JP2022523722A - 複数ドメイン結合性分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗原に関して特異性を有するＴ細胞レセプター(TCR)、免疫グロブリンFcドメイン又はアルブミン-結合性部分；及び免疫エフェクタードメインを含んでなる可溶性複数ドメイン結合性分子に関する。このような複数ドメイン結合性分子は、機能を保持しつつ向上した半減期を示すので、有利である。【選択図】なし

Description

本発明は、抗原に関して特異性を有するＴ細胞レセプター(TCR)、免疫グロブリンFcドメイン又はアルブミン-結合性部分；及び免疫エフェクタードメインを含んでなる可溶性の複数ドメイン結合性分子に関する。この複数ドメイン結合性分子は、機能を保持しつつ、向上した半減期を示すので、有利である。
発明の背景
多くのタンパク質ベースの治療薬(抗体フラグメント及びd融合タンパク質を含む)は、投与後に身体から迅速に排出される。それらの短い循環半減期は、代表的には、小さなサイズ(これが腎濾過による効率的なクリアランスを可能にする)及び細胞内分解からの保護の欠如に帰せられる。この場合、頻回投与又は長い注入時間が、当該薬剤の有効濃度を長期間にわたって維持するために必要となる。投薬を改善するため、循環半減期を延長する幾つかのストラテジが用いられてきた。これらには、可撓性親水性分子(例えば、炭化水素又はPEG(ポリエチレングリコール))の付着によるタンパク質の流体力学半径の増加及び抗体Fcドメイン又は血清アルブミンの付着による胎児性Fcレセプター(FcRn)を介するリサイクリングの活用が挙げられる(Konnteman，Curr Opin Biotechnol. 2011 Dec;22(6):868-76)。
FcRn媒介リサイクリングを活用するストラテジは、インビボで免疫原性を誘導するより低いリスク及び達成し得る長い半減期延長のために、特に魅力的である。例えば、BiTE(登録商標)形式のＴ細胞結合性二重特異性抗体の半減期は、Fcドメインの付着後に200時間を超えると報告されている(Lorenczewskiら，Blood 2017. 130(Suppl 1), 2815)。同様に、アルブミン結合性ドメインが組み込まれてるTriTac(登録商標)形式の二重特異性抗体は、４日を超える半減期を有すると報告されている(Wescheら，Cancer Res 2018;78(13 Suppl):Abstract nr 3814)。
可溶性Ｔ細胞レセプターを抗CD3抗体フラグメントに融合して含んでなる融合体タンパク質は、６～８時間のインビボ半減期を有するＴ細胞結合性二重特異性融合タンパク質の新規カテゴリーである(Satoら，2018 J Clin Onc 2018 36, no. 15_suppl 9521-9521；Middletonら，J Clin Onc 2016 34, no. 15_suppl 3016-3016)。伝統的な抗体とは異なり、Ｔ細胞レセプターは、細胞内抗原に由来し、細胞表面にヒト白血球抗原によって提示される短いペプチド(ペプチド-HLA)を認識するように設計されている。抗原提示細胞上のペプチド-HLA複合体とＴ細胞との間での有効な免疫シナプス形成は、(膜内距離の増加により撹乱される)固定の相互作用幾何形状に依拠している(Choudhuriら，2005 Nature Jul 28;436(7050):578-82)。
発明の説明
半減期が増加した、有効な免疫シナプス形成を媒介することができるＴ細胞結合性二重特異性タンパク質に関する必要性が存在する。
当該分野における予想に反して、本発明者らは、TCR-抗CD3融合タンパク質を抗体Fc領域又はアルブミン結合性部分に融合することにより、驚くべきことに、有効な免疫シナプス形成がもたらされることを見出した。
第１の観点において、
i)Ｔ細胞結合性免疫エフェクターに連結された、ペプチド-主要組織適合性複合体(pMHC)結合性部分と、
ii)免疫グロブリンFc又はアルブミン結合性ドメインを含んでなる半減期延長ドメインと
を含んでなる複数ドメイン結合性分子が提供される。
A)TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質の設計；B)本発明のTCR-抗CD3-Fc融合タンパク質の例示配列 図２は、Fcドメインを組み込まれたTCR-抗CD3融合体が抗原陽性標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を媒介することができることを示す。３つのIgG1-Fc融合体のデータを示す。 A)はアルブミン結合性ペプチドを組み込まれたTCR-抗CD3融合体が抗原陽性標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を媒介することができることを示す。アルブミン結合性ペプチドがC-α(F1)、N-α(F2)又はC-β(F3)のいずれかに付着する３つの形式が示されている。B)は、アルブミン結合性ナノボディを組み込まれているTCR-抗CD3融合体が抗原陽性標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を媒介できることを示している。アルブミン結合性ペプチドがC-α(R)又はC-β(Y)のいずれかに付着する２つの形式が示されている。C)は、アルブミン結合性ドメイン抗体(AlbudabTM)を組み込まれているTCR-抗CD3融合体が抗原陽性標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を媒介することができることを示している。AlbudabTMがTCR-抗CD3融合体のC-αに付着する１つの形式が示されている。 A)は、マウス血清中でのTCR-抗CD3-AlbudabTM融合体のPK特性を示す。B)は、マウスにおける評価に基づく、TCR-抗CD3-AlbudabTM融合体のヒトにおける理論的PKを示す。
第１の観点において、
i)Ｔ細胞結合性免疫エフェクターに連結された、ペプチド-主要組織適合性複合体(pMHC)結合性部分と、
ii)免疫グロブリンFc又はアルブミン結合性ドメインを含んでなる半減期延長ドメインと
を含んでなる複数ドメイン結合性分子が提供される。
好ましくは、pMHC結合性部分は、Ｔ細胞レセプター(TCR)又はTCR及び/若しくは抗体可変ドメインと少なくとも１つの定常ドメインとを含んでなるTCR様抗体である。好ましくは、pMHC結合性部分は、少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインを含んでなる。好ましくは、定常ドメインは、TCR α鎖又はTCR β鎖の定常ドメイン(それぞれTRAC又はTRBC)に相当し得る。或いは、pMHC結合性部分のTCR定常ドメインは、抗体軽鎖又は重鎖の定常ドメイン(CL、CH1、CH2、CH3又はCH4)で置換されていてもよい。定常ドメインは全長であってもよいし、短縮化されていてもよい。TCR定常ドメインは、膜貫通ドメインを除去するように短縮化されていてもよい。定常ドメインが短縮化されている場合、好ましくは、膜結合部分のみが除去されている。天然定常ドメインに関して、追加の変異が、定常ドメインのアミノ酸配列に導入されていてもよい。定常領域は、例えば２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により、二量体化を可能にする残基(天然に存在するもの又は導入されたもの)を含んでいてもよい。
本発明者らは、予想外にも、pMHC結合性部分と、免疫エフェクタードメインと、免疫グロブリンFcドメイン又はアルブミン-結合性部分とを含んでなる複数ドメイン結合性分子が機能的なままであることを見出した。このことは、TCR-pMHC相互作用が固定された結合性幾何配置に依拠する旨及びTCRトリガリングが膜間距離の増加に感受性である旨の当該分野における知識を考慮すれば、特に驚くべきことである。(Garbocziら，Nature. 1996 Nov 14;384(6605):134-41；Choudhuriら，2005 Nature Jul 28;436(7050):578-82；Rudolphら，Annu Rev Immunol. 2006;24:419-66)。事実、速度論的分離モデルは、TCRトリガリングが、(チロシンホスファターゼ(例えばCD45)のサイズ依存性排除に起因してチロシンリン酸化が好ましい)密接接触領域内にTCR-CD3複合体が繋ぎ止められている結果であるとを提案している(Choudhuriら，2005 Nature Jul 28;436(7050):578-82；Davisら，Nat Immunol. 2006 Aug;7(8):803-9)。したがって、TCR-pMHC複合体の小さな寸法(約100Å)及び固定された結合性幾何配置が、免疫シナプス形成及びTCRトリガリングに重要であると理解される。この知識に基づけば、当業者は、本発明の抗原結合性ポリペプチドが、貧弱な免疫シナプス形成、TCR-pMHC結合性幾何配置の摂動、究極的には無効なTCRトリガリングをもたらすと予想されると理解する。
PMHC結合性部分はTCR様抗体であり得る。好ましくは、pMHC結合性部分は、TCR様抗体の可変ドメインを含んでなる。抗体は、天然には、pMHCを認識しない；しかし、pMHCに関して特異性を有する抗体を工学的に操作可能であることは公知である。このような抗体をTCR様又はTCR模擬抗体と呼ぶ(Changら，Expert Opin Biol Ther. 2016 Aug;16(8):979-87及びDahanら，Expert Rev Mol Med. 2012 Feb 24;14:e6)。
TCRはヘテロ二量体α/β又はγ/δ TCRポリペプチド対であり得る。或いは、TCRは単鎖α/β又はγ/δ TCRポリペプチドであり得る。TCR可変ドメインのアミノ酸配列は、天然に見出されるものに相当してもよいし、天然TCRに関して１又は２以上の変異を含有してもよい。このような変異は、所与の抗原に関するTCRの親和性を増大させるようなものであってもよい。追加的に又は代替的に、安定性及び製造可能性を向上させる変異が組み込まれていてもよい。
TCRは、ペプチド抗原と複合体化したMHCに結合し得る。好ましくは、ペプチド抗原は任意の疾患関連抗原である。好ましくは、ペプチド抗原は任意の腫瘍関連抗原である。ペプチド抗原は、WO2011001152、WO2017109496、WO2017175006及びWO2018234319に記載されるようなGP100、NYESO、MAGEA4又はPRAMEに由来するペプチドであり得る。
TCRは、WO2011001152、WO2017109496、WO2017175006及びWO2018234319に記載されるようなアミノ酸配列を有していてもよい。
Ｔ細胞結合性免疫エフェクタードメインは、CD3エフェクタードメインであり得る。Ｔ細胞結合性免疫エフェクターは、CD3及び/又はTCR/CD3複合体との相互作用によりＴ細胞を活性化する抗体scFv(又は類似サイズの抗体様足場)であり得る。CD3エフェクターには抗CD3抗体又は抗体フラグメント、特に、抗CD3 scFv又は抗体様足場が含まれるがこれらに限定されない。更に、免疫エフェクターとしては、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)；スーパー抗原及びその変異体；ケモカイン(例えばIL-8、血小板因子４、メラノーマ増殖刺激タンパク質；免疫細胞(例えばＴ細胞又はNK細胞)上の抗原(例えば抗CD28若しくは抗CD16又は免疫シナプスに位置する任意の分子)及び補体アクチベータに結合する抗体(そのフラグメント、誘導体及びバリアントを含む)が挙げられるが、これらに限定されない。
半減期延長ドメインは、PMHC結合性部分のＣ若しくはＮ末端又はＴ細胞結合性免疫エフェクターのＣ若しくはＮ末端に連結されていてもよい。
半減期延長ドメインは免疫グロブリンFcを含んでなってもよい。免疫グロブリンFcドメインは任意の抗体Fc領域であり得る。Fc領域は、細胞表面Fcレセプター及び補体系の幾つかのタンパク質と相互作用する抗体テイル領域である。Fc領域は、代表的には、共に２つ又は３つの重鎖定常ドメイン(CH2、CH3及びCH4と呼ぶ)及びヒンジ領域を有する２つのポリペプチド鎖を含んでなる。２つの鎖はヒンジ領域内でのジスルフィド結合により連結されている。免疫グロブリンサブクラスIgG1、IgG2及びIgG4のFcドメインは、FcRnに結合して、FcRnを介したリサイクリングを受け、長い循環半減期(３～４週間)を提供する。IgGとFcRnとの相互作用は、CH2及びCH3ドメインの部分をカバーするFc領域に局在化されている。本発明における使用に好適な免疫グロブリンFcドメインは、IgG1又はIgG4ののFcドメインを含むがこれらに限定されない。好ましくは、Fcドメインはヒト配列に由来する。Fc領域はまた、好ましくは、二量体化を容易にするKiH変異並びに活性化するレセプターとの相互作用を防止する変異を有していてもよい(すなわち、機能的にサイレントな分子であってもよい)。免疫グロブリンFcドメインは、その他のドメイン(すなわちTCR又は免疫エフェクター)のＣ又はＮ末端に融合されていてもよい。免疫グロブリンFcは、その他のドメイン(すなわちTCR又は免疫エフェクター)にリンカーを介して融合されていてもよいし、或いはリンカーが用いられていなくてもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長であり得る。本発明の複数ドメイン結合性分子に用い得る適切なリンカーの例として、GGGSGGGG、GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、GSGGGP、GGEPS、GGEGGGP及びGGEGGGSEGGGS(WO2010/133828に記載のもの)が挙げられるが、これらに限定されない。免疫グロブリンFcは、TCRに融合される場合、α若しくはβ鎖のいずれか、又はα及びβ鎖の両方に、リンカー有り又は無しで融合され得る。更に、Fcの個々の鎖がTCRの個々の鎖に融合され得る。
好ましくは、Fc領域はIgG1又はIgG4サブクラスに由来し得る。２つの鎖は、CH2及びCH3定常ドメインとヒンジ領域の全て又は一部とを含んでなってもよい。ヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のヒンジ領域に実質的に又は部分的に相当してもよい。ヒンジは、コアヒンジドメインの全て又は一部及び低位ヒンジ領域の全て又は一部を含んでなってもよい。好ましくは、ヒンジ領域は、２つの鎖を連結する少なくとも１つのジスルフィド結合を含有する。
Fc領域は、WT Fc配列に関して変異を含んでいてもよい。変異には、置換、挿入及び欠失が含まれる。このような変異は、望ましい治療特性の導入を目的としてなされたものであってもよい。例えば、ヘテロ二量体化を容易にするために、オブ・インツー・ホール(KiH)変異がCH3ドメイン中に工学的操作により導入されていてもよい。この場合、一方の鎖が嵩高い突出残基(すなわちノブ)、例えばYを含有するように操作され、他方の鎖が相補ポケット(すなわちホール)を含有するように操作されている。KiH変異の適切な位置は当該分野において公知である。追加的に又は代替的に、Fcyレセプターへの結合を消失させるか若しくは低減させる及び/又はFcRnへの結合を増大させる変異、及び/又はFabアーム交換を防止するか又はプロテアーゼ部位を除去する変異が導入されていてもよい。追加的に又は代替的に、製造上の理由のために、例えば翻訳語修飾(例えばグコシル化)に供され得るアミノ酸を除去又は置換する変異がなされていてもよい。
例としては下記のものが挙げられる：
IgG4(下線を付した残基は、野生型配列に対する変異を示す)
「ノブ」
YGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
「ホール」
YGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG(下線を付した残基は、野生型配列に対する変異を示す)
「ノブ」
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
「ホール」
VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
半減期延長ドメインはアルブミン-結合性ドメインを含んでなり得る。当該分野において公知であるように、アルブミンは、(腎閾値を超える)そのサイズに一部起因し、その特異的相互作用及びFcRnを介するリサイクリングにより、19日の長い循環半減期を有する。アルブミンへの付着は、インビボで治療用分子の循環半減期を向上させる周知のストラテジである。アルブミンは、特異的アルブミン結合性ドメインの使用により非共有結合的に、又は接合若しくは直接遺伝子融合により共有結合的に付着されてもよい。半減期を向上させるために、アルブミンへの付着が利用されている治療用分子の例は、Sleepら，Biochim Biophys Acta. 2013 Dec;1830(12):5526-34に見出される。
アルブミン-結合性ドメインは、アルブミンに結合することができる任意の部分(任意の既知のアルブミン-結合性部分を含む)であり得る。アルブミン結合性ドメインは、アルブミンに特異的に結合する内因性又は外因性リガンド、小さな有機分子、脂肪酸、ペプチド及びタンパク質から選択され得る。好適なアルブミン結合性ドメインの例としては、短いペプチド、例えばDennisら，J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43に記載のもの(例えばペプチドQRLMEDICLPRWGCLWEDDF)；アルブミンに結合するよう操作されたタンパク質、例えば抗体、抗体フラグメント及び抗体様足場、例えばGSKが市場に提供するAlbudab(登録商標)(O'Connor-Semmesら，Clin Pharmacol Ther. 2014 Dec;96(6):704-12)及びAblynxが市場に提供するナノボディ(登録商標)(Van Royら，Arthritis Res Ther. 2015 May 20;17:135)；及び天然に見出されるアルブミン結合性ドメインをベースにするタンパク質、例えばStreptococcalタンパク質であるＧタンパク質(Storkら，Eng Des Sel. 2007 Nov;20(11):569-76)、例えばAffibodyが市場に提供するAlbumod(登録商標)が挙げられる。
好ましくは、アルブミンはヒト血清アルブミン(HSA)である。アルブミン結合性ドメインのヒトアルブミンに関する親和性は、ピコモル～マイクロモルの範囲内であり得る。ヒト血清におけるアルブミンの極端に高い濃度(35～50mg/ml、約0.6mM)を考慮すれば、アルブミン結合性ドメインの実質的に全てがインビボでアルブミンに結合すると計算される。
アルブミン-結合性部分は、その他のドメイン(すなわちTCR又は免疫エフェクター)のＣ又はＮ末端に連結され得る。アルブミン-結合性部分は、その他のドメイン(すなわちTCR又は免疫エフェクター)にリンカーを介して連結されていてもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸長であり得る。本発明の複数ドメイン結合性分子に用い得る適切なリンカーの例として、GGGSGGGG、GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、GSGGGP、GGEPS、GGEGGGP及びGGEGGGSEGGGS(WO2010/133828に記載のもの)が挙げられるが、これらに限定されない。アルブミン-結合性部分は、TCRに融合される場合、α若しくはβ鎖のいずれか、又はα及びβ鎖の両方に、リンカー有り又は無しで融合され得る。
第１の観点に従う複数ドメイン結合性分子は、医薬として用いられ得る。
１つの更なる観点において、第１の観点に従う複数ドメイン結合性分子を含んでなる医薬組成物が提供される。
別の１つの更なる観点において、第１の観点に従う複数ドメイン結合性分子をコードする核酸が提供される。この観点の核酸を含んでなる発現ベクターが提供される。加えて、この観点の核酸又はベクターを含んでなり、複数ドメイン結合性分子をコードする核酸が単一オープンリーディングフレーム又はα鎖及びβ鎖をそれぞれコードする２つの別個のオープンリーディングフレームとして存在する宿主細胞が提供される。
また、１つの更なる観点において、上記の宿主細胞を核酸の発現に最適な条件下で維持すること及び複数ドメイン抗原結合性ポリペプチドを単離することを含んでなる、第１の観点に従う複数ドメイン結合性分子を生産する方法が提供される。
１つの尚更なる観点において、第１の観点に従う複数ドメイン結合性分子を必要とする患者に投与することを含んでなる治療方法が提供される。
本明細書に開示される任意の分子の表現型上サイレントなバリアントも本発明の範囲内である。本明細書で用いる場合、用語「表現型上サイレントなバリアント」は、上記のものに加えて、１又は２以上の更なるアミノ酸変化(置換、挿入及び欠失を含む)が組み込まれたバリアントであって、当該変化を有しない対応する分子に類似する表現型を有するバリアントをいうものと理解される。本出願に関しては、表現型は結合親和性(KD及び/又は結合半減期)及び特異性を含む。好ましくは、可溶性複数ドメイン結合性分子の表現型は、結合親和性及び特異性に加えて、免疫活性化効力及び精製収量を含む。
表現型上サイレントなバリアントは、あ１又は２以上の保存的置換及び/又は１又は２以上の寛容される置換を含有し得る。寛容される置換は、下記の保存的置換の定義には入らないにもかかわらず、表現上サイレントである置換を意味する。当業者は、種々のアミノ酸が類似する特性を有し、よって「保存的」であることを知っている。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの１又は２以上のこのようなアミノ酸は、多くの場合で、当該タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの所望の活性を焼失することなく、１又は２以上の他のこのようなアミノ酸により置換することができる。
よって、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン(脂肪族側鎖を有するアミノ酸)は、多くの場合で、互いに置換することができる。これらの可能な置換のうち、グリシン及びアラニンを互いに置換し(これらは比較的短い側鎖を有するため)及びバリン、ロイシン及びイソロイシンを互いに置換すること(疎水性である、より大きい脂肪族側鎖を有するため)が好適である。多くの場合で互いに置換することができるその他のアミノ酸としては：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン(芳香族側鎖を有するアミノ酸)；リジン、アルギニン及びヒスチジン(塩基性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギン酸及びグルタミン酸(酸性側鎖を有するアミノ酸)；アスパラギン及びグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸)；及び、システイン及びメチオニン(硫黄含有側鎖を有するアミノ酸)が挙げられる。本発明の範囲内のアミノ酸置換は、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸を用いて行うことができることを理解すべきである。例えば、本明細書においては、アラニンのメチル基がエチル基で置換され得ること及び/又はペプチド骨格に小さな変化がなされてもよいことが企図されている。天然の又は合成のアミノ酸が用いられているかどうかにかかわらず、L-アミノ酸のみが存在することが好適である。
このような性質の置換は、「保存的」又は「半保存的」アミノ酸置換と呼ばれることがある。したがって、本発明は、上記のアミノ酸配列のいずれかを含んでなるが、該配列中に１若しくは２以上の保存的置換及び/又は１若しくは２以上の寛容される置換を有し、その結果、TCRのアミノ酸配列が本明細書に開示されるTCR配列に対して少なくとも90％の同一性、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有する分子の使用にまで拡張される。
「同一性」は、当該分野において公知のように、配列比較により決定される、２若しくは３以上のポリペプチド配列間又は２若しくは３以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、同一性はまた、妥当な場合、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間の、配列の並びの一致性によって決定される配列関連性の程度を意味する。２つのポリペプチド配列間又は２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する方法は幾つか存在するが、同一性の決定に一般に用いられる方法は、コンピュータプログラム化されている。２つの配列間の同一性を決定する好適なコンピュータプログラムとしては、GCGプログラムパッケージ(Devereuxら，Nucleic acid Research, 12, 387(1984)、BLASTP、BLASTN及びFASTA(Atschulら，J. Molec. Biol. 215, 403(1990))が挙げられるが、これに限定されない。
CLUSTALプログラムのようなプログラムを用いてアミノ酸配列を比較することができる。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、必要な場合にはいずれかの配列にスペースを挿入して最適な整列を見出す。最適な整列についてアミノ酸の同一性又は類似性(同一性＋アミノ酸タイプの保存)を算出することができる。BLASTxのようなプログラムは、類似する配列を最も長く整列させ、その適合度に対して値を割り当てる。よって、各々が異なるスコアを有する幾つかの類似領域を見出す比較を得ることができる。両タイプの同一性分析が本発明において企図されている。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性は、最適比較を目的として配列を整列させ(例えば、最良整列のために第１の配列にギャップを導入することができる)、対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することにより決定する。「最良整列」は、最も高いパーセント同一性をもたらす２つの配列の整列である。パーセント同一性は、比較する配列中の同一アミノ酸残基又はヌクレオチドの数により決定する(すなわち、％同一性 = 同一位置の数/位置の総数×100)。
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に公知の数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較する数学アルゴリズムの例は、Karlin及びAltschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されるように改変されたKarlin及びAltschul(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。Altschulら(1990)，J. Mol. Biol. 215:403-410のBLASTn及びBLASTpプログラムには、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性の決定は、BLASTnプログラムを用いて行うことができる。２つのタンパク質配列間のパーセント同一性の決定は、BLASTpプログラムを用いて行うことができる。比較目的でギャップを有する整列を得るためには、Altschulら(1997)，Nucleic acid Res. 25:3389-3402に記載されるようにGapped BLASTを利用することができる。或いは、PSI-Blastを用いて、分子間の遠い関連性を検出する累次サーチを行うことができる(前出)。BLAST、Gapped BLAST及びPSI-Blastプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム(例えば、BLASTn及びBLASTp)のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。デフォルトの一般的パラメータは、例えば、Word Size = 3、Expect Threshold = 10を含み得る。パラメータは、短い入力配列について自動的に調整するように選択し得る。配列比較に用いる数学アルゴリズム別の例は、Myers及びMiller，CABIOS(1989)のアルゴリズムである。CGC配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)には、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。当該分野において公知の他の配列分析アルゴリズムとしては、Torellis及びRobotti(1994)，Comput. Appl. Biosci., 10:3-5に記載されるADVANCE及びADAM；並びにPearson及びLipman(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8に記載されるFASTAが挙げられる。FASTAにおいて、ktupは、サーチの感度及び速度を設定するコントロールオプションである。本開示においてパーセント同一性を評価する目的には、デフォルトパラメータを用いるBLASTpを比較法として使用する。加えて、記載したパーセント同一性がアミノ酸について非整数値である場合、得られた値は小数点以下を切り捨てて整数とする(すなわち、25アミノ酸の配列が90％配列同一性を有すると「22.5」となるが、「22」とする)。したがって、提供する実施例では、25アミノ酸のうち22がマッチする配列は、90％以内の配列同一性である。
当業者に自明であるように、Ｃ末端及び/又はＮ末端に提供される配列は、分子の機能的特性(例えばTCR部)に実質的に影響を及ぼすことなく、１、２、３、４、５又は６以上の残基を短縮化又は延長することができる。Ｃ末端及び/又はＮ末端に提供される配列は、１、２、３、４又は５残基が短縮化又は延長され得る。このような全てのバリアントは本発明に包含される。
任意の適切な方法を用いることを条件に、変異(保存的及び寛容される置換、挿入及び欠失を含む)を配列に導入してもよい。このような方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにする方法、制限酵素ベースのクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順が挙げられるが、これらに限定されない。これら方法は、多くの標準的な分子生物学の教科書に詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び制限酵素ベースのクローニングに関する更なる詳細については、Sambrook及びRussell(2001)，Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第３版) CSHL Pressを参照。ライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についての更なる情報は、Rashtchian(1995)，Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6に見出すことができる。本発明により提供されるTCR配列は、固相合成又は当該分野において公知の任意の他の適切な方法から得てもよい。
本発明の分子は、治療用薬剤としての使用に関して理想的な安全性プロフィールを有し得る。理想的な安全性プロフィールは、本発明の分子が、良好な特異性を証明されていることに加えて、更なる前臨床安全性試験に合格していることを意味する。このような試験の例としては、全血存在下でのサイトカイン遊離が少ないこと(よって、インビボで可能性のあるサイトカイン遊離症候群を引き起こすリスクが低いこと)を確証する全血アッセイ、及び代替のHLAタイプを認識する可能性が低いことを確証するアロ反応性試験が挙げられる。
本発明の分子は高収率精製が可能であり得る。収率は、精製プロセスの間に保持される材料の量に基づいて決定し得(すなわち、リフォールディング前に得られた可溶化した物質の量に対する、精製プロセスの終時に得られる正確にフォールディングした物質の量)、及び/又は収率は、元の培養体積に対する、精製プロセスの終時に得られる正確にフォールディングした物質の量に基づいて決定し得る。高収率は、１％以上、より好ましくは５％以上、又はより高い収率を意味する。高収率は、１mg/ml以上、より好ましくは３mg/ml以上、５mg/ml以上、又はより高い収率を意味する。
結合親和性(平衡定数KDに反比例する)及び結合半減期(T1/2と表される)を決定する方法は当業者に公知である。好適な実施形態において、結合親和性及び結合半減期は、(例えばそれぞれBIAcore装置又はOctet装置を使用する)表面プラズモン共鳴(SPR)又はBio-Layer Interferometry(BLI)を用いて測定する。親和性が２倍になればKDは1/2になることが理解される。T1/2はln2/解離速度(koff)として算出する。よって、T1/2が２倍になればkoffは1/2になる。TCRのKD値及びkoff値は、通常、可溶形態のTCR、すなわち細胞質及び膜貫通ドメイン残基を除去するように短縮された形態のTCRについて測定する。個々の測定値間の変動、特に20時間を超える解離時間を有する相互作用についての変動を説明するため、所与のTCRの結合親和性及び/又は結合半減期は、数時間、３時間以上、同じアッセイプロトコルを用いて測定して、結果の平均をとる。２つのサンプル(すなわち、２つの異なるTCR及び/又は同じTCRの２つの調製物)間の結合データを比較するため、測定値は同じアッセイ条件(例えば温度)を用いて測定することが好ましい。TCRに関して記載される測定方法は、本明細書において記載する複数ドメイン抗原結合性ポリペプチドにも適用され得る。
本発明の特定の好適な複数ドメイン結合性分子は、抗原陽性細胞、具体的には、ガン細胞に典型的な抗原を低レベルで提示する細胞に対して(すなわち、５～100、例えば50抗原/細胞(Bossiら(2013) Oncoimmunol. 1;2(11):e26840；Purbhooら(2006)，J Immunol 176(12):7308-7316))、インビトロで高度に強力なＴ細胞応答を生じることができる。このようなTCRは、本明細書に記載される複数ドメイン抗原結合性ポリペプチドへの組込みに適切であり得る。測定されるＴ細胞応答は、Ｔ細胞活性化マーカー(例えば、インターフェロンγ又はグランザイムＢ)の放出若しくは標的細胞殺傷又は他のＴ細胞活性化の尺度(例えばＴ細胞増殖)であってもよい。好ましくは、高度に強力な応答は、nM～pM範囲、好ましくは500nM以下、最も好ましくは１nM以下又は500pM以下のEC50値を有するものである。
本発明の分子のTCR部分はαβヘテロ二量体であり得る。本発明の分子のα-βヘテロ二量体TCR部分は、通常、α鎖TRAC定常ドメイン配列及び/又はβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を含んでなる。定常ドメインは可溶性形式(すなわち、膜貫通ドメインも細胞質ドメインも有しない形式)であり得る。一方又は両方の定常ドメインは、天然型TRAC及び/又はTRBC1/2配列に関して変異、置換又は欠失を含有し得る。用語TRAC及びTRBC1/2はまた、天然の多形バリアント、例えばTRACの４位でのＮ→Ｋを包含する(Bragadoら，International immunology. 1994 Feb;6(2):223-30)。
α及びβ鎖定常ドメイン配列は、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失させるように短縮化又は置換により改変されていてもよい。α及び/又はβ鎖定常ドメイン配列は、例えばWO 03/020763及びWO06000830に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基同士間に導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。α及びβ定常ドメインは、TRACのThr 48の位置及びTRBC1又はTRBC2のSer 57の位置でのシステイン残基の置換により改変され、該システインがTCRのα定常ドメインとβ定常ドメインとの間のジスルフィド結合を形成していてもよい。TRBC1又はTRBC2は、追加的に、定常ドメインの75位でのシステイン→アラニン変異及び定常ドメイン89位でのアスパラギン→アスパラギン酸変異を含んでいてもよい。αβヘテロ二量体に存在する細胞外定常ドメインの一方又は両方は、一方又は両方のＣ末端で、例えば15まで又は10まで又は８まで又は７以下のアミノ酸が欠失されていてもよい(短縮化)。α鎖細胞外定常ドメインのＣ末端は、８アミノ酸が欠失されていてもよい(短縮化)。
本発明の分子のTCR部分は単鎖形式であってもよい。単鎖形式としては、Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ又はVα-Cα-L-Vβ-Cβタイプ(ここで、Vα及びVβはそれぞれTCR α及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCR α及びβ定常領域であり、Lはリンカー配列である)のαβTCRポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない(Weidanzら(1998) J Immunol Methods. Dec 1;221(1-2):59-76；Epelら(2002)，Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565-73；WO 2004/033685；WO9918129)。単鎖TCRは、WO 2004/033685に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有してもよい。単鎖TCRは、WO2004/033685；WO98/39482；WO01/62908；Weidanzら(1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76；Hooら(1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763；Schodin(1996) Mol Immunol 33(9): 819-829)に更に記載されている。
本発明の分子と組み合わせ得る治療用薬剤としては、免疫調整剤及びエフェクター、放射性化合物、酵素(例えば、パーフォリン)又は化学療法剤(例えば、シスプラチン)が挙げられる。毒性効果が確実に所望の位置で発揮されるために、毒物は、緩徐に放出されるように本明細書に記載する複数ドメイン抗原結合性ポリペプチドに連結されたリポソームの内部に存在し得る。このことにより、人体における輸送の間の損傷効果が防止され、該当する抗原提示細胞への複数ドメイン抗原結合性ポリペプチドの結合後に、毒物が最大効果を有することが保証される。
他の適切な治療用薬剤として、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：
・小分子細胞傷害性物質、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有する分子量700ダルトン未満の化合物。このような化合物はまた、細胞傷害性効果を有することができる毒性金属を含有し得る。更に、これら小分子細胞傷害性物質にはまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊又は変換して細胞傷害性物質を放出する化合物が含まれると理解される。このような物質の例として、シスプラチン、メイタンシン(maytansine)誘導体、ラケルマイシン(rachelmycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII(sorfimer sodiumphotofrin II)、テモゾロマイド(temozolmide)、トポテカン、トリメトレキサート(trimetreate)、ラルブーレート(larbourlate)、オーリスタチンＥ(auristatin E)、ビンクリスチン及びドキソルビシンが挙げられる；
・ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質又はそのフラグメント。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、DNAアーゼ及びRNAアーゼ；
・放射性核種、すなわち、１又は２以上のα粒子若しくはβ粒子又はγ線の同時放射を伴って崩壊する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素131、レニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210及び213、アクチニウム225及びアスタチン213；高親和性TCR又はその多量体へのこれら放射性核種の結合を容易にするために、キレート化剤が使用されてもよい；
・免疫刺激物質、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)、
・スーパー抗原及びその変異体；
・TCR-HLA融合体、例えば、ペプチドが一般的なヒト病原体、例えばエプスタインバーウイルス(EBV)に由来するペプチド-HLA複合体との融合体；
・ケモカイン、例えばIL-8、血小板第４因子、メラノーマ増殖刺激タンパク質など；
・抗体又はそのフラグメント。抗Ｔ細胞又はNK細胞決定基抗体(例えば、抗CD3、抗CD28又は抗CD16)が挙げられる；
・免疫シナプスに局在する分子に結合する抗体又はそのフラグメント
・抗体様結合特性を有するオルターナティブタンパク質足場
・補体活性化物質；
・異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性ペプチド。
特に好適な免疫エフェクターは、抗CD3抗体、又は抗CD3抗体の機能的フラグメント若しくはバリアントである。本明細書で用いる場合、用語「抗体」は前記のようなフラグメント及びバリアントを包含する。抗CD3抗体の例としては、OKT3、UCHT-1、BMA-031及び12F6が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の組成物及び方法における使用に適切な抗体フラグメント及びバリアント/アナログとしては、数例挙げるとすれば、ミニボディ、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、dsFv及びscFvフラグメント、ナノボディTM(Ablynx(ベルギー)から市販され、ラクダ科動物(例えば、ラクダ又はラマ)抗体に由来する合成の単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む構築物)及びドメイン抗体(Domantis(ベルギー)；これは、親和性成熟単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメイン又は免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含む)又は抗体様結合特性を示す代替のタンパク質足場、例えばアフィボディ(Affibody(スウェーデン)；工学的に操作されたプロテインＡ足場を含む)若しくはアンチカリン(Anticalins)(Pieris(ドイツ))；工学的に操作されたアンチカリンを含む)が挙げられる。免疫エフェクターは、複数ドメイン抗原結合性ポリペプチドのTCR部分に連結される。ここで、好ましくは、免疫エフェクターは抗CD3抗体である。
複数ドメイン結合性分子の個々の成分の連結は、共有結合的又は非共有結合的付着を介するものであり得る。共有結合的付着は、直接的であってもよいし、リンカー配列を介する間接的であってもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を限定する虞れがある嵩高い側鎖を有しないアミノ酸、例えばグリシン、アラニン及びセリンから主に作られている点で、可撓性である。或いは、より大きい剛性を有するリンカーが望ましくあり得る。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。多くの場合、リンカー配列は、約12アミノ酸長以下、例えば10アミノ酸長以下又は２～10アミノ酸長である。本発明の分子に使用され得る適切なリンカーの例としては、GGGSGGGG、GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、GSGGGP、GGEPS、GGEGGGP及びGGEGGGSEGGGS(WO2010/133828に記載のもの)が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの更なる観点において、本発明は、本発明の複数ドメイン結合性分子をコードする核酸を提供する。幾つかの実施形態において、核酸はcDNAである。幾つかの実施形態におて、核酸はmRNAであり得る。核酸は、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は操作された核酸であり得る。核酸配列は、利用する発現系に従って最適化されたコドンであり得る。当業者に公知のように、発現系は、細菌細胞、例えばE. coli、若しくは酵母細胞、若しくは哺乳動物細胞、若しくは昆虫細胞を含んでいてもよく、又は無細胞発現系であり得る。
本発明はまた、少なくとも１つの上記核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態である構築物を提供する。本発明はまた、１又は２以上の上記構築物を含んでなる組換え宿主細胞を提供する。上記の通り、本発明の特異的結合性分子をコードする核酸は本発明の１つの観点を構成し、特異的結合性分子をコードする核酸からの発現を含んでなる特異的結合性分子の製造方法も同様である。発現は、簡便には、適切な条件下で、核酸を含有する組換え宿主細胞を培養することにより達成し得る。発現による製造後、特異的結合性分子は、任意の適切な技法を用いて単離及び/又は精製されてもよく、その後、必要に応じて使用される。
種々の宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のための系は周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当該分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター肝臓細胞、NSOマウスメラノーマ細胞などが挙げられる。一般的な好適な細菌宿主はE. coliである。原核細胞(例えばE. coli)における抗体及び抗体フラグメントの発現は、当該分野において十分に確立されている。概要については、例えばPluckthun，Bio/Technology 9:545-551 (1991)を参照。培養中の真核細胞における発現もまた、特異的結合性分子の製造のための１つの選択肢として、当業者に利用可能である。最近のレビューとして、例えばReff，Curr. Opinion Biotech. 4:573-576(1993)；Trillら，Curr. Opinion Biotech. 6:553-560(1995)を参照。
必要に応じて適切な調節配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及びその他の配列を含有する適切なベクターを選択し又は構築することができる。ベクターは、適切な場合には、プラスミド、ウイルス、例えばファージ又はファージミドであり得る。更なる詳細については、例えばSambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照。例えば核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのDNAの導入及び遺伝子発現並びにタンパク質の分析における、核酸の操作について多くの公知の技法及びプロトコルは、Ausubelら編，Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Edition, John Wiley & Sons(1992)に詳細に記載されている。
よって、本発明の１つの更なる観点は、本明細書に開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。１つの尚更なる観点は、宿主細胞に該核酸を導入することを含んでなる方法を提供する。導入には任意の利用可能な技法を用い得る。真核細胞については、適切な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム-媒介トランスフェクション及びレトロウイルス又は他のウイルス(例えばワクシニア又は昆虫細胞についてはバキュロウイルス)を用いる形質導入が挙げられ得る。細菌細胞については、適切な技法としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを用いるトランスフェクションが挙げられ得る。導入に続いて、例えば宿主細胞を遺伝子発現条件下に培養することにより、核酸からの発現を引き起こすか又は可能にし得る。
本発明の核酸は、宿主細胞ゲノム(例えば染色体中に組み込まれ得る。組込みは、標準的技法に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含ませることにより、促進されてもよい。
当該分野において周知であるように、分子は翻訳後修飾に付されていてもよい。グリコシル化はそのような修飾の１つであり、TCR鎖中の規定のアミノ酸へのオリゴ糖部分の共有結合的付着を含む。例えば、アスパラギン残基又はセリン/スレオニン残基は、周知のオリゴ糖付着位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状況は、タンパク質配列、タンパク質コンホメーション及び特定の酵素の利用可能性を含む幾つかの因子に依存する。更に、グリコシル化状況(すなわち、オリゴ糖タイプ、共有結合及び付着の総数)は、タンパク質の機能に影響することがある。したがって、組換えタンパク質を製造するときには、グリコシル化の制御が望ましい場合が多い。制御されたグリコシル化は、抗体ベースの治療薬を改善するために用いられる(Jefferisら(2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34.)。本発明の分子のTCR部分について、グリコシル化は、例えば特定の細胞株(哺乳動物細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はヒト胚性肝臓(HEK)細胞を含むがこれらに限定されない)を用いることにより、又は化学的修飾により制御されてもよい。このような修飾は、グリコシル化が薬物動態を改善し、免疫原性を低減させ及び天然型ヒトタンパク質をより厳密に模擬することができるので、望ましくあり得る(Sinclair and Elliott(2005) Pharm Sci.Aug；94(8):1626-35)。
患者への投与のために、本発明の分子(好ましくは、検出可能な標識若しくは治療用薬剤と組み合わせれているもの)又は本発明の核酸、発現ベクター若しくは細胞は、１又は２以上の薬学的に許容され得るキャリア又は賦形剤と共に、滅菌医薬組成物の部分として提供されてもよい。この医薬組成物は、(患者への望ましい投与方法に依存して)任意の適切な形態であり得る。医薬組成物は、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封容器内で提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、(必須ではないが)通常、使用指示書を含む。キットは複数の単位剤形を含み得る。
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば非経口経路(皮下、筋内、髄腔内又は静脈内経路を含む)、経腸(経口又は直腸経路を含む)、吸入又は鼻内経路による投与に適合していてもよい。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により、例えば活性成分をキャリア又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより、製造されてもよい。
本発明の分子の投薬量は、治療すべき疾患又は異常、治療すべき個体の年齢及び状態などに依存して広範に変化し得る。本発明の分子に適切な用量範囲は、25ng/kg～50μg/kg又は１μg～１ｇであり得る。医師が、使用すべき適切な投薬量を最終的には決定する。
本発明の複数ドメイン抗原結合性ポリペプチド、医薬組成物、ベクター、核酸及び細胞は、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％純粋で提供されてもよい。
本発明はまた、次のものを提供する：
・医薬における使用のため、好ましくはガン又は腫瘍の治療法における使用のための、本発明の複数ドメイン抗原結合性ポリペプチド、核酸、医薬組成物又は細胞；
・ガン又は腫瘍の治療用医薬の製造における、本発明の複数ドメイン抗原結合性ポリペプチド、核酸、医薬組成物又は細胞の使用；
・本発明の複数ドメイン抗原結合性ポリペプチド、核酸、医薬組成物又は細胞を患者に投与することを含んでなる、患者におけるガン又は腫瘍の治療法；
・本発明の複数ドメイン抗原結合性ポリペプチド、核酸、医薬組成物又は細胞を含む、ヒト対象に投与するための注射可能製剤。
治療方法は、追加の抗新生物薬を別途に、組合せで又は逐次に投与することを更に含んでいてもよい。このような薬剤の例は、当該分野において公知であり、免疫活性化剤及び/又はＴ細胞調整剤を含み得る。
本発明の各々の観点の好適な特徴は、他の観点の各々についても同様である(ただし、必要な変更は加える)。本明細書において言及した先行技術文献は、法が許容する最大範囲まで組み込まれる。
図面の説明
図１A)TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質の設計；B)本発明のTCR-抗CD3-Fc融合タンパク質の例示配列
図２は、Fcドメインを組み込まれたTCR-抗CD3融合体が抗原陽性標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を媒介することができることを示す。３つのIgG1-Fc融合体のデータを示す。
図３A)はアルブミン結合性ペプチドを組み込まれたTCR-抗CD3融合体が抗原陽性標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を媒介することができることを示す。アルブミン結合性ペプチドがC-α(F1)、N-α(F2)又はC-β(F3)のいずれかに付着する３つの形式が示されている。B)は、アルブミン結合性ナノボディを組み込まれているTCR-抗CD3融合体が抗原陽性標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を媒介できることを示している。アルブミン結合性ペプチドがC-α(R)又はC-β(Y)のいずれかに付着する２つの形式が示されている。C)は、アルブミン結合性ドメイン抗体(AlbudabTM)を組み込まれているTCR-抗CD3融合体が抗原陽性標的細胞の存在下でＴ細胞活性化を媒介することができることを示している。AlbudabTMがTCR-抗CD3融合体のC-αに付着する１つの形式が示されている。
図４A)は、マウス血清中でのTCR-抗CD3-AlbudabTM融合体のPK特性を示す。B)は、マウスにおける評価に基づく、TCR-抗CD3-AlbudabTM融合体のヒトにおける理論的PKを示す。
実施例
以下の実施例は、本発明の複数ドメイン結合性分子を説明する。当該分子は、TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質又はTCR-抗CD3-アルブミン結合性融合タンパク質と呼ぶこともある。

実施例１(Fc融合体)
ａ)TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質の設計
本実施例において、PRAMEのHLA-A*02制限ペプチドに結合する高親和性TCRを含んでなるTCR-抗CD3融合タンパク質を用いた。このような分子の例はWO2018234319に提供される。

ヒトIgG1 Fcドメインを、リンカーを介して、TCR-抗CD3のＣ末端に融合した(概略については図1Aを参照)。当該分野において公知であるヒトIgG1 Fcの機能的バリアントを含んでなる更なる２つの構築物を作製した。バリアント１は、Fcγレセプター(FcγRs)にも補体タンパク質C1qにも結合せず、したがって機能上サイレントである。バリアント２はFcRnに対して増大した結合性(延長したインビボ半減期をもたらし得る)を示す。各場合で、Fcドメインは、ヘテロ二量体化を容易にするための既知のノブ・イン・ホール変異Y86T及びT22Yを含んでなる。

図1Bは、機能上サイレントなヒトIgG1 Fcを含んでなるTCR-抗CD3-Fc融合体(バリアント１)の配列を示す。
ｂ)TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質の発現及び精製
浮遊培養適応チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(ExpiCHO Expression system, Thermo Fisher)に基づく一過性発現系を用いて、Fc融合体の発現を行った。細胞は、種々のIg Fcドメインに融合した該当するTCR鎖を含有する哺乳動物発現プラスミドを用いて、製造業者の指示に従ってトランスフェクトした。収集後、細胞培養上清を、保冷遠心分離機において4000～5000×ｇにて30分間遠心分離することにより明澄化した。上清を0.22μmフィルターに通してろ過し、更なる精製のために集めた。
精製のため、Fc融合体を、先ず緩衝剤で調整後、mAbselect Sureプレパックカラム(GE Healthcare又は同等な樹脂)を製造業者のガイドラインに従って用いて精製した。特定のタンパク質含有画分をプールし、生理学的に適切な緩衝剤中で適切なカラム(GE Healthcare)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。特定のタンパク質含有画分をプールして、下流の試験及び貯蔵のために濃縮した。
ｃ)TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質による強力なＴ細胞活性化
TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質を、抗原提示T2細胞に対するCD3+ Ｔ細胞の強力な再指向化を媒介する能力について評価した。インターフェロン-γ(IFN-γ)放出をＴ細胞活性化についての読取値として用いた。
アッセイは、ヒトIFN-γ ELISPOTキット(BD Biosciences)を製造業者の指示に従って用いて行った。簡潔には、T2細胞を標的細胞として用いて、５nM PRAMEペプチドでパルスした。標的細胞は、アッセイ培地(10％熱不活化FBS及び１％ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミンを含有するRPMI 1640)中に１×106/mlの密度にて調製し、体積50μl中50,000細胞/ウェルにてプレートした。新鮮なドナー血液から単離した末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として用いて、体積50μl中35,000細胞/ウェルにてプレートした。TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質を10nM～0.0001nMの最終濃度に滴定して、ウェルに体積50μlで添加した。
プレートを製造業者の指示に従って調製した。標的細胞、エフェクター細胞及び融合タンパク質を含有するウェルを、アッセイ培地で最終体積200μlにした。全ての反応は３連で行った。コントロールウェルは、融合タンパク質、エフェクター細胞又は標的細胞のいずれかを省いて調製した。プレートを一晩インキュベートした(37℃/５％ CO2)。翌日、プレートを洗浄緩衝剤(１×PBSサシェ、0.05％ Tween-20含有、脱イオン水中に作製)で３回洗浄した。次いで、一次検出抗体を各ウェルに体積50μlで加えた。プレートを室温にて２時間インキュベートした後、再度３回洗浄した。50μlの希釈ストレプトアビジン-HRPを各ウェルに添加し、室温にて１時間インキュベートすることにより二次検出を行い、洗浄工程を繰り返した。使用前15分以内に、１滴(20μl)のAEC色素原を各１mlのAEC基質に加えて混合し、50μlを各ウェルに添加した。スポット発色を定期的にモニターし、プレートを水道水で洗浄して、発色反応を終止させた。次いで、プレートを室温にて少なくとも２時間乾燥させた後、CTLアナライザーをImmunospotソフトウェア(Cellular Technology Limited)と共に用いてスポットをカウントした。PRISMソフトウェアを用いてデータを調製し、分析した。
図２に示す結果は、TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質が抗原陽性標的細胞の存在下で有効なＴ細胞活性化を媒介することを証明している。Ec50値はpM範囲であった(IgG1-Fc、IgG1-Fc-バリアント１及びIgG1-Fc-バリアント２との融合体に関してそれぞれ238pM、257pM及び25pM)。抗原陰性標的細胞を用いたコントロール実験は、機能上サイレントなIgG1-バリアント２が無視し得るバックグランド活性をもたらしたことを証明している。したがって、機能上サイレントなFcドメインが治療用途に最も好適であると考えられた。
実施例２(アルブミン結合)
ａ)TCR-抗CD3-アルブミン結合性融合タンパク質の設計
第１の設計において、TCR-抗CD3融合タンパク質は、gp100のHLA-A*02制限ペプチドに結合する高親和性TCRを含んでいた。この分子のアミノ酸配列はWO2011001152に開示されている。具体的には、TCR-抗CD3融合体は、WO2011001152の配列番号45のα鎖(ここで、配列番号45の番号付けに基づいて、アミノ酸１～109はWO2011001152の配列番号８で置換され、１位のアミノ酸はAである)；及びWO2011001152の配列番号36のβ鎖(ここで、残基259～370はWO2011001152の配列番号27に相当し、１位及び２位のアミノ酸はそれぞれA及びIである)を含んでなっていた。アミノ酸配列QRLMEDICLPRWGCLWEDDFを有するアルブミン結合性ペプチド(Dennisら，J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43に記載される通り)を、TCR-抗CD3融合体にリンカーを介して付着させた。適切なリンカーはGGGGSである。アルブミン結合性ペプチドを３つの異なる付着部位に融合した３つのバリアントを調製した：C-α(F1)、N-α(F2)又はC-β(F3)。
第２の設計において、アルブミン結合性ナノボディを、第１の設計で用いたように、同じTCR-抗CD3融合体に付着した。WO2006122787の配列番号52の配列を有するアルブミン結合性ナノボディをTCR-抗CD3融合体にリンカーを介して付着させた。適切なリンカーはGGGGSである。アルブミン結合性ナノボディをつの異なる付着部位に融合させた２つのバリアントを調製した：C-α(R)又はC-β(Y)。
第３の設計において、アルブミン結合性ドメイン抗体をTCR-抗CD3融合体α鎖のＣ末端に付着させた。抗体はAlbudabTMプラットフォームに属する。このドメイン抗体の２つのバリアントを用いた；DOM 7h-10-14 dAb及びDOM 7h-11-15 dAb(WO201010893中でそれぞれ配列番号26及び27で提供される)。抗体はリンカーを介して、直接的に(すなわち、リンカーを有さずに)付着された。適切なリンカーはGGGGSである。TCR-抗CD3融合タンパク質は、MAGEA3のHLA-A*01制限ペプチドに結合する高親和性TCRを含んでいた。この分子のアミノ酸配列はWO2013041865に提供される。
ｂ)TCR-抗CD3-アルブミン結合性融合タンパク質の発現及び精製
TCR-抗CD3融合タンパク質に関して当該分野において公知のもの(例えば、WO2011001152、実施例２)と同じ方法を用いて、TCR-抗CD3-アルブミン結合性融合タンパク質をE. coli中で封入体として発現させ、その後、リフォールディングさせて精製した。
ｃ)TCR-抗CD3-アルブミン結合性融合タンパク質による強力なＴ細胞活性化
TCR-抗CD3-アルブミン結合性融合タンパク質を、抗原陽性ガン細胞に対するCD3+ Ｔ細胞の強力な再指向化を媒介する能力について評価した。インターフェロン-γ(IFN-γ)放出をＴ細胞活性化についての読取値として用いた。
アッセイは、ヒトIFN-γ ELISPOTキット(BD Biosciences)を製造業者の指示に従って用いて行った。簡潔には、アルブミン結合性ペプチドを含んでなる融合体については、メラノーマMel526細胞を標的細胞として用いた。標的細胞は、アッセイ培地(RPMI 1640＋150μMヒト血清アルブミン(HSA)及び１％ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン)中に１×106/mlの密度にて調製し、体積50μl中50,000細胞/ウェルにてプレートした。新鮮なドナー血液から単離した末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として用いて、体積50μl中30,000細胞/ウェルにてプレートした。TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質を10nM～0.0001nMの最終濃度に滴定して、ウェルに体積50μlで添加した。
Albudab(登録商標)を含んでなる融合体については、ミエローマEJM細胞を標的細胞として用いた。標的細胞は、アッセイ培地(RPMI 1640＋45μM HSA及び１％ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン)中に１×106/mlの密度にて調製し、体積50μl中50,000細胞/ウェルにてプレートした。新鮮なドナー血液から単離した末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として用いて、体積50μl中30,000細胞/ウェルにてプレートした。TCR-抗CD3-Fc融合タンパク質を10nM～0.0001nMの最終濃度に滴定して、ウェルに体積50μlで添加した。
実施例1cに記載の通りにプレートを調製して発色させた。
図3A-Cは、アルブミン結合性部分とTCR-抗CD3融合タンパク質との融合体が、抗原陽性標的細胞の存在下で有効なＴ細胞活性化を媒介することを示している。Ec50値はpM範囲であった(137.4/178.0/137.1)。
実施例３(延長した半減期)
ａ)TCR-抗CD3-アルブミン結合性融合タンパク質のPK評価
TCR-抗CD3-AlbudAb融合体のPK特性をマウス血清中で調べた。
マウスに0.1mg/kgの融合タンパク質を静脈内ボーラス注射により投与し、血清サンプルを120時間にわたって一定間隔で採取した。ELISAベースアッセイを用いてPK評価を行った。簡潔には、ビオチン化pHLA複合体をストレプトアビジン-被覆プレートに付着させた後、血清サンプルを添加した。抗CD3 scFvに対する一次ヤギ抗体と、450nmでのTMBを用いる比色検出に関して活性化されたHRP-接合抗ヤギIgGとを用いて検出工程を行った。生成した結果を用いて、系列希釈及び標準曲線に対する分析によってTCR-抗CD3-Albudab融合体の存在及び結合活性を確証した。結果を％活性として表した。この結果を用いて、Cmax対時間のプロットを作成した。
得られたPKデータを図4Aに示す。「TCR-Alb(10-14)」及び「TCR-Alb(11-15)」と呼ぶサンプルは、実施例2aに記載したTCR-抗CD3融合体のことである。「TCR-Alb(D)」は、非アルブミン結合性Albudabに融合したコントロールサンプルであり、「TCR」とはAlbudabを含まないTCR-抗CD3である。
図4AのPKデータを用いて、TCR-抗CD3-AlbudAb融合体のヒトにおける理論的なPKプロフィールを算出した(図4B)。Albudabとの融合体は、インビボ半減期が７時間から264時間へ延長されたと予測される。

Claims (17)

  1. i)Ｔ細胞結合性免疫エフェクターに連結された、ペプチド-主要組織適合性複合体(pMHC)結合性部分と、
    ii)免疫グロブリンFc又はアルブミン結合性ドメインを含んでなる半減期延長ドメインと
    を含んでなる複数ドメイン結合性分子。
  2. pMHC結合性部分がＴ細胞レセプター(TCR)又はTCR及び/若しくは抗体可変ドメイン及び少なくとも１つの定常ドメインを含んでなるTCR様抗体である、請求項１に記載の複数ドメイン結合性分子。
  3. TCRがヘテロ二量体α/βTCRポリペプチド対である、請求項２に記載の複数ドメイン結合性分子。
  4. TCRが単鎖α/βTCRポリペプチドである、請求項２に記載の複数ドメイン結合性分子。
  5. Ｔ細胞結合性免疫エフェクタードメインが、CD3及び/又はTCR/CD3複合体との相互作用によりＴ細胞を活性化するCD3エフェクタードメインである、請求項１～４のいずれか１項に記載の複数ドメイン結合性分子。
  6. CD3エフェクタードメインが抗体scFv又は抗体様足場を含んでなる、請求項５に記載の複数ドメイン結合性分子。
  7. 半減期延長ドメインが免疫グロブリンFcドメインである、請求項１～６のいずれか１項に記載の複数ドメイン結合性分子。
  8. 半減期延長ドメインがアルブミン結合性ドメインを含んでなる、請求項１～６のいずれか１項に記載の複数ドメイン結合性分子。
  9. 半減期延長ドメインがpMHC結合性部分のＣ若しくはＮ末端又はＴ細胞結合性免疫エフェクターのＣ若しくはＮ末端に連結されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の複数ドメイン結合性分子。
  10. 半減期延長ドメインがpMHC結合性部分又はＴ細胞結合性免疫エフェクターにリンカーを介して連結されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の複数ドメイン結合性分子。
  11. 医薬として使用するための請求項１～１０のいずれか１項に記載の複数ドメイン結合性分子。
  12. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の複数ドメイン結合性分子を含んでなる医薬組成物。
  13. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の複数ドメイン結合性分子をコードする核酸。
  14. 請求項１３に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
  15. 請求項１３に記載の核酸又は請求項１４に記載のベクターを含んでなり、複数ドメイン結合性分子をコードする核酸が単一オープンリーディングフレーム又はそれぞれα鎖及びβ鎖をコードする２つの別個のオープンリーディングフレームとして存在する、宿主細胞。
  16. 請求項１５に記載の宿主細胞を核酸の発現に適切な条件下で維持し、複数ドメイン抗原結合性ポリペプチドを単離することを含んでなる請求項１に記載の複数ドメイン結合性分子の製造方法。
  17. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の複数ドメイン結合性分子又は請求項１２に記載の医薬組成物を必要とする患者に投与することを含んでなる治療方法。
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