CN112534047A - 经修饰的t细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及经修饰以通过调节树突状细胞活性而增强过继细胞疗法的功效的T细胞，包含经修饰的T细胞的组合物，载体和用于治疗癌症的方法，包括施用经修饰的T细胞。特别地，本发明提供了用于过继细胞疗法以治疗实体瘤的经修饰的T细胞。

Description

经修饰的T细胞及其用途
技术领域
本发明大体上涉及经修饰而通过调节树突细胞活性以增强过继细胞疗法的功效的T细胞，包含经修饰的T细胞的组合物，载体和用于治疗癌症的方法，包括施用经修饰的T细胞。特别地，本发明提供了用于过继细胞疗法以治疗实体瘤的经修饰的T细胞。
发明背景
使用嵌合抗原受体(CAR)T细胞的过继细胞疗法(ACT)已经在治疗血液系统恶性肿瘤，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)方面非常成功(Kalos等人，2011，Science Translational Medicine，3(95)：95ra73；Maude等人，2014，NewEngland Journal of Medicine，371(16)：1507-17)，但是由于在局部肿瘤微环境中的免疫抑制作用，其在实体瘤中的成功有限。肿瘤免疫抑制是肿瘤起始和发展的基础。肿瘤利用多种促进免疫抑制的机制，包括抗炎细胞因子产生，包含调节性T细胞(Treg)和髓样来源的抑制性细胞(MDSC)的调节性免疫细胞亚群的募集，对效应T细胞的负共刺激以及免疫抑制性代谢物的产生。在实体瘤的情况下，肿瘤抗原表达的固有异质性也成为将ACT成功适应用于实体瘤的治疗的障碍。在将肿瘤微环境从免疫抑制改为免疫激活以克服肿瘤抗原表达的异质性方面，存在重大的治疗机会。一种这样的治疗方法是通过先天免疫应答增强抗肿瘤免疫力。
CD141+树突细胞在交叉呈递肿瘤抗原方面非常有效，并产生高水平的促炎细胞因子，例如白介素-12(IL-12)。已显示CD141+树突细胞的存在与黑色素瘤中高水平的CD8+T细胞浸润相关(Spranger等人，2017Cancer Cell，31：711-23)。此外，在人源化的小鼠模型中，就细胞因子产生和诱导CD4+T细胞应答的能力而言，已经显示CD141+树突细胞是人树突细胞的最有效亚群(Meixlsperger等人，2013，Blood，121：5034-44)。鼠CD103+树突细胞也表现出与人CD141+树突细胞相似的特征。
工程化改造T细胞以增强CD141+/CD103+树突细胞的分化和功能，有可能通过促进从头内源性抗肿瘤免疫应答来克服与实体瘤中肿瘤抗原表达的固有异质性相关的问题。此外，CD141+/CD103+树突细胞是IL-12的有效产生者，并因此增加CD141+/CD103+树突细胞的数量有可能将肿瘤微环境从免疫抑制的转变为免疫刺激的。最后，也已证明由于CD141+/CD103+树突细胞能够分泌大量CXCL9/10，它们通过增强T细胞向肿瘤部位的转运，对ACT的功效至关重要(Spranger，同上)。
因此，需要生成能够促进CD141+/CD103+树突细胞的分化以增强ACT的经修饰的T细胞。
发明概述
本发明人已经确定经修饰以表达FMS样酪氨酸激酶配体3(FLT3L)的T细胞促进CD141+/CD103+树突细胞的分化，其增强抗肿瘤T细胞应答。
因此，在本发明的一方面，提供了一种分离的T细胞，其经修饰以表达外源性FLT3L。
在第二方面，本发明提供了一种药物组合物，包含根据本发明的经修饰以表达外源性FLT3L的分离的T细胞。
在第三方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括施用治疗有效量的根据本发明的经修饰以表达外源FLT3L的分离的T细胞或包含根据本发明的经修饰以表达外源性FLT3L的分离的T细胞的药物组合物。
在第四方面，本发明提供了根据本发明的经修饰以表达外源FLT3L的分离的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在第五方面，本发明提供了一种载体，包含与T细胞特异性调节元件可操作地连接的编码FLT3L的核酸。
在第六方面，本发明提供了包含编码FLT3L的核酸的病毒颗粒。
在第七方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括从受试者获取血液样品，从血液样品中分离T细胞，用根据本发明的载体在使得载体所编码的核酸得到表达的条件下在体外培养分离的T细胞，和向受试者施用治疗有效量的该T细胞。
在各种替代实施方案中，经修饰的T细胞被进一步经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
附图简述
图1显示抗Her2 CAR T细胞在体内介导抗肿瘤作用。在用5Gy总身体辐照的辐照后转移抗-Her2 CAR T细胞之后，携带已建立的E0771-Her2肿瘤的C57/BL6 Her2转基因小鼠中肿瘤大小(mm2；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形表示。还从0-5天开始用IL-2(50000U/小鼠)和在治疗后的第0、4、8和12天用抗PD-1或同种型对照(200μg/小鼠)对小鼠进行每日治疗。数据表示均值±SEM，每组n＝8只小鼠。**p＜0.001(双向ANOVA)。
图2显示表达FLT3L的CAR T细胞诱导表现优异的APC功能的CD103+DC的分化。(A-E)以下的图形表示：(A)从用抗Her2 CAR和NGFR-FLT3L或对照NGFR(x轴)转导的野生型脾细胞产生的CAR T细胞上清液中的FLT3L产生(pg/mL；y轴)。数据代表n＝6的均值±SEM，***p<0.001(学生T检验)；(B)从野生型小鼠的骨髓生成的CD103+DC的数量(y轴)，其使用25ng/mLGM-CSF和20ng/mL FLTL3(x轴)；或(C)使用NGFR-FLT3L CAR T细胞或NGFR对照CAR T细胞的条件培养基(x轴)；(D)在存在SIINFEKL肽(1μg/mL)，存在或不存在聚肌苷酸：聚胞苷酸的情况下(polyIC；y轴)，将来自(C)的2x 104个DC与4x 104个幼稚OT-I T细胞共培养生成的存活TCRβ+细胞的数量(y轴)；和(E)测定上清液中IFNγ的浓度(pg/mL；y轴)。(B)-(E)数据表示为来自n>3的代表性实验的一式三份培养物的均值±SD。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05(单向ANOVA/Tukey)。
图3显示了在肿瘤部位的FLT3L表达增强了抗肿瘤免疫性。(A)皮下注射5x 105个经工程化改造以表达FLT3L的24JK-Her2肿瘤细胞的(A)Her2转基因(Tg)和(B)RAG-/-小鼠的肿瘤面积(mm2；y轴)相对于时间(肿瘤接种后天数；x轴)的图形表示；在来自肿瘤接种后第8天切除的肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞中的(C)CD8+频率(％；y轴)和(D)CD69表达(％；y轴)的图形表示。数据表示为每组4-6只小鼠的均值±SEM。***p<0.001，**p<0.01(双向ANOVA/Tukey，C非配对t检验)。
图4显示表达FLT3L的抗Her2 CAR T细胞引起更大的治疗功效。向Her2转基因小鼠注射5x 105个经工程化改造以表达FLT3L的24JK-Her2肿瘤细胞，在第9天辐照(0.5Gy)小鼠并在第9天和第10天用1x 107个抗-Her2CAR T细胞治疗小鼠，在第9-13天也用50,000U/IL-2治疗小鼠。(A)用FLT3L CAR T细胞或对照CAR T细胞(x轴)治疗后六天，肿瘤的FLT3L浓度(ng/mL；y轴)的图形表示。数据是每组2-3只小鼠的均值±SD。(B)当肿瘤大小>100mm2时，在用FLT3L CAR T细胞或对照CAR T细胞治疗的小鼠中存活率(％；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形表示。(C)当肿瘤大小>100mm2时，用FLT3L CAR T细胞或对照CAR T细胞治疗的小鼠中肿瘤大小(mm2；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形表示。每组n＝6只小鼠。*p<0.05，对数秩。
图5显示表达FLT3L的OT-I细胞引起更大的治疗功效。当肿瘤大小>100mm2时，在存在或不存在聚肌苷酸：聚胞苷酸(pIC)两种情况下，用FLT3L OT-I细胞或对照OT-I细胞治疗的小鼠中存活率(％；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形表示。
图6显示FLT3L表达诱导肿瘤消退。(A)在用5x 105个经工程化改造以表达FLT3L的24JK-Her2肿瘤细胞(Cherry FLhi)或对照细胞(Cherryhi)皮下注射的hHer2+/-小鼠中肿瘤面积(mm2；y轴)相对于时间(肿瘤接种后天数；x轴)的图形表示；(B)在用Cherry FLhi或Cherryhi皮下注射的hHer2+/-小鼠中存活率(％；y轴)相对于时间(肿瘤接种后天数)的图形表示；(C-E)来自在肿瘤接种后第9天切除的肿瘤和肿瘤引流的淋巴结(dLN)的(C)CD8+T细胞频率(％；y轴)、(D)CD103+DC频率(％；y轴)、(E)迁移DC频率(％；y轴)和(F)驻留DC频率(％；y轴)的图形表示；(G-H)相应群体中的Cherry+细胞频率(％；y轴)的图形表示；(I-J)用Cherry FLhi或Cherryhi细胞在(I)右侧(即同侧)肋腹或(J)左侧(即对侧)肋腹接种的小鼠中肿瘤大小(mm2；y轴)相对于时间(肿瘤接种后天数；x轴)的图形表示；(K)接种到hHer2+/-转基因小鼠右侧肋腹的不同比例的Cherry FLhi和Cherryhi细胞的滴定后，肿瘤大小(mm2；y轴)相对于时间(肿瘤接种后天数；x轴)的图形表示；(L-M)接种后6天时，(L)肿瘤和(M)血清中的FLT3L浓度(ng/mL；y轴)相对于Cherry FLhi和Cherryhi细胞的滴定比(％；x轴)的图形表示；和(N)在用5×105个Cherry FLhi或Cherryhi细胞皮下注射的Rag1-/-小鼠中，肿瘤大小(mm2；y轴)相对于时间(肿瘤接种后天数；x轴)的图形表示。数据显示为每组3-10只小鼠的均值±SEM。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，n.s.非显著的(A、I、J、K和N双向ANOVA；G、L和M单向ANOVA；C、D、E和F未配对学生t检验；以及B Mantel-Cox检验)。
图7显示表达FLT3L的T细胞诱导CD103+DC的分化，从而诱导在体外的优异T细胞扩增。(A)用于转导T细胞的FLT3L NGFR(NGFR FL)质粒载体的示意图；(B)用NGFR FL转导鼠C57BL/6脾细胞的示意图；(C)激活后第7天，在转导的T细胞的上清液中分泌的FLT3L(ng/mL；y轴)的图形表示；(D-F)从骨髓分离后第7天的(D)CD11c+MHCII+DC(计数；y轴)和(E和F)CD103+DC(计数；y轴)的图形表示；(G)在预调理的OT-I T细胞和幼稚OT-I T细胞上CD44(y轴)和CD62L(x轴)表达的图形表示；(H)激活后第5天，预调理的OT-I T细胞与体外分化的OVA257-264SIINFEKL肽脉冲GM DC(无FLT3L补充)或FL DC(有FLT3L补充)共培养后，CD62L(x轴)和CD44(y轴)表达的图形表示；(I)预调理的OT-I T细胞与体外分化的OVA257-264SIINFEKL肽脉冲GM DC(无FLT3L补充)或FL DC(有FTL3L补充)共培养后，T细胞增殖的图形表示；和(J)OT-I T细胞的绝对数量(计数；y轴)的图形表示。数据显示为n＝3的均值±SEM，n.s.不显著，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001(C-E和J，单向ANOVA)。
图8显示分泌FLT3L的T细胞的过继转移使CD103+cDC扩增。(A)E0771-OVA肿瘤模型的OT-I过继转移和治疗的示意图；(B)用E0771-OVA肿瘤细胞接种的野生型小鼠的肿瘤和血清中的FLT3L表达(ng/mL；y轴)的图形表示；(C)治疗后第7天在骨髓中DC前体(前cDC)的比例的图形表示；(D)在治疗后第5天或第7天测量的前cDC在骨髓中的比例(每个股骨的计数；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形表示；(E)肿瘤中常规DC I型(cDC1)、2型(cDC2)和cDC1前体的门控策略的图形表示；(F)在治疗后第5天和第7天测量的肿瘤中cDC1、cDC2和cDC1前体及其他髓样细胞亚群的绝对数量(每毫克肿瘤组织的计数；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形表示；(G)用OT-I或OT-I FLT3L T细胞治疗后差异表达的DC相关基因的热图；(H)表达的倍数变化(Log2(倍数变化)；y轴)相对于均值表达(Log2(均值表达)；x轴)的图形表示；和(I)肿瘤dLN中DC亚群的绝对数量(计数；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形表示。数据显示为两个合并的独立实验中每组n＝3-12只小鼠的均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(单向ANOVA)。
图9显示DC扩增增强了功能性宿主CD8+T细胞在肿瘤部位的浸润。(A)cDC1和cDC2表达IL-12和TNFα(x轴)的图形表示；(B)肿瘤中分泌IL-12的cDC1和分泌TNFα的cDC2的绝对数量(每毫克肿瘤计数；y轴)相对于时间(治疗后的天数；x轴)的图形显示；(C-E)肿瘤(C)OT-I T细胞、(D)IFNγ+OT-I T细胞和(E)TNFα+OT-I T细胞的绝对数量(每mg肿瘤的计数；y轴)的图形表示；(F-H)肿瘤内源性(F)CD8+T细胞、(G)IFNγ+CD8+T细胞和(H)TNFα+CD8+T细胞的绝对数量的图形表示；(I-J)(I)过继转移的OT-I T细胞和(J)内源性CD8+T细胞表达CD62L+Tcf7+表型的比例(％；y轴)的图形显示；(K)OT-I和OT-I FL肿瘤之间差异表达的T和NK细胞相关基因的热图。数据显示为两个合并的独立实验中每组n＝3-12只小鼠的均值±SEM，n.s.不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(单向方差分析)。
图10显示了分泌FLT3L的T细胞与免疫刺激佐剂的组合抑制了与宿主T细胞的激活增加有关的肿瘤生长。(A-C)在治疗后第5天和第8天测量的，用2x 105个E0771 OVA细胞接种并用转导的OT-I T细胞与免疫佐剂pIC(100μg/小鼠)和激动性抗4-1BB抗体(100μg/小鼠)治疗的(A)野生型、(B)Batf3-/-或(C)Rag1-/-小鼠的肿瘤面积(mm2；y轴)相对于时间(治疗后的天数；x轴)的图形表示；(D)在有或没有辅助疗法的情况下，用分泌FLT3L的OT-I T细胞治疗的小鼠的肿瘤之间显著差异表达的基因的基因本体论(GO)生物过程基因集富集分析(GSEA)的图形显示；(E-F)表达(E)CD39和(F)TIM-3的内源性CD8+T细胞比例(％；y轴)的图形表示；(G)在用或不用辅助疗法的OT-I FL治疗后，DC上CD40(y轴)和CD86(x轴)表达的图形显示；(H-J)接受联合疗法的小鼠的肿瘤引流淋巴结内(H)激活的DC、(I)宿主CD8+和(J)转移的OT-I T细胞的绝对数量(计数；y轴)的图形显示。数据显示为两个合并的独立实验中每组n＝3-12只小鼠的均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001(A-C双向ANOVA，E-J单向ANOVA)。
图11显示分泌FLT3L的CAR T细胞和pIC的组合抑制肿瘤生长并提高存活率。(A)在转导以表达抗Her2 CAR和FLT3L Cherry(CAR T FL)或对照的T细胞的上清液中的FLT3L(ng/mL；y轴)的图形显示；(B)CAR T细胞过继转移方案和肿瘤模型的示意图；(C)用分泌FLT3L的CAR T细胞和pIC(治疗后第5天和第8天每剂100μg)组合治疗的hHer2+/-MC38-Her2小鼠中，肿瘤面积(mm2；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形显示；(D)在用分泌FLT3L的CAR T细胞和pIC(治疗后第5天和第8天每剂100μg)联合治疗的hHer2+/-MC38-Her2小鼠中，存活率(％；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形显示；(E-F)在用分泌FLT3L的CART细胞和pIC(治疗后第5天和第8天每剂100μg)的组合治疗的(E)Batf3-/-和(F)Rag1-/-小鼠中，肿瘤面积(mm2；y轴)相对于时间(治疗后天数；x轴)的图形表示。数据显示为每组n＝3-12只小鼠的均值±SEM，n.s.不显著，*p<0.05(C、E和F双向ANOVA和D Mantel-Cox检验)。
图12显示与分泌FLT3L的T细胞的组合疗法诱导表位扩展和记忆应答。(A)用于hHer2+/-小鼠的接种、治愈和再攻击的方案的示意图；(B)在治愈了其原发性MC38-Her2肿瘤的小鼠中肿瘤面积(mm2；y轴)相对于时间(亲本肿瘤再攻击后的天数；x轴)的图形显示；(C-D)如所示，接种E0771-OVA肿瘤并过继转移CD45.2+OT-I T细胞与佐剂一起，治疗后第7天CD45.1+宿主同系小鼠的TCR(C)多样性和(D)频率(％；y轴)的图形显示；(E)确定针对非CAR靶向的抗原的抗肿瘤活性的方案的示意图；(F)H-2Kb OVA四聚体阳性T细胞(x轴)和CAR T细胞(y轴)的频率的图形显示；(G)用分泌FLT3L的CAR-T细胞和佐剂的组合治疗后，hHer2+/-E0771-OVA-Her2小鼠中的四聚体+CD8+T细胞的比例(％；y轴)的图形显示；和(H)用分泌FLT3L的CAR-T细胞和佐剂的组合治疗后，hHer2+/-E0771-OVA-Her2小鼠中的肿瘤面积(mm2；y轴)相对于时间(治疗后的天数；x轴)的图形显示。数据显示为两个合并的独立实验中每组n＝3-12只小鼠的均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001(A和B双向ANOVA，C-D和G单向ANOVA，以及H双向ANOVA)。
图13显示了分泌FLT3L的CAR T细胞与辅助疗法的组合不会引起显著的毒性。(A)在接种了E0771-OVA-Her2并用转导的CAR T细胞治疗的hHer2+/-转基因小鼠中重量(％；y轴)相对于时间(治疗后的天数；x轴)的图形显示；(B-D)在辅助疗法后48小时，血清中(B)尿素，(C)肌酸酐和(D)ALT、AST、总白蛋白、胆红素和γ-谷氨酰转移酶(GGT)(U/L；y轴)的浓度的图形显示；(E)对照未经治疗的(NT)、CAR T或CAR T FL佐剂治疗的小鼠小脑、肝、肾、肺和脾脏的苏木精和曙红组织学染色的图形显示，白色柱指示50μm；和(F)细胞因子G-CSF、GM-CSF、MCP-1、IL-1β和IL-6的浓度(pg/mL；y轴)的图形显示。显示的数据代表每组n＝3-8只小鼠，*p<0.05(A单向ANOVA)。
图14是人神经生长因子受体(NGFR)-FLT3L载体的示意图。
图15是pLXSN抗Her2 CAR载体的示意图。
图16是pSAMEN抗Her2 CAR载体的示意图。
发明详述
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”或诸如“含有”或“包含”的变体将理解为暗示包括陈述的要素或整数或者要素或整数的组，但不排除任何其他要素或整数或者要素或整数的组。
在本说明书中对任何先前出版物(或从中获得的信息)或任何已知事项的引用均不是，也不应被视为对该先前出版物(或从中获得的信息)的承认或接受或任何形式的暗示或已知物质构成了本说明书所涉领域的公知常识的一部分。
除非另外特别定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语应认为具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
除非另有说明，否则本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员众所周知的标准程序。在贯穿所有文献中描述和解释了这类技术，诸如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,Volumes 1和2,IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),DNA Cloning:APractical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括到目前为止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)，以及J.E.Coligan等人(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括到目前为止的所有更新)。
本说明书中提到的所有出版物均通过引用全文并入本文。
必须注意，如在本说明书中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数个方面，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一个/种细胞”包括一个/种细胞以及两种或更多种细胞；提及“一个/种抗原”包括一个/一种抗原以及两种或更多种抗原；等等。
本发明部分地基于以下发现：经修饰以表达FMS样酪氨酸激酶配体3(FLT3L)的T细胞可用于促进CD141+/CD103+树突细胞的分化，从而增强抗肿瘤T细胞应答，包括内源性抗肿瘤免疫应答，促进表位扩展和增强T细胞运输。本发明人惊奇地表明，通过修饰T细胞以表达FLT3L来调节CD141+/CD103+显著地增强了使用常规T细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞的过继细胞疗法的活性。重要的是，本发明的经修饰的T细胞特别适应于治疗实体瘤。
表达FMS样酪氨酸激酶配体3(FLT3L)的T细胞
因此，在第一方面，本发明提供了分离的T细胞，其经修饰以表达外源性FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)。
如本文所用，术语“分离的”是指材料，例如细胞，其基本上或本质上不含在其天然存在的环境中通常与其伴随或相互作用的组分。分离的材料任选地包括在其自然环境中未与该材料一起发现的材料。
本领域众所周知的术语“T细胞”或“T淋巴细胞”包括胸腺细胞、幼稚T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞、激活的T淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。适用于特定实施方案的T细胞的示例性群体包括但不限于辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或T细胞的任何其他亚群。适用于特定实施方案的T细胞的其他示例性群体包括但不限于表达以下一种或多种标志物的T细胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197和HLA-DR，并且如果需要的话，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。
在一个实施方案中，分离的T细胞衍生自哺乳动物供体。在另一个实施方案中，分离的T细胞衍生自人供体。
根据本发明，通过本领域已知的任何分离方法从全血中分离T细胞。例如，可以使用抗体或珠子从全血中分离T细胞。
在一个实施方案中，使用Ficoll-Paque分离方法从全血中分离T细胞。如
Figure BDA0002920355780000101
(1968,Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation,21(Suppl.97,Paper IV):77-89)所述，Ficoll-Paque方法用于通过使用低粘度Ficoll和甲泛影酸钠或泛影酸钠从血液中分离单核细胞。该方法是本领域公知的，并且适于从外周血、脐带血和骨髓中分离单核细胞。
对分离的T细胞的修饰可以通过基因工程化改造以表达FLT3L来完成。基因工程化改造的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如，Ausubel，上文；或Sambrook，上文)。例如，FLT3L的表达可以通过将编码FLT3L多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并将构建体掺入表达载体中来实现。载体可以适合在真核细胞中复制和整合。典型的克隆载体包含用于调节所需核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。在图14中提供了用于表达FLT3L的示例性载体，其对应于SEQ ID NO：1。
本文所用的术语“经修饰的T细胞”是指已经修饰以表达FLT3L的分离的T细胞，或已经修饰以表达FLT3L和CAR两者的分离的T细胞，其中CAR包含抗原结合域和至少一个信号传导结构域。经修饰的T细胞可包括遗传修饰和非遗传修饰(例如，附加体的或染色体外的)。
术语“外源的”和“异位的”在本文中可以互换使用，并且是指通常在T细胞中或其上不表达的FLT3L的表达或者以比在T细胞上正常观察到的更高水平的FLT3L表达。
术语“FMS样酪氨酸激酶3配体”或“FLT3L”在本文中用于指调节早期造血细胞增殖的细胞因子。已经鉴定出FLT3L的多种同工型，其中主要的生物活性形式作为跨膜蛋白的胞外结构域锚定在细胞表面(UniProt ID：P49771-1，同工型1，人FLT3L；UniProt ID：P49772-1，同工型1，鼠FLT3L)。膜结合的同工型可以被蛋白水解切割以生成生物学活性的可溶性同工型(UniProt ID：P49771-2，同工型2，人FLT3L；UniProt ID：P49772-2，同工型2，鼠FLT3L)。因此，术语“FMS样酪氨酸激酶3配体”或“FLT3L”是指FLT3L的所有同工型，包括膜结合的和可溶性同工型。
在一个实施方案中，由本发明的经修饰的T细胞表达的FLT3L同工型是同工型1。
嵌合抗原受体(CAR)/FLT3L T细胞
在一个实施方案中，本发明的分离的T细胞也经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含至少抗原结合结构域的重组多肽构建体，所述抗原结合结构域通过铰链和跨膜结构域连接至细胞内信号传导结构域。
抗原结合结构域是CAR的功能部分，其负责在细胞内传递信息以通过确定的信号传导通路调节细胞活性。在一个实施方案中，抗原结合结构域可包含抗体或其抗体片段。
如本文所用，术语“抗体”广泛地是指任何免疫球蛋白(Ig)分子，其包含四个多肽链，两个重(H)链和两个轻(L)链，或其任何功能性片段、突变体、变体或衍生，其保留了Ig分子的基本表位结合特征。这样的突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。
在全尺寸抗体中，每个重链包含重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区CL。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，它们按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所用，术语“抗体片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原的能力。抗体片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，F(ab’)2片段，包含两个通过铰链区的二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单一技术的VL和VH结构域组成的单链可变片段(scFv)，(v)dAb片段(Ward等人，1989，Nature，341：544-6)，包含单个可变结构域；和(vi)分离的CDR。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体片段。例如，抗原结合结构域可以包含scFv，该scFv由对肿瘤细胞表面分子具有特异性的单克隆抗体(mAb)的VL和VH序列组成。
在一个实施方案中，抗原结合结构域与肿瘤抗原结合。
如本文所用，术语“肿瘤抗原”是指由肿瘤细胞产生的引起免疫应答的任何蛋白质。因此，抗原结合结构域的选择将取决于要治疗的癌症的类型以及肿瘤细胞表达的靶肿瘤抗原和肿瘤细胞表面标志物。来自受试者的肿瘤样品可以针对某些靶肿瘤抗原和肿瘤细胞表面标志物的存在进行表征。例如，来自受试者的乳腺癌细胞对于表皮生长因子受体2(Her2)、雌激素受体和/或孕酮受体中的每一个可以是阳性或阴性。
靶肿瘤抗原和肿瘤细胞表面标志物是本领域已知的，并且包括例如CD19、CD20、CD22、CD30、ROR1、CD123、CD33、CD133、CD138、GD2、Her2、Her1、间皮素、MUC1、gp100、MART-1、MAGE-A3、MUC16、NY-ESO-1L1-CAM、CEA、FAP、VEGFR2、WT1、TAG-72、CD171、αFR、CAIX、PSMA和Lewis Y。
在一个实施方案中，抗原结合结构域结合正常细胞基本上不表达的肿瘤抗原。
在一个实施方案中，抗原结合结构域与选自以下组成的组的抗原结合：CD19、CD20、CD22、CD30、ROR1、CD123、CD33、CD133、CD138、GD2、Her2、Her1、间皮素、MUC1、gp100、MART-1、MAGE-A3、MUC16、NY-ESO-1L1-CAM、CEA、FAP、VEGFR2、WT1、TAG-72、CD171、αFR、CAIX、PSMA和Lewis Y及其组合。在另一个实施方案中，抗原结合结构域结合Her2。
完整且持续的T细胞激活和增殖需要首要的起始信号(信号1)，次级的共刺激受体参与信号(信号2)和细胞因子受体参与信号(信号3)。由于CAR T细胞不能以MHC限制的方式运转，因此它们与抗原呈递细胞(APC)的相互作用通常是不足的，信号2和信号3受到严重损害。因此，一个或多个信号传导结构域的掺入可影响响应于肿瘤相关抗原的T细胞激活的水平和维持，这可导致细胞因子产生增加。
在一个实施方式中，本发明的CAR包含至少一个信号传导结构域。在另一个实施方案中，本发明的CAR包含至少两个信号传导结构域。
CAR信号传导结构域的实例包括CD3ζ、CD28、41BB、DAP10、OX40、ICOS、DAP12、KIR2DS2、4-1BB、CD3s、CD35、CD3C、CD25、CD27、CD79A、CD79B、CARD11、FcRa、Fcftp、FcRy、Fyn、HVEM、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slip76、pTa、TCRa、TCRP、TRIM、Zap70、PTCH2和LIGHT。
在一个实施方案中，CAR包含选自由CD28和CD3ζ信号传导结构域组成的组的信号传导结构域。在另一个实施方案中，CAR包含CD28和CD3ζ信号传导结构域两者。
分离的T细胞的修饰可以通过基因工程化改造以表达CAR来完成。基因工程化改造的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如，Ausubel，上文；或Sambrook，上文)。例如，可以通过将编码CAR多肽或其部分的核酸序列可操作地连接至启动子，并将构建体掺入表达载体中来实现CAR的表达。载体可以适合在真核细胞中复制和整合。典型的克隆载体包含用于调节所需核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。用于表达CAR的合适载体描述于Beavis等人，2017，同上(Her2 CAR)，Ritchie等人，2013，Molecular Therapy，21(11)：2122-2129(Lewis Y)和Westwood等人，2009，Journal of Immunotherapy，32(3)：292-301。在图14和15中提供了示例性载体，其对应于SEQ ID NO：2和3。
药物组合物
在一方面，本发明提供了一种药物组合物，包含治疗有效量的经修饰以表达外源FLT3L的分离的T细胞经和至少一种药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的经修饰以表达外源FLT3L和CAR的分离的T细胞，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
在一个实施方案中，可以以104至109个细胞/kg体重的剂量施用包含本发明的经修饰的T细胞的药物组合物。在另一个实施方案中，包含本发明的经修饰的T细胞的药物组合物可以以105至106细胞/kg体重的剂量施用，包括那些范围内的所有整数值。
包含本发明的经修饰的T细胞的组合物也可以这些剂量多次施用。可以通过使用本领域已知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等人，1988，New EnglandJournal of Medicine，319：1676)。通过监测患者的疾病征兆并相应地调整治疗，本领域技术人员可以容易地确定针对特定受试者的最佳剂量和治疗方案。
本发明的组合物可以以本领域已知的方式制备，并且是适合对哺乳动物特别是人进行肠胃外施用的那些，其包含治疗有效量的单独的组合物，以及一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何合适的载体、稀释剂或赋形剂。这些包括所有水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂和溶质，使组合物与预期接受者的血液等渗；水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂和增稠剂、分散介质、抗真菌剂和抗菌剂、等渗剂和吸收剂等。应当理解，本发明的组合物还可包含其他补充的生理活性剂。
载体必须是药学上“可接受的”，这是在与组合物的其他成分相容且对受试者无害的意义上而言。组合物包括适用于肠胃外施用的那些，包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内施用。组合物可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。这样的方法包括制备与经修饰的T细胞缔合的载体。通常，通过将任何活性成分与液体载体均匀且紧密地缔合在一起来制备组合物。
在一个实施方案中，组合物适合于肠胃外施用。在另一个实施方案中，组合物适合于静脉内施用。
适用于肠胃外施用的组合物包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂和溶质，它们使组合物与预期接受者的血液等渗；以及水性和非水性无菌悬浮液，它们可包括悬浮剂和增稠剂。
本发明还预期本发明的组合物与其他药物和/或除其他治疗方案或方式(例如放射疗法或手术)之外的组合。当本发明的组合物与已知的治疗剂组合使用时，组合可以依次(连续地或被无治疗期分开)或同时或作为混合物施用。在癌症的情况下，在这种情况下可以使用许多已知的抗癌剂。组合的治疗也被认为包括用本发明的组合物进行的治疗，然后进行已知的治疗，或用已知药剂进行的治疗，然后用本发明的组合物进行的治疗，例如作为维持疗法。例如，在癌症的治疗中，涵盖本发明的组合物可以与烷基化剂(例如甲氯乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺顺铂或含铂的烷基化剂例如顺铂、卡铂和奥沙利平)和抗代谢物(例如嘌呤或嘧啶类似物或抗叶酸剂，例如硫唑嘌呤和巯基嘌呤)，蒽环类药物(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌或蒽环霉素类似物)，植物生物碱(例如长春花生物碱或紫杉烷，例如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇或多西他赛)，拓扑异构酶抑制剂(例如I型或II型拓扑异构酶抑制剂)，鬼臼毒素(例如依托泊苷或替尼泊苷)，酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼、尼洛替尼或达沙替尼)，腺苷受体抑制剂(例如A2aR抑制剂、SCH58261、CPI-444、SYN115、ZM241385、FSPTP或A2BR抑制剂例如PSB-1115)，腺苷受体激动剂(例如CCPA、IB-MECA和CI-IB-MECA)，检查点抑制剂，包括PDL-1：PD-1轴的那些，纳武单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、BMS-936559、MEDI4736、MPDL33280A或MSB0010718C)，CTLA-4途径的抑制剂(例如伊匹单抗和tremelimumab)，TIM-3途径的抑制剂或已知促进T细胞功能的激动剂单克隆抗体(包括抗OX40，例如MEDI6469；和抗4-1BB，例如PF-05082566)组合施用。
在一个实施方案中，将本发明所要求保护的组合物与由PDL-1:PD-1轴的抑制剂、TLR3激动剂、4-1BB激动剂、TLR7激动剂、TIM-3的抑制剂和CTLA-4的抑制剂组成的组中的一种或多种组合施用。
在一个实施方案中，本发明所要求保护的组合物与一种或多种免疫佐剂组合施用。
如本文所用，术语“免疫佐剂”是指能够增强受试者对免疫原的免疫应答，包括例如受试者对免疫原的抗体应答的化合物或物质。因此，与单独施用修饰的T或不存在免疫佐剂的情况相比，免疫佐剂可有助于增强受试者中对经修饰以表达外源FLT3L的分离的T细胞的免疫应答。
合适的免疫佐剂是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例包括PDL-1:PD-1轴的抑制剂、TLR3激动剂、4-1BB激动剂、TLR7激动剂、TIM-3的抑制剂和CTLA-4的抑制剂。因此，在一个实施方案中，免疫佐剂选自PDL-1:PD-1轴的抑制剂，TLR3激动剂，4-1BB激动剂，TLR7激动剂，TIM-3抑制剂，和CTLA-4抑制剂。
“PDL-1:PD-1轴的抑制剂”旨在表示抑制细胞中PDL-1:PD-1轴的任何化合物或配体或其药学上可接受的盐。例如，PDL-1:PD-1轴的抑制剂可以是变构或催化抑制剂。
在一个实施方案中，PDL-1:PD-1轴的抑制剂选自由纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、BMS-936559、MEDI4736、MPDL33280A和MSB0010718C组成的组。在另一个实施方案中，PDL-1:PD-1轴的抑制剂是RMP1-14。
“Toll样受体3激动剂”或“TLR3激动剂”旨在表示引发TLR3介导的免疫应答的任何化合物或配体或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，TLR3激动剂选自由聚肌苷酸：聚胞苷酸(也称为聚IC或pIC)、聚ICLC、聚IC12U和IPH3102组成的组。在一个优选的实施方案中，TLR3激动剂是聚IC或聚ICLC。
“4-1BB激动剂”旨在表示当与4-1BB组合时引发免疫刺激应答的任何化合物或配体或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂是抗4-1BB抗体。
“T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3的抑制剂”或“TIM-3的抑制剂”意指抑制细胞中TIM-3的任何化合物或配体或其药学上可接受的盐。例如，TIM-3的抑制剂可以是变构或催化抑制剂。
TIM-3是抑制性T细胞受体，具有潜在的免疫检查点抑制和抗肿瘤活性。TIM-3在肿瘤和正常组织中的巨噬细胞和cDC上表达，在cDC1亚群上高水平表达(Pulido等人，2018，Cancer Cell，33(1)：P60-74.E6)。对TIM-3的抑制消除了T细胞抑制，激活了抗原特异性T淋巴细胞，并增强了细胞毒性T细胞介导的肿瘤细胞裂解。在三阴性和管腔B型乳腺癌模型中，使用抗体抑制TIM-3也显示改善对化学疗法的应答，没有毒性证据。这种联合作用是CD8+T细胞依赖性的，并与粒酶B表达的增加有关(Pulido等人，同上)。TIM-3的抑制剂在化疗期间间接增强CD8+T细胞应答，并且可以根据本文所述的方法适于用作免疫佐剂。
在一个实施方案中，TIM-3的抑制剂是抗TIM-3抗体。合适的抗TIM-3抗体是本领域技术人员已知的，其例示性实例包括抗TIM-3单克隆抗体TSR-022。
“Toll样受体7激动剂”或“TLR7激动剂”旨在表示引发TLR7介导的免疫反应的任何化合物或配体或其药学上可接受的盐。
TLR7是细胞内受体，其识别单链RNA分子并检测RNA病毒，例如流感病毒。已经显示刺激TLR7会产生多种促炎细胞因子，包括I型IFN和IL-12。已显示I型IFN和IL-12是由TLR7激动剂诱导的交叉致敏的关键介导物，其通过I型IFN和IL-12共同依赖性机制的组织来源的和淋巴样器官驻留DC亚群的协调招募和激活来促进CD8+T细胞应答(Oh等人，2011，Blood，118(11)：3028-3038)。
在一个实施方案中，TLR7激动剂选自由TLR7激动剂-抗原缀合物、咪喹莫特(Aldara)、瑞喹莫德(Resiquimod)、嘎德莫特(Gardiquimod)、洛索立宾(Loxoribine)、聚(dT)、TL8-506、CL075、CL097、CL264和CL307组成的组。
“CTLA-4的抑制剂”是指抑制细胞中CTLA-4的任何化合物或配体或其药学上可接受的盐。例如，CTLA-4的抑制剂可以是变构或催化抑制剂。
在一个实施方案中，CTLA-4的抑制剂是伊匹单抗(ipilimumab)。
载体
本发明提供了一种载体，包含可操作地连接至T细胞特异性调节元件的编码FLT3L的核酸。
在一个实施方案中，载体还包含编码CAR的核酸，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
本文所用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”或“核酸序列”是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或核苷酸的修饰形式或类型之一。该术语包括RNA和DNA的单链和双链形式。
如本文所用，术语“基因”包括能够用于产生mRNA的核酸分子，任选地通过添加有助于该过程的元件。基因可能能够或可能不能用来产生功能性蛋白质。基因可以包括编码区和非编码区(例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列以及5'和3'非翻译区)。
术语“转基因”在本文中用于描述已经或即将被人工引入宿主生物的基因组并被传递至该宿主的后代的遗传物质。在一些实施方案中，它赋予导入它的T细胞以期望的性质，或以其他方式导致期望的治疗结果。
如本文所用，术语“编码”等是指核酸提供另一种核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列可以被转录和/或翻译以产生多肽，或者可以被加工成可以被转录和/或翻译以产生多肽的形式，则说该核酸序列“编码”了多肽。这样的核酸序列可以包括编码序列或编码序列和非编码序列两者。因此，术语“编码”等包括对DNA分子转录产生的RNA产物，对RNA分子翻译产生的蛋白质，对DNA分子转录以形成RNA产物以及RNA产物的随后翻译产生的蛋白质，或从DNA分子转录以提供RNA产物，对RNA产物加工以提供经加工的RNA产物(例如mRNA)以及随后经过对经加工的RNA产物的翻译产生的蛋白质。
如本文所用，术语“可操作地连接”或“可操作地链接”是指并置，其中如此描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。例如，与编码序列“可操作地连接”的转录控制序列是指转录控制序列相对于编码序列的定位和/或取向，以允许在与转录控制序列相容的条件下表达编码序列。在另一个实例中，可操作地连接至FLT3L编码序列的NFAT启动子是指NFAT启动子相对于FLT3L编码序列的定位和/或取向，以允许在发生CAR激活的肿瘤微环境中翻译FLT3L编码序列。
如本文所用，术语“开放阅读框”和“ORF”在本文可互换使用，是指在编码序列的翻译起始密码子和终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”(例如ATG)和“终止密码子”(例如TGA、TAA、TAG)是指分别指定蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止的编码序列中三个相邻核苷酸(“密码子”)的单元。
“多肽”、“肽”、“蛋白质”和“蛋白质分子”在本文可互换使用，是指包含氨基酸残基的聚合物或由其组成的分子，并且是指其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于以下氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，应用于“核酸分子”，“多核苷酸”等的术语“重组”应理解为是指人工核酸结构(即，非复制cDNA或RNA；或复制子，自我复制cDNA或RNA)，其如本文所述，可以在分离的T细胞中转录和/或翻译。重组核酸分子或多核苷酸可以插入载体中。可以使用非病毒载体，例如质粒表达载体或病毒载体。根据本发明的载体的种类和核酸构建体的插入技术是本领域已知的。根据本发明的核酸分子或多核苷酸在自然中不以本发明所述的安排存在。换句话说，异源核苷酸序列不天然地与病毒基因组的元件(例如启动子、ORF、聚腺苷酸化信号、核酶)组合。
“调节元件”或“调节序列”是指在特定细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的核酸序列(例如，DNA)。适用于真核细胞的调节序列包括启动子、聚腺苷酸化信号、转录增强子、翻译增强子、调控mRNA稳定性的前导序列或尾随序列，以及靶向序列，该序列将由转录的多核苷酸编码的产物靶向至细胞内的细胞内区室或细胞外环境。
在一个实施方案中，载体包含可操作地连接至T细胞特异性调节元件的编码FLT3L的核酸。T细胞特异性调节元件是本领域已知的，并且包括例如NFAT共有序列是T细胞激活特异性的，NFκB启动子也在T细胞激活期间中被激活。
适合于影响本发明的经修饰的T细胞的嵌合构建体包含编码FLT3L的核酸序列，其可操作地连接至调节元件。此类嵌合构建体还可包含编码CAR的核酸序列，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。备选地，可以提供包含编码CAR的核酸序列的分别的嵌合构建体，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域，其与调节元件可操作地连接。调节元件适当地包含转录和/或翻译控制序列，其将与细胞中的表达相容。通常，转录和翻译控制序列包括但不限于启动子序列、5'非编码区、顺式调节区例如转录调节蛋白或翻译调节蛋白的功能性结合位点、上游开放阅读框、核糖体结合序列、转录起始位点、翻译起始位点、和/或编码前导序列的核苷酸序列、终止密码子、翻译终止位点和3'非翻译区。涵盖本领域已知的组成型或诱导型启动子。这些启动子可以是天然存在的启动子，也可以是超过一种启动子的元件的杂合启动子。
涵盖的启动子序列可以是对哺乳动物细胞天然的，或者可以衍生自替代来源，其中该区域在所选生物体中是有功能的。启动子的选择将取决于预期的宿主细胞。例如，可用于在哺乳动物细胞中表达的启动子包括金属硫蛋白启动子，其可响应重金属(例如镉)而被诱导，β-肌动蛋白启动子以及病毒启动子(例如SV40大T抗原启动子)，人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子，劳斯肉瘤病毒LTR启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子，腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)，单纯疱疹病毒启动子和HPV启动子，尤其是HPV上游调节区域(URR)等。所有这些启动子已被充分描述并且在本领域中容易获得。
在一个实施方案中，调节元件包含诱导型启动子序列，其将转基因的表达限制在发生CAR激活的肿瘤微环境中。合适的诱导型启动子是本领域已知的，例如，NFAT启动子在TCR/CAR的下游被激活，因此将转基因的表达限制在发生CAR激活的肿瘤微环境中。
在一个实施方案中，载体包含与调节元件可操作地连接的编码FLT3L的核酸，其中调节元件包含NFAT启动子序列。在一个实施方案中，包含编码FLT3L的核酸的载体是图14所示的(NGFR)-FLT3L载体，其对应于SEQ ID NO：1。
在一个实施方案中，载体包含可操作地连接至调节元件的编码CAR的核酸。在另一个实施方案中，载体包含编码CAR的核酸，所述CAR识别人Her2抗原且包含CD28和TCR-ζ信号传导结构域(scFv-CD28-ζ)。在另一个实施方案中，包含编码CAR的核酸的载体是图15所示的pLXSN抗Her2CAR载体，其对应于SEQ ID NO：2。在另一个实施方案中，包含编码CAR的核酸的载体是图16中所示的pSAMEN抗Her2 CAR载体，其对应于SEQ ID NO：3。
在另一个实施方案中，载体包含与调节元件可操作地连接的编码FLT3L的核酸，其中调节元件包含组成型活性启动子序列。
增强子元件也可以在本文中用于增加哺乳动物构建体的表达水平。实例包括SV40早期基因增强子，例如在Dijkema等人(1985,EMBO Journal,4:761)中所述，衍生自劳斯肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子，例如在Gorman等人，(1982，Proceedingsof the National Academy of Science.USA,79:6777)中所述，和衍生自人CMV的元件，例如Boshart等人(1985,Cell,41:521)中所述，例如CMV内含子A序列中包含的元件。
嵌合构建体还可包含3'非翻译序列。3'非翻译序列是指基因的一部分，其包含DNA片段，该DNA片段包含聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其他调节信号。聚腺苷酸化信号的特征在于，将聚腺苷酸小段(tracts)添加到mRNA前体的3'末端。聚腺苷酸化信号通常是通过存在与规范形式5'AATAAA-3'的同源性来识别的，尽管变体并不罕见。3'非翻译调节DNA序列优选地包含约50至1,000nt，并且除了聚腺苷酸化信号外可以含有转录和翻译终止序列，和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其他调节信号。
在一些实施方案中，嵌合构建体还包含可选择标记物基因，以允许选择含有构建体的细胞。选择基因在本领域中是众所周知的，并且将相容于在目的细胞中表达。
在一个实施方案中，FLT3L的表达在启动子的控制下。在一个非限制性实施方案中，启动子是细胞组成型启动子，例如人EF1α(人延伸因子1α基因启动子)、DHFR(二氢叶酸还原酶基因启动子)或PGK(磷酸甘油酸激酶基因启动子)，其指导足够水平的CP77表达以在没有对宿主细胞产生明显毒性作用的情况下维持病毒繁殖。启动子也可以是诱导型的，例如细胞诱导型启动子，MTH(来自金属硫蛋白基因)病毒启动子也用于哺乳动物细胞，例如CMV、RSV、SV-40和MoU3。在一个实施方案中，启动子是NFAT共有序列。
病毒转导
在一方面，本发明提供了包含编码FLT3L的核酸的病毒颗粒。
如本文所用，术语“病毒颗粒”是指用于转导细胞的任何病毒或病毒系统。合适的病毒颗粒是本领域已知的，并且包括例如逆转录病毒(例如，MoMLV等)、慢病毒、腺病毒、AAV和EBV。在一个实施方案中，病毒颗粒是逆转录病毒。
在一个实施方案中，病毒颗粒进一步包含编码CAR的核酸，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
“转导”是指使用一种或多种载体将一种或多种基因或其他多核苷酸序列，例如编码FLT3L或CAR的多核苷酸序列，递送至T细胞。在一个实施方案中，通过感染和前病毒整合将逆转录病毒颗粒转导入细胞。在某些实施方案中，如果靶细胞例如T细胞包含通过使用病毒或逆转录病毒载体的感染递送至细胞的基因或其他多核苷酸序列，则其被“转导”。
修饰的T细胞用于治疗癌症
本发明提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括将治疗有效量的经修饰以表达外源FLT3L的分离的T细胞或包含经修饰以表达外源FLT3L的分离的T细胞的药物组合物施用给需要其的受试者。
在一个实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的经修饰以表达外源FLT3L和CAR的分离的T细胞，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域，或包含经修饰以表达外源FLT3L和CAR的分离的T细胞的药物组合物，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
在另一方面，本发明提供了经修饰以表达外源性FLT3L的分离的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在一个实施方案中，用途包括经修饰以表达外源FLT3L和CAR的分离的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
在一个实施方案中，方法进一步包括施用一种或多种免疫佐剂。
在一个实施方案中，免疫佐剂选自由PDL-1:PD-1轴的抑制剂、TLR3激动剂、4-1BB激动剂、TLR7激动剂、TIM-3的抑制剂和CTLA-4的抑制剂组成的组。
用于治疗癌症的治疗方案可以由本领域技术人员确定，并且通常取决于以下因素，包括但不限于肿瘤的类型、大小、分期和受体状态，以及受试者的年龄、体重和总体健康状况。另一个决定性因素可能是发展复发性疾病的风险。例如，对于被确定为处于高风险或更高风险或正在发展复发性疾病的受试者，与被认为处于发展复发性疾病的低风险或较低风险的受试者相比，可以开具更积极的治疗方案。类似地，对于被鉴定为患有更晚期癌症的受试者，例如III或IV期疾病，与患有不太晚期癌症的受试者相比，可以开具更积极的治疗方案。
如本文所用，术语“癌症”是指与异常细胞增殖有关的任何病况。这样的条件对于本领域技术人员是已知的。在一个实施方案中，癌症是原发性癌症(例如，肿瘤)。在另一个实施方案中，癌症是转移性癌症。在再一个实施方案中，癌症是实体癌。
本文所用的术语“治疗”、“处理”和“治疗中”是指补救病况或症状，或以其他方式预防、阻碍、延迟、消除或逆转癌症或其他任何不希望出现的症状的发作或发展的任何和所有用途。因此，术语“治疗”等应在其尽可能最广泛的范围内考虑。例如，治疗不一定意味着对受试者进行治疗直至完全康复或治愈。在表现出多种症状或以多种症状为特征的病况中，治疗不一定必须补救、预防、阻碍、延迟、消除或逆转所述症状的全部，而是可以补救、预防、阻碍、延迟、消除或逆转所述症状的一种或多种。
将要治疗癌症的受试者可以是人或对人具有经济重要性和/或社会重要性的哺乳动物，例如人以外的食肉动物(例如猫和狗)，猪类(例如猪、肉猪和野猪)，反刍动物(例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)，马和鸟类，包括濒临灭绝、饲养在动物园中和禽类的那些鸟类，并且尤其是驯化的禽类，例如家禽，如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，因为它们对人类也具有经济重要性。术语“受试者”不表示特定年龄。因此，意图涵盖成年、青少年和新生受试者。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，以指代本公开内容可适用的任何受试者。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，受试者是人。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指当施用于需要这种治疗的哺乳动物，特别是人时，经修饰的T细胞的量足以治疗癌症。可以由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及受试者的状况的个体差异来确定要施用的经修饰的T细胞的精确量。
通常，T细胞疗法的施用由每千克体重的细胞数定义。但是，由于T细胞将在转移后复制并扩增，因此施用的细胞剂量将不会与最终的稳态细胞数相似。
在另一方面，本发明提供了用于治疗癌症的“过继细胞疗法”或“过继免疫疗法”的方法。因此，这类方法包括：
a.从受试者获取包含T细胞的生物学样品；
b.从样品中分离T细胞；
c.用一种或多种本发明的载体在体外转导分离的T细胞；
d.在使得表达由一种或多种载体编码的一种或多种核酸得到表达的条件下扩增步骤(c)的经修饰的T细胞；和
e.对受试者施用治疗有效量的经修饰的T细胞。
如本文所用，术语“样品”或“生物学样品”是指从受试者(优选地，哺乳动物)中移出的且含有T细胞的组织或体液。T细胞的来源是本领域众所周知的，并且包括外周血、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一个实施方案中，生物学样品是取自受试者的全血。
根据本发明，通过本领域已知的任何分离方法从样品分离T细胞。例如，可以使用抗体或珠子从全血中分离T细胞。
在一个实施方案中，使用Ficoll-Paque分离方法分离T细胞。如
Figure BDA0002920355780000251
(1968，Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation，21(Suppl.97，PaperIV)：77-89)所述，Ficoll-Paque方法用于通过使用低粘度Ficoll和甲泛影酸钠或泛影酸钠从血液中分离单核细胞。该方法是本领域公知的，并且适于从外周血、脐带血和骨髓中分离单核细胞。
“转导”是指使用一种或多种载体将一种或多种基因或其他多核苷酸序列，例如编码FLT3L或CAR的多核苷酸序列，递送至T细胞。在一个实施方案中，通过感染和前病毒整合将逆转录病毒载体转导到细胞中。在某些实施方案中，如果靶细胞例如T细胞包含通过使用病毒或逆转录病毒载体的感染递送至细胞的基因或其他多核苷酸序列，则其被“转导”。在特定实施方案中，转导的细胞在其细胞基因组中包含由逆转录病毒或慢病毒载体递送的一个或多个基因或其他多核苷酸序列。
在一个实施方案中，通过用编码CAR的载体，例如图15和16的载体(其对应于SEQID NO：2和3)，转导T细胞来产生本发明的经修饰的细胞。然后，用其中表达FLT3L的逆转录病毒载体，例如与SEQ ID NO：1相对应的图14的载体，转导所得抗Her2 CAR T细胞。尽管这种“双重转导”方法需要序贯转导两种或更多种载体，本发明还涵盖了双重转导的其他方法，包括同时转导两种或更两种载体。
在一个实施方案中，已经用本发明的载体转导的经修饰的T细胞的群体在使得载体编码的核酸得到表达的条件下扩增。
“扩增”、“扩展”，“繁殖”等是指在施用给受试者之前使用细胞培养条件来增加经修饰的T细胞的数量。可以使用本领域已知的任何细胞培养方法扩增T细胞，例如，可以在组织培养物中以液体培养、单层等扩增T细胞。
术语“可表达的”、“表达的”及其变体是指细胞将核苷酸序列转录为RNA并任选地翻译mRNA以合成提供生物学或生化功能的肽或多肽的能力。
本发明考虑的过继性细胞疗法不限于CAR T细胞疗法。本发明还考虑了使用常规的过继细胞治疗方法来使用受试者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。技术人员将理解，扩增细胞数量并促进相关核酸表达所必需的培养条件将取决于已经根据本发明转导的T细胞的类型。
在一个实施方案中，方法包括：
a.提供包含来自受试者的T细胞的生物学样品；
b.从样品中分离T细胞；
c.用一种或多种本发明的载体在体外转导分离的T细胞；
d.在使得由一种或多种载体编码的一种或多种核酸得到表达的条件下扩增步骤(c)的经修饰的T细胞；和
e.对受试者施用治疗有效量的经修饰的T细胞，
其中方法进一步包括施用一种或多种免疫佐剂。
在一个实施方案中，免疫佐剂选自由PDL-1:PD-1轴的抑制剂、TLR3激动剂、4-1BB激动剂、TLR7激动剂、TIM-3的抑制剂和CTLA-4的抑制剂组成的组。
本领域技术人员将理解，本文描述的发明除了具体描述的之外还可以进行变化和修改。应当理解，本发明包括落入本发明的精神和范围内的所有这样的变化和修改。本发明还单独地或共同地包括本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任何两个或更多个的任何和所有组合。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
通过以下非限制性实施例进一步描述本文中实现的各种实施方案。
实施例1
抗Her2 CAR T细胞模型
如(Mardiana等人，2017，Cancer Research，77：1296-1309；John等人，2013，Clinical Cancer Research，19：5636-5646；Beavis等人，2017，同上)中所述，用识别人Her2抗原(scFv-CD28-ζ)的含有CD28和TCR-ζ信号传导域的CAR转导原代鼠脾细胞。
将同系肿瘤系24JK-Her2(肉瘤细胞系)、0771-Her2(三阴性乳腺癌系)和MC38-Her2(结肠癌细胞系)工程化改造以表达人Her2受体。这些品系是C57/BL6来源的，使得可以将其移植到C57/BL6 hHer-2转基因小鼠中。使用该模型，人Her2受体(减去细胞内信号传导结构域)在乳清酸性蛋白启动子的控制下表达，导致在小脑和乳房组织中的表达。
抗Her2 CAR T细胞在体外介导针对Her2+肿瘤细胞的有效抗肿瘤功效。对携带Her2+肿瘤的小鼠的体内治疗导致部分应答，但即使与辅助免疫疗法(例如抗PD-1或4-1BB)组合，也几乎没有治愈应答(图1)。
实施例2
FLT3L生成的CD103+DC在体外诱导优异的T细胞扩增
用逆转录病毒载体转导T细胞，所述逆转录病毒中表达FLT3L以及被截短的人神经生长因子受体(NGFR)作为标志物基因以指示转导效率(图7A)。通过流式细胞术对GP+e86病毒包装系进行分选，以产生FLT3L低(FLlo)、中(Flint)或高(FLhigh)表达系。在转导以表达NGFR FLlo、Flint或FLhigh之前，将小鼠C57BL/6脾细胞在IL-2、IL-7中培养并使用抗CD3和抗CD28抗体激活。为了证实转导的细胞以低、中和高水平表达FLT3L，在转导后7天收集上清液，并通过ELISA确定FLT3L的存在(图7B和7C)。
为了研究FLT3L产生的DC诱导T细胞的增殖增强的潜力，根据先前公布的方案(Mayer等人，2014，Blood，124：3081-3091)，在GMCSF和FLT3L存在下产生了骨髓来源的DC(BMDDC)。源自NGFR FLlo、Flint或FLhigh T细胞的上清液能够以剂量依赖的方式诱导CD11c+MHCII+DC和CD103+DC的比例和数量增加(图7D-7F)。
我们还检查了从表达FLT3L或对照CAR T细胞产生的DC诱导T细胞增殖的能力。将自OT-I小鼠分离的幼稚CD8+T细胞(其中所有T细胞均具有识别SIINFEKL肽的转基因TCR)用IL-2和IL-7或IL-7和IL-15预调理5天。通过流式细胞术确定预调理的OT-I T细胞上CD44和CD62L的表达，并与幼稚OT-I T细胞进行比较(图7G和7H)。将4x 104个预调理的OT-I T细胞与2x 104个体外分化的OVA257-264 SIINFEKL肽脉冲的GM DC(不补充FLT3L)或FL DC(补充FLT3L)共培养。5天后，根据其倍数扩增和细胞因子产生确定T细胞激活。用FLT3L补充生成的DC显示出显著增强的诱导T细胞增殖的潜力(图7I和7J)。
实施例3
表达FLT3L的CAR T细胞诱导具有优异抗原呈递功能的CD103+DC的分化
用逆转录病毒载体转导抗Her2 CAR T细胞，在所述逆转录病毒载体中表达FLT3L并具有被截短的人神经生长因子受体(NGFR)作为标志物基因，以指示转导效率。用抗Her2CAR和NGFR-FLT3L载体双重转导鼠T细胞产生约40％NGFR+细胞。为了验证转导的细胞表达FLT3L，在转导后7天收集上清液。源自NGFR-FLT3L CAR T细胞的上清液含有高水平(～60000pg/ml)的FLT3L，而来自对照CAR T细胞的上清液则不含可检测水平的FLT3L(图2A)。
为研究表达FLT3L的CAR T细胞诱导CD103+DC分化的潜力，根据先前公布的方案(Mayer等人，2014年，Blood，124：3081-3091)，在GMCSF和FLT3L存在下生成了骨髓来源的DC(BMDDC)。重组FLT3L促进了CD103+树突细胞的分化(图2B)。同样，源自NGFR-FLT3L CAR T细胞的上清液能够诱导CD103+DC的比例和数量增加(图2C)。相比之下，来自对照NGFR-CAR T细胞的上清液没有作用(图2C)。
我们还检查了从表达FLT3L的或对照CAR T细胞生成的DC诱导从头T细胞应答的能力。从OT-I小鼠分离的幼稚CD8+T细胞(其中所有T细胞均具有识别SIINFEKL肽的转基因TCR)与分别用SIINFEKL肽脉冲的DC共培养。5天后，根据其倍数扩增和细胞因子产生确定T细胞激活。根据倍数扩增(图2D)和IFNγ产生(图2E)两者，在来自FLT3L CAR T细胞的上清液存在下生成的DC表现出显著增强诱导T细胞应答的潜力。
鉴于先前的报告已经表明CD103+DC表现出更高的TLR3表达(Desch等人，2014，Nature Communications，5：4674；Jelinek等人，2011，Journal of Immunology，186：2422-2429)，我们研究了TLR3激动剂聚IC的添加是否进一步增强这些效果。聚IC的添加显著地增强了与用FLT3L CAR上清液生成的DC共培养的T细胞的扩增(图2D)和细胞因子产生(图2E)，相对于对照DC，IFNγ产生增加>10倍。该数据清楚地表明表达FLT3L的CAR T细胞促进了CD103+DC的分化，这刺激了优异的CD8+T细胞应答。
实施例4
FLT3L增强体内抗肿瘤免疫应答
为了表征FLT3L对体内肿瘤生长的作用，使用MSCV-Cherry逆转录病毒载体工程化改造肿瘤细胞以表达FLT3L。这样做是在原理上证明，可以在肿瘤微环境中生成FLT3L，而无需过继转移表达FLT3L的T细胞。与对照肿瘤相比，24JK-Her2肿瘤过表达FLT3L导致肿瘤生长显著减少，4/6的表达FLT3L的肿瘤被排除(图3A和6A)。在RAG-/-小鼠中未观察到这种效果(图3B和6N)，表明T细胞依赖机制。
在肿瘤注射后第8天对肿瘤浸润淋巴细胞的流式细胞术分析表明，从表达FLT3L的肿瘤分离的T细胞既更丰富又更激活了，如显著增加的CD69表达所示(图3C)。这些结果表明FLT3L在肿瘤中的表达显著地增强了抗肿瘤免疫应答，引导我们研究在ACT的背景下表达FLT3L的T细胞的治疗潜力。
实施例5
FLT3L在体内诱导肿瘤消退
在另外的分析中，用FLT3L(FL)、Cherry(Cherry FLhi)或对照载体(Cherryhi)转导人24JK-Her2。将5×105个细胞皮下注射到人Her2(hHer2+/-)转基因小鼠的右侧肋腹，并监测肿瘤的生长。当肿瘤面积超过100mm2时，对小鼠实施安乐死。FLT3L表达导致对肿瘤生长的抑制和增强的存活率(图6A和6B)。
还在肿瘤接种后第9天通过流式细胞术分析了肿瘤和肿瘤引流淋巴结(dLN)。在分泌FLT3L的肿瘤中观察到增加的CD8+T细胞浸润和CD103+树突细胞(DC)的扩增。在分泌FLT3L的肿瘤的dLN中检测到了迁移DC和驻留DC的增加(图6C-6F)。此外，肿瘤和dLN中Cherry+细胞的频率表明，迁移DC更有效地取用和转运dLN中的肿瘤抗原。
在双侧胁腹肿瘤模型中系统地评估了FLT3L诱导肿瘤消退的能力，其中在小鼠的右(同侧)胁腹中用Cherry FLhi或对照Cherryhi 24JK-Her2细胞接种，以及在左侧(对侧)胁腹用对照Cherryhi 24JK-Her2细胞接种。注射同侧Cherry FLhi后，我们观察到肿瘤消退。注射对侧Cherryhi 24JK-Her2细胞后未观察到这种效果(图6I和6J)。此外，当将24JK-Her2Cherry FLhi细胞与Cherryhi对照细胞以不同比例滴定并皮下接种到hHer2+/-转基因小鼠的同侧胁腹中时，在Cherry FLhi细胞的100％、10％和1％比例观察到肿瘤面积的减少(图6K)。尽管在Cherry FLhi细胞的比例为10％和1％时，肿瘤和血清FLT3L的水平显著降低(图6L和6M)。这表明FLT3L的局部浓度对于治疗效果是关键的。
实施例6
肿瘤部位的FLT3L表达增强了抗肿瘤免疫力
将Her2转基因小鼠皮下注射5x 105个24JK-Her2肿瘤细胞，在第9天进行非致死性辐照(0.5Gy；允许CAR T细胞移植)并在第9天和第10天用1x 107个抗-Her2 CAR T细胞治疗。施用表达FLT3L的CAR T细胞导致肿瘤中FLT3L的浓度更高(图4A)以及显著更高的治疗功效(图4B)。综上所述，这些结果表明，工程化改造T细胞以表达FLT3L可以增强在肿瘤部位的FLT3L浓度，使宿主免疫系统参与并提高ACT在实体瘤中的功效。
实施例7
研究表达FLT3L的OT-I T细胞的体内治疗潜力
为了在常规ACT模型中测试表达FLT3L的T细胞的作用，我们研究了将表达FLT3L的OT-I T细胞过继转移入携带E0771-OVA肿瘤的小鼠中的功效。
为了确定表达FLT3L的OT-I T细胞的治疗功效，将2×105个表达卵清蛋白(OVA)的三阴性乳腺癌系E0771(E0771 OVAdim)细胞注射入野生型小鼠的第四乳腺脂肪垫中。一旦肿瘤形成(指定为第0天)，将小鼠用非致死性辐射(0.5Gy)进行预调理，以允许T细胞植入，并在第0天和第1天用1x 107个Cherry(对照)或Cherry-FLT3L OT-I T细胞治疗。还向小鼠腹膜内施用50,000U IL-2以维持T细胞生长(图8A)。
还使用实施例3中使用的相同剂量，与聚IC或聚ICLC组合，评价Cherry/Cherry-FLT3L OT-I T细胞的功效。包括单独聚IC或聚ICLC的治疗效果作为对照。
还通过ELISA确定了小鼠血液和血清中FLT3L的表达(图8B)。为了研究表达FLT3L的OT-I T细胞诱导DC前体(前cDC)扩增的潜力，在治疗后第5天和第7天评估了在骨髓、肿瘤和dLN中前cDC的比例(图8C，8D和8I)。显示了肿瘤cDC1、cDC2和cDC1前体的显著增加(图8F)，而在dLN中还显示了总DC、迁移DC和驻留DC的显著增加。总之，这些结果表明分泌FLT3L的T细胞的过继转移扩增了CD130+cDC1。
为了研究在用OT-I或OT-I FLT3L T细胞治疗后与DC相关基因相关的更广泛的转录变化，在治疗后第7天，切除肿瘤，消化，并提取RNA用于使用Nanostring Immune PanelArray进行分析。该分析鉴定了许多差异表达的基因(图8G和8H)，其中许多基因是由树突细胞(包括cDC1)表达的，并且与用分泌FLT3的T细胞治疗后CD103+cDC1的扩增是伴随的。
在如上文[0165]段所述的治疗之后，通过流式细胞术分析E0771-OVA肿瘤浸润淋巴细胞。在用表达FLT3L的OT-I T细胞治疗后第7天，在肿瘤部位表达IL-12和TNFα的cDC1和cDC2的数量显著增加(图9B)。此外，还观察到了表达IFNγ和TNFα的内源性CD8+T细胞的相应显著增加(图9F-9H)。这些结果表明DC扩增增强了功能性宿主CD8+T细胞在肿瘤部位的浸润。
分泌FLT3L的OT-I T细胞显著地增加具有CD62L+TCF7+表型的内源性CD8+T细胞的比例(图9G)。该表型以前与对免疫检查点阻断的应答改善有关(Sade-Feldman等人，2018，Cell，175(4)：998-1013)，并表明这可以增强对免疫佐剂，例如抗PD-1或抗CTLA-4的应答。
还使用以上在段落[0168]中描述的方法来查询与T细胞和NK细胞相关基因相关联的转录变化。该分析鉴定了许多差异表达的基因(图9K)，其可能是导致功能性宿主(即内源性)CD8+T细胞在肿瘤部位的浸润增强的原因。
为进一步研究将表达FLT3L的T细胞与pIC或激动性抗41BB抗体组合，使用OT-I模型在接种E0771细胞并用转导的OT-I T细胞治疗的野生型、Batf3-/-或Rag1-/-小鼠中的体内治疗效果(如图8A所示)。在治疗后第5天和第8天，对小鼠腹膜内给予pIC(100μg/小鼠)和抗41BB(100μg/小鼠)。当肿瘤面积超过150mm2时，对小鼠实施安乐死。在野生型小鼠中，FLT3L表达导致对肿瘤生长的抑制和增强的存活率，而分泌FL的OT-I T细胞与pIC和抗-41BB的组合显著地抑制肿瘤生长(图10A)。在野生型小鼠中观察到的抗肿瘤活性在分别缺少cDC1 DC和T细胞的Batf3-/-和Rag1-/-小鼠中减弱(图10B和10C)。
使用分泌FLT3L的T细胞与免疫刺激佐剂的组合观察到的对肿瘤生长的抑制可能与佐剂疗法后与免疫细胞激活相关的差异表达的基因相关联(图10D)。替代地，该作用也可能与cDC1的激活增强和/或肿瘤或dLN内的肿瘤抗原特异性T细胞的频率相关联(图10E-10J)。
尽管观察到的分泌FLT3L的T细胞与免疫佐剂组合对肿瘤生长的显著抑制，但未观察到显著的毒性(图13)。
实施例8
研究表达FLT3L的抗Her2 CAR T细胞的功效
C57/BL6 Her2转基因小鼠(hHer2-/-)用作接受体，并且如先前所述从WT小鼠产生CAR T细胞(John等人，同上；Beavis等人，2017，同上；图11A)。给小鼠皮下接种2.5×105个表达Her2的结直肠癌细胞系MC38。在肿瘤接种后第5天，在全身辐照(0.5Gy)以对小鼠进行预调理之后，用1×107个CAR T或CAR T FL细胞治疗小鼠。还用五个剂量的IL-2(每个剂量50,000个单位)治疗小鼠以维持T细胞生长。当肿瘤面积超过150mm2时，对小鼠实施安乐死。在体外证实了抗Her2 CAR T细胞的FTL3L表达(图11A)，并导致对肿瘤生长的抑制和增强的存活率(图11C和11D)。分泌FL的CAR T细胞和pIC(治疗后第5天和第8天每剂量100μg)的组合显著地抑制了肿瘤生长并增强了总生存率(图11C和11D)。在缺少功能性cDC1树突细胞(图11E)或T细胞(图11F)的小鼠中未观察到这种效果，因为CAR T细胞不使用DC来识别其同类抗原。因此，在该系统中观察到的任何效果都可能归因于表位扩展和从头抗肿瘤免疫应答的诱导。
如图11A中所述，在右胁腹皮下接种了MC38-Her2细胞，随后用CAR T FL和pIC进行治疗的hHer2-/-小鼠中进一步评估了表位扩展的作用。随后，在治疗后第60天，将治愈了其原发MC38-Her2肿瘤的小鼠左侧(相对侧)胁腹用亲本MC38系进行再次攻击(图12A)。与未治疗过的小鼠相比，治愈了其原发MC38-Her2肿瘤的小鼠在MC38再次攻击期间表现出增强的肿瘤生长抑制(图12B)。
为了评估TCR多样性，如图10A中所述，用E0771-OVA肿瘤接种CD45.1宿主同类系小鼠，并用CD45.2+OT-I T细胞与佐剂进行过继转移。治疗后第7天，使用14种TCR Vβ抗体的组评估肿瘤dLN，以评价CD45.1+宿主CD8+T细胞的TCR多样性。显示了用分泌FLT3L的T细胞和佐剂的组合治疗的小鼠中三个TCR Vβ子集的频率增加，表明宿主CD8+T细胞的寡克隆扩增(图12C和12D)。
最后，我们还评估了抗OVA应答，以确定针对非CAR靶向抗原的抗肿瘤活性。在第四个乳腺脂肪垫中，向hHer2-/-小鼠接种4x 105个表达OVA和Her2的E0771细胞(E0771 OVAHer2细胞)。肿瘤接种后第9天，在全身辐照(0.5Gy)以对小鼠预调理后用1x 107个CAR T或CAR T FL细胞治疗小鼠。在治疗后第0天和第2天腹膜内施用IL-2(每剂量50,000个单位)。另外，在治疗后的第5天和第8天，还对小鼠腹膜内施用pIC(100μg)和抗4-1BB抗体(100μg)。当肿瘤面积超过150mm2时，对小鼠实施安乐死。
CAR T FL细胞与免疫佐剂的组合显著地增强了肿瘤生长抑制(图12H)。这种作用与表位扩展相关联，如血液中H-2Kb OVA四聚体阳性T细胞的频率增加所表明的(图12F-G)。
序列表
<110> Peter MacCallum Cancer Institute
<120> 经修饰的T细胞及其用途
<130> 35265942/MKR/SJD
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7212
<212> DNA
<213> 人
<400> 1
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 60
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 120
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aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatgga acagctgaat atgggccaaa 5040
caggatatct gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca 5100
gatgcggtcc agccctcagc agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa 5160
ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg 5220
ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggggcgc 5280
cagtcctccg attgactgag tcgcccgggt acccgtgtat ccaataaacc ctcttgcagt 5340
tgcatccgac ttgtggtctc gctgttcctt gggagggtct cctctgagtg attgactacc 5400
cgtcagcggg ggtctttcat ttgggggctc gtccgggatc gggagacccc tgcccaggga 5460
ccaccgaccc accaccggga ggtaagctgg ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 5520
aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 5580
gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 5640
gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 5700
attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 5760
taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 5820
ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 5880
gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 5940
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 6000
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 6060
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 6120
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 6180
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 6240
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 6300
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 6360
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 6420
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 6480
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 6540
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 6600
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 6660
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 6720
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 6780
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 6840
gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 6900
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 6960
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 7020
gttgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 7080
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 7140
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 7200
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 7260
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 7320
tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 7380
attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 7440
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 7500
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 7560
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 7620
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 7680
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 7740
acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaattcat accagatcac 7800
cgaaaactgt cctccaaatg tgtccccctc acactcccaa attcgcgggc ttctgcctct 7860
tagaccactc taccctattc cccacactca ccggagccaa agccgcggcc cttccgtttc 7920
tttgct 7926

Claims (41)

1.一种分离的T细胞，其经修饰以表达外源性FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)。
2.权利要求1的分离的T细胞，其中分离的T细胞也经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
3.权利要求2的分离的T细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CD19、CD20、CD22、CD30、ROR1、CD123、CD33、CD133、CD138、GD2、Her2、Her1、间皮素、MUC1、gp100、MART-1、MAGE-A3、MUC16、NY-ESO-1、L1-CAM、CEA、FAP、VEGFR2、WT1、TAG-72、CD171、α-FR、CAIX、PSMA和Lewis Y。
4.权利要求3的分离的T细胞，其中所述抗原结合结构域与Her2结合。
5.权利要求2至4中任一项的分离的T细胞、其中所述信号传导结构域选自以下组成的组：CD3ζ、CD28、41BB、DAP10、OX40、ICOS、DAP12、KIR2DS2、4-1BB、CD3s、CD35、CD3C、CD25、CD27、CD79A、DC79B、CARD11、FcRa、Fcftp、FcRy、Fyn、HVEM、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slip76、pTa、TCRa、TCRP、TRIM、Zap70、PTCH2和LIGHT。
6.权利要求5的分离的T细胞，其中所述信号传导结构域选自由CD28和CD3ζ组成的组。
7.权利要求6的分离的T细胞，其中所述CAR包含CD28和CD3ζ信号传导结构域。
8.权利要求1至7中任一项的分离的T细胞，其中所述分离的T细胞衍生自哺乳动物供体。
9.权利要求8的分离的T细胞，其中所述分离的T细胞衍生自人供体。
10.一种药物组合物，包含权利要求1至9中任一项的分离的T细胞。
11.权利要求10的药物组合物，用于治疗癌症。
12.权利要求11的药物组合物，用于治疗实体癌。
13.权利要求10至12中任一项的药物组合物，与选自下组的一种或多种组合施用：PDL-1:PD-1轴的抑制剂、TLR3激动剂、4-1BB激动剂、TLR7激动剂、TIM-3的抑制剂和CTLA-4的抑制剂。
14.一种治疗癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至9中任一项的分离的T细胞或权利要求10至13中任一项的药物组合物。
15.权利要求14的方法，进一步包括施用选自下组的一种或多种：PDL-1:PD-1轴的抑制剂、TLR3激动剂、4-1BB激动剂、TLR7激动剂、TIM-3的抑制剂和CTLA-4的抑制剂。
16.权利要求14或15的方法，用于治疗实体癌。
17.权利要求14至16中任一项的方法，其中受试者是哺乳动物。
18.权利要求17的方法，其中受试者是人。
19.权利要求1至9中任一项的分离的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
20.一种载体，包含可操作地连接至T细胞特异性调节元件的编码FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的核酸。
21.权利要求20的载体，进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
22.权利要求20或21的载体，其中抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CD19、CD20、CD22、CD30、ROR1、CD123、CD33、CD133、CD138、GD2、Her2、Her1、间皮素、MUC1、gp100、MART-1、MAGE-A3、MUC16、NY-ESO-1、L1-CAM、CEA、FAP、VEGFR2、WT1、TAG-72、CD171、α-FR、CAIX、PSMA和Lewis Y。
23.权利要求22的载体，其中抗原结合结构域与Her2结合。
24.权利要求21至23中任一项的载体，其中信号传导结构域选自由以下组成的组：CD3ζ、CD28、41BB、DAP10、OX40、ICOS、DAP12、KIR2DS2、4-1BB、CD3s、CD35、CD3C、CD25、CD27、CD79A、DC79B、CARD11、FcRa、Fcftp、FcRy、Fyn、HVEM、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slip76、pTa、TCRa、TCRP、TRIM、Zap70、PTCH2和LIGHT。
25.权利要求24的载体，其中信号传导结构域选自由CD28和CD3ζ组成的组。
26.权利要求24的载体，其中CAR包含CD28和CD3ζ信号传导结构域。
27.权利要求20至26中任一项的载体，其中T细胞特异性调节元件是NFAT共有序列。
28.一种病毒颗粒，包含编码FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的核酸。
29.权利要求28的病毒颗粒，还包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中CAR包含抗原结合结构域和至少一个信号传导结构域。
30.权利要求29的病毒颗粒，其中抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CD19、CD20、CD22、CD30、ROR1、CD123、CD33、CD133、CD138、GD2、Her2、Her1、间皮素、MUC1、gp100、MART-1、MAGE-A3、MUC16、NY-ESO-1、L1-CAM、CEA、FAP、VEGFR2、WT1、TAG-72、CD171、α-FR、CAIX、PSMA和Lewis Y。
31.权利要求30的病毒颗粒，其中抗原结合结构域与Her2结合。
32.权利要求29至31中任一项的病毒颗粒，其中信号传导结构域选自下组：CD3ζ、CD28、41BB、DAP10、OX40、ICOS、DAP12、KIR2DS2、4-1BB、CD3s、CD35、CD3C、CD25、CD27、CD79A、DC79B、CARD11、FcRa、Fcftp、FcRy、Fyn、HVEM、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slip76、pTa、TCRa、TCRP、TRIM、Zap70、PTCH2和LIGHT。
33.权利要求32的病毒颗粒，其中信号传导结构域选自由CD28和CD3ζ组成的组。
34.权利要求33的病毒颗粒，其中CAR包含CD28和CD3ζ信号传导结构域。
35.一种试剂盒，当用于转导分离的T细胞时，所述试剂盒包含权利要求20至27中任一项的载体或权利要求28至34中任一项的病毒颗粒。
36.一种治疗癌症的方法，包括：
a.从受试者获取生物学样品；
b.从样品中分离T细胞；
c.用权利要求20至27中任一项的载体或根据权利要求28至34中任一项的病毒颗粒在体外转导分离的T细胞。
d.在使得所述载体所编码的核酸得到表达的条件下扩增步骤(c)的转导的细胞；和
e.对受试者施用治疗有效量的步骤(d)的T细胞。
37.权利要求36的方法，其中所述样品是全血。
38.权利要求36或37的方法，进一步包括施用由以下组成的组中的一种或多种：PDL-1:PD-1轴的抑制剂、TLR3激动剂、4-1BB激动剂、TLR7激动剂、TIM-3的抑制剂和CTLA-4的抑制剂。
39.权利要求36至38中任一项的方法，其中癌症是实体癌。
40.权利要求36至39中任一项的方法，其中受试者是哺乳动物。
41.权利要求40的方法，其中受试者是人。
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