TW201908340A - 改良的雙特異性多肽分子 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種雙特異性多肽分子，包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其提供源自特定于主要組織相容性複合體 (MHC) 相關肽表位的 T 細胞受體 (TCR) 的結合區和源自透過特異性結合所述細胞表面抗原能夠募集人免疫效應細胞的抗體的結合區域，以及製備雙特異性多肽分子的方法及其用途。

Description

改良的雙特異性多肽分子

本發明涉及一種雙特異性多肽分子，包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其提供源自特定于主要組織相容性複合體 (MHC) 相關肽表位的 T 細胞受體 (TCR) 的結合區和源自透過特異性結合所述細胞表面抗原能夠募集人免疫效應細胞的抗體的結合區域，以及製備雙特異性多肽分子的方法及其用途。

隨著分子克隆技術的發展和對抗體工程的深入理解，有多種雙特異性抗體形式（「雙特異性」）可供選擇，以達到最佳的生物活性和臨床目的。在癌症治療中，已開發出了雙特異性抗體，其目的是透過特定於腫瘤細胞上表位元的第一結合結構域和特定於免疫效應細胞上表位元的第二結合結構域將免疫效應細胞的活性重新定向至腫瘤部位。免疫效應細胞重新靶向作用的雙特異性抗體已經以不同的形式開發，包括無可結晶片段 (Fc) 區的形式以及具有對稱或不對稱設計的 IgG 衍生形式。除了將效應細胞重新靶向作用於癌症部位外，還確立了雙特異性抗體的新應用。可開發能夠同時抑制兩個相關信號分子的雙特異性物質以克服固有或獲得性耐藥並且是更有效的血管生成抑制劑。此外，雙特異性抗體可用作治療各種疾病（如：癌症）有前景的免疫刺激劑。雙特異性抗體也可以透過模擬因子 VIII 的功能用於治療 A 型血友病。雙特異性抗體在骨病和感染以及中樞神經系統疾病中也具有廣泛的應用前景（綜述見Yang F. et al. Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies.Int J Mol Sci.2016 Dec 28;18(1)）。

T 細胞表達能夠誘導抗原特異性免疫應答的 T 細胞受體 (TCR) 複合體。抗原肽/主要組織相容性複合體 (MHC) I 類在靶細胞上與 TCR 結合誘導免疫突觸形成並導致透過 CD3 共受體（TCR 信號傳導複合體的組分）的信號傳導。該信號傳導級聯透過 T 細胞向靶細胞釋放和轉移顆粒酶和穿孔素，引導對抗原表達細胞的 T 細胞介導性殺傷。

歷史上，抗體的單鏈連接可變結構域的發現和產生（scFv，Bird et al. 1988 一文的描述）作為雙特異性抗體開發的主要驅動因素。這一概念最終導致 BiTE 分子的產生及其臨床驗證，作為治療白血病的有效藥物 (Baeuerle, P.A.; Reinhardt, C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res.2009, 69, 4941–4944)。在癌症中，與 CD3ε 亞基和腫瘤細胞上的表面抗原共同結合的雙特異性抗體觸發 T 細胞介導的腫瘤細胞殺傷，同時避免了 TCR和 MHC I 類在含抗原複合體中直接相互作用的需要。這擴展了能夠識別腫瘤並充當效應細胞的 T 細胞庫 (Baeuerle, P.A.; Reinhardt, C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy.Cancer Res. 2009, 69, 4941–4944)。

Stieglmaier J. 等人（在：Utilizing the BiTE (bispecific T-cell engager) platform for immunotherapy of cancer.Expert Opin Biol Ther.2015;15(8):1093-9一文中）描述了目前正在研究的基於 T 細胞的癌症免疫治療的各種方法，其中這些是 BiTE®（雙特異性 T 細胞銜接蛋白）抗體構建體，具有獨特的設計和作用機制。它們透過基因連接到單個多肽鏈上構建腫瘤相關表面抗原和 T 細胞受體相關分子 CD3 的單克隆抗體的最小結合結構域。靶細胞抗原和 CD3 的同時銜接可活化多克隆細胞毒性 T 細胞，導致靶細胞裂解。Blinatumomab 是一種靶向作用於 CD19 的 BiTE®，目前正在廣泛的 B 細胞惡性腫瘤中進行研究，最近在美國被 FDA 批准用於治療費城染色體陰性復發/難治性 B-急性淋巴細胞白血病，商品名為 BLINCYTO™。BiTE® 平臺是臨床上最先進的 T 細胞免疫治療選擇之一。

但是，已發現小型雙特異性分子（如 BiTEs®）的缺點是產量低、純化工藝困難、有聚集傾向以及血清半衰期非常短。為了克服這類分子的固有局限性，基於人 IgG 的各種雙特異性形式的開發開始於二十多年前設計的重組雙特異性原型免疫球蛋白 (Ig)-G-樣抗體的概念，當時 Morrison 及其同事將柔性肽接頭融合至 IgG 重鏈的 C 末端，然後融合至具有不同結合特異性的單鏈可變結構域 (Coloma, M.J. and Morrison, S.L. (1997) Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol. 15, 159–163)。這些分子可與「正常」抗體區分開來，因為它們具有雙重功能。技術障礙最初阻礙了進一步開發，導致雙特異性抗體 (bsAb) 仍然是在學術和生物技術環境中研發的主題。但是，快速發展的技術使得重組蛋白衍生物的工程、生產和開發成為可能，再加上制藥行業重新關注，啟動了 bsAb 研究領域。如今，許多不同的 bsAb 形式適合開發治療性蛋白質（綜述參見 Gramer,mAbs .2013;5(6):962-973, Weidle,Cancer Genomics Proteomics.2013 Nov-Dec;10(6):239-50, Brinkmann, MAbs.2017 Feb/Mar;9(2):182-212.）。總之，納入由 CH2 和 CH3 結構域組成的 Fc-（可結晶片段）部分導致生產率的提高、純化工藝的簡化和穩定性的增強。此外，由於 i) 尺寸的增加和 ii) Fc部分與人 Fc 受體 FcRn 相互作用，延長了此類基於 IgG 的藥物的血清半衰期。

基於 IgG 的雙特異性形式的開發由於工程化突變的出現和摻入得以進一步推動，促進兩個不同 CH3 結構域的異二聚化，從而連接兩個不同的多肽鏈。基本概念由 Ridgway JB 等人（在：'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.Protein Eng. 1996 Jul;9 (7):617-21 一文）介紹，他們將「杵臼」(Knobs-into-holes) 方法進行了公開，作為抗體重鏈同型二聚體異二聚化工程化的一種新穎和有效的設計策略。在該方法中，首先透過用 CD4-IgG 免疫黏附素——T366Y 的 CH3 結構域中的較大氨基酸替換小氨基酸來獲得「杵」變體。將杵設計為插入人源化抗 CD3 抗體的 CH3 結構域的「臼」中，該抗體透過用較小的殘基 Y407T 明智地替換大殘基而產生。在這兩種不同的重鏈與抗 CD3 輕鏈共表達後，抗 CD3/CD4-IgG 雜合體代表高達 92% 的蛋白 A 純化的蛋白質庫。相反，在共表達後僅回收達 57% 的抗 CD3/CD4-IgG 雜合體，其中重鏈含有野生型 CH3 結構域。因此，杵臼 (Knobs-into-holes) 工程有助於構建抗體/免疫黏附素雜合體和可能的其他含 Fc 的雙功能治療劑，包括雙特異性免疫黏附素和雙特異性抗體。Atwell et al, 1997,J Mol Biol (Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library) 公開了 Fc 結構域的 CH3 結構域中杵臼突變（杵：T366W/臼：T366S+L368A+Y407V）用於改善異二聚化。這一概念透過額外引入半胱氨酸殘基以在異二聚體 CH3 結構域之間形成穩定的二硫鍵而得到了進一步的改善，如 Merchant et al. 1998, Nature Biotechnology (An Efficient Route to Human Bispecific IgG) 所述。

產生異二聚體分子的其他概念公開如下：Muda et al.2011, PEDS (Therapeutic assessment of SEED: a new engineered antibody platform designed to generate mono- and bispecific antibodies)；Gunasekaran et al. 2010,J Biol Chem (Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG)； Moore et al. 2011,MAbs (A novel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens)；Von Kreudenstein et al. 2013,MAbs (Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability:quality by molecular design)。Ha et al. 2016,Front Immunol (Immunoglobulin Fc Heterodimer Platform Technology: From Design to Application in Therapeutic Antibodies and Proteins) 和 Liu et al. 2017,Front Immunol (Fc Engineering for Developing Therapeutic Bispecific Antibodies and Novel scaffolds) 總結和評述了這些概念。

透過將由鉸鏈、CH2 和 CH3 結構域或其部分組成的 Fc 部分納入到雙特異性分子中，出現了由 Fc:Fc-γ受體 (FcgR) 相互作用誘導的這些分子的非特異性固定的問題。FcgR 由不同的細胞表面分子（FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIb、FcgRIII）組成，其與 IgG 分子的 Fc 部分顯示的表位元具有不同的親和力。由於 i) 對分子的藥代動力學的影響和 ii) 對免疫效應細胞的脫靶啟動，這種非特異性（即，不是由雙特異性分子的兩個結合結構域中的任一個誘導）固定是不利的，因此，已確定消融 FcgR 結合性的各種 Fc 變體和突變。

Morgan et al. 1995, Immunology (The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, FcyRI and FcyRIII binding) 公開了人 IgG1 的殘基233-236與來自人 IgG2 的相應序列交換，導致消除 FcgRI 結合、消除 C1q 結合並減少 FcgRIII 結合。

EP1075496 公開了具有 Fc 區變異的抗體和其他含 Fc 的分子（233P、234V、235A 和在 236 位置無殘基或 G 以及 327G、330S 和 331S），其中重組抗體能夠與靶分子結合而不引發顯著的補體依賴性裂解或細胞介導的靶標破壞。

使用雙親和重新靶向 (DART) 分子以實現，例如：B 細胞淋巴瘤的最佳重新定向的 T 細胞殺傷。Moore 等人描述了最初的 DART 技術（在：Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma, Blood.2011 Apr 28;117(17):4542-51 一文）。與攜帶相同 CD19 和 CD3 抗體 Fv 序列的單鏈雙特異性抗體的比較顯示 DART 分子在引導 B 細胞裂解方面更有效。DART 技術的進一步發展由 DART-Fc 分子實現，如 Root et al, 2016 antibodies (Development of PF-06671008, a Highly Potent Anti-P-cadherin/Anti-CD3 Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment of Cancer) 一文所述。該分子結合了 DART 的高效力以及其他積極特徵，延長了基於 Fc 的分子的血清半衰期。

αβ TCR (TCR) 識別 MHC 呈遞的抗原肽，並負責 T 細胞的特異性。TCR 的 α 鏈和 β 鏈都具有可變 (V) 和恒定結構域。V 結構域參與結合抗原肽，恒定結構域穿過 T 細胞膜。根據結合于肽-MHC 複合體的 TCR 的晶體結構分析，Vα 和 Vβ 鏈的互補決定區 (CDR) 3優選與肽相互作用，而 CDR 1和CDR 2與 MHC 相互作用。但是，也有透過 CDR 1 識別肽和透過 CDR 3 識別 MHC 的描述 (Piepenbrink et al, The basis for limited specificity and MHC restriction in a T cell receptor interface, Nat Commun, 2013; 4, 1948)。TCR αβ 異二聚體與 CD3 蛋白、CD4 或 CD8 以及其他黏附和信號轉導蛋白密切相關。抗原肽與TCR V 區的結合經 CD3 和 CD4 或 CD8 細胞質蛋白透過 TCR 恒定結構域的信號轉導觸發 T 細胞活化。

與用於工程、可溶性蛋白質表達和具有臨床潛力的全長 TCR 形式相比，單鏈 TCR (scTCR) 具有顯著優勢。從可溶性蛋白質表達（即，製造）的角度來看，scTCR 作為單一多肽生產，避免了將每個 TCR 鏈作為單獨多肽生產的要求，並且允許生產更大量的與其肽 MHC 配體結合的正確組裝的 scTCR。該特徵可以允許臨床使用所需的產量。最後，從臨床角度來看，僅由 V 區 (scTv) 組成的 scTCR 可以設計為類似 toscFv 片段的治療劑或診斷試劑。

US 2006-0166875 公開了單鏈 T 細胞受體 (scTCR)，其包含由與 TCRα 鏈恒定區細胞外序列的 N 末端融合的 TCRα 鏈可變區序列構成的 α 區段、由與 TCRβ 鏈恒定區細胞外序列的 N 末端融合的 TCRβ 鏈構成的 β 區段、將 α 區段的C 末端與 β 區段的 N 末端連接的連接序列（反之亦然）、透過二硫鍵連接的 α 和 β 區段的恒定區細胞外序列，連接序列的長度和二硫鍵的位置使得 α 和 β 區段的可變區序列基本上相互定向為天然 α/β T 細胞受體。還公開了兩種或更多種此類 scTCR 的複合體，以及 scTCR 在治療和各種篩選應用中的用途。與 US 2006-0166875 中描述的 scTCR 相反，US2012-0252742 公開了不含恒定結構域的可溶性人單鏈 TCR，其僅由 TCR的可變片段 (scTv) 組成，可用於多種目的，包括癌症、病毒性疾病和自身免疫性疾病的治療。

McCormack E 等人（在：Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors.Cancer Immunol Immunother.2013 Apr;62(4):773-85 一文中）公開了 NY-ESO-1 和 LAGE-1 為癌症睾丸抗原，具有理想的腫瘤免疫治療特徵，結合了許多癌症類型的上調，在正常組織中具有高度限制性表達並共用共同的 HLA-A*0201 表位 157-165。他們提供資料描述了雙重功能 ImmTAC 的特異性和抗腫瘤活性，其包含對融合至抗-CD3 scFv 的 NY-ESO-1157-165 具有特異性的可溶性高親和力 T 細胞受體 (TCR)。該試劑 ImmTAC-NYE 顯示可殺滅 HLA-A2、抗原陽性腫瘤細胞系和新分離的 HLA-A2 和 LAGE-1陽性 NSCLC 細胞。採用體內光學成像的結果顯示，螢光標記的高親和力 NYESO 特異性 TCR 體內靶向作用於異種移植小鼠中的 HLA-A2、NY-ESO-1157-165 陽性腫瘤。在腫瘤模型中測試了體內 ImTAC-NYE 的療效，其中人淋巴細胞穩定地共移植到攜帶腫瘤異種移植物的免疫缺陷 NSG 小鼠中；使用 GFP 螢光讀數在腫瘤預防模型和建立的腫瘤模型中觀察到了療效。使用定量 RT-PCR 分析了 NY-ESO-1 和 LAGE-1 抗原在 15 種正常組織、5 種癌細胞系、10 種 NSCLC 和 10 種卵巢癌樣本中的表達。總體而言，LAGE-1 RNA 在腫瘤樣本中以比 NY-ESO-1 更高的頻率和更高的水準表達。ImmTAC 包含衍生自共價連接至 TCR α 或 β 鏈 C-或 N-末端的抗-CD3 抗體 UCHT-1 的單鏈 Fv。

EP1868650 涉及雙抗體分子及其在治療多種疾病和病症中的用途，包括免疫病症、傳染病、中毒和癌症。雙抗體分子包含兩條多肽鏈，其結合形成至少兩個表位結合位點，其可識別相同或不同抗原上的相同或不同表位。另外，抗原可能來自相同或不同的分子。雙抗體分子的各個多肽鏈可透過非肽鍵共價鍵共價結合，例如但不限於位於每條多肽鏈內的半胱氨酸殘基的二硫鍵合。在特定實施方案中，雙抗體分子還包含 Fc 區，其在本文中公開，因為其允許將抗體樣特性（例如，長半衰期）設計到分子中。EP1868650 要求存在免疫球蛋白的輕鏈或重鏈可變結構域的結合區，並廣泛討論了功能性 Fc 受體結合物。

WO 2016/184592 A1 公開了雙特異性分子，其中一種特異性由 TCR 提供，另一種特異性由針對淋巴細胞表面上抗原或表位的抗體提供，但沒有公開 TCR 元素的特定排列以及本文公開的抗體可變區。

EP2258720A1 涉及功能性 T 細胞受體 (TCR) 融合蛋白 (TFP)，其識別並結合至少一種 MHC 呈遞的表位，並含有至少一種識別和結合抗原的氨基酸序列。

本發明的一個目的是提出能夠靶向作用于肽-MHC 複合體的改良雙特異性分子，其可以容易地生產、顯示出高穩定性並且當與各抗原表位結合時還提供高效力。在研究以下說明及其優選實施方案以及各實施例時，本發明的其他目的和優點將變得顯而易見。

在本發明的第一方面，透過提出選自包含第一多肽鏈和第二多肽鏈的分子組的雙特異性多肽分子來解決上述目的，其中： 第一多肽鏈包含與人免疫效應細胞的細胞表面抗原特異性結合的抗體的可變結構域 (VD1) 的第一結合區，和 與 MHC 相關肽表位特異性結合的 TCR 的可變結構域 (VR1) 的第一結合區，和 連接所述結構域的第一接頭 (LINK1)； 第二多肽鏈包含與 MHC 相關肽表位特異性結合的 TCR 的可變結構域 (VR2) 的第二結合區，和 與人免疫效應細胞的細胞表面抗原特異性結合的抗體的可變結構域 (VD2) 的第二結合區，和 連接所述結構域的第二接頭 (LINK2)； 其中所述第一結合區 (VD1) 和所述第二結合區 (VD2) 結合形成結合細胞表面分子表位的第一結合位點 (VD1)(VD2)； 所述第一結合區 (VR1) 和所述第二結合區 (VR2) 結合形成結合所述 MHC 相關肽表位的第二結合位點 (VR1) (VR2)； 其中所述兩條多肽鏈與人 IgG 鉸鏈結構域和/或人 IgG Fc 結構域或其二聚化部分融合；和 其中所述兩條多肽鏈透過所述鉸鏈結構域和/或 Fc 結構域之間的共價鍵和/或非共價鍵連接；和 其中所述雙特異性多肽分子能夠同時結合細胞表面分子和 MHC 相關肽表位，和 雙特異性多肽分子，其中多肽鏈中結合區的順序選自 VD1-VR1、VD1-VR2、VD2-VR1、VD2-VR2、VR1-VD1、VR1-VD2、VR2-VD1、VR2-VD2，其中結構域透過 LINK1 或 LINK2 連接。

優選的是包含第一多肽鏈和第二多肽鏈的雙特異性多肽分子，其中：第一多肽鏈包含源自透過特異性結合所述細胞表面抗原能夠募集人免疫效應細胞的抗體的可變結構域的第一結合區，和源自與 MHC 相關肽表位特異性結合的 TCR 的可變結構域 (VR1) 的第一結合區，和連接兩個結構域的第一接頭部分 (LINK1)；第二多肽鏈包含源自與 MHC 相關肽表位特異性結合的 TCR 的可變結構域 (VR2) 的第二結合區，和源自透過特異性結合所述細胞表面抗原能夠募集人免疫效應細胞的抗體的可變結構域 (VD2) 的第二結合區，和連接兩個結構域的第二接頭部分 (LINK2)；其中所述第一結合區 (VD1) 和所述第二結合區 (VD2) 結合形成結合細胞表面分子表位的第一結合位點 (VD1)(VD2)；所述第一結合區 (VR1) 和所述第二結合區 (VR2) 結合形成結合所述 MHC 相關肽表位的第二結合位點 (VR1) (VR2)；其中至少一條所述多肽鏈在其 c-末端與衍生自人 IgG 的鉸鏈區、CH2 和/或 CH3-結構域或其部分連接；和其中所述雙特異性多肽分子能夠同時結合免疫效應細胞抗原和MHC相關肽表位。

優選地，根據本發明所述的雙特異性多肽分子以高特異性與免疫效應細胞抗原和作為肽-MHC 複合體呈遞的特異性抗原表位結合，例如，結合親和力 (KD) 為約 100nM 或更低、約 30nM 或更低、約 10nM 或更低、約 3nM 或更低、約 1nM 或更低，透過實施例 6 中描述的生物層干涉測量法測量或透過流式細胞術測定。

根據本發明所述的本發明雙特異性多肽分子在此透過雙特異性多肽分子舉例說明，其包含含有 SEQ ID No.16 的第一多肽鏈和含有 SEQ ID No.17 的第二多肽鏈。

在本發明的第二方面，透過提出編碼本文公開的第一多肽鏈和/或第二多肽鏈的核酸，或包含這種核酸的表達載體，解決了上述目的。在本發明的第三方面，透過提出包含本文定義的載體的宿主細胞解決上述目的。

在本發明的第四方面，透過提出一種產生根據本發明所述的雙特異性多肽分子的方法解決上述目的，該方法包括適當表達包含宿主細胞中所公開核酸的所述表達載體以及適當純化來自細胞和/或其培養基的分子。

在本發明的第五方面，透過提出藥物組合物解決上述目的，所述藥物組合物包含根據本發明所述的雙特異性多肽分子、根據本發明所述的核酸或表達載體或根據本發明所述的細胞以及一種或多種藥用載體或賦形劑。

在本發明的第六方面，本發明涉及根據本發明所述的雙特異性多肽分子、根據本發明所述的核酸或表達載體、根據本發明所述的細胞或根據本發明所述的藥物組合物用於藥物中。

在本發明的第七方面，本發明涉及根據本發明所述的雙特異性多肽分子、根據本發明所述的核酸或表達載體、根據本發明所述的細胞或根據本發明所述的藥物組合物用於治療本文公開的疾病或病症，特別是癌症和傳染病。

在本發明的第八方面，本發明涉及治療疾病或病症的方法，包括給予治療有效量的根據本發明所述的雙特異性多肽分子、根據本發明所述的核酸或表達載體、根據本發明所述的細胞或根據本發明所述的藥物組合物。

在本發明的第九方面，本發明涉及在患者或受試者中引發免疫應答的方法，包括給予治療有效量的根據本發明所述的雙特異性多肽分子或根據本發明所述的藥物組合物。

在第十方面，本發明涉及殺滅患者或受試者靶細胞的方法，包括向患者施用有效量的根據本發明所述的雙特異性多肽分子。

如上所述，本發明提出了新的和改良的雙特異性多肽分子。分子通常包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中所述鏈共同提供對免疫效應細胞表面抗原表位具有特異性的抗體的可變結構域，以及對 MHC 相關肽表位（例如：癌症表位或因感染而呈遞表位，如：HIV 等病毒感染）具有特異性的 TCR 的可變結構域。抗體和 TCR 衍生可變結構域透過位於兩條多肽鏈上的 Fc 部分或其所屬部分之間形成的共價和非共價鍵來穩定。然後，雙特異性多肽分子能夠同時結合細胞受體和 MHC 相關肽表位。

在本發明的背景中，可變結構域 (VD1) 和 (VD2) 衍生自能夠透過特異性結合所述效應細胞的表面抗原而募集人免疫效應細胞的抗體。在一具體實施方案中，所述抗體與人 T 細胞的TCR-CD3 複合體的表位特異性結合，包括肽鏈 TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε 和 CD3ζ。

根據本發明所述的雙特異性多肽分子包含第一多肽和第二多肽鏈，其透過特異性結合所述細胞的表面抗原分別提供衍生自能夠募集人免疫效應細胞的抗體的可變結構域的第一 (VD1) 和第二 (VD2) 結合區。第一結合區 (VD1) 和所述第二結合區 (VD2) 結合形成結合免疫效應細胞表面抗原表位的第一結合位點 (VD1)(VD2)。此外，多肽分子的第一和第二多肽鏈分別包含分別來自對 MHC 相關肽表位具有特異性的 TCR 的可變結構域的第一 (VR1) 和第二 (VR2) 結合區。所述第一結合區 (VR1) 和所述第二結合區 (VR2) 結合形成結合所述 MHC 相關肽表位的第二結合位點 (VR1) (VR2)。在根據本發明所述的雙特異性多肽分子的一項實施方案中，第一多肽鏈中的區域的順序/方向選自 VD1-LINK1-VR1 和 VR1-LINK1-VD1；在另一實施方案中，第二多肽鏈中的區域的順序/方向選自 VD2-LINK2-VR2 和 VR2-LINK-VD2，即，結合位點的排列可以重新排列成「左」或「右」分子（參見，例如，圖5）。此外，可以切換 TCR 相關部分的 α 鏈和 β 鏈的構型。

在本發明的背景中，根據本發明所述的雙親和性多肽分子的實例為呈遞為肽 MHC複合體時結合 SLYNTVATL肽 (SEQ ID No. 7) 的構建體。然而，本發明的概念顯然不限於該特定肽，並且基本上包括在有 MHC 分子情況下呈遞的任何疾病或病症相關表位。此呈遞可能與 MHC I 或 II 類相關。主要組織相容性複合體 I 類 (MHC-I) 分子存在于所有有核細胞的表面上，並顯示大量肽表位元用於 CD8+ T 細胞庫的監測。CD8+ T 細胞應答對於控制和清除病毒感染以及消除轉化和致瘤細胞是必需的。待識別的優選肽表位元的實例可在各文獻中找到，尤其包括 WO 2016/170139 表 1 至 5 中、WO 2016/102272表 1 至 5、WO 2016/156202 表 1 或 2、WO 2016/146751 表 1 至 4、WO 2011/113819 表 2、WO 2016/156230 表 1 至 4b、WO 2016/177784 表 1 至 4b、WO 2016/202963 表 1 至 4、WO 2016/207164 表 1 和表 2、WO 2017/001491 表 1 至 4、WO 2017/005733 表 1 至 4、WO 2017/021527 表 1 至 8、WO 2017/036936 表 1 至 3、用於癌症治療的 PCT/EP2016/073416 表 1 至 4、美國專利公開號 2016-0187351、美國專利公開號 2017-0165335、美國專利公開號 2017-0035807、美國專利公開號 2016-0280759、美國專利公開號 2016-0287687、美國專利公開號 2016 -0346371、美國專利公開號 2016-0368965、美國專利公開號 2017-0022251、美國專利公開號 2017-0002055、美國專利公開號 2017-0029486、美國專利公開號 2017-0037089、美國專利公開號 2017-0136108、美國專利公開號 2017-0101473、美國專利公開號 2017-0096461 、美國專利公開號 2017-0165337、美國公開2017-0189505、美國專利公開號 2017-0173132、美國專利公開號 2017-0296640、美國專利公開號 2017-0253633和美國專利公開號 2017-0260249 中所公開的肽，這些申請中每一個申請的內容透過完整引用併入本文。另一方面，根據本發明所述的雙親和性多肽分子可識別由上述專利申請中所述的任何肽組成的肽。

一方面，根據本發明所述的雙親和性多肽分子結合或能夠特異性地被識別/結合一種或多種肽，總長度為 8 至 100 個氨基酸、8 至 30 個氨基酸、8 至 16 個氨基酸，優選為 8 至 14 個氨基酸，即 8、9、10、11、12、13、14個氨基酸，在拉長 II 類結合肽的情況下，長度也可以是 15、16、17、18、19、20、21 或 22 個氨基酸。另一個方面，根據本發明所述的雙親和性多肽分子結合或能夠特異性地識別/結合一種或多種肽，總長度為 8 至 12 個氨基酸、8 至 10 個氨基酸、9 至 15 個氨基酸、9 至 14 個氨基酸、9 至 13 個氨基酸、9 至 12 個氨基酸、9 至 11 個氨基酸；10 至 15 個氨基酸、10 至 14 個氨基酸、10 至 13 個氨基酸或 10 至 12 個氨基酸。

其他合適的表位元可以從資料庫中確定，例如免疫表位元資料庫（www.iedb.org 上提供）。

術語「人免疫效應細胞」是指人免疫系統中天然細胞庫中的細胞，其在被啟動時能夠引起靶細胞活力的變化。術語「靶細胞活力」在本發明的範圍內可能指靶細胞存活、增殖和/或與其他細胞相互作用的能力。這種相互作用可以是直接的（例如：當靶細胞與另一個細胞接觸時）或間接的（例如：當靶細胞分泌對另一個遠端細胞功能有影響的物質時）。靶細胞可以是人天然或外來細胞。如果是人天然細胞，有利的情況是，靶細胞是經歷轉化成為惡性細胞的細胞。天然細胞還可以是病理學修飾的天然細胞，例如：被病毒、瘧原蟲或細菌等生物體感染的天然細胞。如果是人外來細胞，有利的情況是，靶細胞是入侵病原體，例如：入侵細菌或瘧原蟲。

優選的是根據本發明所述的雙特異性多肽分子，其中所述第一和第二多肽鏈還包含至少一個鉸鏈結構域和/或 Fc 結構域或其部分。在抗體中，「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「鉸鏈結構域」是指位於 CH1 結構域和 CH2 結構域之間重鏈的柔性部分。它長約 25 個氨基酸，分為「上鉸鏈」、「中間鉸鏈」或「核心鉸鏈」和「下鉸鏈」。「鉸鏈子結構域」是指上鉸鏈、中（或核心）鉸鏈或下鉸鏈。IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4 分子鉸鏈的氨基酸序列為（EU 編號指示）： IgG1：E₂₁₆ PKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID No. 1) IgG2：E₂₁₆ RKCCVECPPCPAPPVAGP (SEQ ID No. 2) IgG3：ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE₂₁₆ PKSCDTPPPCPRCPAPELLG (SEQ ID No. 3) IgG4：E₂₁₆ SKYGPPCPSCPAPEFLG (SEQ ID No. 4) 核心鉸鏈區通常含有至少一個連接兩條重鏈的半胱氨酸橋。此外，可以在下鉸鏈區進行突變以改善不需要的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)。

優選的是根據本發明所述的雙特異性多肽分子，其包含至少一個 IgG可結晶片段 (Fc) 結構域，即可結晶片段區（Fc 區）、與 Fc 受體相互作用的抗體尾區和補充系統的一些蛋白質。Fc 區在每條多肽鏈中含有兩個或三個重鏈恒定結構域（CH 結構域 2、3 和 4）。IgG 的 Fc 區也帶有高度保守的 N-糖基化位點。Fc 片段的糖基化對於 Fc 受體介導的活性是必需的。小尺寸雙特異性抗體形式，如：BiTEs® 和 DARTs (~50 kD)，可以快速清除並縮短半衰期。因此，為了改善藥代動力學性質，scTv-細胞受體（例如 CD3）雙特異性多肽分子可以與（人 IgG1）Fc 結構域融合，從而增加分子量。位於 CH2 和 CH3 結構域之間介面的幾個突變，如：T250Q/M428L 和 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F，已被證明可增加對新生兒 Fc 受體 (FcRn) 的結合親和力和半衰期。由此，可以進一步延長含 Fc 分子的血清半衰期。

在本發明的雙特異性多肽分子中，所述 Fc 結構域可包含 CH2 結構域，其含有至少一個效應子功能沉默突變。優選地，將這些突變引入已知與效應子功能相關的人 IgG1 （殘基 233-238）或其他同種型的相應殘基的 ELLGGP (SEQ ID No.50) 序列中。原則上，將對應於衍生自 IgG2 和/或 IgG4 殘基的一個或多個突變引入 IgG1 Fc。優選為：E233P、L234V、L235A 和在位置 236 無殘基或G。另一種突變為 P331S。EP1075496 公開了包含嵌合結構域的重組抗體，所述嵌合結構域衍生自兩個或更多個人免疫球蛋白重鏈 CH2 結構域，其選自 IgG1、IgG2 和 IgG4，並且其中所述嵌合結構域為人免疫球蛋白重鏈 CH2 結構域，其根據EU編號系統，在所述位置有下列氨基酸塊：233P、234V、235A 和在 236 位置無殘基或 G 以及 327G、330S 和 331S，並且與 來自具有所述修飾氨基酸的 人 IgG1、IgG2 或 IgG4 的CH2 序列（殘基 231-340）至少 98% 相同。

要使用的優選 CH2 部分序列的實例可（完全或部分）如下： 231-APPVA ‑GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQ STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAS IEK - 334 (SEQ ID No. 5); 和 231-APPVA ‑GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAS IEK-334 (SEQ ID No. 6)，具有下劃線變化，在 297 位置攜帶 N（糖基化變體）或選自 A、G 和 Q 組（去糖基化變體）的殘基。

在本發明的雙特異性多肽分子中，所述 Fc 結構域可包含 CH3 結構域，其含有至少一個促進異二聚體形成的突變。為了使所需的異二聚體雙特異性-Fc 蛋白的產量最大化並簡化純化程序，可以將「杵臼結構」突變工程化入 Fc 結構域中。採用這種設計，透過向一條鏈添加突出的大疏水殘基（「杵」）並在另一條鏈上產生互補疏水袋（「臼」），驅動 Fc 結構域形成異二聚體而不非它們的正常同二聚體。「杵」變體可以透過用較大的氨基酸替換小氨基酸來插入到對側結構域中的「臼」中，所述對側結構域透過用較小的殘基替換大的殘基而產生 (Ridgway, J.B.B.; Presta, L.G.; Carter, P. “Knobs-into-holes” engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.Protein Eng. 1996, 9, 617–621; WO 2002/002781)。

優選的是根據本發明所述的雙特異性多肽分子，其中所述杵臼結構突變選自 T366W作為杵以及 T366'S、L368'A 和 Y407'V 作為 CH3 結構域中的臼（參見，例如 WO 98/50431）。透過包含突變 K409A 和 F405'K 可以進一步擴展該組突變，如 Wei et al. (Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production, Oncotarget. 2017) 一文所述。另一個杵可以是 T366Y，臼為 Y407'T。

本發明的雙特異性多肽分子還可以包含在第一多肽鏈上的至少一個半胱氨酸殘基和第二多肽鏈上的至少一個半胱氨酸殘基之間的人工引入的半胱氨酸橋，以便改善分子的穩定性，最佳情況是不干擾具有二價分子的結合特徵，和/或用於改善異二聚化。為了增加穩定性，可透過在杵和臼鏈的 CH3 結構域中添加單個半胱氨酸來引入二硫鍵。優選的是根據本發明所述的雙特異性多肽分子，其中 Fc 結構域包含含有至少一個另外的半胱氨酸殘基的 CH3 結構域，例如：S354C 和/或 Y349C。

優選的是根據本發明所述的雙特異性多肽分子，其中所述 CD 分子選自免疫應答相關的 CD 分子組、CD3（例如：CD3γ、CD3δ 和 CD3ε 鏈）、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD18、CD22、CD25、CD28、CD32a、CD32b、CD33、CD41、CD41b、CD42a、CD42b、CD44、CD45RA、CD49、CD55、CD56、CD61、CD64、CD68、CD94、CD90、CD117、CD123、CD125、CD134、CD137、CD152、CD163、CD193、CD203c、CD235a、CD278、CD279、CD287、Nkp46、NKG2D、GITR、FcεRI、TCRα/β、TCRγ/δ 和 HLA-DR。取決於根據本發明所述的雙特異性多肽分子的兩種抗原結合實體的組合，可以實現關於分子功能的特定優勢，特別是增強活性。

優選的是根據本發明所述的示例性雙特異性多肽分子，其中第一多肽鏈中的區域包含 VD1 的 SEQ ID No.28、VR1 的 SEQ ID No.29、LINK1 的 SEQ ID No.3；第二多肽鏈中的區域包含 VD2 的 SEQ ID No.31、VR2 的 SEQ ID No.32 和 LINK2 的 SEQ ID No.30。

進一步優選的是根據本發明所述的示例性雙特異性多肽分子，其中第一多肽鏈中的 FC 區包含 SEQ ID No.26 (Fc1)，第二多肽鏈中的 FC 區包含SEQ ID No.27 (Fc2)。

進一步優選的是根據本發明所述的示例性雙特異性多肽分子，其包含含有 SEQ ID No.16 的第一多肽鏈（1. 全分子鏈）和含有 SEQ ID No.17 的第二多肽鏈（2. 全分子鏈）。

更進一步優選的是根據本發明所述的示例性雙特異性多肽分子，其中結合人免疫細胞（例如 CD3）表面抗原的表位的所述第一結合位點 (VD1) (VD2) 人源化；和/或結合所述 MHC 相關肽表位的所述第二結合位點 (VR1) (VR2) 親和力成熟。

人源化抗體是來自非人物種的抗體（或其部分），其蛋白質序列已經被修飾以增加它們與人體天然產生的抗體變體的相似性。「人源化」工藝通常應用於為人體施用而開發的單克隆抗體（例如，作為抗癌藥物開發的抗體）。用於人源化的合適方法可從文獻中獲知，例如在 Olimpieri, Pier Paolo, Paolo Marcatili 和 Anna Tramontano 中綜述。“Tabhu:Tools for Antibody Humanization.”Bioinformatics 31.3 (2015):434–435. PMC; Safdari Y, Farajnia S, Asgharzadeh M, Khalili M. Antibody humanization methods - a review and update.Biotechnol Genet Eng Rev. 2013;29:175-86; or Ahmadzadeh V, Farajnia S, Feizi MA, Nejad RA.Antibody humanization methods for development of therapeutic applications. MonoclonAntibImmunodiagnImmunother. 2014 Apr;33(2):67-73.

通常，TCR 和抗體的體外親和力成熟可以根據文獻中描述的方法獲得，特別是使用酵母或噬菌體表面展示技術（基於，例如：Holler PD, et al.In vitro evolution of a T cell receptor with high affinity for peptide/MHC.Proc Natl Acad Sci USA.2000 May 9; 97(10):5387-92；Boder ET et al., Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity.Proc Natl Acad Sci USA.2000 Sep 26; 97(20):10701-5；以及作為最近的一個實例，Zhao Q, et al.Affinity maturation of T-cell receptor-like antibodies for Wilms tumor 1 peptide greatly enhances therapeutic potential. Leukemia. 2015; 29(11):2238-2247）。

本說明書中的結合位點 (VD1) (VD2) 和 (VR1) (VR2) 優選分別特異性結合至人免疫細胞的表面抗原和肽-HLA 分子複合體。與本說明書結合位點相關，本文所使用的「特異性結合」及其語法變體用於表示對肽-HLA 分子複合體和/或 100μM 或更小的抗體表位具有結合親和力 (KD) 的位點。本說明書的結合位點 (VD1) (VD2) 和 (VR1) (VR2) 分別與 CD 抗體表位或肽-HLA 分子複合體結合，結合親和力 (KD) 為約 100μM或更低、約 50μM 或更低、約 25μM 或更低，或約 10μM 或更低。更優選的是具有約 1μM 或更低、約 100nM 或更低、約 50nM 或更低、約 25nM 或更低、約 10nM 或更低、約 5nM 或更低、約 2nM 或更低、約 1nM 或更低、約 500pM 或更低、約 200pM 或更低、約 100pM 或更低的結合親和力的高親和力結合位點。本發明結合位點的優選結合親和力範圍的非限制性實例包括約 10pM 至約 100pM、100pM 至約 1nM、1nM 至約 10nM、約 10nM 至約 20nM、約 20nM 至約 30nM、約 30nM 至約 40nM、約 40nM 至約 50nM、約 50nM 至約 60nM、約 60nM 至約 70nM、約 70nM 至約 80nM、約 80nM 至約 90nM、約 90nM 至約 100nM，例如，如實施例 6 中所述，透過生物層干涉測量法測量。

一方面，本公開內容提出了與本文所述的氨基酸序列具有至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98% 或至少 99% 序列同一性的多肽，例如：氨基酸序列 1 至 58。另一方面，本公開內容提出了與本文所述的氨基酸序列具有至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98% 或至少 99% 序列同一性的第一或第二多肽。再一方面，本公開內容提出了與本文所述的一個或多個氨基酸序列具有至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98% 或至少 99% 序列同一性的雙特異性多肽分子。本公開內容進一步提出了一些方面，其中至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98% 或至少 99% 的百分比同一性適用於圖 1 中描述的任何結構區序列，例如：VD1、VR1、Link1、VR2、VD2、Link2 或鉸鏈區，並且如本文所述或是本文所公開的序列的一部分。

一方面，本文所述的多肽或雙特異性多肽分子可以以各種方式改變，包括氨基酸取代、缺失、截短以及插入一個或多個氨基酸。另一方面，本文所述的多肽或雙特異性多肽分子可能包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45 或50 或更多個氨基酸取代、缺失或插入。再一方面，本文所述的多肽或雙特異性多肽分子可能包括 1 至 5、1 至 10、1 至 20、2 至 5、2 至 10、5 至 20、5 至 50 或 10 至 100 個氨基酸取代、缺失或插入。一方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45 或50 或更多個氨基酸取代、缺失或插入適用於圖 1 中描述的任何結構區，例如：VD1、VR1、Link1、VR2、VD2、Link2 或鉸鏈區。本公開內容進一步提出了一些方面，其中 1 至 5、1 至 10、1 至 20、2 至 5、2 至 10、5 至 20、5 至 50 或 10 至 100 個氨基酸取代、缺失或插入適用於圖 1 中描述的任何結構區的序列，例如：VD1、VR1、Link1、VR2、VD2、Link2 或鉸鏈區，並且如本文所述或是本文所公開序列的一部分。

一方面，可以將 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45 或50 或更多個氨基酸添加到本文所述的多肽或雙特異性多肽分子的 N 末端或 C 末端，例如：氨基酸序列 1 至 58。

一方面，VD1 可能與 SEQ ID NO:28 的氨基酸序列具有至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 同一性。

一方面，VR1 可能與 SEQ ID NO:29 的氨基酸序列具有至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 同一性。

一方面，LINK1 或 LINK2 可能與 SEQ ID NO:30 的氨基酸序列具有至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 同一性。

一方面，VD2 可能與 SEQ ID NO:31 的氨基酸序列具有至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 同一性。

一方面，VR2 可能與 SEQ ID NO:32 的氨基酸序列具有至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 同一性。

一方面，鉸鏈可能與 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 的氨基酸序列具有至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 同一性。一方面，CH2 結構域可能與 SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6 的氨基酸序列具有至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 同一性。

一方面，Fc 區可能與 SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:27 的氨基酸序列具有至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 同一性。

一方面，本公開內容提出了與 SEQ ID NO:43、44、45 或 46 的氨基酸序列具有至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98% 或至少 99% 序列同一性的多肽。

一方面，本文公開的多肽或雙特異性多肽分子可以透過在多肽鏈內的不同（可能為選擇性）位點上取代一個或多個殘基而被修飾。此取代可能是保守性的，例如，其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所取代，比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的取代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關，這是確定「保守取代」的基礎。

在根據本發明所述的雙特異性多肽分子的另一優選實施方案中，所述分子攜帶與其偶聯或共軛的活性劑或其部分。所述活性劑可選自由可檢測標記、免疫刺激分子和治療劑組成的組。

可檢測標記可選自由生物素、鏈黴抗生物素蛋白、酶或其催化活性片段、放射性核素、納米顆粒、順磁性金屬離子，或螢光、磷光或化學發光分子組成的組。用於診斷目的的可檢測標記包括例如：螢光標記、放射性標記、酶、核酸探針和造影劑。

可能與本發明分子相關的治療劑包括免疫調節劑、放射性化合物、酶（例如：穿孔素）、化學治療劑（例如：順鉑）或毒素。其他合適的治療劑包括小分子細胞毒性劑，即具有殺死分子量小於 700 道爾頓的哺乳動物細胞能力的化合物。此類化合物還可含有能夠具有細胞毒性作用的有毒金屬。此外，應理解這些小分子細胞毒性劑還包括前體藥物，即在生理條件下衰變或被轉化以釋放細胞毒性劑的化合物。此類藥劑的實例包括順鉑、美登素衍生物、雷查黴素、卡奇黴素、多西他賽、依託泊苷、吉西他濱、異環磷醯胺、伊立替康、美法侖、米托蒽醌、嚇吩姆鈉光敏素 II、替莫唑胺、拓撲替康、葡糖醛酸三甲曲沙、耳他汀 E、長春新堿和多柔比星；肽細胞毒素，即，具有殺傷哺乳動物細胞能力的蛋白質或其片段。例如，蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌細菌外毒素 A、Dnase 和 RNase；放射性核素，即元素的不穩定同位素，其在衰減的同時發出一種或多種的 α 或 β 粒子或 γ 射線。例如，碘-131、錸-186、銦-111、釔-90、鉍-210 和 -213、錒-225 和 砹-213；螯合劑可用於促進這些放射性核素與分子或其多聚體的結合；免疫刺激劑，即，刺激免疫應答的免疫效應分子。例如，細胞因子（如 IL-2 和 IFN-γ）、趨化因子（如：IL-8）、血小板因子 4、黑色素瘤生長刺激蛋白、補體啟動劑；或異種蛋白結構域、同種異體蛋白結構域、病毒/細菌蛋白結構域、病毒/細菌肽。

然後，本發明的另一方面涉及編碼本文公開的第一多肽鏈和/或第二多肽鏈的核酸分子，或包含這種核酸的表達載體。核酸分子可以 DNA、cDNA、PNA、RNA 及其組合。編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列，也可為合成核苷酸序列。一般來說，編碼肽、多肽以及本發明蛋白的 DNA 片段由 cDNA 片段和短寡核苷酸銜接物，或一系列寡核苷酸組成，以提供一種合成基因，該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調節元素的重組轉錄單元中被表達。術語「表達產物」系指多肽或蛋白，它是基因序列和任何核酸序列的翻譯產物，這些序列編碼遺傳密碼退化所造成的同等物，從而編碼同樣的氨基酸。「片斷」這一術語，當指的是一種編碼序列時，表示包含非完整編碼區的 DNA 的一部分，其表達產物與完整編碼區表達產物基本上具有相同的生物學功能或活性。根據預期用途，可以對核酸進行密碼子優化以在合適的（例如：微生物）宿主細胞中表達。遺傳密碼冗餘讓一些氨基酸被一個以上的密碼子編碼，但某些密碼子沒有其他密碼子「理想」，因為匹配 tRNA 以及其他因子的相對可用性 (Gustafsson et al., 2004)。

該核酸可能為，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA 或其組合物，它們可為單鏈和/或雙鏈、或多聚核苷酸的原生或穩定形式（如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸），並且只要它編碼多肽鏈，就可能包含也可能不包含內含子。

然後可以在合適的宿主中包含和/或表達核酸（例如：DNA）以產生包含本發明多肽鏈的多肽。因此，可根據已知技術使用編碼本發明多肽鏈的核酸（例如DNA），用本文所述方法適當修飾後，構建表達載體，然後表達載體用於轉化合適宿主細胞，從而表達和產生本發明中的多肽，如本領域所知。編碼構成本發明化合物多肽鏈的核酸（例如：DNA，或在逆轉錄病毒載體的情況下，RNA）可能被加入到其他多種核酸（例如：DNA）序列，從而引入到合適的宿主中。同伴核酸將取決於宿主的性質、DNA 引入宿主的方式、以及是否需要保持為游離體還是要相互結合。一般來說，核酸可以適當的方向和正確的表達閱讀框架附著到一種表達載體（如質粒）中。如有必要，該核酸可能與所需宿主所識別的相應轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列連接，儘管表達載體中一般存在此類控制功能。然後，該載體使用標準方法被引入宿主。一般來說，並不是所有的宿主都會被載體轉化。因此，有必要選擇轉化過的宿主細胞。選擇方法包括用任何必要的控制元素向表達載體插入一個核酸序列，該序列對轉化細胞中的可選擇性屬性（如抗生素耐藥性）進行編碼。另外，有這種選擇屬性的基因可在另外一個載體上，該載體用來協同轉化所需的宿主細胞。然後，本發明中的重組核酸所轉化的宿主細胞在本文中所述本領域技術人員熟悉的合適條件下培養足夠長的時間，從而表達之後可回收的肽。

有許多已知的表達系統，包括細菌（如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌）、酵母（如酵母菌）、絲狀真菌（如曲黴菌）、植物細胞、動物細胞及昆蟲細胞。該系統可優選為哺乳動物細胞，如來自 ATCC 細胞生物學庫 (Cell Biology Collection) 中的 CHO 細胞。

在一項實施方案中，該說明書提出了如本文中所描述的產生分子的方法，該方法包括在適於促進所述鏈表達的條件下培養能夠表達多肽鏈的宿主細胞。

一方面，為了獲得表達本說明書分子的細胞，將編碼包含 TCR-α 和/或 TCR-β 結合結構域的多肽鏈的核酸克隆到表達載體中，例如 γ 逆轉錄病毒或慢病毒。另一方面，為了獲得表達本說明書分子的細胞，RNA 透過本領域中已知的技術（例如，體外轉錄系統）合成。然後透過電穿孔將體外合成的 RNA 引入合適的細胞中以表達多肽鏈。

為了增加表達，編碼本說明書鏈 的核酸在操作上可連接到強啟動子，例如逆轉錄病毒長末端重複序列 (LTR)、巨細胞病毒 (CMV)、鼠幹細胞病毒 (MSCV) U3、磷酸甘油酸激酶 (PGK)、β-肌動蛋白、泛素蛋白和猿猴病毒 40 (SV40)/CD43複合啟動子、延伸因子 (EF) -1a和脾臟病灶形成病毒 (SFFV) 啟動子。在一優選實施方案中，啟動子與被表達的核酸異源。除了強啟動子外，本說明書的表達盒可能含有附加的元素，可提高轉基因表達，包括中樞多聚嘌呤區 (cPPT)，其促進了慢病毒構建體的核易位 (Follenzi et al., 2000)，和土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元素 (wPRE)，其透過提高 RNA 穩定性增加轉基因表達水準 (Zufferey et al., 1999)。

本發明分子的 α 和 β 結合結構域鏈可由位於分開的載體核酸進行編碼，或者可透過位於同一載體的多核苷酸編碼。

在一實施方案中，宿主細胞被改變結構以表達本說明書的分子。本說明書的宿主細胞相對於待治療的患者可以為同種異體或自體的。

本發明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含根據本發明所述的雙特異性多肽分子、根據本發明所述的核酸或表達載體或根據本發明所述的細胞以及一種或多種藥用載體或賦形劑。本發明的組合物包括可用於製造藥物組合物的原料藥組合物（例如，雜質或非無菌組合物）和可用於製備單位劑型的藥物組合物（即，適合給予受試者或患者的組合物）。此類組合物包含預防或治療有效量的本文公開的預防和/或治療性雙特異性多肽分子（藥劑）或藥劑和藥用載體的組合。優選地，本發明的組合物包含預防或治療有效量的一種或多種本發明分子和藥用載體。

藥物組合物優選包含游離形式或鹽形式的分子。優選的情況是，鹽為分子的藥用鹽，例如：氯化物或乙酸（三氟乙酸）鹽。必須注意的是，本發明分子的鹽與其體內狀態的分子基本上不同，因為該分子不是體內的鹽。

因此，本發明的一項實施方案涉及根據本發明所述的非天然分子，其已經合成產生（例如：合成）為藥用鹽。合成產生肽和/或多肽的方法是本領域公知的。根據本發明所述分子的鹽與其體內狀態的分子顯著不同，因為這些體內產生的分子不是鹽。優選地，鹽為分子的藥用鹽。本發明的這些鹽包括堿和堿土鹽類，諸如 Hofmeister 系列的鹽，包含陰離子 PO₄ ^3- 、SO₄ ^2- 、CH₃ COO^- 、Cl^- 、Br^- 、NO₃ ^- 、ClO₄ ^- 、I^- 、SCN^- 和陽離子 NH₄ ⁺ 、Rb⁺ 、K⁺ 、Na⁺ 、Cs⁺ 、Li⁺ 、Zn²⁺ 、Mg²⁺ 、Ca²⁺ 、Mn²⁺ 、Cu²⁺ 和 Ba²⁺ 。特別地，鹽選自 (NH₄ )₃ PO₄ 、(NH₄ )₂ HPO₄ 、(NH₄ )H₂ PO₄ 、(NH₄ )₂ SO₄ 、NH₄ CH₃ COO、NH₄ Cl、NH₄ Br、NH₄ NO₃ 、NH₄ CIO₄ 、NH₄ I、NH₄ SCN、Rb₃ PO₄ 、Rb₂ HPO₄ 、RbH₂ PO₄ 、Rb₂ SO₄ 、Rb₄ CH₃ COO、Rb₄ Cl、Rb₄ Br、Rb₄ NO₃ 、Rb₄ CIO₄ 、Rb₄ I、Rb₄ SCN、K₃ PO₄ 、K₂ HPO₄ 、KH₂ PO₄ 、K₂ SO₄ 、KCH₃ COO、KCl、KBr、KNO₃ 、KClO₄ 、KI、KSCN、Na₃ PO₄ 、Na₂ HPO₄ 、NaH₂ PO₄ 、Na₂ SO₄ 、NaCH₃ COO、NaCl、NaBr、NaNO₃ 、NaCIO₄ 、NaI、NaSCN、ZnCI₂ Cs₃ PO₄ 、Cs₂ HPO₄ 、CsH₂ PO₄ 、Cs₂ SO₄ 、CsCH₃ COO、CsCl、CsBr、CsNO₃ 、CsCIO₄ 、CsI、CsSCN、Li₃ PO₄ 、Li₂ HPO₄ 、LiH₂ PO₄ 、Li₂ SO₄ 、LiCH₃ COO、LiCl、LiBr、LiNO₃ 、LiClO₄ 、LiI、LiSCN、Cu₂ SO₄ 、Mg₃ (PO₄ )₂ 、Mg₂ HPO₄ 、Mg(H₂ PO₄ )₂ 、Mg₂ SO₄ 、Mg(CH₃ COO)₂ 、MgCl₂ 、MgBr₂ 、Mg(NO₃ )₂ 、Mg(ClO₄ )₂ 、MgI₂ 、Mg(SCN)₂ 、MnCl₂ 、Ca₃ (PO₄ ),、Ca₂ HPO₄ 、Ca(H₂ PO₄ )₂ 、CaSO₄ 、Ca(CH₃ COO)₂ 、CaCl₂ 、CaBr₂ 、Ca(NO₃ )₂ 、Ca(ClO₄ )₂ 、CaI₂ 、Ca(SCN)₂ 、Ba₃ (PO₄ )₂ 、Ba₂ HPO₄ 、Ba(H₂ PO₄ )₂ 、BaSO₄ 、Ba(CH₃ COO)₂ 、BaCl₂ 、BaBr₂ 、Ba(NO₃ )₂ 、Ba(ClO₄ )₂ 、BaI₂ 和 Ba(SCN)₂ 。特別優選為 NH 乙酸、MgCl₂ 、KH₂ PO₄ 、Na₂ SO₄ 、KCl、NaCl 和 CaCl₂ ，例如：氯化物或乙酸鹽（三氟乙酸）鹽。

一方面，本文所述的多肽為藥用鹽的形式。另一方面，藥用鹽形式的多肽為結晶形式。

一方面，本文所述的藥用鹽是指具有在藥物應用可接受範圍內毒性特徵的鹽。

此處使用的「藥用鹽」系指所公開的肽的一種衍生物，其中該肽由制酸或藥劑的堿鹽進行改性。例如，用與適合的酸反應的游離堿（通常其中的中性藥物有一個中性–NH2 基團）製備酸式鹽。適合製備酸鹽的酸包括有機酸，如：乙酸、丙酸、羥基酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水楊酸等等、以及無機酸，如：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一種肽上提呈的酸性基團的堿鹽製劑使用藥用堿基進行製備，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等等。

一方面，藥用鹽可提高本文所述肽的溶解度和/或穩定性。另一方面，本文所述的藥用鹽可透過常規方法由相應的載體肽或複合體製備，方法例如用本文所述的肽或複合體使適當的酸或堿發生反應。另一方面，藥用鹽為結晶形式或半結晶形式。再一方面，藥用鹽可能包括例如：P. H. Stahl 和 C. G. Wermuth 所著的《Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use》（藥用鹽手冊：特徵、選擇和使用）(Wiley-VCH 2002)，L. D. Bighley, S. M. Berge, D. C. Monkhouse,《Encyclopedia of Pharmaceutical Technology》（製劑技術百科全書）Eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, Vol. 13, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong 1995, pp.453-499 中所述的藥用鹽，各參考文獻透過引用整體併入本文。

本發明還包括藥物組合物，其包含本發明的雙特異性多肽分子和對特定癌抗原具有特異性的治療性抗體（例如：腫瘤特異性單克隆抗體）和藥用載體。

在一具體實施方案中，術語「藥用」意指由聯邦或州政府監管機構批准或在《美國藥典》或其他公認的藥典中列出用於動物，更特別是人類。術語「載體」是指與治療劑一起施用的稀釋劑、輔助賦形劑或載體。此類藥物載體可以是無菌液體，例如：水和油，包括石油、動物油、植物油或合成油，諸如：花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水為優選載體。鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液體載體，特別是用於可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、磷酸鈉、乙酸鈉、L-組氨酸、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物還可含有少量的潤濕劑或乳化劑或 pH 緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。通常，本發明組合物的成分以單位劑量形式單獨或混合供應，例如，作為乾燥凍乾粉或無水濃縮物供應，包裝在密封容器內，如：示有活性劑數量的安瓿或小袋內。當組合物透過輸注施用時，可以用含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶配藥。當透過注射施用組合物時，可提供一安瓿無菌注射用水或鹽水，以便可以在施用前混合成分。

那麼，本發明的另一方面涉及根據本發明所述的雙特異性多肽分子、根據本發明所述的核酸或表達載體、根據本發明所述的細胞或根據本發明所述的藥物組合物用於藥物中。通常，雙特異性多肽分子的使用取決於所述分子識別的肽-抗原的醫療背景，進一步描述如下文。

優選的是根據本發明所述的雙特異性多肽分子、根據本發明所述的核酸或表達載體、或根據本發明所述的細胞、或根據本發明所述的藥物組合物用於治療或預防選自免疫疾病、傳染病、中毒和癌症的疾病或病症，包括治療或預防各種癌症或其他異常增殖性疾病，包括（但不限於）如下：癌，包括膀胱、乳腺、結腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、攝護腺、宮頸、甲狀腺和皮膚癌；包括鱗狀細胞癌；淋巴譜系造血系統腫瘤，包括白血病、急性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、B 細胞淋巴瘤、T 細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤；骨髓譜系造血系統腫瘤，包括急性和慢性髓性白血病和早幼粒細胞白血病；間充質來源腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑色素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、神經母細胞瘤和膠質瘤；中樞和外周神經系統腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、神經鞘瘤和骨肉瘤；和其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性幹皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌和畸胎癌。其他癌症可能包括但不限於濾泡性淋巴瘤、具有p53突變的癌、乳腺、攝護腺和卵巢激素依賴性腫瘤、以及癌前病變，例如：家族性腺瘤性息肉病和骨髓增生異常徵候群。在具體的實施方案中，透過本發明的方法和組合物治療或預防卵巢、膀胱、乳腺、結腸、肺、皮膚、胰腺或子宮的惡性腫瘤或增生不良變化（例如：化生和異常增生）或過度增殖性疾病。在其他具體實施方案中，透過本發明的方法和組合物治療或預防肉瘤、黑色素瘤或白血病。

本發明進一步涉及在患者或受試者中引發免疫應答的方法，包括給予治療有效量的根據本發明所述的雙特異性多肽分子或根據本發明所述的藥物組合物。一方面，將根據本發明所述的雙特異性多肽分子群或根據本發明所述的藥物組合物施用於有需要的患者或受試者。

本發明進一步涉及殺滅患者或受試者靶細胞的方法，包括向患者施用有效量的根據本發明所述的雙特異性多肽分子。

本發明還提出了預防、治療或管理受試者中與炎性病症相關的一種或多種症狀的方法，其進一步包括給予所述受試者治療或預防有效量的一種或多種本發明的抗炎劑。本發明還提出了預防、治療或管理與自身免疫疾病相關的一種或多種症狀的方法，其進一步包括給予所述受試者治療或預防有效量的一種或多種本發明的免疫調節劑。可以透過本發明的分子治療或預防的傳染病由感染因子引起，包括但不限於病毒、細菌、真菌、原生動物和病毒。使用本發明的分子結合本發明的方法可以治療或預防的病毒性疾病包括但不限於由 A 型肝炎、B 型肝炎、C 型肝炎、流感、水痘、腺病毒、I 型單純皰疹 (HSV-I)、II 型單純皰疹 (HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒、巨細胞病毒、棘皮病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、小痘、愛潑斯坦巴爾病毒、I 型人類免疫缺陷病毒 (HIV-I)、II 型人類免疫缺陷病毒 (HIV-II)、以及病毒性疾病因子（如：病毒腦膜炎、腦炎、登革熱或小痘）引起的疾病。

使用本發明的分子結合本發明的方法可以治療或預防的細菌性疾病包括但不限於由分枝桿菌立克次氏體、支原體、奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體（萊姆病）、抗壞血酸桿菌（炭疽）、破傷風、鏈球菌、葡萄球菌、分枝桿菌、破傷風、百日咳、霍亂、鼠疫、白喉、衣原體、金黃色葡萄球菌和軍團菌引起的疾病。

使用本發明的分子結合本發明的方法可以治療或預防由原生動物引起的原生動物疾病包括但不限於利什曼原蟲、可哥地亞蟲、錐蟲或瘧疾。使用本發明的分子結合本發明的方法可以治療或預防由寄生蟲引起的寄生蟲病包括但不限於衣原體和立克次氏體。

感染因子和疾病的實例包括但不限於細菌（例如，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、白色念珠菌、普通變形桿菌、草綠色葡萄球菌和銅綠假單胞菌）、病原體（例如，B-淋巴細胞乳多空病毒 (LPV)；百日咳博多特氏菌；博爾納病病毒 (BDV)；牛冠狀病毒；脈絡叢腦膜炎病毒；登革熱病毒；病毒，大腸桿菌；埃博拉病毒；艾柯病毒 1；艾柯病毒-11 (EV)；內毒素 (LPS)；腸道細菌腸道孤兒病毒；腸道病毒；貓白血病病毒；口蹄疫病毒；長臂猿白血病病毒 (GALV)；革蘭氏陰性菌；幽門螺桿菌；乙型肝炎病毒 (HBV)；單純皰疹病毒；HIV-I；人巨細胞病毒；人類冠狀病毒；甲、乙和丙型流感；軍團菌；墨西哥利什曼原蟲；單核細胞增生李斯特氏菌；麻疹病毒；腦膜炎球菌；麻疹病毒；小鼠肝炎病毒；小鼠白血病病毒；小鼠 γ 皰疹病毒；小鼠逆轉錄病毒 S；小鼠冠狀病毒小鼠肝炎病毒；鳥分枝桿菌-M；淋球菌；新城疫病毒；細小病毒 B 19；惡性瘧原蟲；痘病毒；假單胞菌；輪狀病毒；傷寒沙門氏菌；志賀氏菌；鏈球菌； T 細胞嗜淋巴細胞病毒 1；痘苗病毒）。

於是，本發明的再一方面涉及治療疾病或病症的方法，包括給予治療有效量的根據本發明所述的雙特異性多肽分子、根據本發明所述的核酸或表達載體、根據本發明所述的細胞或根據本發明所述的藥物組合物。

本發明的雙特異性多肽分子可用于透過施用雙特異性多肽分子而改善的疾病或病症的預防或治療方法中。此類治療可以與一種或多種藥用載體或賦形劑一起提供在藥物組合物中。治療性雙特異性多肽分子通常作為無菌藥物組合物的一部分提供，其通常包括藥用載體。該藥物組合物可以是任何合適的形式（取決於將其給予患者的所需方法）。它可以以單位劑型提供，通常以密封容器中提供，並且可以作為套藥的一部分提供。此類套藥通常（但不一定）包括使用說明書。它可包括多個所述單位劑型。藥物組合物可以適於透過任何合適的途徑給藥，例如：腸外（包括皮下、肌肉內或靜脈內）途徑。此類組合物可透過藥學領域已知的任何方法製備，例如：透過在無菌條件下將活性成分與載體或賦形劑混合。

一方面，本文所述的肽或其他分子可與水性載體組合。一方面，水性載體選自離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、硬脂酸鎂、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、緩衝物質如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油混合物、鹽或電解質，如酯硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸二鈣、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮-醋酸乙烯酯、纖維素類物質（例如：微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸酯、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯）、澱粉、乳糖一水合物、甘露糖醇、海藻糖十二烷基硫酸鈉和交聯羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物和羊毛脂。

一方面，水性載體含有多種組分，例如水和非水性載體組分，例如如本文所述的那些組分。另一方面，當與本文所述的肽或其他分子組合時，水性載體能夠改善性質，例如改善溶解度、有效性和/或改良免疫治療。此外，組合物可包含輔料，如：緩衝劑、結合劑、衝擊劑、稀釋劑、香料、潤滑劑等。「藥用稀釋劑」例如可能包括溶劑、填充劑、穩定劑、分散介質、塗層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等，它們在生理學上是相容的。藥用稀釋劑的實例包括鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一種或多種以及它們的組合物。在許多情況下，優選在組合物中包含一種或多種等滲劑（例如：海藻糖和蔗糖等糖類）、多元醇（例如：甘露醇、山梨糖醇）或氯化鈉。藥用物質（如：潤濕劑）或少量輔助物質（如：潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑）也在本發明範圍內。此外，組合物可能含有賦形劑，如緩衝液、黏合劑、爆破劑、稀釋劑、香精和潤滑劑。

本發明的雙特異性多肽分子的劑量可在較大範圍內變化，這取決於待治療的疾病或病症、待治療個體的年齡和狀況等；例如，雙特異性多肽分子的合適劑量範圍可以為 25ng/kg 至 50 μg/ kg。醫生將最終確定要使用的適當劑量。

本發明的藥物組合物、載體、核酸和細胞可以以基本上純的形式提供，例如：至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99% 或100% 的純度。

本發明的每個方面的優選特徵是作必要修改後的每個其他方面。本文提到的現有技術檔在法律允許的最大範圍內併入。儘管已經詳細描述了本發明及其優點，但是應該理解，在不脫離所附申請專利範圍限定的本發明精神和範圍的情況下，可以進行各種改變、替換和變更。在以下實施例中將進一步說明本發明，這些實施例僅用於說明目的，並不意圖以任何方式限制本發明。 實施例 實施例 1含 Fc 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體和對照分子的設計。

設計含 Fc 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體和對照分子（如圖 2 所示）以特異性結合至人 TCR-CD3 複合體和肽：MHC 複合體，其包含與 HLA-A2*01 結合的 HIV 衍生肽 SLYNTVATL (SQ ID No. 7)。為了靶向作用於 TCR-CD3 複合體，使用了衍生自 CD3 特異性人源化抗體 hUCHT1 (V9) 的 VH 和 VL 結構域，如 Zhu et al. (Identification of heavy chain residues in a humanized anti-CD3 antibody important for efficient antigen binding and T cell activation.J Immunol , 1995, 155, 1903–1910) 所述，或衍生自 α/βTCR 特異性抗體 BMA031 的 VH 和 VL 結構域，如 Shearman et al.(Construction, expression and characterization of humanized antibodies directed against the human alpha/beta T cell receptor.J Immunol , 1991, 147, 4366-73) 所述並用於人源化版本變體 10（內部產生的資料）。為了靶向作用於肽：MHC 複合體，利用了前述穩定性和親和力成熟的人單鏈 T 細胞受體 868Z11 的 Vα和 Vβ結構域，如 Aggen et al.(Identification and engineering of human variable regions that allow expression of stable single-chain T cell receptors.PEDS , 2011, 24, 361 – 372) 一文所公開。

在含 Fc 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體的情況下，透過基因合成獲得編碼 VH 和 VL（分別對應於 VD1 和 VD2）、Va和Vb（分別對應於 VR1 和 VR2）的各種組合以及編碼接頭 Link1 和 Link2 的 DNA 序列。將得到的 DNA 序列框內克隆至編碼衍生自人 IgG4 [登錄號：K01316] 和 IgG1 [登錄號：P01857] 的鉸鏈區、CH2 和 CH3 結構域的表達載體中，並進一步進行工程化處理。進行工程設計以將杵臼結構突變併入到 CH3 結構域中，其具有和不具有額外的鏈間二硫鍵穩定性；去除 CH2 中的 N-糖基化位點（例如：N297Q 突變）；引入 Fc 沉寂突變；根據 Reiter et al. (Stabilization of the Fv Fragments in Recombinant Immunotoxins by Disulfide Bonds Engineered into Conserved Framework Regions.Biochemistry, 1994, 33, 5451 – 5459) 所述的方法，分別將額外的二硫鍵穩定化引入 VL 和 VH 中。產生的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體、變體以及相應序列的概述列於表 1 中。 表 1：所有產生和評估的含 Fc 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體的概述： KiH：杵臼結構；K/O：Fc 沉寂；KiH-ds：用人工二硫鍵穩定的杵臼結構，連接 CH3:CH3’；ds-hUCHT1(V9)：二硫鍵穩定的 hUCHT1(V9) 可變結構域；Link1：連接 VR1 和 VD1 的接頭。

表 2 構建了表現出相同特異性的各種對照分子，其利用所述 VH、VL、Vα 和 Vβ 結構域與包含如上所述的工程化特徵的 IgG1- 或 IgG4- 衍生恒定結構域組合。 表 2：所有產生和評估的含 Fc 的雙特異性對照分子的概述： KiH：杵臼結構；K/O：Fc 沉寂。 實施例 2含 Fc 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體的產生和純化

用於表達重組蛋白的載體設計為單順反子，由 HCMV 衍生的啟動子元件 pUC19衍生物控制。根據標準培養方法在大腸桿菌中擴增質粒 DNA，隨後使用市售套藥 (Macherey& Nagel) 純化。根據製造商的說明書（ExpiCHO™ system；Thermo Fisher Scientific），將純化的質粒 DNA 用於 CHO-S 細胞的暫態轉染。將轉染的 CHO 細胞在 32℃ 至 37℃ 下培養 6-14 天，並接受一至兩次 ExpiCHO™ Feed 溶液進料。

透過離心（4000×g；30 分鐘）收集條件細胞上清液，並透過過濾 (0.22 µm) 澄清。使用配備的 Äkta Pure 25 L FPLC 系統 (GE Lifesciences) 純化雙特異性分子，以線上進行親和力和尺寸排阻色譜。按照標準親和層析方案，在蛋白 A 柱 (GE Lifesciences) 上進行親和層析。在從親和柱洗脫 (pH 2.8) 後直接進行尺寸排阻色譜，以使用 Superdex 200 pg 16/600 柱 (GE Lifesciences) 按照標準方案獲得高純度單體蛋白。使用根據預測的蛋白質序列計算的消光係數，在 NanoDrop 系統 (Thermo Scientific) 上測定蛋白質濃度。使用 Vivaspin 裝置 (Sartorius) 進行濃縮（如果需要）和緩衝液交換。最後，將純化的分子在 2-8℃ 溫度下以約 1mg/mL 的濃度保存在磷酸鹽緩衝鹽水中。

由於治療性蛋白質在酸性暴露下應表現出合理的穩定性以促進穩健的工業純化工藝，因此評估從蛋白質 A 捕獲柱洗脫的單體蛋白質的百分比（表 3）。顯然，將穩定突變引入分子以及選擇結合結構域的不同方向顯著影響酸性暴露時的穩定性。 表 3：捕获柱酸性洗脱后单体蛋白的分数：

在尺寸排阻色譜後，純化的雙特異性分子顯示高純度（＞93% 的單體蛋白質），透過 HPLC-SEC 在 MabPac SEC-1 柱（5 μm，7.8×300 mm）上測定，其在 Agilent 1100 系統內包含 300 mM NaCl 的 50 mM 磷酸鈉 pH 6.8 中運行（參見圖 3）。非還原和還原 SDS-PAGE 證實了不同雙特異性 TCR/mAb 分子的純度和預期大小（資料未顯示）。 實施例 3由含 Fc 的 TCR/mAb 雙抗體誘導的特異性和靶細胞依賴性 T 細胞活化

使用 T 細胞活化生物測定法 (Promega) 評估含 Fc 的 TCR/mAb 雙抗體對 T 細胞活化的效力。該測定由基因工程化的 Jurkat 細胞系組成，該細胞系表達由 NFAT 反應元件 (NFAT-RE) 驅動的螢光素酶報告基因。根據製造商的說明進行測定。簡而言之，在增加濃度的雙特異性 TCR/mAb 分子存在下，隨後將負載 HIV 特異性肽 SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) 或不載入肽（未載入對照）的 T2 細胞與 Promega 修飾的Jurkat 細胞進行共培養。透過測量發光強度在 16-20 小時後分析 Jurkat 報告基因 T 細胞活化。

分別描述了基於 IgG4（圖 4）和基於 IgG1 的雙特異性 TCR/mAb 分子（圖 5）的代表性效力測定結果。資料表明，無論使用的恒定結構域的 IgG 同種型如何，與備選雙特異性 TCR/mAb 構建體 II、III 和 IV 相比，含 Fc 的 TCR/mAb 雙抗體構建體 IA 和 ID 均顯示出優異的 T 細胞活化，按活化幅度和/或相應的 EC50 值進行測量。此外，針對未負載的 T2 細胞誘導的含 Fc 的 TCR/mAb 雙抗體的非特異性 T 細胞活化低於或至少等於備選雙特異性 TCR/mAb 構建體觀察到的非特異性活化水準。根據上述結果，雙特異性 TCR/mAb 雙抗體分子是用於治療干預的優選分子，因為它們以高度靶向依賴性方式誘導強的效應 T 細胞活化。

此外，LDH 釋放測定 (Promega) 用於定量由不同雙特異性 TCR/mAb 分子誘導的 SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) 肽負載 T2 細胞的 PBMC 介導裂解（圖 10）。與 T 細胞活化生物測定的上述結果一致，含 Fc 的 TCR/mAb 雙抗體構建體 IA 和 ID 再次優於備選雙特異性 TCR/mAb 構建體 II、III 和 IV，如靶細胞裂解絕對水準增加和實現靶細胞半數最大 (EC50) 殺傷所需的 TCR 雙特異性濃度降低所示。對於 TCR/mAb 構建體 II、III 和 IV，TCR/mAb 雙抗體構建體 1A 和 ID 不誘導載有無關肽 (SEQ ID No. 49) 的 T2 細胞裂解，證明對 T2 細胞的靶標特異性裂解。 實施例 4開發含 Fc 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體作為分子平臺

設計含 Fc 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體構建體以用作分子平臺，分別為靶向作用於不同肽：MHC 複合體和效應細胞表面抗原的不同 TCR 衍生的和 mAb 衍生的可變結構域提供支架。為了驗證作為平臺的適合性，在第一組分子中交換 mAb 衍生的可變結構域。使用相同的結構域方向（構建體 ID_4 和 ID_5）或不同方向（IC_4、IC_5）將 hUCHT1(V9) 抗 CD3 抗體（構建體 ID_1）的可變結構域替換為 hBMA031(var10) 抗 TCR 抗體的結構域（詳見表 1 和圖 7）。如上所述進行這些分子的表達、純化和表徵。根據 HPLC-SEC 分析，最終製劑的純度和完整性超過 92%。

效力測定結果顯示了靶向依賴性 Jurkat 報告基因 T 細胞活化和針對抗體可變結構域 hUCHT1（構建體 ID_1）和 hBMA031（構建體 ID_4 和 ID_5）未負載 T2 細胞的最小非特異性活性，從而支援雙特異性 TCR/mAb 雙抗體構建體的平臺適合性（圖 6）。值得注意的是，當構建體 ID_4 和 ID_5 的可變 TCR 和 mAb 結構域在每條多肽鏈上切換形成構建體 IC_4 和 IC_5 時，未觀察到 T 細胞活化（資料未顯示）。後一發現表明，儘管雙特異性 TCR/mAb 雙抗體可用作摻入不同 TCR 和 mAb 可變結構域的平臺構建體，但需要徹底優化結構域方向以實現分子的最佳活性。 實施例 5含 Fc 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體的穩定性

最初利用蛋白質熱轉換測定法 (Thermo Fisher Scientific) 根據製造商的說明使用 7500 即時 PCR 系統 (Applied Biosciences) 評估雙特異性 TCR/mAb 分子的穩定性。簡而言之，將純化的分子與 PTS 緩衝液和 PTS 染料混合，並經受升高的溫度梯度，持續監測樣本的螢光。使用 PTS 軟體 (Thermo Fisher Scientific) 分析記錄的螢光信號，並透過衍生方法計算熔解溫度 (TM)。

透過將溶解在 PBS 中的純化分子在 40℃ 下儲存長達兩週來進行壓力穩定性研究。使用 HPLC-SEC 分析樣本的蛋白質完整性，並使用如上所述的 T 細胞活化測定法 (Promega) 分析效力。

如預期的那樣，透過 HPLC-SEC 分析測定，在 40℃ 下儲存誘導聚集體/高分子量物質的形成（參見圖 8）。在 40℃ 下純化和溫育後基於 IgG1 的分子的效力測定結果顯示於圖 9 中。儘管在 40℃ 下儲存後兩種受測試分子均未顯示效力顯著降低，但觀察到壓力分子 III 和 IV 誘導了顯著量的非特異性（即，靶標非依賴性）Jurkat T 細胞活化。相反，儘管存在如 HPLC-SEC 中所見的一些聚集體，但雙特異性 TCR/mAb 雙抗體仍保留其靶標依賴性效力。 實施例 6：癌症靶向性雙特異性 TCR/mAb 雙抗體分子的產生

為了進一步驗證雙特異性 TCR/mAb 雙抗體構建體的平臺能力，將 TCR 衍生的可變結構域與 TCR 的可變結構域交換，其透過酵母展示技術根據先前描述的方法進行穩定性/親和力成熟 (Smith et al, 2015, T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform. Methods Mol Biol.1319:95-141)。在 HLA-A*02 背景下特異性結合於 HIV 衍生肽 SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) 的 TCR 可變結構域與特異性結合於腫瘤相關肽 PRAME-004 (SEQ ID No. 49)（與HLA-A*02結合）的 TCR 可變結構域交換。此外，人源化 T 細胞募集抗體 hUCHT1(V9) 的可變結構域與新的人源化形式 UCHT1抗體 hUCHT1(Var17) 的可變結構域交換，產生 PRAME-004靶向 TCR/mAb 雙抗體分子 IA_5（包含 SEQ ID No.43 和 SEQ ID No.44）。如實施例 2 中所述進行該分子的表達、純化和表徵。根據 HPLC-SEC 分析，最終製劑的純度和完整性超過 96%。

透過生物層干涉測定法測定雙特異性 TCR/mAb 雙抗體構建體對 PRAME-004:HLA-A*02 的結合親和力。使用製造商推薦的設置在 Octet RED384 系統上進行測量。簡而言之，在分析 HLA-A*02/PRAME-004 連續稀釋之前，將純化的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體分子載入到生物感測器 (AHC) 上。

該 PRAME-004 靶向 TCR/mAb 雙抗體構建體對腫瘤細胞裂解誘導的活性透過評估人癌細胞系 UACC-257、SW982 和 U2OS 的人 CD8 陽性 T 細胞介導的裂解來評價，這些人癌細胞系的腫瘤細胞表面上在 HLA-A*02 背景下呈遞不同複製量的 PRAME-004 肽（透過定量 M/S分析，每個細胞中，UACC-257-約 1100、SW982-約 770、U2OS-約 240 個 PRAME-004 拷貝），測定透過 LDH 釋放測定法確定。

如圖 11 所示，PRAME-004 靶向 TCR/mAb 雙抗體構建體 IA_5 誘導 PRAME-004 陽性腫瘤細胞系的濃度依賴性裂解。即使是每個腫瘤細胞表達少至 240 個 PRAME-004 拷貝數的腫瘤細胞 U2OS 也可透過該 TCR/mAb 雙抗體分子有效地進行裂解。這些結果進一步證明 TCR/mAb 雙抗體形式可用作分子平臺，允許引入不同 TCR 的可變結構域以及不同 T 細胞募集抗體的可變結構域。 實施例 7：TCR/mAb 雙抗體構建體的工程改造性

構建體 IA_5 中使用的可變 TCR 結構域對 PRAME-004的親和力和 TCR 穩定性進一步增強，並用於工程改造成 TCR/mAb 雙抗體支架，產生構建體 IA_6（包含 SEQ ID No.45 和 SEQ ID No.46）。如實施例 2 中所述進行 TCR/mAb 雙抗體分子 IA_5 和 IA_6 的表達、純化和表徵。根據 HPLC-SEC 分析，最終製劑的純度和完整性超過 97%。

在腫瘤細胞系 U2OS 呈遞少量 PRAME-004:HLA-A*02 或未負載 T2 細胞作為靶細胞的細胞毒性實驗中評估了針對PRAME-004的穩定性和親和力增強的 TCR/mAb 雙抗體變體IA_6的效力。

如圖 12 中所示，當與前體構建體 IA_5 相比時，發明人觀察並增加了包含穩定性/親和力增強的 TCR 變體的可變結構域的 TCR/Ab 雙抗體分子 IA_6 的細胞毒性效力。對於兩種構建體 IA_5 和 IA_6，可以確認 PRAME-004 依賴性裂解，因為未檢測到靶標陰性 T2 細胞的細胞溶解。

將蛋白質構建體進一步在 40℃ 下進行熱應激長達兩週，以分析 PRAME-004 特異性 TCR/mAb 雙抗體變體 IA_5 和 IA_6 的穩定性。熱應激後的 HPLC-SEC 分析顯示，與前體構建體 IA_5 相比，變體 IA_6 的穩定性顯著提高（參見圖 13）。對於 IA_6 而言，構建體的高分子物質（即，在主峰之前洗脫）的溫度誘導增加不如 IA_5 明顯。與此結果一致，熱應激後 IA_5 和 IA_6 的完整單體蛋白回收率分別為 87% 和 92%。

這些示例性工程資料證明，透過摻入穩定性/親和力增強的TCR可變結構域，可以進一步改善高效和穩定的 TCR/mAb 雙抗體構建體，從而產生具有優異特徵的治療性蛋白質。 實施例 8：優選構建體的實例

除了如本文所述的 HIV 特異性 TCR 雙特異性構建體（Seq ID No.16 和 Seq ID No.17，在方向 D 中），本發明還提出了接受測試的幾種其他示例性 HIV 特異性構建體。這些構建體基於針對 CD3 (UCHT1) 的潛在抗體的改良人源化變體，其在所有四種可能的方向（Seq ID No.51至 Seq ID No.58，方向A-D）上與本文公開的 HIV 特異性 TCR868 融合。

使用 VH-1-46 和 VK1-018 分別作為重鏈和輕鏈 CDR 的受體框架進行 UCHT1 人源化。選定的 J 區段為 JK1 和 JH4，分別用於輕鏈和重鏈。

所獲得的結果示於下表 4。 表 4 中的資料表明，本發明的人源化可能具有較低的免疫原性（較低的 DRB1 評分）；分子更穩定（熔化溫度升高約 3°C）；與標準品 (V9) 相比，更有效（EC50 降低 ~8x）（關於測定，參見實施例 3）。

無

圖 1 顯示了本發明優選實施方案含有人 IgG1 Fc 的雙特異性多肽分子的示意圖。VD1、VD2 = 源自抗體的可變結構域；VR1、VR2 = 源自 TCR 的可變結構域；Link1、Link2 = 連接接頭；Cys-Cys =半胱氨酸橋。

圖 2 顯示了在本發明的背景下測試的 4 種不同的含有 IgG Fc 的雙特異性多肽分子構建體的示意圖。黑色 = TCR 衍生的可變結構域；淺灰色 = 抗體衍生的可變結構域；白色 = 源自 人 IgG 的恒定結構域。杵-臼突變用圓柱表示。雙抗體分子 IA-ID 根據本發明所述。

圖 3 顯示了根據圖 2 中描繪構建體的具有分子設計的不同雙特異性 TCR/mAb 分子的 HPLC-SEC 分析，其透過 2-柱純化方法純化。不同分子的單體含量測定如下。II：93.84%；III：96.54%；IV：98.49%；IA_1：95.48%；IA_3：98.45%；ID_1：95.75%；IC_4：95.22%；IC_5：92.76%；ID_4：99.31%；ID_5：99.44%.

圖 4 顯示了設計為基於 IgG4 的分子的不同雙特異性 TCR/mAb 構建體（如圖 2 所示）的效力測定結果。在增加濃度的雙特異性 TCR (bssTCR) 分子的存在下，將 Jurkat_NFATRE_luc2 細胞與載有 T2 細胞的 HIV-肽 SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) 共溫育。雙特異性 TCR/mAb 雙抗體分子 IA-IgG4 表現出比兩種備選雙特異性 TCR/mAb 分子更高的效力。

圖 5 顯示了設計為基於 IgG1 的分子的不同雙特異性 TCR/mAb 構建體（如圖 2 所示）的效力測定結果。在增加濃度的雙特異性 TCR (bssTCR) 分子的存在下，將 Jurkat_NFATRE_luc2 細胞與載有 T2 細胞的 HIV-肽 SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) 共溫育。雙特異性 TCR/mAb 雙抗體分子 ID_1、IA_3 和 IA1 表現出比三種備選雙特異性 TCR/mAb 分子顯著更高的效力。

圖 6 顯示了利用靶向作用於 TCR-CD3 複合體的不同可變抗體結構域用不同的基於 IgG1 的雙特異性 TCR/mAb 構建體（如圖 2 所示）進行的效力測定的結果。構建體 ID_1 包含靶向作用於 CD3 的 UCHT1(V9) 抗體的可變結構域，而構建體 ID_4 和 ID_5 包含 α/βTCR 特異性抗體 BMA031 的可變結構域。在增加濃度的雙特異性 TCR (bssTCR) 分子的存在下，將 Jurkat_NFATRE_luc2 細胞與載有 T2 細胞的 HIV-肽 SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) 共溫育。

圖 7 顯示了本發明分子中 VD 和 VR 結構域可能方向的示意圖。VH：抗體衍生的 VH 結構域，VL：抗體衍生的 VL 結構域，Vα：TCR 衍生的 Vα；Vβ：TCR 衍生的 Vβ。

圖 8 顯示了基於 IgG1 的不同雙特異性 TCR/mAb 分子內聚集體（HMWS-高分子量物質）的 HPLC-SEC 分析結果。分別在純化後和分子在 40℃ 下儲存 1 週和 2 週後分析聚集體。

圖 9 顯示了用基於 IgG1 的不同雙特異性 TCR/mAb 分子進行的效力測定的結果。分別在純化後和分子在 40℃ 下儲存 1 週和 2 週後分析效力。在 40℃ 下壓力保存不會導致分子效力的顯著喪失，但是對於分子 III 和 IV，檢測到了 Jurkat T 細胞的非特異性（即，靶標非依賴性）活化的急劇增加。

圖 10 顯示了設計為基於 IgG1 的分子的不同雙特異性 TCR/mAb 構建體（如圖 2 所示）的 LDH釋放測定結果。在增加濃度的雙特異性 TCR (bssTCR) 分子的存在下，將從健康供體分離的 PBMC 與載有 T2 細胞的 HIV-肽 SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) 共溫育。雙特異性 TCR/mAb 雙抗體分子 IA_3 和 ID_1 誘導比三種備選雙特異性 TCR/mAb 分子顯著更高的靶細胞裂解。如右圖所示，測試的雙特異性 TCR/mAb 構建體均未誘導載有無關肽 (SEQ ID No. 49) 的 T2 細胞的可檢測裂解。

圖 11 顯示了 HLA-A*02 上呈遞的靶向作用於腫瘤相關肽 PRAME-004 (SEQ ID No. 49) 的雙特異性 TCR/mAb 雙抗體構建體 IA_5 的 LDH 釋放測定的結果。在增加濃度的 TCR/mAb 雙抗體分子存在下，以效應子：靶標比率為 5：1時，將從健康供體分離的 CD8 陽性 T 細胞與癌細胞系 UACC-257、SW982 和 U2OS 共培育，這些細胞系細胞表面上呈遞不同量的 PRAME-004:HLA-A*02-1複合體（每個細胞分別約 1100、約 770 和約 240 個拷貝，透過 M/S 分析測定）。共培養 48 小時後，根據製造商的說明書 (Promega)，利用 LDH 釋放測定法定量靶細胞裂解。

圖 12 顯示了雙特異性 TCR/mAb 雙抗體構建體 IA_5 和 IA_6 的 LDH 釋放測定的結果，其利用穩定性/親和力成熟的 TCR 及其增強形式，分別針對 HLA-A*02 上呈遞的腫瘤相關肽 PRAME-004 (SEQ ID No. 49)。在增加濃度的 TCR/mAb 雙抗體分子存在下，將從健康供體分離的 CD8 陽性 T 細胞與 U2OS 共培育，該細胞系每個細胞呈遞約 240 個拷貝的 PRAME-004:HLA-A*02-1 複合體或非負載 T2 細胞（效應子：靶標比率為 5：1）。共培養 48 小時後，根據製造商的說明書 (Promega)，利用 LDH 釋放測定法定量靶細胞裂解。

圖 13 顯示了 TCR/mAb 雙抗體構建體 IA_5 和 IA_6 的熱應激穩定性研究的結果，其利用穩定性/親和力成熟的 TCR 及其增強形式，分別針對 HLA-A*02 上呈遞的腫瘤相關肽 PRAME-004 (SEQ ID No. 49)。為此，將蛋白質以 1mg/mL 的濃度在 PBS 中配製，隨後在 40℃ 下儲存兩週。使用 HPLC-SEC 評估了蛋白質完整性和回收。因而，根據在主峰之前洗脫的峰面積百分比確定高分子量物質的量。透過比較未受應力和應力樣本的主峰面積來計算單體蛋白的回收率。

國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無

國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (21)

1. 一種雙特異性多肽分子，其選自包含第一多肽鏈和第二多肽鏈的分子組，其中： 第一多肽鏈包含與人免疫效應細胞的細胞表面抗原特異性結合的抗體的可變結構域(VD1)的第一結合區，和與MHC相關肽表位特異性結合的TCR的可變結構域(VR1)的第一結合區，和連接所述結構域的第一接頭(LINK1)；第二多肽鏈包含與MHC相關肽表位特異性結合的TCR的可變結構域(VR2)的第二結合區，和與人免疫效應細胞的細胞表面抗原特異性結合的抗體的可變結構域(VD2)的第二結合區，和連接所述結構域的第二接頭(LINK2)；其中所述第一結合區(VD1)和所述第二結合區(VD2)結合形成結合免疫效應細胞的細胞表面抗原的的第一結合位點(VD1)(VD2)；所述第一結合區(VR1)和所述第二結合區(VR2)結合形成結合所述MHC相關肽表位的第二結合位點(VR1)(VR2)；其中所述兩條多肽鏈與人IgG鉸鏈結構域和/或人IgG Fc結構域或其二聚化部分融合；和其中所述兩條多肽鏈透過所述鉸鏈結構域和/或Fc結構域之間的共價鍵和/或非共價鍵連接；和其中所述雙特異性多肽分子能夠同時結合細胞表面分子和MHC相關肽表位，和雙特異性多肽分子，其中兩個多肽鏈中結合區的順序選自VD1-VR1和VR2-VD2或VD1-VR2和VR1-VD2或VD2-VR1和VR2-VD1或VD2-VR2和VR1-VD1，並且其中結構域透過LINK1或LINK2連接。
2. 根據請求項1所述的雙特異性多肽分子，其中所述多肽鏈中結合區的順序選自VD1-VR1和VD2-VR2；並且其中結構域分別透過LINK1或LINK2連接。
3. 根據請求項1所述的雙特異性多肽分子，其中所述接頭序列LINK1和/或LINK2含有至少一個選自GGGS、GGGGS、TVLRT、TVSSAS和TVLSSAS的序列基序。
4. 根據請求項1至3中任一項所述的雙特異性多肽分子，其中所述第一和第二多肽鏈還包含至少一個鉸鏈結構域和衍生自人IgG1、IgG2或IgG4的Fc結構域或其部分。
5. 根據請求項4所述的雙特異性多肽分子，其中所述Fc結構域在選自233、234、235、236、297和331位置的殘基處包含至少一個效應子功能沉寂突變，優選其中所述效應子功能沉寂突變透過用衍生自IgG2或IgG4相應殘基取代233、234、235、236和331位置的至少一個殘基而產生。
6. 根據請求項3至5中任一項所述的雙特異性多肽分子，其中所述Fc結構域包含CH3結構域，其含有至少一個促進異二聚體形成的突變。
7. 根據請求項6所述的雙特異性多肽分子，其中所述突變位於選自366、368、405和407的任何位置，優選地，其中所述突變包含T366W和T366'S、L368A'和Y407'V作為杵臼結構突變。
8. 根據請求項3至7中任一項所述的雙特異性多肽分子，其中所述Fc結構域包含CH2和CH3結構域，所述CH2和CH3結構域包含至少兩個另外的半胱氨酸殘基，例如：S354C和Y349C或L242C和K334C。
9. 根據請求項1至8中任一項所述的雙特異性多肽分子，其中所述抗體衍生的結構域VD1和VD2顯示工程化的二硫鍵橋，其在VD1和VD2之間引入共價鍵，並且其中所述半胱氨酸在VL情況下被引入框架區(FR) 4，在VH情況下被引入框架區2。
10. 根據請求項1至9中任一項所述的雙特異性多肽分子，其中已知所述細胞表面分子誘導免疫細胞的活化，或者是選自免疫應答相關分子、CD3（例如：CD3γ、CD3δ和CD3ε鏈）、CD4、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD18、CD22、CD25、CD28、CD32a、CD32b、CD33、CD41、CD41b、CD42a、CD42b、CD44、CD45RA、CD49、CD55、CD56、CD61、CD64、CD68、CD94、CD90、CD117、CD123、CD125、CD134、CD137、CD152、CD163、CD193、CD203c、CD235a、CD278、CD279、CD287、Nkp46、NKG2D、GITR、FcεRI、TCRα/β、TCRγ/δ、HLA-DR所組成的群中的至少一種。
11. 根據請求項1至10中任一項所述的雙特異性多肽分子，其中第一多肽鏈中的區域包含VD1的SEQ ID No.28、VR1的SEQ ID No.29、LINK1的SEQ ID No.3；第二多肽鏈中的區域包含VD2的SEQ ID No.31、VR2的SEQ ID No.32和LINK2的SEQ ID No.30。
12. 根據請求項 3 至 11中任一項所述的雙特異性多肽分子，其中第一多肽鏈中的 FC 區包含 SEQ ID No. 26 至 SEQ ID No. 47 (Fc1)，第二多肽鏈中的 FC 區包含 SEQ ID No. 27 或 SEQ ID No. 48 (Fc2)。
13. 雙特異性多肽分子，其包含含有 SEQ ID No.16 或 SEQ ID No.43 或 SEQ ID No.45 或 SEQ ID No.51、53、55 或 57 的第一多肽鏈，和含有 SEQ ID No.17 或 SEQ ID 44 或 SEQ ID No.46 或 SEQ ID No.52、54、56 或 58 的第二多肽鏈。
14. 根據請求項1至13中任一項所述的雙特異性多肽分子，其中所述分子攜帶可檢測標記。
15. 根據請求項1至14中任一項所述的雙特異性多肽分子，其中結合所述免疫細胞的細胞表面抗原的所述第一結合位點(VD1)(VD2)被人源化；和/或結合所述MHC相關肽表位的所述第二結合位點(VR1)(VR2)成熟以獲得更高的親和力和/或穩定性。
16. 編碼根據請求項1至15任一項所述的第一多肽鏈和/或第二多肽鏈的核酸，或包含至少一種所述核酸的表達載體。
17. 一種宿主細胞，其包含並任選表達請求項16所定義的載體。
18. 一種藥物組合物，其包含根據請求項1至15中任一項所述的雙特異性多肽分子、根據請求項16所述的核酸或載體、或根據請求項17所述的細胞，以及一種或多種藥用載體或賦形劑。
19. 根據請求項1至15中任一項所述的雙特異性多肽分子、根據請求項16所述的核酸或載體、根據請求項17所述的細胞、或根據請求項18所述的藥物組合物用於藥物中。
20. 根據請求項1至15中任一項所述的雙特異性多肽分子、根據請求項16所述的核酸或載體、根據請求項17所述的細胞、或根據請求項18所述的藥物組合物用於治療或預防選癌症、傳染病和自免疫疾病的疾病或病症。
21. 一種治療疾病或病症的方法，包括給予治療有效量的根據請求項1至15中任一項所述的雙特異性多肽分子、根據請求項16所述的核酸或載體、根據請求項17所述的細胞、或根據請求項18所述的藥物組合物。