ES2871146T3

ES2871146T3 - Molécula de polipéptido con especificidad dual mejorada

Info

Publication number: ES2871146T3
Application number: ES18740829T
Authority: ES
Inventors: Martin Hofmann; Felix Unverdorben; Sebastian Bunk; Dominik Maurer
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2017-07-14
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2021-10-28
Anticipated expiration: 2038-07-13
Also published as: TWI817302B; SI3428194T1; US20190016803A1; CA3069842A1; CO2020001491A2; CY1124091T1; AU2018298884A1; KR20200026994A; WO2019012141A1; BR112020000769A2; JP2024023385A; WO2019012138A1; EP3985029A1; CO2020001029A2; EP3428194A1; ZA202000842B; JP2020530762A; BR112020000762A2; HUE057110T2; PL3428194T3

Abstract

Una molécula polipeptídica de especificidad doble que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en la cual: a) la primera cadena polipeptídica comprende ai) un primer dominio variable (VD1) de un anticuerpo, aii) un primer dominio variable (VR1) de un receptor de células T (TCR), y aiii) un primer conector (LINK1) que une dichos dominios; b) la segunda cadena polipeptídica comprende bi) un segundo dominio variable (VR2) de un TCR, bii) un segundo dominio variable (VD2) de un anticuerpo, y biii) un segundo conector (LINK2) que une dichos dominios; en la que dicho primer dominio variable (VD1) y dicho segundo dominio variable (VD2) se asocian para formar un primer sitio de unión (VD1)(VD2) que se une específicamente al antígeno situado en la superficie celular de una célula inmunitaria efectora humana; en la que el primer dominio variable (VR1) es uno de un dominio Vα de TCR y un dominio Vβ de TCR, y el segundo dominio variable (VR2) es el otro del dominio Vα de TCR y el dominio Vβ de TCR, dicho primer dominio variable (VR1) y dicho segundo dominio variable (VR2) se asocian para formar un segundo sitio de unión (VR1) (VR2) que se une a un epítopo peptídico viral asociado a MHC; en la que que las dichas dos cadenas polipeptídicas están fusionadas con dominios bisagra de IgG humana y/o dominios Fc de IgG humana o porciones dimerizadas de los mismos; en la que las dichas dos cadenas polipeptídicas están conectadas por enlaces covalentes y/o no covalentes entre dichos dominios bisagra y/o dominios Fc; en la que dicha molécula polipeptídica de especificidad doble es capaz de unirse simultáneamente a la molécula de la superficie celular y al epítopo peptídico asociado al MHC, y en la que el orden de los dominios variables contenidos en las dos cadenas polipeptídicas es seleccionado entre VD1-VR1 y VR2-VD2 o VD2-VR2 y VR1-VD1.

Description

DESCRIPCIÓN

Molécula de polipéptido con especificidad dual mejorada

La presente invención se refiere a una molécula de polipéptido biespecífica que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica que proporciona una región de unión derivada de un receptor de células T (TCR) siendo específica para un epítopo peptídico vírico asociado al complejo principal de histocompatibilidad (MHC), y una región de unión derivada de un anticuerpo capaz de reclutar células efectoras inmunitarias humanas mediante la unión específica a un antígeno de superficie de dichas células, así como métodos para fabricar la molécula de péptido biespecífica, y usos de la misma.

Antecedentes de la invención

Con el desarrollo de la técnica de clonación molecular y la profunda comprensión de la ingeniería de anticuerpos, existen varios formatos de anticuerpos biespecíficos («biespecíficos») entre los cuales se selecciona para lograr la actividad biológica óptima y el propósito clínico. En la terapia contra el cáncer, los anticuerpos biespecíficos se han desarrollado con el fin de redireccionar la actividad de las células efectoras inmunitarias hacia el sitio del tumor mediante un primer dominio de unión específico para un epítopo en células tumorales y un segundo dominio de unión específico para un epítopo en las células efectoras inmunitarias. Se han desarrollado en distintos formatos de anticuerpos biespecíficos para el redireccionamiento de células efectoras inmunitarias, incluidos los formatos sin región de fragmento cristalizable (Fc) y formatos derivados de IgG con diseño simétrico o asimétrico. Además de redireccionar a las células efectoras hacia el sitio del cáncer, se establecieron nuevas aplicaciones para anticuerpos biespecíficos. Es posible desarrollar anticuerpos biespecíficos que puedan inhibir de forma simultánea dos moléculas de señalización correlacionadas para vencer la resistencia inherente o adquirida y para que sean inhibidores más eficientes de la angiogénesis. Además, los anticuerpos biespecíficos pueden utilizarse como fármacos inmunoestimuladores para el tratamiento de diversas enfermedades, como el cáncer. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para tratar la hemofilia A mimetizando la función del factor VIII. Los anticuerpos biespecíficos también tienen amplias perspectivas de aplicación en enfermedades óseas e infecciones y enfermedades del sistema nervioso central (revisado en Yang F. et al. Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies. Int J Mol Sci. 2016 Dec 28; 18[1]).

Las células T expresan complejos de receptores de células T (TCR) que son capaces de inducir respuestas inmunitarias específicas de antígenos. El acoplamiento del péptido antigénico/complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de Clase I en la célula diana con el TCR induce la formación de una sinapsis inmunológica y conduce a la señalización mediante correceptores CD3, que son componentes del complejo de señalización de TCR. Esta cascada de señales dirige la muerte mediada por células T de la célula que expresa el antígeno mediante la liberación y transferencia de granzimas y perforina desde la célula T a la célula diana.

Históricamente, el descubrimiento y la producción de dominios variables de anticuerpos conectados monocatenarios (scFvs, descritos por Bird et al., 1988) sirvieron como motor principal para el desarrollo de anticuerpos biespecíficos. Este concepto finalmente condujo a la generación de moléculas BiTE y su validación clínica como un potente fármaco contra el tratamiento de la leucemia (Baeuerle P.A.; Reinhardt, C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res. 2009, 69, 4941-4944). En el cáncer, los anticuerpos biespecíficos que se coacoplan con la subunidad épsilon CD3 y un antígeno de superficie en la célula tumoral desencadenan la muerte mediada por células T de la célula tumoral en tanto evitan la necesidad de la interacción directa del TCR y el MHC de clase I en el complejo con antígeno. Esto expande el repertorio de las células T capaces de reconocer el tumor y actuar como células efectoras (Baeuerle, P.A.; Reinhardt, C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res.

2009, 69, 4941-4944).

Stieglmaier J., et al. (en: Utilizing the BiTE [bispecific T-cell engager] platform for immunotherapy of cancer. Expert Opin Biol Ther. 2015; 15[8]:1093-9) describen que actualmente se están investigando diversos enfoques de inmunoterapia contra el cáncer basada en células T, entre las cuales se encuentran constructos de anticuerpos BiTE® (engager de células T biespecíficas), que tienen un diseño y mecanismo de acción únicos. Están construidos ligando genéticamente en una única cadena polipeptídica los dominios de unión mínimos de anticuerpos monoclonales para antígenos de superficie asociados al tumor y para la molécula CD3 asociada al receptor de células T. El acoplamiento concurrente del antígeno de la célula diana y CD3 conduce a la activación de células T citotóxicas policlonales, lo que da lugar a la lisis de las células diana. Blinatumomab, una molécula BiTE® direccionada contra CD19, está siendo investigada para un amplio rango de neoplasias de lcélulas B y ha sido aprobada recientemente en los EE. UU. por la FDA contra la leucemia linfoblástica aguda tipo B recidivante/refractaria, negativa para el cromosoma Filadelfia, con el nombre comercial de BLINCYTO™. La plataforma BiTE® es una de las opciones clínicamente más avanzadas para la inmunoterapia con células T.

No obstante, se ha descubierto que entre los inconvenientes de las pequeñas moléculas biespecíficas, como las BiTE®, se incluyen un bajo rendimiento de producción, procesos de purificación dificultosos, propensión a la agregación y una vida media sérica muy breve. Para superar las limitaciones inherentes de esta clase de moléculas, se desarrollaron diversos formatos biespecíficos basados en la IgG humana a partir del diseño del prototipo biespecífico recombinante de anticuerpos semejantes a la inmunoglobulina (Ig)-G como fuera imaginado hace más de dos décadas, cuando Morrison y sus colaboradores fusionaron péptidos conectores flexibles al terminal C de las cadenas pesadas de una IgG, seguidos por dominios variables monocatenarios con distintas especificidades de unión (Coloma, M.J. and Morrison, S.L. [1997] Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol. 15, 159-163). Las moléculas podían diferenciarse de los anticuerpos «normales» en que tenían dualidades funcionales. Inicialmente, las dificultades técnicas obstaculizaron su desarrollo posterior, lo que hizo que los anticuerpos biespecíficos (BsAb) permanecieran como una cuestión de I D, fundamentalmente en los entornos académico y biotecnológico. No obstante, la rápida evolución de las tecnologías que permitían la ingeniería, la producción y el desarrollo de derivados de proteínas recombinantes, combinada con el interés renovado de la industria farmacéutica, renovó el impulso en la investigación de los BsAb. En la actualidad, existen numerosos formatos diferentes de BsAb adecuados y disponibles para el desarrollo de proteínas terapéuticas (para recapitulaciones, véanse Gramer mAbs. 2013;5(6):962-973, Weidle Cancer Genomics Proteomics. 2013 Nov-Dec;10(6):239-50, Brinkmann MAbs. 2017 Feb/Mar;9(2): 182-212). En resumen, la inclusión de partes de Fc (fragmento cristalizable), que consiste en dominios de CH2 y CH3, condujo a un aumento en la productividad, unos procesos de purificación más simples y una mejora de la estabilidad. Asimismo, la vida media sérica de estos fármacos basados en IgG se prolongó debido a i) el aumento del tamaño y ii) la interacción de la parte Fc con el receptor Fc humano FcRn. El desarrollo de los formatos biespecíficos basados en la IgG recibió un impulso adicional con la aparición e incorporación de las mutaciones diseñadas para facilitar la heterodimerización de dos dominios CH3 diferentes y conectar así dos cadenas polipeptídicas distintas. El concepto básico fue introducido por Ridgway JB, et al. (en: “Knobs-into-holes” engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. 1996 Jul; 9[7]:617-21), quienes presentaron el método «botón en ojal» como una estrategia de diseño novodoso y efectivo para la ingeniería genética de homodímeros de cadena pesada de anticuerpos para heterodimerización. En esta estrategia, se obtenía en primer lugar una variante «botón» mediante la sustitución de un aminoácido pequeño por uno de mayor tamaño en el dominio CH3 de una inmunoadhesina CD4-IgG: T366Y. El botón se diseñó para ser insertado en un «ojal» en el dominio CH3 de un anticuerpo anti-CD3 humanizado creado mediante la sustitución razonada de un residuo grande por uno de menor tamaño: Y407T. Después de la coexpresión de estas dos cadenas pesadas junto con la cadena liviana anti-CD3, el híbrido anti-CD3/CD4-IgG representa hasta el 92 % del conjunto de proteínas de la proteína A purificada. En cambio, solo se recuperó hasta el 57 % del híbrido anti-CD3/CD4-IgG después de su coexpresión con las cadenas pesadas con dominios CH3 de tipo silvestre. Así pues, el diseño de botón en ojal facilita la manipulación genética de un híbrido anticuerpo/inmunoadhesina, así como probablemente el de otros fármacos bifuncionales que contienen Fc, incluyendo inmunoadhesinas biespecíficas y anticuerpos biespecíficos. En Atwell et al, 1997, J Mol Biol (Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library) se presenta una mutación de tipo botón en ojal (botón: T366W/ojal: T366S+L368A+Y407V) en el dominio CH3 del dominio Fc para una mejor heterodimerización. Este concepto fue mejorado por la introducción adicional de residuos de cisteína para formar un puente disulfuro estabilizante entre los dominios CH3 heterodiméricos, tal y como se describe en Merchant et al. 1998, Nature Biotechnology (An Efficient Route to Human Bispecific IgG).

Se divulgan conceptos adicionales para la producción de moléculas heterodiméricas en Muda et al. 2011, PEDS (Therapeutic assessment of SEED: a new engineered antibody platform designed to generate mono- and bispecific antibodies); Gunasekaran et al. 2010, J Biol Chem (Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG); Moore et al. 2011, MAbs (A novel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens); Von Kreudenstein et al. 2013, MAbs (Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability: quality by molecular design.). Estos conceptos se encuentran resumidos y revisados por Ha et al.

2016, Front Immunol (Immunoglobulin Fc Heterodimer Platform Technology: From Design to Application in Therapeutic Antibodies and Proteins) y Liu et al. 2017, Front Immunol (Fc Engineering for Developing Therapeutic Bispecific Antibodies and Novel scaffolds).

Con la inclusión de las partes Fc que consisten en bisagras, dominios CH2 y CH3, o partes de los mismos, en moléculas biespecíficas, surgió el problema de la inmovilización inespecífica de estas moléculas inducida por las interacciones del receptor gamma Fc:Fc- (FcgR). Los FcgR están compuestos por distintas moléculas de la superficie celular (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIb, FcgRIII) que se unen con diferentes afinidades a los epítopos presentados por las partes Fc de las moléculas de IgG. Como tal una inmovilización inespecífica (es decir, no inducida por ninguno de los dos dominios de unión de una molécula biespecífica) es desfavorable debido a i) la influencia de una molécula sobre la farmacocinética y ii) la activación en otras regiones de células efectoras inmunitarias, se han identificado numerosas variantes y mutaciones de Fc que eliminan la unión a FcgR.

En Morgan et al. 1995, Immunology (The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, FcyRI and FcyRIII binding) se divulga el intercambio de los residuos 233-236 de la IgG1 humana con la secuencia correspondiente derivada de la IgG2 humana que daba como resultado la supresión de la unión FcgRI, la supresión de la unión C1q y la disminución de la unión FcgRIII.

En el documento EP1075496 se divulgan anticuerpos y otras moléculas que contienen Fc con variaciones en la región Fc (233P, 234V, 235A, y sin residuos o G en la posición 236 y 327G, 330S y 331S) en donde el anticuerpo recombinante es capaz de unirse a la molécula diana sin desencadenar una lisis dependiente del complemento significativa, o una destrucción de la diana mediada por la célula.

Las moléculas con reorientación de doble afinidad (DART) se emplean para lograr, por ejemplo, un redireccionamiento óptimo de las muertes mediadas por células T en el linfoma de células B. La tecnología original de DART se encuentra descrita en Moore et al. (en: Application of doble affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma. Blood. 2011 Apr 28; 117[17]:4542-51). La comparación con los anticuerpos biespecíficos monocatenarios con secuencias Fv de anticuerpos CD19 y CD3 Fv idénticas demostró que las moléculas DART eran más potentes para dirigir la lisis de las células B. Con las moléculas DART-Fc se logró una evolución adicional de la tecnología DARt , tal y como se describe en Root et al, 2016, Antibodies (Development of PF-06671008, a Highly Potent Anti-P-cadherin/Anti-CD3 Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment of Cancer). Esta molécula combinaba la alta potencia de las DART con, entre otras características positivas, la vida media sérica extendida de las moléculas basadas en Fc.

El apTCR (TCR) reconoce péptidos antigénicos presentados por el MHC y es responsable de la especificidad de las células T. Tanto la cadena a como la p del TCR poseen dominios variables (V) y constantes. Los dominios V están involucrados en la unión a péptidos antigénicos y los dominios constantes atraviesan la membrana de las células T. A partir del análisis cristalográfico del TCR unido al complejo péptido-MHC, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) 3 tanto de la cadena Va como de la cadena Vp interactúan preferentemente con el péptido, en tanto los CDR 1 y 2 interactúan con el MHC. No obstante, también se han descrito el reconocimiento del péptido por CDR 1 y el reconocimiento del MHC por CDR 3 (Piepenbrink et al, The basis for limited specificity and MHC restriction i n a T cell receptor interface, Nat Commun, 2013; 4, 1948). El heterodímero TCR ap está estrechamente asociado a las proteínas CD3, CD4 o CD8, así como a otras proteínas de adhesión y transductoras de señales. La unión del péptido antigénico por parte de las regiones V del TCR desencadena la activación de las células T mediante la transducción de señales a través de los dominios constantes del TCR por las proteínas citoplasmáticas CD3 y CD4 o CD8.

Los TCR monocatenarios (scTCR) presentan ventajas significativas respecto del formato de los TCR enteros en lo que tiene que ver con diseño, expresión de proteínas solubles y potencial clínico. Desde la perspectiva de la expresión de proteínas solubles (esto es, producción), los scTCR se producen como una única cadena polipeptídica, evitando el requisito de producir cada cadena de TCR como polipéptidos separados y permitiendo la producción de mayores cantidades del scTCR debidamente ensamblado que se une a su ligando péptido-MHC. Esta característica puede permitir la producción de los volúmenes necesarios para uso clínico. Por último, desde la perspectiva clínica, los scTCR que consisten únicamente en las regiones V (scTv) pueden formatearse como fármacos o reactivos de diagnóstico similares a los fragmentos scFv.

En el documento US 2006-0166875 se describe un receptor de células T monocatenario (scTCR) que comprende un segmento a constituido por una secuencia de una región variable de una cadena a del TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia extracelular de una región constante de una cadena alfa del TCR, un segmento p constituido por una región variable de una cadena p del TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia extracelular de la región constante de la cadena p del TCR y una secuencia de conexión que conecta el extremo C terminal del segmento a al extremo N terminal del segmento p, o viceversa: las secuencias extracelulares de la región constante de los segmentos a y p se encuentran unidas por un puente disulfuro, en donde la longitud de la secuencia de conexión y la posición del puente disulfuro son tales que las secuencias de la región variable de los segmentos alfa y beta se encuentran mutuamente orientadas sustancialmente como en los receptores de células T a/p nativos. También se describen complejos de dos o más de tales scTCR, así como el uso del scTCR en tratamientos y en diversas aplicaciones diagnósticas. En contraste con el scTCR descrito en el documento US 2006 0166875, en el documento US 2012-0252742 se divulga un TCR monocatenario humano soluble sin dominios constantes, que consiste únicamente en los fragmentos variables del TCR (scTv), y que es útil para numerosos propósitos, entre ellos el tratamiento de enfermedades malignas, víricas y autoinmunitarias.

En McCormack E, et al. (en: Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cáncer Immunol Immunother. 2013 Apr; 62[4]:773-85) se divulga que NY-ESO-1 y LAGE-1 son antígenos del cáncer de testículo con un perfil ideal para inmunoterapia tumoral, donde se combina un aumento de la expresión en muchos tipos de cáncer con una expresión sumamente restringida en tejidos normales en tanto comparten un epítopo HLA-A*0201 en común, 157-165. Presentan datos para describir la especificidad y la actividad antitumoral de un ImmTAC bifuncional, que comprende un receptor de células T (TCR) soluble de alta afinidad específico para NY-ESO-1157-165 fusionado a un scFv anti-CD3. Se ha demostrado que este reactivo, ImmTAC-NYE, mata HLA-A2, líneas celulares tumorales positivas para antígeno y células NSCLC positivas para HLA-A2 y LAGE-1 recién aisladas. Empleando imágenes ópticas in vivo, los resultados muestran el direccionamiento in vivo de TCR específicos de NYESO de alta afinidad marcados con fluorescencia a tumores positivos para HLAA2, NY-ESO-1157-165 en ratones con xenoinjertos. La eficacia de ImmTAC-NYE in vivo se probó en un modelo tumoral en el que se co-injertaron de forma estable linfocitos humanos en ratones NSG inmunodeficientes que albergaban xenoinjertos tumorales; se observó eficacia tanto en la prevención de tumores como en modelos tumorales establecidos que utilizan una lectura de fluorescencia de GFP. Se utilizó RT-PCR cuantitativa para analizar la expresión tanto de los antígenos NY-ESO-1 como de LAGE-1 en 15 tejidos normales, 5 líneas de células cancerosas, 10 NSCLC y 10 muestras de cáncer de ovario. En general, el ARN de LAGE-1 se expresó con mayor frecuencia y en niveles más altos que NY-ESO-1 en las muestras tumorales. Los ImmTAC comprenden un Fv monocatenario derivado del anticuerpo anti-CD3 UCHT-1 unido covalentemente al extremo C o N terminal de la cadena alfa o beta del TCR.

El documento EP1868650 está dirigido a moléculas diacuerpos y a usos de las mismas para el tratamiento de una serie de enfermedades y trastornos, incluyendo trastornos inmunológicos, enfermedades infecciosas, intoxicación y cáncer. Las moléculas diacuerpos comprenden dos cadenas polipeptídicas que se asocian para formar al menos dos sitios de unión para epítopos, los que pueden reconocer epítopos iguales o distintos en antígenos iguales o distintos. Asimismo, los antígenos pueden ser de moléculas iguales o distintas. Las cadenas polipeptídicas individuales de la molécula diacuerpo pueden unirse de forma covalente mediante enlaces covalentes no peptídicos incluidos, entre otros, enlaces disulfuro de residuos de cisteína ubicados dentro de cada cadena polipeptídica. En ciertas formas de realización, las moléculas diacuerpo comprenden asimismo una región Fc, que se divulga en la presente memoria debido a que permite el diseño de propiedades similares a las de los anticuerpos (por ejemplo vida media prolongada) en la molécula. En el documento EP1868650 se requiere la presencia de las regiones de unión de los dominios variables de la cadena liviana o de la cadena pesada de una inmunoglobulina, y se analizan en detalle los ligantes de receptores Fc funcionales.

El documento WO 2016/184592 A1 divulga moléculas biespecíficas en las cuales una parte de la especificidad la aporta un TCR y la otra un anticuerpo, el cual está dirigido contra un antígeno o epítopo situado en la superficie de linfocitos, pero no divulga la disposición específica de los elementos del TCR y de las regiones variables del anticuerpo que se divulgan en la presente memoria.

El documento EP2258720A1 está dirigido a una proteína de fusión (TFP) con un receptor de células T funcional (TCR) que reconoce y se une como mínimo a un epítopo presentado por el MHC, y que contiene como mínimo una secuencia de aminoácidos que reconoce y se une a un antígeno.

El documento WO 2014/159940 divulga diacuerpos que comprenden para cada región de unión contienen los dominios VL y VH de un anticuerpo. Los diacuerpos carecen de los dominios TCR Va y TCR Vp.

El documento EP 2258719 diculga los TCR que comprenden las cadenas a y/o p enteras, en cuyos extremos N-terminales se les fusiona una o varias secuencias de aminoácidos de unión a antígeno, insertadas en una región variable o constante de dicha cadena a y/o 13, o bien tienen sustituidos diversos aminoácidos en una región variable o constante de dicha cadena a y/o 3. Esos TCR funcionales están unidos a la membrana, no son biespecíficos, y además no comprenden dominios variables de un anticuerpo.

El sistema inmunitario ha desarrollado mecanismos para que las células dendríticas y algunos otros fagocitos muestreen y presenten antígenos procedentes del medio extracelular en el MHC de tipo I a través de un proceso denominado presentación cruzada (XPT). Esta vía desempeña un papel esencial en la respuesta inmunitaria contra ciertas infecciones, sobre todo infecciones víricas.

Durante las primeras fases de la infección, por ejemplo, las células T CD8+ específicas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) son primordiales para limitar la replicación del VIH in vivo. Los pacientes cuya infección no progresa durante mucho tiempo presentan unas células T CD8+ específicss del VIH dotados de un perfil funcional superior al de los pacientes que sí progresan. Así pues, el carácter inicialmente robusto de la citólisis y la producción de citocinas por parte de las células T CD8+ mengua durante el curso de la infección crónica progresiva, de modo que las células T no reconocen las variantes elusivas del VIH, se agotan progresivamente y acaban sosteniendo respuestas inmunitarias anómalas contra el VIH. El mantenimiento de la potencia de las células T CD8+ específicas del VIH promovería la erradicación de las células infectadas por el virus, reduciría la viremia y ralentizaría la progresión de la enfermedad.

La administración pasiva de anticuerpos monoclonales (AcM) constituye una plataforma terapéutica prometedora para el tratamiento de las infecciones víricas. En la inmunoterapia vírica, la generación de anticuerpos biespecíficos brinda la oportunidad de diseñar moléculas multifuncionales que posean el mecanismo de acción propuesto, por ejemplo, direccionando específicamente y al mismo tiempo componentes del virus y del hospedador.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar moléculas biespecíficas mejoradas capaces de direccionar complejos de péptidos víricos-MHC, que pueden producirse fácilmente, que presentan alta estabilidad y que también proporcionan alta potencia al unirse a los epítopos de los antígenos respectivos. Otros objetivos y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto al estudiar la siguiente descripción y las formas de realización preferidas de la misma, así como los ejemplos respectivos.

En un primer aspecto de la invención, el objetivo arriba indicado se logra al dar a conocer una molécula de polipéptido con especificidad doble de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en donde:

la primera cadena polipeptídica comprende un primer dominio variable (VD1) de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de la superficie celular de una célula inmunitaria efectora humana, y

un primer dominio variable (VR1) de un TCR que se une específicamente a un epítopo peptídico vírico asociado al MHC, y

un primer conector (LINK1) que une dichos dominios;

la segunda cadena polipeptídica comprende un segundo dominio variable (VR2) de un TCR que se une específicamente a un epítopo peptídico vírico asociado al MHC, y

un segundo dominio variable (VD2) de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de la superficie celular de una célula inmunitaria efectora humana, y

un segundo conector (LINK2) que une dichos dominios;

en donde dicho primer dominio variable (VD1) y dicho segundo dominio variable (VD2) se asocian para formar un primer sitio de unión (VD1)(VD2) que se une al epítopo de la molécula situada en la superficie celular;

en donde el primer dominio variable (VR1) es o un dominio Va de TCR o un dominio Vp de TCR, y el segundo dominio variable (VR2) es complementariamente un dominio Va de TCR o un dominio Vp de TCR, y en que dichos primer (VR1) y segundo (VR2) dominios variables se asocian para formar un segundo sitio de unión (VR1)(VR2) que se une al citado epítopo peptídico vírico asociado al MHC;

en donde las dos cadenas polipeptídicas citadas están fusionadas con dominios bisagra de IgG humana y/o dominios Fc de IgG humana o porciones dimerizadas de los mismos;

en donde esas dos cadenas polipeptídicas citadas están conectadas por enlaces covalentes y/o no covalentes entre dichos dominios bisagra y/o dominios Fc;

en donde dicha molécula polipeptídica de especificidad doble es capaz de unirse simultáneamente a la molécula de la superficie celular y al epítopo peptídico vírico asociado al MHC, y

en donde el orden de las regiones de unión en las cadenas polipeptídicas se selecciona entre VD1-VR1, VD1-VR2, VD2-VR1, VD2-VR2, VR1-VD1, VR1-VD2 VR2-VD1 o VR2-VD2, y en donde los dominios están conectados con LINK1 o con LINK2, preferentemente

en donde el orden de los dominios variables contenidos en las dos cadenas polipeptídicas es seleccionado entre VD1-VR1 y VR2-VD2 o VD2-VR2 y VR1-VD1.

Preferentemente, la molécula de polipéptido con especificidad doble según la presente invención se une con alta especificidad al antígeno de células efectoras inmunitarias y a un epítopo del antígeno específico presentado como un complejo péptido-MHC, por ejemplo con una afinidad de unión (KD) de aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 30 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 3 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, p. ej. medida mediante inteferometría de biocapa como se describe en el Ejemplo 6 o determinada mediante citometría de flujo.

Según la presente invención, las moléculas de polipéptido con especificidad doble de la invención se ejemplifican aquí mediante una molécula de polipéptido con especificidad doble que comprende una primera cadena polipeptídica que comprende las S^eQ ID No. 16, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 51, S^eQ ID No. 55 o S^eQ ID No. 57, y una segunda cadena polipeptídica que comprende las SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 44, SEQ ID No.

46, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56 o SEQ ID No. 58.

En un segundo aspecto de la invención, el objetivo arriba indicado se resuleve proporcionando uno o unos ácidos nucleicos que codifican la primera cadena polipeptídica y/o la segunda cadena polipeptídica tal y como se divulga en la presente memoria, o vector o vectores de expresión que comprenden tal ácido nucleico. En un tercer aspecto de la invención, el objetivo arriba indicado se resuelve proprocionando una célula hospedadora que comprende vector(es) tal y como se define en la presente memoria.

También se divulga un método para producir una molécula de polipéptido de especificidad dual de acuerdo con la presente invención, que comprende la expresión adecuada de dicho vector de expresión que comprende el ácido o ácidos nucleicos como se divulga en una célula huésped hospedadora, y una purificación adecuada de la molécula(s) de la célula y/o el medio de las mismas.

En un cuarto aspecto de la invención, el objeto arriba indicado se resuelve proporcionando una composición farmacéutica que comprende la molécula de polipéptido con especificidad doble acorde a la invención, el ácido nucleico o el/los vectores de expresión acorde(s) a la invención, o la célula acorde a la invención, junto con uno o más vehículos farmacéuticos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

En un quinto aspecto de la invención, la invención se refiere a la molécula de polipéptido con especificidad doble acorde a la invención, al o los ácido(s) nucleico(s) o al o los vector(es) de expresión acorde(s) a la invención, a la célula acorde a la invención, o a la composición farmacéutica acorde a la invención, para su uso en medicina.

En un sexto aspecto de la invención, la invención se refiere a la molécula de polipéptido con especificidad doble acorde a la invención, al ácido nucleico o al o los vector(es) de expresión acorde(s) a la invención, a la célula acorde a la invención, o a la composición farmacéutica acorde a la invención, para su uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos tal y como se divulga en la presente memoria, seleccionadas en particular de entre el cáncer y las enfermedades infecciosas.

También se da a conocer, pero sin que forme parte de la invención un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la molécula de polipéptido con especificidad doble acorde a la invención, al ácido nucleico o al o los vector(es) de expresión acorde(s) a la invención, o a la célula acorde a la invención, o a la composición farmacéutica acorde a la invención.

También se divulga, pero sin que forme parte de la invención, un método para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la invención, el ácido nucleico o el vector o vectores de expresión acordes con la invención, la célula de acuerdo con la invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

También se divulga, pero sin que forme parte de la invención, un método para desencadenar una respuesta inmunitaria en un paciente o sujeto, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

Tal como se ha mencionado antes, la invención proporciona nuevas moléculas de polipéptido con especificidad doble mejorada. Las moléculas generalmente comprenden una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica caracterizada porque las cadenas proporcionan en conjunto un dominio variable de un anticuerpo específico para un epítopo de un antígeno de superficie de células efectoras inmunitarias, y un dominio variable de un TCR que es específico para un epítopo peptídico asociado al MHC, p. ej. infecciones virales, tales como VIH. Los dominios variables derivados de los TCR y de los anticuerpos están estabilizados por enlaces covalentes y no covalentes formados entre las partes Fc o porciones de las mismas ubicados en ambas cadenas polipeptídicas. La molécula de polipéptido con especificidad doble es entonces capaz de unirse de forma simultánea al receptor celular y al epítopo peptídico asociado al MHC.

En el contexto de la presente invención, los dominios variables (VD1) y (VD2) derivan de anticuerpos capaces de reclutar células efectoras inmunitarias humanas mediante la unión específica a un antígeno de superficie de dichas células efectoras. En una forma de realización concreta, dichos anticuerpos se unen específicamente a los epítopos del complejo TCR-CD3 de las células T humanas, que comprende las cadenas peptídicas TCR a, TCR p, CD3 y, CD36, CD3 £, y CD30.

La molécula de polipéptido con especificidad doble comprende, según la presente invención, una cadena de un primer polipéptido y otra de un segundo polipéptido que proporcionan un primero (VD1) y un segundo (VD2) dominio variable, respectivamente, de un dominio variable derivado de un anticuerpo capaz de reclutar células efectoras inmunitarias humanas mediante la unión específica a un antígeno de superficie de dichas células. Dicho primer dominio variable (VD1) y dicho segundo dominio variable (VD2) se asocian para formar un primer sitio de unión (VD1)(VD2) que se une al epítopo del antígeno de superficie de la célula receptora inmunitaria. Asimismo, la primera y la segunda cadena polipeptídica de la molécula de polipéptido comprende un primer (VR1) y un segundo (VR2) dominio variable, respectivamente, derivados de un TCR que es específico para un epítopo peptídico vírico asociado al MHC. El primer dominio variable (VR1) es o un dominio Va de TCR o un dominio Vp de TCR, y el segundo dominio variable (VR2) es complementariamente o un dominio Va de TCR o un dominio Vp de TCR. Dicha primer dominio variable (VR1) y dicho segundo dominio variable (VR2) se asocian para formar un segundo sitio de unión (VR1)(VR2) que se une a dicho epítopo del péptido asociado al MHC; en una realización de la molécula de polipéptido con especificidad doble acorde a la invención, el orden/orientación de los dominios en la primera cadena polipeptídica se selecciona a partir de VD1-LINK1-VR1, y de VR1-LINK1-VD1; y el orden/orientación de los dominios en la segunda cadena polipeptídica se selecciona a partir de VD2-LINK2-VR2, y VR2-LINK-VD2, esto es, la orientación de los sitios de unión puede reordenarse como una molécula «hacia la izquierda» o «hacia la derecha» (véase, por ejemplo, la figura 5). Además, es posible intercambiar la configuración de las cadenas alfa y beta de la parte relacionada con el TCR.

En el contexto de la presente invención, se pone como ejemplo de la molécula de polipéptido de doble afinidad acorde a la invención a unos constructos que se unen al péptido derivado del VIH SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) cuando se presenta como un complejo péptido-MHC. No obstante, el concepto de la invención claramente no está restringido a este péptido en particular, y básicamente comprende cualquier epítopo relacionado con infecciones víricas o trastornos que se presente en el contexto junto con la molécula del MHC. Esta presentación puede estar relacionada tanto con el m Hc de clase I como con el MHC de clase II. Las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) se encuentran presentes en la superficie de todas las células nucleadas y presentan una gran matriz de epítopos peptídicos para su vigilancia por parte del repertorio de células T CD8+. Las respuestas de las células T CD8+ son esenciales para el control y la eliminación de infecciones víricas, así como para la eliminación de las células transformadas y tumorígenas. Pueden encontrarse ejemplos de los epítopos peptídicos preferidos para su reconocimiento en la literatura médica respectiva, e incluyen especialmente los péptidos tal como se describen en las tablas 1 a 5 de WO 2016/170139; tablas 1 a 5 de WO 2016/102272; tablas 1 o 2 de WO 2016/156202; tablas 1 a 4 de WO 2016/146751; tabla 2 de WO 2011/113819; tablas 1 a 4b de WO 2016/156230; tablas 1 a 4b de WO 2016/177784; tablas 1 a 4 de WO 2016/202963; tablas 1 y 2 d e W O 2016/207164; tablas 1 a 4 de WO 2017/001491; tablas 1 a 4 de WO 2017/005733; tablas 1 a 8 de WO 2017/021527; tablas 1 a 3 de WO 2017/036936; y tablas 1 a 4 d e l a PCT/EP2016/073416 para tratamientos oncológicos, Publicación U.S. 2016-0187351, Publicación U.S. 2017-0165335, Publicación U.S. 2017-0035807, Publicación U.S.

2016- 0280759, Publicación U.S. 2016-0287687, Publicación U.S. 2016-0346371, Publicación U.S. 2016-0368965, Publicación U.S. 2017-0022251, Publicación U.S. 2017-0002055, Publicación U.S. 2017-0029486, Publicación U.S.

2017- 0037089, Publicación U.S. 2017-0136108, Publicación U.S. 2017-0101473, Publicación U.S. 2017-0096461, Publicación U.S. 2017-0165337, Publicación U.S. 2017-0189505, Publicación U.S. 2017-0173132, Publicación U.S.

2017-0296640, Publicación U.S. 2017-0253633, y la Publicación U.S. 2017-0260249. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la invención puede reconocer un péptido consistente en cualquiera de los péptidos descritos en las solicitudes de patente antes mencionadas.

La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la invención puede unirse o es capaz de reconocer o de unirse específicamente a uno o más péptidos víricos con una longitud total de 8 a 100 aminoácidos, de 8 y 30 aminoácidos, de 8 a 16 aminoácidos, preferentemente de 8 y 14 aminoácidos, es decir 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 aminoácidos, en el caso de los péptidos de unión a clase II alargados la longitud puede ser también de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 aminoácidos. En particular, la molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la invención puede unirse o es capaz de reconocer o de unirse específicamente a uno o más péptidos víricos con una longitud total de 8 a 12 aminoácidos, de 8 a 10 aminoácidos, de 9 a 15 aminoácidos, de 9 a 14 aminoácidos, de 9 a 13 aminoácidos, de 9 a 12 aminoácidos, de 9 a 11 aminoácidos, de 10 a 15 aminoácidos, de 10 a 14 aminoácidos, de 10 a 13 aminoácidos, o de 10 a 12 aminoácidos.

Es posible identificar otros epítopos adecuados en bases de datos como, por ejemplo, la base Immune Epitope Database (disponible en www.iedb.org).

Los péptidos víricos que han de constituir la diana del constructo de la invención pueden derivar de cualquier infección vírica que conduzca a la presentación de tales péptidos por parte del MHC, como la infección por el VIH, el VHC, el VHB, los herpesvirus, el VPH, el VEB, y similares.

El término «célula(s) efectora(s) inmunitaria(s) humana(s)» se refiere a una célula perteneciente al repertorio natural de células del sistema inmunitario humano que al ser activada es capaz de ocasionar un cambio en la viabilidad de una célula diana. El término «viabilidad de una célula diana» puede referirse, dentro del alcance de la invención, a la capacidad de las células diana para sobrevivir, proliferar y/o interactuar con otras células. Esta interacción puede ser directa, por ejemplo, cuando la célula diana contacta a otra célula, o indirecta, por ejemplo, cuando la célula diana segrega sustancias que influyen sobre el funcionamiento de otra célula distante. La célula diana puede ser nativa o extraña a humanos. En caso de que la célula sea nativa a humanos, la célula diana es ventajosamente una célula que ha sufrido una transformación para convertirse en una célula maligna. La célula nativa puede ser adicionalmente una célula nativa modificada patológicamente, por ejemplo, una célula nativa infectada por un microorganismo tal como un virus, un plasmodio o una bacteria. En caso de que la célula sea extraña a humanos, la célula diana es ventajosamente un patógeno invasor, por ejemplo, una bacteria invasora o un plasmodio invasor.

Se prefiere la molécula de polipéptido con especificidad doble según la invención, en donde dichas primera y segunda cadena polipeptídicas comprenden asimismo al menos un dominio bisagra y/o un dominio Fc o una porción del mismo. En los anticuerpos, la «bisagra» o «región bisagra» o «dominio bisagra» se refiere a la porción flexible de una cadena pesada ubicada entre el dominio CH1 y el dominio CH2. Tiene una longitud de aproximadamente 25 aminoácidos, y se divide en una «bisagra superior», una «bisagra central» o «bisagra intermedia» y una «bisagra inferior». Un «subdominio de bisagra» se refiere a la bisagra superior, a la bisagra central (o intermedia) o a la bisagra inferior. Las secuencias de aminoácidos de las bisagras de una molécula IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 son (numeración de la UE):

IgG1: E²¹⁶PKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID No. 1)

IgG2: E²¹⁶RKCCVECPPCPAPPVAGP (SEQ ID No. 2)

IgG3: ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE²¹⁶PKSCDTPPPCPRCPAPELLG (SEQ ID No. 3)

IgG4: E²¹⁶SKYGPPCPSCPAPEFLG (SEQ ID No. 4)

La región de la bisagra central contiene usualmente al menos un puente de cisteína que conecta a las dos cadenas pesadas. Asimismo, es posible crear mutaciones en la región de la bisagra inferior para reducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) no deseada.

Se prefiere una molécula de polipéptido con especificidad doble según la presente invención que comprende al menos un dominio con un fragmento cristalizable (Fc) IgG, p. ej., una región de fragmento cristalizable (región Fc), la región de la cola de un anticuerpo que interactúa con los receptores Fc y algunas proteínas del sistema de complemento. Las regiones Fc contienen dos o tres dominios constantes de cadena pesada (dominios CH 2, 3 y 4) en cada cadena polipeptídica. Las regiones Fc de las IgG también contienen un sitio de N-glicosilación altamente conservado. La glicosilación del fragmento Fc es esencial para la actividad mediada por el receptor Fc. El tamaño pequeño de los formatos de los anticuerpos biespecíficos tales como los BiTE y los DART (~50 kD) puede conducir a una eliminación rápida y a una vida media corta. Así pues, para mejorar las propiedades farmacocinéticas, la molécula de polipéptido de especificidad doble del receptor celular scTv (p. ej., c D3) puede fusionarse con un dominio Fc humano (IgG1 humana), aumentando de esta manera la masa molecular. Varias mutaciones localizadas en la interfaz entre los dominios CH2 y CH3, tales como T250Q/M428L y M252Y/S254T/T256E H433K/N434F, han demostrado que aumentan la afinidad de unión al receptor Fc neonatal (FcRn) y la vida media de la IgG1 in vivo. Mediante esto, pudo extenderse aún más la vida media sérica de la molécula que contiene Fc.

En las moléculas de polipéptido de especificidad doble de la invención, dicho dominio Fc puede comprender un dominio CH2 que comprende al menos una mutación silenciadora de la función del efector. Preferentemente, estas mutaciones se introducen en la secuencia ELLGGP (SEQ ID No. 50) de la IgG1 humana (residuos 233-238) o en los residuos correspondientes de otros isótopos de los que se sabe que son relevantes para las funciones del efector. En principio, se introduce en Fc IgG1 al menos una mutación correspondiente a los residuos derivados de IgG2 y/o IgG4. Se prefieren: E233P, L234V, L235A y ningún residuo o G en la posición 236. P331S es otra mutación. En EP1075496 se describe un anticuerpo recombinante que comprende un dominio quimérico que deriva de dos o más dominios CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, donde dichas inmunoglobulinas humanas son seleccionadas a partir de IgG1, IgG2 e IgG4, y en donde el dominio quimérico es un dominio CH2 de la cadena pesada de una inmunoglobulina humana que tiene los siguientes bloques de aminoácidos en las posiciones indicadas: 233P, 234V, 235A y ningún residuo o G en las posiciones 236 y 327G, 330S y 331S de acuerdo con el sistema de numeración de la UE, y es al menos un 98 % idéntica a una secuencia CH2 (residuos 231-340) de la IgG1, IgG2 o IgG4 humanas que tienen dichos aminoácidos modificados.

Ejemplos de las secuencias parciales CH2 preferidas para su uso pueden ser (total o parcialmente) los siguientes: 231-APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK-334 (SEQ ID No. 5);

y

231-APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK-334 (SEQ ID No. 6), con las modificaciones señalizadas, que en la posición 297 lleva un N (variante glicosilada) o un residuo seleccionado del grupo de A, G y Q (variante desglicosilada). En las moléculas de polipéptido de especificidad doble de la invención, dicho dominio Fc comprende un dominio CH3 que comprende al menos una mutación que facilita la formación de heterodímeros. Para maximizar la producción de la proteína Fc de especificidad doble heterodimérica deseada y para simplificar la purificación, pueden diseñarse mutaciones de tipo «botón en ojal» en el dominio Fc. Mediante este diseño, se hace que los dominios Fc formen heterodímeros en lugar de sus homodímeros normales mediante la adición de residuos hidrofóbicos voluminosos y sobresalientes («botones») en una cadena y la creación de bolsillos hidrofóbicos complementarios («ojales») en la otra. Puede obtenerse una variante «botón» mediante la sustitución de un aminoácido pequeño por uno de mayor tamaño para insertarlo en el «ojal» del dominio opuesto creado mediante la sustitución de un residuo grande por uno de menor tamaño (Ridgway, J.B.B.; Presta, L.G.; Carter, P. “Knobs-into-holes” engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. 1996, 9, 617-621; WO 2002/002781).

Se prefiere una molécula de polipéptido de especificidad doble según la invención, en donde dicha mutación de botón en ojal es seleccionada de T366W como botón, y T366S, L368A e Y407V como ojal en el dominio CH3 (a modo de ejemplo, véase WO 98/50431). Este conjunto de mutaciones puede extenderse aún más mediante la inclusión de las mutaciones K409A y F405K, tal y como se describen en Wei et al. (Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production, Oncotarget. 2017). T366Y puede ser otro botón, e Y407T el ojal. Las moléculas de polipéptido de especificidad doble de la invención pueden comprender adicionalmente puentes de cisteína introducidos de forma artificial entre al menos un residuo de cisteína en la primera cadena polipeptídica y al menos un residuo de cisteína en la segunda cadena polipeptídica para mejorar la estabilidad de las moléculas, en el mejor de los casos sin interferir con las características de unión de la molécula bivalente, y/o para una mejor heterodimerización. Para lograr estabilidad adicional, puede introducirse un puente disulfuro mediante la adición de una única cisteína en el dominio CH3 de las cadenas del botón y del ojal. Se prefiere la molécula de polipéptido con especificidad doble según la invención, en donde el dominio Fc comprende un dominio CH3 que comprende al menos un residuo de cisteína adicional, por ejemplo, S354C y/o Y349C.

Se prefiere una molécula de polipéptido de especificidad doble según la invención, en donde dicha molécula CD es seleccionada a partir del grupo de moléculas CD relacionadas con la respuesta inmune, CD3, tales como las cadenas CD3 y, CD36 y CD3 £, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45RA, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD152, CD163, CD193, CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FceRI, TCR a/p, TCR y/6 y HLA-DR. Dependiendo de la combinación de las dos entidades de unión al antígeno de la molécula de polipéptidos con especificidad doble según la invención, pueden conseguirse ventajas específicas con respecto a la función de la molécula, en concreto una actividad aumentada. Se prefiere la molécula de polipéptido con especificidad doble ilustrativa según la invención, en donde las regiones de la primera cadena polipeptídica comprenden la SEQ ID No. 28 para VD1, la SEQ ID No. 29 para VR1, la SEQ ID No. 30 para LINK1; y las regiones en la segunda cadena polipeptídica comprenden la SEQ ID No. 31 para VD2, la SEQ ID No. 32 para VR2 y la SEQ ID No. 30 para LINK2

Adicionalmente se prefiere la molécula de polipéptido con especificidad doble ilustrativa según la invención, en donde la región FC en la primera cadena polipeptídica comprende la SEQ ID No. 26 (Fc1), y la región FC en la segunda cadena polipeptídica comprende la SEQ ID No. 27 (Fc2).

Adicionalmente se prefiere la molécula de polipéptido con especificidad doble ilustrativa según la invención que comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID No. 16 (1. cadena de la molécula entera), y una segunda cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID No. 17 (2. cadena de la molécula entera). Se prefiere además la molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la invención que comprende una primera cadena polipeptídica que comprende las SEQ ID No. 51, 53, 55 o 57 (1. cadena de la molécula entera) y una segunda cadena polipeptídica que comprende las SEQ ID No. 52, 54, 56 o 58 (2. cadena de la molécula entera). Adicionalmente se prefiere además la molécula de polipéptido con especificidad doble ilustrativa según la invención, en donde dicho primer sitio de unión (VD1)(VD2) que liga el epítopo del antígeno de superficie de las células inmunitarias humanas (p. ej., CD3) es humanizado; y/o dicho segundo sitio de unión (VR1)(VR2) que liga dicho epítopo peptídico vírico asociado al MHC es madurado por afinidad.

Los anticuerpos humanizados son anticuerpos (o partes de los mismos) de especies no humanas cuyas secuencias de proteínas han sido modificadas para aumentar su similitud con las variantes de los anticuerpos producidos naturalmente en los humanos. El proceso de «humanización» usualmente se aplica a los anticuerpos monoclonales desarrollados para su administración a los humanos (por ejemplo, anticuerpos desarrollados como fármacos antitumorales). Se conocen métodos adecuados de humanización en la literatura, y han sido revisados en, por ejemplo, Pier Paolo, Paolo Marcatili, and Anna Tramontano. “Tabhu: Tools for Antibody Humanization. Bioinformatics 31.3 (2015): 434-435. PMC; Safdari Y, Farajnia S, Asgharzadeh M, Khalili M. Antibody humanization methods - a review and update. Biotechnol Genet Eng Rev. 2013; 29:175-86; o en Ahmadzadeh V, Farajnia S, Feizi MA, Nejad RA. Antibody humanization methods for development of therapeutic applications. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother. 2014 Apr; 33(2):67-73.

En general, es posible realizar la maduración de la afinidad in vitro de los TCR y de los anticuerpos según los métodos descritos en la literatura, especialmente mediante el uso de la presentación en superficie de levaduras o fagos (según, por ejemplo, Holler PD, et al. In vitro evolution of a T cell receptor with high affinity for peptide/MHC. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 May 9; 97[10]:5387-92; Boder ET al., Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 26; 97[20]:10701-5; y, como ejemplo reciente, Zhao Q, et al. Affinity maturation of T-cell receptor-like antibodies for Wilms tumor 1 peptide greatly enhances therapeutic potential. Leukemia. 2015; 29[11]:2238-2247).

Los sitios de unión (VD1)(VD2) y (VR1)(VR2) de la presente descripción se unen de forma específica preferentemente a un antígeno de superficie de células inmunitarias humanas y un complejo de péptido víricomolécula HLA, respectivamente. Tal y como se usa en la presente memoria en relación con los sitios de unión de la presente descripción, «unión específica» y las variantes gramaticales de la misma se usan para indicar un sitio que tiene una afinidad de unión (KD) por un complejo de molécula HLA-péptido y/o un epítopo de un anticuerpo de 100 pM o menos. Los sitios de unión (VD1)(VD2) y (VR1)(VR2) de la presente descripción se unen a un epítopo de un anticuerpo CD o a un complejo de la molécula HLA-péptido, respectivamente, con una afinidad de unión (KD) de aproximadamente 100 pM o menos, aproximadamente 50 pM o menos, aproximadamente 25 pM o menos, o aproximadamente 10 pM o menos. Más preferidos son los sitios de unión de alta afinidad con afinidades de unión de aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos, aproximadamente 10nM o menos, aproximadamente 5 nM o menos, aproximadamente 2 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, aproximadamente 500 pM o menos, aproximadamente 200 pM o menos, aproximadamente 100 pM o menos. Ejemplos no limitantes de los intervalos de afinidad de unión preferidos para los sitios de unión de la presente invención incluyen aproximadamente 10 pM a aproximadamente 100 pM, aproximadamente 100 pM a aproximadamente 1 nM, aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM; aproximadamente 10 nM a aproximadamente 20 nM; aproximadamente 20 nM a aproximadamente 30 nM; aproximadamente 30 nM a aproximadamente 40 nM; aproximadamente 40 nM a aproximadamente 50 nM; aproximadamente 50 nM a aproximadamente 60 nM; aproximadamente 60 nM a aproximadamente 70 nM; aproximadamente 70 nM a aproximadamente 80 nM; aproximadamente 80 nM a aproximadamente 90 nM; y aproximadamente 90 nM a aproximadamente 100 nM, p. ej. medidos mediante interferometría de Bio-Layer como se describe en el Ejemplo 6.

En la presente memoria se divulga un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria como, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos 1 a 58. En otro aspecto, la divulgación proporciona un primer o un segundo polipéptido provisto de una identidad de secuencia de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria. También se divulga una molécula polipeptídica de especificidad doble provista de una identidad de secuencia de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con una o más secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria. La identidad porcentual de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% se aplica a cualquiera de las secuencias de las regiones estructurales descritas en la Figura 1 como, por ejemplo, VD1, VR1, Link1, VR2, VD2, Link2, o la región bisagra, y tal y como se describen o forman parte de las secuencias divulgadas en la presente memoria.

Los polipéptidos o las moléculas polipeptídicas de especificidad doble descritos en la presente memoria pueden ser alterados de diversos modos, como son sustituciones de aminoácidos, deleciones, truncamientos e inserciones de uno o más aminoácidos. Los polipéptidos o las moléculas polipeptídicas de especificidad doble descritos en la presente memoria pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Los polipéptidos o las moléculas polipeptídicas de especificidad doble descritos en la presente memoria pueden incluir 1 a 5, 1 a 10, 1 a 20, 2 a 5, 2 a 10, 5 a 20, 5 a 50 o 10 a 100 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. De acuerdo con un ejemplo, se aplican 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos a cualquiera de las regiones estructurales descritas en la Figura 1, por ejemplo, VD1, VR1, Link1, VR2, VD2, Link2 o regiones bisagra. Se dan a conocer, además, sustituciones, deleciones o inserciones de 1 a 5, 1 a 10, 1 a 20, 2 a 5, 2 a 10, 5 a 20, 5 a 50 o 10 a 100 aminoácidos que se aplican a las secuencias de cualquiera de las regiones estructurales descritas en la Figura 1, por ejemplo, VD1, VR1, Link1, VR2, VD2, Link2 o regiones bisagra, y como se describen o forman parte de las secuencias que se divulgan en la presente memoria.

De acuerdo con un ejemplo, se pueden añadir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 o más aminoácidos al extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido o de una molécula polipeptídica de especificidad doble descritos en la presente memoria, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos 1 a 58.

Por ejemplo, VD1 puede tener una identidad de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 28.

Por ejemplo, VR1 puede tener una identidad de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 29.

Por ejemplo, LINK1 o LINK2 pueden tener una identidad de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 30.

Por ejemplo, VD2 puede tener una identidad de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 31.

Por ejemplo, VR2 puede tener una identidad de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 32.

Por ejemplo, la bisagra puede tener una identidad de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 4. En un aspecto, el dominio CH2 puede tener una identidad de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 5 o la SEQ ID No. 6. En un aspecto, la región Fc puede tener una identidad de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No. 26 o la SEQ ID No. 27.

También se divulga un polipéptido provisto de una identidad de secuencia de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 43, 44, 45 o 46.

Los polipéptidos o las moléculas polipeptídicas de especificidad doble dados a conocer en la presente memoria se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en diferentes sitios de la cadena polipeptídica, posiblemente selectivos. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, cuando un aminoácido es reemplazado por otro aminoácido de estructura y características similares, como en el caso de un aminoácido hidrofóbico que es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, el reemplazo de una leucina por una isoleucina. En estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homólogas de oigen natural, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran con más frecuencia que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las «sustituciones conservadoras».

La molécula polipeptídica de especificidad doble puede llevar consigo un agente activo, o una porción del mismo, acoplado o conjugado a ella. Dicho agente activo puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en un marcador detectable, una molécula inmunoestimuladora, y un agente terapéutico.

El marcador detectable puede seleccionarse del grupo que consiste en biotina, estreptavidina, una enzima o un fragmento catalíticamente activo de la misma, un radionúclido, una nanopartícula, un ion de metal paramagnético, o una molécula fluorescente, fosforescente o quimioluminiscente. Los marcadores detectables a efectos diagnósticos incluyen, por ejemplo, marcadores fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácidos nucleicos y reactivos de contraste.

Los agentes terapéuticos que pueden asociarse con las moléculas de la invención incluyen inmunomoduladores, compuestos radioactivos, enzimas (por ejemplo, perforina), agentes quimioterápicos (por ejemplo, cisplatino), o una toxina. Otros agentes terapéuticos adecuados incluyen agentes citotóxicos de molécula pequeña, es decir, compuestos con un peso molecular menor de 700 dalton que tienen la capacidad de destruir células de mamífero. Dichos compuestos también podrían contener metales tóxicos capaces de producir un efecto citotóxico. Asimismo, debe comprenderse que estos agentes citotóxicos de molécula pequeña también incluyen profármacos, esto es, compuestos que se descomponen o son transformados en condiciones fisiológicas y liberan agentes citotóxicos. Entre los ejemplos de dichos agentes se incluyen los siguientes: cisplatino, derivados de la maitansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecán, melfalán, mitoxantrona, fotofrina (porfímero sódico), temozolomida, topotecán, trimetreato glucuronato, auristatina E vincristina y doxorubicina; citotoxinas peptídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con capacidad para destruir células de mamíferos. Los ejemplos incluyen ricina, toxina de difteria, exotoxina A bacteriana de pseudomonas, ADNasa y ARNasa; radionúclidos, es decir isótopos inestables de elementos que se descomponen con la emisión simultánea de una o más partículas a o p, o de rayos ^y. Los ejemplos incluyen yodo-131, renio-186, indio-111, itrio-90, bismuto-210 y 213, actinio-225 y astatina-213; se pueden usar agentes quelantes para facilitar la asociación de estos radionúclidos con las moléculas, o multímeros de las mismas, inmunoestimuladores, es decir moléculas inmunoefectoras que estimulan la respuesta inmunitaria. Entre los ejemplos se incluyen citocinas tales como IL-2 e IFN, quimiocinas tales como IL-8, factor plaquetario 4, proteína estimuladora del crecimiento de melanoma, activadores del complemento; o dominios de proteína xenogeneica, dominios de proteína alogeneica, dominios de proteína viral/bacteriana, péptidos virales/bacterianos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere entonces a una molécula de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica y/o una segunda cadena polipeptídica tal y como se divulga en la presente memoria, o un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico puede ser un ADN, ADNc, ANP, ARN, y combinaciones de los mismos. La secuencia nucleotídica que codifica para un péptido, oligopéptido o polipéptido en particular puede producirse de forma natural o puede ser producida de forma sintética. Por lo general, los segmentos de DNA que codifican a los péptidos, polipéptidos y proteínas de esta invención se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y enlazadores de oligonucleótidos cortos, o de una serie de oligonucleótidos, para dar lugar a un gen sintético que puede expresarse en una unidad de transcripción recombinante que comprende elementos regulatorios derivados de un operón microbiano o vírico. El término «producto de expresión» significa el polipéptido o la proteína que es el producto natural de la traducción del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por tanto, que codifican el mismo aminoácido o aminoácidos. El término «fragmento», cuando se refiere a una secuencia de codificación, significa una porción de ADN que no comprende la región codificante completa, cuyo producto de expresión retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que el producto de expresión de la región codificante completa. Dependiendo del uso previsto, pueden optimizarse los codones del ácido nucleico para su expresión en una célula huésped adecuada (p. ej., una célula microbiana). La redundancia del código genético permite que algunos aminoácidos sean codificados por más de un codón, pero algunos codones son menos «óptimos» que otros debido tanto a la disponibilidad relativa de los ARNt complementarios como a otros factores (Gustafsson et al., 2004).

La molécula de ácido nucleico puede ser un ADN, ADNc, ANP, ARN, y combinaciones de los mismos, sea de cadena simple y/o doble, o formas nativas o estabilizadas de los polinucleótidos, por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fosforotioato y que puede o no contener intrones en tanto codifique las cadenas polipeptídicas.

El ácido nucleico (p. ej., ADN) puede entonces ser comprendido y/o expresado en un huésped adecuado para producir un polipéptido que comprende la cadena polipeptídica de la invención. Así pues, el ácido nucleico (p. ej., ADN) que codifica la cadena polipeptídica de la invención puede usarse de acuerdo con técnicas conocidas, debidamente modificadas en vista de lo descrito en la presente memoria, para construir un vector de expresión, el cual es usado a continuación para transformar una célula huésped adecuada para la expresión y la producción del polipéptido de la invención, como se conoce en la técnica. El ácido nucleico (p. ej., el ADN o, en el caso de los vectores retrovirales, el ARN) que codifica la o las cadenas polipeptídicas que constituyen el compuesto de la invención puede unirse a una amplia variedad de secuencias de ácidos nucleicos (p. ej., ADN) para su introducción en un huésped adecuado. El ácido nucleico acompañante dependerá de la naturaleza del huésped, de la forma de introducción del ADN en el huésped, y de si se desea un mantenimiento o la integración episomal. Generalmente, el ácido nucleico se inserta en un vector de expresión, como, por ejemplo, un vector plasmídico, en la orientación y el marco de lectura adecuados para la expresión. Si es necesario, el ácido nucleico podrá unirse a las secuencias adecuadas de nucleótidos de control regulador de traducción y transcripción reconocidas por el huésped deseado, aunque tales controles suelen estar disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce entonces en el huésped mediante las técnicas habituales. Generalmente, no todos los huéspedes serán transformados por el vector. Por lo tanto, será necesario seleccionar las células huésped transformadas. Una de las técnicas de selección implica la incorporación en el vector de expresión de una secuencia de ácido nucleico, con los elementos de control necesarios, que codifica para un rasgo seleccionable en la célula transformada como, por ejemplo, la resistencia a antibióticos. De forma alternativa, el gen para dicho rasgo seleccionable puede ser otro vector, que es usado para cotransformar la célula huésped deseada. Las células huésped que han sido transformadas por el ácido nucleico recombinante de la invención son cultivadas entonces durante el tiempo necesario y en las condiciones apropiadas conocidas por los expertos en la materia, según la información descrita en este documento, para permitir la expresión del polipéptido, que entonces podrá ser recuperado.

Se conocen muchos sistemas de expresión, incluyendo bacterias (por ejemplo, E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), hongos filamentosos (por ejemplo, Aspergillus), células de plantas, animales e insectos. Preferentemente, el sistema podrá ser de células de mamífero tales como las células CHO disponibles en la ATCC Cell Biology Collection

También se divulga un método para producir una molécula tal y como se describe en la presente memoria, donde el método comprende el cultivo de una célula huésped capaz de expresar la o las cadenas polipeptídicas bajo condiciones adecuadas para promover la expresión de dicha cadena o cadenas.

A fin de obtener células que expresen las moléculas de la presente descripción, se pueden clonar los ácidos nucleicos que codifican a las cadenas polipeptídicas que comprenden a los dominios de unión de los TCR a y/o de los TCR p en vectores de expresión, tales como vectores gamma retrovirales o lentovirales. Alternativamente, para obtener las células que expresan las moléculas de la presente descripción, se pueden sintetizar los ARN mediante técnicas conocidas en la técnica, p. ej., sistemas de transcripción in vitro. Los a Rn sintetizados in vitro se introducen a continuación en células adecuadas mediante electroporación para la expresión de las cadenas polipeptídicas.

Para aumentar la expresión, las cadenas de ácidos nucleicos codificantes de la presente descripción pueden enlazarse funcionalmente a promotores fuertes, tales como repeticiones terminales largas (LTR), citomegalovirus (CMV), el virus de células madre murino (MSCV) U3, fosfoglicerato quinasa (PGK), p-actina, ubiquitina, y un promotor compuesto del virus del simio 40 (SV40)/CD43, el factor de elongación (EF)-1a y el promotor de virus formadores de foco en el bazo (SFFV). El promotor puede ser heterólogo respecto del ácido nucleico que se está expresando. Además de los promotores fuertes, los casetes de expresión de esta descripción pueden contener elementos adicionales que pueden aumentar la expresión transgénica, incluyendo un tracto de polipurina central (cPPT) que promueve la traslocación nuclear de los constructos lentivirales (Follenzi et al., 2000), y el elemento de regulación postranscripcional del virus de hepatitis de la marmota (wPRE), lo que aumenta el nivel de expresión transgénica al aumentar la estabilidad del ARN (Zufferey et al., 1999).

Las cadenas del dominio de unión alfa y beta de una molécula de la presente invención pueden codificarse mediante ácidos nucleicos localizados en vectores separados, o pueden codificarse mediante polinucleótidos localizados en el mismo vector.

Se puede desarrollar una célula hospedadora para expresar una molécula en la presente descripción. Las células hospedadoras de la presente descripción pueden ser alógenas o autólogas con respecto al paciente que se va a tratar.

Otro aspecto más de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la molécula de polipéptido con especificidad doble según la presente invención, el/los ácidos nucleicos o el/los vectores de expresión según la presente invención, o la célula según la presente invención, junto con uno o más vehículos o excipientes aceptables farmacéuticamente. Las composiciones de la invención incluyen composiciones de principios activos útiles para la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ej., composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son adecuadas para la administración a un sujeto o paciente) que se pueden usar en la preparación de las formas farmacéuticas unitarias. Dichas composiciones comprenden una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico de la molécula (agente) de polipéptido con especificidad doble terapéutica y/o profiláctica dada a conocer en la presente memoria o una combinación del agente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico o profiláctico de una o más moléculas

de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos farmacéuticos preferentemente comprenden las moléculas en la forma libre o como una sal.

Preferentemente, las sales son sales farmacéuticamente aceptables de las moléculas como, por ejemplo, las sales

de cloruro o acetato (trifluoroacetato). Cabe destacar que las sales de las moléculas según la presente invención

difieren sustancialmente de las moléculas en su(s) estado(s) in vivo, ya que las moléculas no son sales in vivo.

La presente divulgación, pues, se refiere a una molécula de orogen no natural según la invención que se ha producido de forma artificial (por ejemplo, se ha sintetizado) como una sal farmacéuticamente aceptable. Los métodos para producir de forma sintética péptidos y/o polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Las sales de las moléculas según la presente invención difieren sustancialmente de las moléculas en su(s) estado(s) in vivo, ya que

las moléculas tal como se generaron in vivo no son sales. Preferentemente, las sales son sales farmacéuticamente aceptables de las moléculas. Estas sales según la invención incluyen sales alcalinas y alcalinotérreas como sales de

la serie Hofmeister que comprenden como aniones PO^43-, SO^42-, CH³COO-, Cl-, Br-, NO^3-, CO^4", I-, SCN^-y como cationes NH⁴⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺y Ba²⁺. En concreto, se seleccionaron sales de

entre (NH⁴)³PO⁴, ,(NH⁴)²HPO⁴, (NH⁴)H²PO⁴, (NH⁴)²SO⁴, NH⁴CH³COO, NH⁴Cl, NH⁴Br, NH⁴NO³, NH⁴CIO⁴, NH⁴I, NH⁴SCN, Rb³PO⁴, Rb²HPO⁴, RbH²PO⁴, Rb²SO⁴, Rb⁴CH³COO, Rb⁴Cl, Rb⁴Br, Rb⁴NO³, Rb⁴CIO⁴, Rb⁴I, K³PO⁴, K²HPO⁴, KH²PO⁴, K²SO⁴, KCH³COO, KCl, KBr, KNO³, KClO⁴, KI, KSCN, Na³PO⁴, Na²HPO⁴, NaH²PO⁴, Na²SO⁴, NaCH³COO, NaCl, NaBr, NaNO³, NaCIO⁴, NaI, NaSCN, ZnCI²Cs³PO⁴, Cs²HPO⁴, CsH²PO⁴, Cs²SO⁴, CsCH³COO, CsCl, CsBr, CsNO³, CsCIO⁴, CsI, CsSCN, Li³PO⁴, Li²HPO⁴, LiH²PO⁴, Li²SO⁴, UCH³COO, LiCl, LiBr, LiNO³, LiClO⁴, LiI, LiSCN, Cu²SO⁴, Mg³(PO⁴)², Mg²HPO⁴, Mg(H²PO⁴)², Mg²SO⁴, Mg(CH³COO)², MgCl², MgBr², Mg(NO³)², Mg(ClO⁴)², MgI², Mg(SCN)², MnCl², Ca³(PO⁴),, Ca²HPO⁴, Ca(H²PO⁴)², CaSO⁴, Ca(CH³COO)², CaCl², CaBr², Ca(NO³)², Ca(ClO⁴)², CaI², Ca(SCN)², Ba³(PO⁴)², Ba²HPO⁴, Ba(H²PO⁴)², BaSO⁴, Ba(CH³COO)², BaCl²,

BaBr², Ba(NO³)², Ba(ClO⁴)², Bab y Ba(SCN)². Se prefieren particularmente acetato de Nh, MgCl², KH²PO⁴, Na²SO⁴,

KCl, NaCl y CaCb, como, por ejemplo, las sales de cloruro o acetato (trifluoroacetato).

El polipéptido descrito en la presente memoria puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En

otro aspecto, un polipéptido en la forma de una sal farmacéutica está en forma cristalina.

Una sal farmacéuticamente aceptable descrita en la presente memoria se refiere a sales cuyo perfil de toxicidad

queda dentro de márgenes aceptables para las aplicaciones farmacéuticas.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «una sal farmacéuticamente aceptable» se refiere a un derivado de los péptidos divulgados en el que el péptido es modificado para obtener sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (normalmente la forma neutra del fármaco posee un grupo -NH2 neutro) haciéndola reaccionar con un ácido adecuado. Ácidos adecuados para la preparación de sales ácidas

incluyen tanto ácidos orgánicos, p. ej. ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico y similares, como ácidos inorgánicos, como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. A la inversa, la preparación de sales básicas a partir de grupos

ácidos que pueden estar presentes en un péptido se hace empleando una base farmacéuticamente aceptable como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio, trimetilamina o similares. Las

sales farmacéuticamente aceptables pueden aumentar la solubilidad y/o la estabilidad de los péptidos descritos en la presente memoria. Las sales farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden ser preparadas con medios convencionales a partir del correspondiente complejo o del péptido portador mediante la reacción, por ejemplo, del ácido o de la base apropiados con los péptidos o complejos tal y como se describe en la presente memoria. Las

sales farmacéuticamente aceptables pueden estar presentes en forma cristalina o semicristalina. En otro aspecto

más, las sales farmacéuticamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, las descritas en Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use por P. H. Stahl y C. G. Wermuth (Wiley-VCH 2002) y L. D.

Bighley, S. M. Berge y D. C. Monkhouse, en “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”. Eds. J. Swarbrick y J. C.

Boylan, Vol. 13, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Basilea, Hong Kong, 1995, págs. 453-499.

También se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de polipéptido con especificidad

doble de la invención y un anticuerpo terapéutico (por ej., un anticuerpo monoclonal propio de tumor) que es específico para un antígeno concreto del cáncer, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El término «farmacéuticamente aceptable» puede significar autorizado por una autoridad de registro farmacéutico

de un gobierno nacional o federal o enumerada en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y más concretamente en humanos. El término «vehículo» se refiere

a un diluyente, excipiente adyuvante o transportador con el que se administra el fármaco. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluyendo los derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es el vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol pueden emplearse también como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, fosfato sódico, acetato sódico, L-histidina, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede también contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes o amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación lenta y similares. Generalmente, los componentes de las composiciones de la invención se suministran bien por separado o mezclados juntos en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o un concentrado sin agua en un contenedor sellado herméticamente como una ampolla o un sobre indicando la cantidad del principio activo. Si la composición ha de administrarse mediante infusión, puede dispensarse como un frasco para infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Si la composición se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para preparados inyectables o solución salina de forma que los componentes se puedan mezclar antes de la administración.

Otro aspecto de la presente invención entonces se refiere a la molécula de polipéptido con especificidad doble según la invención, el ácido nucleico o el vector de expresión según la invención, la célula según la invención, o la composición farmacéutica según la invención, para su uso en medicina. En general, el uso de la molécula de polipéptido con especificidad doble depende del contexto médico del/los antígeno(s)-péptido(s) que es/son reconocidos por dicha molécula, tal como se describe más abajo.

Se prefiere la molécula de polipéptido con especificidad doble según la invención, el ácido nucleico o el vector de expresión según la invención o la célula según la invención, o la composición farmacéutica según la invención, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno seleccionado entre infecciones víricas, como también se describen más abajo.

También se divulgan, pero sin que formen parte de la invención, métodos para desencadenar una respuesta inmunitaria en un paciente o sujeto, los cuales comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Una población de la molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede administrar a un paciente o sujeto que la necesita.

También se divulgan, sin que forme parte de la invención, un método para destruir células diana en un paciente o sujeto el cual comprende la administración al paciente de una cantidad eficaz de la molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la presente invención.

También se divulgan, sin que formen parte de la invención, métodos para prevenir, tratar o controlar uno más síntomas asociados con las enfermedades víricas. Las enfermedades víricas que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la invención junto con los métodos de la presente invención incluyen, sin limitación, las producidas por hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simple tipo I (VHS-I), herpes simple tipo II (VHS-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, papilomavirus, papovavirus, citomegalovirus, ecinovirus, arbovirus, hantavirus, virus de Coxsackie, virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus de la rubeola, virus de la poliomielitis, viruela, virus de Epstein Barr, virus de la inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-I), virus de la inmunodeficiencia humana tipo II (VIH-II), y agentes de enfermedades víricas como la meningitis vírica, encefalitis, dengue o viruela.

También se divulga, pero sin que forma parte de la presente invención, un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de polipéptido con especificidad doble según la invención, el ácido nucleico o el vector de expresión según la invención, la célula según la invención, o la composición farmacéutica según la invención.

La molécula de polipéptido con especificidad doble de la invención puede usarse en un método para prevenir o tratar una enfermedad o afección que mejora mediante la administración de la molécula de polipéptido con especificidad doble. Dichos tratamientos se pueden proporcionar en una composición farmacéutica junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las moléculas de polipéptido terapéuticas con especificidad doble se suministrarán habitualmente como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede presentarse en una forma adecuada, (dependiendo del método deseado de administración al paciente). Puede proporcionarse en una forma farmacéutica unitaria, se proporcionará generalmente en un contenedor sellado y se puede proporcionar como parte de un kit. Dicho kit normalmente incluiría (aunque no necesariamente) instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas farmacéuticas unitarias. La composición farmacéutica puede adaptarse para administración mediante una vía indicada, como vía parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular o intravenosa). Dichas composiciones pueden prepararse mediante un método conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo, mediante la mezcla del principio activo con el/los vehículos o excipientes bajo condiciones estériles.

Los péptidos u otras moléculas descritas en la presente memoria se pueden combinar con un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser seleccionado entre intercambiadores iónicos, óxido de aluminio, estearato de aluminio, estearato de magnesio, lecitina, proteínas de suero, como albúmina sérica humana, sustancias amortiguadoras del pH como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, sales o electrolitos, como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, fosfato dicálcico, hidrogenosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato magnésico, polivinilpirrolidona (povidona), polivinilpirrolidona-acetato de vinilo, sustancias celulósicas (celulosa microcristalina, hidroxipropilmetilcelulosa, succinato acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa), almidón, lactosa monohidrato, manitol, trehalosa, laurilsulfato de sodio, y croscarmelosa sódica, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, polimetacrilato, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.

El vehículo acuoso puede contener múltiples componentes, como agua junto con un componente de soporte no acuoso, como algunos de los componentes descritos en la presente memoria. En otro aspecto, el vehículo acuoso es capaz de conferir propiedades mejoradas cuando se combina con un péptido o con otra molécula descritos en la presente memoria, como, por ejemplo, mejorar la solubilidad, la eficacia o mejorar la inmunoterapia. Además, la composición puede contener excipientes, tales como amortiguadores, aglutinantes, disgregantes, diluyentes, saborizantes, lubricantes, etc. Un «diluyente farmacéuticamente aceptable» puede incluir, por ejemplo, disolventes, sustancias de relleno, estabilizantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, compuestos isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de diluyentes aceptables desde el punto de vista farmacéutico son uno o varios de los siguientes: solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos será preferible incluir en la composición uno o más isotonizantes, por ejemplo, glúcidos como la trehalosa y la sacarosa, polialcoholes como el manitol o el sorbitol, o cloruro sódico. Las sustancias farmacéuticamente aceptables como humectantes o pequeñas cantidades de sustancias auxiliares como emulsificadores o humectantes, conservantes o amortiguadores, también quedan comprendidas en el ámbito de la presente invención. Además, la composición puede contener excipientes, tales como amortiguadores, aglutinantes, disgregantes, diluyentes, saborizantes y lubricantes.

Las dosificaciones de las moléculas de polipéptido con especificidad doble de la presente invención pueden variar entre límites amplios, dependiendo de la enfermedad o del trastorno que se trate, la edad y el estado de la persona que se trate, etc.; por ejemplo, un intervalo de dosis adecuado para una molécula de polipéptido con especificidad doble puede estar entre 25 ng/kg y 50 pg/kg. Un médico determinará en última instancia las dosificaciones oportunas que se usarán.

Las composiciones farmacéuticas, vectores, ácidos nucleicos y células de la invención pueden proporcionarse en una forma sustancialmente pura, por ejemplo, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % pura.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención son, al igual que para cada uno de los demás aspectos, por analogía. La presente invención se ilustrará con mayor detalle en los ejemplos siguientes, que se proporcionan a efectos ilustrativos únicamente y no pretenden limitar la invención de ningún modo.

La figura 1 muestra una vista esquemática de una forma de realización preferida de la presente invención, el Fc-de la IgG1 humana que contiene la molécula de polipéptido con especificidad doble. VD1, VD2 = dominios variables derivados de anticuerpo; VR1, VR2 = dominios variables derivados de TCR; Link1, Link2 = conectores; Cys-Cys = puentes de cisteína.

La figura 2 muestra una vista esquemática de 4 constructos diferentes de Fc de la IgG1 que contienen la molécula de polipéptido con especificidad doble tal como se analiza en el contexto de la presente invención. Negro = dominios variables derivados de TCR; gris claro = dominios variables derivados de anticuerpo; blanco = dominios de variable constantes derivados de la IgG humana. Las mutaciones de botón en ojal se indican mediante un cilindro. Las moléculas de diacuerpos IA-ID son según la invención.

La figura 3 muestra el análisis HPLC-SEC de diferentes moléculas biespecíficas TCR/AcM con un diseño molecular según los constructos mostrados en la figura 2, que se purificaron mediante un proceso de purificación de dos columnas. Los contenidos monoméricos de las diferentes columnas se determinan como se expone a continuación: II: 93,84 %; III: 96,54 %; IV: 98,49 %; IA_1: 95,48 %; IA_3: 98,45 %; ID_1: 95,75 %; IC_4: 95,22 %; IC_4: 92,76 %; ID_4: 99,31 %; ID_5: 99,44 %.

La figura 4 muestra los resultados del análisis de potencia con diferentes constructos biespecíficos TCR/AcM (como se muestra en la figura 2) diseñados como moléculas basadas en la IgG4. Las células Jurkat_NFATRE_luc2 se coincubaron con células T2 cargadas con péptido-VIH SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) en la presencia de concentraciones en aumento de moléculas biespecíficas TCR (bssTCR). La molécula IA-IgG4 biespecífica de diacuerpo TCR/AcM mostró una potencia mayor que las dos moléculas alternativas TCR/AcM con especificidad doble.

La figura 5 muestra los resultados del análisis de potencia con diferentes constructos biespecíficos TCR/AcM (como se muestra en la figura 2) diseñados como moléculas basadas en la IgG1. Las células Jurkat_NFATRE_luc2 se coincubaron con células T2 cargadas con péptido-VIH SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) en presencia de concentraciones en aumento de moléculas biespecíficas TCR (bssTCR). Las moléculas ID_1, IA_3 e ⁱA1 biespecíficas de diacuerpo TCR/AcM mostraron una potencia mucho mayor que las tres moléculas alternativas TCR/AcM con especificidad doble.

La figura 6 muestra los resultados del análisis de potencia realizado con diferentes constructos biespecíficos TCR/AcM basados en la IgG1 (como se muestra en la figura 2) utilizando diferentes dominios variables de anticuerpos, ambos dirigidos al complejo TCR-CD3. El constructo ID_1 comprende dominios variables del anticuerpo UCHT1(V9) que se dirige a CD3, mientras que los constructos ID_4 e lD_5 comprenden dominios variables del anticuerpo BMA031 a y p específico para t Cr . Las células Jurkat_NFATRE_luc2 se coincubaron con células T2 cargadas con péptido-VIH SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) en la presencia de concentraciones en aumento de moléculas biespecíficas TCR (bssTCR).

La figura 7 muestra una vista esquemática de las posibles orientaciones de los dominios VD y VR en las moléculas de la presente invención. VH: dominio VH derivado de anticuerpo; VL: dominio VL derivado de anticuerpo; Va: Va derivado de TCR; Vp: Vp derivado de TCR.

La figura 8 muestra los resultados del análisis mediante HPLC-SEC de agregados (HMWS = especies de peso molecular elevado) dentro de las diferentes moléculas biespecíficas TCR/AcM basadas en la IgG1. Se analizaron los agregados después de la purificación y tras la conservación de las moléculas a 40 °C durante 1 y 2 semanas, respectivamente.

La figura 9 muestras los resultados del análisis de potencia realizado con diferentes moléculas biespecíficas TCR/AcM basadas en la IgG1. Se analizó la potencia después de la purificación y tras la conservación de las moléculas a 40 °C durante 1 y 2 semanas, respectivamente. La conservación en condiciones extremas no supuso una pérdida significativa de potencia de las moléculas, pero se detectó un marcado aumento de la activación inespecífica (es decir, independiente de la diana) de las células T Jurkat para las moléculas III y IV.

La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo de liberación de LDH realizado con diferentes constructos de TCR/AcM biespecíficos (como los mostrados en la Figura 2) diseñados como moléculas derivadas de la IgG1. Las PBMC aisladas de un donante sano se incubaron simultáneamente con células T2 cargas con el péptido del VIH SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) en presencia de concentraciones crecientes de moléculas TCR biespecíficas (bsTCR). Las moléculas de diacuerpo TCR/AcM biespefíficas IA_3 e ID_1 estimularon una lisis notablemente superior de células diana que otras tres moléculas de TCR/AcM de especificidad doble. Como se observa en la gráfica de la derecha, ninguno de los constructos de TCR/AcM biespecíficos analizados estimularon una lisis detectable de las células T2 cargadas con un péptido irrelevante (SEQ ID No. 49).

La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo de liberación de LDH con el constructo de diacuerpo TCR/AcM biespecífico IA_5 dirigido contra el péptido tumoral PRAME-004 (SEQ ID No. 49) presentado por HLA-A*02. Células T CD8-positivas procedentes de un donante sano se incubaron conjuntamente con las líneas de células cancerosas UACC-257, S^w982 y U2OS que presentaban complejos PR^aM^e-004:HLA-A*02-1 en distinta cantidad en la superficie celular (aprox. 1100, aprox. 770 y aprox. 240 copias por célula, respectivamente, según lo determinado por un análisis M/S) con un cociente de células efectoras:diana de 5:1 en presencia de concentraciones crecientes de moléculas de diacuerpo TCR/AcM. A las 48 horas de cultivo se cuantificó la lisis de las células diana mediante ensayos de liberación de LDH siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega).

La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo de liberación de LDH con los constructos de diacuerpo TCR/AcM biespecífico IA_5 e IA_6 utilizando un TCR de estabilidad/afinidad madurada TCR y una versión mejorada del mismo, respectivamente, contra el péptido tumoral PRAME-004 (SEQ ID No. 49) presentado en HLA-A*02. Células T CD8-positivas aisladas de un donante sano se incubaron conjuntamente con la línea de células cancerosas U2OS que presentaba aprox. 240 copias del complejo PRAME-004:HLA-A*02-1 por célula o bien células T2 no cargadas (cociente de células efectoras:diana de 5:1) en presencia de concentraciones crecientes de moléculas de diacuerpo TCR/AcM. A las 48 horas de cultivo se cuantificó la lisis de las células diana mediante ensayos de liberación de LDH siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega).

La Figura 13 muestra los resultados de un estudio de termoestabilidad de los constructos de diacuerpo TCR/AcM biespecífico IA_5 e IA_6 utilizando un TCR de estabilidad/afinidad madurada y una versión mejorada del mismo, respectivamente, contra el péptido tumoral PRAME-004 (SEQ ID No. 49) presentado por HLA-A*02. Para ello, las proteínas se formularon en tampón PBS a una concentración de 1 mg/ml y permanecieron después conservadas a 40 °C durante dos semanas. Con HPLC-SEC se evaluó la integridad de las proteínas y su recuperación. La cantidad de especies de alto peso molecular se determinó a partir del porcentaje del área del pico que eluyó antes del pico principal. La recuperación de la proteína monomérica se calculó comparando las áreas de los picos principales correspondientes a muestras no sometidas a estrés térmico y sometidas a este.

Ejemplos

Ejemplo 1

Diseño de diacuerpos biespecíficos TCR/AcM que contienen Fc y moléculas de control.

Los diacuerpos biespecíficos TCR/AcM que contienen Fc y moléculas de control (como se ilustra en la figura 2) se diseñaron para unir específicamente el complejo TCR-CD3 humano al complejo péptido-MHC que comprende el péptido derivado de VIH SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) unido a HLA-A2*01. Para dirigirse al complejo TCR-CD3, se utilizaron dominios VH y VL derivados del anticuerpo humanizado hUCHT1(V9) específico para CD3, descrito por Zhu et al. (Identification of heavy chain residues in a humanized anti-CD3 antibody important for efficient antigen binding and T cell activation. J Immunol, 1995, 155, 1903-1910) o dominios VH y VL derivados del anticuerpo BMA031 específico para TCR a y p, descrito en Shearman et al. (Construction, expression and characterization of humanized antibodies directed against the human alfa/beta T cell receptor. J Immunol, 1991, 147, 4366-73) y empleado en la variante 10 de la versión humanizada (datos generados internamente). Para dirigirse al complejo péptido-MHC, se utilizaron dominios Va y Vp del receptor de células T 868Z11 monocatenario, humano, madurado con estabilidad y afinidad descrito previamente y divulgado por Aggen et al. (Identification and engineering of human variable regions that allow expression of stable single-chain T cell receptors. PEDS, 2011, 24, 361-372).

En el caso de diacuerpos biespecíficos TCR/AcM que contienen Fc, se obtuvo mediante síntesis génica la codificación de secuencias de ADN para diversas combinaciones de VH y VL (correspondientes a VD1 y VD2, respectivamente) y Va y Vp (correspondientes a VR1 y VR2, respectivamente), así como la codificación para los conectores Link1 y Link2. Las secuencias de ADN resultantes se clonaron con la estructura de vectores de expresión que codifican para la región bisagra, dominios CH2 y CH3 derivados de la IgG4 humana [N.° de acceso: K01316] y la IgG1 [N.° de acceso: P01857] respectivamente, y se siguieron desarrollando. Se ha realizado ingeniería genética para incorporar las mutaciones botón en ojal a los dominios CH3 con y sin estabilización del puente disulfuro intercatenario adicional; para eliminar el sitio de N-glucosilación en CH2 (por ej., mutación N297Q); para introducir mutaciones silenciadoras de Fc; para introducir estabilización del puente disulfuro adicional a VL y VH, respectivamente, según los métodos descritos por Reiter et al. (Stabilization of the Fv Fragments in Recombinant Immunotoxins by Disulfide Bonds Engineered into Conserved Framework Regions. Biochemistry, 1994, 33, 5451 5459). Se enumera un resumen de los diacuerpos biespecíficos TCR/AcM producidos, las variantes, así como las secuencias correspondientes en la Tabla 1.

Tabla 1: Resumen de todos los diacuerpos biespecíficos TCR/AcM que contienen Fc evaluados y generados: KiH: botón en ojal; K/O: Fc silenciado; KiH-ds: botón en ojal estabilizado con puente disulfuro artificial para conectar CH3:CH3'; dominios variables de hUCHT1(V9) estabilizado ds-hUCHT1(V9): puente disulfuro; Link1: conector que conecta VR1 y VD1.

Se construyeron diversas moléculas de control que muestran las mismas especificidades (Tabla 2) utilizando dichos dominios V^h, VL, Va y Vp en combinaciones con dominios constantes derivados de la IgG1 o la IgG4 que comprenden características desarrolladas conforme se describió anteriormente.

Tabla 2: Resumen de todas las moléculas de control biespecíficas que contienen Fc evaluadas y generadas: KiH:

Botón en ojal; K/O: Fc silenciado.

Ejemplo 2

Producción y purificación de diacuerpos biespecíficos TCR/AcM que contienen Fc.

Se diseñaron vectores para la expresión de proteínas recombinantes como derivados del pUC19 monocistrónicos controlados por elementos promotores derivados de VCMH. Se amplificó el ADN plásmido en E.coli según métodos de cultivo estándar y posteriormente se purificó utilizando kits disponibles en el mercado (Macherey & Nagel). El ADN plásmido purificado se usó para la transfección transitoria de células de CHO-S (de ovario de hámster chino en cultivo en suspensión) según las instrucciones del fabricante (sistema ExpiCHO™; Thermo Fisher Scientific). Se cultivaron las células CHO transfectadas entre 6 y 14 días a una temperatura de entre 32 °C y 37 °C, y se les suministró de uno a dos suplementos nutricionales de la solución nutricional ExpiCHO™.

Se obtuvo el sobrenadante celular condicionado mediante centrifugación (4000 x g; 30 minutos) y se negativizó mediante filtración (0,22 pm). Se purificaron las moléculas biespecíficas usando un sistema Ákta Pure 25 L FPLC (GE Lifesciences) equipado para realizar la afinidad y la cromatografía de exclusión por tamaños en línea. Se realizó la cromatografía de afinidad en las columnas de la proteína A (GE Lifesciences) después de los protocolos cromatográficos de afinidad estándar. Se realizó la cromatografía de exclusión por tamaños directamente después de la elución (pH 2,8) de la columna de afinidad para obtener proteínas monoméricas muy puras usando columnas Superdex 200 pg 16/600 (GE Lifesciences) conforme a los protocolos estándar. Se determinaron las concentraciones de proteínas en un sistema NanoDrop (Thermo Scientific) usando coeficientes de extinción calculados según las secuencias de proteínas previstas. Se realizó la concentración, si procedía, y el cambio de amortiguador usando los dispositivos Vivaspin (Sartorius). Finalmente, se conservaron las moléculas purificadas en solución salina amortiguada con fosfato en concentraciones de aproximadamente 1 mg/ml a temperaturas de 2 °C -8 °C.

Dado que las proteínas deben mostrar una estabilidad razonable con la exposición acídica para facilitar los procesos de purificación industrial sólida, se evaluó el porcentaje de proteína monomérica que se eluye de la columna de captura de la proteína A (Tabla 3). Resulta obvio que la introducción de mutaciones estabilizadoras en las moléculas, así como la selección de distintas orientaciones de dominios de unión, tienen una marcada repercusión en la estabilidad con la exposición acídica.

Tabla 3: Fracción de proteína monomérica tras la elución acídica de la columna de captura:

Después de la cromatografía de exclusión por tamaños, las moléculas biespecíficas purificadas demostraron una elevada pureza (>93 % de proteína monomérica) conforme se determinó mediante HPLC-SEC en las columnas MabPac SEC-1 (5 pm, 7,8 x 300 mm) que circulaban en 50 mM de fosfato sódico, pH 6,8, que contenía 300 mM de NaCl dentro del sistema Agilent 1100 (véase la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.). La SDS-PAGE reductora y no reductora confirmó la pureza y el tamaño esperado de las diferentes moléculas TCR/AcM con especificidad doble (no se muestran los datos).

Ejemplo 3

Activación de células T dependientes de la célula diana y específicos inducidos por diacuerpos TCR/AcM que contienen Fc

Se evaluó la potencia de diacuerpos TCR/AcM que contienen Fc con respecto a la activación de células T usando el bioanálisis de activación de células T (Promega). El bioanálisis consiste en una línea celular Jurkat genéticamente modificada que expresa un marcador de luciferasa impulsado por un elemento de respuesta NFAT. Los análisis se realizaron conforme indicó el fabricante. En resumen, las células T2 cargados con el péptido SLYNTVATL específico para VIH (SED ID No. 7) o sin carga peptídica (control sin carga) se cocultivaron posteriormente con células Jurkat modificadas con Promega en presencia de concentraciones en aumento de moléculas TCR/AcM biespecíficas. Se analizó la activación de las células T con marcador Jurkat después de entre 16 y 20 horas mediante determinación de la intensidad de la luminiscencia.

Se ilustran los resultados representativos del análisis de potencia para moléculas TCR/AcM biespecíficas basadas en la IgG4 (¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.) y la IgG1 (¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.), respectivamente. Los datos indican que independientemente del isótopo de la IgG del dominio constante utilizado, los constructos IA e ID de diacuerpos TCR/AcM que contienen Fc mostraron una activación de células T superior en comparación con los constructos TCR/AcM biespecíficos alternativos II, III y IV, conforme se determinó mediante la magnitud de la activación y/o los respectivos valores EC50. Asimismo, la activación inespecífica de células T de diacuerpos TCR/AcM que contienen Fc inducida contra células T no cargadas se redujo, o al menos se equiparó a un nivel igual de activación inespecífica observada para los constructos TCR/AcM biespecíficos alternativos. Según los resultados anteriores, las moléculas de diacuerpos TCR/AcM con especificidad doble son las moléculas preferidas para la intervención terapéutica, ya que inducen una activación potente de células T efectoras de una manera muy dependiente de la diana.

Además, se recurrió al ensayo de liberación de LDH (Promega) para cuantificar la lisis, mediada por las PBMC, de células T2 cargadas con el péptido SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) inducida por las diversas moléculas de TCR/AcM biespecíficas (Figura 10). En consonancia con los resultados anteriores del bioensayo de activación de células T, los constructos de diacuerpo TCR/AcM portadores de Fc IA e ID resultaron superiores a los constructos TCR/AcM biespecíficos II, III y IV a la vista del aumento del nivel absoluto de lisis de células diana y la concentración más baja de TCR biespecíficos necesaria para lograr la concentración máxima eficaz al 50% (CE50) para destruir las células diana. En cuanto a los constructos de TCR/AcM II, III y IV, los constructos de diacuerpo TCR/AcM IA e ID no estimularon la lisis de las células T2 cargadas con un péptido irrelevante (SED ID No. 49), lo cual demuestra que la lisis de las células T2 depende específicamente de la diana.

Ejemplo 4

Desarrollo de diacuerpos biespecíficos TCR/AcM que contienen Fc como una plataforma de moléculas

Se diseñaron los constructos de diacuerpos TCR/AcM biespecíficos que contienen Fc para servir de plataforma molecular y proporcionar el andamiaje para diferentes dominios variables derivados de AcM y derivados de TCR dirigidos a diferentes complejos péptido-MHC y antígenos de superficie de células efectoras, respectivamente. Para validar la sostenibilidad de la plataforma, se intercambiaron los dominios variables derivados de AcM en un primer conjunto de moléculas. Se sustituyeron los dominios variables del anticuerpo hUCHT1(V9) anti-CD3 (constructo ID_1) contra los dominios del anticuerpo hBMA031(var10) anti-TCR empleando la misma orientación de dominio (constructos ID_4 e ID_5) o una orientación diferente (IC_4, IC_5) (véase la Tabla 1 y la figura 7 para obtener más detalles). Se realizaron, conforme se describió más arriba, la expresión, purificación y caracterización de estas moléculas. La pureza y la integridad de las preparaciones finales superó el 92 % según los análisis mediante HPLC-SEC.

Los resultados del análisis de potencia revelaron una activación de células T Jurkat informadoras dependientes de la diana y una mínima actividad inespecífica contra las células T2 no cargadas para ambos dominios variables de anticuerpos hUCHT1 (constructo ID_1) y hBMA031 (constructos ID_4 e ID_5), lo que avala la idoneidad de la plataforma de los constructos de diacuerpos TCR/AcM con especificidad doble (figura 6). Cabe destacar que cuando se intercambiaron los dominios variables TCR y AcM de los constructos ID_4 e ID_5 en cada cadena polipeptídica dando como resultado los constructos IC_4 e IC_5, no se observó activación de células T (no se muestran los datos). El último hallazgo indica que, a pesar de que se pueden usar los diacuerpos TCR/AcM biespecíficos como un constructo de plataforma para incorporar diferentes dominios variables TCR y AcM, es necesaria una rigurosa optimización de la orientación del dominio para logar la actividad óptima de las moléculas.

Ejemplo 5

Estabilidad de diacuerpos biespecíficos TCR/AcM que contienen Fc

Se evaluó inicialmente la estabilidad de las moléculas TCR/AcM biespecíficas utilizando el ensayo de cambio térmico de proteínas (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante usando un sistema de PCR 7500 a tiempo real (Applied Biosciences). En resumen: se mezclaron las moléculas purificadas con amortiguador PTS y tinción PTS y se sometieron a un gradiente de temperatura en aumento monitorizando constantemente la fluorescencia de las muestras. Se analizaron las señales de fluorescencia registradas usando software PTS (Thermo Fisher Scientific) y se calcularon las temperaturas de fusión (T^m) mediante el método derivativo.

Se realizaron estudios de estabilidad en condiciones extremas mediante conservación de moléculas purificadas disueltas en PBS a 40 °C durante un máximo de dos semanas. Se analizaron las muestras con respecto a la integridad de la proteína usando HPLC-SEC y la potencia usando el análisis de activación de células T (Promega), conforme se describió más arriba.

Como era de esperar, la conservación a 40 °C indujo la formación de agregados/especies de elevado peso molecular, según se determinó en los análisis mediante HPLC-SEC (véase la figura 8). Se muestran en la figura 9 los resultados de los análisis de potencias de moléculas basadas en la IgG después de la purificación y la incubación a 40 °C. Aunque ninguna de las moléculas analizadas mostró una reducción significativa de la potencia tras la conservación a 40 °C, se observó que las moléculas en condiciones extremas III y IV indujeron una cantidad significativa de activación de células T Jurkat inespecífica (es decir, independiente de la diana). Por el contrario, los diacuerpos TCR/AcM biespecíficos conservaron su potencia dependiente de la diana, a pesar de la presencia de algunos agregados conforme se observó en la HPLC-SEC.

Ejemplo 6:

Generación de moléculas de diacuerpo TCR/AcM biespecíficas dirigidas contra el cáncer

Para validar de forma adicional las capacidades de los constructos de diacuerpos TCR/AcM biespecíficos, se intercambiaron dominios variables derivados de un TCR por dominios variables de un TCR cuya estabilidad/afinidad había sido madurada por expresión en la superficie celular de levaduras conforme a un método descrito previamente (Smith et al., 2015, T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform. Methods Mol Biol.

1319:95-141). Los dominios variables de TCR que se unen específicamente al péptido del VIH SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) en el contexto de HLA-A*02 se intercambiaron por dominios variables de TCR que se unen específicamente al péptido tumoral PRAME-004 (SEQ ID No. 49) unido a HLA-A*02. Asimismo, los dominios variables del anticuerpo humanizado reclutante de células T hUCHT1(V9) se intercambiaron con los dominios variables del hUCHT1(Var17), una nueva versión humanizada del anticuerpo UCHT1, lo que dio como resultado la molécula de diacuerpo TCR/AcM dirigida contra PRAME-004 IA_5 (la cual comprende la SEQ ID No. 43 y la SEQ ID No. 44). La expresión, la purificación y la caracterización de esta molécula se llevó a cabo del modo descrito en el Ejemplo 2. La pureza y la integridad de la preparación final superó el 96% según el análisis por HPLC-SEC.

Las afinidades de unión de los constructos de diacuerpo TCR/AcM biespecíficos hacia PRAME-004:HLA-A*02 se determinaron por interferometría de biocapa. Las mediciones se realizaron con un sistema Octet RED384 aplicando los ajustes recomendados por el fabricante. En suma, se cargaron moléculas biespecíficas de diacuerpo TCR/AcM en biosensores (AHC) antes de proceder al análisis con diluciones seriadas de HLA-A*02/PRAME-004.

La actividad de este constructo de diacuerpo TCR/AcM dirigido contra PRAME-004 en cuanto a la inducción de la lisis de las células tumorales se evaluó valorando la lisis mediada por células T CD8+ humanas de las líneas de células cancerosas humanas UACC-257, SW982 y U2OS que presentaban copias del péptido PRAME-004 en distinto número en el contexto de HLA-A*02 sobre la superficie de las células tumorales (UACC-257: aprox. 1100; SW982: aprox. 770; U2OS: aprox. 240 copias de PRAME-004 por célula, determinada por análisis M/S cuantitativo). Como se muestra en la Figura 11, el constructo de diacuerpo TCR/AcM dirigido contra PRAME-004 IA_5 indujo una lisis, dependiente de la concentración, de las líneas de células tumorales portadoras del PRAME-004. Incluso las células tumorales U2OS que apenas expresan 240 copias de PRAME-004 en cada célula tumoral fueron sometidas a lisis eficazmente por esta molécula de diacuerpo TCR/AcM. Estos resultados demuestran, además, que el formato de diacuerpo TCR/AcM es aplicable como plataforma molecular para introducir dominios variables de TCR diferentes, así como dominios variables de distintos anticuerpos reclutadores de células T.

Ejemplo 7:

Modificación de los constructos de diacuerpos TCR/AcM

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula polipeptídica de especificidad doble que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en la cual:

a) la primera cadena polipeptídica comprende

ai) un primer dominio variable (VD1) de un anticuerpo,

aii) un primer dominio variable (VR1) de un receptor de células T (TCR), y

aiii) un primer conector (LINK1) que une dichos dominios;

b) la segunda cadena polipeptídica comprende

bi) un segundo dominio variable (VR2) de un TCR,

bii) un segundo dominio variable (VD2) de un anticuerpo, y

biii) un segundo conector (LINK2) que une dichos dominios;

en la que dicho primer dominio variable (VD1) y dicho segundo dominio variable (VD2) se asocian para formar un primer sitio de unión (VD1)(VD2) que se une específicamente al antígeno situado en la superficie celular de una célula inmunitaria efectora humana;

en la que el primer dominio variable (VR1) es uno de un dominio Va de TCR y un dominio Vp de TCR, y el segundo dominio variable (VR2) es el otro del dominio Va de TCR y el dominio Vp de TCR, dicho primer dominio variable (VR1) y dicho segundo dominio variable (VR2) se asocian para formar un segundo sitio de unión (VR1) (VR2) que se une a un epítopo peptídico viral asociado a MHC;

en la que que las dichas dos cadenas polipeptídicas están fusionadas con dominios bisagra de IgG humana y/o dominios Fc de IgG humana o porciones dimerizadas de los mismos;

en la que las dichas dos cadenas polipeptídicas están conectadas por enlaces covalentes y/o no covalentes entre dichos dominios bisagra y/o dominios Fc;

en la que dicha molécula polipeptídica de especificidad doble es capaz de unirse simultáneamente a la molécula de la superficie celular y al epítopo peptídico asociado al MHC, y

en la que el orden de los dominios variables contenidos en las dos cadenas polipeptídicas es seleccionado entre VD1-VR1 y VR2-VD2 o VD2-VR2 y VR1-VD1.

2. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con la reivindicación 1, en la que las secuencias conectoras LINK1 y/o LINK2 contienen al menos un motivo de secuencia seleccionado entre GGGS, GGGGS, TVLRT, TVSSAS, y TVLSSAS.

3. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que las dichas primera y segunda cadena polipeptídicas comprenden además al menos un dominio bisagra y un dominio Fc o porciones de los mismos derivados de IgG1, IgG2 o IgG4 humanas, en la que preferentemente dicho dominio Fc comprende al menos una mutación anuladora de la función efectora en la secuencia de SEQ ID No. 50 (ELLGGP) de la IgG1 humana, más preferentemente en la que dicha mutación anuladora de la función efectora se genera por una o más mutaciones E1P, L2V o L3A y la ausencia de residuos en la posición 4 de la SEQ ID No. 50.

4. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con una cuaquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en la que dicho dominio Fc comprende un dominio CH3 que comprende al menos una mutación que facilita la formación de heterodímeros, preferentemente, en la que dichas mutaciones comprenden mutaciones de botón en ojal.

5. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que dicho dominio Fc comprende dominios CH2 y CH3 que comprenden al menos dos residuos de cisteína adicionales.

6. Las moléculas polipeptídicas de especificidad doble según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en las que dichos dominios variables de anticuerpo VD1 y VD2 presentan un puente disulfuro diseñado que introduce un enlace covalente entre VD1 y VD2 y donde dichas cisteínas se introducen en la región estructural (FR) 4 en el caso de VL y la región estructural 2 en el caso de la VH.

7. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que se sabe que dicha molécula de superficie celular induce la activación de células inmunitarias, o es al menos una seleccionada entre el grupo consistente en CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45RA, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD152, CD163, CD193, CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FceRI, TCRa/p and TCR^y/6, HLA-DR, preferiblemente en donde dicha molécula de superficie celular es CD3y, CD36 o CD3e.

8. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que las regiones en la primera cadena polipeptídica comprende las SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 29 y SEQ ID No.

30, y las regiones en la segunda cadena polipeptídica comprende las SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 32 y SEQ ID No.

30.

9. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en la que la región Fc en la primera cadena polipeptídica comprende la SEQ ID No. 26 o la SEQ ID No. 47 (Fc1), y la región Fc en la segunda cadena polipeptídica comprende la SEQ ID No. 27 o la SEQ ID No. 48 (Fc2).

10. La molécula polipeptídica de especificidad doble de la reivindicación 1, en la que la primera cadena polipeptídica comprende las SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 43, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 55 o SEQ ID No. 57, y en la que la segunda cadena polipeptídica comprende las SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56 o SEQ ID No. 58.

11. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho primer sitio de unión (VD1)(VD2) que se une al antígeno de la superficie celular de las dichas células inmunitarias es humanizado, y/o dicho segundo sitio de unión (VR1)(VR2) que se une al dicho epítopo peptídico vírico asociado al MHC tiene la afinidad madurada y/o la estabilidad madurada.

12. Un ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica y/o la segunda cadena polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos ácidos nucleicos.

13. Una célula hospedadora que comprende y que opcionalmente expresa un vector como se define en la reivindicación 12.

14. Una composición farmacéutica que comprende la molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el ácido nucleico o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 12, o la célula de acuerdo con la reivindicación 13, junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

15. La molécula polipeptídica de especificidad doble de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el ácido nucleico o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 12, la célula de acuerdo con la reivindicación 13, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, para uso en medicina, preferentemente para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas.