CN114574479A - 一种高通量组装嵌合抗原受体的方法及其应用 - Google Patents

一种高通量组装嵌合抗原受体的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高通量组装嵌合抗原受体的方法及其应用。该方法通过对CAR分子的模块之间和/或CAR分子前后端与载体骨架之间插入接头序列，该接头序列不影响CAR分子的正常功能，且可以作为CAR分子文库组装的通用接头分子；接头序列是三种氨基酸G、S、A中两个或三个的任意组合对应的碱基序列或载体骨架序列最外端两个或三个氨基酸所对应的碱基序列。该方法可以高效地使用Golden Gate组装技术进行CAR分子的高通量组装，在不影响CAR分子的功能的前提下可以大大提高CAR质粒构建的通量，同时极大地降低CAR质粒构建的时间和试剂成本。利用该方法可以构建CAR分子文库，为筛选找到理想的CAR候选分子提供了思路。

Description

一种高通量组装嵌合抗原受体的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高通量组装嵌合抗原受体的方法及其应用。
背景技术
一个典型的嵌合抗原受体CAR分子在结构上有四个按照顺序融合的模块，即抗原结合区、铰链区、跨膜区、信号区。虽说目前基于CD28和4-1BB的共刺激结构CAR-T在临床上已经取得成功，但是越来越多的研究同时也表明这四个模块的不同组合对CAR-T细胞的表型和功能具有协同性，即改变其中任何一个模块都可能影响CAR-T细胞的特异性、信号转导、杀伤、增殖、耗竭以及在体内的存续等，进而最终影响到CAR-T细胞的临床药效和安全性。
常规的CAR分子质粒构建是将四个模块的某种特定组合进行逐个质粒的单独构建，可以使用全基因合成或者经典的分子克隆策略进行，然后再进行后续的CAR病毒包装或者非病毒体系制备CAR分子，最后进行CAR-T细胞构建以及体外和体内药效和安全性评价。由于CAR分子的质粒构建和病毒包装以及药效学和安全性评价耗费的整体时间长，现有的技术平台通量低，如果要进行四个模块的组合构建大量的CAR分子质粒将耗费大量的时间、试剂和人力成本，因此，高通量组装CAR分子以及后续CAR分子的筛选方法对于找到理想的候选分子将非常关键。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种高通量组装嵌合抗原受体的方法，在不影响CAR分子的功能的基础上，可以高通量组装CAR分子和构建CAR文库，为CAR分子的筛选提供新的策略。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种高通量组装嵌合抗原受体的方法，通过对CAR分子不同模块之间和/或CAR分子前后端与载体骨架之间插入接头序列，该接头序列不影响CAR分子的正常功能，且可以作为CAR分子文库组装的通用接头分子。
进一步地，CAR分子文库组装的方法为Gibson Assembly组装方法或者GoldenGate组装方法。
进一步地，上述接头序列为三种氨基酸G、S、A中两个或三个的任意组合对应的碱基序列或载体骨架序列最外端两个或三个氨基酸所对应的碱基序列，该载体骨架序列最外端两个或三个氨基酸所对应的碱基序优选为ATCCCA；上述接头序列优选为ATCCCA、GCGGCCGCA、GCGGCA或GCCGCT。
进一步地，上述方法包括如下步骤：
步骤一，设计嵌合抗原受体质粒：针对CAR分子的全部模块或一些模块之间和/或CAR分子前后端与载体骨架之间设计接头序列；CAR分子的全部模块或一些模块之间的接头序列是三种氨基酸G、S、A中两个或三个的任意组合对应的碱基序列；CAR分子前后端与载体骨架之间的接头序列是三种氨基酸G、S、A中两个或三个的任意组合的碱基序列或是载体骨架序列最外端两个或三个氨基酸所对应的碱基序列；所有接头序列中都有4个碱基作为Golden Gate组装方法使用的限制性内切酶酶切的黏性末端序列；
步骤二，PCR扩增嵌合抗原受体中的各个模块：针对两端含有接头序列的模块的引物设计原则如下：
(1)每个片段的上游扩增引物结构如下：
片段5’接头前序列+片段5’接头序列+与模板配对区；
(2)每个片段的下游扩增引物结构如下：
片段3’接头前序列+片段5’接头序列的反向互补序列+与模板配对区；
步骤三，载体骨架的设计与构建：在载体骨架上添加Golden Gate组装方法使用的限制性内切酶的酶切位点序列和/或与CAR分子连接的第一与最后一个接头序列；
步骤四，采用Golden Gate组装技术组装重组质粒；
其中，步骤二中的接头前序列的结构是：随机保护碱基序列+Golden Gate限制性内切酶识别位点序列。
进一步地，上述模块包括抗原结合区、铰链区、跨膜区、信号区；该抗原结合区优选为单链抗体、纳米抗体、抗体结构类似蛋白或靶点对应的配体，其结合的抗原优选为α-甲胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、B7H3、Ba 733、BAFF-R、BAGE、BCMA、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD56、CD59、CD64、CD66a/b/c/e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD117、CD123、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CD319、CD371、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CLL1、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA、CEACAM-6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、EpCAM、纤维母细胞生长因子、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、GPRC5D、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素和它的亚单位、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导性因子、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子1、Igκ、IL1RAP、Lewis Y、LMP1、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子、MAGE、MAGE-3、MART1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MMG49、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、NKG2D、胰腺癌粘蛋白、PD-L1、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、ROR1、T101、SAGE、S100、存活素、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆逊-弗雷登里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bc1-2、bc1-6、Kras、致癌基因标志物或致癌基因产物；该铰链区优选为CD8、CD28、IgG1、IgG4、CH3、CH2-CH3、4-1BB、ICOS、OX40、CD40或CD80蛋白的铰链区或恒定区序列；该跨膜区优选为CD8a、CD28、CD4、ICOS、CD7、CD2、CD80、CD40、OX40、CD27、LFA-1、4-1BB、ICOS、CD3ζ或CD3ε蛋白的跨膜区；信号区优选选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、MYD88、CD40、KIR2DS2、DAP10、DAP12、CD3ζ、TLRs、CD2、LFA-1、CD8α、CD40、CD80、CD3ε蛋白的胞内区的一种或多种，或者以上蛋白胞内区的功能片段的一种或多种。
进一步地，上述限制性内切酶为BsaI、BbsI或BsmBI，其识别的位点优选依次为GGTCTC(1/5)^、GAAGAC(2/6)^和CGTCTC(1/5)^。
进一步地，上述方法还包括将重组质粒转化到大肠杆菌中进行质粒扩增和制备质粒文库以及测序验证。
本发明的第二方面是提供第一方面所述的方法在构建CAR分子文库中的应用，采用2种或2种以上的抗原结合区、铰链区、跨膜区和/或共刺激信号区，且设计的接头序列的组合经筛选保证组装正确率大于75％。
进一步地，上述抗原结合区包括核酸序列为SEQ ID NO：1-6和22中的一条或多条；铰链-跨膜区包括核酸序列为SEQ ID NO：7-10中的一条或多条；信号区分子包括核酸序列为SEQ ID NO：11-14中的一条或多条。
本发明的第三方面是提供本发明第一方面所述的方法组装的CAR分子文库。
本发明的第四方面是提供编码本发明第三方面所述的CAR分子文库的核酸序列文库。
本发明的第五方面是提供用于构建本发明第三方面所述的CAR分子文库的质粒文库。
本发明的第六方面是提供本发明第三方面所述的CAR分子文库修饰的CAR细胞文库。
本发明的第七方面是提供上述CAR分子文库、核酸序列文库、质粒文库或CAR细胞文库在制备治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫病的药物或试剂盒中的应用。
本发明的第八方面是提供本发明第三方面所述的CAR分子文库在筛选靶点CAR分子的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的一种高通量组装嵌合抗原受体的方法在CAR分子内的片段之间连接接头序列，从而可以高效地使用Golden Gate组装技术进行CAR分子的高通量组装，在不影响CAR分子的功能的前提下可以大大提高CAR质粒构建的通量，同时极大地降低CAR质粒构建的时间和试剂成本。此外，利用该方法可以构建CAR分子文库，为筛选找到理想的CAR候选分子提供了思路。
附图说明
图1是本发明一实施例中在CAR分子上加上接头序列的示例图；
图2是本发明一实施例中包括接头序列的CAR质粒的结构示意图；
图3显示了本发明一实施例中检测CAR-T阳性率的结果；
图4显示了本发明一实施例中构建的CAR-T杀伤实验结果；
图5显示了本发明一实施例中体外杀伤实验中各组细胞因子(IFN-γ)释放水平；
图6是本发明一实施例中对构建的文库96Lib进行质量控制过程中Golden Gate组装菌液的PCR结果；其中，“+”表示组装正确克隆，“-”表示组装不正确克隆；
图7显示了本发明一实施例中对构建的文库126Lib进行质量控制过程中GoldenGate组装菌液的PCR结果；其中，“+”表示组装正确克隆，“-”表示组装不正确克隆；
图8显示了本发明一实施例中检测由96Lib构建的CAR-T阳性率的结果；
图9显示了本发明一实施例中体外杀伤实验对靶细胞的杀伤结果；
图10显示了本发明一实施例中体外杀伤实验中各组细胞因子(IFN-γ)释放水平。
具体实施方式
本发明提供了一种高通量组装嵌合抗原受体的方法及其应用。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。以下实施例中序列方框位置为Golden Gate组装方法使用到的Bbs I酶切位点，下划线表示Golden Gate组装方法使用的限制性内切酶酶切的黏性末端序列。
以下描述的本发明所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并非意在限制本发明。
模块：在本发明中，“模块”特指CAR分子结构中的不同功能区域，如抗原结合区、铰链区、跨膜区、信号区；其中CAR的抗原结合区最常用的是单链抗体或者纳米抗体以及抗体结构类似蛋白如DARPin等，也可以使用靶点对应的配体作为抗原结合区，该抗原结合区特异性可识别并结合如下抗原分子中的至少一种：α-甲胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、B7H3、Ba 733、BAFF-R、BAGE、BCMA、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD56、CD59、CD64、CD66a/b/c/e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD117、CD123、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CD319、CD371、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CLL1、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA、CEACAM-6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、EpCAM、纤维母细胞生长因子、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、GPRC5D、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和它的亚单位、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导性因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子1、Igκ、IL1RAP、Lewis Y、LMP1、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子、MAGE、MAGE-3、MART1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MMG49、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、NKG2D、胰腺癌粘蛋白、PD-L1、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、ROR1、T101、SAGE、S100、存活素、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆逊-弗雷登里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bc1-2、bc1-6、Kras、致癌基因标志物和致癌基因产物、CLDN18、CLDN6等；上述CAR的铰链区常用的为CD8、CD28、IgG1、IgG4、CH3、CH2-CH3、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80等蛋白或者抗体的铰链区或恒定区序列，如下表1所示；CAR分子的跨膜区常用CD8a、CD28、CD4、ICOS、CD7、CD2、CD80、CD40、OX40、CD27、LFA-1、4-1BB、ICOS、CD3ζ、CD3ε等蛋白的跨膜区，如下表2所示；CAR的信号区分子可为CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、MYD88-CD40、KIR2DS2、DAP10、DAP12、CD3ζ、TLRs、CD2、LFA-1、CD8α、CD40、CD80、CD3ε等蛋白的胞内区的一种或者多种，或者是上述信号区分子胞内区的功能片段的一个或者多个，如下表3所示。
表1 CAR的铰链区信息
铰链区名称 UniProt登录号 氨基酸位置
CD8α P01732 138-182
CD28 P10747 114-152
IgG4-Hinge P01861 99-110
IgG4-CH3 P01861 221-327
IgG4/2-CH2-CH3 P01861/P01859 111-327
IgG2-Hinge P01859 99-110
IgG2-CH3 P01859 220-326
short CD28 P10747 138-152
CD7 P09564 131-180
表2 CAR的跨膜区信息
跨膜区名称 UniProt登录号 氨基酸位置
CD8α P01732 183-206
CD28 P10747 153-179
CD4 P01730 397-418
ICOS Q9Y6W8 141-161
CD7 P09564 181-201
CD2 P06729 210-235
CD80 P33681 243-263
CD40 P25942 194-215
OX40 P43489 215-235
CD27 P26842 192-212
CD11a P20701 1091-1111
4-1BB Q07011 187-213
ICOS Q9Y6W8 141-161
CD3ζ P20963 31-51
CD3ε P07766 127-152
CD18 P05107 701-723
表3 CAR的胞内区信息
Figure BDA0003517196050000081
Figure BDA0003517196050000091
Figure BDA0003517196050000101
Figure BDA0003517196050000111
Golden Gate组装：一种无缝DNA组装技术，其核心特点是使用IIS型限制性内切酶，如BsaI、BbsI、BsmBI等，这类限制性内切酶的识别位点是固定的碱基序列，但是切割位点与识别位点不同，例如BsaI，识别和切割位点表示为GGTCTC(N1/N5)，指的是识别位点为GGTCTC，切割位点为该序列3’端第1个碱基和反向互补序列的第5个碱基。
接头序列：特指不同CAR分子模块中添加的氨基酸序列所对应的碱基序列，接头序列用于不同模块间的Golden Gate组装。
实施例1
本实施例提供一种高通量组装嵌合抗原受体的方法，其包括如下步骤：
1.设计接头序列
在CAR分子的全部或某些片段(例如抗原结合区、铰链区、跨膜区、信号区分子1、信号区分子2、其他功能片段等)之间和/或CAR分子前后端加入接头序列(例，如图1所示)；其中，接头序列是三种氨基酸G、S、A中两个或三个的任意组合的碱基序列(如：GGG/SSA/AAA/GSA/AA/GG/SA等，理论上一共有36种组合，参见表5)，此外，与载体骨架相连的两个接头序列(即CAR分子前后连接的接头序列)也可以是载体骨架序列最外端两个或三个氨基酸所对应的包含Golden Gate组装方法使用的限制性内切酶所识别的酶切位点的序列。上述氨基酸G、S、A对应的密码子序列如下表4所示。
表4氨基酸G、S、A对应的密码子序列信息
Figure BDA0003517196050000121
Figure BDA0003517196050000131
表5接头序列的36种组合
接头长度：2个氨基酸 接头长度：3个氨基酸
GG GGG
SS GGS
AA GGA
GS GSG
GA GSS
SG GSA
SA GAG
AG GAS
AS GAA
SSS
SSG
SSA
SGS
SGG
SGA
SAS
SAG
SAA
AAA
AAG
AAS
AGA
AGG
AGS
ASA
ASG
ASS
2.扩增片段
2.1设计各个片段扩增引物
按照以下设计规则进行设计：
(1)每个片段的上游扩增引物结构如下：
片段5’接头前序列+片段5’接头序列+与模板配对区；
(2)每个片段的下游扩增引物结构如下：
片段3’接头前序列+片段5’接头序列的反向互补序列+与模板配对区的反向互补序列。
特别地，上述接头前序列的结构是：随机保护碱基序列+Golden Gate限制性内切酶识别位点序列，例如针对序列如SEQ ID NO：1所示的抗原结合区设计的上游扩增引物为：
Figure BDA0003517196050000141
下游扩增引物为：
Figure BDA0003517196050000142
2.2片段扩增体系
片段全部由CRO公司进行全基因合成后通过PCR进行扩增得到，其扩增体系和PCR扩增条件如下表6和表7：
表6 PCR扩增体系
Figure BDA0003517196050000143
表7 PCR扩增条件
Figure BDA0003517196050000144
Figure BDA0003517196050000151
3.载体骨架的设计与构建
载体骨架的设计核心是要在CAR载体骨架上添加Golden Gate组装的酶切位点序列和与CAR分子连接的第一与最后一个接头序列，从而保证文库组装后CAR读码框的正确性。
例如：如果接头序列是ATCCCA和GCCGCT，那么插入到CAR载体骨架上的序列是：
Figure BDA0003517196050000152
按照常规基因合成方法进行构建载体骨架即可，并且要确保所使用的GoldenGate组装限制酶切位点在载体的其他区域没有。
4.Golden Gate组装重组质粒
按照如下表8配制Golden Gate反应体系；Golden Gate反应条件如下表9。
表8 Golden Gate反应体系
试剂名称 加样量(μl或ng)
抗原结合区等摩尔混合片段 100ng
铰链区等摩尔混合片段 50ng
跨膜区等摩尔混合片段 50ng
共刺激信号区等摩尔混合片段 50ng
CAR载体骨架质粒 1000ng
5×T4 DNA ligase buffer 4μl
BbsI或BsaI或BsmBI 1μl
T4 DNA ligase 1μl
ddH<sub>2</sub>O 补足至20μl
表9 Golden Gate反应条件
Figure BDA0003517196050000161
将反应产物按照常规化学转化或者电穿孔转化法进行转化并涂平板进行文库制备。
实施例2
本实施例提供一种采用实施例1提供的方法组装的嵌合抗原受体P21126Lib17，该构建包括载体骨架、抗原结合区、铰链-跨膜区和共刺激信号区一共4个片段(如图2)，该嵌合抗原受体中各个模块的序列和接头序列如下表10。该嵌合抗原受体的构建方法如下：
表10各个模块以及接头序列的具体信息
Figure BDA0003517196050000162
Figure BDA0003517196050000171
使用Golden Gate组装成功后，然后接下来进行慢病毒包装和CAR-T制备以及杀伤等功能评估：
一，慢病毒包装
将抽提好的中抽质粒P21126Lib17进行慢病毒包装，具体步骤如下：
1.实验前需确认293T细胞状态(包括细胞形态、扩增状况、传代数小于15代)；
2.第一天铺板293T细胞(T75培养瓶约接种6-7×106个细胞，培养基体积25ml，T175培养瓶中接种约15-18×106个细胞，培养基体积40ml)；
3.第二天包病毒前，需确认293T细胞汇合度在70％-80％以上，且小于95％，并进行等体积换液，换液后继续培养，等待Tube A和Tube B混合液准备好；
4.分别配置Tube A和Tube B(T175和T75体积不同，具体如下所述)，并进行颠倒或者低速振荡混匀；
T175体系：
Tube A：Opti-MEM(4.6ml)+Lipo3000(129μl)
Tube B：Opti-MEM(4.6ml)+P3000(111μl)+辅助质粒PZ201/PZ202/PZ203(41.4μg，1：1：1质量比)+P21126Lib17质粒(13.8μg)；
T75体系：
Tube A：Opti-MEM(2ml)+Lipo3000(55μl)
Tube B：Opti-MEM(2ml)+P3000(46μl)+辅助质粒PZ201/PZ202/PZ203(18μg，1：1：1质量比)+P21126Lib17质粒(6μg)。
5.将Tube A加入到Tube B中，振荡混匀，室温孵育15分钟；
6.将第3步中换过液的培养瓶翻面，使培养基处于培养瓶另一面，将Tube A+B混合物加入，轻摇混匀后，再将培养瓶缓慢翻回正面；
7.放回培养箱中培养2天后，收集上清，500g离心10min，用0.45μm滤器过滤上清至50ml离心管中，包好封口膜，10000g，4℃离心2h，可见沉淀；
8.在生物安全柜中，弃上清，将离心管倒扣在外科用纱布上，3min后，取新的纱布轻轻擦拭管内壁，注意不要碰到沉淀；
9.用200μl X-vivo培养基溶解沉淀后，取2μl进行滴度测定，剩余贴好标签，标明LV病毒ID编号、制备批次、制备人和分装体积，后置于-80℃保存。
二、CAR-T制备过程
将上步骤制备好的P21126Lib17慢病毒进行CAR-T制备，具体步骤如下：
第0天细胞复苏
a)准备含有25×106个PBMC细胞的冻存管。
b)实验准备：配制CD2/3/28磁珠混合物；配制包含IL-2(浓度为300U/ml)的T细胞培养基；准备10倍PBMC冻存体积的PBS；准备用于分选的磁铁、架子、分选柱子和CD3 Beads。
c)水浴锅复苏PBMC冻存管，转到离心管中混合后计数，然后再按照CD3beads使用要求进行离心，后充分混匀于4℃孵育15分钟。
d)分选柱子放置磁铁卡槽内，加入上述步骤中孵育的PBMC细胞悬液自然流下的为非CD3细胞，使用X-VIVO培养基冲洗2次，后从磁铁卡槽中取下柱子，使用X-VIVO培养基冲洗，流出样品为CD3细胞并计数；假定收到8×106个CD3细胞，使用EP管，CD2/CD3/CD28磁珠混合物取40μl，加至少400μlX-VIVO培养基，300g*5min，弃上清，加入200μl培养基。
e)调为2.5M/ml(4×106个CD3+细胞*2孔，1.6ml*2孔)的细胞密度，补足培养基，转移到24孔板中进行培养。
第1天在十二孔板中进行RetroNectin(重组人纤维连接片段)预包被
a)感染分组：需十二板的4孔。
b)取96μlRetroNectin母液(1μg/μl)加到4ml PBS中混匀，1ml/孔。
c)封口膜封好板子后于4℃过夜孵育。
第1天T细胞感染
a)RetroNectin板从冰箱取出，弃上清，用PBS洗两遍，加入1ml/孔PBS，待用。
b)感染分组：每组感染2×106个T细胞，剩余细胞作为对照组，至少共需6×106个T细胞(1；2；3组)+2×106个T细胞(第4组)。
c)吹散细胞团，取样，计数及细胞活率。
d)按照实验分组，取出总数为6×106的细胞悬液，1100rpm，离心10min；弃上清后调整密度为2.5×106个细胞/ml。
e)感染：分3组每2×106个细胞(0.8ml)，与指定MOI病毒浓缩液混合，补培养基至终体积为1ml。
f)RetroNectin板吸弃PBS，将细胞-病毒混合液加入板中，离心300g*110分钟(或直接置于培养箱培养)。
g)4～6h后，每孔补加1ml T细胞完全培养基。
第2天T细胞密度调整
a)准备：T细胞完全培养基(加入了300U/ml IL-2)。
b)将T细胞轻轻吹散，取样计数，用T细胞完全培养基调整密度为0.5～0.8×106个/ml。视细胞增殖状态进行合理的密度调整，至少隔天进行计数补液。
第5天感染率检测
a)准备：anti-VHH-APC
b)取感染CAR-T和unT细胞于EP管中，离心300g*5min，弃上清，用Buffer(含2％FBS的PBS溶液)清洗，用100μl Buffer重悬细胞。
c)样品：按400X使用anti-VHH-APC，4℃避光孵育30min，然后用Buffer清洗。
d)流式细胞仪，上机检测，unT组和P21126Lib17组CAR-T阳性率如图3所示。
三、CAR-T体外杀伤实验
1.效应细胞及靶细胞处理
(1)效应细胞处理
将P21126(无接头序列对照CAR分子)CAR-T细胞P21126Lib17(P21126CAR分子中加入了接头序列CAR分子)CAR-T细胞及unT细胞培养至第4-8天左右，流式检测CAR阳性率和CD3比例(可根据需要检测TIM3及PD1等)，根据CD3+和CAR+比例加入T细胞，调整各CAR-T组为相同阳性率，取适当数量CAR-T组及unT细胞，300g离心5min，加入含5％FBS的X-VIVO培养基，调整细胞至适当密度。
(2)靶细胞处理
将靶细胞消化处理，计数，根据需要取一定量靶细胞(例如NUGC-4细胞)，300g离心5min，用含5％FBS的X-VIVO培养基，调整细胞至2×105个/ml，在96孔板中，每孔加100μl靶细胞，即2×104个/孔，培养过夜后进行杀伤实验。
2.实验组设置(以96孔板为例)：
将P21126 CAR-T细胞和P21126Lib17 CAR-T细胞的CAR阳性率调整为同一比例，可使用unT进行调整；后按照下述步骤布板：
a.效应细胞组1与靶细胞，效靶比2:1，靶细胞总数2×104个/孔，共100μl，效应细胞4×104个加至反应板，补液至总体积200μl，每组两个复孔；
b.效应细胞组2与靶细胞，效靶比0.5:1，靶细胞总数2×104个/孔，共100μl，效应细胞1×104个加至反应板，补液至总体积200μl，每组两个复孔；
3.杀伤实验
效应细胞与靶细胞共孵育24h后，流式检测并分析靶细胞杀伤比例，可按需要检测其他标志物，结果如图4和图5。
由结果可知，在2:1和0.5:1两种效靶比条件下，加入了GoldenGate组装接头的P21126Lib17与不加入接头的P21126的两个构建的杀伤效果类似，可判定接头的加入不影响CAR分子的功能。
实施例3
本实施例利用实施例1提供的方法构建CAR文库96Lib并对其进行质量评估，具体的构建过程和结果如下：
1.文库中CAR包括3个模块：抗原结合区、铰链-跨膜区和信号区分子1，包含的模块信息如下表11，结构如图2所示。
表11 96Lib的CAR分子文库各个模块和接头序列的信息
Figure BDA0003517196050000201
Figure BDA0003517196050000211
2.扩增片段：按照实施例1的方法对上述模块进行设计引物和PCR扩增。
3.构建载体骨架：按照实施例1提供的设计思路进行设计，构建的载体骨架序列为SEQ ID NO：21。
4. 96Lib文库的Golden Gate组装实验，按照表8配制Golden Gate反应体系，反应条件如表9所示。将反应产物按照常规化学转化或者电穿孔转化法进行转化并涂平板进行文库制备。
5. 96Lib文库的质量控制
96Lib文库的多样性是96，要求的单克隆总数是10倍多样性，即需要大于960个克隆，实际的单克隆总数约为3000，其Golden Gate组装菌液PCR结果如图6所示，组装成功率为92％，克隆测序正确率约为80％。此外，部分测序克隆的CAR结构如下表12所示。
表12部分克隆的CAR结构的测序结果
Figure BDA0003517196050000212
Figure BDA0003517196050000221
实施例4
本实施例利用实施例1提供的方法构建CAR文库126Lib并对其进行质量评估，具体的构建过程和结果如下：
1.文库中CAR包括3个模块：抗原结合区、铰链-跨膜区和信号区分子1，包含的模块信息如下表13，结构如图2所示。
表13 126Lib的CAR分子文库各个模块和接头序列的信息
模块 序列多样性 序列表ID 5’接头序列 3’接头序列
抗原结合区 1 SEQ ID NO：22 AT<u>CCCA</u> GC<u>GGCC</u>GCA
铰链-跨膜区 4 SEQ ID NO：7-10 GC<u>GGCC</u>GCA <u>GCGG</u>CA
信号区分子1 4 SEQ ID NO：11-14 <u>GCGG</u>CA <u>GCCG</u>CT
2.扩增片段：按照实施例1的方法对上述模块进行设计引物和PCR扩增。
3.构建载体骨架：按照实施例1提供的设计思路进行设计，构建的载体骨架序列为SEQ ID NO：21。
4. 126Lib文库的Golden Gate组装实验，按照表8配制Golden Gate反应体系，反应条件如表9所示。将反应产物按照常规化学转化或者电穿孔转化法进行转化并涂平板进行文库制备。
5. 126Lib文库的质量控制
126Lib文库的多样性是16，要求的单克隆总数是10倍多样性，即需要大于160个克隆，实际的单克隆总数约为2000，其Golden Gate组装菌液PCR结果如图7所示，组装成功率为85％，克隆测序正确率约为75％。此外，部分测序克隆的CAR结构如下表14所示。
表14部分克隆的CAR结构的测序结果
测序克隆ID号 抗原结合区模块 铰链-跨膜区模块 信号分子1模块 信号分子2-CD3zeta
P21126Lib1 SEQ ID NO：22 CD7 OX40 完整
P21126Lib2 SEQ ID NO：22 short CD28 CD28 完整
P21126Lib4 SEQ ID NO：22 CD8 4-1BB 完整
P21126Lib5 SEQ ID NO：22 CD8 OX40 完整
P21126Lib7 SEQ ID NO：22 short CD28 CD28 完整
P21126Lib11 SEQ ID NO：22 CD8 4-1BB 完整
P21126Lib12 SEQ ID NO：22 short CD28 模块缺失 完整
P21126Lib14 SEQ ID NO：22 short CD28 4-1BB 完整
P21126Lib16 SEQ ID NO：22 CD8 OX40 完整
P21126Lib19 SEQ ID NO：22 CD7 4-1BB 完整
P21126Lib24 SEQ ID NO：22 模块缺失 CD28 完整
P21126Lib26 SEQ ID NO：22 CD28 OX40 完整
P21126Lib27 SEQ ID NO：22 short CD28 OX40 完整
P21126Lib28 SEQ ID NO：22 short CD28 CD28 完整
P21126Lib29 SEQ ID NO：22 short CD28 CD28 完整
P21126Lib30 SEQ ID NO：22 short CD28 ICOS 完整
P21126Lib32 SEQ ID NO：22 short CD28 CD28 完整
实施例5
本实施例验证实施例3制备的CAR文库96Lib的功能，具体的实验步骤和结果如下：
一、96Lib文库质粒包装慢病毒
将抽提好的96Lib文库质粒进行慢病毒包装，具体步骤如下：
1.实验前需确认293T细胞状态(包括细胞形态、扩增状况、传代数小于15代)；
2.第一天铺板293T细胞(T75培养瓶约接种6-7×106个细胞，培养基体积25ml，T175培养瓶中接种约15-18×106个细胞，培养基体积40ml)；
3.第二天包病毒前，需确认293T细胞汇合度在70％-80％以上，且小于95％，并进行等体积换液，换液后继续培养，等待Tube A和Tube B混合液准备好；
4.分别配置Tube A和Tube B(T175和T75体积不同，具体如下所述)，并进行颠倒或者低速振荡混匀；
T175体系：
Tube A：Opti-MEM(4.6ml)+Lipo3000(129μl)
Tube B：Opti-MEM(4.6ml)+P3000(111μl)+辅助质粒PZ201/PZ202/PZ203(41.4μg，1：1：1质量比)+96Lib文库质粒(13.8μg)；
T75体系：
Tube A：Opti-MEM(2ml)+Lipo3000(55μl)
Tube B：Opti-MEM(2ml)+P3000(46μl)+辅助质粒PZ201/PZ202/PZ203(18μg，1：1：1质量比)+96Lib文库质粒(6μg)。
5.将Tube A加入到Tube B中，振荡混匀，室温孵育15分钟；
6.将第3步中换过液的培养瓶翻面，使培养基处于培养瓶另一面，将Tube A+B混合物加入，轻摇混匀后，再将培养瓶缓慢翻回正面；
7.放回培养箱中培养2天后，收集上清，500g离心10min，用0.45μm滤器过滤上清至50ml离心管中，包好封口膜，10000g，4℃离心2h，可见沉淀；
8.在生物安全柜中，弃上清，将离心管倒扣在外科用纱布上，3min后，取新的纱布轻轻擦拭管内壁，注意不要碰到沉淀；
9.用200μl X-VIVO培养基溶解沉淀后，取2μl进行滴度测定，剩余贴好标签，标明LV病毒ID编号、制备批次、制备人和分装体积，后置于-80℃保存。
二、96Lib慢病毒制备CAR-T
将上步骤制备好的96Lib慢病毒进行CAR-T制备，具体步骤如下：
第0天细胞复苏
a)准备含有25×106个PBMC细胞的冻存管。
b)实验准备：配制CD2/3/28磁珠混合物；配制包含IL-2(浓度为300U/ml)的T细胞培养基；准备10倍PBMC冻存体积的PBS；准备用于分选的磁铁、架子、分选柱子和CD3 Beads。
c)水浴锅复苏PBMC冻存管，转到离心管中混合后计数，然后再按照CD3beads使用要求进行离心，后充分混匀于4℃孵育15分钟。
d)分选柱子放置磁铁卡槽内，加入上述步骤中孵育的PBMC细胞悬液自然流下的为非CD3细胞，使用X-VIVO培养基冲洗2次，后从磁铁卡槽中取下柱子，使用X-VIVO培养基冲洗，流出样品为CD3细胞并计数；假定收到8×106个CD3细胞，使用EP管，CD2/CD3/CD28磁珠混合物取40μl，加至少400μlX-VIVO培养基，300g*5min，弃上清，加入200μl培养基。
e)调为2.5M/ml(4×106个CD3+细胞*2孔，1.6ml*2孔)的细胞密度，补足培养基，转移到24孔板中进行培养。
第1天在十二孔板中进行RetroNectin预包被
a)感染分组：需十二板的4孔。
b)取96μlRetroNectin母液(1μg/μl)加到4ml PBS中混匀，1ml/孔。
c)封口膜封好板子后于4℃过夜孵育。
第1天T细胞感染
a)RetroNectin板从冰箱取出，弃上清，用PBS洗两遍，加入1ml/孔PBS，待用。
b)感染分组：每组感染2×106个T细胞，剩余细胞作为对照组，至少共需6×106个T细胞(1；2；3组)+2×106个T细胞(第4组)。
c)吹散细胞团，取样，计数及细胞活率。
d)按照实验分组，取出总数为6×106的细胞悬液，1100rpm，10min离心；弃上清后调整密度为2.5×106个细胞/ml。
e)感染：分3组每2×106个细胞(0.8ml)，与指定MOI病毒浓缩液混合，补培养基至终体积为1ml。
f)弃RetroNectin板中的PBS，将细胞-病毒混合液加入板中，离心300g*110分钟(或直接置于培养箱培养)。
g)4～6h后，每孔补加1ml T细胞完全培养基。
第2天T细胞密度调整
a)准备：T细胞完全培养基(加入了300U/ml IL-2)。
b)将T细胞轻轻吹散，取样计数，用T细胞完全培养基调整密度为0.5～0.8×106个/ml。视细胞增殖状态进行合理的密度调整，至少隔天进行计数补液。
第5天感染率检测
a)准备：anti-VHH-APC
b)取CAR-T和unT细胞于EP管中，离心300g*5min，弃上清，用Buffer(含2％FBS的PBS溶液)洗，用100μl Buffer重悬细胞。
c)样品：按400X使用anti-VHH-APC，4℃避光孵育30min，然后用Buffer清洗。
d)流式细胞仪，上机检测，unT组和96Lib组CAR-T阳性率如图8所示。
三、96Lib CAR-T体外杀伤实验
1.效应细胞及靶细胞处理
(1)效应细胞处理
将96Lib CAR-T细胞、同靶点单个CAR分子构建P21126 CAR-T细胞和P21126Lib17CAR-T细胞以及同靶点文库P21126LibCAR-T细胞及unT细胞培养至第4-8天左右，流式检测CAR阳性率和CD3比例(可根据需要检测TIM3及PD1等)，根据CD3+和CAR+比例加入T细胞，调整各CAR-T组为相同阳性率，取适当数量CAR-T组及unT细胞，300g离心5min，加入含5％FBS的X-VIVO培养基，调整细胞至适当密度。
(2)靶细胞处理
将靶细胞消化处理，计数，根据需要取一定量靶细胞(例如NUGC-4细胞)，300g离心5min，用含5％FBS的X-VIVO培养基，调整细胞至2×105个/ml，在96孔板中，每孔加100μl靶细胞，即2×104个/孔，培养过夜后进行杀伤实验；
2.实验组设置(以96孔板为例)：
将96Lib CAR-T细胞、同靶点单个CAR分子构建P21126 CAR-T细胞和P21126Lib17CAR-T细胞以及同靶点文库P21126Lib CAR-T细胞的CAR阳性率调整为同一比例，可使用unT进行调整；后按照下述步骤布板：
a.效应细胞组1与靶细胞，效靶比2:1，靶细胞总数2×104个/孔，共100μl，效应细胞4×104个加至反应板，补液至总体积200μl，每组两个复孔；
b.效应细胞组2与靶细胞，效靶比0.5:1，靶细胞总数2×104个/孔，共100μl，效应细胞1×104个加至反应板，补液至总体积200μl，每组两个复孔；
3.杀伤实验
效应细胞与靶细胞共孵育24h后，流式检测并分析靶细胞杀伤比例，可按需要检测及其他标志物，结果如图9和10。
由结果可知，在2:1和0.5:1两种效靶比条件下，96Lib组的杀伤与同靶点的单个CAR分子构建P21126和P21126Lib17以及另一个同靶点的文库126Lib的杀伤能力相当，可判定96Lib的文库CAR分子的功能正常。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 苏州易慕峰生物科技有限公司
<120> 一种高通量组装嵌合抗原受体的方法及其应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgcggctg 60
agctgcgctg ctagcggctc cttcttcagg ggtcctgtag gtgaatggta caggcaggct 120
cctggcaagg gcagggagct ggtggctccc gctgggatag attaccgaag accggtaggc 180
aattcaccac cgtgcaggag caccatctcc cgggataatg ctaagaacac cgtgtacctg 240
cagatgaata gcctgaagcc cgaggacacc gccgtgtact attgcaacgt ggagccgacg 300
tttatccaca cagttgggcc acttgggtgg ggccagggca ccctggtgac agtgagctcc 360
<210> 2
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 2
gaggtccaac tcgtggagtc cggcgggggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ctagcggcaa catcttcaga actgactacc ggcagtggta cagacaagcc 120
cccggcaagg gcagagagct ggtggcctca gccctgcgag caaggaggca aacaagctgc 180
ccacgacccg aggagagatt caccatcagc agagacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcaacgc cggacgagtc 300
ttagccggct gccacaaccg ggatgcctgg tggggccaag gcaccctggt gaccgtgagc 360
agc 363
<210> 3
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 3
gaggtccaag tcgtggagtc cggcgggggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ctagcggcaa catcttcaga tccacggcag atcgatggta cagacaagcc 120
cccggcaagg gcagagagct ggtggccaca gcccgaacac cggatgcgca gcgcgtcaaa 180
gcgcgggcgt gcaccagatt caccatcagc agagacaacg ccaagaacac catgtacctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcaacgc ccagtggggt 300
ccgccaagac cccacattcg gggtaccagt tggggccaag gcaccctggt gaccgtgagc 360
agc 363
<210> 4
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 4
gaggtgcaac tcgtcgagag cgggggcggc ctggtgcaac ccggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ctagcggcag cttcttcaga ggccctagtg gtagctggta cagacaagcc 120
cccggcagcc aaagagagct ggtggccaga aaaggtgagg gagagaccac cgccaacacg 180
ctacacgcca ggctcagatt caccatcagc agagacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcaacgt gaccttcgat 300
aggcgggttg accacgtccc tgaaacatgg ggccaaggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210> 5
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 5
gaagtgcagc tggtcgagag cggcggcggg ctggtgcagc ccggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ctagcggcag catcttcagc ggaaattggc gctgctggta cagacaagcc 120
cccggcaagc agagagagct ggtggccacg aggaccggaa aagagccaca ggaccggcta 180
gctgtgcacg cccccagatt caccatcagc agagacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcaacgc cgcaggtatc 300
ggaccgagac tccggaaccc ccacgggacg cggttgtggg gccaaggcac cctggtgacc 360
gtgagcagc 369
<210> 6
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 6
caggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggcag catcttcaac gcttggcgta cgtcgtggta cagacaggcc 120
cctggcaaac agagagagct ggttgccgtc actcgccggc tacgtccagg cagtatgacc 180
ggaggctgct ctacaagatt caccatcagc cgggacaacg ccaagaacac cgtgtacctg 240
cagatgaaca gcctgaagcc tgaggacacc gccgtgtact actgcaacgt gtgttgcgcg 300
aggcggaggt ggtacatggt cctcccttgg ggccagggca cactggtcac agtgtcatct 360
<210> 7
<211> 207
<212> DNA
<213> CD8铰链区-跨膜区（人工序列）
<400> 7
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 213
<210> 8
<211> 198
<212> DNA
<213> CD28铰链区-跨膜区（人工序列）
<400> 8
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120
tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180
tttattattt tctgggtg 204
<210> 9
<211> 213
<212> DNA
<213> CD7铰链区-跨膜区（人工序列）
<400> 9
gtgacagagg aacagtccca aggatggcac agatgctcgg acgccccacc aagggcctct 60
gccctccctg ccccaccgac aggctccgcc ctccctgacc cgcagacagc ctctgccctc 120
cctgacccgc cagcagcctc tgccctccct gcggccctgg cggtgatctc cttcctcctc 180
gggctgggcc tgggggtggc gtgtgtgctg gcg 219
<210> 10
<211> 126
<212> DNA
<213> 截短CD28铰链区-跨膜区（人工序列）
<400> 10
aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg 60
gtggttgggg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 120
tgggtg 130
<210> 11
<211> 123
<212> DNA
<213> CD28胞内信号区（人工序列）
<400> 11
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 127
<210> 12
<211> 126
<212> DNA
<213> 4-1BB胞内信号区（人工序列）
<400> 12
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 130
<210> 13
<211> 126
<212> DNA
<213> OX40胞内信号区（人工序列）
<400> 13
gccctgtacc tgctccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 60
ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 120
aagatc 130
<210> 14
<211> 114
<212> DNA
<213> ICOS胞内信号区（人工序列）
<400> 14
tgttggctta caaaaaagaa gtattcatcc agtgtgcacg accctaacgg tgaatacatg 60
ttcatgagag cagtgaacac agccaaaaaa tctagactca cagatgtgac ccta 116
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 15
actgcaggaa gactccccag aggtgcagct ggtggag 37
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 16
cgttatgaag acctccgggg agctcactgt caccagg 37
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 17
cccaaggtct tcataacgta tgcacgagaa gactcgccg 39
<210> 18
<211> 399
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 18
actgcaggaa gactccccag aggtgcagct ggtggagagc ggcggcggac tggtgcagcc 60
tggaggaagc ctgcggctga gctgcgctgc tagcggctcc ttcttcagga tcgtggctaa 120
gggttggtac aggcaggctc ctggcaaggg cagggagctg gtggctacca tcaccagggg 180
cggctccacc tattatgccg atagcatgaa gggcaggagc accatctccc gggataatgc 240
taagaacacc gtgtacctgc agatgaatag cctgaagccc gaggacaccg ccgtgtacta 300
ttgcaacgtg cggatggagg tgcccttcgt gcagcctaac gattactggg gccagggcac 360
cctggtgaca gtgagctccg cggccaggtc ttcataacg 411
<210> 19
<211> 238
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 19
actgcaggaa gactcggccg caattgaagt tatgtatcct cctccttacc tagacaatga 60
gaagagcaat ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac ctttgtccaa gtcccctatt 120
tcccggacct tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt gggggagtcc tggcttgcta 180
tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg gcggaggtct tcataacg 244
<210> 20
<211> 162
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 20
actgcaggaa gactcgcggc aaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 60
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 120
cgcgacttcg cagcctatcg ctccgccgag gtcttcataa cg 166
<210> 21
<211> 7625
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 21
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240
ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300
gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360
tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420
ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagaggagc tctctcgacg caggactcgg 480
cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac tggtgagtac gccaaaaatt 540
ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg 600
agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa 660
ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 720
ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca 780
ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 840
aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa 900
agtaagacca ccgcacagca agcggccact gatcttcaga cctggaggag gagatatgag 960
ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt 1020
agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg 1080
agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 1140
gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 1200
gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 1260
ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg 1320
gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa 1380
taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa 1440
caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa 1500
tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac 1560
aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag 1620
aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc 1680
gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga 1740
aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg aacggatctc gacggtatcg 1800
gttaactttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga 1860
cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aattcaaaat 1920
tttatcgata agcttgggag ttccgggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc 1980
gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag 2040
gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg 2100
tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt 2160
tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg 2220
ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc 2280
cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc 2340
gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg 2400
gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg 2460
acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca 2520
cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac 2580
atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca 2640
agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc 2700
ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc 2760
tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc 2820
cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccactgagta 2880
ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg 2940
ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt 3000
taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc 3060
ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc 3120
gtgactcgag ctcaagcttc gaattcgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc 3180
tctgtgagtt accacaccca gcattcctcc tgatcccaag gtcttcataa cgtatgcacg 3240
agaagactcg ccgctagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 3300
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 3360
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 3420
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 3480
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 3540
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaaggatcc 3600
acctggtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta 3660
actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta 3720
ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt 3780
atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg 3840
caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt 3900
tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag 3960
gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc 4020
cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc 4080
cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc 4140
ttccgcgtca tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc 4200
ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa 4260
gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gataagatct gctttttgct 4320
tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg 4380
aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt 4440
ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc 4500
tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga 4560
atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 4620
agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 4680
aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca 4740
tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 4800
ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 4860
gcttttttgg aggcctagac ttttgcagag accaaattcg taatcatgtc atagctgttt 4920
cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 4980
tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 5040
cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 5100
gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 5160
tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 5220
acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 5280
aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 5340
cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 5400
gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 5460
tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 5520
tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 5580
cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 5640
gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 5700
ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 5760
ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 5820
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 5880
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 5940
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 6000
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 6060
tctgacagtc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga 6120
gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca 6180
atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag 6240
tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca 6300
tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgcgcgcct tgagcctggc gaacagttcg 6360
gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc 6420
atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc 6480
ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga 6540
gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt 6600
cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac 6660
gatagccgcg ctgcctcgtc ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca 6720
aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt 6780
gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg 6840
tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg atcagatctt 6900
gatcccctgc gccatcagat ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac tttgcagggc 6960
ttcccaacct taccagaggg cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc tgtccataaa 7020
accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag ctacctgctt tctctttgcg 7080
cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat tcatcccaca tttccccgaa 7140
aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 7200
gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 7260
tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 7320
gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag 7380
agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 7440
gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat 7500
cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat 7560
taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgcca 7620
agctg 7879
<210> 22
<211> 768
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 22
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgcggctg 60
agctgcgctg ctagcggctc cttcttcagg ggtcctgtag gtgaatggta caggcaggct 120
cctggcaagg gcagggagct ggtggctccc gctgggatag attaccgaag accggtaggc 180
aattcaccac cgtgcaggag caccatctcc cgggataatg ctaagaacac cgtgtacctg 240
cagatgaata gcctgaagcc cgaggacacc gccgtgtact attgcaacgt ggagccgacg 300
tttatccaca cagttgggcc acttgggtgg ggccagggca ccctggtgac agtgagctcc 360
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggaggt ccaagtcgtg 420
gagtccggcg ggggcctggt gcagcccggc ggcagcctga gactgagctg cgccgctagc 480
ggcaacatct tcagatccac ggcagatcga tggtacagac aagcccccgg caagggcaga 540
gagctggtgg ccacagcccg aacaccggat gcgcagcgcg tcaaagcgcg ggcgtgcacc 600
agattcacca tcagcagaga caacgccaag aacaccatgt acctgcagat gaacagcctg 660
agagccgagg acaccgccgt gtactactgc aacgcccagt ggggtccgcc aagaccccac 720
attcggggta ccagttgggg ccaaggcacc ctggtgaccg tgagcagc 768

Claims (15)

1.一种高通量组装嵌合抗原受体的方法，其特征在于，通过对CAR分子不同模块之间和/或CAR分子前后端与载体骨架之间插入接头序列，该接头序列不影响CAR分子的正常功能，且可以作为CAR分子文库组装的通用接头分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，CAR分子文库组装的方法为GibsonAssembly组装方法或者Golden Gate组装方法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头序列为三种氨基酸G、S、A中两个或三个的任意组合对应的碱基序列或载体骨架序列最外端两个或三个氨基酸所对应的碱基序列，所述载体骨架序列最外端两个或三个氨基酸所对应的碱基序优选为ATCCCA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，设计嵌合抗原受体质粒：针对CAR分子的全部模块或一些模块之间和/或CAR分子前后端与载体骨架之间设计接头序列；CAR分子的全部模块或一些模块之间的接头序列是三种氨基酸G、S、A中两个或三个的任意组合对应的碱基序列；CAR分子前后端与载体骨架之间的接头序列是三种氨基酸G、S、A中两个或三个的任意组合的碱基序列或是载体骨架序列最外端两个或三个氨基酸所对应的碱基序列；所有接头序列中都有4个碱基作为GoldenGate组装方法使用的限制性内切酶酶切的黏性末端序列；
步骤二，PCR扩增嵌合抗原受体中的各个模块：针对两端含有接头序列的模块的引物设计原则如下：
(1)每个片段的上游扩增引物结构如下：
片段5’接头前序列+片段5’接头序列+与模板配对区；
(2)每个片段的下游扩增引物结构如下：
片段3’接头前序列+片段5’接头序列的反向互补序列+与模板配对区；
步骤三，载体骨架的设计与构建：在载体骨架上添加Golden Gate组装方法使用的限制性内切酶的酶切位点序列和/或与CAR分子连接的第一与最后一个接头序列；
步骤四，采用Golden Gate组装技术组装重组质粒；
其中，步骤二中的接头前序列的结构是：随机保护碱基序列+Golden Gate限制性内切酶识别位点序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述模块包括抗原结合区、铰链区、跨膜区、信号区；所述抗原结合区优选为单链抗体、纳米抗体、抗体结构类似蛋白或靶点对应的配体，其结合的抗原优选为α-甲胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、B7H3、Ba 733、BAFF-R、BAGE、BCMA、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD56、CD59、CD64、CD66a/b/c/e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD117、CD123、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CD319、CD371、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CLL1、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA、CEACAM-6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、EpCAM、纤维母细胞生长因子、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、GPRC5D、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素和它的亚单位、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导性因子、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子1、Igκ、IL1RAP、Lewis Y、LMP1、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子、MAGE、MAGE-3、MART1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MMG49、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、NKG2D、胰腺癌粘蛋白、PD-L1、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、ROR1、T101、SAGE、S100、存活素、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆逊-弗雷登里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bc1-2、bc1-6、Kras、致癌基因标志物或致癌基因产物；所述铰链区优选为CD8、CD28、IgG1、IgG4、CH3、CH2-CH3、4-1BB、ICOS、OX40、CD40或CD80蛋白的铰链区或恒定区序列；所述跨膜区优选为CD8a、CD28、CD4、ICOS、CD7、CD2、CD80、CD40、OX40、CD27、LFA-1、4-1BB、ICOS、CD3ζ或CD3ε蛋白的跨膜区；信号区优选选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、MYD88、CD40、KIR2DS2、DAP10、DAP12、CD3ζ、TLRs、CD2、LFA-1、CD8α、CD40、CD80、CD3ε蛋白的胞内区的一种或多种，或者以上蛋白胞内区的功能片段的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为BsaI、BbsI或BsmBI。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括将重组质粒转化到大肠杆菌中进行质粒扩增和制备质粒文库以及测序验证。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法在构建CAR分子文库中的应用，其特征在于，采用2种或2种以上的抗原结合区、铰链区、跨膜区和/或共刺激信号区，且设计的接头序列的组合经筛选保证组装正确率大于75％。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗原结合区包括核酸序列为SEQ IDNO：1-6和22中的一条或多条；铰链-跨膜区包括核酸序列为SEQ ID NO：7-10中的一条或多条；所述信号区分子包括核酸序列为SEQ ID NO：11-14中的一条或多条。
10.如权利要求1-7任一项所述方法组装的CAR分子文库。
11.一种编码如权利要求10所述CAR分子文库的核酸序列文库。
12.一种用于构建如权利要求10所述CAR分子文库的质粒文库。
13.一种如权利要求13所述CAR分子文库修饰的CAR细胞文库。
14.如权利要求10所述的CAR分子文库、如权利要求11所述的核酸序列文库、如权利要求12所述的质粒文库、如权利要求13所述的CAR细胞文库在制备治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫病的药物或试剂盒中的应用。
15.如权利要求10所述CAR分子文库在筛选靶点CAR分子的应用。
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