CN112424230A - 双功能结合多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含pMHC结合部分和PD‑1激动剂的双功能结合多肽。
Description
背景
已知PD-1途径在调节免疫系统中的抑制信号和刺激信号之间的平衡中起着至关重要的作用。PD-1途径的活化下调免疫活性，从而促进外周免疫耐受并预防自身免疫(Keir等人,Annu Rev Immunol,26:677-704,2008；Okazaki等人,Int Immunol 19:813-824,2007)。PD-1是在活化的免疫细胞(包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞)的表面上表达的跨膜受体蛋白(Agata等人,Int Immunol 8:765-772,1996)。PD-1的胞质尾区包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。PD-L1和PD-L2是PD-1的天然配体，并在抗原呈递细胞的表面上表达(Dong等人,Nat Med.,5:1365-1369,1999；Freeman等人,J Exp Med 192:1027-1034,2000；Latchman等人,Nat Immunol 2:261-268,2001)。配体接合后，磷酸酶被募集到PD-1的ITIM区，从而导致TCR介导的信号传导被抑制，并且随后淋巴细胞的增殖、细胞因子的分泌和细胞毒活性降低。PD-1还可以通过其抑制来自共刺激的生存信号的能力来诱导T细胞凋亡(Keir等人,Annu Rev Immunol,26:677-704,2008)。
PD-1途径在控制自身免疫中的中心作用首先通过观察到PD-1敲除小鼠患上迟发性进行性关节炎、狼疮样肾小球性肾炎和自身免疫心肌病而被证明(Nishimura等人,Immunity 11:141-151,1999；Nishimura等人,Science 291:319-322,2001)。此外，在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠中引入PD-1缺陷显著加速了糖尿病的发生，从而导致所有小鼠在10周龄之前患上糖尿病(Wang等人,PNAS 102:11823-11828,2005)。在人类中，PD-1似乎也显示出相当的调节功能。已将PD-1基因内的单核苷酸多态性与包括红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、类风湿性关节炎和格雷夫斯病的多种自身免疫性疾病联系起来(Prokunina等人,Arthritis Rheum 50:1770,2004；Neilson等人,Tissue Antigens 62:492,2003；Kroner等人,Ann Neurol 58:50,2005；Okazaki等人,Int Immunol 19:813-824,2007)；其他自身免疫性疾病中也已经报道了PD-1途径的扰乱(Kobayashi等人,J Rheumatol 32:215,2005；Mataki等人,Am J Gastroenterol 102:302,2007)。最后，已将拮抗性抗体对PD-1途径的阻断与癌症患者中的自身免疫副作用关联起来(Michot等人,Eur J Cancer 54:139-148,2016)。
导致PD-1途径活化的治疗策略为自身免疫疾病的治疗提供了有希望的方法。例如，已显示过表达PD-L1的人造树突细胞降低了小鼠模型中脊髓炎症以及实验性自身免疫性脑脊髓炎的临床严重性(Hirata等人,J Immunol 174:1888-1897,2005)。此外，已显示表达PD-L1伴随阻断共刺激分子的重组腺病毒预防BXSB小鼠的狼疮性肾炎(Ding等人,ClinImmunol 118:258-267,2006)。已经开发了许多PD-1激动剂抗体以用于治疗人的各种自身免疫疾病(例如，参见WO2013022091、WO2004056875、WO2010029435、WO2011110621、WO2015112800)。然而，尽管开发了这些试剂，但几乎没有证据提示可溶性试剂有效触发PD-1信号传导，并且据我们所知，只有一种这样的分子已进入了临床试验用于治疗牛皮癣(参见NCT03337022)。PD-1激动剂的给药还可能触发远离疾病部位的全身免疫作用，从而导致临床毒性。因此，需要用于治疗自身免疫疾病的更安全且更有效的PD-1激动剂疗法。
本发明人出人意料地发现，包含与肽-MHC结合部分融合的PD-1激动剂的分子导致对PD-1信号传导的有效抑制。
不受理论的束缚，本发明人假设对T细胞活化的有效抑制需要使PD-1激动剂定位至免疫突触。PD-1激动剂连接至与疾病特异性肽-MHC结合的部分(例如TCR或TCR样抗体)，会将激动剂引导至免疫突触，从而提供了更安全且更有效的策略来调节PD-1途径。
T细胞受体(TCR)由CD4+和CD8+ T细胞自然表达。TCR旨在识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子(在人类中，MHC分子也称为人白细胞抗原或HLA)复合的抗原呈递细胞表面上展示的短肽抗原(Davis,等人,(1998),Annu Rev Immunol 16:523-544.)。CD8+ T细胞也称为细胞毒性T细胞，特异性识别与I类MHC结合的肽，通常负责发现感染细胞或癌细胞以及介导对感染细胞或癌细胞的破坏。
期望用于免疫治疗用途的TCR能够强烈识别靶抗原，由此意味着TCR应当对靶抗原具有高亲和力和/或长结合半衰期，以发挥有效的应答。自然界中存在的TCR通常对靶抗原具有低亲和力(微摩尔范围低)，因此通常有必要鉴定可对给定TCR序列进行的包括但不限于取代、插入和/或缺失的突变，以改善抗原结合。为了用作可溶性靶向剂，TCR抗原的结合亲和力优选在纳摩尔至皮摩尔范围内，并且结合半衰期优选为数小时。还期望治疗性TCR表现出对靶抗原的高特异性水平，以减轻由脱靶结合导致的在临床应用中的毒性风险。考虑到TCR抗原识别的天然简并性，要获得如此高的特异性可能尤其具有挑战性(Wooldridge,等人,(2012),J Biol Chem 287(2):1168-1177；Wilson,等人,(2004),Mol Immunol 40(14-15):1047-1055)。最后，期望能够以高度稳定的形式表达并纯化治疗性TCR。
发明内容
作为第一方面，本发明提供了包含pMHC结合部分和PD-1激动剂的双功能结合多肽。pMHC结合部分可以包含TCR可变结构域和/或抗体可变结构域。pMHC结合部分可以是T细胞受体(TCR)或TCR样抗体。pMHC结合部分可以是异二聚体α/βTCR多肽对或单链α/βTCR多肽。PD-1激动剂可以是PD-L1的可溶性胞外形式或其功能片段，PD-L1可以包含以下序列或由以下序列组成：FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPY。PD-1激动剂可以是全长抗体或其片段，例如scFv抗体。
PD-1激动剂可以与pMHC结合部分的C末端或N末端融合，并且可以通过接头与pMHC结合部分融合。接头的长度可以多达25个氨基酸。优选地，接头的长度为2、3、4、5、6、7或8个氨基酸。
当pMHC结合部分是TCR时，TCR可以在α链的恒定区和β链的恒定区之间包含非天然二硫键，并且可以与肽抗原特异性结合。
本发明的另一方面提供了用于治疗自身免疫疾病的根据本发明第一方面的双功能结合多肽，所述自身免疫疾病例如斑秃、强直性脊柱炎、特应性皮炎、格雷夫斯病、多发性硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、1型糖尿病以及白癜风和炎性肠病。
本发明还提供了包含根据第一方面的双功能结合多肽的药物组合物。
提供了编码根据第一方面的双功能结合多肽的核酸，以及包含该核酸的表达载体。
还提供了包含这样的核酸或这样的载体的宿主细胞，其中编码双功能结合多肽的核酸可以以单个开放阅读框或分别编码TCR的α链和β链的两个不同的开放阅读框存在。
还提供了制备根据第一方面的双功能结合多肽的方法，其中该方法包括在表达核酸的任选条件下维持本发明的宿主细胞，并分离第一方面的双功能结合肽。
本发明还包括一种治疗自身免疫病症的方法，该方法包括将根据第一方面的双功能结合多肽给药至有需要的患者。
具体实施方式
作为第一方面，本发明提供了包含pMHC结合部分和PD-1激动剂的双功能结合多肽。pMHC结合部分可以包含TCR可变结构域。可替代地，pMHC结合部分可包含抗体可变结构域。pMHC结合部分可以是T细胞受体(TCR)或TCR样抗体。
TCR序列最通常是参考IMGT命名法进行描述的，IMGT命名法是TCR领域的技术人员众所周知并且可理解的。例如，参见：LeFranc和LeFranc,(2001).“T细胞受体白皮书(Tcell Receptor Factsbook)”,Academic Press；Lefranc,(2011),Cold Spring HarbProtoc 2011(6):595-603；Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix 1:Appendix10；和Lefranc,(2003),Leukemia 17(1):260-266.简而言之，αβTCR由两条二硫键连接的链组成。通常认为每条链(α和β)具有两个结构域，即可变结构域和恒定结构域。短连接区将可变结构域和恒定结构域连接，并且通常被视为α可变区的一部分。另外，β链通常在连接区旁含有短多变区，该多变区通常也被视为β可变区的一部分。
每条链的可变结构域位于N末端，并包含三个嵌入于框架序列(FR)中的互补决定区(CDR)。CDR包含用于肽-MHC结合的识别位点。有数种编码α链可变区(Vα)的基因和数种编码β链可变区(Vβ)的基因，这些基因通过其可变区的框架、CDR1和CDR2序列以及通过部分定义的CDR3序列而区别开来。Vα和Vβ基因在IMGT命名法中分别以前缀TRAV和TRBV指代(Folchand Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(1):42-54；Scaviner and Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(2):83-96；LeFranc and LeFranc,(2001),“T细胞受体白皮书”,Academic Press)。同样，有数个连接基因(或J基因)，对于α链和β链分别被称为TRAJ或TRBJ，而对于β链，有被称为TRBD的多变基因(或D基因)(Folch and Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(2):107-114；Scaviner and Lefranc,(2000),ExpClin Immunogenet 17(2):97-106；LeFranc and LeFranc,(2001),“T细胞受体白皮书”,Academic Press)。T细胞受体链的巨大多样性是由各种V、J和D基因之间的组合重排产生的，这包括等位基因变体和连接多样性(Arstila等人,(1999),Science 286(5441):958-961；Robins等人,(2009),Blood 114(19):4099-4107.)。TCRα链和β链的恒定区(或C区)分别被称为TRAC和TRBC(Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix 1:Appendix10)。
当pMHC结合部分是TCR时，TCR可以是非天然存在的和/或纯化和/或工程化的。相对于天然TCR，一个以上突变可以存在于α链可变结构域和/或β链可变结构域中。优选在CDR区域内进行突变。通常引入这样的突变以改善结合部分(例如TCR)对特定肽抗原HLA复合物的结合亲和力。
pMHC结合部分可以是TCR样抗体。TCR样抗体是本领域中用于被赋予了对MHC呈递的肽抗原的TCR样特异性的抗体分子的术语，并且通常TCR样抗体对抗原的亲和力高于天然TCR(Dahan等人,Expert Rev Mol Med 14:e6,2012)这些抗体可以包含重链和轻链，该重链和轻链各自包含可变区和恒定区。本发明中涵盖这些抗体的功能片段，例如如本领域所熟知的scFv、Fab片段等。
本发明的双功能结合多肽具有结合特异性肽抗原-MHC复合物的特性。在本发明的多肽的上下文中的特异性涉及它们识别呈递肽抗原-MHC复合物的靶细胞的能力，同时具有最小的识别不呈递肽抗原-MHC复合物的靶细胞的能力。
本发明的双功能结合多肽可以具有用作治疗试剂的理想安全谱。理想的安全谱是指除了表现出良好的特异性外，本发明的多肽还可以通过进一步的临床前安全性测试。这样的测试的实例包括同种异体反应测试，以确认识别替代性HLA类型的可能性很低。
本发明的双功能结合多肽可以适于高产率的纯化。产率可以基于纯化过程中保留的材料的量而确定(即在纯化过程结束时获得的正确折叠的材料的量相对于重新折叠前获得的增溶材料的量)，或者产率可以基于在纯化过程结束时获得的正确折叠的材料的量相对于原始培养物体积而确定。高产率是指大于1％，或更优选大于5％，或更高的产率。高产率是指大于1mg/ml，或更优选地大于3mg/ml，或大于5mg/ml，或更高的产率。
本发明的双功能结合多肽将对肽抗原和PD-1具有合适的结合亲和力。确定结合亲和力(与平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)的方法是本领域技术人员已知的。在优选的实施方式中，使用表面等离子体共振(SPR)或生物层干涉法(BLI)，例如分别使用BIAcore仪器或Octet仪器来确定结合亲和力和结合半衰期。应当理解，结合多肽的亲和力加倍导致KD减半。T1/2通过ln2除以解离速率常数(koff)来计算。因此，T1/2加倍导致koff减半。通常针对多肽的可溶形式测量KD和koff值。为了考虑独立测量之间的变化，尤其对于解离时间超过20小时的相互作用，可以使用相同的测定方案测量给定多肽的结合亲和力或结合半衰期数次(例如3次或更多次)，并且取结果的平均值。为了比较两个样品(即两个不同多肽和或相同多肽的两种制剂)之间的结合数据，优选使用相同的测定条件(例如温度)进行测量。
对于其中pMHC结合部分包含TCR可变结构域的本发明的双功能结合多肽，所述结构域可以是α和β可变结构域。当pMHC结合部分是TCR时，这样的TCR可以是αβ异二聚体。在某些情况下，pMHC结合部分包含γ和δTCR可变结构域。当pMHC结合部分是TCR时，这样的TCR可以是γδ异二聚体。
本发明的pMHC结合部分可包含胞外α链TRAC恒定结构域序列和/或胞外β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列。恒定结构域可以被截短，使得不存在跨膜结构域和胞质结构域。恒定结构域中的一个或两者可含有相对于天然TRAC和/或TRBC1/2序列的突变、取代或缺失。术语TRAC和TRBC1/2还涵盖天然多态变体，例如在TRAC第4位处由N突变为K(Bragado etal International immunology.1994Feb；6(2):223-30)。
可替代地，除了全长或截短的恒定结构域，也可以没有TCR恒定结构域。由此，本发明的pMHC结合部分可以由TCRα链和β链的可变结构域组成。
当pMHC结合部分包含TCR可变结构域时，这样的TCR可变结构域可以呈单链形式，例如单链TCR。单链形式包括但不限于Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ或Vα-Cα-L-Vβ-Cβ类型的αβTCR多肽，其中Vα和Vβ分别是TCRα和β可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和β胞外恒定区，L是接头序列(Weidanz等人,(1998)J Immunol Methods.Dec 1；221(1-2):59-76；Epel等人,(2002),Cancer Immunol Immunother.Nov；51(10):565-73；WO 2004/033685；WO9918129)。当存在时，胞外恒定结构域中的一个或两者可以是全长，或者它们可以被截短和/或含有如上所述的突变。在某些实施方式中，本发明的单链TCR可变结构域和/或单链TCR可具有在相应恒定结构域的残基之间的引入的二硫键，如WO 2004/033685中所述。WO2004/033685；WO98/39482；WO01/62908；Weidanz等人.(1998)J Immunol Methods 221(1-2):59-76；Hoo等人.(1992)Proc Natl Acad Sci U S A 89(10):4759-4763；Schodin(1996)Mol Immunol 33(9):819-829中进一步描述了单链TCR。
对于其中pMHC结合部分为TCR的本发明的双功能结合多肽，可以通过截短或取代来修饰该TCR的α链和β链恒定结构域序列，以缺失TRAC外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2外显子2的Cys2之间的天然二硫键。α链和/或β链恒定结构域序列可具有在相应恒定结构域的残基之间的引入的二硫键，如例如WO 03/020763中所述。在优选的实施方式中，可以通过用半胱氨酸残基取代TRAC的Thr 48位置和TRBC1或TRBC2的Ser 57位置来修饰α和β恒定结构域，所述半胱氨酸在TCR的α和β恒定结构域之间形成二硫键。TRBC1或TRBC2还可包含在恒定结构域第75位处的半胱氨酸至丙氨酸突变，以及在恒定结构域第89位处的天冬酰胺至天冬氨酸突变。存在于本发明的αβ异二聚体中的胞外恒定结构域中的一个或两者可以在C末端或C端被截短，例如截短最多15个、最多10个或最多8个或更少的氨基酸。存在于本发明的αβ异二聚体中的胞外恒定结构域中的一个或两者可以在C末端或C端被截短，例如截短最多15个、最多10个或最多8个氨基酸。α链胞外恒定结构域的C末端可以被截短8个氨基酸。
胞外恒定结构域之间可以存在非天然二硫键。在WO03020763和WO06000830中进一步描述了所述非天然二硫键。非天然二硫键可以在TRAC的Thr 48位置与TRBC1或TRBC2的Ser 57位置之间。恒定结构域中的一个或两者可含有相对于天然TRAC和/或TRBC1/2序列的一个或多个突变取代或缺失。
在其中pMHC结合部分包含TCR可变结构域的双功能结合多肽的另一种优选形式中，TCR可变结构域和PD-1激动剂结构域可以在分开的多肽链上交替，从而导致二聚化。WO2019012138中描述了这样的形式。简而言之，第一多肽链可以包含(从N末端到C末端)第一抗体可变结构域、随后的TCR可变结构域、以及任选的随后的Fc结构域。第二链可以包含(从N末端到C末端)TCR可变结构域、其后的第二抗体可变结构域、以及任选的随后的Fc结构域。考虑适当长度的接头，链将二聚化为多特异性分子，该多特异性分子任选地包括Fc结构域。结构域以该方式位于不同链上的分子也可被称为双抗体，本文中也考虑了该双抗体。可以添加额外的链和结构域以形成例如三抗体。
因此，本文还提供了双特异性多肽分子，其选自包含第一多肽链和第二多肽链的分子组，其中：
第一多肽链包含PD-1激动剂抗体的可变结构域的第一结合区(VD1)、和与MHC相关肽表位特异性结合的TCR的可变结构域的第一结合区(VR1)、以及连接所述结构域的第一接头(LINK1)；
第二多肽链包含与MHC相关肽表位特异性结合的TCR的可变结构域的第二结合区(VR2)、和PD-1激动剂抗体的可变结构域的第二结合区(VD2)、以及连接所述结构域的第二接头(LINK2)；
其中所述第一结合区(VD1)和所述第二结合区(VD2)缔合以形成第一结合位点(VD1)(VD2)；
所述第一结合区(VR1)和所述第二结合区(VR2)结合形成结合所述MHC相关肽表位的第二结合位点(VR1)(VR2)；
其中所述两条多肽链与人IgG铰链结构域和/或人IgG Fc结构域或其二聚化部分融合；以及
其中所述两条多肽链通过所述铰链结构域和/或Fc结构域之间的共价键和/或非共价键来连接；以及
其中所述双重特异性多肽分子能够同时激动PD-1并结合MHC相关肽表位，以及双重特异性多肽分子，其中两条多肽链中结合区的顺序选自VD1-VR1和VR2-VD2、或VD1-VR2和VR1-VD2、或VD2-VR1和VR2-VD1、或VD2-VR2和VR1-VD1，其中结构域通过LINK1或LINK2来连接。
PD-1激动剂可以对应于PD-L1(Uniprot ref：Q9NZQ7)或PD-L2(Q9BQ51)或其功能片段的可溶性胞外区。PD-L1可以包含下列序列或由下列序列组成。
全长PD-L1具有下列序列：
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER
可以将PD-L1的截短形式与pMHC结合部分融合，只要它保留结合和激动PD-1的能力即可。这样的截短片段可如以下序列所示：
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPY
可替代地，也可以将较短或较长的截短与pMHC结合部分融合。
PD-1激动剂可以是全长抗体或其片段(例如scFv抗体或Fab片段)或纳米抗体。WO2011110621和WO2010029434和WO2018024237中提供了这样的抗体的实例。本发明的抗体分子可包含具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，并且可以是但不限于：Fab、修饰的Fab、Fab'、修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、单域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、双价抗体、三价抗体或四价抗体、Bis-scFv、双抗体、三抗体、四抗体、纳米抗体和上述任意的表位结合片段。
PD-1激动剂可以与pMHC结合部分的C末端或N末端融合，并可以通过接头与pMHC结合部分融合，该接头的长度可以为2、3、4、5、6、7或8个氨基酸。接头的长度可以为10、12、15、16、18、20或25个氨基酸。接头序列可以重复以形成更长的接头。每个接头可以基于较短接头序列的一个、两个、三个或四个重复而形成。接头序列通常是柔性的，因为它们主要由氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，这些氨基酸不具有可能限制柔性的庞大的侧链。可替代地，可能需要具有更大刚性的接头。可以容易地确定接头序列的可用或最佳长度。接头的长度可以多达25个氨基酸。通常接头序列的长度将小于约12个氨基酸，例如小于10个氨基酸，或为2至8个氨基酸。可以用于本发明的TCR中的合适接头的实例包括但不限于：GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、GSGGGP、GGEPS、GGEGGGP和GGEGGGSEGGGS(如WO2010/133828中所述)。
本发明的双功能结合多肽可以进一步包含pK修饰部分。当使用免疫球蛋白Fc结构域时，它可以是任何抗体Fc区。Fc区是与细胞表面Fc受体和补体系统的某些蛋白质相互作用的抗体的尾区。Fc区通常包含两条多肽链以及铰链区，该两条多肽链均具有两个或三个重链恒定结构域(称为CH2、CH3和CH4)。两条链通过铰链区内的二硫键连接。来自免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2和IgG4的Fc结构域与FcRn结合并经历FcRn介导的回收，从而提供了长的循环半衰期(3-4周)。IgG与FcRn的相互作用已被定位在覆盖CH2和CH3结构域的部分的Fc区中。用于本发明的优选的免疫球蛋白Fc包括但不限于来自IgG1或IgG4的Fc结构域。优选地，Fc结构域来源自人序列。Fc区还可优选包括促进二聚化的KiH突变，以及防止与活化受体即功能沉默分子相互作用的突变。免疫球蛋白Fc结构域可以与其他结构域(即TCR可变结构域或免疫效应物)的C末端或N末端融合。免疫球蛋白Fc可通过接头与其他结构域(即TCR可变结构域或免疫效应物)融合。接头序列通常是柔性的，因为它们主要由氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，这些氨基酸不具有可能限制柔性的庞大的侧链。可替代地，可能需要具有更大刚性的接头。可以容易地确定接头序列的可用或最佳长度。通常接头序列的长度将小于约12个氨基酸，例如小于10个氨基酸，或为2至10个氨基酸，接头的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。可以用于本发明的多结构域结合分子中的合适接头的实例包括但不限于：GGGSGGGG、GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、GSGGGP、GGEPS、GGEGGGP和GGEGGGSEGGGS(如WO2010/133828中所述)。当免疫球蛋白Fc与TCR融合时，它可以通过接头或不通过接头而与α链或β链融合。此外，Fc的单条链可以与TCR的单条链融合。
优选地，Fc区可以来源自IgG1或IgG4亚类。两条链可包含CH2和CH3恒定结构域以及铰链区的全部或一部分。铰链区可以基本上或部分地对应于来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区。铰链可包括核心铰链结构域的全部或部分以及下部铰链区结构域的全部或一部分。优选地，铰链区含有连接两条链的至少一个二硫键。
Fc区可包含相对于WT序列的突变。突变包括取代、插入和缺失。可以出于引入所需治疗特性的目的进行这样的突变。例如，为了促进异源二聚化，可以将杵臼(knobs intoholes，KiH)突变工程化到CH3结构域中。在这种情况下，一条链被工程化为包含大突出残基(即杵)，例如Y，另一条链被工程化为含有互补的窝(即臼)。KiH突变的合适位置是本领域已知的。另外地或可替代地，可以引入突变，该突变消除或减少与Fcγ受体的结合和/或增加与FcRn的结合，和/或防止Fab臂交换，或去除蛋白酶位点。
PK修饰部分也可以是白蛋白结合结构域，该白蛋白结合结构域也可以起到延长半衰期的作用。如本领域中已知的，白蛋白的循环半衰期长具，为19天，部分是由于白蛋白的大小高于肾脏阈值，以及由于其特异性相互作用和通过FcRn的回收。与白蛋白附接是改善体内治疗分子的循环半衰期的熟知的策略。白蛋白可以通过使用特定的白蛋白结构域而被非共价附接，或通过缀合或直接遗传融合而共价附接。Sleep等人,Biochim BiophysActa.2013Dec；1830(12):5526-34中给出了利用与白蛋白附接以改善半衰期的治疗分子的实例。
白蛋白结合结构域可以是能够与白蛋白结合的任何部分，包括任何已知的白蛋白结合部分。白蛋白结合结构域可以选自特异性结合白蛋白的内源性或外源性配体、有机小分子、脂肪酸、肽和蛋白质。优选的白蛋白结合结构域的实例包括：短肽，例如Dennis等人,JBiol Chem.2002Sep 20；277(38):35035-43中所述(例如肽QRLMEDICLPRWGCLWEDDF)；工程化以结合白蛋白的蛋白质，例如抗体、抗体片段以及如支架蛋白的抗体，例如由GSK商业提供的
(O'Connor-Semmes等人,Clin Pharmacol Ther.2014Dec；96(6):704-12)和由Ablynx商业提供的
(Van Roy等人,Arthritis Res Ther.2015May 20；17:135)；和基于天然存在的白蛋白结合结构域的蛋白质，例如链球菌蛋白G蛋白(Stork等人,Eng Des Sel.2007Nov；20(11):569-76)，例如由Affibody商业提供的
优选地，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。白蛋白结合结构域对人白蛋白的亲和力可以在皮摩尔至微摩尔的范围内。考虑到人血清中白蛋白的浓度极高(35-50mg/ml，约0.6mM)，据计算，基本上所有白蛋白结合结构域都将与体内白蛋白结合。
白蛋白结合部分可以与其他结构域(即TCR可变结构域或免疫效应物)的C末端或N末端连接。白蛋白结合部分可以通过接头与其他结构域(即TCR可变结构域或免疫效应物)连接。接头序列通常是柔性的，因为它们主要由氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，这些氨基酸不具有可能限制柔性的庞大的侧链。可替代地，可能需要具有更大刚性的接头。可以容易地确定接头序列的可用或最佳长度。通常接头序列的长度将小于约12个氨基酸，例如小于10个氨基酸，或为2至10个氨基酸。接头的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。可以用于本发明的多域结合分子中的合适接头的实例包括但不限于：GGGSGGGG、GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、GSGGGP、GGEPS、GGEGGGP和GGEGGGSEGGGS(如WO2010/133828中所述)。当白蛋白结合部分与TCR连接时，它可以通过接头或不通过接头而与α链或β链连接。
本发明的另一方面提供了用于治疗自身免疫疾病的根据本发明第一方面的双功能结合多肽，所述自身免疫疾病例如斑秃、强直性脊柱炎、特应性皮炎、格雷夫斯病、多发性硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、1型糖尿病、白癜风、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、眼部疾病(例如葡萄膜炎)、皮肤性狼疮和狼疮性肾炎以及由PD-1/PD-L1拮抗剂引起的癌症患者的自身免疫疾病。
本发明还提供了用于治疗或预防疼痛，特别是与炎症有关的疼痛的根据本发明第一方面的双功能结合多肽。
任选地，本发明的双功能多肽用于治疗1型糖尿病、炎性肠病和类风湿性关节炎。
本发明还提供了包含根据第一方面的双功能结合多肽的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了编码本发明的双功能结合多肽的核酸。在一些实施方式中，核酸是cDNA。在一些实施方式中，核酸可以是mRNA。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明TCR的α链可变结构域的序列的核酸。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明TCR的β链可变结构域的序列的核酸。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码TCR样抗体的轻链的序列的核酸。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码TCR样抗体的重链的序列的核酸。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码PD-1激动剂的全部或一部分(例如PD-L1或由其截短的序列)或激动性PD-1抗体的全部或一部分(例如这样的抗体的轻链和/或重链)的序列的核酸。核酸可以是非天然存在的和/或纯化和/或工程化的。核酸序列可以是根据所使用的表达系统而密码子优化的。如本领域技术人员已知的，表达系统可以包括细菌细胞(例如大肠杆菌)、或酵母细胞、或哺乳动物细胞、或昆虫细胞，或者它们可以是无细胞表达系统。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸的载体。优选地，载体是合适的表达载体。
本发明还提供了带有本发明载体的细胞。合适的细胞包括细菌细胞(例如大肠杆菌)、或酵母细胞、或哺乳动物细胞、或昆虫细胞。载体可以包含在单个开放阅读框中或在两个不同的分别编码TCR的α链和β链或分别编码TCR样抗体的轻链或重链的开放阅读框中进行编码的本发明的核酸。另一个方面提供了带有第一表达载体和第二表达载体的细胞，所述第一表达载体包含编码本发明多肽的TCR/TCR样抗体的α链/轻链的核酸，所述第二表达载体包含编码本发明多肽的TCR/TCR样抗体的β链/重链的核酸。本发明的细胞可以是分离的和/或重组的和/或非天然存在的和/或工程化的。
如本领域熟知的，多肽可以经历翻译后修饰。糖基化是一种这样的修饰，其包括寡糖部分与TCR/TCR样抗体/PD-L1或PD-1抗体或其他PD-1激动剂中限定的氨基酸共价附接。例如，天冬酰胺残基或丝氨酸/苏氨酸残基是寡糖附接的熟知位置。特定蛋白的糖基化状态取决于许多因素，包括蛋白序列、蛋白构象和某些酶的可用性。此外，糖基化状态(即寡糖类型、共价连接和附接的总数)可以影响蛋白功能。因此，当生产重组蛋白时，通常需要控制糖基化。已经使用控制的糖基化来改善基于抗体的治疗剂(Jefferis等人，(2009)Nat RevDrug Discov Mar；8(3):226-34)。对于本发明的可溶的TCR，可以通过例如在体内使用特定细胞系(包括但不限于哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)细胞)或通过化学修饰来控制糖基化。这种修饰可能是期望的，因为糖基化可以改善药代动力学，降低免疫原性并更接近地模拟天然人蛋白(Sinclair和Elliott,(2005)Pharm Sci.Aug；94(8):1626-35)。
为了施用至患者，本发明的双功能结合多肽可以作为无菌药物组合物的一部分与一种或多种药学上可接受载体或赋形剂一起而提供。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于所期望的将其施用至患者的方法)。该药物组合物可以以单位剂型提供，一般在密闭容器中提供，并且可以作为试剂盒的一部分提供。这样的试剂盒通常(尽管不一定)包括使用说明书。该药物组合物可以包括多个所述单位剂型。
药物组合物可适于通过任何合适的途径给药，例如肠胃外(包括皮下、肌内、鞘内或静脉内)、肠内(包括口服或直肠)、吸入或鼻内途径。这样的组合物可以通过药学领域中已知的任何方法制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载体或赋形剂混合。
本发明的物质的剂量可以在宽限度之间变化，这取决于要治疗的疾病或病症、要治疗个体的年龄和状况等。双功能结合多肽的合适剂量范围可以为25ng/kg至50μg/kg或1μg至1g的范围。医师将最终确定要使用的合适剂量。
本发明的双功能结合多肽、药物组合物、载体、核酸和细胞可以以基本上纯的形式提供，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯度。
还提供了包含这样的核酸或这样的载体的宿主细胞，其中编码双功能结合多肽的核酸可以以单个开放阅读框或分别编码TCR的α链和β链的两个不同的开放阅读框存在。
还提供了制备根据第一方面的双功能结合多肽的方法，其中该方法包括在表达本发明的核酸的任选条件下维持本发明的宿主细胞，并分离第一方面的双功能结合肽。
本发明每个方面的优选特征与其他每个方面作必要修改后相同。本文提及的现有技术文件以法律允许的最大程度并入。
现在参考以下非限制性实施例和附图描述本发明，其中：
图1显示了在存在肽冲击的靶细胞的情况下，本发明的包含可溶性TCR以及PD-L1的截短形式的双功能多肽对NFAT报告物活性的剂量依赖性抑制。
图2显示了在存在肽冲击的靶细胞的情况下，本发明的包含可溶性TCR以及PD-1激动剂scFv抗体片段的双功能多肽对NFAT报告物活性的抑制。
图3显示了在存在肽冲击的靶细胞的情况下，本发明的包含可溶性TCR以及PD-1激动剂scFv抗体片段的双功能多肽对人原代t细胞活化的抑制。
图4显示了在存在肽冲击的靶细胞的情况下，本发明的双功能多肽对NFAT报告物活性的抑制，该双功能多肽包含：具有不同特异性的两种可溶性TCR中的一种，以及PD-1激动剂scFv抗体片段。
实施例
实施例1
以下实施例证明，与可溶性TCR融合的PD-1激动剂在靶向免疫突触时有效抑制T细胞活化。
在该双功能结合多肽中使用的可溶性TCR是天然TCR的亲和力增强版本，该版本特异性识别源自人前胰岛素原的HLA-A*02限制性肽(WO2015092362中描述了这样的分子)。PD-1激动剂是包含PD-1相互作用位点的PD-L1胞外区的截短版本(Zak等人,Structure 23:2341-2348,2015)。PD-L1通过标准的5个氨基酸接头与TCRα链的N末端融合。
使用Jurkat NFAT荧光素酶PD-1报告物测定，在存在HEK293T抗原呈递靶细胞的情况下，测量TCR-PD1激动剂融合分子介导的对T细胞NFAT活性的抑制。
方法
TCR-PD1激动剂融合分子的表达、重折叠和纯化
使用基于悬浮适应的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的高产率瞬时表达系统(ExpiCHO表达系统，Thermo Fisher)进行TCR-PD1激动剂融合分子的表达。使用含有与PD-1激动剂融合的TCR链的哺乳动物表达质粒，根据制造商的说明来进行细胞共转染。收获后，通过在冷冻离心机中将上清液以4000-5000×g离心30分钟来进行细胞培养上清液的澄清。上清液通过0.22μm过滤器过滤并收集以进行进一步纯化。
可替代地，使用大肠杆菌作为宿主生物进行TCR-PD1激动剂融合分子的表达。将含有α链和β链的表达质粒分别转化到BL21pLysS大肠杆菌菌株中，并在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上铺板。从每个转化中挑选环状菌落，并在LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素和1％葡萄糖)中在37℃下生长，直到OD600达到约0.5至1.0。然后将LB起始培养物添加到自诱导培养基(Foremedium)中，细胞在37℃生长约3小时，然后30℃过夜。通过离心收集细胞，并在Bugbuster(Novagen)中裂解。通过进行两次Triton洗涤(50mM Tris pH 8.1、100mM NaCl，10mM EDTA、0.5％Triton)去除细胞碎片和膜，提取包涵体(IB)。每次通过以10000g离心5分钟来收获IB。为了除去去污剂，将IB用50mM Tris pH8.1、100mM NaCl和10mMEDTA洗涤。最终将IB重悬在50mM Tris pH8.1、100mM NaCl和10mM EDTA的缓冲液中。为了测量蛋白质产率，将IB溶解在8M尿素缓冲液中，并通过280nM的吸光度确定浓度。
对于重折叠，以1:1的摩尔比混合α链和β链，并在37℃下在6M胍盐酸盐、50mM TrispH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、20mM DTT中变性30分钟。然后将变性链添加到由4M尿素、100mM Tris pH 8.1、0.4M L-精氨酸、2mM EDTA，1mM胱胺和10mM半胱胺组成的重折叠缓冲液中，并在持续搅拌下孵育10分钟。将含有变性链的重折叠缓冲液在Spectra/Por 1膜中对10x体积的H2O透析约16小时，对10x体积的10mM Tris pH 8.1透析约7小时，并对10x体积的10mM Tris pH8.1透析约16小时。
使用POROS 50HQ(Thermo Fisher Scientific)阴离子交换柱，用20mM Tris pH8.1作为上样缓冲液且20mM Tris pH8.1与1M NaCl作为结合和洗脱缓冲液，在AKTA pure(GE Healthcare)上纯化从哺乳动物或大肠杆菌表达系统获得的可溶性蛋白。将蛋白质上样到柱子上，并用0-50％的洗脱缓冲液梯度洗脱。合并含有蛋白质的级分，并在20mM MESpH6.0中稀释20倍(体积/体积)，以在POROS 50HS(Thermos Fisher Scientific)柱上、使用20mM MES pH6.0以及20mM MES pH6.0、1M NaCl分别作为结合缓冲液以及洗脱缓冲液，进行第二步阳离子交换色谱法。使用0-100％的洗脱缓冲液梯度洗脱阳离子交换柱上的结合蛋白。合并包含蛋白质的阳离子交换级分，并使用PBS作为运行缓冲液在Superdex 200HR(GEHealthcare)凝胶过滤柱上进一步纯化。来自凝胶过滤的阳性级分合并，浓缩并在-80℃下储存直至需要。
Jurkat NFAT Luc-PD-1报告物测定
将HLA-A*02阳性的HEK293T靶细胞用TCR活化剂质粒(BPS Bioscience，目录号：60610)进行瞬时转染，并用TCR-PD1激动剂融合分子识别的相关肽进行冲击。然后将靶细胞与不同浓度的TCR-PD1激动剂融合分子一起孵育，使得与同源肽-HLA-A2复合物结合。将组成型表达PD-1的Jurkat NFAT Luc PD-1效应细胞添加到靶细胞中，并在18至20小时后确定NFAT活性。在洗去或未洗去的情况下进行实验(TCR-PD1激动剂融合分子结合后)。使用未受冲击的靶细胞进行进一步的对照。包括了TCR活化剂/PD-L1转染的HEK293T A2B2M靶细胞作为阳性对照。
结果
图1所示的数据表明，在存在肽冲击的靶细胞的情况下，无论洗去或未洗去，通过TCR-PD1激动剂融合分子观察到对NFAT报告物活性的剂量依赖性抑制。至关重要的是，未受冲击的靶细胞观察到最小抑制，表明靶向免疫突触对于PD-1激动剂活性至关重要。
实施例2
以下实施例提供了与可溶性TCR融合的PD-1激动剂在靶向免疫突触时可有效抑制T细胞活化的进一步证据。
该实施例中使用的实验系统和方法与实施例1中所描述的相同，除了在该情况下，TCR-PD1激动剂融合分子的PD-1激动剂部分是scFv抗体片段，例如WO2011110621中所述。
使用实施例1中所述的Jurkat NFAT荧光素酶PD-1报告物测定，在存在HEK293T抗原呈递靶细胞的情况下，测量TCR-PD1激动剂融合分子介导的对T细胞NFAT活性的抑制。
结果
如图2a所示，在用100nM TCR-PD1激动剂融合分子处理的肽冲击的细胞(标记为+PPI)中观察到对NFAT活性的显著抑制(>60％)；而在用TCR-PD1激动剂融合分子处理的未受冲击的靶细胞(标记为-PPI)中观察到最小抑制。单独使用可溶性TCR或单独使用PD-1激动剂(以scFv或IgG4形式)的对照实验均未显示报告物活性受到抑制，这表明PD-1激动剂活性需要使PD-1激动剂靶向免疫突触。图2b进一步显示了对NFAT活性的剂量依赖性抑制。同样，只有TCR-PD1激动剂融合分子形式能够抑制NFAT活性。非靶向PD-1激动剂抗体不能抑制活性。
综上所述，这些结果证明，使PD-1激动剂靶向免疫突触对于PD-1激动剂活性至关重要。
实施例3
以下实施例提供了与可溶性TCR融合的PD-1激动剂在靶向免疫突触时可有效抑制T细胞活化的进一步证据。
本实施例中使用的TCR-PD1激动剂融合分子与实施例2中描述的相同，其中PD1激动剂是scFv抗体片段。
在这种情况下，使用替代测定来评估TCR-PD1激动剂融合分子对原代人T细胞功能的影响。
方法
原代人T细胞测定
使用pan-T细胞分离试剂盒(Miltenyi，目录号：130-096-535)从新鲜制备的PBMC中分离原代人T细胞。用葡萄球菌肠毒素B(SEB，100ng/ml，Sigma S4881)预加载(pre-load)HLA-A*02阳性Raji B细胞(Raji A2B2M)1小时，然后用33Gy照射。对于预活化，将原代人T细胞与加载SEB的Raji A2B2M靶细胞以1:1的比例孵育，在24孔细胞培养板中使用1x10E6个细胞/ml的每种细胞类型。将原代人T细胞与加载SEB的Raji A2B2M细胞孵育10天，并在第3天和第7天添加IL-2(50U/ml)。在第10天，将预活化的T细胞洗涤并重悬于新鲜培养基中。将新鲜的Raji A2B2M细胞用TCR-PD1激动剂融合分子识别的20μM相关肽冲击2小时，或不进行冲击2小时。在肽冲击的最后1小时中，用SEB(10ng/ml)加载Raji A2B2M细胞，然后用33Gy照射。将Raji A2B2M细胞以1x10E5个细胞/孔在96孔细胞培养板中铺板，然后与TCR-PD1激动剂融合分子滴定液预孵育1小时。将预活化的T细胞以1x10E5细胞/孔添加到Raji A2B2M靶细胞中，并孵育48小时。收集上清液，并使用MSD ELISA测定IL-2水平。
结果
图3所示的数据表明，在存在肽冲击的靶细胞的情况下，TCR-PD1激动剂融合分子对原代人T细胞IL-2的产生进行剂量依赖性抑制，而非靶向TCR-PD1激动剂融合分子(即用未受冲击的靶细胞)或单独的PD-1激动剂scFv则不能。这些数据证明，将PD-1激动剂靶向免疫突触导致原代细胞中的PD-1激动剂活性。
实施例4
以下实施例证明，使用识别替代抗原的TCR观察到相同的技术效果。
本实施例中使用的实验系统和方法与实施例2中描述的相同。在这种情况下，PD-1激动剂抗体与两种不同的可溶性TCR融合。
使用实施例1中所述的Jurkat NFAT荧光素酶PD-1报告物测定，在存在HEK293T抗原呈递靶细胞的情况下，测量TCR-PD1激动剂融合分子介导的对T细胞NFAT活性的抑制。
结果
如图4所示，通过两种TCR-PD1激动剂融合分子(包含与TCR1或TCR2融合的PD-1激动剂scFv抗体片段)，在存在用各自的肽(肽1或2)冲击的靶细胞的情况下，观察到强的剂量依赖性抑制。对于两种TCR-PD1激动剂融合分子，在不存在靶向肽的情况下进行研究时，观察到最小活性。
这些结果证明，使用对不同的pMHC具有特异性的可溶性TCR，可以将TCR-PD1激动剂融合分子导向不同的组织，并且TCR-PD1激动剂融合分子可以促进对T细胞活性的靶向抑制。
Claims (22)
1.一种双功能结合多肽，包含pMHC结合部分和PD-1激动剂。
2.根据权利要求1所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述pMHC结合部分包含TCR可变结构域和/或抗体可变结构域。
3.根据权利要求1所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述pMHC结合部分是T细胞受体(TCR)或TCR样抗体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述pMHC结合部分是异二聚体α/βTCR多肽对。
5.根据前述权利要求中任一项所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述pMHC结合部分是单链α/βTCR多肽。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述TCR在α链的恒定区和β链的恒定区之间包含非天然的二硫键。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述TCR与肽抗原特异性结合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述PD-1激动剂是PD-L1或其功能片段。
9.根据权利要求8所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述PD-L1包含以下序列或由以下序列组成：
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPY。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述PD-1激动剂是全长抗体或其片段。
11.根据权利要求10所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述PD-1激动剂是scFv抗体。
12.根据前述权利要求中任一项所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述PD-1激动剂与所述pMHC结合部分的C末端或N末端融合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述PD-1激动剂通过接头与所述pMHC结合部分融合。
14.根据权利要求13所述的双功能结合多肽，其特征在于，所述接头的长度为2、3、4、5、6、7或8个氨基酸。
15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至14中任一项所述的双功能结合多肽。
16.一种核酸，其编码根据权利要求1至14中任一项所述的双功能结合多肽。
17.一种表达载体，其包含权利要求16所述的核酸。
18.一种宿主细胞，其包含根据权利要求16所述的核酸或根据权利要求17所述的载体，任选地，其中编码所述双功能结合多肽的所述核酸以单个开放读码框或分别编码α链和β链的两个不同的开放阅读框存在。
19.一种制备根据权利要求1至14中任一项所述的双功能结合多肽的方法，所述方法包括在表达核酸的任选条件下维持根据权利要求18所述的宿主细胞，并分离所述双功能结合肽。
20.根据权利要求1至14中任一项所述的双功能结合多肽、根据权利要求15所述的药物组合物、根据权利要求16所述的核酸和/或根据权利要求17所述的载体，用于医学，特别是用于治疗自身免疫疾病的用途，或者用于治疗或预防疼痛特别是与炎症有关的疼痛的用途。
21.根据权利要求20所述的双功能结合多肽、药物组合物、核酸和/或载体的用途，其特征在于，所述自身免疫疾病是斑秃、强直性脊柱炎、特应性皮炎、格雷夫斯病、多发性硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、1型糖尿病和白癜风、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、眼部疾病(例如葡萄膜炎)、皮肤性狼疮和狼疮性肾炎以及由PD-1/PD-L1拮抗剂引起的癌症患者的自身免疫疾病中的一种。
22.一种治疗自身免疫病症的方法，所述方法包括将权利要求1至14中任一项所述的双功能结合多肽、根据权利要求15所述的药物组合物、根据权利要求16所述的核酸和/或根据权利要求17所述的载体给药至有需要的患者。
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