
場合により、前記CRBNポリペプチド基質ドメインは、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物であり、
場合により、前記IMiDはFDA承認薬物であり、前記IMiDは、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択され、
場合により、前記デグロンは、HCV NS4デグロン、PEST(ヒトIκBαの残基277~307の二つのコピー)、GRR(ヒトp105の残基352~408)、DRR(酵母Cdc34の残基210~295)、SNS(SP2及びNBのタンデムリピート(A型インフルエンザ又はB型インフルエンザのSP2-NB-SP2)、RPB(酵母RPBの残基1688~1702の四つのコピー)、SPmix(SP1及びSP2のタンデムリピート(A型インフルエンザウイルスM2タンパク質のSP2-SP1-SP2-SP1-SP2)、NS2(A型インフルエンザウイルスNSタンパク質の残基79~93の三つのコピー)、ODC(オルニチンデカルボキシラーゼの残基106~142)、Nek2A、マウスODC(残基422~461)、マウスODC_DA(D433A及びD434A点変異を含むmODCの残基422~461)、APC/Cデグロン、COP1 E3リガーゼ結合デグロンモチーフ、CRL4-Cdt2結合PIPデグロン、アクチンフィリン結合デグロン、KEAP1結合デグロン、KLHL2及びKLHL3結合デグロン、MDM2結合モチーフ、N-デグロン、低酸素シグナル伝達におけるヒドロキシプロリン修飾、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、SCFユビキチンリガーゼ結合ホスホデグロン、植物ホルモン依存的SCF-LRR結合デグロン、DSGxxS(配列番号190)リン依存的デグロン、Siah結合モチーフ、SPOP SBCドッキングモチーフ、ならびにPCNA結合PIPボックスからなる群から選択され、あるいは
場合により、前記デグロンは、前記細胞膜係留ドメインのC末端に局在化されている、
請求項1~5のいずれか一項に記載の操作された核酸。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の操作された核酸を含む発現ベクターであって、場合により、ウイルスベクターである、発現ベクター。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の操作された核酸によりコードされる、膜切断可能なキメラタンパク質。
- N末端からC末端に配向された膜切断可能なキメラタンパク質であって、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dはデグロンを含み、かつ
S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、
膜切断可能なキメラタンパク質。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の操作された核酸、又は請求項7に記載の発現ベクター、又は請求項8もしくは請求項9に記載の膜切断可能なキメラタンパク質を含む、単離細胞であって、
場合により、前記細胞は、T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマデルタT細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、調節性T細胞、ウイルス特異的T細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞(ESC)、ESC由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞(MSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、及びiPSC由来細胞からなる群から選択される自己細胞又は同種細胞である、
単離細胞。 - 操作された核酸を含む単離細胞であって、前記操作された核酸は、プロモーターと膜切断可能なキメラタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド配列とを含む発現カセットを含み、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sは分泌性エフェクター分子を含み、
Cはプロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、かつ
Dはデグロンを含み、
前記プロモーターは、前記外因性ポリヌクレオチド配列に動作可能に連結され、かつS-C-MT-Dが、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されており、
場合により、前記細胞は、T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマデルタT細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、調節性T細胞、ウイルス特異的T細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、自然リンパ球細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、赤血球、血小板細胞、ヒト胚性幹細胞(ESC)、ESC由来細胞、多能性幹細胞、間葉系間質細胞(MSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、及びiPSC由来細胞からなる群から選択される自己細胞又は同種細胞である、
単離細胞。 - 前記細胞は抗原認識受容体をさらに含み、
場合により、前記抗原認識受容体は、5T4、ADAM9、AFP、AXL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、C4.4、CA6、カドヘリン3、カドヘリン6、CCR4、CD123、CD133、CD138、CD142、CD166、CD25、CD30、CD352、CD37、CD38、CD44、CD56、CD66e、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD80、CEA、CEACAM5、クローディン18.2、cMet、CSPG4、CTLA、DLK1、DLL3、DR5、EGFR、ENPP3、EpCAM、EphA2、エフリンA4、ETBR、FGFR2、FGFR3、FRアルファ、FRb、GCC、GD2、GFRa4、gpA33、GPC3、gpNBM、GPRC5、HER2、IL-13R、IL-13Ra、IL-13Ra2、IL-8、IL-15、IL1RAP、インテグリンaV、KIT、L1CAM、LAMP1、ルイスY、LeY、LIV-1、LRRC、LY6E、MCSP、メソテリン、MUC1、MUC16、MUC1C、NaPi2B、ネクチン4、NKG2D、NOTCH3、NY ESO 1、オバリン、Pカドヘリン、pan-Erb2、PSCA、PSMA、PTK7、ROR1、S Aures、SCT、SLAMF7、SLITRK6、SSTR2、STEAP1、サバイビン、TDGF1、TIM1、TROP2、及びWT1からなる群から選択される抗原を認識し、
場合により、前記抗原認識受容体は、抗原結合ドメインを含み、
場合により、前記抗原結合ドメインは、抗体、抗体の抗原結合断片、F(ab)断片、F(ab’)断片、一本鎖可変断片(scFv)、又は単一ドメイン抗体(sdAb)を含み、
場合により、前記scFvは、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、
場合により、前記VH及びVLは、ペプチドリンカーにより分離されており、
場合により、前記scFvは、構造VH-L-VL又はVL-L-VHを含み、VHは前記重鎖可変ドメインであり、Lは前記ペプチドリンカーであり、かつVLは前記軽鎖可変ドメインであり、
場合により、前記抗原認識受容体はキメラ抗原受容体(CAR)であり、
場合により、前記CARは一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、かつ前記一つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ鎖細胞内シグナル伝達ドメイン、CD97細胞内シグナル伝達ドメイン、CD11a-CD18細胞内シグナル伝達ドメイン、CD2細胞内シグナル伝達ドメイン、ICOS細胞内シグナル伝達ドメイン、CD27細胞内シグナル伝達ドメイン、CD154細胞内シグナル伝達ドメイン、CD8細胞内シグナル伝達ドメイン、OX40細胞内シグナル伝達ドメイン、4-1BB細胞内シグナル伝達ドメイン、CD28細胞内シグナル伝達ドメイン、ZAP40細胞内シグナル伝達ドメイン、CD30細胞内シグナル伝達ドメイン、GITR細胞内シグナル伝達ドメイン、HVEM細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP10細胞内シグナル伝達ドメイン、DAP12細胞内シグナル伝達ドメイン、及びMyD88細胞内シグナル伝達ドメインからなる群から選択され、
場合により、前記CARは膜貫通ドメインを含み、かつ前記膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD3ゼータ鎖膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、OX40膜貫通ドメイン、ICOS膜貫通ドメイン、CTLA-4膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、LAG-3膜貫通ドメイン、2B4膜貫通ドメイン、及びBTLA膜貫通ドメインからなる群から選択され、ならびに/あるいは
場合により、前記CARは、前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインの間にスペーサー領域を含む、
請求項10又は請求項11に記載の単離細胞。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の操作された核酸、請求項7に記載の発現ベクター、請求項8もしくは請求項9に記載の膜切断可能なキメラタンパク質、又は請求項10~12のいずれか一項に記載の単離細胞、及び医薬的に許容可能な担体、医薬的に許容可能な賦形剤、又はそれらの組み合わせを含む、組成物。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の操作された核酸、請求項7に記載の発現ベクター、請求項8もしくは請求項9に記載の膜切断可能なキメラタンパク質、請求項10~12のいずれか一項に記載の単離細胞、又は請求項13に記載の組成物を投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法。
- 膜係留エフェクター分子の放出を誘導する方法であって、
a)細胞を提供することであって、前記細胞は、膜結合プロテアーゼ及び膜切断可能なキメラタンパク質を含み、N末端からC末端に配向されており、式:
S-C-MT-Dを有し、
式中、
Sはエフェクター分子を含み、
Cは同族膜結合プロテアーゼ切断部位を含み、
MTは細胞膜係留ドメインを含み、
Dは薬物誘導性デグロンを含み、かつ
S-C-MT-Dは、単一ポリペプチドとして発現されるように構成されている、
提供すること;ならびに
b)前記膜結合プロテアーゼ及び前記膜切断可能なキメラタンパク質の発現のために適切な条件下で前記細胞を培養すること、
を含み、
発現時に、前記膜切断可能なキメラタンパク質は、前記細胞の前記細胞膜に係留され、かつ
発現時に、前記膜結合プロテアーゼは、前記膜切断可能なキメラタンパク質の前記同族膜結合プロテアーゼ切断部位を切断し、それにより前記エフェクター分子を前記細胞膜から放出する、
方法。 - 前記細胞を、前記デグロンを誘導する薬物と接触させることをさらに含み、
場合により、前記デグロンの誘導によって、前記膜切断可能なキメラタンパク質が分解される、
請求項15に記載の方法。 - 前記分泌性エフェクター分子は、治療クラスから選択され、
前記治療クラスは、サイトカイン、ケモカイン、ホーミング分子、成長因子、共活性化分子、腫瘍微小環境修飾因子、リガンド、抗体、ペプチド、及び酵素からなる群から選択され、
場合により、前記分泌性エフェクター分子は、ヒト由来エフェクター分子であり、
場合により、前記サイトカインは、IL1-ベータ、IL2、IL4、IL6、IL7、IL10、IL12、IL12p70融合タンパク質、IL15、IL17A、IL18、IL21、IL22、I型インターフェロン、インターフェロン-ガンマ、及びTNF-アルファからなる群から選択され、
場合により、前記ケモカインは、CCL21a、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL10-CXCL11融合タンパク質、CCL19、CXCL9、及びXCL1からなる群から選択され、
場合により、前記ホーミング分子は、抗インテグリンアルファ4、ベータ7;抗MAdCAM;SDFl;及びMMP-2からなる群から選択され、
場合により、前記成長因子は、FLT3L及びGM-CSFからなる群から選択され、
場合により、前記共活性化分子は、4-1BBL及びCD40Lからなる群から選択され、
場合により、前記腫瘍微小環境修飾因子は、アデノシンデアミナーゼ、TGFベータインヒビター、免疫チェックポイントインヒビター、VEGFインヒビター、及びHPGE2からなる群から選択され、
場合により、前記TGFベータインヒビターは、抗TGFベータペプチド、抗TGFベータ抗体、TGFb-TRAP、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、
場合により、前記免疫チェックポイントインヒビターは、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗TIGIT抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗B7-H3抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗GAL9抗体、抗A2AR抗体、抗ホスファチジルセリン抗体、抗CD27抗体、抗TNFa抗体、抗TREMl抗体、及び抗TREM2抗体からなる群から選択され、ならびに
場合により、前記VEGFインヒビターは、抗VEGF抗体、抗VEGFペプチド、又はそれらの組み合わせを含む、
請求項15又は請求項16に記載の方法。 - a)前記同族プロテアーゼ切断部位は、1型膜貫通プロテアーゼ切断部位、II型膜貫通プロテアーゼ切断部位、GPIアンカー型プロテアーゼ切断部位、ADAM8プロテアーゼ切断部位、ADAM9プロテアーゼ切断部位、ADAM10プロテアーゼ切断部位、ADAM12プロテアーゼ切断部位、ADAM15プロテアーゼ切断部位、ADAM17プロテアーゼ切断部位、ADAM19プロテアーゼ切断部位、ADAM20プロテアーゼ切断部位、ADAM21プロテアーゼ切断部位、ADAM28プロテアーゼ切断部位、ADAM30プロテアーゼ切断部位、ADAM33プロテアーゼ切断部位、BACE1プロテアーゼ切断部位、BACE2プロテアーゼ切断部位、SIPプロテアーゼ切断部位、MT1-MMPプロテアーゼ切断部位、MT3-MMPプロテアーゼ切断部位、MT5-MMPプロテアーゼ切断部位、フリンプロテアーゼ切断部位、PCSK7プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位、マトリプターゼ-2プロテアーゼ切断部位、MMP9プロテアーゼ切断部位、及びNS3プロテアーゼ切断部位からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断可能であり;ならびに/あるいは
b)前記細胞膜係留ドメインは、膜貫通-細胞内ドメイン又は膜貫通ドメインを含み、
場合により、前記膜貫通-細胞内ドメイン及び/又は膜貫通ドメインは、PDGFR-ベータ、CD8、CD28、CD3ゼータ鎖、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、LNGFR、EpoR、又はBTLAから由来し;ならびに/あるいは
c)前記細胞膜係留ドメインは、細胞表面受容体、又はその細胞膜結合部分を含み;ならびに/あるいは
d)前記プロテアーゼは、前記細胞に対して内因性であり、かつ1型膜貫通プロテアーゼ、II型膜貫通プロテアーゼ、GPIアンカー型プロテアーゼ、ADAM8プロテアーゼ、ADAM9プロテアーゼ、ADAM10プロテアーゼ、ADAM12プロテアーゼ、ADAM15プロテアーゼ、ADAM17プロテアーゼ、ADAM19プロテアーゼ、ADAM20プロテアーゼ、ADAM21プロテアーゼ、ADAM28プロテアーゼ、ADAM30プロテアーゼ、ADAM33プロテアーゼ、BACE1プロテアーゼ、BACE2プロテアーゼ、SIPプロテアーゼ、MT1-MMPプロテアーゼ、MT3-MMPプロテアーゼ、MT5-MMPプロテアーゼ、フリンプロテアーゼ、PCSK7プロテアーゼ、マトリプターゼプロテアーゼ、マトリプターゼ-2プロテアーゼ、及びMMP9プロテアーゼからなる群から選択され;ならびに/あるいは
e)前記プロテアーゼは、前記細胞に対して異種であり、場合により、前記プロテアーゼが、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造タンパク質3(NS3)であり;ならびに/あるいは
f)前記プロテアーゼ切断部位は、NS3プロテアーゼ切断部位を含み、場合により、前記NS3プロテアーゼ切断部位が、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、又はNS5A/NS5B接合部切断部位を含み;ならびに/あるいは
g)前記プロテアーゼは、プロテアーゼインヒビターにより抑制することができ、場合により、前記プロテアーゼインヒビターは、シメプレビル、ダノプレビル、アスナプレビル、シルプレビル、ボセプレビル、ソバプレビル、パリタプレビル、テラプレビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、及びボキシロプレビルからなる群から選択され;ならびに/あるいは
h)前記プロテアーゼは、デグロンをさらに含み、場合により、前記プロテアーゼの発現が、調節が可能であり、
場合により、免疫調節薬物(IMiD)への応答においてセレブロン(CRBN)に結合することが可能でありそれにより前記分泌性エフェクター分子のユビキチン経路媒介性分解を促進するセレブロン(CRBN)ポリペプチド基質ドメインを、前記デグロンは含み、
場合により、前記CRBNポリペプチド基質ドメインは、IKZF1、IKZF3、CKla、ZFP91、GSPT1、MEIS2、GSS E4F1、ZN276、ZN517、ZN582、ZN653、ZN654、ZN692、ZN787、及びZN827、又はCRBNの薬物誘導性結合が可能なその断片からなる群から選択され、
場合により、前記CRBNポリペプチド基質ドメインは、天然CRBNポリペプチド配列のキメラ融合産物であり、場合により、前記CRBNポリペプチド基質ドメインが、FNVLM VHKRS HTGER PLQCE ICGFT CRQKG NLLRH IKLHT GEKPF KCHLC NYACQ RRDAL(配列番号189)のアミノ酸配列を有するIKZF3/ZFP91/IKZF3キメラ融合産物であり、ならびに
場合により、前記IMiDは、サリドマイド、レナリドミド、及びポマリドミドからなる群から選択されるFDA承認薬物である、
請求項15~17のいずれか一項に記載の方法。
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