BR112021014962A2 - Moléculas de ligação de múltiplos domínios, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método de produção da molécula de ligação de múltiplos domínios, e método de tratamento - Google Patents
Moléculas de ligação de múltiplos domínios, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método de produção da molécula de ligação de múltiplos domínios, e método de tratamento Download PDFInfo
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Abstract
moléculas de ligação de múltiplos domínios, composição farmacêutica, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método de produção da molécula de ligação de múltiplos domínios, e método de tratamento. a presente invenção refere-se a moléculas de ligação de múltiplos domínios solúveis que compreendem receptores de células t (tcr) com especificidade para um antígeno, um domínio fc de imunoglobulina ou uma porção química de ligação à albumina; e um domínio efetor imune. essas moléculas de ligação de múltiplos domínios são vantajosas porque exibem meia-vida melhorada enquanto retêm a função.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação de múltiplos domínios solúveis que compreendem receptores de células T (TCR) com especificidade para um antígeno, um domínio Fc de imunoglobulina ou uma porção química de ligação à albumina; e um domínio efetor imune. Essas moléculas de ligação de múltiplos domínios são vantajosas porque exibem meia-vida melhorada enquanto retêm a função.
[0002] Muitas terapias baseadas em proteínas, incluindo fragmentos de anticorpos e proteínas de fusão, são rapidamente eliminadas do corpo após a administração. Sua meia- vida circulatória curta é normalmente atribuída ao seu tamanho pequeno, que permite a eliminação eficaz por meio de filtração renal e falta de proteção contra a degradação intracelular. Nesses casos, a administração frequente ou longos tempos de infusão são necessários para manter uma concentração eficaz do fármaco por períodos prolongados. Para melhorar a dosagem, várias estratégias têm sido empregadas para estender a meia- vida circulatória. Isso inclui o aumento do raio hidrodinâmico da proteína através da fixação de moléculas hidrofílicas flexíveis, como carboidratos ou PEG (polietelenoglicol) e a exploração da reciclagem por meio do receptor Fc neonatal (FcRn), através da fixação de domínios Fc de anticorpos ou albumina sérica (Konnteman, Curr Opin Biotechnol. 2011 Dez;22(6):868-76).
[0003] Estratégias que exploram a reciclagem mediada por FcRn são particularmente atraentes devido ao menor risco de induzir imunogenicidade in vivo e longas extensões de meia-vida que podem ser alcançadas. Por exemplo, a meia-vida de uma célula T que envolve anticorpo biespecífico do formato BiTE®, é relatada como sendo superior a 200 h, após a fixação de um domínio Fc (Lorenczewski, et al., Blood 2017. 130(Suppl 1), 2815). Similarmente, os anticorpos biespecíficos do formato TriTac®, que incorporam um domínio de ligação à albumina, são relatados como tendo uma meia-vida de mais de quatro dias (Wesche et al., Cancer Res 2018; 78 (13 Supl): Abstract nr 3814).
[0004] Proteínas de fusão que compreendem um receptor de célula T solúvel fusionado a um fragmento de anticorpo anti-CD3 são uma nova categoria de células T que envolvem proteínas de fusão biespecíficas com uma meia-vida in vivo na região de 6-8 h (Sato et al., 2018 J Clin Onc 2018 36, nº 15_suppl 9521-9521; Middleton et al., J Clin Onc 2016 34, nº 15_suppl 3016-3016). Ao contrário dos anticorpos tradicionais, os receptores de células T são projetados para reconhecer peptídeos curtos derivados de antígenos intracelulares e apresentados na superfície da célula pelo antígeno leucocitário humano (peptídeo-HLA). A formação de sinapse imune eficaz entre um complexo de peptídeo-HLA em uma célula apresentadora de antígeno e uma célula T depende de uma geometria de interação fixa, que é perturbada por aumentos na distância intramembrana (Choudhuri et al., 2005 Nature Jul 28;436(7050):578-82).
[0005] Há uma necessidade de proteínas biespecíficas que envolvem células T com meia-vida aumentada que são capazes de mediar a formação de sinapses imunes eficazes. Contrariamente às expectativas na técnica, os inventores constataram que a fusão de uma proteína de fusão TCR-anti-CD3 a uma região Fc de anticorpo ou uma porção química de ligação à albumina resultou surpreendentemente na formação de sinapse imune eficaz.
[0006] Em um primeiro aspecto, é fornecida uma molécula de ligação de múltiplos domínios que compreende:
[0007] i) uma porção química de ligação do complexo principal de histocompatibilidade de peptídeos (pMHC) ligada a uma célula T que envolve o efetor imune; e
[0008] ii) um domínio de extensão de meia-vida, que compreende uma imunoglobulina Fc ou um domínio de ligação à albumina.
[0009] De preferência, a porção química de ligação a pMHC é um receptor de células T (TCR) ou anticorpo semelhante a TCR, que compreende TCR e/ou domínios variáveis de anticorpo e pelo menos um domínio constante. De preferência, a porção química de ligação a pMHC compreende pelo menos um domínio constante de imunoglobulina. De preferência, o domínio constante pode corresponder a um domínio constante de uma cadeia alfa de TCR ou uma cadeia beta de TCR (TRAC ou TRBC respectivamente). Alternativamente, o domínio constante de TCR da porção química de ligação de pMHC pode ser substituído por um domínio constante de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo (CL, CH1, CH2, CH3 ou CH4). O domínio constante pode ser de comprimento total ou pode ser truncado. O domínio constante de TCR pode ser truncado para remover o domínio transmembranar. Onde o domínio constante é truncado, de preferência, apenas as porções associadas à membrana são removidas. Mutações adicionais podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos do domínio constante em relação a um domínio constante natural. A região constante também pode incluir resíduos, de ocorrência natural ou introduzidos, que permitem a dimerização por meio de, por exemplo, uma ligação dissulfeto entre dois resíduos de cisteína.
[0010] Os presentes inventores constataram inesperadamente que uma molécula de ligação de múltiplos domínios que compreende uma porção química de ligação a pMHC, um domínio efetor imune e um domínio Fc de imunoglobina ou uma porção química de ligação à albumina, permanece funcional. Isto é particularmente surpreendente, dado o conhecimento na técnica de que a interação TCR-pMHC depende de uma geometria de ligação fixa e que o acionamento de TCR é sensível a aumentos na distância intermembrana (Garboczi et al., Nature. 1996 Nov 14;384(6605):134-41; Choudhuri et al., 2005 Nature Jul 28;436(7050):578-82; Rudolph et al., Annu Rev Immunol. 2006;24:419-66). De fato, o modelo de segregação cinética propõe que o desencadeamento de TCR é o resultado da amarração do complexo TCR-CD3 dentro de zonas de contato próximo nas quais a fosforilação de tirosina é favorecida por causa da exclusão dependente do tamanho de tirosina fosfatases, como CD45 (Choudhuri et al., 2005 Nature Jul 28;436(7050):578-82; Davis et al., Nat Immunol. 2006 Ago;7(8):803-9). As pequenas dimensões do complexo TCR-pMHC (aprox. 100 Å) e geometria de ligação fixa são, portanto, entendidas como importantes para a formação de sinapses imunológicas e o desencadeamento de TCR. Com base neste conhecimento, uma pessoa versada entenderia que seria esperado que os polipeptídeos de ligação ao antígeno da invenção resultassem em formação de sinapse imunológica pobre, perturbação da geometria de ligação de TCR-pMHC e, em última análise, desencadeamento de TCR ineficaz.
[0011] A porção química de ligação a pMHC pode ser um anticorpo semelhante a TCR. De preferência, a porção química de ligação de pMHC compreende os domínios variáveis de um anticorpo semelhante a TCR. Os anticorpos não reconhecem naturalmente um pMHC; no entanto, sabe-se que os anticorpos com especificidade para pMHC podem ser projetados. Tais anticorpos são denominados como anticorpos semelhantes a TCR ou mimetizadores de TCR (Chang et al., Expert Opin Biol Ther. 2016 Ago;16(8):979-87 e Dahan et al., Expert Rev Mol Med. 2012 Fev 24;14:e6).
[0012] O TCR pode ser um par de polipeptídeo TCR heterodimérico alfa/beta ou gama/delta. Alternativamente, o TCR pode ser um polipeptídeo de TCR alfa/beta ou gama/delta de cadeia única. A sequência de aminoácidos dos domínios variáveis de TCR pode corresponder àqueles encontrados na natureza ou podem conter uma ou mais mutações em relação a um TCR natural. Essas mutações podem ser feitas para aumentar a afinidade do TCR para um determinado antígeno. Adicionalmente ou alternativamente, mutações podem ser incorporadas para melhorar a estabilidade e a capacidade de fabricação.
[0013] O TCR pode se ligar ao MHC em complexo com um antígeno peptídico. De preferência, o antígeno peptídico é qualquer antígeno associado a doenças. De preferência, o antígeno peptídico é qualquer antígeno associado a tumor. O antígeno peptídico pode ser um peptídeo derivado a partir de GP100, NYESO, MAGEA4 ou PRAME, conforme descrito nos documentos WO2011001152, WO2017109496, WO2017175006 e WO2018234319.
[0014] O TCR pode ter uma sequência de aminoácidos conforme definido nos documentos WO2011001152, WO2017109496, WO2017175006 e WO2018234319.
[0015] O domínio efetor imune que envolve células T pode ser um domínio efetor de CD3. O efetor imune que envolve células T pode ser um anticorpo scFv (ou um arcabouço semelhante a um anticorpo de tamanho semelhante) que ativa uma célula T através da interação com CD3 e/ou complexo TCR/CD3. Efetores de CD3 incluem, porém sem limitação, a anticorpos anti-CD3 ou fragmentos de anticorpos, particularmente um scFv anti-CD3 ou arcabouços semelhantes a anticorpos. Outros efetores imunes incluem, porém sem limitação, a citocinas, como IL-2 e IFN-γ; superantígenos e mutantes dos mesmos; quimiocinas, tais como IL-8, fator 4 das plaquetas, proteína estimuladora do crescimento do melanoma; anticorpos, incluindo fragmentos, derivados e variantes dos mesmos, que se ligam a antígenos em células imunes, como células T ou células NK (por exemplo, anti-CD28 ou anti-CD16 ou quaisquer moléculas que se localizam na sinapse imune) e ativadores de complemento.
[0016] O domínio de prolongamento da meia-vida pode ser ligado ao terminal C ou N da porção química de ligação de pMHC ou ao terminal C ou N do efetor imune que envolve células T.
[0017] O domínio de prolongamento da meia-vida pode compreender uma imunoglobulina Fc. O domínio Fc de imunoglobulina pode ser qualquer região Fc de anticorpo. A região Fc é a região da cauda de um anticorpo que interage com os receptores Fc da superfície celular e algumas proteínas do sistema complementar. A região Fc tipicamente compreende duas cadeias polipeptídicas, sendo que ambas têm dois ou três domínios constantes de cadeia pesada (denominados CH2, CH3 e
CH4) e uma região de articulação.
As duas cadeias são ligadas por ligações dissulfeto dentro da região da articulação.
Os domínios Fc das subclasses de imunoglobulina IgG1, IgG2 e IgG4 se ligam e sofrem reciclagem mediada por FcRn, proporcionando uma meia-vida circulatória longa (3 a 4 semanas). A interação de IgG com FcRn foi localizada na região Fc cobrindo partes do domínio CH2 e CH3. A imunoglobulina Fc preferencial para uso na presente invenção inclui, porém sem limitação, domínios Fc de IgG1 ou IgG4. De preferência, o domínio Fc é derivado de sequências humanas.
A região Fc também pode incluir preferencialmente mutações KiH que facilitam a dimerização, bem como mutações para impedir a interação com receptores ativadores, isto é, moléculas funcionalmente silenciosas.
O domínio Fc de imunoglobulina pode ser fusionado ao terminal C ou N dos outros domínios (isto é, o TCR ou efetor imune). A imunoglobulina Fc pode ser fusionada com os outros domínios (isto é, o TCR ou efetor imune) através de um ligante, alternativamente, nenhum ligante pode ser usado.
As sequências de ligante geralmente são flexíveis, pois são compostas principalmente de aminoácidos, tais como glicina, alanina e serina, que não têm cadeias laterais volumosas que provavelmente restringem a flexibilidade.
Alternativamente, ligantes com maior rigidez podem ser desejáveis.
Comprimentos utilizáveis ou ótimos de sequências de ligação podem ser determinados facilmente.
Frequentemente, a sequência ligante terá menos do que cerca de 12, tal como menos do que 10 ou de 2-10 aminoácidos de comprimento.
O ligante pode ter comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos.
Exemplos de ligantes adequados que podem ser usados em moléculas de ligação de múltiplos domínios da invenção incluem, porém, sem limitação: e (conforme descrito no documento WO2010/133828). Onde a imunoglobulina Fc é fusionada ao TCR, ela pode ser fusionada tanto às cadeias alfa quanto a beta ou ambas as cadeias alfa e beta, com ou sem um ligante. Além disso, as cadeias individuais do Fc podem ser fundidas a cadeias individuais do TCR.
[0018] De preferência, a região Fc pode ser derivada da subclasse IgG1 ou IgG4. As duas cadeias podem compreender domínios constantes CH2 e CH3 e a totalidade ou parte de uma região de articulação. A região de articulação pode corresponder substancial ou parcialmente a uma região de articulação de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. A articulação pode compreender a totalidade ou parte de um domínio de articulação central e a totalidade ou parte de uma região de articulação inferior. De preferência, a região de articulação contém pelo menos uma ligação dissulfeto ligando as duas cadeias.
[0019] A região Fc pode compreender mutações em relação a uma sequência WT. As mutações incluem substituições, inserções e exclusões. Essas mutações podem ser feitas com o propósito de introduzir propriedades terapêuticas desejáveis. Por exemplo, para facilitar a heterodimerização, mutações de “botões em orifícios” (“knobs into holes” (KiH)) podem ser projetadas no domínio CH3. Nesse caso, uma corrente é projetada para conter um resíduo saliente volumoso (ou seja, o botão), tal como Y, e a outra é projetada para conter uma bolsa complementar (ou seja, o orifício). Posições adequadas para mutações KiH são conhecidas na técnica. Adicional ou alternativamente, podem ser introduzidas mutações que anulam ou reduzem a ligação a receptores Fcy e/ou aumentam a ligação a FcRn e/ou evitam a troca de braço Fab ou removem locais de protease. Adicionalmente ou alternativamente, mutações podem ser feitas por razões de fabricação, por exemplo, para remover ou substituir aminoácidos que podem estar sujeitos a modificações pós-translações, como glicosilação. EXEMPLOS INCLUEM:
[0020] IgG4 (resíduos sublinhados indicam mutações versus a sequência de tipo selvagem) “BOTÃO” “ORIFÍCIO”
[0021] IgG1 (resíduos sublinhados indicam mutações versus a sequência de tipo selvagem) “BOTÃO” “ORIFÍCIO”
[0022] O domínio de prolongamento da meia-vida pode compreender um domínio de ligação à albumina. Como é conhecido na técnica, a albumina tem uma meia-vida circulatória longa de 19 dias, em parte devido ao seu tamanho estar acima do limiar renal e por sua interação específica e reciclagem por meio de FcRn. A ligação à albumina é uma estratégia bem conhecida para melhorar a meia-vida circulatória de uma molécula terapêutica in vivo. A albumina pode ser ligada de forma não covalente, através do uso de um domínio de ligação à albumina específico, ou covalentemente, por conjugação ou fusão genética direta. Exemplos de moléculas terapêuticas que exploraram a ligação à albumina para melhorar a meia-vida são dados em Sleep et al., Biochim Biophys Acta. Dezembro de 2013; 1830 (12):5.526 a 5.534.
[0023] O domínio de ligação à albumina pode ser qualquer porção química capaz de se ligar à albumina, incluindo qualquer porção química de ligação à albumina conhecida. Os domínios de ligação à albumina podem ser selecionados dentre ligantes endógenos ou exógenos, pequenas moléculas orgânicas, ácidos graxos, peptídeos e proteínas que se ligam especificamente à albumina. Exemplos de domínios de ligação à albumina preferenciais incluem peptídeos curtos, tais como descritos em Dennis et al., J Biol Chem. 20 de setembro de 2002; 277(38):35.035 a 35.043 (por exemplo, o peptídeo QRLMEDICLPRWGCLWEDDF); proteínas modificadas para se ligar à albumina, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpos e estruturas semelhantes a anticorpos, por exemplo, Albudab® (O'Connor-Semmes et al., Clin Pharmacol Ther. dezembro de 2014; 96(6):704 a 12), fornecido comercialmente por GSK and Nanobody® (Van Roy et al., Arthritis Res Ther. 20 de maio de 2015; 17:135), fornecido comercialmente por Ablynx; e proteínas à base de domínios de ligação à albumina encontradas na natureza, tais como proteína G estreptocócica (Stork et al., Eng Des
Sel. Novembro de 2007; 20(11):569 a 76), por exemplo Albumod® fornecido comercialmente por Affibody
[0024] De preferência, a albumina é albumina de soro humano (HSA). A afinidade do domínio de ligação à albumina para a albumina humana pode ser na faixa de picomolar a micromolar. Dada a concentração extremamente alta de albumina no soro humano (35 a 50 mg/ml, aproximadamente 0,6 mM), é calculado que substancialmente todos os domínios de ligação à albumina serão ligados à albumina in vivo.
[0025] A porção química de ligação à albumina pode ser ligada ao terminal C ou N de outros domínios (isto é, o TCR ou efetor imune). A porção química de ligação à albumina pode ser ligada a outros domínios (isto é, o TCR ou efetor imune) através de um ligante. As sequências de ligante geralmente são flexíveis, pois são compostas principalmente de aminoácidos, tais como glicina, alanina e serina, que não têm cadeias laterais volumosas que provavelmente restringem a flexibilidade. Alternativamente, ligantes com maior rigidez podem ser desejáveis. Comprimentos utilizáveis ou ótimos de sequências de ligação podem ser determinados facilmente. Frequentemente, a sequência ligante terá menos do que cerca de 12, tal como menos do que 10 ou de 2 a 10 aminoácidos de comprimento. O ligante pode ter comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos. Exemplos de ligantes adequados que podem ser usados em moléculas de ligação de múltiplos domínios da invenção incluem, porém, sem limitação: e (conforme descrito no documento WO2010/133828).
Onde a porção química de ligação à albumina está ligada ao TCR, ela pode ser ligada tanto às cadeias alfa quanto à beta ou ambas as cadeias alfa e beta, com ou sem um ligante.
[0026] A molécula de ligação de múltiplos domínios, de acordo com o primeiro aspecto, pode ser para uso como um medicamento.
[0027] Em um outro aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação de múltiplos domínios, de acordo com o primeiro aspecto.
[0028] Em ainda um aspecto adicional, é fornecido um ácido nucleico que codifica a molécula de ligação de múltiplos domínios, de acordo com o primeiro aspecto. Também é fornecido um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico deste aspecto. Adicionalmente, é fornecida uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico ou o vetor deste aspecto, em que o ácido nucleico que codifica a molécula de ligação de múltiplos domínios está presente como um único quadro de leitura aberto ou dois quadros de leitura abertos distintos que codificam a cadeia alfa e cadeia beta respectivamente.
[0029] Também é fornecido, em um aspecto adicional, um método para fazer a molécula de ligação de múltiplos domínios, de acordo com o primeiro aspecto, que compreende manter a célula hospedeira descrita acima sob condições opcionais para a expressão do ácido nucleico e isolar o polipeptídeo de ligação ao antígeno de múltiplos domínios.
[0030] Em ainda um aspecto adicional, é fornecido um método de tratamento que compreende a administração da molécula de ligação de múltiplos domínios, de acordo com o primeiro aspecto, a um paciente em necessidade do mesmo.
[0031] Dentro do escopo da invenção estão variantes fenotipicamente silenciosas de qualquer molécula revelada no presente documento. Conforme utilizado no presente documento, o termo "variantes fenotipicamente silenciosas" é entendido como referindo-se a uma variante que incorpora uma ou mais outras alterações de aminoácidos, incluindo substituições, inserções e deleções, além daquelas estabelecidas acima, cuja variante tem um fenótipo semelhante à molécula correspondente sem a dita mudança(ou mudanças). Para os fins deste pedido, o fenótipo compreende afinidade de ligação (KD e/ou meia-vida de ligação) e especificidade. De preferência, o fenótipo para uma molécula de ligação de múltiplos domínios solúvel, inclui potência de ativação imune e rendimento de purificação, além de afinidade e especificidade de ligação.
[0032] Variantes fenotipicamente silenciosas podem conter uma ou mais substituições conservativas e/ou uma ou mais substituições toleradas. Por substituições toleradas entende-se aquelas substituições que não se enquadram na definição de conservativa conforme fornecido abaixo, mas são fenotipicamente silenciosas. A pessoa versada está ciente de que vários aminoácidos têm propriedades semelhantes e, portanto, são "conservativos”. Um ou mais aminoácidos de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo podem frequentemente ser substituídos por um ou outros mais aminoácidos sem eliminar uma atividade desejada dessa proteína, polipeptídeo ou peptídeo.
[0033] Assim, os aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina podem frequentemente ser substituídos entre si (aminoácidos com cadeias laterais alifáticas). Destas substituições possíveis, é preferencial que a glicina e a alanina sejam usadas para substituir uma pela outra (uma vez que têm cadeias laterais relativamente curtas) e que valina, leucina e isoleucina são usadas para substituir uma pela outra (uma vez que têm cadeias laterais alifáticas maiores que são hidrofóbicos). Outros aminoácidos que muitas vezes podem ser substituídos entre si incluem: fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos com cadeias laterais aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas); aspartato e glutamato (aminoácidos com cadeias laterais ácidas); asparagina e glutamina (aminoácidos possuindo cadeias laterais de amida); e cisteína e metionina (aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre). Deve ser observado que as substituições de aminoácidos dentro do escopo da presente invenção, podem ser feitas com o uso de aminoácidos de ocorrência natural ou não natural. Por exemplo, é contemplado no presente documento que o grupo metil em uma alanina pode ser substituído por um grupo etil e/ou que pequenas alterações podem ser feitas na estrutura do peptídeo. A possibilidade dos aminoácidos naturais ou sintéticos serem ou não utilizados, é preferencial que apenas L-aminoácidos estejam presentes.
[0034] As substituições desta natureza são frequentemente denominadas como substituições de aminoácidos "conservativas" ou "semiconservativas". A presente invenção, portanto, se estende ao uso de uma molécula que compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas acima, mas com uma ou mais substituições conservativas e ou uma ou mais substituições toleradas na sequência, de modo que a sequência de aminoácidos do TCR, tenha pelo menos 90 % de identidade, tal como 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade, com as sequências de TCR reveladas no presente documento.
[0035] “Identidade” como conhecida na técnica é a relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, como determinado por comparação das sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de afinidade entre sequências polipeptídicas ou polinucleotídicas, de acordo com o caso, como determinado pela combinação entre cadeias dessas sequências. Embora existam diversos métodos para medir a identidade entre dois polipeptídeos ou duas sequências polinucleotídicas, os métodos comumente empregados para determinar a identidade são codificados em programas de computador. Os programas de computador preferenciais para determinar a identidade entre duas sequências incluem, porém, sem limitação, o pacote de programas GCG (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN e FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)).
[0036] Pode-se usar um programa como o programa CLUSTAL para comparar sequências de aminoácidos. Este programa compara sequências de aminoácidos e encontra o alinhamento ideal inserindo-se espaços em qualquer sequência conforme apropriado. É possível calcular a identidade ou semelhança de aminoácidos (identidade mais conservação do tipo de aminoácido) para um alinhamento ideal. Um programa como o BLASTx irá alinhar o trecho mais longo de sequências semelhantes e atribuir um valor ao ajuste. Assim, é possível obter uma comparação em que várias regiões de similaridade são encontradas, cada uma com uma pontuação diferente. Ambos os tipos de análise de identidade são contemplados na presente invenção.
[0037] A identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos é determinada pelo alinhamento das sequências para fins de comparação ideal (por exemplo, podem ser introduzidos intervalos na primeira sequência para melhor alinhamento com a sequência) e comparação dos resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições correspondentes. O “melhor alinhamento” é um alinhamento de duas sequências que resulta na identidade percentual superior. A identidade percentual é determinada pelo número de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos nas sequências que são comparadas (ou seja, % de identidade = número de posições idênticas/número total de posições x 100).
[0038] A determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada com o uso de um algoritmo matemático conhecido pelos versados na técnica. Um exemplo de algoritmo matemático para comparar duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5873-5877. Os programas BLASTn e BLASTp de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 incorporaram tal algoritmo. A determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotídeos pode ser realizada com o programa BLASTn. A determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências de proteínas pode ser realizada com o programa BLASTp. Para obter alinhamentos com espaçamentos para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, o PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre as moléculas (Id.). Quando se utiliza os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTp e BLASTp) podem ser usados.
Consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Os parâmetros gerais padrão podem incluir, por exemplo, Tamanho de Palavra = 3, Limite Esperado = 10. Os parâmetros podem ser selecionados para ajustar automaticamente para sequências curtas de entrada.
Outro exemplo de algoritmo matemático utilizado para comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). O programa ALIGN (versão 2.0), que faz parte do pacote de software de alinhamento de sequência CGC, incorporou esse algoritmo.
Outros algoritmos para análise de sequência conhecidos na técnica incluem ADVANCE e ADAM, conforme descrito em Torellis e Robotti (1994) Comput.
Appl.
Biosci., 10: 3-5; e FASTA descrito em Pearson e Lipman (1988) Proc.
Natl.
Acad.
Sci. 85:2444-8. Dentro do FASTA, ktup é uma opção de controle que define a sensibilidade e velocidade da pesquisa.
Para fins de avaliação de identidade percentual na presente revelação, BLASTp com os parâmetros padrão é usado como a metodologia de comparação.
Adicionalmente, quando a identidade percentual recitada fornece um valor de número não inteiro para os aminoácidos (isto é, uma sequência de 25 aminoácidos com 90% de identidade de sequência fornece um valor de "22,5", o valor obtido é arredondado para o próximo número inteiro, portanto, “22”). Consequentemente, no exemplo fornecido, uma sequência com 22 combinações de 25 aminoácidos está dentro de 90% de identidade de sequência.
[0039] Como será óbvio para as pessoas versados na técnica, pode ser possível truncar ou estender as sequências fornecidas no terminal C e/ou terminal N do mesmo, em 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos, sem afetar substancialmente as características funcionais da molécula, por exemplo, a porção de TCR. As sequências fornecidas no C-terminal e/ou N-terminal do mesmo podem ser truncadas ou estendidas por 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos. Todas essas variantes são abrangidas pela presente invenção.
[0040] Mutações, incluindo substituições, inserções e deleções conservativas e toleradas, podem ser introduzidas nas sequências fornecidas com o uso de qualquer método apropriado, que inclui, porém sem limitação, aqueles baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR), clonagem baseada em enzimas de restrição ou clonagem independente de ligação (LIC) procedimentos. Esses métodos são detalhados em muitos dos textos padrão de biologia molecular. Para obter mais detalhes sobre a reação em cadeia da polimerase (PCR) e clonagem baseada em enzimas de restrição, consultar Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3ª Ed.) CSHL Press. Mais informações sobre procedimentos de clonagem independente de ligação (LIC) podem ser encontradas em Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6. As sequências de TCR fornecidas pela invenção podem ser obtidas a partir de síntese de estado sólido ou qualquer outro método apropriado conhecido na técnica.
[0041] As moléculas da invenção podem ter um perfil de segurança ideal para uso como reagentes terapêuticos. Um perfil de segurança ideal significa que além de demonstrar boa especificidade, as moléculas da invenção podem ter passado em outros testes de segurança pré-clínicos. Exemplos de tais testes incluem ensaios de sangue total para confirmar a liberação mínima de citocinas na presença de sangue total e, portanto, baixo risco de causar uma síndrome de liberação potencial de citocinas in vivo e testes de alorreatividade para confirmar o baixo potencial de reconhecimento de tipos alternativos de HLA.
[0042] As moléculas da invenção podem ser passíveis de purificação de alto rendimento. O rendimento pode ser determinado com base na quantidade de material retido durante o processo de purificação (ou seja, a quantidade de material dobrado corretamente obtido no final do processo de purificação em relação à quantidade de material solubilizado obtido antes do redobramento), e/ou o rendimento pode ser baseado na quantidade de material dobrado corretamente obtido ao final do processo de purificação, em relação ao volume da cultura original. Alto rendimento significa rendimento maior do que 1%, ou mais preferencialmente maior do que 5% ou maior. Alto rendimento significa rendimento maior do que 1 mg/ml, ou mais preferencialmente maior do que 3 mg/ml, ou maior do que 5 mg/ml ou maior.
[0043] Os métodos para determinar a afinidade de ligação (inversamente proporcional à constante de equilíbrio KD) e a meia-vida de ligação (expressa como T½) são conhecidos dos especialistas na técnica. Em uma modalidade preferencial, a afinidade de ligação e a meia-vida de ligação são determinadas com o uso de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR) ou Interferometria de Bio-camada (BLI), por exemplo, com o uso de um instrumento BIAcore ou instrumento Octet, respectivamente. Será observado que dobrar a afinidade resulta em reduzir pela metade o KD. T½ é calculada como ln2 dividido pela taxa de desaceleração (koff). Portanto, a duplicação de T½ resulta em uma redução à metade na koff. Os valores KD e koff para TCRs são geralmente medidos para formas solúveis de TCR, isto é, aquelas formas que são truncadas para remover resíduos de domínio citoplasmático e transmembranar. Para levar em conta a variação entre as medições independentes e, particularmente, para as interações com tempos de dissociação superiores a 20 horas, a afinidade de ligação e/ou meia-vida de ligação de um dado TCR pode ser medida várias vezes, por exemplo, 3 ou mais vezes, com o uso do mesmo protocolo de ensaio e tomada uma média dos resultados. Para comparar os dados de ligação entre duas amostras (isto é, dois TCRs diferentes e ou duas preparações do mesmo TCR), é preferencial que as medições sejam feitas com o uso das mesmas condições de ensaio (por exemplo, temperatura). Os métodos de medição descritos em relação aos TCRs também podem ser aplicados aos polipeptídeos de ligação ao antígeno de múltiplos domínios aqui descritos.
[0044] Certas moléculas de ligação de múltiplos domínios preferenciais da invenção são capazes de gerar uma resposta de células T altamente potente in vitro contra células positivas para antígeno, particularmente aquelas células que apresentam baixos níveis de antígeno típico de células cancerosas (isto é, na ordem de 5-100, por exemplo 50, antígenos por célula (Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11):e26840; Purbhoo et al.,(2006). J Immunol 176(12): 7308- 7316)). Tais TCRs podem ser adequados para incorporação nos polipeptídeos de ligação a antígeno de múltiplos domínios descritos no presente documento. A resposta de células T que é medida pode ser a liberação de marcadores de ativação de células T, como Interferon γ ou Granzyme B, ou morte de células-alvo ou outra medida de ativação de células T, como proliferação de células T. De preferência, uma resposta altamente potente é aquela com valor EC50 na faixa de nM - pM, de preferência 500 nM ou inferior, mais preferencialmente, 1 nM de inferior, ou 500 pM ou inferior.
[0045] As porções de TCR das moléculas da invenção podem ser heterodímeros αβ. Porções de TCR heterodiméricas alfa-beta das moléculas da invenção compreendem, em geral, uma sequência de domínio constante TRAC de cadeia alfa e/ou uma sequência de domínio constante TRBC1 de cadeia beta ou TRBC2. Os domínios constantes podem estar em formato solúvel (isto é, que não tem domínios transmembranares ou citoplasmáticos). Um ou ambos os domínios constantes podem conter mutações, substituições ou exclusões em relação às sequências TRAC e/ou TRBC1/2 nativas. O termo TRAC e TRBC1/2 também abrange variantes polimórficas naturais, por exemplo N a K na posição 4 de TRAC (Bragado et al International immunology. Fevereiro de 1994; 6 (2):223-30).
[0046] As sequências de domínio constante de cadeia alfa e beta podem ser modificadas por truncamento ou substituição para deletar a ligação dissulfeto nativa entre Cys4 do éxon 2 de TRAC e Cys2 do éxon 2 de TRBC1 ou TRBC2. A sequência (ou sequências) de domínio constante de cadeia alfa e/ou beta pode ter uma ligação dissulfeto introduzida entre resíduos dos respectivos domínios constantes, como descrito, por exemplo, no documento WO 03/020763 e WO06000830. Os domínios constantes alfa e beta podem ser modificados por substituição de resíduos de cisteína na posição Thr 48 de TRAC e na posição Ser 57 de TRBC1 ou TRBC2, sendo que as ditas cisteínas formam uma ligação dissulfeto entre os domínios constantes alfa e beta do TCR. TRBC1 ou TRBC2 podem incluir adicionalmente uma mutação de cisteína para alanina na posição 75 do domínio constante e uma mutação de asparagina para ácido aspártico na posição 89 do domínio constante. Um ou ambos os domínios constantes extracelulares presentes em um heterodímero αβ podem ser truncados no terminal C ou terminais C, por exemplo, por até 15, ou até 10, ou até 8 ou menos aminoácidos. O terminal C do domínio constante extracelular da cadeia alfa pode ser truncado por 8 aminoácidos.
[0047] As porções de TCR das moléculas da invenção podem estar no formato de cadeia única. Os formatos de cadeia única incluem, porém, sem limitação, polipeptídeos TCR αβ dos tipos Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ ou Vα- Cα-L-Vβ- Cβ, em que Vα e Vβ são regiões variáveis de TCR α e β, respectivamente, Cα e Cβ são regiões constantes de TCR α e β, respectivamente, e L é uma sequência ligante (Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. Dez 1;221(1 a 2):59 a 76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565 a 73; WO 2004/033685; WO9918129). Os TCRs de cadeia única podem ter uma ligação dissulfeto introduzida entre os resíduos dos respectivos domínios constantes, conforme descrito no documento WO 2004/033685. Os TCRs de cadeia única são descritos adicionalmente nos documentos WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1 a 2): 59 a 76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci EUA 89(10):
4.759 a 4.763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819 a 829).
[0048] Os agentes terapêuticos que podem estar associados às moléculas da invenção incluem moduladores imunológicos e efetores, compostos radioativos, enzimas
(perforina, por exemplo) ou agentes quimioterápicos (cis- platina, por exemplo). Para garantir que os efeitos tóxicos sejam exercidos no local desejado, a toxina pode estar dentro de um lipossoma ligado ao polipeptídeo de ligação ao antígeno de múltiplos domínios descrito no presente documento, de modo que o composto seja liberado lentamente. Isso evitará efeitos prejudiciais durante o transporte no corpo e garantirá que a toxina tenha efeito máximo após a ligação do polipeptídeo de ligação ao antígeno de múltiplos domínios descrito no presente documento às células de apresentação de antígeno relevantes.
[0049] Exemplos de agentes terapêuticos adequados incluem, porém, sem limitação:
[0050] • agentes citotóxicos de moléculas pequenas, isto é, compostos com a capacidade de matar células de mamíferos com um peso molecular inferior a 700 Daltons. Esses compostos também podem conter metais tóxicos capazes de ter um efeito citotóxico. Além disso, deve ser entendido que estes agentes citotóxicos de moléculas pequenas também incluem pró-fármacos, isto é, compostos que decaem ou são convertidos em condições fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Exemplos de tais agentes incluem cis-platina, derivados de maitansina, rachelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etoposido, gencitabina, ifosfamida, irinotecano, melfalano, mitoxantrona, sorfímero sódicofotofrina II, temozolomida, topotecano, vinoristina e arburistatina 12;
[0051] • citotoxinas de peptídeo, isto é, proteínas ou fragmentos das mesmas com a capacidade de matar células de mamíferos. Por exemplo, ricina, toxina da difteria, exotoxina bacteriana A de pseudomonas, Dnase e Rnase;
[0052] • radionuclídeos, isto é, isótopos instáveis de elementos que decaem com a emissão simultânea de um ou mais de α ou β partículas, ou γ raios. Por exemplo, iodo 131, rênio 186, índio 111, ítrio 90, bismuto 210 e 213, actínio 225 e astato 213; agentes quelantes podem ser usados para facilitar a associação desses radionuclídeos aos TCRs de alta afinidade ou multímeros dos mesmos;
[0053] • Imunoestimulantes, isto é, moléculas imunes efetoras que estimulam a resposta imune. Por exemplo, citocinas como IL-2 e IFN-γ,
[0054] • Superantígenos e mutantes dos mesmos;
[0055] • Fusões TCR-HLA, por exemplo, fusão com um complexo de peptídeo-HLA, em que o dito peptídeo é derivado a partir de um patógeno humano comum, como o vírus Epstein Barr (EBV);
[0056] • quimiocinas, como IL-8, fator de plaquetas 4, proteína estimuladora de crescimento de melanoma, etc.;
[0057] • anticorpos ou fragmentos dos mesmos, incluindo anticorpos anti-células T ou determinantes de células NK (por exemplo, anti-CD3, anti-CD28 ou anti-CD16);
[0058] • anticorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam a moléculas que se localizam na sinapse imune
[0059] • arcabouços de proteína alternativos com características de ligação semelhantes a anticorpos
[0060] • ativadores de complemento;
[0061] • domínios de proteína xenogênica, domínios de proteína alogênica, domínios de proteína virais/bacterianos, peptídeos virais/bacterianos.
[0062] Um efetor imune particularmente preferencial é um anticorpo anti-CD3, ou um fragmento funcional ou variante do dito anticorpo anti-CD3. Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo" abrange tais fragmentos e variantes. Exemplos de anticorpos anti-CD3 incluem, porém, sem limitação, OKT3, UCHT-1, BMA-031 e 12F6. Fragmentos de anticorpos e variantes/análogos que são adequados para uso nas composições e métodos descritos no presente documento incluem minicorpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)2, fragmentos dsFv e scFv, Nanocorpos™ (estes construtos, comercializados pela Ablynx (Bélgica), compreendem o domínio pesado variável de imunoglobulina única sintética derivada de um anticorpo de camelídeo (por exemplo, camelo ou lama) e Anticorpos de Domínio (Domantis (Bélgica), que compreende um domínio pesado variável de imunoglobulina única maturada por afinidade ou domínio leve variável de imunoglobulina) ou arcabouços de proteína alternativos que exibem características de ligação semelhantes a anticorpos, tais como Affibodies (Affibody (Suécia), que compreende arcabouço de proteína A projetada) ou Anticalinas (Pieris (Alemanha)), que compreende anticalinas projetadas) para citar apenas alguns, o efetor imune está ligado à porção TCR do polipeptídeo de ligação ao antígeno de múltiplos domínios, em que preferencialmente o efetor imune é um anticorpo anti-CD3.
[0063] A ligação dos componentes individuais da molécula de ligação de múltiplos domínios pode ser por meio de fixação covalente ou não covalente. A fixação covalente pode ser direta ou indireta por meio de uma sequência ligante. As sequências de ligante geralmente são flexíveis, pois são compostas principalmente de aminoácidos, tais como glicina, alanina e serina, que não têm cadeias laterais volumosas que provavelmente restringem a flexibilidade. Alternativamente, ligantes com maior rigidez podem ser desejáveis. Comprimentos utilizáveis ou ótimos de sequências de ligação podem ser determinados facilmente. Frequentemente, a sequência ligante terá menos do que cerca de 12, tal como menos do que 10 ou de 2 a 10 aminoácidos de comprimento. Exemplos de ligantes adequados que podem ser usados nas moléculas da invenção incluem, porém sem limitação: e (conforme descrito no documento WO2010/133828).
[0064] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação de múltiplos domínios da invenção. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é cDNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico pode ser mRNA. O ácido nucleico pode ser de ocorrência não natural e/ou purificado e/ou modificado. A sequência de ácido nucleico pode ser otimizada por códons, de acordo com o sistema de expressão utilizado. Como é conhecido pelos versados na técnica, os sistemas de expressão podem incluir células bacterianas, tais como E. coli, ou células de levedura, ou células de mamífero, ou células de inseto, ou podem ser sistemas de expressão livres de células.
[0065] A presente invenção também fornece construtos na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um ácido nucleico como descrito acima. A presente invenção também fornece uma célula hospedeira recombinante que compreende um ou mais construtos como acima. Como mencionado, um ácido nucleico que codifica uma molécula de ligação específica da invenção forma um aspecto da presente invenção, assim como um método de produção da molécula de ligação específica, cujo método compreende a expressão a partir de ácido nucleico que codifica a mesma. A expressão pode ser convenientemente alcançada por cultura sob condições apropriadas de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico. Após a produção por expressão, uma molécula de ligação específica pode ser isolada e/ou purificada usando qualquer técnica adequada, em seguida usada conforme apropriado.
[0066] Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamíferos, leveduras e sistemas de baculovírus. As linhas de células de mamíferos disponíveis na técnica para a expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês, células HeLa, células de rim de hamster bebê, células de melanoma de camundongo NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano comum preferencial é E. coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos em células procarióticas, como E. coli, está bem estabelecida na técnica. Para uma revisão, consultar, por exemplo, Plückthun, Bio/Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura também está disponível para as pessoas versadas na técnica como uma opção para a produção de uma molécula de ligação específica, consultar para uma revisão recente, por exemplo Reff, Curr. Opinion Biotech. 4:573-576 (1993); Trill et al., Curr. Opinion Biotech. 6:553-560 (1995).
[0067] Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências regulatórias apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras,
sequências de poliadenilação, sequências potenciadoras, genes marcadores e outras sequências conforme apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, 'Fago, ou fagemídeo, conforme apropriado. Para obter mais detalhes, consulte, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão gênica e análise de proteínas, são descritos em detalhes em Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology, 2ª edição, John Wiley & Sons (1992).
[0068] Assim, um outro aspecto da presente invenção fornece uma célula hospedeira contendo ácido nucleico como revelado no presente documento. Ainda um outro aspecto fornece um método que compreende a introdução de tal ácido nucleico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-Dextran, eletroporação, transfecção mediada por lipossomas e transdução usando retrovírus ou outro vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de inseto, baculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófago. A introdução pode ser seguida causando-se ou permitindo-se a expressão do ácido nucleico, por exemplo, por cultura de células hospedeiras sob condições para expressão do gene.
[0069] O ácido nucleico da invenção pode ser integrado no genoma (por exemplo, cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão.
[0070] Como é bem conhecido na técnica, os polipeptídeos podem estar sujeitos a modificações pós- translação. A glicosilação é uma dessas modificações, que compreende a ligação covalente de porções de oligossacarídeo a aminoácidos definidos na cadeia de TCR. Por exemplo, resíduos de asparagina ou resíduos de serina/treonina são locais bem conhecidos para ligação de oligossacarídeos. A situação de glicosilação de uma determinada proteína depende de vários fatores, incluindo a sequência da proteína, a conformação da proteína e a disponibilidade de certas enzimas. Além disso, a situação de glicosilação (isto é, tipo de oligossacarídeo, ligação covalente e número total de ligações) pode influenciar a função da proteína. Portanto, ao produzir proteínas recombinantes, frequentemente é desejável controlar a glicosilação. A glicosilação controlada tem sido usada para melhorar a terapêutica baseada em anticorpos. (Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226 a 34.). Para as porções de TCR das moléculas da invenção, a glicosilação pode ser controlada, usando linhas de células específicas, por exemplo (que inclui, porém sem limitação, a linhas de células de mamíferos, como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de rim embrionário humano (HEK)), ou por modificação química. Essas modificações podem ser desejáveis, uma vez que a glicosilação pode melhorar a farmacocinética, reduzir a imunogenicidade e simular mais de perto uma proteína humana nativa (Sinclair e Elliott, (2005) Pharm Sci.Ago; 94 (8): 1.626 a 1.635).
[0071] Para administração a pacientes, as moléculas da invenção (de preferência associadas a um marcador detectável ou agente terapêutico), ácidos nucleicos, vetores de expressão ou células da invenção podem ser fornecidos como parte de uma composição farmacêutica estéril juntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes. Essa composição farmacêutica pode estar em qualquer forma adequada (dependendo do método desejado de administração a um paciente). A mesma pode ser fornecida na forma de dosagem unitária, geralmente será fornecida em um recipiente vedado e pode ser fornecida como parte de um kit. Esse kit normalmente (embora não necessariamente) incluiria instruções de uso. O mesmo pode incluir uma pluralidade das ditas formas de dosagem unitária.
[0072] A composição farmacêutica pode ser adaptada para administração por qualquer via apropriada, tal como parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intratecal ou intravenosa), enteral (incluindo oral ou retal), inalação ou vias intranasais. Tais composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica de farmácia, por exemplo, misturando-se o ingrediente ativo com o veículo (ou veículos) ou excipiente (ou excipientes) em condições estéreis.
[0073] As dosagens das moléculas da presente invenção podem variar entre limites amplos, dependendo da doença ou distúrbio a ser tratado, da idade e condição do indivíduo a ser tratado, etc. uma faixa de dose adequada para uma molécula da invenção pode ser na faixa de 25 ng/kg a 50 µg/kg ou 1 µg a 1 g. Em última análise, um médico determinará as dosagens apropriadas a serem usadas.
[0074] Polipeptídeos de ligação a antígeno de múltiplos domínios, composições farmacêuticas, vetores, ácidos nucleicos e células da invenção podem ser fornecidos na forma substancialmente pura, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% pura.
[0075] Também fornecidos pela invenção são:
[0076] • Polipeptídeo de ligação a antígeno de múltiplos domínios, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula da invenção para uso em medicina, de preferência para uso em um método de tratamento de câncer ou tumor;
[0077] • o uso de um polipeptídeo de ligação a antígeno de múltiplos domínios, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer ou tumor;
[0078] • um método de tratamento de câncer ou tumor em um paciente, que compreende a administração ao paciente de um polipeptídeo de ligação a antígeno de múltiplos domínios, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula da invenção;
[0079] • uma formulação injetável para administração a um sujeito humano que compreende um polipeptídeo de ligação a antígeno de múltiplos domínios, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula da invenção.
[0080] O método de tratamento pode incluir ainda a administração separadamente, em combinação ou sequencialmente, de um agente antineoplásico adicional. Exemplos de tais agentes são conhecidos na técnica e podem incluir agentes de ativação imunológica e/ou agentes moduladores de células T.
[0081] As características preferenciais de cada aspecto da invenção são como para cada um dos outros aspectos mutatis mutandis. Os documentos da técnica anterior mencionados no presente documento são incorporados por referência em toda a extensão permitida por lei.
[0082] A Figura 1 A) Projeto da proteína de fusão TCR-antiCD3-Fc; B) Sequência exemplificativa de uma proteína de fusão TCR-antiCD3-Fc da invenção
[0083] A Figura 2 mostra que uma fusão TCR-antiCD3 que incorpora um domínio Fc é capaz de mediar a ativação de células T na presença de células-alvo positivas para o antígeno. Os dados para três fusões IgG1-Fc são mostrados.
[0084] A Figura 3 A) mostra que uma fusão TCR- antiCD3 que incorpora um peptídeo de ligação à albumina é capaz de mediar a ativação de células T na presença de células-alvo positivas para o antígeno. Três formatos são mostrados em que o peptídeo de ligação à albumina está ligado a C-alfa (F1), N- alfa (F2) ou C-beta (F3). B) mostra que uma fusão TCR-antiCD3 que incorpora um nanocorpo de ligação à albumina é capaz de mediar a ativação de células T na presença de células-alvo positivas para o antígeno. Dois formatos são mostrados em que o peptídeo de ligação à albumina é anexado a C-alfa (R) ou C- beta (Y). C) mostra que uma fusão TCR-antiCD3 que incorpora um anticorpo de domínio de ligação à albumina (Albudab®) é capaz de mediar a ativação de células T na presença de células-alvo positivas para o antígeno. É mostrado um formato em que o Albudab® está fixado a C-alfa da fusão TCR-antiCD3.
[0085] A Figura 4 A) Mostra as características PK da fusão TCR-antiCD3-Albudab® em soro de camundongo e B) mostra PK teórica em humanos para uma avaliação baseada na fusão TCR- antiCD3-Albudab® em camundongos.
[0086] Os exemplos a seguir descrevem moléculas de ligação de múltiplos domínios da invenção, que podem ser denominadas como proteínas de fusão TCR-antiCD3-Fc ou proteínas de fusão de ligação à albumina TCR-antiCD3. EXEMPLO 1 (FC FUSÃO) A) PROJETO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO TCR-ANTICD3-FC
[0087] Neste exemplo, foi usada uma proteína de fusão TCR-antiCD3 que compreende um TCR de alta afinidade que se liga a um peptídeo restrito a HLA-A*02 de PRAME. Exemplos de tais moléculas são fornecidos no documento WO2018234319.
[0088] O domínio Fc de IgG1 humana foi fusionado através de um ligante ao terminal C do TCR-antiCD3 (consultar a Figura 1A para esquema). Outros dois construtos foram feitos compreendendo variantes funcionais de Fc de IgG1 humana que são conhecidas na técnica. A variante 1 não se liga aos receptores Fcγ (FcγRs) ou complementam a proteína C1q e, portanto, é funcionalmente silenciosa. A variante 2 mostra aumento na ligação a FcRn, o que pode resultar em meia-vida in vivo estendida. Em cada caso, o domínio Fc compreende botões conhecidos em mutações de orifícios Y86T e T22Y para facilitar a heterodimerização.
[0089] A Figura 1B mostra a sequência de uma fusão TCR-anti-CD3-Fc que compreende um Fc de IgG1 humana funcionalmente silencioso (Variante 1) B) EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO TCR-
ANTICD3-FC
[0090] A expressão de fusões de Fc foi realizada com o uso de um sistema de expressão temporário com base em células de ovário de hamster chinês (CHO) adaptadas à suspensão (sistema de expressão ExpiCHO, Thermo Fisher). As células foram transfectadas de acordo com as instruções do fabricante, com o uso de plasmídeos de expressão de mamíferos contendo as cadeias de TCR relevantes fusionadas a vários domínios Fc de Ig. Após a colheita, os sobrenadantes da cultura celular foram clarificados por centrifugação das células a 4000 - 5000 x g por 30 minutos em uma centrífuga refrigerada. Os sobrenadantes foram filtrados através de um filtro de 0,22 µm e coletados para purificação adicional.
[0091] Para purificação, as fusões Fc foram primeiro ajustadas com tampão antes de serem purificadas com o uso de colunas mAbselect Sure pré-embaladas (GE Healthcare ou resinas equivalentes), de acordo com as diretrizes do fabricante. As frações contendo proteínas específicas foram agrupadas e posteriormente purificadas por cromatografia de exclusão de tamanho usando colunas apropriadas (GE Healthcare) em tampões fisiologicamente relevantes. As frações contendo proteínas específicas foram agrupadas e concentradas para teste e armazenamento a jusante. C) ATIVAÇÃO POTENTE DE CÉLULAS T POR PROTEÍNAS DE FUSÃO TCR-ANTICD3-FC
[0092] As proteínas de fusão TCR-antiCD3-Fc foram avaliadas quanto à sua capacidade de mediar o redirecionamento potente de células T CD3+ contra células T2 que apresentam antígeno. A liberação de interferon-γ (IFN-γ) foi usada como uma leitura para a ativação de células T.
[0093] Os ensaios foram realizados usando um kit IFN-γ ELISPOT humano (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células T2 foram utilizadas como células-alvo e pulsadas com 5 nM de peptídeo PRAME. As células-alvo foram preparadas a uma densidade de 1x106/ml em meio de ensaio (RPMI 1640 contendo 10% de FBS inativado por calor e 1% de penicilina-estreptomicina-L- glutamina) e plaqueadas a 50.000 células por poço em um volume de 50 μl. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC), isoladas de sangue de doador fresco, foram utilizadas como células efetoras e plaqueadas a 35.000 células por poço em um volume de 50 μl. As proteínas de fusão TCR-antiCD3-Fc foram tituladas para concentrações finais entre 10 nM e 0,0001 nM e adicionadas ao poço em um volume de 50 μl.
[0094] As placas foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Os poços contendo células-alvo, células efetoras e proteínas de fusão foram feitos até um volume final de 200 μl com meio de ensaio. Todas as reações foram realizadas em triplicado. Os poços de controle também foram preparados com a omissão de proteína de fusão, células efetoras ou células-alvo. As placas foram incubadas de um dia para o outro (37 ºC/5% CO2). No dia seguinte, as placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (1x sachê de PBS, contendo 0,05% de Tween-20, feito em água desionizada). O anticorpo de detecção primária foi então adicionado a cada poço em um volume de 50 μl. As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 2 horas antes de serem lavadas novamente três vezes. A detecção secundária foi realizada adicionando 50 μl de estreptavidina-HRP diluída a cada poço e incubando em temperatura ambiente por 1 hora e a etapa de lavagem repetida. Não mais do que 15 minutos antes do uso, uma gota (20 μl) de cromogênio AEC foi adicionada a cada 1 ml de substrato AEC e misturado e 50 μl adicionado a cada poço. O desenvolvimento de manchas foi monitorado regularmente e as placas foram lavadas em água da torneira para encerrar a reação de desenvolvimento. As placas foram então deixadas secar em temperatura ambiente por pelo menos 2 horas antes da contagem das manchas com o uso de um analisador CTL com software Immunospot (Cellular Technology Limited). Os dados foram preparados e analisados com uso do software PRISM.
[0095] Os resultados apresentados na Figura 2 demonstram que as proteínas de fusão TCR-antiCD3-Fc medeiam a ativação efetiva das células T na presença de células-alvo positivas para o antígeno. Os valores Ec50 estavam na faixa de pM (238 pM 257 pM e 25 pM, respectivamente, para fusões com IgG1-Fc, IgG1-Fc-variante1 e IgG1-Fc-variante2, respectivamente). Experimentos de controle com células-alvo negativas para o antígeno demonstraram que a IgG1-variante2 funcionalmente silenciosa deu atividade de fundo insignificante. Domínios Fc funcionalmente silenciosos foram, portanto, considerados mais preferenciais para uso terapêutico. EXEMPLO 2 (LIGAÇÃO À ALBUMINA) A) PROJETO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DE LIGAÇÃO À ALBUMINA TCR-ANTICD3
[0096] Em um primeiro projeto, a proteína de fusão TCR-antiCD3 compreendida de um TCR de alta afinidade que se liga a um peptídeo restrito a HLA-A*02 de gp100. A sequência de aminoácidos de tais moléculas é revelada no documento WO2011001152. Especificamente, a fusão TCR-antiCD3 compreendida da cadeia alfa de SEQ ID No: 45 do documento WO2011001152, em que os aminoácidos 1-109 são substituídos pela SEQ ID No. 8 do documento WO2011001152 e o aminoácido na posição 1 é A, com base na numeração de SEQ ID No: 45; e uma cadeia beta de SEQ ID No: 36 do documento WO2011001152, em que os resíduos 259-370 correspondem a SEQ ID No. 27 do documento WO2011001152, os aminoácidos nas posições 1 e 2 são A e I respectivamente. Peptídeo de ligação à albumina com a sequência de aminoácidos (conforme descrito em Dennis et al., J Biol Chem. 2002 Set 20;277(38):35035-43) foi fixado à fusão TCR-antiCD3 por meio de um ligante. Um ligante adequado é . Três variantes foram preparadas nas quais o peptídeo de ligação à albumina foi fusionado em três locais de fixação diferentes: C-alfa (F1), N-alfa (F2) ou C-beta (F3).
[0097] Em um segundo projeto, um nanocorpo de ligação à albumina foi fixado à mesma fusão TCR-antiCD3 como usado no primeiro projeto. Um nanocorpo de ligação à albumina com a sequência de SEQ ID No: 52 no documento WO2006122787 foi fixado à fusão TCR-antiCD3 por meio de um ligante. Um ligante adequado é . Duas variantes foram preparadas em que o nanocorpo de ligação à albumina foi fusionado em dois locais de fixação diferentes: C-alfa (R) ou C-beta (Y).
[0098] Em um terceiro projeto, um anticorpo de domínio de ligação à albumina foi fixado ao terminal C da cadeia alfa de fusão TCR-antiCD3. O anticorpo pertence à plataforma Albudab®. Duas variantes do anticorpo de domínio foram usadas; DOM 7h-10-14 dAb e DOM 7h-11-15 dAb, fornecidos pelas SEQ ID Nos: 26 e 27 respectivamente no documento WO201010893. O anticorpo foi fixado por meio de um ligante e diretamente (isto é, sem um ligante). Um ligante adequado é
. A proteína de fusão TCR-antiCD3 compreendida um TCR de alta afinidade que se liga a um peptídeo restrito a HLA-A*01 de MAGEA3. As sequências de aminoácidos de tais moléculas são fornecidas no documento WO2013041865. B) EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DE LIGAÇÃO À ALBUMINA TCR-ANTICD3
[0099] Proteínas de fusão de ligação à albumina TCR-antiCD3 foram expressas em E. coli como corpos de inclusão e subsequentemente redobradas e purificadas, com o uso da mesma metodologia conhecida na técnica para proteínas de fusão TCR- antiCD3 (por exemplo, consultar o documento WO2011001152, exemplo 2) C) ATIVAÇÃO POTENTE DE CÉLULAS T POR PROTEÍNAS DE FUSÃO DE LIGAÇÃO À ALBUMINA TCR-ANTICD3
[0100] Proteínas de fusão de ligação à albumina TCR-antiCD3 foram avaliadas quanto à sua capacidade de mediar o redirecionamento potente de células T CD3+ contra células cancerígenas positivas para antígeno. A liberação de interferon-γ (IFN-γ) foi usada como uma leitura para a ativação de células T.
[0101] Os ensaios foram realizados com o uso de um kit ELISPOT IFN-γ humano (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, para as fusões que compreendem o peptídeo de ligação à albumina, células de melanoma Mel526 foram usadas como células-alvo. As células- alvo foram preparadas a uma densidade de 1x106/ml em meio de ensaio (RPMI 1640, mais 150 µM de albumina de soro humano (HSA) e 1% de penicilina-estreptomicina-L-glutamina) e plaqueadas a
50.000 células por poço em um volume de 50 μl. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC), isoladas de sangue de doador fresco, foram utilizadas como células efetoras e plaqueadas a 30.000 células por poço em um volume de 50 μl. As proteínas de fusão TCR-antiCD3-Fc foram tituladas para concentrações finais entre 10 nM e 0,0001 nM e adicionadas ao poço em um volume de 50 μl.
[0102] Para fusões que compreendem Albudab®, células EJM de mieloma foram usadas como células-alvo. As células-alvo foram preparadas a uma densidade de 1x106/ml em meio de ensaio (RPMI 1640, mais 45 µM de albumina de HSA e 1% de penicilina-estreptomicina-L-glutamina) e plaqueadas a
50.000 células por poço em um volume de 50 μl. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC), isoladas de sangue de doador fresco, foram utilizadas como células efetoras e plaqueadas a 30.000 células por poço em um volume de 50 μl. As proteínas de fusão TCR-antiCD3-Fc foram tituladas para concentrações finais entre 10 nM e 0,0001 nM e adicionadas ao poço em um volume de 50 μl.
[0103] As placas foram preparadas e desenvolvidas conforme descrito no Exemplo 1c
[0104] A Figura 3A-C mostra que a fusão de uma porção química de ligação à albumina a uma proteína de fusão TCR-antiCD3 medeia a ativação de células T eficaz na presença de células-alvo positivas para antígeno. Os valores Ec50 estavam na faixa de pM (137,4/178,0/137,1) EXEMPLO 3 (MEIA-VIDA ESTENDIDA) A) AVALIAÇÃO DE PK DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DE LIGAÇÃO À ALBUMINA TCR-ANTICD3
[0105] As características PK das fusões TCR- antiCD3-AlbudAb foram investigadas em soro de camundongo.
[0106] Os camundongos receberam uma dose de 0,1 mg/kg de proteína de fusão por injeção intravenosa em bolus e as amostras de soro foram coletadas em intervalos regulares durante um período de 120 horas. A avaliação de PK foi realizada usando um ensaio com base em ELISA. Em resumo, o complexo de pHLA biotinilado foi fixado a placas revestidas com estreptavidina e as amostras de soro foram então adicionadas. Uma etapa de detecção foi realizada com o uso de um anticorpo de cabra primário contra scFv anti-CD3 e um IgG anti-cabra conjugado com HRP ativado para detecção colorimétrica com TMB a 450 nm. Os resultados gerados foram usados para confirmar a presença e atividade de ligação da fusão TCR-antiCD3-Albudab com o uso de uma série de diluição e análise contra uma curva padrão. Os resultados são relatados como % de atividade e usados para gerar um gráfico de Cmax ao longo do tempo.
[0107] Os dados de PK resultantes são mostrados na Figura 4A. Observe que as amostras denotadas 'TCR-Alb (10- 14)' e 'TCR-Alb (11-15)' referem-se às fusões TCR-antiCD3 descritas no Exemplo 2a. 'TCR-Alb (D)' é uma amostra de controle fusionada a um Albudab de ligação sem albumina, e 'TCR' refere-se ao TCR-antiCD3 sem Albudab.
[0108] Os dados de PK da Figura 4A foram usados para calcular um perfil de PK teórico para fusões TCR-antiCD3- AlbudAb em humanos (Figura 4B). A fusão para Albudab está previsto para estender in vivo a meia-vida a partir de 7 h a 264 h.
Claims (17)
1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS caracterizada por compreender: i) uma porção química de ligação do complexo principal de histocompatibilidade de peptídeos (pMHC) ligada a uma célula T que envolve o efetor imune; e ii) um domínio de extensão de meia-vida, que compreende uma imunoglobulina Fc ou um domínio de ligação à albumina.
2. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela porção química de ligação de pMHC ser um receptor de células T (TCR) ou anticorpo semelhante a TCR, que compreende TCR e/ou domínios variáveis de anticorpo e pelo menos um domínio constante.
3. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo TCR ser um par de polipeptídeo TCR alfa/beta heterodimérico.
4. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo TCR ser um polipeptídeo TCR alfa/beta de cadeia única.
5. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo domínio efetor imune que envolve células T ser um domínio efetor de CD3 que ativa uma célula T através da interação com CD3 e/ou complexo TCR/CD3.
6. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo domínio efetor de CD3 compreender um anticorpo scFv ou arcabouço semelhante a anticorpo.
7. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo domínio de extensão de meia-vida ser um domínio Fc de imunoglobulina.
8. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo domínio de extensão de meia-vida compreender um domínio de ligação à albumina.
9. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo domínio de prolongamento da meia-vida estar ligado ao terminal C ou N da porção química de ligação de pMHC ou ao terminal C ou N do efetor imune que envolve células T.
10. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo domínio de prolongamento da meia-vida estar ligado à porção química de ligação de pMHC ou ao efetor imune que envolve células T por meio de um ligante.
11. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por ser para uso como um medicamento.
12. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender a molécula de ligação de múltiplos domínios, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
13. ÁCIDO NUCLEICO caracterizado por codificar a molécula de ligação de múltiplos domínios, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
14. VETOR DE EXPRESSÃO caracterizado por compreender o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 13.
15. CÉLULA HOSPEDEIRA que compreende o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 13 ou o VETOR de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo ácido nucleico que codifica a molécula de ligação de múltiplos domínios estar presente como um único quadro de leitura aberto ou dois quadros de leitura abertos distintos, que codificam a cadeia alfa e a cadeia beta, respectivamente.
16. MÉTODO DE PRODUÇÃO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE MÚLTIPLOS DOMÍNIOS, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender a manutenção da célula hospedeira, como definida na reivindicação 15, sob condições opcionais para a expressão do ácido nucleico e o isolamento do polipeptídeo de ligação ao antígeno de múltiplos domínios.
17. MÉTODO DE TRATAMENTO caracterizado por compreender a administração da molécula de ligação de múltiplos domínios, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou da composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 12, a um paciente em necessidade das mesmas.
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