ES2819976T3

ES2819976T3 - Composiciones y usos médicos para la reprogramación de TCR con proteínas de fusión

Info

Publication number: ES2819976T3
Application number: ES16797244T
Authority: ES
Inventors: Patrick Baeuerle; Gregory Sieczkiewicz; Robert Hofmeister
Original assignee: TCR2 Therapeutics Inc
Current assignee: TCR2 Therapeutics Inc
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2016-05-18
Publication date: 2021-04-19
Anticipated expiration: 2036-05-18
Also published as: JP2021176326A; EA202090931A2; US10442849B2; IL303905A; IL255697B2; AU2016264323B2; CN114634943A; EA201792420A1; US11965012B2; JP2018515123A; EP3770168A1; HK1252643A1; EA202090931A3; EA035618B1; FI3298033T4; ES2819976T5; WO2016187349A1; US20200362011A1; PT3298033T; PL3298033T5

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende (I) un linfocito T humano, en donde el linfocito T comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP) que comprende (a) una subunidad de TCR que comprende (i) al menos una parte de un dominio extracelular de TCR, y (ii) un dominio intracelular de TCR que comprende un dominio estimulador de un dominio de señalización intracelular de CD3 épsilon; CD3 gamma, o CD3 delta; y (b) un dominio de anticuerpo murino, humano o humanizado que comprende un dominio de unión al antígeno; donde la subunidad de TCR y el dominio de anticuerpo se enlazan de forma operativa, y donde la TFP se incorpora en un TCR cuando se expresa en un linfocito T; y (II) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y usos médicos para la reprogramación de TCR con proteínas de fusión

Referencia cruzada

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 62/163.342, presentada el 18 de mayo de 2015.

Antecedentes de la invención

La mayoría de los pacientes con neoplasias hematológicas o con tumores sólidos de fase avanzada son incurables con terapias estándar. Además, las opciones de tratamiento tradicionales frecuentemente tienen efectos secundarios graves. Se han realizado numerosos intentos para hacer que el sistema inmunitario de un paciente rechace las células cancerosas, enfoque al que se hace referencia de forma conjunta como inmunoterapia contra el cáncer. Sin embargo, existen diversos obstáculos que dificultan que se logre la eficacia clínica. Si bien se han identificado cientos de los denominados antígenos tumorales, estos a menudo derivan de sí mismos y por tanto pueden dirigir la inmunoterapia contra el cáncer hacia tejido sano o son escasamente inmunogénicos. Además, las células cancerosas utilizan múltiples mecanismos para hacerse invisibles u hostiles al inicio y la propagación de un ataque al sistema inmunitario por parte de las inmunoterapias contra el cáncer.

Recientes avances que utilizan una terapia de linfocitos T autólogos modificados por un receptor de antígeno quimérico (CAR, por sus siglas en inglés), que se basa en la redirección de linfocitos T modificados genéticamente a una molécula de superficie celular adecuada en las células cancerosas, muestran resultados prometedores en el aprovechamiento de la potencia del sistema inmunitario para tratar neoplasias de linfocitos B (véase, por ejemplo, Sadelain et ál., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)). Los resultados clínicos con linfocitos T CAR específicos para CD19 (denominados CTL019) han demostrado remisión total en pacientes que padecen leucemia linfocítica crónica (LLC) así como leucemia linfoblástica aguda infantil (LLA) (véase, por ejemplo, Kalos et ál., Sci Transl Med 3:95ra73 (2011), Porter et ál., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et ál., NEJM 368:1509-1518 (2013)). Un enfoque alternativo es el uso de las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés) seleccionadas para un antígeno de péptido asociado a un tumor para modificar genéticamente los linfocitos T autólogos. Estas cadenas de TCR formarán complejos TCR completos y proporcionarán los linfocitos T con un TCR para una segunda especificidad definida. Se obtuvieron resultados alentadores con linfocitos T autólogos modificados que expresan las cadenas alfa y beta de TCR específico para NY-ESO-1 en pacientes con carcinoma sinovial.

Además de la capacidad de los linfocitos T modificados genéticamente que expresan un CAR o un segundo TCR de reconocer y destruir las respectivas células diana in vitro/ex vivo, la terapia exitosa en pacientes con linfocitos T modificados requiere que los linfocitos T sean capaces de una potente activación, expansión, continuidad en el tiempo y, en caso de una enfermedad recidivante, que permitan una respuesta «de memoria». La eficacia clínica elevada y manejable de linfocitos T CAR se encuentra limitada actualmente a pacientes con neoplasias de linfocitos B positivos a c D19 y con sarcoma sinovial con expresión del péptido NY-ESO-1 que expresen HLA-A2. Existe una necesidad clara de mejorar los linfocitos T modificados genéticamente para que actúen de forma más amplia contra diversas neoplasias humanas. En la presente se describen proteínas de fusión novedosas de subunidades de TCR, inclusive CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta, y de las cadenas TCR alfa y TCR beta con dominios de unión específicos para los antígenos de superficie celular que tienen el potencial de vencer las limitaciones de los enfoques existentes. En la presente se describen proteínas de fusión novedosas que eliminan de forma más eficiente las células diana que CAR, pero liberan niveles comparables o menores de citoquinas proinflamatorias. Estas proteínas de fusión y sus usos médicos representan una ventaja para TFP respecto a CAR ya que los niveles elevados de estas citoquinas se han asociado con toxicidades que limitan la dosis para las terapias con CAR-T adoptivas.

El documento EP2258720 (AI) se dirige a una proteína de fusión (TFP) de receptor de linfocito T funcional (TCR) que reconoce y se une al menos a un epítopo presentado en el MHC, y que contiene al menos una secuencia de aminoácido que reconoce y que se une a un antígeno. La divulgación se dirige adicionalmente a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la misma, a un linfocito T que expresa dicha TFP, y a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de enfermedades que implican células malignas que expresan dicho antígeno asociado al tumor. El documento WO 2010/052014 (Al) se refiere a un método para el tratamiento, la mejora o la eliminación de leucemia linfoblástica aguda (ALL), comprendiendo el método la administración de una composición farmacéutica que comprende una construcción de anticuerpo biespecífico de cadena única CD19xCD3 a un paciente adulto que lo necesite. El documento EP0638119 (Al) se refiere a genes del receptor quimérico adecuados para dotar a los linfocitos con especificidad de tipo de anticuerpo, e incluye un primer segmento de gen que codifica un dominio Fv monocatenario de un anticuerpo específico y un segundo segmento de gen que codifica todo o parte de los dominios transmembrana y citoplasmático, y opcionalmente el dominio extracelular, de una molécula desencadenante de células inmunes. El gen del receptor quimérico, cuando se transfecta a células inmunes, expresa el sitio de reconocimiento del anticuerpo y la fracción desencadenante de la célula inmunitaria en una cadena continua. Los linfocitos transformados son útiles en tratamientos terapéuticos.

Compendio de la invención

En la presente se proporcionan proteínas de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP, por sus siglas en inglés), linfocitos T modificados para expresar una o más TFP y usos médicos de los mismos para el tratamiento de enfermedades.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de ácido nucleico recombinante aislada que codifica una proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP), que comprende una subunidad de TCR que comprende al menos una parte de un dominio extracelular de TCR y un dominio intracelular de TCR que comprende un dominio estimulador de un dominio de señalización intracelular de CD3 épsilon; y un dominio de anticuerpo humano o humanizado que comprende un dominio de unión al antígeno donde la subunidad de TCR y el dominio de anticuerpo se enlazan de forma operativa, y donde la TFP se incorpora a un TCR cuando se expresa en un linfocito T.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de ácido nucleico recombinante aislada que codifica una proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP), que comprende una subunidad de TCR que comprende al menos una parte de un dominio extracelular de TCR y un dominio intracelular de TCR que comprende un dominio estimulador de un dominio de señalización intracelular de CD3 gamma; y un dominio de anticuerpo humano o humanizado que comprende un dominio de unión al antígeno donde la subunidad de TCR y el dominio de anticuerpo se enlazan de forma operativa, y donde la TFP se incorpora a un TCR cuando se expresa en un linfocito T.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de ácido nucleico recombinante aislada que codifica una proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP), que comprende una subunidad de TCR que comprende al menos una parte de un dominio extracelular de TCR y un dominio intracelular de TCR que comprende un dominio estimulador de un dominio de señalización intracelular de CD3 delta; y un dominio de anticuerpo humano o humanizado que comprende un dominio de unión al antígeno donde la subunidad de TCR y el dominio de anticuerpo se enlazan de forma operativa, y donde la TFP se incorpora a un TCR cuando se expresa en un linfocito T.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de ácido nucleico recombinante aislada que codifica una proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP), que comprende una subunidad de TCR y un dominio de anticuerpo humano o humanizado que comprende un dominio de unión al antígeno que es un dominio de unión anti-CD19.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de ácido nucleico recombinante aislada que codifica una proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP) que comprende una subunidad de TCR y un dominio de anticuerpo humano o humanizado que comprende un dominio de unión al antígeno que es un dominio de unión antiantígeno de maduración de linfocitos B (BCMA, por sus siglas en inglés).

En algunos casos, la subunidad de TCR y el dominio del anticuerpo se encuentran enlazados de forma operativa. En algunos casos, la TFP se incorpora en un TCR cuando se expresa en un linfocito T. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno codificado se conecta al dominio extracelular del TCR mediante una secuencia enlazadora. En algunos casos, la secuencia enlazadora codificada comprende (G4S)n, donde n=1 a 4. En algunos casos, la subunidad de TCR comprende un dominio extracelular de TCR. En algunos casos, la subunidad de TCR comprende un dominio transmembrana de TCR. En algunos casos, la subunidad de TCR comprende un dominio intracelular de TCR. En algunos casos, la subunidad de TCR comprende (i) un dominio extracelular de TCR, (ii) un dominio transmembrana de TCR y (iii) un dominio intracelular de TCR, donde al menos dos de (i), (ii) y (iii) son de la misma subunidad de TCR. En algunos casos, la subunidad de TCR comprende un dominio intracelular de TCR que comprende un dominio estimulador que se selecciona de un dominio de señalización intracelular de CD3 épsilon, CD3 gamma o CD3 delta, o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos una, dos o tres modificaciones en esta. En algunos casos, la subunidad de TCR comprende un dominio intracelular que comprende un dominio estimulador que se selecciona de un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una modificación en esta. En algunos casos, el dominio de anticuerpo humano o humanizado comprende un fragmento de anticuerpo. En algunos casos, el dominio de anticuerpo humano o humanizado comprende un scFv o un dominio V^h. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada codifica (i) una cadena ligera (LC) CDR1, LC CDR2 y LC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de dominio de unión de cadena ligera anti-CD19 con 70-100 % de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 29, respectivamente, y/o (ii) una cadena pesada (HC) Cd R1, HC CDR2 y HC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de dominio de unión de cadena pesada anti-CD19 con 70-100 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 35, respectivamente. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una pero no más de 30 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 49, o una secuencia con 95-99 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 49. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una región variable de cadena pesada, donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una pero no más de 30 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 51, o una secuencia con 95-99 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 51. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada codifica (i) una cadena ligera (LC) CDR1, LC CDR2 y LC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de dominio de unión de cadena ligera anti-BCMA con 70-100 % de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 41, respectivamente, y/o (ii) una cadena pesada (HC) C^dR1, HC CDR2 y HC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de dominio de unión de cadena pesada anti-BCMA con 70-100 % de identidad de secuencia respecto a SEQ ID NO: 43, la SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 47, respectivamente. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una pero no más de 30 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 53, o una secuencia con 95-99 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 53. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una región variable de cadena pesada, donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una pero no más de 30 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 55, o una secuencia con 95-99 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 55. En algunos casos, la TFP incluye un dominio extracelular de una subunidad de ^tC^rque comprende un dominio extracelular, o una parte de este, de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en una cadena alfa TCR, una cadena beta TCR, una subunidad de TCR CD3 épsilon, una subunidad de TCR CD3 gamma, una subunidad de TCR CD3 delta, fragmentos funcionales de estas, y secuencias de aminoácidos de estas que tienen al menos una pero no más de 20 modificaciones. En algunos casos, la TFP codificada incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en una cadena alfa TCR, una cadena beta TCR, una subunidad de TCR CD3 épsilon, una subunidad de TCR CD3 gamma, una subunidad de TCR CD3 delta, fragmentos funcionales de estas, y secuencias de aminoácidos de estas que tienen al menos una pero no más de 20 modificaciones. En algunos casos, la TFP codificada incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en una cadena alfa de TCR, una cadena beta de TCR, una cadena zeta de TCR, una subunidad de TCR CD3 épsilon, una subunidad de TCR CD3 gamma, una subunidad de TCR CD3 delta, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, fragmentos funcionales de estos, y secuencias de aminoácidos de estos que tienen al menos una pero no más de 20 modificaciones. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En algunos casos, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional obtenido de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137), y las secuencias de aminoácidos de estos que tienen al menos una pero no más de 20 modificaciones en estas. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia líder. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico aislada es ARNm.

En algunos casos, la TFP incluye un motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM, por sus siglas en inglés) de una subunidad de TCR que comprende un ITAM, o una parte de este, de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en una subunidad de TCR CD3 zeta, una subunidad de TCR CD3 épsilon, una subunidad de TCR ^cD3 gamma, una subunidad de TCR CD3 delta, una cadena zeta de TCR, una cadena del receptor Fc épsilon 1, una cadena del receptor Fc épsilon 2, una cadena del receptor Fc gamma 1, una cadena del receptor Fc gamma 2a, una cadena del receptor Fc gamma 2b1, una cadena del receptor Fc gamma 2b2, una cadena del receptor Fc gamma 3a, una cadena del receptor Fc gamma 3b, una cadena del receptor Fc beta 1, TYROBP (DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, fragmentos funcionales de estos, y secuencias de aminoácidos de estos que tienen al menos una pero no más de 20 modificaciones a estas. En algunos casos, el ITAM remplaza un ITAM de CD3 gamma, CD3 delta o CD3 épsilon. En algunos casos, el ITAM se selecciona del grupo que consiste en una subunidad de TCR CD3 zeta, una subunidad de TCR CD3 épsilon, una subunidad de TCR CD3 gamma y una subunidad de TCR CD3 delta y remplaza un ITAM diferente que se selecciona del grupo que consiste en una subunidad de TCR CD3 zeta, una subunidad de TCR CD3 épsilon, una subunidad de TCR CD3 gamma y una subunidad de TCR CD3 delta.

En algunos casos, el ácido nucleico comprende un análogo de nucleótido. En algunos casos, el análogo de nucleótido se selecciona del grupo que consiste en 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo, 2'-deoxi, T-deoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), T-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-D^mA^eOE), 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA) modificado, un ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés), un ácido nucleico de etileno (ENA, por sus siglas en inglés), un ácido nucleico de péptido (PNA, por sus siglas en inglés), un ácido nucleico de 1',5'- anhidrohexitol (HNA, por sus siglas en inglés), un morfolino, un nucleótido metilfosfonato, un nucleótido tiolfosfonato y una 2'-fluoro N3-P5'-fosforamidita.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de polipéptido aislada codificada por una molécula de ácido nucleico que se proporciona en la presente.

En un aspecto, en el presente documento se proporciona una molécula de TFP aislada que comprende un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de TFP aislada que comprende un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en donde la molécula de TFP es capaz de interaccionar funcionalmente con un complejo de TCR endógeno y/o al menos un polipéptido de TCR endógeno.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de TFP aislada que comprende un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, donde la molécula de TFP es capaz de integrarse de forma funcional al complejo endógeno de TCR

En algunos casos, la molécula de TFP aislada comprende un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. En algunos casos, el dominio de unión anti-CD19 es un dominio scFv o uno V^h. En algunos casos, el dominio de unión anti-CD19 comprende una cadena pesada con 95-100 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51, un fragmento funcional de esta, o una secuencia de aminoácidos de esta que tenga al menos una pero no más de 30 modificaciones. En algunos casos, el dominio de unión anti-CD19 comprende una cadena ligera con 95-100 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49, un fragmento funcional de esta, o una secuencia de aminoácidos de esta que tenga al menos una pero no más de 30 modificaciones. En algunos casos, la molécula de TFP aislada comprende un dominio extracelular de TCR que comprende un dominio extracelular, o una parte de este, de una proteína que se selecciona del grupo que consta de una cadena alfa de TCR, una cadena beta de TCR, una subunidad de TCR CD3 épsilon, subunidad de TCR CD3 gamma, una subunidad de TCR CD3 delta, fragmentos funcionales de estas, y secuencias de aminoácidos de estas que tengan al menos una pero no más de 20 modificaciones. En algunos casos, el dominio de unión anti-CD19 se conecta con el dominio extracelular de TCR mediante una secuencia enlazadora. En algunos casos, la región enlazadora comprende (G4S)n, donde n=1 a 4.

En un aspecto, en el presente documento se proporciona una molécula de TFP aislada que comprende un dominio de unión anti-BCMA humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de TFP aislada que comprende un dominio de unión anti-BCMA humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, en donde la molécula de TFP es capaz de interaccionar de manera funcional con un complejo de TCR endógeno y/o al menos un polipéptido de TCR endógeno.

En un aspecto, se proporciona en la presente una molécula de TFP aislada que comprende un dominio de unión anti-BCMA humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, donde la molécula de TFP es capaz de integrarse de forma funcional al complejo endógeno de TCR

En algunos casos, la molécula de TFP aislada comprende un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende un dominio de unión anti-BCMA humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. En algunos casos, el dominio de unión anti-BCMA es un dominio scFv o uno V^h. En algunos casos, el dominio de unión anti-BCMA comprende una cadena pesada con 95-100 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55, un fragmento funcional de esta, o una secuencia de aminoácidos de esta que tenga al menos una pero no más de 30 modificaciones. En algunos casos, el dominio de unión anti-BCMA comprende una cadena ligera con 95-100 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53, un fragmento funcional de esta, o una secuencia de aminoácidos de esta que tenga al menos una pero no más de 30 modificaciones. En algunos casos, la molécula de TFP aislada comprende un dominio extracelular de TCR que comprende un dominio extracelular, o una parte de este, de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en una cadena alfa de TCR, una cadena beta de TCR, una subunidad de TCR CD3 épsilon, una subunidad de TCR CD3 gamma, una subunidad de TCR CD3 delta, fragmentos funcionales de estas, y secuencias de aminoácidos de estas que tienen al menos una pero no más de 20 modificaciones. En algunos casos, el dominio de unión anti-BCMA se conecta al dominio extracelular de TCR mediante una secuencia enlazadora. En algunos casos, la región enlazadora comprende (G4S)n, donde n=1 a 4. En algunos casos, la molécula de TFP aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En algunos casos, la molécula de TFP aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, la molécula de TFP aislada comprende además una secuencia líder.

En un aspecto, se proporciona en la presente un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una TFP que se proporciona en la presente. En algunos casos, el vector se selecciona del grupo que consiste en un ADN, un ARN, un plásmido, un vector de lentivirus, un vector adenovírico, un vector del virus de sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés) o un vector de retrovirus. En algunos casos, el vector comprende además un promotor. En algunos casos, el vector es un vector transcrito in vitro. En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una cola de poli(A). En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una UTR 3'.

En un aspecto, se proporciona en la presente una célula que comprende un vector que se proporciona en la presente. En algunos casos, la célula es un linfocito T humano. En algunos casos, el linfocito T es un linfocito T CD8+ o CD4+. En algunos casos, la célula comprende además un ácido nucleico que codifica una molécula inhibidora que comprende un primer polipéptido que comprende al menos una parte de una molécula inhibidora, que se asocia con un segundo polipéptido que comprende una señal positiva de un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, la molécula inhibidora comprende un primer polipéptido que comprende al menos una parte de PD1 y un segundo polipéptido que comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primario. En un aspecto, se proporciona en la presente un linfocito T CD8+ o CD4+ humano que comprende al menos dos moléculas de TFP, donde las moléculas de TFP comprenden un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular, donde la molécula de TFP es capaz de interactuar de forma funcional con un complejo endógeno de TCR y/o al menos un polipéptido endógeno de TCR dentro, en y/o sobre la superficie del linfocito T CD8+ o CD4+ humano.

En un aspecto, se proporciona en la presente un complejo de proteína que comprende: una molécula de TFP que comprende un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular; y al menos un complejo endógeno de TCR.

En algunos casos, el TCR comprende un dominio extracelular, o una parte de este, de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en una cadena alfa de TCR, una cadena beta de TCR, una subunidad de TCR CD3 épsilon, una subunidad de TCR CD3 gamma y una subunidad de TCR CD3 delta. En algunos casos, el dominio de unión anti-CD19 se conecta al dominio extracelular de TCR mediante una secuencia enlazadora. En algunos casos, la región enlazadora comprende (G4S)n, donde n=1 a 4.

En un aspecto, se proporciona en la presente un complejo de proteína que comprende: una molécula de TFP que comprende un dominio de unión anti-BCMA humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular; y al menos un complejo endógeno de TCR.

En algunos casos, el TCR comprende un dominio extracelular, o una parte de este, de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en una cadena alfa de TCR, una cadena beta de TCR, una subunidad de TCR CD3 épsilon, una subunidad de TCR CD3 gamma y una subunidad de TCR CD3 delta. En algunos casos, el dominio de unión anti-BCMA se conecta al dominio extracelular de TCR mediante una secuencia enlazadora. En algunos casos, la región enlazadora comprende (G4S)n, donde n=1 a 4.

En un aspecto, se proporciona en la presente un linfocito T CD8+ o CD4+ humano que comprende al menos dos proteínas TFP diferentes por complejo de proteína que se proporciona en la presente.

En un aspecto, se proporciona en la presente un método para crear una célula que comprende la transducción de un linfocito T con un vector que se proporciona en la presente.

En un aspecto, se proporciona en la presente un método para generar una población de células con modificación de ARN que comprende la introducción de un ARN transcrito in vitro o ARN sintético en una célula, donde el ARN comprende un ácido nucleico que codifica una molécula de TFP que se proporciona en la presente.

En un aspecto, se proporciona en la presente un método para proporcionar una inmunidad antitumoral en un mamífero que comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz de una célula que exprese una molécula de TFP que se proporciona en la presente, o que exprese una molécula de polipéptido que se proporciona en la presente.

En algunos casos, la célula es un linfocito T autólogo. En algunos casos, la célula es un linfocito T alogénico. En algunos casos, el mamífero es un ser humano.

En un aspecto, se proporciona en la presente un uso médico para el tratamiento de un mamífero que tiene una enfermedad asociada con la expresión de CD19 o BCMA, que comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz de una molécula de TFP que se proporciona en la presente, una célula que se proporciona en la presente o una molécula de polipéptido que se proporciona en la presente.

En algunos casos, la enfermedad asociada con la expresión de CD19 o BCMA se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad proliferativa, un cáncer, una neoplasia, una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico, una preleucemia, un síntoma no relacionado con cáncer asociado con la expresión de CD19. En algunos casos, la enfermedad es un cáncer hematológico que se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfoide aguda de linfocitos B (LLA B), leucemia linfoide aguda de linfocitos T (LLA T), leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoblástica crónica (LLC), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas, linfoma folicular de células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia, síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom, preleucemia, una enfermedad asociada con la expresión de CD19 o BCMA, y combinaciones de estas. En algunos casos, las células que expresan una molécula de TFP se administran combinadas con un agente que aumenta la eficacia de una célula que exprese una molécula de TFP. En algunos casos, se liberan menos citoquinas en el mamífero en comparación con un mamífero al que se administra una cantidad eficaz de un linfocito T que exprese un receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CD19 o un CAR anti-BCMA. En algunos casos, las células que expresan una molécula de TFP se administran combinadas con un agente que mejora uno o más efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa una molécula de TFP. En algunos casos, las células que expresan una molécula de TFP se administran combinadas con un agente que trata la enfermedad asociada con CD19 o BCMA.

En un aspecto, una molécula de ácido nucleico aislada que se proporciona en la presente, una molécula de polipéptido aislada que se proporciona en la presente, una TFP aislada que se proporciona en la presente, un complejo que se proporciona en la presente, un vector que se proporciona en la presente o una célula que se proporciona en la presente son para su uso como un medicamento.

En un aspecto, se proporciona en la presente un uso médico de tratamiento de un mamífero que tiene una enfermedad asociada con la expresión de CD19 o BCMA, que comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz de una molécula de TFP que se proporciona en la presente, una célula que se proporciona en la presente o una molécula de polipéptido que se proporciona en la presente, donde se liberan menos citoquinas en el mamífero en comparación con un mamífero al que se administra una cantidad eficaz de un linfocito T que exprese un receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CD19 o un CAR anti-BCMA.

Breve descripción de las figuras

Las características novedosas de la invención se establecen detalladamente en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención se puede obtener con referencia a la siguiente descripción detallada que establece modalidades ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y las figuras adjuntas en las cuales:

La FIGURA 1 es una ilustración esquemática que demuestra el uso de los polipéptidos de fusión del receptor de linfocitos T (TFP) de la invención. Un ejemplo de TFP contiene un scFv anti-CD19 y un polipéptido CD3 épsilon de longitud completa fusionados mediante una secuencia enlazadora (G4S)3. Cuando se produce o se introduce en un linfocito T, la TFP se asocia con otros polipéptidos del receptor de linfocitos T endógeno (TCR) (que se muestra que incluye dos polipéptidos CD3 épsilon, un polipéptido CD3 gamma, un polipéptido CD3 delta, dos polipéptidos CD3 zeta, una subunidad TCR alfa y una subunidad TCR beta, donde el segmento gris horizontal representa la membrana de plasma) para formar un TCR reprogramado en el cual uno o ambos polipéptidos endógenos CD3 épsilon se sustituyen por TFP.

La FIGURA 2A representa ilustraciones esquemáticas que demuestran ejemplos de variaciones de polipéptidos de fusión del receptor de linfocitos T reprogramados (TFP) de la invención.

La Figura 2A ilustra un ejemplo de TCR reprogramado que contiene una TFP que contiene un scFv anti-CD19 y un polipéptido Va de TCR de longitud completa fusionado mediante una secuencia enlazadora (G4S)3.

La FIGURA 2B ilustra una serie de ejemplos de TCR reprogramados que contienen múltiples TFP, inclusive i) un scFv anti-CD19 y un polipéptido Va de t Cr de longitud completa fusionados mediante una secuencia enlazadora (G4S)3 y ii) un scFv anti-CD19 y un polipéptido Vp de TCR de longitud completa fusionados mediante una secuencia enlazadora (G4S)3.

La FIGURA 2C ilustra un ejemplo de un TCR reprogramado que contiene múltiples TFP, inclusive i) un scFv anti-CD19 y un polipéptido de TCR truncado (A) fusionados mediante una secuencia enlazadora (G4S)3 y ii) un scFv anti-CDl9 y un polipéptido CD3 épsilon de longitud completa fusionados mediante una secuencia enlazadora (G4S)3. El polipéptido del TCR truncado (A) se encuentra truncado por la eliminación de Va.

La FIGURA 2D ilustra un ejemplo de un TCR reprogramado que contiene múltiples TFP, inclusive i) un scFv anti-CD19 y un polipéptido Va de TCR truncado (A) fusionados mediante una secuencia enlazadora (G4S)3 y ii) un scFv anti-CDl9 y un polipéptido Vp de TCR truncado (A) fusionados mediante una secuencia enlazadora (G4S)3. El polipéptido del TCR truncado (A) se encuentra truncado por la eliminación de Vp.

La FIGURA 3 es una ilustración esquemática que demuestra el uso de los polipéptidos de fusión del receptor de linfocitos T (TFP) de la invención. Un ejemplo de TFP contiene un dominio V^hanti-CD19 y un polipéptido CD3 épsilon de longitud completa fusionados mediante una secuencia enlazadora (G4S)3. Cuando se produce mediante un linfocito T o se introduce en un linfocito T, la TFP se asocia con otros polipéptidos del receptor de linfocitos T endógeno (TCR) (que se muestra que incluye dos polipéptidos CD3 épsilon, un polipéptido CD3 gamma, un polipéptido CD3 delta, dos polipéptidos CD3 zeta, una subunidad TCR alfa y una subunidad TCR beta, donde el segmento gris horizontal representa la membrana plasmática) para formar un TCR reprogramado en el cual uno o ambos polipéptidos endógenos CD3 épsilon se sustituyen por TFP.

La FIGURA 4 es una serie de ilustraciones esquemáticas que demuestran construcciones de ADN que codifican diversas TFP.

La FIGURA 5 es un ejemplo de una gráfica de barras que ilustra la expresión superficial de TFP anti-CD19 LL (enlazador largo) en los linfocitos T después de la transducción lentiviral. Los linfocitos T efectores fueron no transducidos o transducidos con CAR anti-CD19-28Z o las construcciones TFP anti-CD19 LL indicadas. Después de expandirse durante 10 días en IL-2, se determinó su expresión superficial de la construcción CAR o TFP adecuada mediante citometría de flujo.

La FIGURA 6 es una gráfica de barras de ejemplo que ilustra la expresión superficial de TFP anti-CD19 SL (enlazador corto) en linfocitos T después de la transducción lentiviral. Los linfocitos T efectores fueron no transducidos o transducidos con CAR anti-CD19-28 Z o las construcciones TFP anti-CD19 SL indicadas. Después de expandirse durante 7 días en IL-2, se determinó su expresión superficial de la construcción CAR o TFP adecuada mediante citometría de flujo.

La FIGURA 7 es una gráfica de barras de ejemplo que ilustra la expresión superficial de TFP anti-BCMA en linfocitos T después de la transducción lentiviral. Los linfocitos T efectores fueron no transducidos o transducidos con construcciones TFP anti-BCMA-CD3£ o anti-BCMA-CD3Y. Después de expandirse durante 10 días en IL-2, se determinó su expresión superficial de TFP mediante citometría de flujo.

La FIGURA 8 es un ejemplo de gráfica de barras que ilustra la eliminación de las células diana Raji que expresan CD19 mediante TFP anti-CD19 LL. Los linfocitos T efectores transducidos se expandieron durante 14 días antes de la incubación durante 18 horas con células diana Raji 1x104 a proporciones de E:T de 20:1, 10:1 o 5:1. El porcentaje de citotoxicidad se determinó en un ensayo de citotoxicidad por citometría de flujo.

La FIGURA 9 es un ejemplo de gráfica de barras que ilustra la eliminación de células diana RPMI8226 que expresan BCMA mediante TFP anti-BCMA. Los linfocitos T efectores transducidos se expandieron durante 12 días antes de la incubación durante 4 horas con células diana RPMI8226 1x104 a proporciones de E:T de 10:1 o 5:1. El porcentaje de citotoxicidad se determinó en un ensayo de citotoxicidad por citometría de flujo.

La FIGURA 10A es un ejemplo de gráfica que ilustra la eliminación de células diana HeLa transducidas con CD19 mediante una construcción CAR anti-CD19-28Z con el transcurso del tiempo. Se expandieron los linfocitos T efectores transducidos durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa transducidas con CD19. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad, en un ensayo RTCA.

La FIGURA 10B es una gráfica de ejemplo que ilustra la eliminación de células diana HeLa transducidas con CD19 mediante una construcción TFP anti-CD19-CD3£ LL en el transcurso del tiempo. Se expandieron los linfocitos T efectores transducidos durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa transducidas con CD19. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad, en un ensayo RTCA.

La FIGURA 10C es una gráfica de ejemplo que ilustra la eliminación de células diana HeLa transducidas con CD19 mediante una construcción TFP anti-CD19-CD3Y LL en el transcurso del tiempo. Se expandieron los linfocitos T efectores transducidos durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa transducidas con CD19. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad, en un ensayo RTCA.

La FIGURA 10D es una gráfica de ejemplo que ilustra la eliminación de células diana HeLa transducidas con CD19 mediante una construcción TFP anti-CD19-TCRac LL en el transcurso del tiempo. Se expandieron los linfocitos T efectores transducidos durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa transducidas con CD19. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad, en un ensayo RTCA.

La FIGURA 10E es una gráfica de ejemplo que ilustra la eliminación de células diana HeLa transducidas con CD19 mediante una construcción TFP anti-CD19-TCRpc LL en el transcurso del tiempo. Se expandieron los linfocitos T efectores transducidos durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa transducidas con CD19. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad, en un ensayo RTCA.

La FIGURA 10F es una gráfica de ejemplo que ilustra la eliminación de células diana HeLa transducidas con CD19 mediante una construcción TFP anti-CD19-TCRa LL en el transcurso del tiempo. Se expandieron los linfocitos T efectores transducidos durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa transducidas con CD19. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad, en un ensayo RTCA.

La FIGURA 10G es una gráfica de ejemplo que ilustra la eliminación de células diana HeLa transducidas con CD19 mediante una construcción TFP anti-CD19-TCRp LL en el transcurso del tiempo. Se expandieron los linfocitos T efectores transducidos durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa transducidas con CD19. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad, en un ensayo RTCA.

La FIGURA 11 es un ejemplo de gráfica que ilustra la eliminación de células diana HeLa transducidas con CD19 mediante TFP anti-CD19. Se expandieron los linfocitos T efectores transducidos durante 7 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa transducidas con CD19. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad, en un ensayo RTCA.

La FIGURA 12 es un ejemplo de gráfica que ilustra la eliminación de células diana HeLa transducidas con BCMA mediante TFP anti-BCMA en el transcurso del tiempo. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos o transducidos con TFP anti-BCMA-CD3£ o anti-BCMA-CD3Y se expandieron durante 7 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa o HeLa-BCMA. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad, en un ensayo RTCA.

La FIGURA 13 es un ejemplo de gráfica que ilustra la actividad de eliminación de los linfocitos T transducidos con diversas cantidades de lentivirus que codifica TFP anti-CD19-CD3£ LL en el transcurso del tiempo. Los linfocitos T transducidos con la MOI indicada de lentivirus que codifica TFP anti-CD19-CD3£ LL se expandieron durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa transducidas con CD19. Se determinó el índice celular, que indica la citotoxicidad.

La FIGURA 14 es un ejemplo de gráfica que ilustra la actividad de eliminación de linfocitos T transfectados por electroporación con ARMn transcrito in vitro (IVT) que codifica TRuC anti-CD19-CD3£ SL o anti-CD19-CD3Y SL. Se transfectaron los linfocitos T efectores mediante electroporación de PBMC activadas con ARNm transcrito in vitro (IVT) que codifica el control GFP, TRuC anti-CD19-CD3£ SL o anti-CD19-CD3Y SL. Después de la expansión durante 3 días, se incubaron los efectores durante 4 horas con 1x104 células Raji o células K562 a proporciones E:T de 10:1. El porcentaje de citotoxicidad se determinó en un ensayo de citotoxicidad por citometría de flujo.

La FIGURA 15A es un ejemplo de gráfica que ilustra la liberación de IL-2 por parte de los linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19 LL como respuesta a las células diana que portan CD19. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos, fueron transducidos con CAR de control, un CAR anti-CD19-28Z o la TFP anti-CD19 LL indicada se expandieron durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana Raji o K562. Se determinaron los niveles de IL-2 mediante ELISA.

La FIGURA 15B es un ejemplo de gráfica que ilustra la liberación de IFN-y por parte de los linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19 LL como respuesta a las células diana que portan CD19. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos, fueron transducidos con CAR de control, un CAR anti-CD19-28Z o la TFP anti-CD19 LL indicada se expandieron durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana Raji o K562. Se determinaron los niveles de IFN-^ymediante ELISA.

La FIGURA 15C es un ejemplo de gráfica que ilustra la liberación de IL-2 por parte de los linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19 LL como respuesta a las células diana que portan CD19. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos, fueron transducidos con CAR de control, un CAR anti-CD19-28Z o la TFP anti-CD19 LL indicada se expandieron durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa o CD19-HeLa. Se determinaron los niveles de IL-2 mediante ELISA.

La FIGURA 15D es un ejemplo de gráfica que ilustra la liberación de IFN-^ypor parte de los linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19 LL como respuesta a las células diana que portan CD19. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos, fueron transducidos con CAR de control, un CAR anti-CD19-28Z o la TFP anti-CD19 LL indicada se expandieron durante 14 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa o CD19-HeLa. Se determinaron los niveles de IFN-y mediante ELISA.

La FIGURA 16 es un ejemplo de gráfica que ilustra la liberación de IFN-^ypor parte de los linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19 como respuesta a las células diana que portan c D19. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos o que fueron transducidos con la TFP anti-CD19 indicada se expandieron durante 7 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa o CD19-HeLa. Se determinaron los niveles de IFN-^ymediante ELISA.

La FIGURA 17A es un ejemplo de gráfica que ilustra la liberación de IL-2 por parte de los linfocitos T transducidos con TFP anti-BCMA como respuesta a las células diana que portan BCMA. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos o transducidos con TFP anti-BCMA-CD3£ o anti-BCMA-CD3Y se expandieron durante 7 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa o HeLa-BCMA. Se determinó la producción de IL-2 mediante 2 plex Luminex.

La FIGURA 17B es un ejemplo de gráfica que ilustra la liberación de IFN-y por parte de los linfocitos T transducidos con TFP anti-BCMA como respuesta a las células diana que portan BCMA. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos o transducidos con TFP anti-BCMA-CD3£ o anti-BCMA-CD3Y se expandieron durante 7 días antes de la incubación con 1x104 células diana HeLa o HeLa-BCMA. Se determinó la producción de IFN-y mediante 2 plex Luminex.

La FIGURA 18 es un ejemplo de gráfica que ilustra la desgranulación de los linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19 como respuesta a las células diana que portan CD19. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos o que fueron transducidos con CAR anti-CD19-28Z, TFP anti-BCMA-CD3£ LL o TFP anti-BCMA-CD3^yLL se expandieron durante 14 días antes de la incubación con 1x104 de las células diana CD19 positivas o CD19 negativas que se indicaron. Se determinó el porcentaje de células CD107+ en la selección CD3+CD8+. Se cultivaron en conjunto las células diana y las efectoras en presencia de un anticuerpo anti-CD107a marcado de forma fluorescente. Después se determinó el porcentaje de linfocitos T dentro de las selecciones CD3 y CD4/CD8 que se tiñeron de manera positiva para CD107a de superficie celular mediante citometría de flujo. La FIGURA 19 es un ejemplo de gráfica que ilustra la desgranulación de los linfocitos T transducidos con TFP anti-BCMA como respuesta a las células diana que portan BCMA. Los linfocitos T efectores que no fueron transducidos o que fueron transducidos con 50 MOI de TFP anti-BCMA-CD3£ o anti-BCMA-CD3Y se expandieron durante 13 días antes de la incubación con 1x104 de las células diana RPMI8226 BCMA positivas indicadas. Se determinó el porcentaje de células CD107+ en la selección CD3+CD8+.

La FIGURA 20A ilustra ejemplos de gráficas de la eficacia in-vivo de los linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19 LL en modelos de xenoinjertos de leucemia humana diseminados. Se expuso a ratones NSG de forma intravenosa con 5 x105 células Raji tres días antes de la transferencia adoptiva de 5x106 linfocitos T que no fueron transducidos o que fueron transducidos con CAR anti-CD19-28^, TFP anti-CD19-CD3£ LL o TFP anti-CD19-CD3Y LL.

La FIGURA 20B ilustra ejemplos de gráficas de la eficacia in-vivo de los linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19 LL en modelos de xenoinjertos de leucemia humana diseminados. Se expuso a ratones NSG de forma intravenosa con 1x106 células Nalm-6 (derecha) tres días antes de la transferencia adoptiva de 5x106 linfocitos T que no fueron transducidos o que fueron transducidos con CAR anti-CD19-28^, TFP anti-CD19-CD3£ LL o TFP anti-CD19-CD3Y LL. La comparación de las curvas de supervivencia mediante ensayo de rango logarítmico (Mantel-Cox) demostró un p = 0,0001 (Grupo 4 en oposición a 1, 2, 3), p = 0,0001 (Grupo 1 en oposición a 2, 3) y p = 0,0004 (Grupo 2 en oposición a 3). La comparación de las curvas de supervivencia mediante ensayo de Gehan-Breslow-Wilcoxon demostró un p = 0,0001 (Grupo 4 en oposición a 1, 2, 3), p = 0,0001 (Grupo 1 en oposición a 2, 3) y p = 0,0005 (Grupo 2 en oposición a 3).

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, se describen en la presente moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP) que comprende una subunidad de TCR y un dominio de anticuerpo humano o humanizado que comprende un dominio de unión anti-CD19. En algunas modalidades, la subunidad de TCR comprende un dominio extracelular de TCR. En otras modalidades, la subunidad de TCR comprende un dominio transmembrana de TCR. En aun otras modalidades, la subunidad de TCR comprende un dominio intracelular de TCR. En modalidades adicionales, la subunidad de TCR comprende (i) un dominio extracelular de TCR, (ii) un dominio transmembrana de TCR y (iii) un dominio intracelular de TCR, donde al menos dos de (i), (ii) y (iii) son de la misma subunidad de TCR. En más modalidades adicionales, la subunidad de TCR comprende un dominio intracelular de TCR que comprende un dominio estimulador que se selecciona de un dominio de señalización intracelular de CD3 épsilon, CD3 gamma o CD3 delta, o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos una, dos o tres modificaciones en esta. En más modalidades adicionales, la subunidad de TCR comprende un dominio intracelular que comprende un dominio estimulador que se selecciona de un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones en esta.

En algunas modalidades, el dominio de anticuerpo humano o humanizado comprende un fragmento de anticuerpo. En algunas modalidades, el dominio de anticuerpo humano o humanizado comprende un scFv o un dominio V^h. En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico aisladas comprenden (i) una cadena ligera (LC) CDR1, LC CDR2 y LC CDR3 de cualquier secuencia de aminoácidos de dominio de unión de cadena ligera anti-CD19 que se proporcione en la presente, y/o (ii) una cadena pesada (HC) CDR1, HC CDR2 y HC CDR3 de cualquier secuencia de aminoácidos de dominio de unión de cadena pesada anti-CD19 que se proporcione en la presente.

En algunas modalidades, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la presente, o una secuencia con 95-99 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos que se proporciona en la presente. En otras modalidades, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en la presente, o una secuencia con 95-99 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos que se proporciona en la presente.

En algunas modalidades, la TFP incluye un dominio extracelular de una subunidad de TCR que comprende un dominio extracelular, o una parte de este, de una proteína, que se selecciona del grupo que consiste en la cadena alfa o beta del receptor de linfocitos T, CD3 delta, CD3 épsilon o CD3 gamma, o un fragmento funcional de estas, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones en estas. En otras modalidades, la TFP codificada incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en la cadena alfa y beta del TCR o subunidades de TCR CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta, o un fragmento funcional de estas, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones en estas.

En algunas modalidades, la TFP codificada incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del TCR o CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154, o un fragmento funcional de estos, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones en esta.

En algunas modalidades, el dominio de unión al antígeno anti-CD19 codificado se conecta al dominio extracelular del TCR mediante una secuencia enlazadora. En algunos casos, la secuencia enlazadora codificada comprende (G4S)n, donde n=1 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora codificada comprende una secuencia enlazadora larga (LL, por sus siglas en inglés). En algunos casos, la secuencia enlazadora larga codificada comprende (G4S)n, donde n=2 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora codificada comprende una secuencia enlazadora corta (SL, por sus siglas en inglés). En algunos casos, la secuencia enlazadora corta codificada comprende (G4S)n, donde n=1 a 3.

En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico aisladas comprenden además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En algunos casos, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional obtenido de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137), o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones en esta.

En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico aisladas comprenden además una secuencia líder.

También se proporcionan en la presente moléculas de polipéptidos aisladas, codificadas por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente.

También se proporcionan en la presente, en otro aspecto, moléculas aisladas de proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TFP) que comprenden un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. En algunas modalidades, las moléculas de TFP aisladas comprenden un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, que comprende un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. En algunas modalidades, el dominio de unión anti-CD19 es un dominio scFv o uno V^h. En otras modalidades, el dominio de unión anti-CD19 comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos que se proporciona en la presente, o un fragmento funcional de esta, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la presente, o una secuencia con 95-99 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos que se proporciona en la presente.

En algunas modalidades, las moléculas de TFP aisladas comprenden un dominio extracelular de TCR que comprende un dominio extracelular, o una parte de este, de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en la cadena alfa o beta del receptor de linfocitos T, CD3 delta, CD3 épsilon o CD3 gamma, o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones en esta. En algunas modalidades, el dominio de unión anti-CD19 se conecta al dominio extracelular de TCR mediante una secuencia enlazadora. En algunos casos, la región enlazadora comprende (G4S)n, donde n=1 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora larga (LL). En algunos casos, la secuencia enlazadora larga comprende (G4S)n, donde n=2 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora corta (SL). En algunos casos, la secuencia enlazadora corta comprende (G4S)n, donde n=1 a 3.

En algunas modalidades, las moléculas de TFP aisladas comprenden además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En otras modalidades, las moléculas de TFP aisladas comprenden además una secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular. En aun otras modalidades, las moléculas de TFP aisladas comprenden además una secuencia líder.

También se proporcionan en la presente vectores que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de las moléculas de TFP mencionadas anteriormente. En algunas modalidades, el vector se selecciona del grupo que consiste en un ADN, un ARN, un plásmido, un vector de lentivirus, un vector adenovírico o un vector de retrovirus. En algunas modalidades, el vector comprende además un promotor. En algunas modalidades, el vector es un vector transcrito in vitro. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una cola de poli(A). En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una UTR 3'.

También se proporcionan en la presente células que comprenden cualquiera de los vectores descritos. En algunas modalidades, la célula es un linfocito T humano. En algunas modalidades, la célula es un linfocito T CD8+ o CD4+. En otras modalidades, las células comprenden además un ácido nucleico que codifica una molécula inhibidora que comprende un primer polipéptido que comprende al menos una parte de una molécula inhibidora, que se asocia con un segundo polipéptido que comprende una señal positiva de un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, la molécula inhibidora comprende un primer polipéptido que comprende al menos una parte de PD1 y un segundo polipéptido que comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primario.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente moléculas de TFP aisladas que comprenden un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, donde la molécula de TFP es capaz de interactuar de forma funcional con un complejo endógeno de TCR y/o al menos un polipéptido endógeno de TCR.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente moléculas de TFP aisladas que comprenden un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, donde la molécula de TFP es capaz de integrarse de forma funcional al complejo endógeno de TCR

En otro aspecto, se proporcionan en la presente linfocitos T CD8+ o CD4+ humanos que comprenden al menos dos moléculas de TFP, donde las moléculas de TFP comprenden un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular, donde la molécula de TFP es capaz de interactuar de forma funcional con un complejo endógeno de TCR y/o al menos un polipéptido endógeno de TCR dentro, en y/o sobre la superficie del linfocito T CD8+ o CD4+ humano.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente complejos de proteínas que comprenden i) una molécula de TFP que comprende un dominio de unión anti-CD19 humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular; y ii) al menos un complejo endógeno de TCR.

En algunas modalidades, el TCR comprende un dominio extracelular, o parte de este, de una proteína que se selecciona del grupo que consiste en la cadena alfa o beta del receptor de linfocitos T, CD3 delta, CD3 épsilon o CD3 gamma. En algunas modalidades, el dominio de unión anti-CD19 se conecta al dominio extracelular de TCR mediante una secuencia enlazadora. En algunos casos, la región enlazadora comprende (G4S)n, donde n=1 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora larga (LL). En algunos casos, la secuencia enlazadora larga comprende (G4S)n, donde n=2 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora corta (SL). En algunos casos, la secuencia enlazadora corta comprende (G4S)n, donde n=1 a 3.

También se proporcionan en la presente linfocitos T humanos CD8+ o CD4+ que comprenden al menos dos proteínas de TFP diferentes por cada uno de cualquiera de los complejos de proteínas descritos.

En otro aspecto, se proporciona en la presente una población de linfocitos T humanos CD8+ o CD4+, donde los linfocitos T de la población comprenden, de forma individual o conjunta, al menos dos moléculas de TFP, donde las moléculas de TFP comprenden un dominio de unión anti-CD19 o anti-BCMA, humano o humanizado, un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana y un dominio intracelular, donde la molécula de TFP es capaz de interactuar de forma funcional con un complejo endógeno de TCR y/o al menos un polipéptido endógeno de TCR dentro, en y/o sobre la superficie del linfocito T humano CD8+ o CD4+.

En otro aspecto, se proporciona en la presente una población de linfocitos T humanos CD8+ o CD4+, donde los linfocitos T de la población comprenden, de forma individual o conjunta, al menos dos moléculas de TFP codificadas por una molécula de ácido nucleico aislada proporcionada en la presente.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente métodos para crear una célula que comprenden la transducción de un linfocito T con cualquiera de los vectores descritos.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente métodos para generar una población de células con modificación de ARN que comprenden la introducción de un ARN transcrito in vitro o ARN sintético en una célula, donde el ARN comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de las moléculas de TFP descritas.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente usos médicos para proporcionar una inmunidad antitumoral en un mamífero que comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz de una célula que exprese cualquiera de las moléculas de TFP descritas. En algunas modalidades, la célula es un linfocito T autólogo. En algunas modalidades, la célula es un linfocito T alogénico. En algunas modalidades, el mamífero es un ser humano. En otro aspecto, se proporcionan en la presente usos médicos para el tratamiento de un mamífero que padece una enfermedad asociada con la expresión de CD19, que comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz del linfocito que comprende cualquiera de las moléculas de TFP descritas. En algunas modalidades, la enfermedad asociada con la expresión de CD19 se selecciona de una enfermedad proliferativa, tal como un cáncer o una neoplasia o una afección precancerosa, tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia, o es un síntoma no relacionado con el cáncer asociado con la expresión de CD19. En algunas modalidades, la enfermedad es un cáncer hematológico que se selecciona del grupo que consiste en una o más de leucemias agudas, inclusive, de modo no taxativo, leucemia linfoide aguda de linfocitos B («LLA B»), leucemia linfoide aguda de linfocitos T («LLA T»), leucemia linfoblástica aguda (LLA); una o más leucemias crónicas, inclusive, de modo no taxativo, leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC); cánceres hematológicos o afecciones hematológicas adicionales, inclusive, de modo no taxativo, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom y «preleucemia», que son un conjunto diverso de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de las células sanguíneas mieloides, y enfermedades asociadas con la expresión de CD19, que incluyen, de modo no taxativo, cánceres, neoplasias, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas atípicas y/o no clásicas que expresen CD19; y combinaciones de estas.

En algunas modalidades, las células que expresan cualquiera de las moléculas de TFP descritas se administran combinadas con un agente que mejora uno o más efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa una molécula de TFP. En algunas modalidades, las células que expresan cualquiera de las moléculas de TFP descritas se administran combinadas con un agente que trata la enfermedad asociada con CD19.

También se proporcionan en la presente cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas, cualquiera de las moléculas de polipéptidos aisladas descritas, cualquiera de las TFP aisladas descritas, cualquiera de los complejos de proteínas descritos, cualquiera de los vectores descritos o cualquiera de las células descritas para su uso como un medicamento.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que les otorga comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención.

Los artículos «un» y «uno» hacen referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, «un elemento» hace referencia a un elemento o más de un elemento.

Tal como se utiliza en la presente, «aproximadamente» puede significar más o menos de 1 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, o más de 30 por ciento, según la situación y si el experto en la técnica lo sabe o lo puede saber.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, «sujeto» o «sujetos» o «individuos» puede incluir, de modo no taxativo, mamíferos, tales como seres humanos o mamíferos no humanos, por ejemplo, animales domesticados, para la agricultura o salvajes, así como aves y animales acuáticos. «Pacientes» son sujetos que padecen o corren riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección u otros, que necesiten las composiciones y usos médicos que se proporcionan en la presente.

Tal como se utiliza en la presente, «tratar» o «tratamiento» hace referencia a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o la mejora de una enfermedad o afección. Tratar puede incluir, por ejemplo, reducir, retrasar o aliviar la gravedad de uno o más síntomas de la enfermedad o afección, o puede incluir la reducción de la frecuencia con la cual un paciente experimenta los síntomas de una enfermedad, defecto, trastorno o afección adversa, y similares. Tal como se utiliza en la presente, «tratar o prevenir» se utiliza a veces en la presente para hacer referencia a un uso médico que produce algún nivel de tratamiento o mejora de la enfermedad o afección, y contempla un intervalo de resultados orientados a ese fin, inclusive, de modo no taxativo, la prevención de una afección en su totalidad. Tal como se utiliza en la presente, «prevenir» hace referencia a la prevención de la enfermedad o afección, por ejemplo, la formación de tumores, en el paciente. Por ejemplo, si un individuo en riesgo de desarrollar un tumor u otra forma de cáncer es tratado con los usos médicos de la presente invención y no desarrolla después el tumor u otra forma de cáncer, entonces se ha prevenido la enfermedad, al menos durante un período de tiempo, en ese individuo.

Tal como se utiliza en la presente, una «cantidad terapéuticamente eficaz» es la cantidad de una composición, o un componente activo de esta, suficiente para proporcionar un efecto beneficioso o para reducir de otro modo un evento perjudicial al individuo a quien se le administra la composición. En la presente, «dosis terapéuticamente eficaz» significa una dosis que produce uno o más efectos deseados o deseables (por ejemplo, beneficiosos) para los cuales se administra, donde tal administración se da una o más veces durante un período de tiempo determinado. La dosis exacta dependerá del fin del tratamiento y un experto en la técnica podrá verificarla utilizando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); y Pickar, Dosage Calculations (1999))

Tal como se utiliza en la presente, una «proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR)» o «TFP» incluye un polipéptido recombinante derivado de diversos polipéptidos que comprenden el TCR, que en general es capaz de i) unirse a un antígeno de superficie en las células diana y ii) interactuar con otros componentes de polipéptidos del complejo intacto de TCR, normalmente cuando se coubica en o sobre la superficie de un linfocito T.

Tal como se utiliza en la presente, el término «CD19» hace referencia a la proteína del grupo de diferenciación 19, que es un determinante antigénico que se puede detectar en células precursoras de leucemia de linfocitos B, otros linfocitos B malignos y la mayoría de las células del linaje de linfocitos B normales. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos humanos y murinos se pueden encontrar en bases de datos públicas, tal como GenBank, UniProt y Swiss-Prot. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de CD19 humano se puede encontrar como el n.° de registro de UniProt/Swiss-Prot P15391. La secuencia canónica de polipéptido CD19 humano es el n.° de registro de UniProt P15391 (o P15391-1):

MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPL AIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMS PKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLE LKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLC SLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNP SSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFS NAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYE NMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR (SEQ ID NO: 1).

La secuencia de nucleótidos que codifica el CD19 humano se puede encontrar con el n.° de registro NM001178098. CD19 se expresa en la mayoría de los cánceres de linaje B, inclusive, por ejemplo, LLA, LLC y linterna no Hodgkin (LNH). Se proporcionan más adelante otras células que expresan CD19 en la definición de «enfermedad asociada con la expresión de CD19». También constituye un marcador preliminar de progenitoras de linfocitos B normales. Véase, por ejemplo, Nicholson et ál. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). En un ejemplo, la parte de unión al antígeno de TFP reconoce y se une a un epítopo dentro del dominio extracelular de la proteína de CD19 tal como se expresa en linfocitos B malignos y normales.

Tal como se utiliza en la presente, el término «BCMA» hace referencia al antígeno de maduración de linfocitos B, también conocido como el miembro 17 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF17, por sus siglas en inglés) y la proteína del grupo de diferenciación 269 (CD269) es una proteína que en los seres humanos se codifica mediante el gen de TNFRSF17. TNFRSF17 es un receptor de superficie celular de la superfamilia del receptor de TNF que reconoce el factor de activación de los linfocitos B (BAFF, por sus siglas en inglés) (véase, por ejemplo, Laabi et ál., EMBO 11 (11): 3897-904 (1992). Este receptor se expresa en linfocitos B maduros y puede ser importante para el desarrollo de los linfocitos B y la respuesta autoinmune. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos humanos y murinos se pueden encontrar en bases de datos públicas, tal como GenBank, UniProt y Swiss-Prot. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de BCMA humano se puede encontrar como el n.° de registro de UniProt/Swiss-Prot Q02223. La secuencia canónica de polipéptido BCMA humano es el n.° de registro de UniProt Q02223 (o Q02223-1):

MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRK INSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTT KTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR (SEQ ID NO: 2).

La secuencia de nucleótidos que codifica el BCMA humano se puede encontrar en el n.° de registro NM001192. BCMA se expresa en la mayoría de los cánceres de linaje B, inclusive, por ejemplo, leucemia, linfomas y mieloma múltiple. Se proporcionan más adelante otras células que expresan BCMA en la definición de «enfermedad asociada con la expresión de BCMA». Este receptor ha demostrado que se une específicamente al miembro 13b de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando) (TNFSF13B/TALL-1/BAFF) y que conduce a la activación de NF-kappaB y MAPK8/JNK. Este receptor también se une a diversos miembros de la familia TRAF y por tanto puede transducir señales para la supervivencia y la proliferación celular (véase, por ejemplo, Laabi et ál., Nucleic Acids Research 22 (7): 1147-54 (1994). En un ejemplo, la parte de unión al antígeno de TFP reconoce y se une a un epítopo dentro del dominio extracelular de la proteína de BCMA tal como se expresa en linfocitos B malignos y normales.

El término «anticuerpo», tal como se utiliza en la presente, hace referencia a secuencias de proteína o de polipéptido derivadas de una molécula de inmunoglobulina, que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas de origen policlonal o monoclonal, o fragmentos de estos, y se pueden derivar de fuentes naturales o recombinantes.

Las expresiones «fragmento de anticuerpo» o «dominio de unión al anticuerpo» hacen referencia a al menos una parte de un anticuerpo, o variantes recombinantes de estos, que contiene el dominio de unión al antígeno, es decir, una región variable determinante antigénica de un anticuerpo intacto, que sea suficiente para conferir reconocimiento y unión específica del fragmento de anticuerpo a una diana, tal como un antígeno y su epítopo definido. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, de modo no taxativo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')², y Fv, fragmentos de anticuerpo de cadena simple (sc)Fv («scFv»), anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio simple tales como sdAb (ya sea V^lo V^h), dominios de camélidos V^hhy anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término «scFv» hace referencia a una proteína de fusión que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, donde las regiones variables de cadena ligera y pesada se unen de forma contigua mediante un enlazador polipeptídico corto flexible, y capaz de expresarse como una cadena polipeptídica simple, y donde scFv conserva la especificidad del anticuerpo intacto del cual deriva.

«Región variable de cadena pesada» o «V^h» con respecto a un anticuerpo hacen referencia al fragmento de la cadena pesada que contiene tres CDR interpuestas entre las extensiones flanqueantes conocidas como regiones marco, donde estas regiones marco por lo general se conservan mejor que las CDR y forman una estructura que da soporte a las CDR.

A menos que se especifique, tal como se utiliza en la presente un scFv puede tener las regiones variables V^ly V^hen cualquier orden, por ejemplo, con respecto a los extremos terminales N y C del polipéptido, el scFv puede comprender V^L-enlazador-V^Ho puede comprender V^H-enlazador-V^L.

La parte de la composición de TFP de la invención que comprende un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo de este, puede existir en una diversidad de formas donde el dominio de unión al antígeno se expresa como parte de una cadena de polipéptidos contigua que incluye, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio simple (sdAb), un anticuerpo de cadena simple (scFv) derivado de un anticuerpo murino, humanizado o humano (Harlow et ál., 1999, en: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; Harlow et ál., 1989, en: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et ál., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et ál., 1988, Science 242:423-426). En un aspecto, el dominio de unión al antígeno de una composición de TFP de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, la TFP comprende un fragmento de anticuerpo que comprende un scFv o un sdAb.

La expresión «cadena pesada de anticuerpo», hace referencia a la más grande de dos tipos de cadenas de polipéptidos presentes en las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones naturales y que determina normalmente la clase a la cual pertenece el anticuerpo.

La expresión «cadena ligera de anticuerpo» hace referencia a la más pequeña de dos tipos de cadenas de polipéptidos presentes en las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones naturales. Las cadenas ligeras kappa («k») y lambda («A») hacen referencia a los dos isotipos principales de cadena ligera de anticuerpo.

La expresión «anticuerpo recombinante» hace referencia a un anticuerpo que se genera utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un sistema de expresión de bacteriófagos o levaduras. También debe interpretarse que la expresión significa un anticuerpo que se generó mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, donde el ADN o la secuencia de aminoácidos se obtuvo utilizando tecnología de ADN recombinante o de secuencia de aminoácidos que se encuentra disponible y es conocida en la técnica.

El término «antígeno» o «Ag» hace referencia a una molécula que es capaz de unirse específicamente mediante un anticuerpo o que provoca de otro modo una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar ya sea la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto en la técnica comprenderá que cualquier macromolécula, inclusive prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos se pueden derivar de ADN recombinante o genómico. Un experto en la técnica comprenderá que cualquier ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia parcial de nucleótidos que codifica una proteína que provoca una respuesta inmunitaria codifica por tanto un «antígeno», tal como se utiliza tal término en la presente. Además, el experto en la técnica comprenderá que un antígeno no necesita estar codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Resulta muy evidente que la presente invención incluye, de modo no taxativo, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos se disponen en diversas combinaciones para codificar los polipéptidos que provocan la respuesta inmunitaria deseada. Además, un experto en la técnica comprenderá que un antígeno no necesita ser codificado por un «gen» en absoluto. Resulta evidente que se puede generar un antígeno sintetizado o se puede derivar de una muestra biológica o puede ser una macromolécula además de un polipéptido. Tal muestra biológica puede incluir, de modo no taxativo, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido con otros componentes biológicos.

La expresión «efecto antitumoral» hace referencia a un efecto biológico que se puede manifestar mediante diversos medios, inclusive, de modo no taxativo, por ejemplo, una disminución en el volumen tumoral, una disminución en la cantidad de células tumorales, una disminución en la cantidad de metástasis, un aumento en la expectativa de vida, una disminución en la proliferación de células tumorales, una disminución en la supervivencia de las células tumorales o una mejora de los diversos síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un «efecto antitumoral» también se puede manifestar mediante la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la invención en la prevención de la aparición de tumores en primer lugar.

El término «autólogo» hace referencia a cualquier material derivado del mismo individuo al cual se volverá a introducir después.

El término «alogénico» hace referencia a cualquier material derivado de un animal diferente de la misma especie o diferente paciente que el individuo al cual se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más locus no son idénticos. En algunos aspectos, el material alogénico de los individuos de la misma especie puede ser suficientemente diferente genéticamente para interactuar de forma antigénica.

El término «xenogénico» hace referencia a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

La expresión «cáncer» hace referencia a una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido y descontrolado de células anómalas. Las células cancerosas pueden extenderse de forma local o mediante el flujo sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Se describen ejemplos de diversos cánceres en la presente e incluyen, de modo no taxativo, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer cerebral, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares.

Las frases «enfermedad asociada con la expresión de CD19» y «enfermedad asociada con la expresión de BCMA» incluyen, de modo no taxativo, una enfermedad que se asocia con la expresión de CD19 o BCMA o una afección asociada con células que expresan CD19 o BCMA, inclusive, por ejemplo, enfermedades proliferativas tales como un cáncer o neoplasia o una afección precancerosa, tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia; o un síntoma no relacionado con cáncer asociado con las células que expresan CD19 o BCMA. En un aspecto, un cáncer asociado con la expresión de CD19 o BCMA es un cáncer hematológico. En un aspecto, el cáncer hematológico es una leucemia o un linfoma. En un aspecto, un cáncer asociado con la expresión de CD19 o BCMA incluye cánceres y neoplasias, inclusive, de modo no taxativo, por ejemplo, una o más leucemias agudas que incluyen de modo no taxativo, por ejemplo, LLA de linfocitos B, leucemia linfoide aguda de linfocitos T (LLA T), una o más leucemias crónicas, inclusive por ejemplo, de modo no taxativo, LLC o leucemia mielógena crónica (LMC). Los cánceres adicionales o afecciones hematológicas que se asocian con la expresión de CD19 comprenden, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, linfoma de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom y «preleucemia», que son un conjunto diverso de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides, y similares. Enfermedades adicionales asociadas con la expresión de CD19 o la expresión de BCMA incluyen, de modo no taxativo, por ejemplo, cánceres, neoplasias, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas atípicas y/o no clásicas asociadas con la expresión de CD19 o BCMA. Los síntomas no relacionados con cáncer asociados con la expresión de CD19 o BCMA incluyen por ejemplo, de modo no taxativo, enfermedades autoinmunes, (por ejemplo, lupus, artritis reumatoide, colitis), trastornos inflamatorios (alergia y asma) y trasplantes.

La expresión «modificaciones de secuencia conservadoras» hace referencia a las modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. Es posible introducir modificaciones en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas en las que el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se definen las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de una TFP de la invención puede remplazarse con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y se puede analizar la TFP alterada utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.

El término «estimulación» hace referencia a una respuesta primaria inducida por la unión de un dominio estimulador o una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando afín, lo que de este modo media un evento de transducción de señal, tal como, de modo no taxativo, la transducción de señales mediante el complejo TCR/CD3. La estimulación puede mediar la expresión alterada de determinadas moléculas y/o la reorganización de las estructuras citoesqueléticas y similares.

Las expresiones «molécula estimuladora» o «dominio estimulador» hacen referencia a una molécula, o una parte de esta, expresada por un linfocito T que proporciona la o las secuencias de señalización citoplasmática primaria que regulan la activación primaria del complejo TCR de un modo estimulador para al menos algunos aspectos de la vía de señalización de linfocitos T. En un aspecto, la señal primaria se inicia mediante, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptidos y que conduce a la mediación de una respuesta de los linfocitos T, inclusive, de modo no taxativo, la proliferación, la activación, la diferenciación y similares. Una secuencia de señalización citoplasmática primaria (a la que también se hace referencia como «dominio de señalización primaria») que actúa de una forma estimuladora puede contener un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina o «ITAM». Los ejemplos de un ITAM que contiene la secuencia de señalización citoplasmática primaria que resulta particularmente útil en la invención incluye, de modo no taxativo, aquellas derivadas de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como «ICOS») y CD66d.

La expresión «célula presentadora de antígeno» o «APC» hace referencia a una célula del sistema inmunitario tal como una célula accesoria (por ejemplo, un linfocito B, una célula dendrítica y similares) que presenta un antígeno extraño en complejo con complejos mayores de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) en su superficie. Los linfocitos T pueden reconocer estos complejos utilizando los receptores de linfocitos T (TCR). Las APC procesan antígenos y los presentan a los linfocitos T.

Un «dominio de señalización intracelular», tal como se utiliza el término en la presente, hace referencia a una parte intracelular de una molécula. El dominio de señalización intracelular genera una señal que promueve una función efectora inmunitaria de la célula que contiene TFP, por ejemplo, un linfocito T que expresa TFP. Los ejemplos de función efectora inmunitaria, por ejemplo, en un linfocito T que expresa TFP, incluyen la actividad citolítica y la actividad de los linfocitos T auxiliares, inclusive la secreción de citoquinas. En una modalidad, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización intracelular primario. Los ejemplos de dominios de señalización intracelular primarios incluyen aquellos derivados de moléculas responsables de la estimulación primaria, o estimulación dependiente de antígenos. En una modalidad, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio intracelular coestimulador. Los ejemplos de dominios de señalización intracelular coestimuladores incluyen aquellos derivados de moléculas responsables de las señales coestimuladoras o estimulación independiente de los antígenos.

Un dominio de señalización intracelular primario puede comprender un ITAM («motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina»). Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmáticas primarias incluyen, de modo no taxativo, las derivadas de CD3 zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d DAP10 y DAP12.

La expresión «molécula coestimuladora» hace referencia al compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, lo que media de este modo una respuesta coestimuladora mediante el linfocito T, tal como, de modo no taxativo, la proliferación. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de superficie celular que no sean receptores antigénicos ni sus ligandos, que se requieren para una respuesta inmunitaria eficiente. Las moléculas coestimuladoras incluyen, de modo no taxativo una molécula MHC clase 1, BTLA y un receptor de ligando tipo Toll, así como OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) y 4-1BB (CD137). Un dominio de señalización intracelular coestimulador puede ser la parte intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora puede representarse en las siguientes familias de proteínas: proteínas receptoras de TNF, proteínas tipo inmunoglobulina, receptores de citoquina, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM, por sus siglas en inglés) y receptores de activación de células NK. Los ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, antígeno 1 asociado con la función linfocitaria (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83, y similares. El dominio de señalización intracelular puede comprender la parte intracelular total, o el dominio de señalización intracelular natural total, de la molécula de la cual deriva, o un fragmento funcional de esta. El término «4-1BB» hace referencia a un miembro de la superfamilia de TNFR con una secuencia de aminoácidos que se proporciona como el n.° de registro de GenBank AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, de ratón, roedor, mono, simio y similares; y un «dominio coestimulador 4-1BB» se define como los residuos de aminoácidos 214-255 del n.° de registro de GenBank AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, de ratón, roedor, mono, simio y similares.

La expresión «que codifica» hace referencia a la propiedad inherente de las secuencias de nucleótidos específicas en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para funcionar como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (por ejemplo, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas producidas por estos. Por lo tanto, un gen, ADNc o ARN codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm correspondiente a ese gen producen la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena de codificación, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y usualmente se proporciona en listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como la plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, pueden designarse como que codifican la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

Salvo que se especifique lo contrario, una «secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos» incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas la una de la otra y/o codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida que la secuencia de nucleótidos que codifican la proteína pueden contener, en alguna versión, uno o más intrones.

Las expresiones «cantidad eficaz» o «cantidad terapéuticamente eficaz» se utilizan de forma indistinta en la presente y hacen referencia a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, tal como se describe en la presente, eficaz para lograr un resultado biológico o terapéutico particular.

El término «endógeno» hace referencia a cualquier material de un organismo, célula, tejido o sistema, o producido dentro de estos.

El término «exógeno» hace referencia a cualquier material introducido desde un organismo, célula, tejido o sistema, o producido fuera de estos.

El término «expresión» hace referencia a la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos en particular impulsada por un promotor.

La expresión «vector de transferencia» hace referencia a una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que se puede utilizar para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica, inclusive, de modo no taxativo, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por tanto, la expresión «vector de transferencia» incluye un plásmido o virus que se replica de forma autónoma. La expresión también debe comprenderse como que incluye además compuestos que no son plásmidos ni virales, que facilitan la transferencia de ácido nucleico a las células, tal como, por ejemplo, un compuesto de polilisina, liposoma, y similares. Los ejemplos de vectores de transferencia virales incluyen, de modo no taxativo, vectores adenovíricos, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales y similares.

La expresión «vector de expresión» hace referencia a un vector que comprende un polinucleótido recombinante, que comprende las ecuencias de control de expresión unidas de forma operativa a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión se pueden proporcionar mediante la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, inclusive cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudo o contenido en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

El término «lentivirus» hace referencia a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus al ser capaces de infectar células que no se dividen; pueden proporcionar una cantidad significativa de información genética al ADN de la célula hospedadora, por lo que son uno de los métodos más eficientes de vector de administración de gen. El VIH, VIS y VIF son todos ejemplos de lentivirus.

La expresión «vector lentiviral» hace referencia a un vector derivado de al menos una parte de un genoma de lentivirus, que incluye especialmente un vector lentiviral autoinactivante tal como se proporciona en Milone et ál., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Otros ejemplos de vectores de lentivirus que se pueden utilizar en la clínica incluyen, de modo no taxativo, por ejemplo, la tecnología de administración de genes L^eNTIVECTOR™ de Oxford BioMedica, el sistema de vector LENTIMAX™ de Lentigen y similares. Los tipos no clínicos de vectores lentivirales también se encuentran disponibles y serían conocidos para el experto en la técnica.

Los términos «homólogo» o «identidad» hacen referencia a la identidad de secuencia de subunidad entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas de polipéptidos. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas es ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN es ocupada por adenina, entonces son homólogas o idénticas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa de la cantidad de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero con una longitud de diez subunidades) de las posiciones en las dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son 50 % homólogas; si el 90 % de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10) coinciden o son homólogas, las dos secuencias son 90 % homólogas.

Las formas «humanizadas» de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de estas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')²u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En general, los anticuerpos humanizados y los fragmentos de anticuerpo de estos son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor o fragmento de anticuerpo) en las cuales los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) del receptor se remplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo, que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de región marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, un anticuerpo/fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las CDR importadas o secuencias de marco. Estas modificaciones pueden refinar adicionalmente y optimizar el rendimiento del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo de este, comprenderá considerablemente todos de al menos uno, y normalmente dos dominios variables, en los cuales todas o considerablemente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o una parte significativa de las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado, o fragmento de anticuerpo, también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), comúnmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et ál., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et ál., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593 596, 1992.

«Humano/a» o «totalmente humano/a» hace referencia a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, donde la molécula total es de origen humano o consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo o inmunoglobulina.

El término «aislado» significa alterado o extraído de su estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o péptido natural presente en un animal vivo no se encuentra «aislado» pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o totalmente de los materiales coexistentes de su estado natural se encuentra «aislado». Una proteína o ácido nucleico aislado puede existir en una forma considerablemente purificada o puede existir en un entorno no natural tal como, por ejemplo, una célula hospedadora.

En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos comunes. «A» hace referencia a adenosina, «C» hace referencia a citosina, «G» hace referencia a guanosina, «T» hace referencia a timidina y «U» hace referencia a uridina.

La expresión «enlazado/a de forma operativa» o «control transcripcional» hace referencia al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que resulta en la expresión de esta última. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico se enlaza de forma operativa con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando se pone la primera secuencia de ácido nucleico en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está enlazado de manera operativa a una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Las secuencias de ADN unidas de forma operativa pueden encontrarse unas junto a otras y, por ejemplo, cuando es necesario unir dos regiones de codificación de proteínas, se encuentran en el mismo marco de lectura.

La expresión administración «parenteral» de una composición inmunogénica incluye, por ejemplo, inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, técnicas de infusión o intratumoral.

Las expresiones «ácido nucleico» o «polinucleótido» hacen referencia a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y polímeros de estos, ya sea en forma de cadena simple o doble. A menos que se limite de manera específica, la expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que poseen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca de forma implícita variantes modificadas de forma conservadora de esta (por ejemplo, sustituciones de codones redundantes), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias así como la secuencia que se indica explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones redundantes pueden lograrse mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et ál., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Los términos «péptido», «polipéptido» y «proteína» se utilizan indistintamente y hacen referencia a un compuesto que comprende residuos de aminoácidos enlazados de manera covalente mediante enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se limita la cantidad máxima de aminoácidos que puede comprender una secuencia de proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen todo péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en la presente, el término hace referencia tanto a cadenas cortas, a las que también se hace referencia comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, a las que por lo general se hace referencia en la técnica como proteínas, de las cuales existen muchos tipos. Los «polipéptidos» incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos considerablemente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Un polipéptido incluye un péptido natural, un péptido recombinante o una combinación de estos. El término «promotor» hace referencia a una secuencia de ADN reconocida por el mecanismo de transcripción de la célula, o mecanismo sintético introducido, que se necesita para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótidos.

La expresión «secuencia promotora/reguladora» hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que es necesaria para la expresión de un producto génico que se enlaza de forma operativa a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora nuclear y en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se necesitan para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que expresa el producto génico de una manera específica para un tejido.

La expresión promotor «constitutivo» hace referencia a una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza de forma operativa con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula en muchas condiciones fisiológicas de la célula, o todas ellas.

La expresión promotor «inducible» hace referencia a una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza de forma operativa con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula básicamente sólo cuando se encuentra presente en la célula un inductor que corresponde con el promotor.

La expresión promotor «específico para un tejido» hace referencia a una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza de manera operativa con un polinucleótido codificado o especificado por un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula básicamente sólo si la célula es una célula del tipo de tejido que corresponde al promotor. Las expresiones «enlazador» y «enlazador polipeptídico flexible», tal como se utilizan en el contexto de un scFv, hacen referencia a un enlazador peptídico que consiste en aminoácidos tales como residuos de glicina y/o serina, utilizados solos o combinados, para enlazar entre sí regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera. En una modalidad, el enlazador polipeptídico flexible es un enlazador Gly/Ser y comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)ⁿ, donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1. Por ejemplo, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 y n=10. En una modalidad, los enlazadores polipeptídicos flexibles incluyen, de modo no taxativo, (Gly⁴Ser)⁴o (Gly⁴Ser)³. En otra modalidad, los enlazadores incluyen múltiples repeticiones de (Gly²Ser), (GlySer) o (Gly³Ser). También se incluyen dentro del alcance de la invención enlazadores descritos en WO2012/138475. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora larga (LL). En algunos casos, la secuencia enlazadora larga comprende (G4S)n, donde n=2 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora corta (SL). En algunos casos, la secuencia enlazadora corta comprende (G⁴S)ⁿ, donde n=1 a 3.

Tal como se utiliza en la presente, un casquete 5' (también denominado un casquete de ARN, un casquete de 7-metilguanosina de ARN o un casquete m7G de ARN) es un nucleótido guanina modificado que se agregó a la parte «delantera» o extremo 5' de un ARN mensajero eucariota poco después del inicio de la transcripción. El casquete 5' consiste en un grupo terminal que se enlaza al primer nucleótido transcrito. Su presencia es fundamental para el reconocimiento por parte del ribosoma y la protección de RNasas. La adición de casquete se acopla a la transcripción y sucede de forma cotranscripcional, de modo que se influencien entre sí. Poco después del inicio de la transcripción, el extremo 5' del ARNm que se esté sintetizando se une mediante un complejo de sintetización de casquete asociado con la ARN polimerasa. Este complejo enzimático cataliza las reacciones químicas que son necesarias para la generación de casquetes de ARNm. La síntesis procede como una reacción bioquímica de múltiples etapas. El resto de generación de casquetes se puede modificar para modular la funcionalidad del ARNm, tal como su estabilidad o eficiencia de traducción.

Tal como se utiliza en la presente, «ARN transcrito in vitro» hace referencia al ARN, preferentemente ARNm, que se sintetizó in vitro. Por lo general, el ARN transcrito in vitro se genera a partir de un vector de transcripción in vitro. El vector de transcripción in vitro comprende una plantilla que se utiliza para generar el ARN transcrito in vitro.

Tal como se utiliza en la presente, «poli(A)» es una serie de adenosinas unidas por poliadenilación al ARNm. En la modalidad preferida de una construcción para expresión transitoria, el poliA se encuentra entre 50 y 5000, preferentemente mayor de 64, más preferentemente mayor de 100, más preferentemente mayor de 300 o 400. Las secuencias poli(A) se pueden modificar de forma química o enzimática para modular la funcionalidad del ARNm, tal como la localización, la estabilidad o la eficiencia de traducción.

Tal como se utiliza en la presente, «poliadenilación» hace referencia al enlace covalente de un resto poliadenililo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero. En organismos eucariotas, la mayoría de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) son poliadeniladas en el extremo 3'. La cola poli(A) en 3' es una secuencia larga de nucleótidos adenina (frecuentemente varios cientos) que se agrega al pre-ARNm mediante la acción de una enzima, la poliadenilato polimerasa. En eucariotas superiores, la cola poli(A) se agrega en transcripciones que contienen una secuencia específica, la señal de poliadenilación. La cola de poli(A) y la proteína unida a esta ayudan en la protección del ARNm de la degradación por exonucleasas. La poliadenilación también es importante para la terminación de la transcripción, la exportación del ARNm desde el núcleo y la traducción. La poliadenilación ocurre en el núcleo inmediatamente después de la transcripción del ADN en a Rn , pero adicionalmente también puede suceder después en el citoplasma. Después de que haya terminado la transcripción, la cadena de ARNm se escinde mediante la acción de un complejo de endonucleasa asociado con la ARN polimerasa. El sitio de escisión se caracteriza normalmente por la presencia de la secuencia de bases AAUAAA cerca del sitio de escisión. Después de que se escinde el ARNm, se agregan residuos de adenosina al extremo 3' libre en el sitio de escisión.

Tal como se utiliza en la presente, «transitorio» hace referencia a la expresión de un transgén no integrado durante un período de horas, días o semanas, donde el período de tiempo de expresión es menor que el período de tiempo para la expresión del gen si se integra en el genoma o está contenido dentro de un replicón de plásmido estable en la célula hospedadora.

La expresión «vía de transducción de señal» hace referencia a la relación bioquímica entre una diversidad de moléculas de transducción de señal que juegan un papel en la transmisión de una señal de una parte de una célula a otra parte de una célula. La expresión «receptor de superficie celular» incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitir la señal a través de la membrana de una célula.

El término «sujeto» pretende incluir organismos vivos en los cuales se pueda provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos, seres humanos).

La expresión célula «considerablemente purificada» hace referencia a una célula que carece considerablemente de otros tipos celulares. Una célula considerablemente purificada también hace referencia a una célula que se separó de otros tipos celulares con los cuales se asocia normalmente en su estado natural. En algunos casos, una población de células considerablemente purificadas hace referencia a una población homogénea de células. En otros casos, esta expresión hace referencia simplemente a que una célula que se separó de las células con las cuales se asocia naturalmente en su estado natural. En algunos aspectos, las células se cultivan in vitro. En otros aspectos, las células no se cultivan in vitro.

La expresión «terapéutico», tal como se utiliza en la presente, significa un tratamiento. Un efecto terapéutico se obtiene mediante la reducción, supresión, remisión o erradicación de un estado de enfermedad.

El término «profilaxis», tal como se utiliza en la presente, significa la prevención o el tratamiento protector para una enfermedad o un estado de enfermedad.

En el contexto de la presente invención, «antígeno tumoral» o «antígeno de trastorno hiperproliferativo» o «antígeno asociado con un trastorno hiperproliferativo» hacen referencia a antígenos que son comunes para trastornos hiperproliferativos específicos. En determinados aspectos, los antígenos del trastorno hiperproliferativo de la presente invención derivan de cánceres, inclusive, de modo no taxativo, melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, NHL, leucemias, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas, tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer pancreático y similares.

Los términos «transfectado» o «transformado» o «transducido» hacen referencia a un proceso mediante el cual el ácido nucleico exógeno se transfiere o introduce en la célula hospedadora. Una célula «transfectada» o «transformada» o «transducida» es aquella que se ha transfectado, transformado o transducido con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula del sujeto primario y su progenie.

La expresión «se une específicamente» hace referencia a un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un ligando específico, que reconoce y se une a un compañero de unión afín (por ejemplo, CD19) presente en una muestra, pero que no reconoce considerablemente o se une a otras moléculas en la muestra, aunque no necesariamente. Intervalos: a lo largo de la presente descripción, se pueden presentar diversos aspectos de la invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalos se proporciona meramente a los efectos de la conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo describe específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 debe considerarse que tiene específicamente los subintervalos descritos, tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. A modo de otro ejemplo, un intervalo tal como 95-99 % de identidad incluye algo con 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad e incluye subintervalos tales como 96 99 %, 96-98 %, 96-97 %, 97-99 %, 97-98 % y 98-99 % de identidad. Esto es de aplicación sin importar la amplitud del intervalo.

DESCRIPCIÓN

En la presente se proporcionan composiciones de materia y usos médicos para el tratamiento de una enfermedad, tal como el cáncer, utilizando proteínas de fusión del receptor de linfocitos T (TCR). Tal como se utiliza en la presente, una «proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR)» o «TFP» incluye un polipéptido recombinante derivado de diversos polipéptidos que comprenden el TCR, que en general es capaz de i) unirse a un antígeno de superficie en las células diana y ii) interactuar con otros componentes de polipéptidos del complejo intacto de TCR, normalmente cuando se coubica en o sobre la superficie de un linfocito T. Tal como se proporciona en la presente, las TFP proporcionan beneficios considerables en comparación con los receptores de antígenos quiméricos. La expresión «receptor de antígeno quimérico» o, de forma alternativa, «CAR» hace referencia a un polipéptido recombinante que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular en forma de un scFv, un dominio transmembrana y dominios de señalización citoplasmática (a los que también se hace referencia como «dominios de señalización intracelular») que comprenden un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora tal como se define más adelante. Por lo general, el dominio de señalización intracelular central de un CAR deriva de la cadena CD3 zeta que se encuentra normalmente asociada con el complejo TCR. El dominio de señalización de CD3 zeta puede fusionarse con uno o más dominios de señalización funcionales derivados de al menos una molécula coestimuladora tal como 4-1BB (es decir, CD137), CD27 y/o CD28.

Proteínas de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP)

La presente invención abarca construcciones de ADN recombinante que codifican TFP, donde la TFP comprende un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a CD19, por ejemplo, CD19 humano, donde la secuencia del fragmento de anticuerpo se encuentra contigua y en el mismo marco de lectura que una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad de TCR, o una parte de esta. La presente invención abarca construcciones de ADN recombinante que codifican TFP, donde la TFP comprende un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a BCMA, por ejemplo, BCMA humano, donde la secuencia del fragmento de anticuerpo se encuentra contigua y en el mismo marco de lectura que una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad de TCR, o una parte de esta. Las TFP que se proporcionan en la presente son capaces de asociarse con una o más subunidades de TCR endógenas (o, alternativamente, una o más subunidades exógenas o una combinación de endógenas y exógenas) para formar un complejo de TCR funcional.

En un aspecto, la TFP de la invención comprende un elemento de unión específica a la diana al que se hace referencia de otro modo como un dominio de unión al antígeno. La elección de resto depende del tipo y la cantidad del antígeno diana que define la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno puede elegirse para reconocer un antígeno diana que actúa como un marcador de superficie celular en las células diana asociadas con un estado de enfermedad particular. Por tanto, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como antígenos diana para el dominio de unión al antígeno en una TFP de la invención incluyen aquellos asociados con infecciones virales, bacterianas y parasitarias; enfermedades autoinmunes; y enfermedades cancerosas (por ejemplo, enfermedades malignas).

En un aspecto, la respuesta de linfocitos T mediada por TFP puede orientarse a un antígeno de interés mediante la modificación de un dominio de unión al antígeno en la TFP que se une específicamente a un antígeno deseado.

En un aspecto, la parte de la TFP que comprende el dominio de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que selecciona CD19. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno selecciona CD19 humano. En un aspecto, la parte de la TFP que comprende el dominio de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que selecciona BCMA. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno selecciona BCMA humano.

El dominio de unión al antígeno puede ser cualquier dominio que se une al antígeno, inclusive, de modo no taxativo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento funcional de este, inclusive, de modo no taxativo, un anticuerpo de dominio simple tal como un dominio variable de cadena pesada (V^h), un dominio variable de cadena ligera (V^l) y un dominio variable (V^hh) de un nanocuerpo derivado de camélido, y a una estructura alternativa que se conoce en la técnica que funciona como dominio de unión al antígeno, tal como un dominio de fibronectina recombinante, anticalina, DARPIN y similares. Asimismo, es posible utilizar un ligando natural o sintético que reconoce y se une específicamente al antígeno diana como dominio de unión al antígeno para la TFP. En algunos casos, resulta beneficioso para el dominio de unión al antígeno que se derive de las mismas especies en las cuales la TFP se utilizará en última instancia. Por ejemplo, para el uso en seres humanos, puede resultar beneficioso para el dominio de unión al antígeno de la TFP que comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

Por tanto, en un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende un anticuerpo humanizado o humano o un fragmento de anticuerpo, o un anticuerpo murino o fragmento de anticuerpo. En una modalidad, el dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA, humano o humanizado, comprende una o más (por ejemplo, las tres) región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1), región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) y región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de un dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA humano o humanizado descrito en la presente, y/o una o más (por ejemplo, las tres) región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) y región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio de unión a anti-CD19 humano o humanizado descrito en la presente, por ejemplo, un dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA humano o humanizado que comprende una o más, por ejemplo, las tres, LC CDR y una o más, por ejemplo, las tres, HC CDR. En una modalidad, el dominio de unión a anti-CD19 humano o humanizado comprende una o más (por ejemplo, las tres) región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) y región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA humano o humanizado descrito en la presente, por ejemplo, el dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA humano o humanizado tiene dos regiones variables de cadena pesada, donde cada uno comprende una HC CDR1, una HC CDR2 y una HC CDR3 descrita en la presente. En una modalidad, el dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA humano o humanizado comprende una región variable de cadena ligera humanizada o humana descrita en la presente y/o una región variable de cadena pesada humanizada o humana descrita en la presente. En una modalidad, el dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA humanizado o humano comprende una región variable de cadena pesada humanizada descrita en la presente, por ejemplo, al menos dos regiones variables de cadena pesada humanizadas o humanas descritas en la presente. En una modalidad, el dominio de unión anti-CD19 o anti-BCMA es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos que se proporciona en la presente. En una modalidad, el dominio de unión anti-CD19 o anti-BCMA (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la presente, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos proporcionada en la presente; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada que se proporciona en la presente, o una secuencia con 95-99 % de identidad respecto a una secuencia de aminoácidos proporcionada en la presente. En una modalidad, el dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA humano o humanizado es un scFv, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente se une a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, mediante un enlazador, por ejemplo, un enlazador descrito en la presente. En una modalidad, el dominio de unión anti-CD19 o anti-BCMA humanizado incluye un enlazador (Gly⁴-Ser)ⁿ, donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 3 o 4. La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv pueden encontrarse, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligera-enlazador-región variable de cadena pesada o región variable de cadena pesadaenlazador-región variable de cadena ligera. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora larga (LL). En algunos casos, la secuencia enlazadora larga comprende (G⁴S)ⁿ, donde n=2 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora corta (SL). En algunos casos, la secuencia enlazadora corta comprende (G⁴S)ⁿ, donde n=1 a 3.

En algunos aspectos, se humaniza un anticuerpo no humano, donde las secuencias o regiones específicas del anticuerpo se modifican para aumentar la similitud respecto a un anticuerpo producido de forma natural en un ser humano, o fragmento de este. En un aspecto, se humaniza el dominio de unión al antígeno.

Es posible producir un anticuerpo humanizado utilizando una diversidad de métodos conocidos en la técnica, inclusive, de modo no taxativo, injertos de CDR (véase, por ejemplo, la patente europea n.° EP 239.400; la publicación internacional n.° WO 91/09967; y las patentes estadounidenses n.° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), inactivación o remodelación de superficie (véase, por ejemplo, las patentes europeas n.° EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et ál., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et ál., 1994, PNAS, 91:969-973), trasposición de cadena (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.565.332) y las técnicas descritas, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US2005/0042664, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US2005/0048617, la patente estadounidense n.° 6.407.213, la patente estadounidense n.° 5.766.886, la publicación internacional n.° WO 9317105, Tan et ál., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et ál., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et ál., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et ál., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et ál., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et ál., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et ál., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), y Pedersen et ál., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994). Frecuentemente, los residuos de marco en las regiones marco se sustituirán con el correspondiente residuo del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de marco se identifican mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de los residuos de marco y CDR para identificar los residuos de marco importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar los residuos de marco inusuales en posiciones particulares (véase, por ejemplo, Queen et ál., patente estadounidense n.° 5.585.089; y Riechmann et ál., 1988, Nature, 332:323).

Un anticuerpo humanizado o fragmento de este tiene uno o más residuos de aminoácidos que permanecen en este de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente residuos de «importación», que se toman normalmente de un dominio variable de «importación». Tal como se proporciona en la presente, los anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpo comprenden una o más CDR de moléculas de inmunoglobulina no humana y regiones marco donde los residuos de aminoácidos que comprenden el marco derivan de la línea germinal humana, completamente o en su mayor parte. Se conocen en la técnica múltiples técnicas para la humanización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y se pueden llevar a cabo básicamente siguiendo el método de Winter y sus colaboradores (Jones et ál., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et ál., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et ál., Science, 239:1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de CDR de roedor o secuencias de CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano, es decir, injertos de CDR (EP 239.400; publicación PCT n.° WO 91/09967; y las patentes estadounidenses n.° 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640). En tales anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpo, se sustituyó considerablemente menos de un dominio variable humano intacto mediante la secuencia correspondiente de una especie no humana. Los anticuerpos humanizados son frecuentemente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de marco (FR, por sus siglas en inglés) se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La humanización de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo también se puede lograr mediante inactivación o remodelación de superficie (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et ál., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); y Roguska et ál., PNAS, 91:969-973 (1994)) o la trasposición de cadena (patente estadounidense n.° 5.565.332).

La elección de dominios variables humanos, tanto de cadena ligera como pesada, que se va utilizar en la creación de los anticuerpos humanizados es para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método «de mejor ajuste», la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza comparándola con la biblioteca completa de secuencias humanas de dominio variable conocidas. La secuencia humana más próxima a la del roedor se acepta entonces como el marco (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims et ál., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et ál., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Es posible utilizar el mismo marco para varios anticuerpos humanizados diferentes (véase, por ejemplo, Nicholson et ál. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et ál., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et ál., J. Immunol., 151:2623 (1993)). En algunas modalidades, la región marco, por ejemplo, las cuatro regiones marco, de la región variable de cadena pesada derivan de una secuencia de línea germinal V^h4-4-59. En una modalidad, la región marco puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, del aminoácido en la secuencia murina correspondiente. En una modalidad, la región marco, por ejemplo, las cuatro regiones marco de la región variable de cadena ligera, deriva de una secuencia de línea germinal VK3-1.25. En una modalidad, la región marco puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, del aminoácido en la secuencia murina correspondiente.

En algunos aspectos, la parte de una composición de TFP de la invención que comprende un fragmento de anticuerpo se humaniza con la retención de alta afinidad para el antígeno diana y otras propiedades biológicas favorables. De acuerdo con un aspecto de la invención, los anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpo se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son conocidos para los expertos en la técnica. Existen programas informáticos que ilustran y muestran estructuras de conformación tridimensional probables de secuencias de inmunoglobulina candidata seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, por ejemplo, el análisis de los residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse al antígeno diana. De esta forma, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación de modo que se logre la característica deseada de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como el aumento de afinidad para el antígeno diana. En general, los residuos de CDR se encuentran directamente implicados y de forma considerable en influenciar la unión al antígeno.

Un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo puede retener una especificidad antigénica similar al anticuerpo original, por ejemplo, en la presente invención, la capacidad de unirse a CD19 humano. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo puede tener afinidad y/o especificidad mejoradas de unión a CD19 humano o BCMA humano.

En un aspecto, el dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA se caracteriza por rasgos o propiedades funcionales particulares de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, en un aspecto, la parte de una composición de TFP de la invención que comprende un dominio de unión al antígeno se une específicamente a CD19 humano o BCMA humano. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno tiene la misma especificidad de unión, o similar, a CD19 humano que el scFv FMC63 descrito en Nicholson et ál. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). En un aspecto, la invención se relaciona con un dominio de unión al antígeno que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, donde el dominio de unión al anticuerpo se une específicamente a una proteína CD19 o BCMA o un fragmento de esta, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera variable y/o una cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos que se proporciona en la presente. En determinados aspectos, scFv es contiguo y se encuentra en el mismo marco de lectura que una secuencia líder.

En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 o anti-BCMA es un fragmento, por ejemplo, un fragmento variable de cadena simple (scFv). En un aspecto, el dominio de unión a anti-CD19 es un Fv, un Fab, un (Fab')²o un anticuerpo híbrido bifuncional (por ejemplo, biespecífico) (por ejemplo, Lanzavecchia et ál., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de estos de la invención se unen a una proteína CD19 con afinidad mejorada o de tipo salvaje.

También se proporcionan en la presente métodos para obtener un dominio de unión al antígeno del anticuerpo específico para un antígeno diana (por ejemplo, CD19, BCMA o cualquier antígeno diana descrito en otras secciones de la presente para dianas de dominios de unión a restos de fusión), donde el método comprende proporcionar mediante adición, eliminación, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio V^Hestablecido en la presente, un dominio V^Hque es una secuencia de aminoácidos variante del dominio V^h, que combina opcionalmente el dominio V^hque se proporciona con uno o más dominios V^l, y analizar el dominio V^ho la combinación V^h/V^lo combinaciones para identificar un miembro de unión específico o un dominio de unión de antígeno del anticuerpo específico para un antígeno diana de interés (por ejemplo, CD19 o BCMA) y opcionalmente con una o más propiedades deseadas.

En algunos casos, los dominios V^Hy scFv se pueden preparar de acuerdo con el método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Bird et ál., (1988) Science 242:423-426 y Huston et ál., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Las moléculas de scFv se pueden producir mediante enlaces de las regiones V^hy V^lentre sí utilizando enlazadores polipeptídicos flexibles. Las moléculas de scFv comprenden un enlazador (por ejemplo, un enlazador Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizada. La longitud de enlazador puede afectar enormemente cómo se pliegan e interactúan las regiones variables de un scFv. De hecho, si se emplea un enlazador polipeptídico corto (por ejemplo, entre 5-10 aminoácidos) se impide el pliegue dentro de la cadena. El pliegue dentro de la cadena también es necesario para juntar las dos regiones variables para formar un sitio de unión al epítope funcional. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora larga (LL). En algunos casos, la secuencia enlazadora larga comprende (G⁴S)ⁿ, donde n=2 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora corta (SL). En algunos casos, la secuencia enlazadora corta comprende (G⁴S)ⁿ, donde n=1 a 3. Para ejemplos de orientación y tamaños de enlazadores, véase, por ejemplo, Hollinger et ál. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses n.° 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 y las publicaciones PCT n.° WO2006/020258 y WO2007/024715.

Un scFv puede comprender un enlazador de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más de 15 residuos entre sus regiones V^ly V^h. La secuencia enlazadora puede comprender cualquier aminoácido de origen natural. En algunas modalidades, la secuencia enlazadora comprende los aminoácidos glicina y serina. En otra modalidad, la secuencia enlazadora comprende conjuntos de repeticiones de glicina y serina tales como (Gly⁴Ser)ⁿ, donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1. En una modalidad, el enlazador puede ser (Gly⁴Ser)⁴o (Gly⁴Ser)³. La variación en la longitud de enlazador puede conservar o mejorar la actividad, lo que da lugar a una eficacia superior en los estudios de actividad. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora larga (LL). En algunos casos, la secuencia enlazadora larga comprende (G4S)n, donde n=2 a 4. En algunos casos, la secuencia enlazadora comprende una secuencia enlazadora corta (SL). En algunos casos, la secuencia enlazadora corta comprende (G⁴S)ⁿ, donde n=1 a 3.

Estabilidad y mutaciones

La estabilidad de un dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA, por ejemplo, moléculas de scFv (por ejemplo, scFv soluble) se puede evaluar con referencia a las propiedades biofísicas (por ejemplo, la estabilidad térmica) de una molécula de scFv de control convencional o un anticuerpo de longitud total. En una modalidad, el scFv humanizado o humano tiene una estabilidad térmica que es mayor de aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,25, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,75, aproximadamente 1, aproximadamente 1,25, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,75, aproximadamente 2, aproximadamente 2,5, aproximadamente 3, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10 grados, aproximadamente 11 grados, aproximadamente 12 grados, aproximadamente 13 grados, aproximadamente 14 grados o aproximadamente 15 grados Celsius que un scFv original en los ensayos descritos.

La estabilidad térmica mejorada del dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA, por ejemplo, scFv se confiere posteriormente a la construcción total CD19-TFP, lo que conduce a propiedades terapéuticas mejoradas de la construcción de TFP anti-CD19 o anti-BCMA. La estabilidad térmica del dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA, por ejemplo, scFv se puede mejorar en al menos aproximadamente 2 °C o r 3 °C en comparación con un anticuerpo convencional. En una modalidad, el dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA, por ejemplo, scFv tiene una estabilidad térmica mejorada de 1 °C en comparación con un anticuerpo convencional. En otra modalidad, el dominio de unión a anti-CD19, por ejemplo, scFv tiene una estabilidad térmica mejorada de 2 °C en comparación con un anticuerpo convencional. En otra modalidad, el scFv tiene una estabilidad térmica mejorada de 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10 °C, 11 °C, 12 °C, 13 °C, 14 °C o 15 °C en comparación con un anticuerpo convencional. Las comparaciones se pueden realizar, por ejemplo, entre moléculas de scFv descritas en la presente y moléculas de scFv o fragmentos de Fab de un anticuerpo del cual derivan scFv V^hy V^l. Es posible medir la estabilidad térmica utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, se puede medir T^m. Los métodos para medir T^my otros métodos para la determinación de la estabilidad de las proteínas se describen con mayor detalle más adelante.

Las mutaciones en scFv (que surgen mediante la humanización o la mutagénesis directa del scFv soluble) alteran la estabilidad del scFv y mejoran la estabilidad general del scFv y la construcción TFP anti-CD19 o anti-BCMA. La estabilidad del scFv humanizado se compara con el scFv murino utilizando mediciones tales como T^m, desnaturalización de temperatura y concentración de temperatura. En una modalidad, el dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA, por ejemplo, un scFv, comprende al menos una mutación que surge del proceso de humanización, de modo que el scFv mutado confiere estabilidad mejorada a la construcción TFP Anti-CD19. En otra modalidad, el dominio de unión a anti-CD19, por ejemplo, scFv comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mutaciones que surgen del proceso de humanización, de modo que el scFv mutado confiera estabilidad mejorada a la construcción CD19-TFP o BCMA-TFP.

En un aspecto, el dominio de unión al antígeno de la TFP comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga a una secuencia de aminoácidos de dominio de unión al antígeno descrita en la presente, y el dominio de unión al antígeno conserva las propiedades funcionales deseadas de los fragmentos de anticuerpo anti-CD19 o anti-BCMA descritos en la presente. En un aspecto específico, la composición de TFP de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, ese fragmento de anticuerpo comprende un scFv.

En diversos aspectos, el dominio de unión al antígeno de la TFP se modifica mediante la modificación de uno o más aminoácidos dentro de una o ambas regiones variables (por ejemplo, V^hy/o V^l), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco. En un aspecto específico, la composición de TFP de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, ese fragmento de anticuerpo comprende un scFv.

El experto en la técnica comprenderá que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención puede modificarse adicionalmente de modo que varíen en la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, de tipo salvaje), pero no en la actividad deseada. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos adicionales que conducen a las sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos «no esenciales» pueden realizarse en la proteína. Por ejemplo, un residuo de aminoácidos no esencial en una molécula se puede remplazar con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. En otra modalidad, una serie de aminoácidos se puede remplazar con una serie estructuralmente similar que difiere en el orden y/o la composición de los miembros de la familia de cadena lateral, por ejemplo, es posible realizar una sustitución conservadora, en la cual se remplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar.

Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, inclusive cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

El porcentaje de identidad en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos hace referencia a dos o más secuencias que son la misma. Dos secuencias son «considerablemente idénticas» si poseen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (por ejemplo, 60 % de identidad, opcionalmente 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad en una región específica, o, cuando no se especifica, en la totalidad de la secuencia), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada, tal como se mide mediante el uso de uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. De manera opcional, la identidad existe en una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos), o más preferentemente en una región que tiene una longitud de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos).

Para comparar las secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencias. Pueden utilizarse los parámetros predeterminados del programa o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula después el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, según los parámetros del programa. Se conocen en la técnica los métodos para alinear las secuencias para su comparación. La alineación óptima de secuencias para su comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol.

48:443, mediante la búsqueda para el método de similitud de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis), o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Brent et ál., (2003) Current Protocols in Molecular Biology). Dos ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et ál., (1977) Nuc. Acids Res.

25:3389-3402; y Altschul et ál., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para la realización del análisis con BLAST se encuentra disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica.

En un aspecto, la presente invención contempla las modificaciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de inicio (por ejemplo, scFv) que genera moléculas equivalentes en cuanto a su función. Por ejemplo, V^Ho V^lde un dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA, por ejemplo, scFv, que comprende la TFP se pueden modificar para conservar al menos aproximadamente 70 %, 71 %. 72 %. 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de la región marco V^ho V^lde inicio del dominio de unión a anti-CD19, por ejemplo, scFv.

La presente invención contempla modificaciones de la construcción total de TFP, por ejemplo, las modificaciones en una o más secuencias de aminoácidos de los diversos dominios de la construcción TFP para generar moléculas equivalentes en cuanto a función. La construcción TFP se puede modificar para conservar al menos aproximadamente 70 %, 71 %. 72 %. 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de la construcción TFP de inicio.

Dominio extracelular

El dominio extracelular se puede derivar ya sea de una fuente natural o recombinante. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivar de cualquier proteína, pero en particular una proteína transmembrana o unida a la membrana. En un aspecto, el dominio extracelular es capaz de asociarse con el dominio transmembrana. Un dominio extracelular que tiene uso particular en la presente invención puede incluir al menos la o las regiones extracelulares de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, o CD3 épsilon, CD3 gamma o CD3 delta o, en modalidades alternativas, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154.

Dominio transmembrana

En general, una secuencia TFP contiene un dominio extracelular y un dominio transmembrana codificado por una secuencia genómica simple. En modalidades alternativas, una TFP se puede diseñar para que comprenda un dominio transmembrana que es heterólogo respecto al dominio extracelular de la TFP. Un dominio transmembrana puede incluir uno o más aminoácidos adicionales junto a la región transmembrana, por ejemplo, uno o más aminoácidos asociados con la región extracelular de la proteína de la cual deriva la transmembrana (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o hasta 15 aminoácidos de la región extracelular) y/o uno o más aminoácidos adicionales asociados con la región intracelular de la proteína de la cual deriva la proteína transmembrana (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o hasta 15 aminoácidos de la región intracelular). En un aspecto, el dominio transmembrana es aquel que se asocia con uno de los otros dominios de la TFP utilizada. En algunos casos, el dominio transmembrana se puede seleccionar o modificar mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana de superficie, por ejemplo, para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de homodimerización con otra TFP en la superficie de TFP-linfocito T. En un aspecto diferente, la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana se puede modificar o sustituirse de modo que se minimicen las interacciones con los dominios de unión del compañero de unión natural presente en la misma TFP.

El dominio transmembrana se puede derivar ya sea de una fuente natural o recombinante. Cuando la fuente sea natural, el dominio puede derivar de cualquier proteína unida a la membrana o proteína transmembrana. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de señalizar los dominios intracelulares cuando la TFP se unió a una diana. Un dominio transmembrana de uso particular en la presente invención puede incluir al menos la o las regiones transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. En algunos casos, el dominio transmembrana puede unirse a la región extracelular de la TFP, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno de la TFP, mediante una bisagra, por ejemplo, una bisagra de una proteína humana. Por ejemplo, en una modalidad, la bisagra puede ser una bisagra de inmunoglobulina humana (Ig), por ejemplo, una bisagra IgG4 o una bisagra CD8a.

Enlazadores

Opcionalmente, un enlazador oligo o polipeptídico corto, entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y la región citoplasmática de la TFP. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado. Por ejemplo, en un aspecto, el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 3). En algunas modalidades, el enlazador se codifica mediante una secuencia de nucleótidos de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 4).

Dominio citoplasmático

El dominio citoplasmático de la TFP puede incluir un dominio de señalización intracelular, si la TFP contiene los polipéptidos c D3 gamma, delta o épsilon; las subunidades TCR alfa y TCR beta generalmente carecen de un dominio de señalización. Generalmente, un dominio de señalización intracelular es responsable en general de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la cual se introdujo la TFP. La expresión «función efectora» hace referencia a una función especializada de una célula. La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser la actividad citolítica o la actividad auxiliar, inclusive la secreción de citoquinas. Por lo tanto, la expresión «dominio de señalización intracelular» hace referencia a la parte de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige la célula para realizar una función especializada. Si bien generalmente se puede emplear la totalidad del dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar toda la cadena. En la medida en que se utilice una parte truncada del dominio de señalización intracelular, dicha parte truncada se puede utilizar en lugar de la cadena intacta mientras transduzca la señal de función efectora. La expresión dominio de señalización intracelular, por lo tanto, pretende incluir cualquier parte truncada del dominio de señalización intracelular que sea suficiente para transducir la señal de función efectora. Los ejemplos de dominios de señalización intracelular para su uso en la TFP de la invención incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de linfocitos T (TCR) y los correceptores que actúan en conjunto para iniciar la transducción de señales después del acoplamiento del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia recombinante que tenga la misma capacidad funcional.

Se sabe que las señales generadas únicamente a través de TCR no son suficientes para la activación total de los linfocitos T sin tratamiento previo y que se necesita una señal secundaria y/o coestimuladora. Por tanto, se puede decir que la activación de linfocitos T sin tratamiento previo se encuentra mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmáticas: aquellas que inician la activación primaria dependiente del antígeno mediante TCR (dominios de señalización intracelular primarios) y aquellas que actúan de una manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (dominio citoplasmático secundario, por ejemplo, un dominio coestimulador).

Un dominio de señalización primario regula la activación primaria del complejo TCR, ya sea de una manera estimuladora o de una manera inhibidora. Los dominios de señalización intracelular primarios que actúan de una manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM).

Los ejemplos de ITAM que contienen dominios de señalización intracelular primarios que son de uso particular en la invención incluyen aquellos de CD3 zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En una modalidad, una TFP de la invención comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario de CD3-épsilon. En una modalidad, un dominio de señalización primario comprende un dominio ITAM modificado, por ejemplo, un dominio ITAM mutado que tiene una alteración (por ejemplo, un aumento o una disminución) de la actividad, en comparación con el dominio ITAM natural. En una modalidad, un dominio de señalización primario comprende un dominio de señalización intracelular primario que contiene ITAM modificado, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario que contiene ITAM optimizado y/o truncado. En una modalidad, un dominio de señalización primario comprende uno, dos, tres, cuatro o más motivos ITAM.

El dominio de señalización intracelular de la TFP puede comprender el dominio de señalización CD3 zeta en sí mismo o se puede combinar con cualquier otro u otros dominios de señalización intracelular deseados que sean útiles en el contexto de una TFP de la invención. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular de la TFP puede comprender una parte de cadena CD3 épsilon y un dominio de señalización coestimulador. El dominio de señalización coestimulador hace referencia a una parte de la TFP que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular distinta a un receptor de antígeno o sus ligandos, que se necesita para una respuesta eficiente de linfocitos a un antígeno. Los ejemplos de tales moléculas incluyen Cd27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD1, ICOS, el antígeno 1 asociado con la función linfocitaria (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares. Por ejemplo, la coestimulación con CD27 ha demostrado que mejora la expansión, la función efectora y la supervivencia de los linfocitos T TFP humanos in vitro y aumenta la continuidad de los linfocitos T humanos y la actividad antitumoral in vivo (Song et ál. Blood. 2012; 119(3):696-706).

Las secuencias de señalización intracelular dentro de la parte citoplasmática de la TFP de la invención se pueden enlazar entre sí en un orden específico o aleatorio. Opcionalmente, un enlazador oligo o polipeptídico corto, por ejemplo, entre 2 y 10 aminoácidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) de longitud, puede formar el enlace entre las secuencias de señalización intracelular.

En una modalidad, es posible utilizar un doblete de glicina-serina como enlazador adecuado. En una modalidad, es posible utilizar un aminoácido simple, por ejemplo, una alanina, una glicina, como enlazador adecuado.

En un aspecto, la célula que expresa TFP descrita en la presente puede comprender además una segunda TFP, por ejemplo, una segunda TFP que incluye un dominio de unión al antígeno diferente, por ejemplo, a la misma diana (CD19 o BCMA) o a una diana diferente (por ejemplo, CD123). En una modalidad, cuando la célula que expresa TFP comprende dos o más TFP diferentes, los dominios de unión al antígeno de las diferentes TFP pueden ser tales que los dominios de unión al antígeno no interactúen entre sí. Por ejemplo, una célula que expresa una primera y una segunda TFP puede tener un dominio de unión al antígeno de la primera TFP, por ejemplo, como un fragmento, por ejemplo, un scFv, que no forma una asociación con el dominio de unión al antígeno de la segunda TFP, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno de la segunda TFP es un V^hh.

En otro aspecto, la célula que expresa TFP descrita en la presente puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que mejore la actividad de una célula que exprese TFP. Por ejemplo, en una modalidad, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, PD1, pueden disminuir, en algunas modalidades, la capacidad de una célula que expresa TFP de generar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En una modalidad, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociada con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En una modalidad, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, LAG3, CTLA4, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4 y T iGiT, o un fragmento de cualquiera de estos (por ejemplo, al menos una parte de un dominio extracelular de cualquiera de estos), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 4-1BB, CD27 o CD28, por ejemplo, tal como se describe en la presente) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización CD3 zeta descrito en la presente). En una modalidad, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una parte de un dominio extracelular de PD1), y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización CD3 zeta descrito en la presente). PD1 es un miembro inhibidor de la familia CD28 de los receptores que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en los linfocitos B, linfocitos T y células mieloides activados (Agata et ál. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha demostrado que dos ligandos para PD1, PD-L1 y PD-L2 regulan por disminución la activación de los linfocitos T tras la unión a PD1 (Freeman et ál. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et ál. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et ál. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et ál. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et ál. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et ál. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). La supresión inmunitaria se puede revertir mediante inhibición de la interacción local de PD1 con PD-L1.

En una modalidad, el agente comprende el dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) de una molécula inhibidora, por ejemplo, es posible fusionar muerte programada 1 (PD1) a un dominio transmembrana y opcionalmente un dominio de señalización intracelular tal como 41BB y CD3 zeta (a los que también se hace referencia como PD1 TFP). En una modalidad, la PD1 TFP, cuando se utiliza combinado con una anti-CD19 TFP descrita en la presente, mejora la continuidad de los linfocitos T. En una modalidad, la TFP es una PD1 TFP que comprende el dominio extracelular de PD 1. De manera alternativa, se proporcionan TFP que contienen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo tal como un scFv que se une específicamente al ligando de muerte programada 1 (PD-L1) o el ligando de muerte programada 2 (PD-L2).

En otro aspecto, la presente invención proporciona una población de linfocitos T que expresan TFP, por ejemplo, linfocitos T TFP. En algunas modalidades, la población de linfocitos T que expresan TFP comprende una mezcla de células que expresan diferentes TFP. Por ejemplo, en una modalidad, la población de linfocitos T TFP puede incluir una primera célula que expresa una TFP que tiene un dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA descrito en la presente y una segunda célula que expresa una TFP que tiene un dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA diferente, por ejemplo, un dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA descrito en la presente que difiere del dominio de unión a anti-CD19 en la TFP expresada por la primera célula. A modo de otro ejemplo, la población de células que expresan TFP puede incluir una primera célula que expresa una TFP que incluye un dominio de unión a anti-CD19 o anti-BCMA, por ejemplo, tal como se describe en la presente, y una segunda célula que expresa una TFP que incluye un dominio de unión al antígeno a una diana que no sea CD19 o BCMA (por ejemplo, otro antígeno asociado con el tumor).

En otro aspecto, la presente invención proporciona una población de células donde al menos una célula en la población expresa una TFP que tiene un dominio anti-CD19 o anti-BCMA descrito en la presente, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que mejora la actividad de una célula que expresa TFP. Por ejemplo, en una modalidad, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras pueden, por ejemplo, en algunas modalidades, disminuir la capacidad de una célula que expresa TFP de generar una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En una modalidad, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociada con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente.

En la presente se describen métodos para la producción de ARN transcrito in vitro que codifica TFP. La presente invención también incluye una construcción de ARN que codifica TFP que se puede transfectar directamente a una célula. Un método para generar ARNm para su uso en la transfección puede implicar la transcripción in vitro (IVT, por sus siglas en inglés) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguido por la adición de poliA, para producir una construcción que contiene la secuencia no traducida en 3' y 5' («UTR»), un casquete en 5' y/o un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés), el ácido nucleico a expresar y una cola poliA, normalmente con una longitud de 50-2000 bases. El ARN producido de este modo puede transfectar de forma eficiente diferentes tipos de células. En un aspecto, la plantilla incluye secuencias para la TFP.

En un aspecto, la TFP anti-CD19 o anti-BCMA se codifican mediante ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica la TFP anti-CD19 o anti-BCMA se introduce en un linfocito T para la producción de un linfocito T TFP. En una modalidad, la TFP con ARN transcrito in vitro se puede introducir a una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN se produce mediante transcripción in vitro utilizando una plantilla generada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Es posible convertir el ADN de interés de cualquier fuente mediante PCR en una plantilla para la síntesis in vitro del ARNm utilizando cebadores adecuados y ARN polimerasa. La fuente del ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN de plásmidos, ADN de fago, ADNc, una secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente adecuada de ADN. La plantilla deseada para la transcripción in vitro es una TFP de la presente invención. En una modalidad, el ADN a utilizar para la PCR contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede ser de una secuencia de ADN de origen natural del genoma de un organismo. En una modalidad, el ácido nucleico puede incluir algunas o todas las regiones no traducidas 5' y/o 3' (UTR). El ácido nucleico puede incluir exones e intrones. En una modalidad, el ADN a utilizar para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humana. En otra modalidad, el ADN a utilizar para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humana que incluye las UTR 5' y 3'. El ADN puede ser, de forma alternativa, una secuencia de ADN artificial que no se expresa normalmente en un organismo de origen natural. Un ejemplo de secuencia de ADN artificial es aquel que contiene partes de genes que se ligan entre sí para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión. Las partes de a Dn que se ligan entre sí pueden ser de un único organismo o de más de un organismo.

La PCR se utiliza para generar una plantilla para la transcripción in vitro del ARNm que se utiliza para la transfección. Los métodos para llevar a cabo la pCr son conocidos en la técnica. Se diseñan cebadores para su uso en la PCR para que tengan regiones que son considerablemente complementarias respecto a regiones del ADN que se van a utilizar como plantilla para la PCR. «Considerablemente complementario/a», tal como se utiliza en la presente, hace referencia a secuencias de nucleótidos donde la mayoría o todas las bases en la secuencia cebadora son complementarias, o una o más bases no son complementarias o tienen error de emparejamiento. Las secuencias considerablemente complementarias son capaces de hibridarse con el ADN diana pretendido en condiciones de hibridación utilizadas para PCR. Los cebadores pueden diseñarse para ser considerablemente complementarios respecto a cualquier parte de la plantilla de ADN. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar para amplificar la parte de un ácido nucleico que normalmente se transcribe en células (el marco de lectura abierto), inclusive las UTR 5' y 3'. Los cebadores también pueden diseñarse para amplificar una parte de un ácido nucleico que codifica un dominio particular de interés. En una modalidad, los cebadores se diseñan para amplificar la región codificante de un ADNc humano, inclusive todas o partes de las UTR 5' y 3'. Los cebadores útiles para la PCR se pueden generar mediante métodos sintéticos que son conocidos en la técnica. «Cebadores directos» son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son considerablemente complementarios respecto a los nucleótidos en la plantilla de ADN que se encuentran en la parte anterior de la secuencia de ADN que se va a amplificar. «Parte anterior» se utiliza en la presente para hacer referencia a una ubicación 5, respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación con la cadena codificante. «Cebadores inversos» son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son considerablemente complementarios respecto a una plantilla de ADN de cadena doble que se encuentra en la parte posterior de la secuencia de ADN que se va a amplificar. «Parte posterior» se utiliza en la presente para hacer referencia a una ubicación 3', respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación con la cadena codificante.

Es posible utilizar cualquier ADN polimerasa útil para la PCR en los métodos descritos en la presente. Los reactivos y la polimerasa se encuentran disponibles en el mercado de varias fuentes.

También se pueden utilizar estructuras químicas con capacidad de promover la eficiencia de estabilidad y/o traducción. El ARN tiene preferentemente UTR 5' y 3'. En una modalidad, la UTR 5' se encuentra entre uno y 3000 nucleótidos de longitud. La longitud de las secuencias de UTR 5' y 3' UTR que se van a agregar a la región codificante se puede alterar mediante diferentes métodos, inclusive, de modo no taxativo, el diseño de cebadores para PCR que se hibriden a diferentes regiones de las UTR. Utilizando este enfoque, el experto en la técnica puede modificar las longitudes de las UTR 5' y 3' necesarias para lograr la eficiencia de traducción óptima después de la transfección del ARN transcrito.

Las UTR 5' y 3' pueden ser UTR 5' y 3' endógenas de origen natural para el ácido nucleico de interés. De manera alternativa, las secuencias de UTR que no son endógenas respecto al ácido nucleico de interés se pueden agregar mediante la incorporación de las secuencias de UTR en los cebadores directos e inversos o mediante cualquier otra modificación de la plantilla. El uso de las secuencias de UTR que no son endógenas respecto al ácido nucleico de interés puede ser útil para la modificación de la eficiencia de estabilidad y/o traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que los elementos ricos en AU en las secuencias de UTR 3' pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, las UTR 3' se pueden seleccionar o diseñarse para aumentar la estabilidad del ARN transcrito según las propiedades de las UTR que se conocen en la técnica.

En una modalidad, la UTR 5' puede contener la secuencia Kozak del ácido nucleico endógeno. De manera alternativa, cuando una UTR 5' que no es endógena respecto al ácido nucleico de interés se agrega por PCR tal como se describió anteriormente, es posible rediseñar una secuencia de consenso Kozak mediante la adición de la secuencia de UTR 5'. Las secuencias Kozak pueden aumentar la eficiencia de traducción de algunas transcripciones de ARN, pero no parece necesario para todos los ARN para permitir una traducción eficiente. El requisito para las secuencias Kozak para muchos ARNm se conoce en la técnica. En otras modalidades, la UTR 5' puede ser la UTR 5' de un virus de ARN cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras modalidades, es posible utilizar diversos análogos de nucleótidos en la UTR 3' o 5' para impedir la degradación de exonucleasa del ARNm.

Para permitir la síntesis del ARN a partir de una plantilla de ADN sin necesidad de clonación genética, debe unirse un promotor de transcripción a la plantilla de ADN en la parte anterior de la secuencia que se va a transcribir. Cuando una secuencia que funciona como un promotor para una ARN polimerasa se agrega al extremo 5' del cebador directo, el promotor de la ARN polimerasa se incorpora en el producto de PCR en la parte anterior del marco de lectura abierto que se va a transcribir. En una modalidad preferida, el promotor es un promotor de T7 polimerasa, tal como se describe en otras secciones de la presente. Otros promotores útiles incluyen, de modo no taxativo, los promotores de ARN polimerasa T3 y SP6. Las secuencias de nucleótidos de consenso para los promotores T7, T3 y SP6 son conocidas en la técnica.

En una modalidad preferida, el ARNm tiene tanto un casquete en el extremo 5' como una cola poli(A) en 3' que determinan la unión al ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En una plantilla de ADN circular, por ejemplo, el ADN de plásmido, la ARN polimerasa produce un producto concatamérico largo que no es adecuado para la expresión en células eucariotas. La transcripción del ADN de plásmido linealizado en el extremo de UTR 3' produce un ARNm de tamaño normal que no es eficaz en la transfección eucariota, incluso si se poliadeniliza después de la transcripción.

En una plantilla de ADN lineal, la ARN polimerasa de fago T7 puede extender el extremo 3' de la transcripción más allá de la última base de la plantilla (Schenborn y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

El método convencional de integración de extensiones poliA/T en una plantilla de ADN es la clonación molecular. Sin embargo, la secuencia poliA/T integrada en el ADN de plásmido puede causar inestabilidad del plásmido, por lo cual las plantillas de ADN de plásmido obtenidas de células bacterianas frecuentemente se encuentran muy contaminadas con eliminaciones y otras irregularidades. Esto hace que los procedimientos de clonación no sólo sean trabajosos y que requieran mucho tiempo sino que frecuentemente no son fiables. Por este motivo es muy deseable un método que permita la construcción de plantillas de ADN con extensiones poliA/T en 3' sin clonación. El segmento poliA/T de la plantilla de ADN transcripcional se puede producir durante la PCR mediante el uso de un cebador inverso que contiene una cola poliT, tal como una cola de 100 T (el tamaño puede ser de 50-5000 T), o después de la PCR mediante cualquier otro método, inclusive, de modo no taxativo, ligadura de ADN o recombinación in vitro. Las colas poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. Por lo general, la longitud de una cola poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una modalidad, la cola poli(A) tiene entre 100 y 5000 adenosinas.

Las colas poli(A) de ARN se pueden extender adicionalmente después de la transcripción in vitro con el uso de una poli(A) polimerasa, tal como una poliA polimerasa de E. coli (E-PAP, por sus siglas en inglés). En una modalidad, el aumento de la longitud de una cola poli(A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos produce aproximadamente un aumento de dos veces la eficacia de traducción del ARN. Adicionalmente, la unión de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Tal unión puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos de ATP pueden incorporarse en la cola poli(A) utilizando poli(A) polimerasa. Los análogos de ATP pueden aumentar además la estabilidad del ARN.

Los casquetes en 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una modalidad preferida, los ARN producidos por los métodos descritos en la presente incluyen un casquete 5'. El casquete en 5' se proporciona utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente (Cougot, et ál., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et ál., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et ál., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

Los ARN producidos mediante métodos descritos en la presente también contienen una secuencia de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). La secuencia de IRES puede ser cualquier secuencia vírica, cromosómica o de diseño artificial que inicie la unión del ribosoma independiente del casquete al ARNm y facilite el inicio de la traducción. Es posible incluir cualquier soluto adecuado para la electroporación celular, que puede contener factores que facilitan la permeabilidad y viabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y tensioactivos. Es posible introducir el ARN en células diana utilizando cualquier cantidad de métodos diferentes, por ejemplo, métodos disponibles en el mercado que incluyen, de modo no taxativo, electroporación (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburgo, Alemania), trasnfección mediada por liposoma catiónico utilizando lipofección, encapsulación de polímeros, transfección mediada por péptidos o sistemas de administración de partículas biolísticas tales como «pistolas génicas» (véase, por ejemplo, Nishikawa, et ál. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).

Construcciones de ácido nucleico que codifican una TFP

La presente invención proporciona también moléculas de ácido nucleico que codifican una o más construcciones de TFP descritas en la presente. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico se proporciona como una transcripción de ARN mensajero. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico se proporciona como una construcción de ADN. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, mediante el análisis de bibliotecas de células que expresan el gen, mediante la derivación del gen a partir de un vector que se sabe que las incluye o mediante el aislamiento directamente de las células y tejidos que las contienen, utilizando técnicas estándar. De manera alternativa, el gen de interés se puede producir por medios sintéticos, en lugar de clonarse.

La presente invención proporciona también vectores en los cuales se inserta un ADN de la presente invención. Los vectores derivados de retrovirus, tales como lentivirus, son herramientas adecuadas para lograr la transferencia génica a largo plazo ya que permiten una integración estable y duradera de un transgén y su propagación en las células hijas. Los vectores lentivirales tienen la ventaja agregada sobre los vectores derivados de onco-retrovirus, tal como virus de leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferativas, tales como hepatocitos. También tienen la ventaja agregada de tener baja inmunogenicidad.

En otra modalidad, el vector que comprende el ácido nucleico que codifica la TFP deseada de la invención es un vector adenovírico (A5/35). En otra modalidad, la expresión de ácidos nucleicos que codifican las TFP se puede lograr utilizando transposones tales como bella durmiente, crisper, CAS9 y nucleasas de dedos de zinc. Véase más adelante June et ál. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716.

Las construcciones de expresión de la presente invención también se pueden utilizar para la inmunización con ácido nucleico y la terapia génica, utilizando protocolos de administración génica estándares. Los métodos para la administración génica son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466). En otra modalidad, la invención proporciona un vector de terapia génica.

El ácido nucleico se puede clonar en una cantidad de tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector que incluye, de modo no taxativo, un plásmido, un fagémido, un derivado de fagos, un virus animal y un cósmido. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores secuenciadores.

Además, el vector de expresión se puede proporcionar en una célula en forma de un vector vírico. La tecnología de vectores víricos es conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et ál., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tomos 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), y otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, de modo no taxativo, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios convenientes de endonucleasa de restricción y uno o más marcadores seleccionables, (por ejemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; y la patente estadounidense n.° 6.326.193).

Se ha desarrollado una cantidad de sistemas víricos para la transferencia génica en células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para sistemas de administración génica. Se puede insertar un gen seleccionado en un vector e insertarse en partículas retrovirales utilizando métodos conocidos en la técnica. Después es posible aislar el virus recombinante y administrarlo a las células del sujeto ya sea in vivo o ex vivo. Se conoce en la técnica una cantidad de sistemas retrovirales. En algunas modalidades, se utilizan los vectores de adenovirus. Se conoce en la técnica una cantidad de vectores de adenovirus. En una modalidad, se utilizan vectores de lentivirus.

Los elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia del inicio de la transcripción. Comúnmente, estos se encuentran ubicados en la región 30-110 pb en la parte anterior del sitio de inicio, si bien se ha demostrado que una cantidad de promotores contiene elementos funcionales en la parte posterior del sitio de inicio. El espacio entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de manera que se conserve la función del promotor cuando los elementos se invierten o mueven unos con respecto a los otros. En el promotor de timidina cinasa (tk, por sus siglas en inglés), el espacio entre los elementos promotores puede aumentar a 50 bp de separación antes de que comience a decaer la actividad. Según el promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar ya sea de forma cooperativa o independiente para activar la transcripción.

Un ejemplo de un promotor que es capaz de expresar un transgén TFP en un linfocito T de mamífero es el promotor EF1a. El promotor natural EF1a conduce la expresión de la subunidad alfa del complejo de factor de elongación 1, que es responsable de la administración enzimática de los aminoacil ARNt al ribosoma. El promotor EF1a se ha utilizado ampliamente en plásmidos de expresión en mamíferos y ha demostrado ser eficaz en la conducción de la expresión de TFP a partir de transgenes clonados en un vector lentiviral (véase, por ejemplo, Milone et ál., Mol. Ther.

17(8): 1453-1464 (2009)). Otro ejemplo de promotor es la secuencia promotora de citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) temprano inmediato. Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte que puede impulsar niveles altos de expresión de cualquier secuencia de polinucleótidos unida operativamente a esta. Sin embargo, también es posible utilizar otras secuencias promotoras constitutivas, inclusive, de modo no taxativo, el promotor temprano del virus del simio 40 (SV40), el virus tumoral mamario de ratones (MMTV, por sus siglas en inglés), el promotor de la repetición terminal larga (LTR, por sus siglas en inglés) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el promotor MoMuLV, un promotor del virus de leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus de sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tal como, de modo no taxativo, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor del factor de elongación 1a , el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina cinasa. Además, la invención no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. También se contemplan los promotores inducibles como parte de la invención. El uso de un promotor inducible proporciona un cambio molecular capaz de encender la expresión de la secuencia de polinucleótidos que se enlaza de forma operativa cuando se desea tal expresión, o apagar la expresión cuando no se desea tal expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, de modo no taxativo, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoide, un promotor de progesterona y un promotor regulado por tetraciclina.

Para evaluar la expresión de un polipéptido de TFP o partes de este, el vector de expresión que se introducirá en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen informante o ambos para facilitar la identificación y selección de las células que presentan expresión a partir de la población de células que se pretende transfectar o infectar a través de los vectores virales. En otros aspectos, el marcador seleccionable se puede llevar en una parte de ADN separada y utilizarse en un procedimiento de transfección conjunta. Tanto los marcadores seleccionables como los genes informantes se pueden flanquear con secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células hospedadoras. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares.

Los genes informantes se utilizan para identificar las células posiblemente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen informante es un gen que no se encuentra presente o no se expresa en el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta mediante alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. Se evalúa la expresión del gen informante en un momento adecuado después de la introducción del ADN en las células receptoras. Los genes informantes adecuados pueden incluir genes que codifican la luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de proteína fluorescente verde (por ejemplo, Ui-Tei et ál., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son conocidos y se pueden preparar utilizando técnicas conocidas u obtenerse en el mercado. En general, la construcción con la región flanqueante mínima en 5' que muestra el mayor nivel de expresión de gen informante se identifica como promotor. Dichas regiones promotoras pueden unirse a un gen informante y utilizarse para evaluar los agentes y determinar la capacidad de modular la transcripción impulsada por el promotor.

Los métodos para introducir y expresar genes en una célula son conocidos en la técnica. En el contexto de un vector de expresión, es posible introducir el vector fácilmente en una célula hospedadora, por ejemplo, una célula de mamífero, bacteriana, de levadura o de insecto mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión se puede transferir a una célula hospedadora por medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et ál., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tomos 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY). Un método preferido para la introducción de un polinucleótido en una célula hospedadora es la transfección con fosfato de calcio

Los métodos biológicos para la introducción de un polinucleótido de interés en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y específicamente los vectores retrovirales, se han vuelto el método más utilizado para la inserción de genes en células de mamífero, por ejemplo, de ser humano. Otros vectores virales pueden derivar de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados y similares (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5.350.674 y 5.585.362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen los sistemas de dispersión coloidal, tal como los complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un ejemplo de sistema coloidal para su uso como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial). Se encuentran disponibles otros métodos de administración dirigida de ácidos nucleicos de última generación, tal como la administración de polinucleótidos con nanopartículas dirigidas u otro sistema de administración de tamaño submicrónico adecuado.

En caso de que se utilice un sistema de administración no viral, un ejemplo de vehículo de administración es un liposoma. El uso de las formulaciones lipídicas se contempla para la introducción de ácidos nucleicos en una célula hospedadora (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado a un lípido. El ácido nucleico asociado a un lípido puede encontrarse encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma mediante una molécula de enlace asociada al liposoma y al oligonucleótido, atrapado en un liposoma, formando un complejo con un liposoma, disperso en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o formando un complejo con una micela o asociado de otro modo a un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípido/ADN o lípido/vector de expresión no se limitan a ninguna estructura particular en la solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de bicapa, como micelas o con una estructura «contraída». También pueden encontrarse simplemente intercaladas en una solución, posiblemente formando agregados que no presenten un tamaño o forma uniforme. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos sintéticos o de origen natural. Por ejemplo, los lípidos incluyen las microgotas grasas que se originan naturalmente en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Es posible obtener los lípidos adecuados para su uso en fuentes comerciales. Por ejemplo, fosfatidilcolina de dimiristilo («DMPC») se puede obtener de Sigma, St. Louis, Mo.; fosfato de dicetilo («DCP») se puede obtener de K & K Laboratories (Plainview, N.Y.); colesterol («Choi») se puede obtener de Calbiochem-Behring; fosfatidilglicerol de dimiristilo («DMPG») y otros lípidos se pueden obtener de Avanti Polar Lipids, Inc., (Birmingham, Ala.). Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -20 °C. El cloroformo se utiliza como único solvente ya que se evapora más rápido que el metanol. «Liposoma» es un término genérico que abarca una diversidad de vehículos lipídicos simples y multilamelares formados mediante la generación de bicapas lipídicas cerradas o agregados. Los liposomas pueden caracterizarse por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípido y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas de lípidos separadas por un medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos sufren una autorreorganización antes de la formación de estructuras cerradas y retienen agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et ál., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, las composiciones que tienen diferentes estructuras en la solución que la estructura vesicular normal también se encuentran comprendidas. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o existir meramente como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan complejos de lipofectamina y ácido nucleico.

Independientemente del método utilizado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula hospedadora o exponer de otro modo una célula al inhibidor de la presente invención, para confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula hospedadora, es posible llevar a cabo una variedad de ensayos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de «biología molecular» conocidos para los expertos en la técnica, tales como transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos «bioquímicos», tales como detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, mediante medios inmunológicos (ELISA y transferencia Western) o mediante ensayos descritos en la presente para identificar agentes que se encuentren dentro del alcance de la invención.

La presente invención proporciona además un vector que comprende una TFP que codifica moléculas de ácido nucleico. En un aspecto, un vector TFP puede transducirse directamente en una célula, por ejemplo, un linfocito T. En un aspecto, el vector es un vector de clonación o de expresión, por ejemplo, un vector que incluye, de modo no taxativo, una o más construcciones de vectores de plásmidos (por ejemplo, plásmidos de expresión, vectores de clonación, minicírculos, minivectores, cromosomas doble minuto), retrovirales y lentivirales. En un aspecto, el vector es capaz de expresar la construcción de TFP en linfocitos T de mamífero. En un aspecto, el linfocito T de mamífero es un linfocito T humano.

Fuentes de linfocitos T

Antes de la expansión y la modificación genética, se obtiene una fuente de linfocitos T de un sujeto. El término «sujeto» pretende incluir organismos vivos en los cuales se pueda provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de estos. Los linfocitos T se pueden obtener de una cantidad de fuentes, inclusive células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, efusión pleural, tejido del bazo y tumores. En determinados aspectos de la presente invención, es posible utilizar cualquier cantidad de líneas de linfocitos T disponible en la técnica. En determinados aspectos de la presente invención, es posible obtener linfocitos T de una unidad de sangre recolectada de un sujeto utilizando cualquier cantidad de métodos conocidos para el experto en la técnica, tal como la separación Ficoll™. En un aspecto preferido, se obtienen las células de sangre en circulación de un individuo mediante aféresis. El producto de la aféresis normalmente contiene linfocitos, incluidos linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En un aspecto, las células extraídas mediante aféresis se pueden lavar para retirar la fracción de plasma y para colocar las células en un amortiguador o medio adecuado para las etapas de procesamiento posteriores. En un aspecto de la invención, se lavan las células con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés). En un aspecto alternativo, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos cationes divalentes, si no todos. Las etapas de activación iniciales cuando no hay calcio pueden conducir a una activación incrementada. Tal como comprenderán fácilmente los expertos en la técnica, es posible lograr una etapa de lavado mediante métodos conocidos en la técnica, tal como mediante el uso de una centrífuga de «flujo continuo» semiautomática (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, CytoMate de Baxter o el Cell Saver 5 de Haemonetics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, es posible volver a suspender las células en una diversidad de amortiguadores biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS sin Ca y sin Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin amortiguador. De manera alternativa, los componentes no deseables de la muestra de aféresis se pueden eliminar y es posible volver a suspender las células directamente en un medio de cultivo.

En un aspecto, se aíslan linfocitos T de linfocitos de sangre periférica mediante lisado de los glóbulos rojos y eliminación de los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente de PERCOLLTm o mediante elutriación centrífuga a contraflujo. Es posible aislar adicionalmente una subpoblación específica de linfocitos T, tal como linfocitos T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, en un aspecto, se aíslan los linfocitos T mediante incubación con microesferas conjugadas con anti-CD3/anti-CD28 (por ejemplo, 3x28), tal como DYNABEADS™ M-450 CD3/CD28 T, durante un período de tiempo suficiente para la selección positiva de los linfocitos T deseados. En un aspecto, el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En un aspecto adicional, el período de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores de números enteros entre estos. En un aspecto adicional, el período de tiempo es al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En aun otro aspecto preferido, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En un aspecto, el período de tiempo de incubación es de 24 horas. Es posible utilizar tiempos de incubación más prolongados para aislar los linfocitos T en cualquier situación en la que haya pocos linfocitos T en comparación con otros tipos celulares, tal como al aislar linfocitos infiltrantes de tumor (TIL, por sus siglas en inglés) de tejido tumoral o de individuos inmunodeprimidos. Además, el uso de tiempos de incubación más prolongados puede aumentar la eficiencia de la captura de linfocitos T CD8+. Por tanto, al acortar o alargar simplemente el tiempo, se permite que los linfocitos T se unan a las microesferas CD3/CD28 y/o al aumentar o disminuir la proporción de microesferas respecto a los linfocitos T (tal como se describe adicionalmente en la presente), es posible seleccionar de forma preferencial subpoblaciones de linfocitos T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos durante el proceso. Adicionalmente, al aumentar o disminuir la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las microesferas u otra superficie, es posible seleccionar de forma preferencial subpoblaciones de linfocitos T a favor o en contra en el inicio del cultivo o en cualquier otro momento deseado. El experto en la técnica reconocería que también es posible utilizar múltiples ciclos de selección en el contexto de la presente invención. En determinados aspectos, puede resultar deseable llevar a cabo un procedimiento de selección y utilizar las células «no seleccionadas» en el proceso de activación y expansión. Las células «no seleccionadas» también pueden someterse a ciclos adicionales de selección.

Es posible lograr el enriquecimiento de una población de linfocitos T mediante selección negativa con una combinación de anticuerpos dirigidos a los marcadores superficiales exclusiva para las células con selección negativa. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a los marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas de forma negativa. Por ejemplo, para el enriquecimiento de linfocitos CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales normalmente incluye anticuerpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En determinados aspectos, puede resultar deseable enriquecer o preferir de forma positiva linfocitos T reguladores que normalmente expresen CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ y FoxP3+. De manera alternativa, en determinados aspectos, los linfocitos T reguladores se reducen mediante microesferas conjugadas anti-C25 u otro método similar de selección.

En una modalidad, es posible seleccionar una población de linfocitos T que exprese uno o más de IFN-^y, TNF-alfa, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B y perforina, u otras moléculas adecuadas, por ejemplo, otras citoquinas. Los métodos de análisis para la expresión celular se pueden determinar, por ejemplo, mediante los métodos descritos en la publicación PCT n.°: WO 2013/126712.

Para aislar una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, es posible variar la concentración de células y superficie (por ejemplo, partículas tales como microesferas). En determinados aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el cual se mezclan las microesferas y las células (por ejemplo, aumento de la concentración de células), para asegurar el contacto máximo de células y microesferas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de 2 mil millones de células/ml. En un aspecto, se utiliza una concentración de mil millones de células/ml. En un aspecto adicional, se utiliza más de 100 millones de células/ml. En un aspecto adicional, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En aun otro aspecto, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En aspectos adicionales, es posible utilizar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones elevadas puede producir un aumento en el rendimiento celular, la activación celular y la expansión celular. Además, el uso de concentraciones celulares elevadas permite una captura más eficiente de células que pueden expresar débilmente los antígenos diana de interés, tal como linfocitos T negativos para CD28, o de muestras donde hay muchas células tumorales presentes (por ejemplo, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficiente de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión más débil de CD28.

En un aspecto relacionado, puede ser deseable utilizar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de linfocitos T y la superficie (por ejemplo, partículas tales como microesferas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto prefiere las células que expresan mayores cantidades de antígenos deseados que se van a unir a las partículas. Por ejemplo, los linfocitos T CD4+ expresan niveles mayores de CD28 y se capturan de forma más eficiente que los linfocitos T CD8+ en concentraciones diluidas. En un aspecto, la concentración de células utilizada es 5x106/ml. En otros aspectos, la concentración utilizada puede ser de entre 1x105/ml y 1x106/ml y cualquier valor entero entre estos. En otros aspectos, las células pueden incubarse en un rotador durante extensiones de tiempo variables a velocidades variables a 2-10 °C o a temperatura ambiente.

También es posible congelar los linfocitos T para estimulación después de la etapa de lavado. Sin pretender limitarse a la teoría, la etapa de congelamiento y posterior descongelamiento proporciona un producto más uniforme al eliminar los granulocitos y en cierta medida los monocitos en la población celular. Después de la etapa de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, es posible suspender las células en una solución de congelamiento. Si bien se conocen en la técnica muchas soluciones de congelamiento y parámetros y serán útiles en este contexto, un método implica el uso de PBS que contenga DMSO al 20 % y albúmina de suero humano al 8 %, o un medio de cultivo que contenga dextrano 40 al 10 % y dextrosa al 5 %, albúmina de suero humano al 20 % y DMSO al 7,5 %, o Plasmalyte-A al 31,25 %, dextrosa al 5 %, NaCl al 0,45 %, dextrano 40 al 10 % y dextrosa al 5 %, albúmina de suero humano al 20 % y DMSO al 7,5 % u otro medio de congelamiento celular adecuado que contenga, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, después se congelan las células a -80 °C a una velocidad de 1 por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Es posible utilizar otros métodos de congelamiento controlado así como congelamiento no controlado inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido. En determinados aspectos, las células criopreservadas se descongelan y se lavan tal como se describe en la presente y se las deja en reposo durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación con los métodos de la presente invención.

También se contempla en el contexto de la invención la recolección de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un período de tiempo anterior a cuando se puedan necesitar las células expandidas descritas en la presente. Como tal, la fuente de células que se van a expandir se puede recolectar en cualquier momento necesario y es posible aislar las células deseadas, tal como linfocitos T, y congelarlas para su uso posterior en la terapia con linfocitos T para cualquier cantidad de enfermedades o afecciones que se beneficiarían de la terapia con linfocitos T, tal como las que se describen en la presente. En un aspecto, se toma una muestra de sangre o aféresis de un sujeto sano en términos generales. En determinados aspectos, se toma una muestra de sangre o aféresis de un sujeto en términos generales sano, quien padece el riesgo de desarrollar una enfermedad pero aún no ha desarrollado tal enfermedad, y se aíslan las células de interés y se congelan para su uso posterior. En determinados aspectos, es posible expandir, congelar y utilizar en un momento posterior los linfocitos T. En determinados aspectos, se recolectan muestras de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular tal como se describe en la presente pero antes de cualquier tratamiento. En un aspecto adicional, se aíslan las células de una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto antes de cualquier cantidad de modalidades de tratamiento pertinentes, inclusive, de modo no taxativo, tratamientos con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivirales, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, citoxan, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación.

En un aspecto adicional de la presente invención, se obtienen linfocitos T de un paciente directamente después del tratamiento que deja al sujeto con linfocitos T funcionales. A este respecto, se observó que después de determinados tratamientos contra el cáncer, en tratamientos particulares con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el período en el que los pacientes normalmente se recuperarían del tratamiento, la calidad de los linfocitos T obtenidos puede ser óptima o mejorada por su capacidad de expandirse ex vivo. Asimismo, después de la manipulación ex vivo con los métodos descritos en la presente, estas células pueden encontrarse en un estado preferido para la realización mejorada de injertos y la expansión in vivo. Por tanto, se contempla dentro del contexto de la presente invención recolectar células sanguíneas, inclusive linfocitos T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante la fase de recuperación. Además, en aspectos adicionales, los regímenes de movilización (por ejemplo, movilización con GM-CSF) y acondicionamiento se pueden utilizar para crear una condición en un sujeto donde se favorezca la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos celulares particulares, especialmente durante una ventana definida de tiempo después de la terapia. Los tipos de células ilustrativos incluyen linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

Activación y expansión de linfocitos T

Es posible activar los linfocitos T y expandirlos en términos generales utilizando métodos como los descritos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.° 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 20060121005.

En general, los linfocitos T de la invención pueden expandirse al contacto con una superficie que se unió a un agente que estimula una señal asociada a un complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de los linfocitos T. En particular, es posible estimular las poblaciones de linfocitos T tal como se describe en la presente, tal como mediante el contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de unión al antígeno de este, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o mediante el contacto con un activador de la proteína cinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de los linfocitos T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, es posible poner en contacto a una población de linfocitos T con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones adecuadas para estimular la proliferación de linfocitos T. Para estimular la proliferación de linfocitos T CD4+ o CD8+, se utiliza un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Es posible utilizar los ejemplos de anticuerpo anti-CD28 que incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, Francia), tal como se pueden utilizar otros métodos conocidos comúnmente en la técnica (Berg et ál., Transplant Proc.

30(8):3975-3977, 1998; Haanen et ál., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et ál., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

Los linfocitos T que fueron expuestos a diversos tiempos de estimulación pueden presentar diferentes características. Por ejemplo, los productos celulares mononucleares de sangre periférica con aféresis o sangre típicos tienen una población de linfocitos T auxiliares (TH, CD4+) que es mayor que la población de linfocitos T citotóxicos o supresores (TC, CD8+). La expansión ex vivo de los linfocitos T mediante la estimulación de receptores CD3 y CD28 produce una población de linfocitos T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en linfocitos TH, mientras que después de aproximadamente los días 8-9, la población de linfocitos T comprende una población gradualmente mayor de linfocitos TC. Por consiguiente, según el fin del tratamiento, infundir a un sujeto con una población de linfocitos T que comprende predominantemente linfocitos TH puede resultar ventajoso. De manera similar, si se aisló un subconjunto específico para el antígeno de linfocitos TC, puede ser beneficioso expandir este subconjunto a un grado mayor.

Adicionalmente, además de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en su mayor parte, de forma reproducible durante el transcurso del proceso de expansión celular. Por tanto, tal capacidad de reproducción habilita la capacidad de ajustar un producto de linfocitos T activado para fines específicos.

Una vez que se construye una TFP anti-CD19 o anti-BCMA, es posible utilizar varios ensayos para evaluar la actividad de la molécula, tal como, de modo no taxativo, la capacidad de expandir linfocitos T después de la estimulación con antígenos, mantener la expansión de linfocitos T sin volver a estimular y actividades anticancerosas en modelos adecuados in vitro y en animales. Los ensayos para evaluar los efectos de una TFP anti-CD19 o anti-BCMA se describen con mayor detalle más adelante

El análisis de transferencia Western de la expresión de TFP en linfocitos T primarios se puede utilizar para detectar la presencia de monómeros y dímeros (por ejemplo, Milone et ál., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). Muy brevemente, se expanden los linfocitos T (1:1 mezcla de linfocitos T CD4+ y CD8+) que expresan las TFP in vitro durante más de 10 días seguido por la lisis y SDS-PAGE en condiciones de reducción. Las TFP se detectan mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo a una cadena TCR. Se utilizan los mismos subconjuntos de linfocitos T para el análisis SDS-PAGE en condiciones de no reducción para permitir la evaluación de la formación de dímeros covalentes.

La expansión in vitro de linfocitos T TFP+ después de la estimulación con antígenos puede medirse mediante citometría de flujo. Por ejemplo, se estimula una mezcla de linfocitos T CD4+ y CD8+ con alfaCD3/alfaCD28 y APC seguido por la transducción con vectores lentivirales que expresan GFP bajo el control de los promotores que se van a analizar. Los ejemplos de promotores incluyen promotores del gen CMV IE, EF-1alfa, ubiquitina C o fosfogliceroquinasa (pGk ). Se evalúa la fluorescencia GFP en el día 6 de cultivo en los subconjuntos de linfocitos T CD4+ y/o ^cD8+ mediante citometría de flujo (véase, por ejemplo, Milone et ál., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). De manera alternativa, se estimula una mezcla de linfocitos T CD4+ y CD8+ con microesferas magnéticas cubiertas con alfaCD3/alfaCD28 en el día 0, y se transduce con TFP en el día 1 utilizando un vector lentiviral bicistrónico que expresa TFP junto con eGFP utilizando una secuencia de omisión de ribosoma 2A. Se volvieron a estimular los cultivos con células CD19+ K562 (K562-CD19), células K562 de tipo salvaje (K562 tipo salvaje) o células K562 que expresan hCD32 y 4-1BBL en presencia del anticuerpo antiCD3 y anti-CD28 (K562-BBL-3/28) después del lavado. Se agregó IL-2 exógeno a los cultivos cada dos días a 100 IU/ml. Se enumeran los linfocitos T GFP+ mediante citometría de flujo utilizando recuento basado en microesferas (véase, por ejemplo, Milone et ál., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)).

También es posible medir la expansión de linfocitos T TFP+ sostenida sin volver a estimular (véase, por ejemplo, Milone et ál., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). Brevemente, se mide el volumen medio de linfocitos T (fl) en el día 8 del cultivo utilizando un contador de partículas Coulter Multisizer III después de la estimulación con microesferas magnéticas cubiertas con alfaCD3/alfaCD28 en el día 0, y la transducción con la TFP indicada en el día 1.

También es posible utilizar modelos animales para medir una actividad de TFP-T. Por ejemplo, es posible utilizar un modelo de xenoinjertos utilizando linfocitos T humanos TFP+ específicos para CD19 para tratar una pre-LLA B humana primaria en ratones inmunodeficientes (véase, por ejemplo, Milone et ál., Molecular Therapy 17(8): 1453 1464 (2009)). Muy brevemente, después de establecer ^lL^a, se aleatorizaron los ratones a grupos de tratamiento. Se inyectan de forma conjunta diferentes cantidades de linfocitos T modificados a una proporción de 1:1 en ratones NOD/SCID/y-/- con LLA B. Se evalúa la cantidad de copias de cada vector en el ADN de bazo de ratones en diversos momentos después de la inyección de linfocitos T. Se evalúan los animales en busca de leucemia en intervalos semanales. Se miden los recuentos de hemoblastos de LLA B CD19+ de sangre periférica en ratones a los que se inyectaron linfocitos T alfaCD19-zeta TFP+ o linfocitos T transducidos de forma simulada. Se comparan las curvas de supervivencia para los grupos utilizando el ensayo de rango logarítmico. Además, también es posible analizar los recuentos absolutos de linfocitos T CD4+ y CD8+ de sangre periférica 4 semanas después de la inyección de linfocitos T en ratones NOD/SCID/^y-/-. Se inyectó a los ratones células leucémicas y 3 semanas después se les inyectaron linfocitos T modificados para expresar TFP mediante un vector lentiviral bicistrónico que codifica la TFP unida a eGFP. Se normalizaron los linfocitos T a linfocitos T GFP+ con procesamiento de 45-50 % al mezclar con células transducidas de forma simulada antes de la inyección, y se confirmó mediante citometría de flujo. Se evalúan los animales en busca de leucemia en intervalos de una semana. Se comparan las curvas de supervivencia para los grupos de linfocitos T TFP+ utilizando el ensayo de rango logarítmico.

Es posible evaluar la respuesta al tratamiento con TFP dependiente de la dosis (véase, por ejemplo, Milone et ál., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). Por ejemplo, se obtiene sangre periférica 35-70 días después de establecer leucemia en ratones a los que se inyectaron el día 21 linfocitos T TFP, una cantidad equivalente de linfocitos T transducidos de forma simulada o sin linfocitos T. Se purgó a ratones de cada grupo de forma aleatoria para la determinación de los recuentos de hemoblastos de LLA CD19+ de sangre periférica y después se sacrifican en los días 35 y 49. Se evaluó al resto de los animales en los días 57 y 70.

La evaluación de la proliferación celular y la producción de citoquinas se describió anteriormente, por ejemplo, en Milone et ál., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Brevemente, la evaluación de proliferación mediada por TFP se lleva a cabo en placas de microtitulación al mezclar linfocitos T lavados con células K562 que expresan CD19 (K19) o CD32 y CD137 (KT32-BBL) para una proporción final de linfocitos T:K562 de 2:1. Se irradiaron células K562 con radiación gamma antes de su uso. Se agregan anticuerpos monoclonales anti-CD3 (clon OKT3) y anti-CD28 (clon 9.3) a los cultivos con células KT32-BBL para que sirvan como control positivo para la estimulación de la proliferación de linfocitos T dado que estas señales respaldan la expansión a largo plazo de los linfocitos T CD8+ ex vivo. Se enumeran los linfocitos T en cultivos utilizando las microesferas fluorescentes CountBright™ (Invitrogen) y citometría de flujo, tal como lo describe el fabricante. Se identifican los linfocitos T TFP+ mediante expresión de GFP utilizando linfocitos T que se modificaron con vectores lentivirales que expresan TFP unidos a eGFP-2A. Para los linfocitos T TFP+ que no expresan GFP, se detectan los linfocitos T TFP+ con proteína CD19 recombinante biotinilada y un conjugado secundario de avidina-PE. La expresión de CD4+ y CD8+ en linfocitos T también se detecta de forma simultánea con anticuerpos monoclonales específicos (BD Biosciences). Se llevan a cabo mediciones de citoquina en sobrenadantes recolectados 24 horas después de volver a estimular utilizando el kit de determinación de citoquinas de tipo TH1/TH2 humanas con matriz citométrica de microesferas (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se evalúa la fluorescencia utilizando un citómetro de flujo FACScalibur y se analizan los datos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Es posible evaluar la citotoxicidad mediante un ensayo estándar de liberación de 51Cr (véase, por ejemplo, Milone et ál., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). Brevemente, se cargan las células diana (líneas k 562 y células pro-ALL B primarias) con 51Cr (como NaCrO4, New England Nuclear) a 37 °C durante 2 horas con agitación frecuente, se lava dos veces en RPMI completo y se colocan en placas de microtitulación. Se mezclan los linfocitos T efectores con células diana en los pocillos en RPMI completo en diversas proporciones de linfocito efector:célula diana (E:T). También se preparan pocillos adicionales que contienen únicamente el medio (liberación espontánea, SR, por sus siglas en inglés) o una solución al 1 % de detergente triton-X 100 (liberación total, TR, por sus siglas en inglés). Después de 4 horas de incubación a 37 °C, se cultivó sobrenadante de cada pocillo. Después se midió 51Cr liberado utilizando un contador de partículas gamma (Packard Instrument Co., Waltham, Mass.). Cada condición se llevó a cabo al menos por triplicado y se calculó el porcentaje de lisis utilizando la fórmula: % lisis=(ER-SR)/(TR-SR), donde ER representa el 51Cr promedio liberado para cada condición experimental.

Es posible utilizar tecnología de generación de imágenes para evaluar el tráfico específico y la proliferación de TFP en modelos animales que tienen tumores. Tales ensayos se han descrito, por ejemplo, en Barrett et ál., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011). Brevemente, se inyecta a ratones NOD/SCI^d/^yc-/- (NSG) IV con células Nalm-6, seguido 7 días después con linfocitos T, 4 horas después de la electroporación con las construcciones de TFP. Se transfectan de forma estable los linfocitos T con una construcción lentiviral para expresar la luciferasa de luciérnaga y se generaron imágenes de los ratones en busca de bioluminiscencia. De manera alternativa, es posible medir la eficacia terapéutica y la especificidad de una inyección simple de linfocitos T TFP+ en el modelo de xenoinjertos Nalm-6 tal como a continuación: Se inyecta en ratones NSG Nalm-6 transducidas para expresar de forma estable la luciferasa de luciérnaga, seguido por una inyección simple en la vena de la cola de linfocitos T electroporados con TFP CD197 días después. Se generan imágenes de los animales en diversos momentos posteriores a la inyección.

Por ejemplo, es posible generar mapas térmicos de la densidad de fotones de la leucemia positiva para la luciferasa de luciérnaga en ratones representativos en el día 5 (2 días antes del tratamiento) y el día 8 (24 horas después de PBL TFP+).

También es posible utilizar otros ensayos, inclusive aquellos descritos en la sección de Ejemplos en la presente, así como aquellos conocidos en la técnica, para evaluar las construcciones de TFP anti-CD19 o anti-BCMA de la invención.

Aplicaciones terapéuticas

Enfermedades y/o trastornos asociados con CD19 o BCMA

En un aspecto, la invención proporciona usos médicos para el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de CD19 o BCMA. En un aspecto, la invención proporciona usos médicos para el tratamiento de una enfermedad donde parte del tumor es negativo para CD19 o BCMA y parte del tumor es positivo para CD19 o BCMA. Por ejemplo, la TFP de la invención es útil para el tratamiento de sujetos que han experimentado un tratamiento para una enfermedad asociada con la expresión elevada de CD19 o BCMA, donde el sujeto que ha experimentado un tratamiento para niveles elevados de CD19 o BCMA presenta una enfermedad asociada con niveles elevados de CD19 o BCMA.

En un aspecto, la invención hace referencia a un vector que comprende una TFP anti-CD19 o BCMA TFP que se enlaza de forma operativa al promotor para la expresión en linfocitos T de mamífero. En un aspecto, la invención proporciona un linfocito T recombinante que expresa la TFP CD19 o BCMA para su uso en el tratamiento de tumores que expresan CD19 o BCMA, donde el linfocito T recombinante que expresa la TFP CD19 o BCMA se denomina TFP-T CD19 o BCMA. En un aspecto, la TFP-T CD19 o BCMA de la invención es capaz de poner en contacto una célula tumoral con al menos una TFP CD19 o BCMA de la invención expresada en su superficie de modo que la TFP-T seleccione como diana la célula tumoral y se inhiba el crecimiento del tumor.

En un aspecto, la invención hace referencia a un uso médico de inhibición del crecimiento de una célula tumoral que exprese CD19 o BCMA, que comprende el contacto de la célula tumoral con un linfocito T TFP CD19 o BCMA de la presente invención de modo que TFP-T se active como respuesta al antígeno y seleccione como diana la célula cancerosa, donde se inhiba el crecimiento del tumor.

En un aspecto, la invención hace referencia a un uso médico para el tratamiento del cáncer en un sujeto. El uso médico comprende la administración al sujeto de una TFP linfocito T CD19 o BCMA de la presente invención, de modo que se trate el cáncer en el sujeto. Un ejemplo de un cáncer que se puede tratar mediante la TFP linfocito T CD19 o BCMA de la invención es un cáncer asociado con la expresión de CD19 o BCMA. En un aspecto, el cáncer asociado con la expresión de CD19 o BCMA es un cáncer hematológico. En un aspecto, el cáncer hematológico es leucemia o linfoma. En un aspecto, un cáncer asociado con la expresión de CD19 incluye cánceres y neoplasias que incluyen, de modo no taxativo, por ejemplo, una o más leucemias agudas que incluyen, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia linfoide aguda de linfocitos B («LLA B»), leucemia linfoide aguda de linfocitos T («LLA T»), leucemia linfoide aguda (LLA); una o más leucemias crónicas, inclusive, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoide crónica (LLC). Los cánceres adicionales o afecciones hematológicas que se asocian con la expresión de CD19 o BCMA incluyen, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, linfoma de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom y «preleucemia», que son un conjunto diverso de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides, y similares. Además, una enfermedad asociada con la expresión de CD19 o de BCMA incluye, de modo no taxativo, por ejemplo, cánceres, neoplasias, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas atípicas y/o no clásicas asociadas con la expresión de CD19 o BCMA.

En algunas modalidades, un cáncer que puede tratarse con una TFP CD19 o BCMA, por ejemplo, la que se describe en la presente, es mieloma múltiple. El mieloma múltiple es un cáncer en la sangre, que se caracteriza por la acumulación de un clon de células plasmáticas en la médula ósea. Las terapias actuales para el mieloma múltiple incluyen, de modo no taxativo, el tratamiento con lenalidomida, que es un análogo de la talidomida. La lenalidomida tiene actividades que incluyen la actividad antitumoral, la inhibición de la angiogénesis y la inmunomodulación. Por lo general, se cree que las células de mieloma son negativas para la expresión de CD19 o BCMA mediante citometría de flujo. La presente invención abarca el reconocimiento de que un pequeño porcentaje de las células tumorales de mieloma expresa CD19 o BCMA. Por tanto, en algunas modalidades, una TFP C19 o BCMA, por ejemplo, tal como se describen en la presente, puede utilizarse para seleccionar como dianas a las células del mieloma. En algunas modalidades, una terapia con TFP CD19 o BCMA se puede utilizar combinada con una o más terapias adicionales, por ejemplo, el tratamiento con lenalidomida.

La invención incluye un tipo de terapia celular donde los linfocitos T se modifican genéticamente para expresar una TFP y se infunde el linfocito T que expresa TFP a un receptor que lo necesite. La célula infundida es capaz de eliminar las células tumorales en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, los linfocitos T que expresan TFP son capaces de replicarse in vivo, lo que produce una continuidad a largo plazo que puede llevar a un control tumoral sostenido. En varios aspectos, los linfocitos T administrados al paciente, o su descendencia, persisten en el paciente durante al menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, trece meses, catorce meses, quince meses, dieciséis meses, diecisiete meses, dieciocho meses, diecinueve meses, veinte meses, veintiún meses, veintidós meses, veintitrés meses, dos años, tres años, cuatro años o cinco años después de la administración del linfocito T al paciente.

La invención incluye también un tipo de terapia celular donde los linfocitos T se modifican, por ejemplo, mediante ARN transcrito in vitro, para expresar de forma transitoria una TFP y el linfocito T que expresa TFP se infunde en un receptor que lo necesite. La célula infundida es capaz de eliminar las células tumorales en el receptor. Por tanto, en diversos aspectos, los linfocitos T administrados al paciente se encuentran presentes durante menos de un mes, por ejemplo, tres semanas, dos semanas o una semana, después de la administración del linfocito T al paciente.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, la respuesta inmunitaria antitumoral provocada por los linfocitos T que expresan TFP puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva, o de manera alternativa puede deberse a una respuesta inmunitaria directa en oposición a una indirecta. En un aspecto, los linfocitos T transducidos con TFP presentan secreción de citoquinas proinflamatoria específica y actividad citolítica potente como respuesta a las células cancerosas humanas que expresan el antígeno CD19 o BCMA, resisten la inhibición de c D19 o BCMA soluble, median la eliminación pasajera y median la regresión de un tumor humano establecido. Por ejemplo, las células tumorales sin antígeno dentro de un campo heterogéneo de tumores que expresan CD19 o que expresan BCMA pueden ser susceptibles a la destrucción indirecta mediante linfocitos T con redirección de CD19 o redirección de BCMA que ha reaccionado anteriormente contra células cancerosas contiguas positivas para el antígeno.

En un aspecto, los linfocitos T modificados con TFP humanos de la invención pueden ser de un tipo de vacuna para inmunización ex vivo y/o terapia in vivo en un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un ser humano.

Con respecto a la inmunización ex vivo, se da al menos uno de los siguientes in vitro antes de la administración de la célula al mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica una TFP a las células o iii) criopreservación de las células.

Los procedimientos ex vivo son conocidos en la técnica y se tratan de forma más completa más adelante. Brevemente, se aíslan las células de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa una TFP descrita en la presente. La célula modificada con TFP se puede administrar a un receptor mamífero para proporciona un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un ser humano y la célula modificada con TFP puede ser autóloga respecto al receptor. De manera alternativa, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas respecto al receptor. El procedimiento para la expansión ex vivo de células progenitoras y madre hematopoyéticas se describe en la patente estadounidense n.° 5.199.942, puede aplicarse a las células de la presente invención. Se conocen otros métodos adecuados en la técnica, por lo tanto, la presente invención no se limita a ningún método particular de expansión ex vivo de las células. Brevemente, el cultivo ex vivo y la expansión de los linfocitos T comprende: (1) recolectar células progenitoras y madre hematopoyéticas CD34+ de un mamífero del cultivo de sangre periférica o explantes de médula ósea; y (2) expandir tales células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en las patentes estadounidenses n.° 5.199.942, es posible utilizar otros factores tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, para el cultivo y la expansión de las células.

Además del uso de una vacuna basada en células en cuanto a la inmunización ex vivo, la presente invención proporciona también composiciones y usos médicos para la inmunización in vivo para provocar una respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno en un paciente.

En general, las células activadas y expandidas como se describe en la presente se pueden utilizar en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surjan en individuos inmunodeprimidos. En particular, los linfocitos T modificados con TFP de la invención se utilizan en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CD19 o BCMA. En determinados aspectos, las células de la invención se utilizan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CD19 o BCMA. Por tanto, la presente invención proporciona usos médicos para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CD19 o BCMA, que comprende la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de los linfocitos T modificados con TFP de la invención.

En un aspecto, los linfocitos T TFP de la invención se pueden utilizar para tratar una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o neoplasia o que sea una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia. En un aspecto, el cáncer es un cáncer hematológico. En un aspecto, el cáncer hematológico es leucemia o linfoma. En un aspecto, los linfocitos T-TFP de la invención se pueden utilizar para tratar cánceres y neoplasias tales como, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemias agudas, inclusive, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia linfoide aguda de linfocitos B («LlA B»), leucemia linfoide aguda de linfocitos T («LLA T»), leucemia linfoide aguda (LLA); una o más leucemias crónicas, inclusive, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC); cánceres hematológicos adicionales o afecciones hematológicas, inclusive, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células grandes o células pequeñas, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom y «preleucemias», que son un conjunto diverso de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de las células sanguíneas mieloides, y similares. Además, una enfermedad asociada con la expresión de CD19 o de BCMA incluye, de modo no taxativo, por ejemplo, cánceres, neoplasias, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas atípicas y/o no clásicas que expresan CD19 o BCMa . Los síntomas no relacionados con cáncer, asociados con la expresión de CD19 o BCMA, incluyen por ejemplo, de modo no taxativo, enfermedades autoinmunes, (por ejemplo, lupus), trastornos inflamatorios (alergia y asma) y trasplantes.

Los linfocitos T modificados con TFP de la presente invención se pueden administrar solos o como una composición farmacéutica combinados con diluyentes y/o con otros componentes, tales como IL-2 u otras citoquinas o poblaciones celulares.

Cáncer hematológico

Las afecciones de cáncer hematológico son los tipos de cáncer tales como leucemia y afecciones linfoproliferativas malignas que afectan la sangre, la médula ósea y el sistema linfático.

Es posible clasificar la leucemia como leucemia aguda y leucemia crónica. La leucemia aguda se puede clasificar además como leucemia mielógena aguda (LMA) y leucemia linfoide aguda (LLA). La leucemia crónica incluye leucemia mielógena crónica (LMC) y leucemia linfoide crónica (LLC). Otras afecciones relacionadas incluyen síndromes mielodisplásicos (SMD, conocidos anteriormente como «preleucemia») que son un conjunto diverso de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides y el riesgo de transformación en LMA.

La presente invención proporciona composiciones y usos médicos para tratar el cáncer. En un aspecto, el cáncer es un cáncer hematológico que incluye, de modo no taxativo, leucemia o un linfoma. En un aspecto, los linfocitos T-TFP de la invención se pueden utilizar para tratar cánceres y neoplasias tales como, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemias agudas, inclusive, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia linfoide aguda de linfocitos B («^lL^aB»), leucemia linfoide aguda de linfocitos T («LLA T»), leucemia linfoide aguda (LLA); una o más leucemias crónicas, inclusive, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC); cánceres hematológicos adicionales o afecciones hematológicas, inclusive, de modo no taxativo, por ejemplo, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células grandes o células pequeñas, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom y «preleucemias», que son un conjunto diverso de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de las células sanguíneas mieloides, y similares. Además, una enfermedad asociada con la expresión de CD19 o de BCMA incluye, de modo no taxativo, por ejemplo, cánceres, neoplasias, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas atípicas y/o no clásicas que expresan CD19 o BCMA.

La presente invención proporciona también usos médicos para la inhibición de la proliferación o reducción de una población de células que expresa CD19 o BCMA, donde tales usos médicos comprenden poner en contacto una población de células que comprenden una célula que expresa CD19 o BCMA con un linfocito T-TFP anti-CD19 o anti-BCMA de la invención que se une a la célula que expresa CD19 o BCMA. En un aspecto específico, la presente invención proporciona usos médicos para la inhibición de la proliferación o reducción de la población de células cancerosas que expresen CD19 o BCMA, donde tales usos médicos comprenden el contacto de la población de células cancerosas que expresa CD19 o BCMA con un linfocito T-TFP anti-CD19 o anti-BCMA de la invención que se une a la célula que expresa CD19 o BCMA. En un aspecto, la presente invención proporciona usos médicos para la inhibición de la proliferación o reducción de la población de células cancerosas que expresen CD19 o BCMA, donde tales usos médicos comprenden el contacto de la población de células cancerosas que expresa CD19 o BCMA con un linfocito T-TFP anti-CD19 o anti-BCMA de la invención que se une a la célula que expresa CD19 o BCMA. En determinados aspectos, el linfocito T-TFP anti-CD19 o anti-BCMA de la invención reduce la cantidad, el número, el monto o el porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 65 %, al menos 75 %, al menos 85 %, al menos 95 % o al menos 99 % en un sujeto con leucemia mieloide, o un modelo animal de esta, u otro cáncer asociado con células que expresan CD19 o BCMA respecto a un control negativo. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.

La presente invención también proporciona usos médicos para prevenir, tratar y/o manejar una enfermedad asociada con células que expresan CD19 o BCMA (por ejemplo, un cáncer hematológico o un cáncer atípico que exprese CD19 o BCMA), donde tales usos médicos comprenden la administración a un sujeto que lo necesite de un linfocito T-TFP anti-CD19 o anti-BCMA de la invención que se une a la célula que expresa CD19 o BCMA. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no taxativos de trastornos asociados con células que expresan CD19 o BCMA incluyen trastornos autoinmunes (tales como lupus), trastornos inflamatorios (tales como alergias y asma) y cánceres (tales como cánceres hematológicos o cánceres atípicos que expresan CD19 o BCMA).

La presente invención también proporciona usos médicos para prevenir, tratar y/o manejar una enfermedad asociada con células que expresan CD19 o BCMA, donde tales usos médicos comprenden la administración a un sujeto que lo necesite de un linfocito T-TFP anti-CD19 o anti-BCMA de la invención que se une a la célula que expresa CD19 o BCMA. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.

La presente invención proporciona usos médicos para prevenir la recaída del cáncer asociado con células que expresan CD19 o BCMA, donde tales usos médicos comprenden la administración a un sujeto que lo necesite de un linfocito T-TFP anti-CD19 o anti-BCMA de la invención que se une a la célula que expresa CD19 o BCMA. En un aspecto, los usos médicos comprenden la administración al sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de un linfocito T-TFP anti-CD19 o anti-BCMA descrito en la presente que se une a la célula que expresa CD19 o BCMA combinado con una cantidad eficaz de otra terapia.

Terapias combinadas

Una célula que expresa una TFP descrita en la presente puede utilizarse combinada con otros agentes y terapias conocidas. Tal como se usa en la presente, administración «combinada» significa que se administran dos (o más) tratamientos diferentes al sujeto durante el transcurso del padecimiento del trastorno por parte del sujeto, por ejemplo, se administran los dos o más tratamientos después de haber diagnosticado al sujeto con el trastorno y antes de curar o eliminar el trastorno o de interrumpir el tratamiento por otros motivos. En algunas modalidades, la administración de un tratamiento sigue en curso cuando inicia la administración del segundo, de forma que exista superposición en términos de administración. Algunas veces se hace referencia a esto como «administración simultánea» o «administración concurrente». En otras modalidades, la administración de un tratamiento termina antes de que comience la administración del otro tratamiento. En algunas modalidades de cualquiera de los casos, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, por ejemplo, se observa un efecto equivalente con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce en gran medida los síntomas que lo que se observaría si se administrara el segundo tratamiento en ausencia del primer tratamiento o se observa la situación análoga con el primer tratamiento. En algunas modalidades, la administración es tal que la reducción de un síntoma u otro parámetro relativo al trastorno es mayor que la que se observaría con la administración de un tratamiento en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, completamente aditivo o mayor que aditivo. La administración puede ser tal que aún pueda detectarse un efecto del primer tratamiento administrado cuando se administra el segundo.

En algunas modalidades, «al menos un agente terapéutico adicional» incluye una célula que expresa TFP. También se proporcionan linfocitos T que expresan múltiples TFP, que se unen a los mismos antígenos diana o a unos diferentes, o a los mismos epítopos o unos diferentes en el mismo antígeno diana. También se proporcionan en la presente poblaciones de linfocitos T en las cuales un primer subconjunto de linfocitos T expresa una primera TFP y un segundo subconjunto de linfocitos T que expresa una segunda TFP.

Es posible administrar una célula que expresa TFP descrita en la presente y al menos un agente terapéutico adicional de forma simultánea, en la misma composición o en una aparte, o en forma secuencial. En el caso de administración secuencial, la célula que expresa TFP descrita en la presente puede administrarse primero y el agente adicional puede administrarse segundo, o es posible invertir el orden de administración.

En aspectos adicionales, una célula que expresa TFP descrita en la presente puede utilizarse en una pauta de tratamiento combinada con cirugía, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y anticuerpos FK506, u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. vacunas peptídicas, tal como la que se describe en Izumoto et ál. 2008 J Neurosurg 108:963-971.

En una modalidad, es posible administrar al sujeto un agente que reduce o mejora un efecto secundario asociado con la administración de una célula que expresa TFP. Los efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa TFP incluyen, de modo no taxativo, síndrome de liberación de citoquina (CRS, por sus siglas en inglés) y linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH, por sus siglas en inglés), también denominada síndrome de activación de macrófagos (SAM). Los síntomas de c Rs incluyen fiebre alta, náuseas, hipotensión transitoria, hipoxia y similares. Por consiguiente, los usos médicos descritos en la presente pueden comprender la administración de una célula que expresa TFP descrita en la presente a un sujeto y la administración adicional de un agente para manejar los niveles elevados de un factor soluble producto del tratamiento con una célula que expresa TFP. En una modalidad, el factor soluble elevado en el sujeto es uno o más de IFN-y, TNFa, IL-2 e IL-6. Por lo tanto, un agente administrado para tratar este efecto secundario puede ser un agente que neutralice uno o más de estos factores solubles. Tales agentes incluyen, de modo no taxativo, un esteroide, un inhibidor de TNFa y un inhibidor de IL-6. Un ejemplo de un inhibidor de TNFa es entanercept. Un ejemplo de un inhibidor de IL-6 es tocilizumab (toc).

En una modalidad, es posible administrar al sujeto un agente que mejora la actividad de una célula que expresa TFP. Por ejemplo, en una modalidad, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. En algunas modalidades, las moléculas inhibidoras, por ejemplo, muerte programada 1 (PD1), pueden disminuir la capacidad de una célula que expresa TFP de generar una respuesta inmunitaria efectora. Los ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, mediante la inhibición en el nivel del ADN, ARN o proteico, puede optimizar el rendimiento de una célula que expresa TFP. En modalidades, es posible utilizar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo ARNbc, por ejemplo, un ARNip o ARNhp, para inhibir la expresión de una molécula inhibidora en la célula que expresa TFP. En una modalidad, el inhibidor es un ARNhp. En una modalidad, la molécula inhibidora se inhibe dentro de una célula que expresa TFP. En estas modalidades, una molécula de ARNbca que inhibe la expresión de la molécula inhibidora se enlaza al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, de la TFP. En una modalidad, el inhibidor de una señal inhibidora puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una molécula inhibidora. Por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a PD1, PD-L1, PD-L2 o CTLA4 (por ejemplo, ipilimumab (al que también se hace referencia como MDX-010 y MDX-101, y se comercializa como YervoyTM; Bristol-Myers Squibb; Tremelimumab (anticuerpo monoclonal IgG2 disponible gracias a Pfizer, conocido anteriormente como ticilimumab, CP-675.206)). En una modalidad, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a TIM3. En una modalidad, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a LAG3.

En algunas modalidades, el agente que mejora la actividad de una célula que expresa TFP puede ser, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, donde el primer dominio es una molécula inhibidora, o fragmento de esta, y el segundo dominio es un polipéptido que se asocia con una señal positiva, por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de señalización intracelular tal como se describe en la presente. En algunas modalidades, el polipéptido que se asocia con una señal positiva puede incluir un dominio coestimulador de CD28, CD27, ICOS, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular de CD28, CD27 y/o ICOS, y/o un dominio de señalización primario, por ejemplo, de CD3 zeta, por ejemplo, tal como se describe en la presente. En una modalidad, la proteína de fusión se expresa mediante la misma célula que expresó la TFP. En otra modalidad, la proteína de fusión se expresa mediante una célula, por ejemplo, un linfocito T que no expresa una TFP anti-CD19.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender una célula que expresa TFP, por ejemplo, múltiples células que expresan TFP, tal como se describe en la presente, combinada con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender amortiguadores tales como solución salina amortiguada neutra, solución salina amortiguada con fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y conservantes. Las composiciones de la presente invención se encuentran formuladas, en un aspecto, para administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en una forma adecuada para la enfermedad a tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de la administración se determinará mediante tales factores como la condición del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosificaciones adecuadas pueden determinarse mediante ensayos clínicos.

En una modalidad, la composición farmacéutica se encuentra considerablemente libre, por ejemplo, no hay niveles detectables, de un contaminante, por ejemplo, que se selecciona del grupo que consiste en endotoxina, micoplasma, lentivirus competente para replicación (RCL), p24, ácido nucleico VSV-G, gag VIH, microesferas cubiertas con anti-CD3/anti-CD28 residual, anticuerpos de ratón, suero humano agrupado, albúmina de suero bovino, suero bovino, componentes de medios de cultivo, célula empaquetadora de vector o componentes de plásmidos, una bacteria y un hongo. En una modalidad, la bacteria es al menos una que se selecciona del grupo que consiste en Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia y Streptococcus pyogenes grupo A.

Cuando se indica una «cantidad inmunológicamente eficaz», «una cantidad eficaz antitumoral», «una cantidad eficaz para inhibir un tumor» o «una cantidad terapéutica», la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que se deberá administrar puede determinarla un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y afección del paciente (sujeto). Es posible establecer en forma general que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos T descritos en la presente se puede administrar a una dosificación de 104 a 109 células/kg de peso corporal, en algunos casos de 105 a 106 células/kg de peso corporal, inclusive todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de linfocitos T también se pueden administrar múltiples veces en esas dosificaciones. Las células se pueden administrar mediante el uso de técnicas de infusión que se conocen en la inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et ál., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

En determinados aspectos, puede ser deseable administrar linfocitos T activados a un sujeto y después se vuelve a extraer sangre posteriormente (o se lleva a cabo una aféresis), activar los linfocitos T de estos de acuerdo con la presente invención y volver a infundir al paciente con estos linfocitos T activados y expandidos. Este proceso se puede realizar varias veces cada pocas semanas. En determinados aspectos, es posible activar los linfocitos T a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En determinados aspectos, se activan los linfocitos T a partir de extracciones de sangre de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc o 100 cc.

La administración de las composiciones presentadas puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, inclusive mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar a pacientes de forma transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o de manera intraperitoneal. En un aspecto, las composiciones de linfocitos T de la presente invención se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En un aspecto, las composiciones de linfocitos T de la presente invención se administran mediante inyección i.v.. Las composiciones de linfocitos T pueden inyectarse directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.

En un ejemplo de aspecto particular, los sujetos pueden someterse a leucaféresis, donde los leucocitos se recolectan, se enriquecen o se reducen ex vivo para seleccionar y/o aislar las células de interés, por ejemplo, linfocitos T. Estas cepas de linfocitos T pueden expandirse mediante métodos conocidos en la técnica y tratarse de modo que una o más construcciones de TFP de la invención puedan introducirse, lo que crea de este modo un linfocito T que expresa TFP de la invención. Los sujetos que lo necesitan pueden someterse posteriormente a tratamiento estándar con una quimioterapia de dosis elevada seguido por trasplante de células madre de sangre periférica. En determinados aspectos, después o de manera simultánea con el trasplante, los sujetos reciben una infusión de los linfocitos T TFP expandidos de la presente invención. En un aspecto adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

La dosificación de los tratamientos anteriores que se van a administrar a un paciente variarán con la naturaleza exacta de la afección que se esté tratando y el receptor del tratamiento. El escalamiento de las dosificaciones para administración a seres humanos se puede llevar a cabo de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. La dosis para CAMPATH, por ejemplo, se encontrará generalmente en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, normalmente se administra únicamente durante un período de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg por día si bien en algunos casos es posible utilizar dosis mayores de hasta 40 mg por día (descrito en la patente estadounidense n.° 6.120.766).

En una modalidad, la TFP se introduce en linfocitos T, por ejemplo, utilizando transcripción in vitro, y el sujeto (por ejemplo, un ser humano) recibe una administración inicial de linfocitos T TFP de la invención, y una o más administraciones posteriores de los linfocitos T TFP de la invención, donde una o más administraciones posteriores se administran durante menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días después de la administración previa. En una modalidad, se administra más de una administración de los linfocitos T TFP de la invención al sujeto (por ejemplo, un ser humano) por semana, por ejemplo, se administran 2, 3 o 4 administraciones de los linfocitos T TFP de la invención por semana. En una modalidad, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de una administración de los linfocitos T TFP por semana (por ejemplo, 2, 3 o 4 administraciones por semana) (a lo que también se hace referencia en la presente como un ciclo), seguido por una semana sin administraciones de linfocitos T TFP, y después se administra una o más administraciones adicionales de los linfocitos T TFP (por ejemplo, más de una administración de los linfocitos T TFP por semana) al sujeto. En otra modalidad, el sujeto (por ejemplo, un ser humano) recibe más de un ciclo de linfocitos T TFP, y el tiempo entre cada ciclo es menor de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 días. En una modalidad, los linfocitos T TFP se administran cada dos días durante 3 administraciones por semana. En una modalidad, los linfocitos T TFP de la invención se administran durante al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más semanas.

En un aspecto, los linfocitos T TFP CD19 se generan utilizando vectores virales lentivirales, tales como lentivirus. Los linfocitos T TFP generados de ese modo tienen expresión estable de TFP.

En un aspecto, los linfocitos T TFP expresan de forma transitoria los vectores TFP durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 días después de la transducción. La expresión transitoria de las TFP se puede ver afectada por la administración de un vector de TFP de ARN. En un aspecto, el ARN de TFP se transduce en el linfocito T mediante electroporación.

Un potencial problema que puede surgir en pacientes tratados con linfocitos T que expresan de forma transitoria TFP (particularmente con linfocitos T TFP que tienen scFv murino) es la anafilaxis después de múltiples tratamientos.

Sin pretender limitarse a esta teoría, se cree que tal respuesta anafiláctica puede ser provocada porque el paciente desarrolla una respuesta humoral anti-TFP, es decir, anticuerpos anti-TFP que tienen un isotipo anti-IgE. Se cree que las células de producción de anticuerpos de un paciente sufren un cambio de clase del isotipo IgG (que no genera anafilaxis) al isotipo IgE cuando hay un descanso de diez a catorce días en la exposición al antígeno.

Si un paciente tiene un riesgo elevado de generar una respuesta de anticuerpos anti-TFP durante el transcurso de la terapia transitoria con TFP (tal como los que se generan por transducciones de ARN), los descansos de infusión de linfocitos T TFP no debería durar más de diez a catorce días.

Ejemplos

La invención se describe en mayor detalle mediante la referencia a los ejemplos experimentales que siguen. Estos ejemplos se proporcionan solamente a efectos ilustrativos y no se pretende que sean limitativos a menos que se especifique de otra manera. Por lo tanto, no debería interpretarse de forma alguna que la invención se limite a los ejemplos que figuran a continuación, sino que debería interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que resulten evidentes a partir de las indicaciones que se proporcionan en la presente. Sin descripción adicional, se considera que un experto en la técnica, mediante la descripción que antecede y los ejemplos ilustrativos que siguen, puede elaborar y utilizar los compuestos de la presente invención y poner en práctica los usos médicos que se reivindican. Los ejemplos prácticos que figuran a continuación señalan específicamente los diversos aspectos de la presente invención, y no debe interpretarse que limiten de forma alguna al resto de la descripción.

Ejemplo 1: Construcciones de TFP

Se modificaron construcciones de TFP Anti-CD19 mediante clonación de un fragmento de ADN scFv anti-CD19 unido a CD3 o un fragmento de ADN TCR mediante una secuencia de ADN que codifica un enlazador corto (SL): AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE (SEQ ID NO: 5) o un enlazador largo (LL): AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE (SEQ ID NO: 6) en el vector p510 ((System Biosciences (SBI)) en los sitios XbaI y EcoRI.

Las construcciones TRuC anti-CD19 generadas fueron p510_antiCD19_LL_TCRa (anti-CD19 scFv - enlazador largo- cadena a del receptor de linfocitos T humano de longitud completa), p510_antiCD19_LL_TCR aC (anti-CD19 scFv - enlazador largo- cadena de dominio constante a del receptor de linfocitos T humano), p510_antiCD19_LL_TCRp (anti-CD19 scFv - enlazador largo- cadena p del receptor de linfocitos T humano de longitud completa), p510_antiCD19_LL_TCRpC (anti-CD19 scFv - enlazador largo- cadena de dominio constante p del receptor de linfocitos T humano), p510_antiCD19_LL_CD3Y (anti-CD19 scFv - enlazador largo- cadena CD3^yhumana), p510_antiCD19_LL_CD3⁸(anti-CD19 scFv - enlazador largo- cadena CD3⁸humana), p510_anticDl9_LL_CD3£ (anti-CD19 scFv - enlazador largo- cadena CD3e humana), p510_antiCD19_SL_TCRp (anti-CD19 scFv - enlazador corto- cadena p del receptor de linfocitos T humano de longitud completa), p510_antiCD19_SL_CD3Y (anti-CD19 scFv - enlazador corto- cadena CD3y humana), p510_antiCD19_SL_CD3⁸(anti-CD19 scFv - enlazador corto- cadena CD3⁸humana), p510_antiCD19_SL_CD3£ (anti-CD19 scFv - enlazador corto- cadena CD3^ehumana).

La construcción CAR anti-CD19, p510_antiCD19_28Z, se generó mediante clonación de ADN sintético que codifica anti-CD19, dominio extracelular de CD28 parcial, dominio transmembrana de CD28, dominio intracelular de CD28 y CD3 zeta en el vector p510 en los sitios XbaI y EcoRI.

Se modificaron construcciones TFP Anti-BCMA mediante clonación de un fragmento de ADN scFv anti-BCMA enlazado a un fragmento de ADN CD3 mediante una secuencia de ADN que codifica el enlazador: GGGGSGGGGSGGGGSLE (SEQ ID NO: 7) en el vector p510 (SBI) en los sitios XbaI y EcoRI. Las construcciones TFP anti-BCMA generadas fueron p510_antiBCMA_CD3Y (anti-BCMA scFv - enlazador- cadena CD3y humana) y p510_antiBCMA_CD3s (anti-BCMA scFv - enlazador- cadena CD3e humana).

Se sintetizó BCMA de longitud completa y se clonó en p514 (SBI) en los sitios BamHI y NheI para generar la construcción p514_BCMA, utilizada para generar líneas celulares diana estables.

Las construcciones TFP de proteína de activación Anti-fibroblastos (FAP) y anti-Carboanhidrasa-9 (CAIX) se modifican mediante clonación de un fragmento de ADN scFv anti-FAP o anti-CAIX enlazado a un fragmento de ADN CD3 mediante una secuencia de ADN que codifica el enlazador: GGGGSGGGGSGGGGSLE (SEQ ID NO: 7) en el vector p510 (SBI) en los sitios XbaI y EcoRI. Las construcciones TFP anti-FAP o anti-CAIX que se pueden generar incluyen p510_antiFAP_CD3Y (anti-FAP scFv -enlazador -cadena CD3y humana) y p510_antiFAP _CD3e (anti-FAP scFv - enlazador- cadena CD3^ehumana) y p510_antiCAIX _CD3^y(anti-CAIX scFv - enlazador-cadena CD3^y humana) y p510_antiCAIX _CD3e (anti-CAIX scFv - enlazador- cadena CD3e humana).

Es posible sintetizar FAP y CAIX de longitud completa y clonarlos en p514 (SBI) en los sitios BamHI y Nhel para generar las construcciones p514_FAP y p514_CAIX, que se pueden utilizar para generar líneas celulares diana estables.

Se muestran a continuación los ejemplos de secuencias de construcciones:

SECUENCIAS DE CONSTRUCCIONES

Construcción diana

P514_BCMA (SEQ ID NO: 8)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 241 ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 301 gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 361 tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 421 ccgaacaggg acctgaaagc gaaagggaaa ccagagctct ctcgacgcag gactcggctt 481 gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 541 actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 601 attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 661 aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 721 gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 781 tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 841 atagagataa 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tcaagtagtg 5041 tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 5101 tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca 5161 aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 5221 taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 5281 ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa 5341 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac 5401 taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt 5461 agtgaggagg cttttttgga ggcctagact tttgcagaga cggcccaaat tcgtaatcat 5521 ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 5581 ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 5641 cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 5701 tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 5761 ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 5821 taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 5881 agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 5941 cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 6001 tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 6061 tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 6121 gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 6181 acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 6241 acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 6301 cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 6361 gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 6421 gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 6481 agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 6541 ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 6601 ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 6661 atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 6721 tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 6781 gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 6841 ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 6901 caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 6961 cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 7021 cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 7081 cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 7141 agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 7201 tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 7261 agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 7321 atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 7381 ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 7441 cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 7501 caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 7561 attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 7621 agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct 7681 aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc 7741 gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg 7801 tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg 7861 gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 7921 tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 7981 gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc 8041 tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 8101 ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagctg.

Construcciones de CAR

p510_antiCD19_28z (SEQ ID NO: 9)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct 3121 cctccttacc tagacaatga gaagagcaat ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac 3181 ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt 3241 gggggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 3301 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 3361 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 3421 tccagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 3481 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 3541 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 3601 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 3661 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 3721 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aagaattcgg atccgcggcc 3781 gcgaaggatc tgcgatcgct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt 3841 ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaacgggt gcctagagaa ggtggcgcgg 3901 ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga 3961 accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag 4021 aacacagctg aagcttcgag gggctcgcat ctctccttca cgcgcccgcc gccctacctg 4081 aggccgccat ccacgccggt tgagtcgcgt tctgccgcct cccgcctgtg gtgcctcctg 4141 aactgcgtcc gccgtctagg taagtttaaa gctcaggtcg agaccgggcc tttgtccggc 4201 gctcccttgg agcctaccta gactcagccg gctctccacg ctttgcctga ccctgcttgc 4261 tcaactctac gtctttgttt cgttttctgt tctgcgccgt tacagatcca agctgtgacc 4321 ggcgcctacg ctagatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg 4381 tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca 4441 ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc 4501 gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct 4561 ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg 4621 ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc 4681 accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg 4741 gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg 4801 tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag cggctcggct 4861 tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca 4921 agcccggtgc ctgagtcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 4981 gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 5041 atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 5101 tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 5161 ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 5221 ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 5281 gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat _ C ; _ T> / -X l 1 _L /-I /~T -I— / ^~1 /~1 -I— -I— -I— /~1 /~1 ■ "I L—» "I— /T / T /~1 ■)— ^ -I— /-I / ^~f / v~-1- / v~-1- -I «——^ /~f -I «——^ /~f - «|—— - «|—— / ^~f / V"-1 'V /^"1 U í3 V /" -1 'V /^"l ) L— . / y"T y/"T U CJ L . 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p526A_19BBZ (SEQ ID NO: 10)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg ^{n / r t _ j_ j_ _ _ _ _}:?u-l auaauuyyay aagtgaatta ^■I1^—_CI ^4—L.CICI ^— C ^k I ⁴L^—.CI ⁴L^—.CI aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca 1441 attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 1501 aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 1561 attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 1621 tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 1681 ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1741 gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1801 taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1861 taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt 1921 tatcgatact agtggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg 1981 cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaacgggtgc ctagagaagg 2041 tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt 2101 gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt 2161 gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg cgcccgccgc 2221 cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc cgcctgtggt 2281 gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag accgggcctt 2341 tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct ttgcctgacc 2401 ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta cagatccaag 2461 ctgtgaccgg cgcctactct agagccgcca ccatggccct gcctgtgaca gctctgctgc 2521 tgcctctggc cctgctgctc catgccgcca gacccgatat ccagatgacc cagaccacca 2581 gcagcctgag cgccagcctg ggcgatagag tgaccatcag ctgccgggcc agccaggaca 2641 tcagcaagta cctgaactgg tatcagcaga aacccgacgg caccgtgaag ctgctgatct 2701 accacaccag cagactgcac agcggcgtgc ccagcagatt ttctggcagc ggctccggca 2761 ccgactacag cctgaccatc tccaacctgg aacaggaaga tatcgctacc tacttctgtc 2821 agcaaggcaa caccctgccc tacaccttcg gcggaggcac caagctggaa atcacaggcg 2881 gcggaggatc tggcggaggt ggaagtggcg gaggcggcag cgaagtgaaa ctgcaggaaa 2941 gcggccctgg cctggtggcc ccttctcagt ctctgtccgt gacctgtacc gtgtccggcg 3001 tgtccctgcc cgattatggc gtgtcctgga tccggcagcc tcccagaaag ggcctggaat 3061 ggctgggcgt gatctggggc agcgagacaa cctactacaa cagcgccctg aagtcccggc 3121 tgaccatcat caaggacaac tccaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga 3181 ccgacgacac cgccatctac tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca 3241 tggactactg gggccagggc accagcgtga ccgtgtctag cacaaccacc cctgccccta 3301 gacctcccac cccagcccca acaattgcca gccagcctct gtctctgcgg cccgaagctt 3361 gtagacctgc tgccggcgga gccgtgcaca ccagaggact ggatttcgcc tgcgacatct 3421 acatctgggc ccctctggcc ggcacatgtg gcgtgctgct cctcagcctg gtcatcaccc 3481 tgtactgcaa gcggggcaga aagaaactgc tctacatctt caagcagccc ttcatgcggc 3541 ccgtgcagac cacacaggaa gaggacggct gctcctgcag attccccgag gaagaagaag 3601 gcggctgcga gctgagagtg aagttcagca gatccgccga cgcccctgcc taccagcagg 3661 gacagaacca gctgtacaac gagctgaacc tgggcagacg ggaagagtac gacgtgctgg 3721 acaagcggag aggcagagat cccgagatgg gcggcaagcc cagacggaag aatccccagg 3781 aaggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggaa 3841 tgaagggcga gcggagaaga ggcaagggcc acgatggcct gtaccagggc ctgagcaccg 3901 ccaccaagga cacctacgat gccctgcaca tgcaggccct gccacccaga gaattcgaag 3961 gatccgcggc cgctgagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc 4021 ccggcccttc cggaatggag agcgacgaga gcggcctgcc cgccatggag atcgagtgcc 4081 gcatcaccgg caccctgaac ggcgtggagt tcgagctggt gggcggcgga gagggcaccc 4141 ccaagcaggg ccgcatgacc aacaagatga agagcaccaa aggcgccctg accttcagcc 4201 cctacctgct gagccacgtg atgggctacg gcttctacca cttcggcacc taccccagcg 4261 gctacgagaa ccccttcctg cacgccatca acaacggcgg ctacaccaac acccgcatcg 4321 agaagtacga ggacggcggc gtgctgcacg tgagcttcag ctaccgctac gaggccggcc 4381 gcgtgatcgg cgacttcaag gtggtgggca ccggcttccc cgaggacagc gtgatcttca 4441 ccgacaagat catccgcagc aacgccaccg tggagcacct gcaccccatg ggcgataacg 4501 tgctggtggg cagcttcgcc cgcaccttca gcctgcgcga cggcggctac tacagcttcg 4561 tggtggacag ccacatgcac ttcaagagcg ccatccaccc cagcatcctg cagaacgggg 4621 gccccatgtt cgccttccgc cgcgtggagg agctgcacag caacaccgag ctgggcatcg 4681 tggagtacca gcacgccttc aagaccccca tcgccttcgc cagatcccgc gctcagtcgt 4741 ccaattctgc cgtggacggc accgccggac ccggctccac cggatctcgc tagagctgaa 4801 tctaagtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta 4861 actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta 4921 ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt 4981 atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg 5041 caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt 5101 tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag 5161 gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc 5221 cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc 5281 cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc 5341 ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc 5401 ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa 5461 gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa aataagatct gctttttgct 5521 tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg 5581 aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt 5641 ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc 5701 tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga 5761 atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 5821 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 5881 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca 5941 gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg 6001 ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctagact 6061 tttgcagaga cggcccaaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 6121 atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 6181 cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 6241 gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 6301 gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 6361 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 6421 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 6481 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 6541 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 6601 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 6661 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 6721 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 6781 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 6841 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 6901 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 6961 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 7021 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 7081 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 7141 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 7201 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 7261 gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 7321 gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 7381 caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 7441 ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 7501 attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 7561 ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 7621 gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 7681 ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 7741 tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 7801 gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 7861 cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 7921 gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 7981 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 8041 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 8101 gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 8161 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 8221 catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 8281 ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa 8341 acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga 8401 gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact 8461 atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca 8521 gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 8581 gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg 8641 ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 8701 cggccagtgc caagctg.

TFP (TRuC) construcciones

p510_antiCDl9_LL_TCRalfa (SEQ ID NO: 11)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct 3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc 3181 gaggtgaatg gagagaatgt ggagcagcat ccttcaaccc tgagtgtcca ggagggagac 3241 agcgctgtta tcaagtgtac ttattcagac agtgcctcaa actacttccc ttggtataag 3301 caagaacttg gaaaaagacc tcagcttatt atagacattc gttcaaatgt gggcgaaaag 3361 aaagaccaac gaattgctgt tacattgaac aagacagcca aacatttctc cctgcacatc 3421 acagagaccc aacctgaaga ctcggctgtc tacttctgtg cagcaagtag gaaggactct 3481 gggggttacc agaaagttac ctttggaact ggaacaaagc tccaagtcat cccaaatatc 3541 cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg agagactcta aatccagtga caagtctgtc 3601 tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga ttctgatgtg 3661 tatatcacag acaaaactgt gctagacatg aggtctatgg acttcaagag caacagtgct 3721 gtggcctgga gcaacaaatc tgactttgca tgtgcaaacg ccttcaacaa cagcattatt 3781 ccagaagaca ccttcttccc cagcccagaa agttcctgtg atgtcaagct ggtcgagaaa 3841 agctttgaaa cagatacgaa cctaaacttt caaaacctgt cagtgattgg gttccgaatc 3901 ctcctcctga aagtggccgg gtttaatctg ctcatgacgc tgcggctgtg gtccagctga 3961 taagaattcg atccgcggcc gcgaaggatc tgcgatcgct ccggtgcccg tcagtgggca 4021 gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaacgggt 4081 gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt 4141 tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt 4201 cgcaacgggt ttgccgccag aacacagctg aagcttcgag gggctcgcat ctctccttca 4261 cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat ccacgccggt tgagtcgcgt tctgccgcct 4321 cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc gccgtctagg taagtttaaa gctcaggtcg 4381 agaccgggcc tttgtccggc gctcccttgg agcctaccta gactcagccg gctctccacg 4441 ctttgcctga ccctgcttgc tcaactctac gtctttgttt cgttttctgt tctgcgccgt 4501 tacagatcca agctgtgacc ggcgcctacg ctagatgacc gagtacaagc ccacggtgcg 4561 cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga 4621 ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct 4681 gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga 4741 cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc 4801 cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat 4861 ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg 4921 cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga 4981 ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc 5041 cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg 5101 cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctgagtcgac aatcaacctc tggattacaa 5161 aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 5221 cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 5281 cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 5341 tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac 5401 ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat 5461 cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt 5521 ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 5581 tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 5641 ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag 5701 tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tggtaccttt aagaccaatg acttacaagg 5761 cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact 5821 cccaacgaaa ataagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 5881 gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 5941 cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 6001 tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta 6061 ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg 6121 cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 6181 tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc 6241 tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 6301 aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 6361 gtgaggaggc ttttttggag gcctagactt ttgcagagac ggcccaaatt cgtaatcatg 6421 gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 6481 cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 6541 gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 6601 cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 6661 tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 6721 aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 6781 gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 6841 ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 6901 ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 6961 gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 7021 ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 7081 cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 7141 cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 7201 gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 7261 aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 7321 tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 7381 gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 7441 tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 7501 gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 7561 tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 7621 ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 7681 ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 7741 tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 7801 aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 7861 gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 7921 gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 7981 ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 8041 gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 8101 gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 8161 gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 8221 tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 8281 gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 8341 agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 8401 aaaaaaggga 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p510_antiCDl9_LL_TCRalfaC (SEQ ID NO: 12)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata 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ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 CCytaCaCyt tCyyayyyyy yaCtaaytty yaaataaCay yCtCCaCCtC tyyatCCyyC 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct 3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc 3181 gagccaaata tccagaaccc tgaccctgcc gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt 3241 gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag 3301 gattctgatg tgtatatcac agacaaaact gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag 3361 agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac 3421 aacagcatta ttccagaaga caccttcttc cccagcccag aaagttcctg tgatgtcaag 3481 ctggtcgaga aaagctttga aacagatacg aacctaaact ttcaaaacct gtcagtgatt 3541 gggttccgaa tcctcctcct gaaagtggcc gggtttaatc tgctcatgac gctgcggctg 3601 tggtccagct gataagaatt cgatccgcgg ccgcgaagga tctgcgatcg ctccggtgcc 3661 cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc 3721 aattgaacgg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac 3781 tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg 3841 aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagc tgaagcttcg aggggctcgc 3901 atctctcctt cacgcgcccg ccgccctacc tgaggccgcc atccacgccg gttgagtcgc 3961 gttctgccgc ctcccgcctg tggtgcctcc tgaactgcgt ccgccgtcta ggtaagttta 4021 aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc tagactcagc 4081 cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct acgtctttgt ttcgttttct 4141 gttctgcgcc gttacagatc caagctgtga ccggcgccta cgctagatga ccgagtacaa 4201 gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 4261 cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 4321 ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 4381 ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 4441 ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 4501 gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 4561 ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 4621 ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 4681 ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 4741 cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgagtcg acaatcaacc 4801 tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 4861 gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 4921 cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 4981 tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 5041 cattgccacc 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p510_antiCDI9_LL_TCRbeta (SEQ ID NO: 13)

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p510_antiCDl9_LL_TCRbetaC (SEQ ID NO: 14)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg ⁿzf ^/Z ^{1 _1/~<_1 _14-4-/~*-/~*--,/-v,}

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p510_antiCDl9_LL_CD3gamma (SEQ ID NO: 15)

1 a c g c g tg ta g t c t t a tg c a a t a c t c t t g t a g tc t tg c a a c a tg g ta a c g a tg a g tta g c a 61 a c a tg c c t ta caaggagaga aaaagcaccg tg c a tg c c g a t tg g tg g a a g ta a g g tg g ta 121 c g a tc g tg c c t ta t ta g g a a ggcaacagac g g g tc tg a c a tg g a ttg g a c g a accac tg a 181 a t tg c c g c a t tg c a g a g a ta t t g t a t t t a a g tg c c ta g c t c g a ta c a a ta a a c g g g tc tc 241 tc tg g t ta g a c c a g a tc tg a g cc tggga gc t c t c tg g c ta ac tagggaac c c a c tg c t ta 301 a g c c tc a a ta a a g c t tg c c t tg a g tg c t t c a a g ta g tg tg tg c c c g tc tg t t g t g t g a c t 361 c tg g ta a c ta g a g a tc c c tc a g a c c c t t t t a g tc a g tg tg g a a a a tc tc t agcag tggcg 421 cccgaacagg gacc tgaa ag cgaaagggaa a ccagag c tc tc tc g a c g c a g g a c tc g g c t 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga 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p510_antiCDl9_LL_CD3delta (SEQ ID NO: 16)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 ^{f- rr n t- rr «=* «=* rr n rr} nrtpp nctctnaa rr n rrrr n rr a n t- rr rrhrT^rrh^mrTr1 CcLcLcLcLcLtt.t.t 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta

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ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 6541 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 6601 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 6661 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 6721 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 6781 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 6841 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 6901 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 6961 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 7021 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 7081 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 7141 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 7201 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 7261 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 7321 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 7381 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 7441 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 7501 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 7561 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 7621 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 7681 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 7741 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 7801 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 7861 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 7921 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 7981 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 8041 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 8101 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 8161 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 8221 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 8281 aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 8341 tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 8401 cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct 8461 taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc 8521 gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa 8581 ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg 8641 atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa 8701 aacgacggcc agtgccaagc tg.

p510_antiCDl9_LL_CD3epsilon (SEQ ID NO: 17)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caattgaagt tatgtatcct 3121 cctccttacc taggtggcgg cggttctggt ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc 3181 gaggatggta atgaagaaat gggtggtatt acacagacac catataaagt ctccatctct 3241 ggaaccacag taatattgac atgccctcag tatcctggat ctgaaatact atggcaacac 3301 aatgataaaa acataggcgg tgatgaggat gataaaaaca taggcagtga tgaggatcac 3361 ctgtcactga aggaattttc agaattggag caaagtggtt attatgtctg ctaccccaga 3421 ggaagcaaac cagaagatgc gaacttttat ctctacctga gggcaagagt gtgtgagaac 3481 tgcatggaga tggatgtgat gtcggtggcc acaattgtca tagtggacat ctgcatcact 3541 gggggcttgc tgctgctggt ttactactgg agcaagaata gaaaggccaa ggccaagcct 3601 gtgacacgag gagcgggtgc tggcggcagg caaaggggac aaaacaagga gaggccacca 3661 cctgttccca acccagacta tgagcccatc cggaaaggcc agcgggacct gtattctggc 3721 ctgaatcaga gacgcatctg ataagaattc gatccgcggc cgcgaaggat ctgcgatcgc 3781 tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 3841 ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 3901 gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 3961 gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacagct gaagcttcga 4021 ggggctcgca tctctccttc acgcgcccgc cgccctacct gaggccgcca tccacgccgg 4081 ttgagtcgcg ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag 4141 gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct 4201 agactcagcc ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt 4261 tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac gctagatgac 4321 cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtccccaggg ccgtacgcac 4381 cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgatc cggaccgcca 4441 catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg 4501 caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt 4561 cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg 4621 gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc 4681 gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc 4741 cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac 4801 ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt 4861 cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgagtcga 4921 caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 4981 tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 5041 tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 5101 gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 5161 tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 5221 tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 5281 gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 5341 cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 5401 caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 5461 tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt 5521 taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg 5581 gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa aataagatct gctttttgct tgtactgggt 5641 ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc 5701 ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg 5761 actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta 5821 gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga atatcagaga 5881 gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 5941 atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 6001 atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca gttccgccca 6061 ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 6121 ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctagact tttgcagaga 6181 cggcccaaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac 6241 aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 6301 gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 6361 gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 6421 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 6481 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 6541 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 6601 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 6661 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 6721 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 6781 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 6841 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 6901 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 6961 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 7021 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 7081 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 7141 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 7201 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 7261 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 7321 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 7381 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 7441 cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 7501 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 7561 cgagcgcaga 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p510_antiCDl9_SL_CD3epsilon (SEQ ID NO: 18)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caggtggcgg cggttctggt 3121 ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc gaggatggta atgaagaaat gggtggtatt 3181 acacagacac catataaagt ctccatctct ggaaccacag taatattgac atgccctcag 3241 tatcctggat ctgaaatact atggcaacac aatgataaaa acataggcgg tgatgaggat 3301 gataaaaaca taggcagtga tgaggatcac ctgtcactga aggaattttc agaattggag 3361 caaagtggtt 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ctcaactcta cgtctttgtt tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc 4261 aagctgtgac cggcgcctac gctagatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac 4321 ccgcgacgac gtccccaggg ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc 4381 cacgcgccac accgtcgatc cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact 4-441 _{— ----}n_----i_---_---I_---r_---:_---n _---i_---_----n_----a_-----ñcr ñ a ra h raa a r _-J t_---r_----a_-----a_-----n_-----a_-----h_---—m _{J -J} a _--n_------a_----a_--—a a _—fa ta a a _---t_---r_-~a n a a a _—J r a a r a _~ a r a r r _~ a r 4501 ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg 4561 cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct 4621 cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc 4681 cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga 4741 gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga 4801 gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg 4861 catgacccgc aagcccggtg cctgagtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga 4921 aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 4981 aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 5041 atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 5101 gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 5161 cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 5221 ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 5281 ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 5341 gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 5401 gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 5461 cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 5521 atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa 5581 aataagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 5641 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 5701 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 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aggctccgcc cccctgacga 6601 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 6661 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 6721 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 6781 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 6841 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 6901 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 6961 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 7021 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 7081 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 7141 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 7201 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 7261 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ⁷³ _ ² - ¹ — ^ttaatct - ^a - ^a - ^{c aat} — ^h - ^ac - ^c - ^a - ^at _ ^a / ^c — ^t — ^t — ^a - ^a - ^t - ⁿ - ^a — ^a --- ^t 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p510_antiCDl9_SL_CD3gamma (SEQ ID NO: 19)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc ^{/t ■(— /—t /"~ -tj d i L- - c a . / '--T j /-1/-T /~t 4 L—. iU— iL—. /MtC nl' n^L f.O nC nl ^} r- ^{i V /t. /t /t /t ■ JO H— L- H— L- -I— /—i / V~»i,CT.C /-t -I— n ■)- n n n n n n m l —f /t} /~i ^rj^-L ^{l -}.ua ^rr> c ^rr i ^> L ^{r -}.'-jHH0 ^—i' 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caggtggcgg cggttctggt 3121 ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc gagcagtcaa tcaaaggaaa ccacttggtt 3181 aaggtgtatg actatcaaga agatggttcg gtacttctga 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p510_antiCDl9_SL_CD3delta (SEQ ID NO: 20)

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catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caggtggcgg cggttctggt 3121 ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc gagttcaaga tacctataga ggaacttgag 3181 gacagagtgt ttgtgaattg 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p510_antiCDl9_SL_TCRbeta (SEQ ID NO: 21)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 2401 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 2461 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 2521 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 2581 attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 2641 ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataacag gctccacctc tggatccggc 2701 aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct 2761 ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 2821 cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 2881 gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 2941 atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 3001 acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 3061 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagcggccg caggtggcgg cggttctggt 3121 ggcggcggtt ctggtggcgg cggttctctc gagctgggag caggcccagt ggattctgga 3181 gtcacacaaa ccccaaagca cctgatcaca gcaactggac agcgagtgac gctgagatgc 3241 tcccctaggt ctggagacct ctctgtgtca tggtaccaac agagcctgga ccagggcctc 3301 cagttcctca ttcagtatta taatggagaa gagagagcaa aaggaaacat tcttgaacga 3361 ttctccgcac 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gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct 5101 ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc 5161 cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg 5221 agtcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta 5281 tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc 5341 ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga 5401 ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac 5461 ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc 5521 cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc 5581 tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg 5641 gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc 5701 ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc 5761 gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg 5821 tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa 5881 aggggggact 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p510_antiBCMA_CD3epsilon (SEQ ID NO: 22)

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aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac 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gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat 5041 cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt 5101 gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc 5161 tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc 5221 ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg 5281 ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga 5341 cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc 5401 tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc 5461 tttgggccgc ctccccgcct ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat 5521 cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaaa 5581 taagatctgc tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag 5641 ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt 5701 caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt 5761 tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta 5821 taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt gagaggaact tgtttattgc agcttataat 5881 ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 5941 tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc 6001 cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta 6061 tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct 6121 tttttggagg cctagacttt tgcagagacg gcccaaattc gtaatcatgg tcatagctgt 6181 ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 6241 agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 6301 tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 6361 cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 6421 gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 6481 ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 6541 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 6601 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 6661 aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 6721 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 6781 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 6841 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 6901 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 6961 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 7021 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 7081 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 7141 gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 7201 ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 7261 agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 7321 ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 7381 gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 7441 catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 7501 cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 7561 cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 7621 gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 7681 tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 7741 gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 7801 tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 7861 gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 7921 gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 7981 taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 8041 tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 8101 ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 8161 taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 8221 tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 8281 aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 8341 ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt 8401 tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc 8461 tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt 8521 gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc 8581 ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat 8641 tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 8701 tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 8761 cacgacgttg taaaacgacg gccagtgcca agctg

p510_antiBCMA_CD3gamma (SEQ ID NO: 23)

1 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 61 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 121 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 181 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 241 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 301 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 361 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 421 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 481 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 541 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 601 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 661 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 721 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 781 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 841 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 901 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 961 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1021 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1081 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1141 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1201 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1261 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1321 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1381 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1441 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1501 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1561 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1621 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1681 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1741 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1801 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1861 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1921 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1981 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2041 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2101 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2161 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2221 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2281 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2341 gcattcctcc tgatcccaca ggtgcagctg gtgcagagcg gcgcggaagt gaaaaaaccg 2401 ggcgcgagcg tgaaagtgag ctgcaaagcg agcggctata gctttccgga ttattatatt 2461 aactgggtgc gccaggcgcc gggccagggc ctggaatgga tgggctggat ttattttgcg 2521 agcggcaaca gcgaatataa ccagaaattt accggccgcg tgaccatgac ccgcgatacc 2581 agcagcagca ccgcgtatat ggaactgagc agcctgcgca gcgaagatac cgcggtgtat 2641 ttttgcgcga gcctgtatga ttatgattgg tattttgatg tgtggggcca gggcaccatg 2701 gtgaccgtga gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 2761 gatattgtga tgacccagac cccgctgagc ctgagcgtga ccccgggcga accggcgagc 2821 attagctgca aaagcagcca gagcctggtg catagcaacg gcaacaccta tctgcattgg 2881 tatctgcaga aaccgggcca gagcccgcag ctgctgattt ataaagtgag caaccgcttt 2941 agcggcgtgc cggatcgctt tagcggcagc ggcagcggcg cggattttac cctgaaaatt 3001 agccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg tattattgcg cggaaaccag ccatgtgccg 3061 tggacctttg gccagggcac caaactggaa attaaaagcg gtggcggcgg ttctggtggc 3121 ggcggttctg gtggcggcgg ttctctcgag cagtcaatca aaggaaacca cttggttaag 3181 gtgtatgact atcaagaaga tggttcggta cttctgactt gtgatgcaga agccaaaaat 3241 atcacatggt ttaaagatgg gaagatgatc ggcttcctaa ctgaagataa aaaaaaatgg 3301 aatctgggaa gtaatgccaa ggacccacga gggatgtatc agtgtaaagg atcacagaac 3361 aagtcaaaac cactccaagt gtattacaga atgtgtcaga actgcattga actaaatgca 3421 gccaccatat ctggctttct ctttgctgaa atcgtcagca ttttcgtcct tgctgttggg 3481 gtctacttca ttgctggaca ggatggagtt cgccagtcga gagcttcaga caagcagact 3541 ctgttgccca atgaccagct ctaccagccc ctcaaggatc gagaagatga ccagtacagc 3601 caccttcaag gaaaccagtt gaggaggaat tgataagaat tcggatccgc ggccgcgaag 3661 gatctgcgat cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 3721 gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 3781 ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 3841 tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 3901 gctgaagctt cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc cgccgcccta cctgaggccg 3961 ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct cctgaactgc 4021 gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc cggcgctccc 4081 ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc ttgctcaact 4141 ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga tccaagctgt gaccggcgcc 4201 tacgctagat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca 4261 gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg 4321 atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg 4381 ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca 4441 cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt 4501 tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc 4561 ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg 4621 gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg 4681 ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg 4741 tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg 4801 gtgcctgagt cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 4861 ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 4921 ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 4981 tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg 5041 acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg 5101 ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 5161 caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct 5221 ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg 5281 tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc 5341 ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc 5401 cgcctggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 5461 aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac gaaaataaga tctgcttttt 5521 gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta 5581 gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc 5641 cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa 5701 atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa 5761 tgaatatcag agagtgagag gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 5821 aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 5881 tccaaactca 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tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 6781 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 6841 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 6901 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 6961 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 7021 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 7081 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 7141 gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 7201 aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 7261 aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 7321 cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 7381 ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 7441 cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 7501 ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 7561 ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 7621 ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 7681 gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 7741 ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 7801 ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 7861 gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 7921 ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 7981 cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 8041 ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 8101 aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 8161 gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 8221 gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 8281 cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 8341 aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 8401 ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta 8461 actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc 8521 acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact 8581 gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat 8641 gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa 8701 cgacggccag tgccaagctg.

Ejemplo 2: Secuencias de anticuerpos

Generación de secuencias de anticuerpos

La secuencia canónica de polipéptido CD19 humano es el n.° de registro de UniProt P15391 (o P15391-1). La secuencia canónica de polipéptido BCMA humano es el n.° de registro de UniProt Q02223 (o Q02223-1). Se proporcionan polipéptidos de anticuerpo que son capaces de unirse específicamente al polipéptido humano CD19 o el polipéptido humano BCMA o un polipéptido humano FAP o un polipéptido humano BCMA, y fragmentos o dominios de estos. Es posible generar anticuerpos anti-CD19, anti-FAP, anti-CAIX y anti-BCMA utilizando diversas tecnologías (véase, por ejemplo, (Nicholson et ál, 1997). Cuando se utilizan anticuerpos murinos anti-CD19, anti-FAP, anti-CAIX o anti-BCMA como material de partida, se desea la humanización de los anticuerpos murinos anti-CD19, anti-FAP, anti-CAIX o anti-BCMA para el entorno clínico, donde los residuos específicos para ratón pueden inducir una respuesta al antígeno humano anti-ratón (HAMA, por sus siglas en inglés) en sujetos que reciben el tratamiento con la proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP), es decir, el tratamiento con linfocitos T transducidos con las construcciones TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX, o TFP.BCMA. La humanización se logra mediante el injerto de regiones CDR de anticuerpos murinos anti-CD19, anti-FAP, anti-CAIX o anti-BCMA en marcos aceptores de línea germinal humana adecuados, que incluyen opcionalmente otras modificaciones a las regiones CDR y/o marco. Tal como se proporciona en la presente, la numeración de residuos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos siguen a Kabat (Kabat E. A. et ál, 1991; Chothia et ál, 1987).

Generación de scFv

Las IgG humanas o humanizadas anti-CD19, anti-FAP, anti-CAIX o anti-BMCA se utilizan para generar las secuencias scFv para las construcciones TFP. Se obtienen las secuencias de ADN que codifican los dominios V^ly V^hhumanos o humanizados y opcionalmente se optimizan los codones para las construcciones para la expresión en células de Homo sapiens. Se varía el orden en el cual aparecen los dominios V^ly V^hen el scFv (es decir, orientación V^l-V^h, o V^h-V^l) y tres copias de la subunidad «G4S» o «G⁴S» (G⁴S)³conectan los dominios variables para crear el dominio scFv. Las construcciones de plásmidos scFv anti-CD19, anti-FAP, anti-CAIX y anti-BCMA pueden tener etiquetas opcionales Flag, His u otras etiquetas de afinidad y se electroporan en HEK293 u otras líneas celulares de mamífero o ser humano adecuadas y se purifican. Los ensayos de validación incluyen análisis de unión mediante FACS, análisis cinético utilizando Proteon y tinción de las células que expresan CD19.

Se muestran a continuación ejemplos de CDR anti-CD19 o anti-BMCA de dominios V^ly V^hy las secuencias de nucleótidos que los codifican, respectivamente:

Anti-CD19

CDR1 de cadena ligera anti-CD19

Secuencia de codificación: AGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAA (SEQ ID NO: 24).

Secuencia de aminoácidos: RASQDISK (SEQ ID NO: 25).

CDR2 de cadena ligera anti-CD19

Secuencia de codificación: ATCTACCATACATCAAGATTA (SEQ ID NO: 26).

Secuencia de aminoácidos: IYHTSRL (SEQ ID NO: 27).

CDR3 de cadena ligera anti-CD19

Secuencia de codificación: CAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACG (SEQ ID NO: 28).

Secuencia de aminoácidos: QQGNTLPYT (SEQ ID NO: 29).

CDR1 de cadena pesada anti-CD19

Secuencia de codificación: GGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGC (SEQ ID NO: 30).

Secuencia de aminoácidos: GVSLPDYGVS (SEQ ID NO: 31).

CDR2 de cadena pesada anti-CD19

Secuencia de codificación: GTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTC (SEQ ID NO: 32). Secuencia de aminoácidos: VIWGSETTYYNSAL (SEQ ID NO: 33).

CDR3 de cadena pesada anti-CD19

Secuencia de codificación: CATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTAC (SEQ ID NO: 34).

Secuencia de aminoácidos: HYYYGGSYAMDY (SEQ ID NO: 35).

Anti-BCMA

CDR1 de cadena ligera anti-BCMA

Secuencia de codificación-. AAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCAT (SEQ ID NO: 36).

Secuencia de aminoácidos: KSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 37).

CDR2 de cadena ligera anti-BCMA

Secuencia de codificación: AAAGTGAGCAACCGCTTTAGC (SEQ ID NO: 38).

Secuencia de aminoácidos: KVSNRFS (SEQ ID NO: 39).

CDR3 de cadena ligera anti-BCMA

Secuencia de codificación: GCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACC (SEQ ID NO: 40)

Secuencia de aminoácidos: AETSHVPWT (SEQ ID NO: 41).

CDR1 de cadena pesada anti-BCMA

Secuencia de codificación: AAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAAC (SEQ ID NO: 42).

Secuencia de aminoácidos: KASGYSFPDYYIN (SEQ ID NO: 43).

CDR2 de cadena pesada anti-BCMA

Secuencia de codificación: TGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGC (SEQ ID NO: 44).

Secuencia de aminoácidos: WIYFASGNSEYNQKFTG (SEQ ID NO: 45).

CDR3 de cadena pesada anti-BCMA

Secuencia de codificación: CTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTG (SEQ ID NO: 46).

Secuencia de aminoácidos: LYDYDWYFDV (SEQ ID NO: 47).

Región variable de cadena ligera anti-CD19

Secuencia de codificación:

GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGC AAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCAT ACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATT AGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGG GGGGACTAAGTTGGAAATAACA (SEQ ID NO: 48).

Secuencia de aminoácidos:

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLE QEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(SEQ ID NO: 49).

Región variable de cadena pesada anti-CD19

Secuencia de codificación:

GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCT CAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGG AGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTC CAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTAT TACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 50).

Secuencia de aminoácidos:

EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQV FLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 51).

Región variable de cadena ligera anti-BCMA

Secuencia de codificación:

GATATTGTGATGACCCAGACCCCGCTGAGCCTGAGCGTGACCCCGGGCGAACCGGCGAGCATTAGCTGCAAAA GCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCATTGGTATCTGCAGAAACCGGGCCAGAGCCC GCAGCTGCTGATTTATAAAGTGAGCAACCGCTTTAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGC GCGGATTTTACCCTGAAAATTAGCCGCGTGGAAGCGGAAGATGTGGGCGTGTATTATTGCGCGGAAACCAGCCA TGTGCCGTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAAAGC (SEQ ID NO: 52).

Secuencia de aminoácidos:

DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTL KISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIKS(SEQ ID NO: 53).

Región variable de cadena pesada anti-BCMA

Secuencia de codificación:

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCG AGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGG GCTGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGCCGCGTGACCATGACCCGCGAT ACCAGCAGCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTTTTGCGCGA GCCTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO: 54).

Secuencia de aminoácidos:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTS SSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 55).

Fuente de subunidades TCR

Todas las subunidades del complejo de receptor de linfocitos T (TCR) humanos contienen un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular. Un complejo humano TCR contiene el polipéptido CD3-épsilon, el polipéptido CD3-gamma, el polipéptido CD3-delta, el polipéptido CD3-zeta, el polipéptido de cadena alfa de TCR y el polipéptido de cadena beta de TCR. La secuencia canónica de polipéptido CD3-épsilon humano es el n.° de registro de Uniprot P07766. La secuencia canónica de polipéptido CD3-gamma humano es el n.° de registro de Uniprot P09693. La secuencia canónica de polipéptido CD3-delta humano es el n.° de registro de Uniprot P043234. La secuencia canónica de polipéptido CD3-zeta humano es el n.° de registro de Uniprot P20963. La secuencia canónica de cadena alfa de TCR humana es el n.° de registro de Uniprot Q6ISU1. La secuencia canónica de región C de cadena beta de TCR humana es el n.° de registro de Uniprot P01850, una secuencia de región V de cadena beta de TCR es P04435.

La secuencia canónica del polipéptido CD3-épsilon humano es:

MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGS DEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNR KAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (SEQ ID NO: 56).

La secuencia canónica del polipéptido CD3-gamma humano es:

MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAK DPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPND QLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN (SEQ ID NO: 57).

La secuencia canónica del polipéptido CD3-delta humano es:

MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKD KESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQ YSHLGGNWARNK (SEQ ID NO: 58).

La secuencia canónica del polipéptido CD3-zeta humano es:

MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRR EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA LHMQALPPR (SEQ ID NO: 59).

La secuencia canónica de la cadena alfa de TCR humana es:

MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYG PSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVL RLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPG SPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA (SEQ ID NO: 60).

La secuencia canónica de la región C de cadena alfa de TCR humana es:

PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACAN AFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS (SEQ ID NO: 61). La secuencia canónica de CTL-L17 de la región V de cadena alfa de TCR humana es:

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISS IKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL (SEQ ID NO: 62).

La secuencia canónica de la región C de cadena beta de TCR humana es:

EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLS SRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILL GKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF (SEQ ID NO: 63).

La secuencia canónica de CTL-L17 de la región V de cadena beta de TCR humana es:

MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEK SRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL (SEQ ID NO: 64).

La secuencia canónica de YT35 de la región V de cadena beta de TCR humana es:

MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDS GMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV (SEQ ID NO: 65).

Un ejemplo de secuencia de cadena pesada anti-BCMA es:

Generación de TFP a partir de dominios TCR y scFv

Se enlazan de forma recombinante los scFv CD19 o BCMA a CD3-épsilon u otras subunidades TCR (véase 1C) utilizando una secuencia enlazadora, tal como G⁴S, (G⁴S⁾²(G⁴S⁾³o (G⁴S)⁴. Se utilizan diversos enlazadores y configuraciones de scFv. Se utilizaron las cadenas TCR alfa y TCR beta para la generación de TFP, ya sea como polipéptidos de longitud completa o únicamente sus dominios constantes. Se permite cualquier secuencia variable de cadenas TCR alfa y TCR beta para crear TFP.

Vectores de expresión de TFP

Se proporcionan los vectores de expresión que incluyen: un promotor (promotor potenciador de citomegalovirus (CMV)), una secuencia de señal para permitir la secreción, una señal de poliadenilación y terminador de transcripción (gen de la hormona de crecimiento bovina (BGH)), un elemento que permita la replicación episomal y la replicación en procariotas (por ejemplo, origen SV40 y ColE1 u otros conocidos en la técnica) y elementos para permitir la selección (gen de resistencia a la ampicilina y marcador de zeocina).

Preferentemente, la construcción de ácido nucleico que codifica TFP se clona en un vector de expresión lentiviral y se valida la expresión según la cantidad y la calidad de la respuesta de linfocitos T efectores de los linfocitos T transducidos con TFP.CD19 ( «CD19.TFP» o «linfocitos T CD19.TFP» o «TFP.CD19» o «linfocitos T TFP.CD19») como respuesta a las células diana CD19+, los linfocitos T transducidos con TFP.FAP («FAP.TFP» o «linfocitos T FAP.TFP» o «TFP.FAP» o «linfocitos T TFP.FAP») como respuesta a células diana FAP+, linfocitos T transducidos con TFP.CAIX («CAIX.TFP» o «linfocitos T CAIX.TFP» o «TFP.CAIX» o «linfocitos T TFP.CAIX») como respuesta a las células diana CAIX+ o linfocitos T transducidos con TFP.BCMA («BCMA.TFP» o «linfocitos T BCMA.TFP» o «TFP.BCMA» o «linfocitos T TFP.BCMA») como respuesta a las células diana BCMA . Las respuestas de linfocitos T efectores incluyen, de modo no taxativo, expansión celular, proliferación, duplicación, producción de citoquina y lisis de células diana o actividad citolítica (es decir, desgranulación).

Los vectores de transferencia lentiviral TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX o TFP.BCMA se utilizan para producir el material genómico empaquetado en las partículas lentivirales pseudotipadas VSVg. Se mezcla a Dn de vector de transferencia lentiviral con los tres componentes de empaquetado de VSVg, gag/pol y rev combinados con reactivo Lipofectamina para transfectarlos en células 293. Después de 24 y 48 horas, se recolecta el medio, se filtra y se concentra mediante ultracentrifugación. Se almacena la preparación vírica resultante a -80C. Se determina la cantidad de unidades de transducción mediante titulación en células SupT1. Los linfocitos T TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX o TFP.BCMA redirigidos se producen mediante la activación de linfocitos T sin tratamiento frescos con microesferas anti-CD3x anti-CD28 durante 24 hrs y después la adición de la cantidad adecuada de unidades de transducción para obtener el porcentaje deseado de linfocitos T transducidos. Se permite que estos linfocitos T modificados se expandan hasta que reposen y disminuyan de tamaño, en cuyo momento se criopreservan para análisis posterior. Las cantidades y tamaños de células se miden utilizando coulter multisizer III. Antes de la criopreservación, se determina el porcentaje de células transducidas (que expresan TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX o TFP.BCMA en la superficie celular) y su intensidad de fluorescencia relativa de esa expresión mediante análisis con citometría de flujo. A partir de las gráficas de histogramas, se examinan los niveles de expresión relativa de las TFP al comparar el porcentaje transducido con su intensidad fluorescente relativa.

En algunas modalidades, se introducen múltiples TFP mediante transducción de linfocitos T con múltiples vectores virales.

Evaluación de actividad citolítica, capacidades de proliferación y secreción de citoquina de linfocitos T humanizados redirigidos con TFP

Se determinan las capacidades funcionales de los linfocitos T TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX o TFP.BCMA para producir TFP expresadas en la superficie celular y para eliminar células tumorales diana, proliferar y secretar citoquinas utilizando ensayos conocidos en la técnica.

Se tratan PBMC humanas (por ejemplo, sangre de un donante con aféresis normal cuyos linfocitos T sin tratamiento se obtienen mediante selección negativa para linfocitos T, linfocitos CD4+ y CD8+) con interleucina 2 humana (IL-2), después se activan con microesferas anti-CD3x anti-CD28, por ejemplo, en RPMI al 10 % a 37 °C, CO²al 5 % antes de la transducción con los vectores lentivirales que codifican TFP. Se utilizan los ensayos de citometría de flujo para confirmar la presencia en la superficie celular de una TFP, tal como mediante un anticuerpo anti-FLAG o un anticuerpo de dominio variable anti-murino. La producción de citoquina (por ejemplo, IFN-y) se mide utilizando ELISA u otros ensayos.

Ejemplo 3: Eficacia de linfocitos T TFP humanos en un modelo de ratón de LLA humana

Es posible cultivar células de LLA humanas primarias en ratones inmunodeprimidos (por ejemplo, NSG o NOD) sin tener que cultivarlas in vitro. Asimismo, las líneas celulares de LLA humanas cultivadas pueden inducir la leucemia en tales ratones. Es posible utilizar los ratones que tienen LLA para evaluar la eficacia de linfocitos T humanos TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX o TFP.BCMA, por ejemplo, en el modelo HALLX5447. La lectura en este modelo es la supervivencia de los ratones después de infusión intravenosa (i.v.) de células LLA en ausencia y en presencia de linfocitos T humanos TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX o TFP.BCMA administrados de forma i.v..

Ejemplo 4: Tratamiento con linfocitos T TFP humanos en un modelo de ratón con xenoinjerto de tumor sólido In Vivo

La eficacia de los linfocitos T humanos TFP.CD19 o TFP.BCMA se pueden evaluar también en modelos de ratón con inmunosupresión que tienen tumores sólidos subcutáneos derivados de líneas celulares humanas de LLA, LLC o NHL que expresan CD19 o BCMA. El encogimiento tumoral como respuesta al tratamiento con linfocitos T humanos TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX o TFP.BCMA puede evaluarse ya sea mediante medición con calibrador de tamaño tumoral o mediante el seguimiento de la intensidad de una señal de fluorescencia GFP emitida por células tumorales que expresan GFP.

Las células de tumores sólidos humanas primarias se pueden cultivar en ratones inmunosuprimidos sin tener que cultivarlas in vitro. Los ejemplos de células de cánceres sólidos incluyen líneas celulares de tumores sólidos, tales como las que se proporcionan en The Cancer Genome Atlas (TCGA) y/o la Broad Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE, véase, Barretina et ál., Nature 483:603 (2012)). Los ejemplos de células de cánceres sólidos incluyen células tumorales primarias aisladas de carcinoma de células renales, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de cuello uterino, cáncer cerebral, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de riñón o de estómago. Es posible utilizar estos ratones para evaluar la eficacia de los linfocitos T TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX o TFP.BCMA en los modelos de xenoinjerto de tumores humanos (véase, por ejemplo, Morton et ál., Nat. Procol. 2:247 (2007)). Después de un implante o inyección de células primarias 1x106-1x107 (suspensiones tumorales en volumen tratadas con colagenasa en material de matriz ^eC) o fragmentos tumorales (fragmentos de tumores primarios en material de matriz EC) de forma subcutánea, se permite que los tumores crezcan a 200-500 mm3 antes del inicio del tratamiento.

Ejemplo 5: Demostración de polipéptidos TFP multiplexados y uso de linfocitos T humanizados multiplexados, redirigidos con TFP

Los polipéptidos TFP que se proporcionan en la presente son capaces de asociarse de forma funcional con polipéptidos de subunidades ^tC^rendógenas para formar complejos TCR funcionales. Aquí, se utilizan múltiples TFP en vectores lentivirales para transducir linfocitos T para crear un complejo TCR recombinante funcional y multiplexado. Por ejemplo, se proporciona un linfocito T que contiene i) una primera TFP que tiene un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular del polipéptido CD3-delta y un fragmento de anticuerpo scFv específico para CD19, FAP, CAIX o BCMA y ii) una segunda t Fp que tiene un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular del polipéptido CD3-gamma y un fragmento de anticuerpo específico para CD19, FAP, CAIX o BCMA. La primera TFP y la segunda TFP son capaces de interactuar entre sí y con polipéptidos de subunidades de TCR endógenas, lo que forma de este modo un complejo TCR funcional.

El uso de estos linfocitos T humanizados multiplexados TFP.CD19, TFP.FAP, TFP.CAIX o TFP.BCMA se demuestra en tumores líquidos y sólidos, tal como se proporcionan en los Ejemplos 2 y 3 anteriormente.

Ejemplo 6: Preparación de linfocitos T transducidos con TFP

Producción lentiviral

Se prepararon lentivirus que codifican las construcciones adecuadas tal como a continuación. Se sembraron 5x106 células HEK293FT en una placa de 100 mm y se permitió que alcanzaran 70-90 % de confluencia durante la noche. Se diluyeron 2,5 |jg de los plásmidos de ADN indicados y 20 pl de mezcla de envasado de lentivirus (ALSTEM, n.° de catálogo VP100; véase el apéndice B3) en 0,5 ml de d Me M o de medio Opti-MEM I sin suero y se mezcló suavemente. En un tubo separado, se diluyeron 30 j l del reactivo de transfección NanoFect (ALSTEM, n.° de categoría NF100) en 0,5 ml de DMEM o medio Opti-MEM I sin suero y se mezcló suavemente. Se mezclaron después las soluciones NanoFect/DMEM y ADN/DMEM y se sometieron a agitación vorticial durante 10-15 segundos antes de la incubación de la mezcla DMEM-plásmidos-NanoFect a temperatura ambiente durante 15 minutos. El complejo de transfección completa de la etapa previa se agregó por goteo a la placa de células y se sacude para dispersar el complejo de transfección de forma uniforme en la placa. Después se incuba la placa durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada de CO²al 5 %. Al día siguiente, se remplaza el sobrenadante con 10 ml de medio fresco y se complementa con 20 j l de ViralBoost (500x, ALSTEM, n.° de categoría VB100). Después se incuban las placas a 37 °C durante 24 horas adicionales. Después se recolectó el sobrenadante que contiene lentivirus en un tubo centrífugo cónico estéril de 50 ml con tapa y se puso en hielo. Después de la centrifugación a 3000 rpm durante 15 minutos a 4 °C, se filtró el sobrenadante limpio con un filtro estéril de 0,45 jm con baja unión a proteínas y se aisló posteriormente un virus mediante ultracentrifugación a 25.000 rpm (Beckmann, L8-70M) durante 1,5 horas, a 4 °C. Se eliminó el sedimento y se volvió a suspender en medio DMEM y se establecieron las concentraciones/titulaciones de lentivirus mediante RT-PCR cuantitativa, utilizando el kit de titulación Lenti-X qRT-PCR (Clontech; número de catálogo 631235). Se eliminó cualquier ADN plásmido residual mediante tratamiento con DNasal. Se utilizó la preparación madre de virus para infección inmediatamente o en alícuotas y se almacenó a -80 °C para uso futuro.

Es posible llevar a cabo experimentos similares con construcciones FAP.TFP y CAIX.TFP.

Aislamiento de PBMC

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre entera o la capa leucocitaria. Se recolectó sangre entera en vacutainers de 10 ml de heparina y se procesó inmediatamente o se almacenó durante la noche a 4 °C. Se mezclaron aproximadamente 10 ml de sangre entera anticoagulada con solución amortiguadora salina amortiguada con fosfato (PBS) para un volumen total de 20 ml en un tubo centrífugo cónico de 50 ml (PBS, pH 7,4, sin Ca2+/Mg2+). Después se superpusieron 20 ml de esta mezcla de sangre/PBS suavemente en la superficie de 15 ml de Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, 17-1440-03) antes de la centrifugación a 400g durante 30-40 min a temperatura ambiente sin aplicación de pausas.

Se adquirió la capa leucocitaria de Research Blood Components (Boston, MA). Se prepararon tubos Leucosep (Greiner bio-one) mediante la adición de 15 ml Ficoll-Paque (GE Health Care) y se centrifugó a 1000g durante 1 minuto. Se diluyó la capa leucocitaria 1:3 en PBS (pH 7,4, sin Ca2+ o Mg2+). Se transfirió la capa leucocitaria diluida al tubo Leucosep y se centrifugó a 1000g durante 15 minutos sin aplicación de pausas. La capa de células que contenían células mononucleares de sangre periférica (PBMC), que se observa en la interfaz de plasma diluido/Ficoll, se eliminó cuidadosamente para minimizar la contaminación por Ficoll. Se eliminaron después Ficoll, plaquetas y proteínas de plasma mediante lavado de las PBMC tres veces con 40 ml de PBS mediante centrifugación a 200g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después, se contaron las células con un hemocitómetro. Se lavaron las PBMC lavadas una vez con medio con CAR-T (AIM V-AlbuMAX (BSA) (Life Technologies), con suero AB al 5 % y 1,25 pg/ml de anfotericina B (Gemini Bioproducts, Woodland, CA), 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina). De manera alternativa, se transfirieron PBMC lavadas a viales aislados y se congelaron a -80 °C durante 24 horas antes de almacenarse en nitrógeno líquido para uso posterior.

Activación de linfocitos T

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre entera o capa leucocitaria estimuladas con microesferas magnéticas conjugadas con anticuerpo CD3 y CD28 anti-humanos durante 24 horas antes de la transducción viral. Se lavaron una vez PBMC aisladas recientemente en medio CAR-T (AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies), con suero AB al 5 % y 1,25 pg/ml de anfotericina B (Gemini Bioproducts), 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) sin huIL-2, antes de volver a suspenderlas a una concentración final de 1x106 células/ml en medio CAR-T con 300 lU/ml de IL-2 humana (de una solución madre 1000x; Invitrogen). Si las PBMC se congelaron anteriormente, se descongelaron y se volvieron a suspender a 1x107 células/ml en 9 ml de medio cDMEM precalentado (37 °C) (Life Technologies), en presencia de FBS al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina, a una concentración de 1x106 células/ml antes de lavarse una vez en un medio CARt , volver a suspenderse a 1x106 células/ml en medio CAR-T y agregar IL-2, tal como se describió anteriormente.

Antes de la activación, se lavaron tres veces microesferas magnéticas conjugadas de anticuerpo CD28 y CD3 anti humano (Invitrogen) con 1 ml de PBS estéril 1x (pH7,4), utilizando un bastidor magnético para aislar las microesferas de la solución, antes de volver a suspender en un medio CAR-T, con 300 lU/ml de IL-2 humana, hasta una concentración final de 4x107 microesferas/ml. Se mezclaron después las PBMC y las microesferas a una proporción de microesfera respecto a célula de 1:1, mediante transferencia de 25 pl (1x106 microesferas) de microesferas a 1 ml de PBMC. Después se administró la cantidad deseada de alícuotas a pocillos individuales de una placa de cultivo celular sin tratar o de poca unión de 12 pocillos y se incubó a 37 °C, con CO²al 5 %, durante 24 horas antes de la transducción viral.

Transducción/transfección de linfocitos T y expansión

Después de la activación de las células PBMC, se incubaron durante 24 horas a 37 °C, CO²al 5 %. Se descongeló el lentivirus en hielo y se agregaron 5x106 lentivirus, junto con 2 pl de Transplus (Alstem) por ml de medio (una dilución final de 1:500) a cada pocillo de 1x106 células. Se incubaron células durante 24 horas adicionales antes de repetir la adición del virus. De manera alternativa, se descongeló lentivirus en hielo y se agregó el virus respectivo a 5 o 50 MOI en presencia de 5 pg/ml de polibreno (Sigma). Se espinocularon células a 100g durante 100 minutos a temperatura ambiente. Después se cultivaron células en presencia continua de 300 IU/ml de IL-2 humana durante un período de 6-14 días (el tiempo total de incubación depende de la cantidad final de linfocitos T CAR necesaria). Se analizaron las concentraciones celulares cada 2-3 días, agregando medio en ese momento para mantener la suspensión celular a 1x106 células/ml.

En algunos casos, se electroporaron PBMC activadas con ARNm transcrito in vitro (IVT, por sus siglas en inglés) (FIG. 14). Se estimularon las PBMC humanas con microesferas Dyna (ThermoFisher) a una proporción de 1 a 1 durante 3 días en presencia de 300 IU/ml de IL-2 recombinante humana (R&D System). Se eliminaron las microesferas antes de la electroporación. Se lavaron las células y se volvieron a suspender en un medio OPTI-MEM (ThermoFisher) a la concentración de 2,5x107 células/ml. Se transfirieron 200 pl de la suspensión celular (5x106 células) a las cubetas de electroporación Plus™ con 2 mm de espacio (Harvard Apparatus BTX) y se preenfriaron en hielo. Se agregó 10 pg de ARNm TFP IVT a la suspensión celular. La mezcla de ARNm/células se electroporó después a 200 V durante 20 milisegundos utilizando ECM830 Electro Square Wave Porator (Harvard Apparatus BTX). Inmediatamente después de la electroporación, se transfirieron las células a medio de cultivo celular fresco (AIM V AlbuMAX (BSA) medio sin suero suero AB humano al 5 % 300 IU/ml IL-2) y se incubó a 37 °C.

Verificación de la expresión de TFP mediante tinción celular

Después de la transducción lentiviral o la electroporación de ARNm, se confirmó la expresión de CAR y TFP anti-CD19, anti-FAP, anti-CAIX y anti-BCMA mediante citometría de flujo, utilizando un anticuerpo Fab anti-ratón para detectar el scFv murino anti-CD19, anti-FAP, anti-CAIX o anti-BCMA. Se lavaron los linfocitos T tres veces en 3 ml de amortiguador de tinción (PBS, BSA al 4 %) y se volvieron a suspender en PBS a 1x106 células por pocillo. Para la exclusión de células muertas, se incubaron células con Live Dead Aqua (Invitrogen) durante 30 minutos en hielo. Se lavaron las células dos veces con PBS y se volvieron a suspender en 50 pl de amortiguador de tinción. Para bloquear los receptores de Fc, se agregó 1 pl de IgG de cabra normal diluida 1:100 (LifeTechnologies) a cada tubo y se incubó en hielo durante 10 minutos. Se agregó 1,0 ml de amortiguador FACS a cada tubo, se mezcló bien y se sedimentaron las células mediante centrifugación a 300g durante 5 min. Se detectó la expresión superficial de las TFP scFv mediante anticuerpos de cabra anti-ratón-F(ab)²policlonales marcados con biotina (Life Technologies) con anticuerpos de IgG de cabra policlonales normales marcados con biotina (Life Technologies) que sirven como control de isotipo. Se agregaron ambos anticuerpos a 10 pg/ml en un volumen de reacción de 100 pl. Después se incubaron las células a 4 °C durante 45 minutos, se lavaron una vez, se volvieron a suspender en amortiguador FACS y se bloquearon con IgG de ratón normal (Invitrogen) mediante la adición de 100 pl de IgG de ratón normal diluida 1:1000 a cada tubo. Después se incubaron las células en hielo durante 10 minutos, se lavaron con amortiguador de tinción y se volvieron a suspender en 100 pl de amortiguador de tinción. Después se tiñeron las células mediante la adición de 1,0 pl de estreptavidina marcada con ficoeritrina (PE) (BD Biosciences) y se agregaron el anticuerpo anti-humano CD3 APC (Clon-UCHT1, BD Biosciences), el anticuerpo anti-humano CD8 PerCP/Cy5.5 (Clon SK1, BD Biosciences) y el anticuerpo anti-humano CD4 Pacific Blue (Clon RPA-T4, BD Biosciences) a cada tubo. Se llevó a cabo una citometría de flujo utilizando LSRFortessa™ X20 (BD Biosciences) y se adquirieron los datos utilizando el software Diva FACS y se analizó con FlowJo (Treestar, Inc. Ashland, OR). Entre 20 % y 40 % de los linfocitos T transducidos expresaron CAR anti-CD19, TFP LL anti-CD19, TFP SL anti-CD19 o TFP anti-BCMA, lo que indica niveles comparables de transducción y expresión superficial de construcciones CAR y TFP (FIG. 5-7).

Ejemplo 7: Ensayo de citotoxicidad mediante citometría de flujo

Se marcaron las células diana que fueron positivas o negativas para las respectivas dianas CD19, FAP, CAIX o BCMA, con el tinte fluorescente carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE). Estas células diana se mezclaron con linfocitos T efectores que no se transdujeron, se transdujeron con construcciones CAR-T de control o se transdujeron con TFP. Después del período de incubación indicado, se determinó el porcentaje de células diana marcadas con CFSE vivas respecto a las muertas y las células diana de control negativo para cada cultivo celular efector/diana mediante citometría de flujo. El porcentaje de supervivencia de células diana en cada cultivo de células diana linfocitos T se calculó respecto a los pocillos que contenían únicamente células diana.

Se midió la actividad citotóxica de los linfocitos T efectores al comparar la cantidad de células diana supervivientes en células diana con o sin linfocitos T efectores, seguido por la incubación conjunta de las células efectoras y diana, utilizando citometría de flujo. En experimentos con TFP CD19 o linfocitos CAR-T, las células diana fueron células Raji de linfoma de Burkitt positivas para CD19 (ATCC, CCL-86), mientras que las células utilizadas como control negativo fueron células K562 negativas para CD19 (ATCC, CCL-243). En experimentos con linfocitos T TFP BCMA, las células diana fueron células de plasmacitoma/mieloma RPMI-8226 positivas para BCMA (ATCC, CCL-155), mientras que las células utilizadas como control negativo fueron células Raji de linfoma de Burkitt negativas para BCMA (ATCC, CCL-86).

Se lavaron una vez las células diana y se volvieron a suspender en PBS a 1*106 células/ml. Se agregó el tinte fluorescente carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE) (ThermoFisher) a la suspensión celular a una concentración de 0,03 pM y se incubaron las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción de marcado mediante la adición a la suspensión celular de medio de cultivo celular completo (RPMI-1640 HI-FBS al 10 %) al volumen 5 veces el volumen de reacción y se incubaron las células durante 2 minutos adicionales a temperatura ambiente. Se sedimentaron las células mediante centrifugación y se volvieron a suspender en medio de citotoxicidad (RPMI1640 sin rojo de fenol (Invitrogen) más suero AB al 5 % (Gemini Bioproducts) a 2x105 células/ml. Se agregaron cincuenta microlitros de suspensión de células diana marcadas con CFSE (equivalente a 10.000 células) a cada pocillo de la placa de fondo den U de 96 pocillos (Corning).

Se transdujeron linfocitos T efectores con construcciones TFP BCMA, junto con linfocitos T no transducidos como controles negativos, se lavaron y se suspendieron a 2x106 células/ml, o 1x106 células/ml en medio de citotoxicidad. Se agregaron 50 pl de suspensiones de linfocitos T efectores (equivalente a 100.000 o 50.000 células) a las células diana en placas para alcanzar la proporción efectores respecto a dianas de 10 a 1 o de 5 a 1, respectivamente, en un volumen total de 100 pl. Después se mezclaron los cultivos, se centrifugaron y se incubaron durante 4 horas a 37 °C, CO²al 5 %. Inmediatamente después de esta incubación, se agregó 7AAD (7-aminoactinomicina D) (BioLegend) a las células cultivadas tal como lo recomienda el fabricante y se llevó a cabo citometría de flujo con un BD Fortessa X-20 (BD Biosciences). Se llevó a cabo un análisis de los datos de citometría de flujo utilizando el software FlowJo (TreeStar, Inc.).

Se calculó el porcentaje de supervivencia para las células diana RPMI-8226 mediante la división de la cantidad de células diana vivas RPMI-8226 (CFSE+7-AAD-) en la muestra con linfocitos T efectores y células diana entre la cantidad de células RPMI-8226 (CFSE+7-AAD-) vivas en la muestra con células diana solas. Se calculó la citotoxicidad para las células efectoras como el porcentaje de eliminación para RPMI-8226 = 100 % - porcentaje de supervivencia de las células RPMI-8226.

Tal como se describió anteriormente, los linfocitos T transducidos con una construcción CAR anti-CD19 28Z demostraron citotoxicidad contra los linfocitos B Raji que expresan CD19, cuando se los compara con los linfocitos T que no fueron transducidos o que fueron transducidos con un control CAR no específico para CD19 (FIG. 8). Sin embargo, los linfocitos T transducidos con anti-CD19-CD3£ indujeron una citotoxicidad más eficiente contra las dianas Raji que el control CAR anti-CD19 en todas las proporciones efector:diana analizadas. Las TFP anti-CD19-CD3y también mediaron una citotoxicidad potente que fue mayor que la observada con CAR anti-CD19 en las proporciones efector:diana de entre 5 y 10:1 (FIG. 8). Se observó cierta citotoxicidad con TFP anti-CD19-TCRa y anti-CD19-TCRp. Se obtuvieron resultados similares con TFP anti-CD19 construidas con una región bisagra alternativa. Una vez más, la citotoxicidad contra células diana Raji que expresan CD19 fue mayor con linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19-CD3£ o anti-CD19-CD3Y que con linfocitos T transducidos con CAR anti-CD19. Los linfocitos T electroporados con ARNm que codifica TFP específicas para CD-19 también demostró una citotoxicidad potente contra células Raji que expresan CD19. Si bien no se observó una eliminación significativa de células K562 negativas para CD19 con ninguna de las construcciones TRuC anti-CD19 o de control, se observó una eliminación específica para CD19 de Raji mediante linfocitos T transducidos con TRuC SL anti-CD19-CD3Y o SL anti-CD19-CD3£ (FIG. 14).

Los linfocitos T transducidos con TFP específicos para el antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA) también demostraron una citotoxicidad potente contra células RPMI8226 que expresan BCMA. Los linfocitos T transducidos con TFP anti-BCMA-CD3£ o anti-BCMA-CD3Y mediaron eficientemente la citotoxicidad contra las células diana RPMI8226 que expresan BCMA. A una proporción de 10:1 de efectoras respecto a células diana, casi el 100 % de las células diana fue eliminado (FIG. 9).

Ejemplo 8: Citotoxicidad mediante ensayo de citotoxicidad en tiempo real

Las TFP anti-CD19 y anti-BCMA también demostraron una citotoxicidad superior respecto a los CAR anti-CD19 en el formato de ensayo de citotoxicidad en tiempo real (RTCA, por sus siglas en inglés). El ensayo RTCA mide la impedancia eléctrica de una monocapa celular diana adherente en cada pocillo de una placa especializada de 96 pocillos en tiempo real, y presenta la lectura final como un valor llamado índice celular. Los cambios en el índice celular indican alteraciones en la monocapa celular diana, producto de la eliminación de células diana mediante efectores de linfocitos T incubados de forma conjunta. Por tanto, la citotoxicidad de los linfocitos T efectores se puede evaluar como el cambio en el índice celular de los pocillos tanto con células diana como linfocitos T efectores, en comparación con el de los pocillos solamente con células diana.

Las células diana para RTCA fueron células HeLa que expresan CD19 (CD19-HeLa) o BCMA (BCMA-HeLa) con células HeLa originales, no transducidas como controles negativos. Se sintetizó el ADN que codifica CD19 o BCMA humano de longitud completa mediante GeneArt (ThermoFisher) y se insertó en el sitio de clonación múltiple del vector lentiviral de promotor dual pCDH514B (System Bioscience) que porta neomicina como marcador de selección, bajo el control de un promotor EFla. Después se empaquetó el lentivirus que porta el vector codificante de CD19 o BCMA. Se transdujeron células HeLa con lentivirus CDl9 o BCMA durante 24 horas y después se seleccionaron con G418 (1 mg/mL). Se confirmó la expresión de CD19 o BCMA mediante CD19-Hela o BCMA-HeLa transducidas a través de análisis FACS con anticuerpos CD19 o BCMA anti-humanos (BioLegend, clon n.° 19A2; Miltenyi, clon .° REA315).

Se cultivaron células diana adherentes en DMEM, FBS al 10 %, antibiótico-antimicótico al 1 % (Life Technologies). Para preparar RTCA, se agregaron 50 pl de medio RPMI en los pocillos adecuados de una placa E (ACEA Biosciences, Inc, n.° catálogo: JL-10-156010-1A). Después se colocó la placa en un instrumento RTCA MP (ACEA Biosciences, Inc.) y se ingresaron la disposición adecuada de placa y el programa del ensayo al software RTCA 2.0 tal como se describe en el manual de los fabricantes. Se llevaron a cabo mediciones de referencia cada 15 minutos para 100 mediciones. Después se agregaron 1x104 células diana en un volumen de 100 pl a cada pocillo de ensayo y se permitió que las células se asentaran durante 15 minutos. Se devolvió la placa al lector y se retomaron las lecturas.

Al día siguiente, se lavaron los linfocitos T efectores y se volvieron a suspender en medios de citotoxicidad (RPMI1640 sin rojo de fenol (Invitrogen) más suero AB al 5 % (Gemini Bioproducts; 100-318)). Después se quitó la placa del instrumento y los linfocitos T efectores, suspendidos en medio de citotoxicidad (RPMI1640 sin rojo de fenol suero AB al 5 %), se agregaron a cada pocillo a 100.000 células o 50.000 células para alcanzar la proporción efector respecto a diana de 10 a 1 o 5 a 1, respectivamente. Después se colocó la placa nuevamente en el instrumento. Se llevó a cabo la medición cada 2 minutos para 100 mediciones y después cada 15 minutos para 1000 mediciones.

En el ensayo RTCA, se observó eliminación de HeLa transducidas por CD19 mediante linfocitos T transducidos con linfocitos T transducidos con CAR anti-CD19-28Z, tal como se demostró mediante una disminución dependiente del tiempo en el índice celular seguido por la adición de las células efectoras respecto a HeLa solas o HeLa incubadas conjuntamente con linfocitos T transducidos con una construcción CAR de control (FIG. 11). Sin embargo, la eliminación de células diana mediante linfocitos T que expresan TFP anti-CD19-CD3£ o anti-BCMA-CD3Y fue más profunda y más rápida que lo observado con el CAR anti-CD19. Por ejemplo, dentro de 4 horas de adición de linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19-CD3£, básicamente se completó la eliminación de las células diana que expresan CD19. Se observó poca eliminación o nada de esta con los linfocitos T transducidos con una cantidad de construcciones TFP que comprenden otras construcciones CD3 y TCR. Se obtuvieron resultados similares con TFP anti-CD19 construidas con una región bisagra alternativa. La citotoxicidad contra células diana HeLa transducidas con CD19 nuevamente fue mayor con linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19-CD3£ o anti-CD19-CD3Y que con linfocitos T transducidos con CAR anti-CD19.

Los linfocitos T transducidos con TFP anti-BCMA también demostraron una citotoxicidad potente contra las células RPMI8226 que expresan BCMA. Tal como se muestra en la FIGURA 9, los linfocitos T transducidos con TFP antiBCMA-CD3e o anti-BCMA-CD3Y mediaron eficientemente la citotoxicidad contra las células diana RPMI8226 que expresan BCMA. A una proporción de efector respecto a diana de 10:1, se eliminó casi el 100 % de las células diana (FIGURA 12).

La actividad citotóxica de los linfocitos T transducidos con TFP fue dependiente de la dosis con respecto a la cantidad de virus (MOI) utilizada para la transducción. El aumento de eliminación de CD19-HeLa se observó con un aumento de MOI de lentivirus TFP anti-CD19-CD3£, lo que refuerza adicionalmente la relación entre la transducción por TFP y la actividad citotóxica (FIGURA 13).

Ejemplo 9: Secreción de IL-2 e IFN-v mediante ELISA

Otra medida de la activación de linfocitos T efectores asociada con el reconocimiento de células que portan el antígeno afín es la producción de citoquinas efectoras, tales como la interleucina 2 (IL-2) e interferón gamma (IFN-^y).

Se llevaron a cabo ensayos ELISA para IL-2 humana (n.° de catálogo EH2IL2, Thermo Scientific) e IFN-y n.° de catálogo KHC4012, Invitrogen) tal como se describe en los prospectos de los productos. Brevemente, se agregaron 50 |jl de muestras o estándares reconstituidos por duplicado a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, seguido por 50 j l de reactivo de anticuerpo biotinilado. Se mezclaron las muestras mediante golpeteo suave de la placa varias veces. Después se agregaron 50 j l de diluyente estándar a todos los pocillos que no contenían muestras o estándares y se selló cuidadosamente la placa con una cubierta de placa adhesiva antes de la incubación durante 3 horas a temperatura ambiente (20-25 °C). Después se quitó la cubierta de placa, se vació el contenido de la placa y se rellenó cada pocillo con amortiguador de lavado. Este procedimiento de lavado se repitió un total de 3 veces y se transfirió la placa en toallas de papel u otro material absorbente. Se agregaron 100 j l de solución estreptavidina-HRP preparada a cada pocillo y se fijó una nueva cubierta de placa antes de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después se volvió a quitar la cubierta de placa, se descartó el contenido de la placa y se agregaron 100 j l de solución de sustrato ^tM^ben cada pocillo. Se permitió que la reacción se transformara a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos, después de lo cual se agregaron 100 j l de solución de cese de reacción en cada pocillo. Evaluación de la placa. Se midió la absorbancia en un lector de placas ELISA establecido a 450 nm y 550 nm dentro de 30 minutos del cese de la reacción. Se restaron valores de 550 nm de los valores de 450 nm y se calcularon las cantidades de IL-2 en muestras desconocidas respecto a los valores obtenidos de una curva estándar de IL-2.

De manera alternativa, se llevaron a cabo ensayos 2 Plex utilizando el kit de reactivo amortiguador magnético de citoquina humana (Invitrogen, LHB0001M) con el kit de microesferas magnéticas para IL-2 humana (Invitrogen, LHC0021M) y el kit de microesferas magnéticas para IFN-^yhumano (Invitrogen, LHC4031M). Brevemente, se agregaron 25 j l de microesferas de anticuerpos para IL-2 e IFN-^yhumanos a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se lavó utilizando las siguientes pautas: dos lavados de 200 j l 1x con solución de lavado, colocar la placa en contacto con un separador magnético de placas de 96 pocillos (Invitrogen, A14179), permitir que las microesferas se asienten durante 1 minuto y decantar el líquido. Después, se agregaron 50 j l de amortiguador de incubación a cada pocillo de la placa con 100 j l de estándares reconstituidos por duplicado o 50 j l de muestras (sobrenadantes de ensayos de citotoxicidad) y 50 j l de diluyente de ensayo, por triplicado, para un volumen total de 150 jl. Se mezclaron las muestras en la oscuridad a 600 rpm con un agitador orbital con un radio de órbita de 3 mm durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavó la placa siguiendo las mismas pautas de lavado y se agregaron 100 j l de anticuerpo detector biotinilado con IL-2 e IFN-y a cada pocillo. Se mezclaron las muestras en la oscuridad a 600 rpm con un agitador orbital con un radio de órbita de 3 mm durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavó la placa siguiendo las mismas pautas de lavado y se agregaron 100 j l de estreptavidina-R-ficoeritrina a cada pocillo. Se mezclaron las muestras en la oscuridad a 600 rpm con un agitador orbital con un radio de órbita de 3 mm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavó la placa 3 veces utilizando las mismas pautas de lavado y después se decantó el líquido, se volvieron a suspender las muestras en 150 j l de solución de lavado 1x. Se mezclaron las muestras a 600 rpm con un agitador orbital con un radio de órbita de 3 mm durante 3 minutos y se almacenó durante la noche a 4 °C. Después, se lavó la placa siguiendo las mismas pautas de lavado y se volvió a suspender las muestras en 150 j l de solución de lavado 1x.

Se leyó la placa utilizando el sistema MAGPIX (Luminex) y el software xPONENT. Se llevó a cabo el análisis de los datos utilizando el software MILLIPLEX Analyst, que proporciona las concentraciones de citoquina y la curva estándar.

La FIGURA 15 muestra que, respecto a linfocitos T transducidos con CAR de control o no transducidos, los linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19 producen niveles mayores tanto de IL-2 como de IFN-y cuando se cultivan junto con células Raji que expresan de forma endógena CD19 o células HeLa transducidas con CD19. En oposición, el cultivo conjunto con células K562 negativas para CD19 o células HeLa no transducidas produce poca liberación de citoquina, o no la produce, a partir de los linfocitos T transducidos con TFP. De forma coherente con los datos de citotoxicidad previos, las TFP anti-CD19 construidas con una región bisagra alternativa generaron resultados similares tras el cultivo conjunto con células diana que portan CD19 (FIGURA 16).

De acuerdo con los datos de citotoxicidad previos, anti-CD19-CD3£ y anti-CD19-CD3Y produjeron los niveles de IL-2 e IFN-y más altos de las construcciones t Fp (FIGURAS 15 y 16). Sin embargo, la producción de citoquina mediante linfocitos T transducidos con TFP anti-CD19-CD3£ y anti-CD19-CD3Y fue comparable con aquella de los linfocitos T que expresan CAR anti-CD19-28Z, a pesar de que las TFP demostraron niveles mucho mayores de eliminación de células diana (FIGURAS. 8 y 11). La posibilidad de que las TFP puedan eliminar de forma más eficaz las células diana que CAR, pero que liberen niveles comparables o menores de citoquinas proinflamatorias, representa una posible ventaja para las TFP respecto a CAR, ya que los niveles elevados de estas citoquinas se han asociado con las toxicidades limitantes de las dosis para las terapias adoptivas CAR-T.

Los linfocitos T transducidos con TFP anti-BCMA-CD3£ o anti-BCMA-CD3Y también produjeron IL-2 e IFN-y tras un cultivo conjunto con BCMA-HeLa pero no con células HeLa de control que no expresaron BCMA (FIGURA 17). Es posible llevar a cabo experimentos similares con construcciones FAP.TFP y CAIX.TFP.

Ejemplo 10: Exposición de CD107a mediante citometría de flujo

Un ensayo adicional para la activación de linfocitos T es la expresión superficial de CD107a, una proteína de membrana asociada al lisosoma (LAMP-1) que se ubica en la membrana de los gránulos citolíticos citoplasmáticos en células en reposo. La desgranulación de los linfocitos T efectores, un requisito previo para la actividad citolítica, produce la movilización de CD107a a la superficie celular, después de la exocitosis de gránulos inducida por activación. Por tanto, la exposición de CD107a proporciona una medida adicional de la activación de linfocitos T, además de la producción de citoquina, que se correlaciona fuertemente con la citotoxicidad.

Se lavaron las células diana y efectoras por separado y se volvieron a suspender en medio de citotoxicidad (RPMI+ suero AB humano al 5 % antibiótico antimicótico al 1 %). Se llevó a cabo el ensayo mediante la combinación de 2x105 células efectoras con 2x105 de células diana en un volumen final de 100 pl en placas con fondo en U de 96 pocillos (Corning), en presencia de 0,5 pl/pocillo de anticuerpo CD107a (LAMP-1) anti-humano marcado con PE/Cy7 (Clon H4A3, BD Biosciences). Después se incubaron los cultivos durante una hora a 37 °C, CO²al 5 %. Inmediatamente después de esta incubación, se agregaron cuidadosamente 10 pl de una dilución 1:10 del inhibidor de secreción monensina (solución 1000x, BD GolgiStop™) a cada pocillo sin alterar las células. Después se incubaron las placas durante 2,5 horas adicionales a 37 °C, CO²al 5 %. Después de esta incubación, se tiñeron las células con anticuerpo CD3 APC anti-humano (Clon UCHT1, BD Biosciences), anticuerpo CD8 PerCP/Cy5.5 anti humano (Clon SK1, BD Biosciences) y anticuerpo CD4 Pacific Blue anti-humano (Clon RPA-T4, BD Biosciences) y después se incubó durante 30 minutos a 37 °C, CO²al 5 %. Después se lavaron las células 2x con amortiguador FACs (y se volvieron a suspender en 100 pl de amortiguador FACS y 100ul de amortiguador IC fix antes del análisis. Se detectó la exposición de CD107a en la superficie de linfocitos T mediante citometría de flujo. Se llevó a cabo una citometría de flujo con un LSRFortessa™ X20 (BD Biosciences) y se llevó a cabo el análisis de los datos de citometría de flujo utilizando el software FlowJo (Treestar, Inc. Ashland, OR). Se determinó el porcentaje de linfocitos T efectores ^cD8+, dentro de la selección CD3, que fueron CD107 positivos para cada cultivo de células efectoras/diana.

De forma coherente con los datos de citotoxicidad y citoquinas anteriores, el cultivo conjunto de células diana que expresan CD19, tales como células Raji o Nalm-6, con linfocitos T efectores transducidos con CAR anti-CD19-28Z indujo un aumento de 3 a 5 veces en la expresión de CD107a en la superficie respecto a las efectoras incubadas con células diana CD19 negativas (FIGURA 18). En comparación, en las mismas condiciones, las efectoras que expresan TFP anti-CD19-CD3£ LL o anti-CD19-CD3Y LL presentaron una inducción de 5 a 7 veces de la expresión de CD107a. Las TFP anti-CD19 construidas con una región bisagra alternativa generaron resultados similares tras cultivo conjunto con células diana que portan CD19.

Respecto a los linfocitos T no transducidos, las células transducidas con TFP anti-BCMA-CD3£ o anti-BCMA-CD3y también presentaron un aumento en la expresión superficial de CD107a tras el cultivo conjunto con células RPMI8226 BCMA positivas (FIGURA 19). Estos resultados indican que los linfocitos T efectores transducidos con TFP se activan y se desgranulan tras la exposición a células diana que expresan su antígeno afín.

Ejemplo 11: Estudios de eficacia en ratones in Vivo

Para evaluar la capacidad de los linfocitos T efectores transducidos con TFP anti-CD19 de lograr respuestas antitumorales in vivo, se transfirieron de manera adoptiva linfocitos T efectores con CAR anti-CD19-28Z, t Fp anti-CD19-CD3£ LL o TFP anti-CD19-CD3Y LL en ratones NOD/SCID/IL-2R/-/-(NSG-JAX) que habían sido inoculados previamente con líneas celulares de leucemia humana Raji o Nalm6 CD19+.

Se obtuvieron ratones hembra NOD/SCID/IL-2Ry- / - (NSG-JAX), al menos de 6 semanas, antes del inicio del estudio de The Jackson Laboratory (número de inventario 005557) y se aclimataron durante 3 días antes del uso experimental. Se mantuvieron las líneas celulares de leucemia humana Raji y Nalm-6 para inoculación en cultivo de fase logarítmica antes de la recolección y el recuento con azul de tripano para determinar un recuento celular viable. El día de exposición tumoral, se centrifugaron las células a 300g durante 5 minutos y se volvieron a suspender en PBS estéril precalentado a 1x106 células/100 pl (Nalm-6) o 5x105 células/100 pl (Raji). Se prepararon linfocitos T para transferencia adoptiva, ya sea no transducidos o transducidos con construcciones CAR anti-CD19-28Z, TFP anti-CD19-CD3£ LL o TFP anti-CD3Y LL. El día 0 del estudio, se expuso a 10 animales por grupo experimental de forma intravenosa con 5x105 de células Raji o 1x106 de células Nalm-6. 3 días después, se transfirieron de forma intravenosa 5x106 de las poblaciones de linfocitos T efectores indicados a cada animal en 100 pl de PBS estéril. Se registraron diariamente observaciones clínicas detalladas en los animales hasta la eutanasia. Se tomaron mediciones del peso corporal a todos los animales semanalmente hasta la muerte o eutanasia. Se practicó la eutanasia a todos los animales 35 días después de la transferencia adoptiva de los artículos de ensayo y de control. Se practicó la eutanasia a todo animal que pareciera moribundo durante el estudio a criterio del director del estudio, consultando con un veterinario.

Respecto a los linfocitos T no transducidos, la transferencia adoptiva de linfocitos T transducidos con CAR anti-CD19-28Z, TFP anti-CD19-CD3£ LL o TFP anti-CD19-CD3Y LL prolongó la supervivencia tanto de ratones con tumores Raji (FIGURA 20A) como de Nalm6 (FIGURA 20B), lo cual indica que tanto CAR anti-CD19 como los linfocitos T transducidos con TFP fueron capaces de mediar la eliminación de células diana con un correspondiente aumento de supervivencia en estos modelos de ratón. De forma conjunta, estos datos indican que las TFP representan una plataforma alternativa para la modificación de receptores quiméricos que demuestren una eliminación superior específica para un antígeno respecto a CAR de primera generación, tanto in vitro como in vivo.

Si bien en la presente se mostraron y se describieron modalidades preferidas de la invención, será evidente para los expertos en la técnica que dichas modalidades se proporcionan únicamente a modo de ejemplo. Se entenderá que es posible emplear varias alternativas equivalentes a las modalidades de la invención que se describieron en la presente al ponerla en práctica. Se pretende que las reivindicaciones siguientes definan el alcance de la invención y que los usos médicos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes se encuentren cubiertos de ese modo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende

(I) un linfocito T humano, en donde el linfocito T comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión del receptor de linfocitos T (TCR) (TFP) que comprende

(a) una subunidad de TCR que comprende

(i) al menos una parte de un dominio extracelular de TCR, y

(ii) un dominio intracelular de TCR que comprende un dominio estimulador de un dominio de señalización intracelular de CD3 épsilon; CD3 gamma, o CD3 delta; y

(b) un dominio de anticuerpo murino, humano o humanizado que comprende un dominio de unión al antígeno;

donde la subunidad de TCR y el dominio de anticuerpo se enlazan de forma operativa, y

donde la TFP se incorpora en un TCR cuando se expresa en un linfocito T; y

(II) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el dominio de unión a antígeno es un dominio de unión anti-CD19 o un dominio de unión anti-antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA).

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio de unión a antígeno está conectado al dominio extracelular de TCR mediante una secuencia enlazadora, en donde, opcionalmente, la secuencia enlazadora codificada comprende (G4S)n, en donde n=1 a 4.

4. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la subunidad de TCR comprende (i) un dominio extracelular de TCR, (ii) un dominio transmembrana de TCR, y (iii) un dominio intracelular de TCR, en donde al menos dos de (i), (ii) y (iii) son de una misma subunidad de TCR, opcionalmente, en donde (i), (ii) y (iii) son de una misma subunidad de TCR.

5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el dominio de anticuerpo murino, humano o humanizado comprende una scFv o un anticuerpo de dominio único, en donde el anticuerpo de dominio único es opcionalmente un dominio V^h.

6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el dominio de unión a antígeno comprende (i) una cadena ligera (LC) CDR1, LC CDR2 y LC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de un dominio de unión de cadena ligera anti-CD19 con el 70-100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:25, la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 29, respectivamente, y/o (ii) una cadena pesada (HC) CDR1, HC CDR2 y HC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de dominio de unión de cadena pesada anti-CD19 con el 70-100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 35, respectivamente.

7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador, opcionalmente, en donde el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional obtenido de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), y 4-1BB (CD137) y las secuencias de aminoácidos de los mismos que tienen al menos una pero no más de 20 modificaciones a las mismas.

8. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el linfocito T es un linfocito T primario.

9. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el linfocito T es un linfocito T CD8+ o CD4+.

10. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el linfocito T comprende adicionalmente un ácido nucleico que codifica al menos una parte de una molécula inhibidora, en donde la al menos una parte de una molécula inhibidora se asocia con un segundo polipéptido que comprende una señal positiva de un dominio de señalización intracelular, opcionalmente, en donde la molécula inhibidora comprende un primer polipéptido que comprende al menos una porción de PD1 y un segundo polipéptido que comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primario.

11. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el linfocito T forma un conjugado con una célula humana que expresa un antígeno que interactúa específicamente con el dominio de unión a antígeno, la producción de IL-2 por el linfocito T aumenta en presencia de una célula humana que expresa un antígeno que interactúa específicamente con el dominio de unión a antígeno, o el linfocito T presenta una elevada citotoxicidad para una célula humana que expresa un antígeno que interactúa específicamente con el dominio de unión a antígeno.

12. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la subunidad de TCR comprende la SEQ ID NO: 56 o la SEQ ID NO: 57.

13. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en un método de tratamiento de un mamífero que tiene una enfermedad.

14. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 13, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad proliferativa, un cáncer, una neoplasia, mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico y una preleucemia.

15. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 13, donde la enfermedad es un cáncer hematológico que se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfoide aguda de linfocitos B (LLA B), leucemia linfoide aguda de linfocitos T (LLA T), leucemia linfoblástica aguda (LLA); leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoblástica crónica (LLC), leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas, linfoma folicular de células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia, síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom, preleucemia, una enfermedad asociada con la expresión de CD19 o BCMA, y combinaciones de estas.