KR20210010896A - 이기능성 결합 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 pMHC 결합 모이어티 및 PD-1 작용제를 포함하는 이기능성 결합 폴리펩타이드를 제공한다.

Description

이기능성 결합 폴리펩타이드
PD-1 경로는 면역계에서 억제 및 자극 신호 간의 균형을 조절하는데 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. PD-1 경로의 활성화는 면역 활성을 하향조절하여 말초 면역 관용성을 촉진시키고 자가면역을 방지한다 (참조: Keir et al., Annu Rev Immunol, 26:677-704, 2008; Okazaki et al., Int Immunol 19:813-824, 2007). PD-1은 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하는, 활성화된 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 막관통 수용체 단백질이다 (참조: Agata et al., Int Immunol 8:765-772, 1996). PD-1의 세포질 꼬리는 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다. PD-L1 및 PD-L2는 PD-1의 자연 리간드이고 항원 제시 세포의 표면 상에서 발현된다 (참조: Dong et al., Nat Med., 5:1365-1369, 1999; Freeman et al., J Exp Med 192:1027-1034, 2000; Latchman et al., Nat Immunol 2:261-268, 2001). 리간드 결합시, 포스파타제는 PD-1의 ITIM 영역으로 동원되어 TCR-매개된 신호전달을 억제함에 이어서 림프구 증식, 사이토킨 분비 및 세포독성 활성을 감소시킨다. PD-1은 또한 동시-자극으로부터의 생존 신호를 억제하는 이의 능력을 통해 T 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있다 (참조: Keir et al., Annu Rev Immunol, 26:677-704, 2008).
자가면역을 제어하는데 있어서 PD-1 경로의 중추 역할은 PD-1 녹아웃 마우스가 후기-발병 진행성 관절염, 루프스 유사 사구체신염 및 자가면역 심근병증을 발병한다는 관찰에 의해 처음으로 입증되었다 (참조: Nishimura et al., Immunity 11:141-151, 1999; Nishimura et al., Science 291: 319-322, 2001). 추가로, 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스에서 PD-1 결핍의 도입은 당뇨병의 발생률을 상당히 가속화시키고, 모든 마우스에서 10주령까지 당뇨병의 발병을 유도한다 (참조: Wang et al., PNAS 102:11823-11828, 2005). 인간에서도 PD-1은 유사한 조절 기능을 보여주는 것으로 나타난다. PD-1 유전자 내 단일 뉴클레오타이드 다형태는 다양한 자가면역 질환과 연관되어 있고, 이는 홍반성 낭창, 다발성 경화증, I형 당뇨병, 류마티스 관절염 및 그레이브씨 질환을 포함하고 (참조: Prokunina et al., Arthritis Rheum 50:1770, 2004; Neilson et al., Tissue Antigens 62:492, 2003; Kroner et al., Ann Neurol 58:50, 2005; Okazaki et al., Int Immunol 19:813-824, 2007); PD-1 경로의 교란은 다른 면역 질환에서도 보고되었다 (참조: Kobayashi et al., J Rheumatol 32:215, 2005; Mataki et al., Am J Gastroenterol 102:302, 2007). 결과적으로, 길항성 항체에 의한 PD-1 경로의 차단은 암 환자에서 자가면역 부작용과 연관되어 있다 (참조: Michot et al., Eur J Cancer 54:139-148, 2016).
PD-1 경로의 활성화를 유도하는 치료학적 전략은 자가면역 병태의 치료를 위한 전망있는 접근법을 제공한다. 예를 들어, PD-L1을 과발현하는 인공 수지상 세포는 마우스 모델에서 실험 자가면역 뇌척수염의 척수 염증 및 임상 중증도를 감소시키는 것으로 나타났다 (참조: Hirata et al., J Immunol 174:1888-1897, 2005). 추가로 동시-자극 분자의 차단을 수반하는, PD-L1을 발현하는 재조합 아데노바이러스는 BXSB 마우스에서 낭창성 신염을 예방하는 것으로 나타났다 (참조: Ding et al., Clin Immunol 118:258-267, 2006). 다수의 PD-1 작용제 항체는 인간에서 다양한 자가면역 질환의 치료를 위해 개발되었다(예를 들어, 참조: WO2013022091, WO2004056875, WO2010029435, WO2011110621, WO2015112800). 그러나, 상기 시약의 개발에도 불구하고, 가용성 제제가 PD-1 신호전달을 촉발시키는데 효율적임을 시사하는 증거가 거의 없었고, 본 발명자의 견해로는 단지 하나의 상기 분자가 건선의 치료를 위한 임상 시험에 들어갔다 (참조: NCT03337022). PD-1 작용제의 투여는 또한 질환 부위로부터 원위에서 전신 면역 효과를 촉발하여 임상 독성을 유도한다는 잠재력을 갖는다. 따라서, 자가면역 질환의 치료를 위해 보다 안전하고 보다 효과적인 PD-1 작용제 치료요법이 요구된다.
본 발명자들은 놀랍게도 펩타이드-MHC 결합 모이어티에 융합된 PD-1 작용제를 포함하는 분자가 PD-1 신호전달의 효율적인 억제를 유도함을 밝혔다.
특정 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 T 세포 활성화의 효율적인 억제가 면역 시냅스에 대한 PD-1 작용제의 국소화를 요구하는 것으로 가정한다. TCR 또는 TCR-유사 항체와 같은 질환-특이적 펩타이드-MHC에 결합하는 모이어티로의 PD-1 작용제의 접착은 상기 작용제를 면역 시냅스로 유도하여 PD-1 경로를 조절하기 위한 보다 안전하고 보다 강력한 전략을 제공한다.
T 세포 수용체 (TCR)는 자연적으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 발현된다. TCR은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자와 복합체화된 항원 제시 세포의 표면상에 나타나는 짧은 펩타이드 항원을 인식하도록 디자인된다(인간에서, MHC 분자는 인간 백혈구 항원 또는 HLA로도 알려져 있다) (참조: Davis, et al., (1998), Annu Rev Immunol 16: 523-544.). 또한 세포독성 T 세포로서 호칭되는 CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I에 결합된 펩타이드를 특이적으로 인식하고 일반적으로 감염되거나 암세포의 파괴를 찾아서 매개하는데 관여한다.
면역치료학적 사용을 위한 TCR은 표적 항원을 강하게 인식하는 것이 바람직할 수 있고, 이는 TCR이 강력한 반응을 발휘하기 위해 표적 항원에 대해 고친화성 및/또는 긴 결합 반감기를 가져야만 함을 의미한다. 이들이 자연에 존재하는 바와 같이, TCR은 전형적으로 표적 항원에 대해 낮은 친화성 (낮은 마이크로몰 범위)을 갖고, 따라서 항원 결합을 개선시키기 위해 소정의 TCR 서열에 주어질 수 있는, 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하되 이에 제한되지 않는 돌연변이를 확인하는 것이 종종 필요하다. 가용성 표적화제로서 사용하기 위해서는 나노몰 내지 피코몰 범위의 TCR 항원 결합 친화성 및 수시간의 결합 반감기가 바람직할 수 있다. 또한, 치료학적 TCR이 임상 적용에서 오프-표적 결합으로부터 비롯되는 독성의 위험성을 완화시키기 위해 표적 항원에 대한 고수준의 특이성을 입증하는 것이 요구될 수 있다. 상기 고특이성은 특히 TCR 항원 인식의 자연적 퇴화를 고려할때 수득하기가 어려울 수 있다 (참조: Wooldridge, et al., (2012), J Biol Chem 287(2): 1168-1177; Wilson, et al., (2004), Mol Immunol 40(14-15): 1047-1055). 결과적으로, 치료학적 TCR은 고도로 안정한 형태로 발현되고 정제될 수 있는 것이 요구될 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 제1 양상으로서 pMHC 결합 모이어티 및 PD-1 작용제를 포함하는 이기능성 결합 폴리펩타이드를 제공한다. pMHC 결합 모이어티는 TCR 가변 도메인 및/또는 항체 가변 도메인을 포함할 수 있다. pMHC 결합 모이어티는 T 세포 수용체(TCR) 또는 TCR-유사 항체일 수 있다. pMHC 결합 모이어티는 이종이량체 알파/베타 TCR 폴리펩타이드 쌍 또는 단일쇄 알파/베타 TCR 폴리펩타이드일 수 있다. PD-1 작용제는 PD-L1의 가용성 세포외 형태 또는 이의 기능성 단편일 수 있고, 상기 PD-L1은 하기의 서열을 포함할 수 있거나 이것으로 이루어질 수 있다: FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPY. PD-1 작용제는 전장 항체 또는 scFv 항체와 같은 이의 단편일 수 있다.
PD-1 작용제는 pMHC 결합 모이어티의 C 또는 N 말단에 융합될 수 있고 링커를 통해 pMHC 결합 모이어티에 융합될 수 있다. 링커는 25개 까지의 아미노산 길이일 수 있다. 바람직하게 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 길이이다.
상기 pMHC 결합 모이어티가 TCR인 경우, TCR은 알파 쇄의 불변 영역과 베타 쇄의 불변 영역 간의 비-고유 디-설파이드 결합을 포함할 수 있고 펩타이드 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 추가의 양상은 원형 탈모증, 강직성 척추염, 아토피성 피부염, 그레이브씨 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 1형 당뇨병 및 백반증 및 염증성 장 질환과 같은 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 제1 양상에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한 제1 양상에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제1 양상에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
추가로, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공되고, 이기능성 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 단일 개방 판독 프레임으로서 또는 각각 TCR의 알파 쇄 및 베타 쇄를 암호화하는 2개의 별개의 개방 판독 프레임으로서 존재할 수 있다.
제1 양상에 따라 이기능성 결합 폴리펩타이드를 제조하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 핵산의 발현을 위한 임의의 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 유지하고 제1 양상의 이기능성 결합 펩타이드를 단리함을 포함한다.
제1 양상에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 장애를 치료하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 제1 양상으로서 pMHC 결합 모이어티 및 PD-1 작용제를 포함하는 이기능성 결합 폴리펩타이드를 제공한다. pMHC 결합 모이어티는 TCR 가변 도메인을 포함할 수 있다. 대안적으로, pMHC 결합 모이어티는 항체 가변 도메인을 포함할 수 있다. pMHC 결합 모이어티는 T 세포 수용체(TCR) 또는 TCR-유사 항체일 수 있다.
TCR 서열은 대부분 일반적으로 TCR 분야에서 광범위하게 공지되어 있고 상기 연구에 접근가능한 IMGT 명명법을 참조로 기재된다. 예를 들어, 하기를 참조한다: LeFranc and LeFranc, (2001). “T cell Receptor Factsbook”, Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10; and Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266. 간단히 말해서, αβ TCR은 2개의 디설파이드 연결된 쇄로 이루어진다. 각각의 쇄 (알파 및 베타)는 일반적으로 2개의 도메인, 즉, 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로서 간주된다. 짧은 연결 영역은 가변 및 불변 도메인을 연결하고 일반적으로 알파 가변 영역의 일부로 간주된다. 추가로, 베타 쇄는 일반적으로, 연결 영역 다음에 위치한 짧은 다양한 영역을 포함하며, 이는 일반적으로 베타 가변 영역의 일부로 간주된다.
각각의 쇄의 가변 도메인은 N-말단에 위치하고 프레임워크 서열 (FR)에 매립된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 상기 CDR은 펩타이드-MHC 결합을 위한 인식 부위를 포함한다. 알파 쇄 가변 (Vα) 영역을 암호화하는 여러 유전자 및 베타 쇄 가변 (Vβ) 영역을 암호화하는 여러 유전자가 있고, 이들은 이들의 프레임워크, CDR1 및 CDR2 서열, 및 부분적으로 한정된 CD3 서열에 의해 구분된다. Vα 및 Vβ 유전자는 IMGT 명명법에 따라 각각 접두사 TRAV 및 TRBV에 의해 언급된다 (참조: Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), “T cell Receptor Factsbook”, Academic Press). 또한, 알파 및 베타 쇄 각각에 대해 TRAJ 또는 TRBJ로 호칭되는 여러 연결 또는 J 유전자가 있고 베타 쇄에 대해서 TRBD로 호칭되는 다양성 또는 D 유전자가 있다 (참조: Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), “T cell Receptor Factsbook”, Academic Press). T 세포 수용체 쇄의 거대한 다양성은 대립유전자 변이체 및 접합 다양성을 포함하는, 다양한 V, J 및 D 유전자 간의 조합 재정렬로부터 비롯된다 (참조: Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107.) TCR 알파 및 베타 쇄의 불변 또는 C 영역은 각각 TRAC 및 TRBC로서 언급된다 (참조: Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10).
상기 pMHC 결합 모이어티가 TCR인 경우, 상기 TCR은 비자연적으로 발생하고/하거나 정제되고/되거나 가공될 수 있다. 하나 초과의 돌연변이가 고유 TCR에 비해 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 베타 쇄 가변 도메인에 존재할 수 있다. 돌연변이는 바람직하게 CDR 영역 내에서 이루어진다. 상기 돌연변이(들)는 전형적으로 특이적 펩타이드 항원 HLA 복합체에 대한 결합 모이어티 (예를 들어, TCR)의 결합 친화성을 개선시키기 위해 도입된다.
pMHC 결합 모이어티는 TCR-유사 항체일 수 있다. TCR-유사 항체는 당업계에서 MHC에 의해 제시된 펩타이드 항원에 대한 TCR-유사 특이성이 부여되고 일반적으로 고유 TCR 보다 항원에 대해 보다 높은 친화성을 갖는 항체 분자에 대해 사용되는 용어이다. (참조: Dahan et al., Expert Rev Mol Med 14:e6, 2012). 이러한 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 이의 각각은 가변 영역 및 불변 영역을 포함한다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이 scFv, Fab 단편 등과 같은 상기 항체의 기능성 단편들이 본 발명에 포함된다.
본 발명의 이기능성 결합 폴리펩타이드는 특이적 펩타이드 항원-MHC 복합체에 결합하는 성질을 갖는다. 본 발명의 폴리펩타이드와 관련된 특이성은 펩타이드 항원-MHC 복합체를 제시하지 않는 표적 세포를 인식하는 최소한의 능력을 가지면서 펩타이드 항원-MHC 복합체를 제시하는 표적 세포를 인식하는 능력에 관한 것이다.
본 발명의 이기능성 결합 폴리펩타이드는 치료학적 시약으로서 사용하기 위해 이상적인 안전성 프로필을 가질 수 있다. 이상적인 안전성 프로필은 양호한 특이성을 입증하는 것 뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩타이드가 추가의 임상전 안전성 시험을 통과할 수 있음을 의미한다. 이러한 시험의 예는 또 다른 HLA 유형의 인식에 대해 낮은 가능성을 확인하기 위해 동종이계반응 시험을 포함한다.
본 발명의 이기능성 결합 폴리펩타이드는 고수율 정제가 가능할 수 있다. 수율은 정제 공정 동안에 보유된 물질의 양 (즉, 재폴딩 전에 수득된 가용화된 물질의 양에 상대적으로 정제 공정 종료 시점에 수득된 올바르게 폴딩된 물질의 양)을 기준으로 결정될 수 있고, 또는 수율은 본래의 배양 부피에 상대적으로 정제 공정 종료 시점에 수득된 올바르게 폴딩된 물질의 양을 기준으로 할 수 있다. 고수율은 1% 이상, 또는 보다 바람직하게 5% 이상, 또는 더 높은 수율을 의미한다. 고수율은 1 mg/ml 이상, 또는 보다 바람직하게 3 mg/ml 이상, 또는 5 mg/ml, 또는 더 높은 수율을 의미한다.
본 발명의 이기능성 결합 폴리펩타이드는 펩타이드 항원 및 PD-1에 대해 적합한 결합 친화성을 갖는다. 결합 친화성 (평형 상수 KD에 역비례하는) 및 결합 반감기 (T½으로서 표현되는)를 결정하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 구현예에서, 결합 친화성 및 결합 반감기는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 또는 바이오-층 간섭계 (BLI)를 사용하여 예를 들어, 각각 BIAcore 장비 또는 Octet 장비를 사용하여 결정된다. 결합 폴리펩타이드 친화성의 2배 증가는 KD를 절반으로 반감시키는 것으로 인식된다. T½는 ln2를 오프-속도 (koff)로 나누어 계산한다. 따라서, T½의 2배 증가는 koff를 반으로 절감시킨다. KD 및 koff 값은 일반적으로 가용성 형태의 폴리펩타이드에 대해 측정된다. 독립적 측정 사이의 변화 및 특히 20시간 초과의 해리 시간과의 상호작용을 설명하기 위해, 소정의 폴리펩타이드의 결합 친화성 및 또는 결합 반감기는 동일한 검정 프로토콜 및 취해진 결과의 평균값을 사용하여 수회, 예를 들어 3회 이상 측정될 수 있다. 2개의 샘플 (2개의 상이한 폴리펩타이드 및 또는 동일한 폴리펩타이드의 2개의 제제)을 비교하기 위해, 동일한 검정 조건 (예를 들어, 온도)을 사용하여 측정되는 것이 바람직할 수 있다.
pMHC 결합 모이어티가 TCR 가변 도메인을 포함하는 본 발명의 이기능성 결합 폴리펩타이드에 대해, 도메인은 α 및 β 가변 도메인일 수 있다. pMHC 결합 모이어티가 TCR인 경우, 상기 TCR은 αβ 이종이량체일 수 있다. 특정 경우에, pMHC 결합 모이어티는 γ 및 δ TCR 가변 도메인을 포함한다. pMHC 결합 모이어티가 TCR인 경우, 상기 TCR은 γδ 이종이량체일 수 있다.
본 발명의 pMHC 결합 모이어티는 세포외 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 na 세포외 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 불변 도메인은 막관통 및 세포질 도메인이 존재하지 않도록 절단될 수 있다. 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 고유 TRAC 및/또는 TRBC1/2 서열에 비해 돌연변이, 치환 또는 결실을 함유할 수 있다. 용어 TRAC 및 TRBC1/2은 또한 자연의 다형태 변이체, 예를 들어, TRAC의 4번 위치에서 N에서 K로의 변이체를 포함한다 (참조: Bragado et al International immunology. 1994 Feb;6(2):223-30).
대안적으로, 전장 또는 절단된 불변 도메인 보다는 TCR 불변 도메인이 부재일 수 있다. 따라서, 본 발명의 pMHC 결합 모이어티는 TCR 알파 및 베타 쇄의 가변 도메인으로 구성될 수 있다.
pMHC 결합 모이어티가 TCR 가변 도메인을 포함하는 경우, 상기 TCR 가변 도메인은 단일쇄 형식, 예를 들어, 단일쇄 TCR일 수 있다. 단일쇄 형식은 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, 또는 Vα-Cα-L-Vβ-Cβ 유형의 αβ TCR 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 여기서, Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 세포외 불변 영역이고 L은 링커 서열이다 (참조: Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. Dec 1;221(1-2):59-76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565-73; WO 2004/033685; WO9918129). 존재하는 경우, 세포외 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 전장일 수 있거나 이들은 절단될 수 있고/있거나 상기된 바와 같이 돌연변이를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 단일쇄 TCR 가변 도메인 및/또는 단일쇄 TCR은 WO 2004/033685에 기재된 바와 같이 각각의 불변 도메인의 잔기들 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 단일쇄 TCR은 추가로 문헌(참조: WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829))에 기재되어 있다.
pMHC 결합 모이어티가 TCR인 본 발명의 이기능성 결합 폴리펩타이드에 대해, 상기 TCR의 알파 및 베타 쇄 불변 도메인 서열은 절단 또는 치환에 의해 변형되어 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이에 고유 디설파이드 결합을 결실시킬 수 있다. 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)은 예를 들어, WO 03/020763에 기재된 바와 같이 각각의 불변 도메인의 잔기 간에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 알파 및 베타 불변 도메인은 TRAC의 Thr 48 위치 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57 위치에서 시스테인 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있고, 상기 시스테인은 TCR의 알파와 베타 불변 도메인 간에 디설파이드 결합을 형성한다. TRBC1 또는 TRBC2는 추가로 불변 도메인의 75번 위치에서 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이 및 불변 도메인의 89번 위치에서 아스파라긴의 아스파르트산으로의 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 αβ 이종이량체에 존재하는 세포외 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 C 말단부 또는 C 말단에서, 예를 들어, 최대 15 개, 또는 최대 10개, 또는 최대 8개 또는 그 미만의 아미노산까지 절단될 수 있다. 본 발명의 αβ 이종이량체에 존재하는 세포외 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 C 말단부 또는 C 말단에서, 예를 들어, 최대 15 개, 또는 최대 10개, 또는 최대 8개의 아미노산까지 절단될 수 있다. 알파 쇄 세포외 불변 도메인의 C 말단부는 8개 아미노산까지 절단될 수 있다.
비-고유 디설파이드 결합은 세포외 불변 도메인 사이에 존재할 수 있다. 상기 비-고유 디설파이드 결합은 추가로 WO03020763 및 WO06000830에 기재되어 있다. 비-고유 디설파이드 결합은 TRAC의 Thr 48 위치와 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57 위치 사이에 있을 수 있다. 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 고유 TRAC 및/또는 TRBC1/2 서열에 비해 하나 이상의 돌연변이 치환 또는 결실을 함유할 수 있다.
pMHC 결합 모이어티가 TCR 가변 도메인을 포함하는 이기능성 결합 폴리펩타이드의 또 다른 바람직한 형식에서, TCR 가변 도메인 및 PD-1 작용제 도메인(들)은 별도의 폴리펩타이드 쇄 상에 번갈아 이량체화를 유도한다. 상기 형식은 WO2019012138에 기재되어 있다. 간략하게, 제1 폴리펩타이드 쇄는 (N 말단에서 C 말단으로) 제1 항체 가변 도메인, 이어서 TCR 가변 도메인, 이어서 임의로 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 제2 쇄는 (N 말단으로부터 C 말단으로) TCR 가변 도메인, 이어서 제2 항체 가변 도메인, 이어서 임의로 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 적당한 길이의 링커임을 고려하면, 상기 쇄는 임의로 Fc 도메인을 포함하는, 다중-특이적 분자로 이량체화한다. 도메인이 상기 방식으로 상이한 쇄에 위치하는 분자는 또한 본원에서 고려되는 디아바디로서 지칭될 수 있다. 추가의 쇄 및 도메인이 첨가되어 예를 들어, 트리아바디를 형성할 수 있다.
따라서, 본원에서는 또한 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 분자 그룹으로부터 선택되는 이중 특이성 폴리펩타이드 분자가 제공되고, 여기서: 상기 제1 폴리펩타이드 쇄는 PD-1 작용제 항체의 가변 도메인 (VD1)의 제1 결합 영역 및 MHC 연합된 펩타이드 에피토프에 특이적으로 결합하는 TCR의 가변 도메인 (VR1)의 제1 결합 영역 및 상기 도메인들을 연결하는 제1 링커 (LINK1)를 포함하고;
상기 제2 폴리펩타이드 쇄는 MHC-연합된 펩타이드 에피토프에 특이적으로 결합하는 TCR의 가변 도메인 (VR2)의 제2 결합 영역, 및 PD-1 작용제 항체의 가변 도메인 (VD2)의 제2 결합 영역, 및 상기 도메인을 연결하는 제2 링커 (LINK2)를 포함하고; 여기서, 상기 제1 결합 영역(VD1) 및 상기 제2 결합 영역(VD2)은 연합하여 제1 결합 부위(VD1)(VD2)를 형성하고; 상기 제1 결합 영역 (VR1) 및 상기 제2 결합 영역(VR2)을 연합하여 상기 MHC-연합된 펩타이드 에피토프에 결합하는 제2 결합 부위(VR1)(VR2)를 형성하고; 여기서, 상기 2개의 폴리펩타이드 쇄는 인간 IgG 힌지 도메인 및/또는 인간 IgG Fc 도메인 또는 이의 이량체화 부분에 융합되고; 여기서, 상기 2개의 폴리펩타이드 쇄는 상기 힌지 도메인 및/또는 Fc-도메인 사이에 공유 및/또는 비-공유 결합에 의해 연결되고; 여기서, 상기 이중 특이성 폴리펩타이드 분자는 동시에 PD-1에 효능작용하고 MHC 연합된 펩타이드 에피토프 및 이중 특이성 폴리펩타이드 분자에 결합할 수 있고, 여기서, 2개의 폴리펩타이드 쇄 중에 배열된 결합 영역은 VD1-VR1 및 VR2-VD2 또는 VD1-VR2 및 VR1-VD2, 또는 VD2-VR1 및 VR2-VD1 또는 VD2-VR2 및 VR1-VD1로부터 선택되고 상기 도메인은 LINK1 또는 LINK2에 의해 연결된다.
PD-1 작용제는 PD-L1 (Uniprot ref: Q9NZQ7) 또는 PD-L2 (Q9BQ51) 또는 이의 기능성 단편의 가용성 세포외 영역에 상응할 수 있다. PD-L1은 하기 제시된 바와 같은 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.
전장 PD-L1은 하기 제시된 서열을 갖는다:
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSY
RQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVV
DPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIF
YCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER
절단된 형태의 PD-L1은 이것이 PD-1에 결합하고 작용하는 능력을 보유한다면 pMHC 결합 모이어티에 융합될 수 있다. 이러한 절단된 단편은 하기의 서열에 제시된 바와 같을 수 있다:
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSY
RQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPY
대안적으로, 보다 짧거나 보다 긴 절단물은 또한 pMHC 결합 모이어티에 융합될 수 있다.
PD-1 작용제는 전장 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, scFv 항체 또는 Fab 단편 또는 나노바디일 수 있다. 상기 항체의 예는 WO2011110621 및 WO2010029434 및 WO2018024237에에 제공된다. 본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편을 포함할 수 있고 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 나노바디 및 상기 임의의 에피토프-결합 단편일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
PD-1 작용제는 pMHC 결합 모이어티의 C 또는 N 말단부에 융합될 수 있고 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 길이일 수 있는 링커를 통해 상기 pMHC 결합 모이어티에 융합될 수 있다. 링커는 10, 12, 15, 16, 18, 20 또는 25개 아미노산 길이일 수 있다. 링커 서열은 반복되어 보다 긴 링커를 형성할 수 있다. 각각의 링커는 보다 짧은 링커 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 반복체 상에 형성될 수 있다. 링커 서열은 일반적으로 가요성이어서 이들은 주로 가요성을 제한할 가능성이 있는 부피가 큰 측쇄를 갖지 않는 글라이신, 알라닌 및 세린과 같은 아미노산으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 보다 큰 강직성을 갖는 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 유용하거나 최적의 길이는 용이하게 결정될 수 있다. 링커는 25개 까지의 아미노산 길이일 수 있다. 흔히 링커 서열은 약 12개 미만, 예를 들어, 10개 미만 또는 2 내지 8개 아미노산 길이이다. 본 발명의 TCR에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: GGGGS, GGGSG, GGSGG, GSGGG, GSGGGP, GGEPS, GGEGGGP, 및 GGEGGGSEGGGS (WO2010/133828에 기재된 바와 같이).
본 발명의 이기능성 결합 폴리펩타이드는 pK 변형 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 면역글로불린 Fc 도메인이 사용되는 경우, 이것은 임의의 항체 Fc 영역일 수 있다. Fc 영역은 세포 표면 Fc 수용체 및 보체계의 일부 단백질과 상호작용하는 항체의 꼬리 영역이다. Fc 영역은 전형적으로 둘 다 2개 또는 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH2, CH3 및 CH4로 호칭되는) 및 힌지 영역을 갖는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 2개의 쇄는 힌지 영역 내 디설파이드 결합에 의해 연결되어 있다. 면역글로불린 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG4로부터의 Fc 도메인은 결합하여 FcRn 매개된 재순환을 진행하여 긴 순환 반감기(3 - 4주)를 부여한다. IgG와 FcRn의 상호작용은 CH2 및 CH3 도메인의 Fc 영역 커버링 부위에 국소화되었다. 본 발명에 사용하기 위해 바람직한 면역글로불린 Fc는 IgG1 또는 IgG4 기원의 Fc 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, Fc 도메인은 인간 서열로부터 유래한다. Fc 영역은 또한 바람직하게 이량체화를 촉진시키는 KiH 돌연변이 및 활성화 수용체와의 상호작용을 방지하기 위한 돌연변이, 즉 기능적으로 사일런트 분자를 포함한다. 면역글로불린 Fc 도메인은 다른 도메인 (즉, TCR 가변 도메인 또는 면역 이펙터)의 C 또는 N 말단부에 융합될 수 있다. 면역글로불린 Fc는 링커를 통해 다른 도메인 (즉, TCR 가변 도메인 또는 면역 이펙터)에 융합될 수 있다. 링커 서열은 일반적으로 가요성이어서 이들은 주로 가요성을 제한할 가능성이 있는 부피가 큰 측쇄를 갖지 않는 글라이신, 알라닌 및 세린과 같은 아미노산으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 보다 큰 강직성을 갖는 링커가 요구될 수 있다. 링커 서열의 유용하거나 최적의 길이는 용이하게 결정될 수 있다. 흔히 링커 서열은 약 12개 미만, 예를 들어, 10개 미만, 또는 2 내지 10개 아미노산 길이이다. 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이일 수 있다. 다중-도메인 결합 분자에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: GGGSGGGG, GGGGS, GGGSG, GGSGG, GSGGG, GSGGGP, GGEPS, GGEGGGP, 및 GGEGGGSEGGGS (WO2010/133828에 기재된 바와 같이). 면역글로불린 Fc가 TCR에 융합되는 경우, 이것은 링커의 유무에 관계없이 알파 또는 베타 쇄에 융합될 수 있다. 추가로, Fc의 개별 쇄들은 TCR의 개별 쇄에 융합될 수 있다.
바람직하게, Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4 서브클래스로부터 유래할 수 있다. 2개의 쇄는 CH2 및 CH3 불변 도메인 및 모든 힌지 영역 또는 일부를 포함할 수 있다. 힌지 영역은 실질적으로 또는 부분적으로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 힌지 영역에 상응할 수 있다. 힌지는 모든 코어 힌지 도메인 또는 일부 및 모든 하부 힌지 영역 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직하게, 힌지 영역은 2개의 쇄를 연결하는 적어도 하나의 디설파이드 결합을 함유한다.
Fc 영역은 WT 서열에 상대적으로 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 상기 돌연변이는 목적할 수 있는 치료학적 성질을 도입할 목적을 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 이종이량체화를 촉진시키기 위해, 크놉 인투 홀 (KiH) 돌연변이는 CH3 도메인으로 가공될 수 있다. 이 경우에, 하나의 쇄는 벌크 돌출 잔기 (즉, 크놉), 예를 들어, Y를 함유하도록 가공되고 다른 하나는 보상 포켓 (즉, 홀)을 함유하도록 가공된 쇄이다. KiH 돌연변이를 위해 적합한 위치는 당업계에 공지되어 있다. 추가로 또는 대안적으로 Fcy 수용체로의 결합을 폐지시키거나 감소시키고 또는 FcRn으로의 결합을 증가시키고/시키거나 Fab 암(arm) 교환을 방지하거나 프로테아제 부위를 제거하는 돌연변이가 도입될 수 있다.
PK 변형 모이어티는 또한 알부민-결합 도메인일 수 있고, 이는 또한 반감기를 연장시키는 작용을 할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 알부민은 부분적으로 이의 크기로 인해 19일의 긴 순환 반감기를 갖고 이는 신장 역치 초과이고 이의 특이적 상호작용 및 FcRn을 통한 재순환에 의한 것이다. 알부민으로의 접착은 생체내 치료학적 분자의 순환 반감기를 개선시키는 널리 공지된 전략이다. 알부민은 특이적 알부민 결합 도메인의 사용을 통해 비공유적으로 또는 접합이나 직접적인 유전학적 융합에 의해 공유적으로 접착될 수 있다. 개선된 반감기를 위해 알부민으로의 접착을 활용한 치료학적 분자의 예는 문헌(참조: Sleep et al., Biochim Biophys Acta. 2013 Dec;1830(12):5526-34)에 기재되어 있다.
알부민-결합 도메인은 임의의 공지된 알부민-결합 모이어티를 포함하는, 알부민에 결합할 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 알부민 결합 도메인은 내인성 또는 외인성 리간드, 작은 유기 분자, 지방산, 알부민에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 단백질로부터 선택될 수 있다. 바람직한 알부민 결합 도메인의 예는 문헌(참조: Dennis et al., J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43)에 기재된 바와 같은 짧은 펩타이드 (예를 들어, 펩타이드 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF); 알부민에 결합하도록 가공된 단백질, 예를 들어, 항체, 항체 단편 및 항체 유사 스캐폴드, 예를 들어, 제조원 (GSK)에 의해 시판되는 Albudab® (O'Connor-Semmes et al., Clin Pharmacol Ther. 2014 Dec;96(6):704-12), 및 제조원 (Ablynx)에 의해 시판되는 Nanobody® (Van Roy et al., Arthritis Res Ther. 2015 May 20;17:135); 및 자연에서 발견되는 알부민 결합 도메인을 기반으로 하는 단백질, 예를 들어, 제조원( Affibody) 에 의해 시판되는 스트렙토코커스 단백질 G 단백질 (참조: Stork et al., Eng Des Sel. 2007 Nov;20(11):569-76).
바람직하게, 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 인간 알부민에 대한 알부민 결합 도메인의 친화성은 피코몰 내지 마이크로몰 범위로 있을 수 있다. 인간 혈청에서 극히 고농도의 알부민(35-50 mg/ml, 대략 0.6 mM)을 고려하여, 실질적으로 모든 알부민 결합 도메인은 생체내 알부민에 결합될 것으로 계산된다.
알부민-결합 모이어티는 다른 도메인 (즉, TCR 가변 도메인 또는 면역 이펙터)의 C 또는 N 말단부에 연결될 수 있다. 알부민-결합 모이어티는 링커를 통해 다른 도메인 (즉, TCR 가변 도메인 또는 면역 이펙터)에 연결될 수 있다. 링커 서열은 일반적으로 가요성이어서 이들은 주로 가요성을 제한할 가능성이 있는 부피가 큰 측쇄를 갖지 않는 글라이신, 알라닌 및 세린과 같은 아미노산으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 보다 큰 강직성을 갖는 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 유용하거나 최적의 길이는 용이하게 결정될 수 있다. 흔히 링커 서열은 약 12개 미만, 예를 들어, 10개 미만 또는 2 내지 10개 아미노산 길이이다. 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 다중-도메인 결합 분자에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: GGGSGGGG, GGGGS, GGGSG, GGSGG, GSGGG, GSGGGP, GGEPS, GGEGGGP, 및 GGEGGGSEGGGS (WO2010/133828에 기재된 바와 같이). 알부민-결합 모이어티가 TCR에 연결되는 경우, 이것은 링커의 유무에 상관없이 알파 또는 베타 쇄에 연결될 수 있다.
본 발명의 추가의 양상은 원형 탈모증, 강직성 척추염, 아토피성 피부염, 그레이브씨 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 1형 당뇨병, 백반증, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 셀리악 질환, 눈 질환 (예를 들어, 포도막염), 피부 낭창 및 낭창성 신염 및 PD-1/PD-L1 길항제에 의해 유발된 암 환자에서 자가면역 질환과 같은, 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 제1 양상에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한 통증, 특히 염증과 연관된 통증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 제1 양상에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 제공한다.
임의로, 본 발명의 이기능성 폴리펩타이드는 1형 당뇨병, 염증성 장 질환 및 류마티스 관절염의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 제1 양상에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 이기능성 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 cDNA이다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 α 쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 β 쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 TCR-유사 항체의 경쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 TCR-유사 항체의 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 모든 PD-1 작용제 또는 이의 일부, 예를 들어, PD-L1 또는 이의 절단된 형태, 또는 모든 효능성 PD-1 항체 또는 이의 일부, 예를 들어, 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 핵산은 비-자연적으로 발생하고/하거나 정제되고/되거나 가공될 수 있다. 핵산 서열은 활용된 발현 시스템에 따라 코돈 최적화될 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 발현 시스템은 세균 세포, 예를 들어, E. coli, 또는 효모 세포, 또는 포유동물 세포 또는 곤충 세포를 포함할 수 있거나 이들은 무세포 발현 시스템일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게 벡터는 적합한 발현 벡터이다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 함유하는 세포를 제공한다. 적합한 세포는 세균 세포, 예를 들어, E. coli 또는 효모 세포 또는 포유동물 세포 또는 곤충 세포를 포함한다. 벡터는 각각 TCR의 알파 쇄 및 베타 쇄, 또는 각각 TCR-유사 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는, 단일 개방 판독 프레임 또는 2개의 구분된 개방 판독 프레임을 암호화하는 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 양상은 본 발명의 폴리펩타이드의 TCR/TCR-유사 항체의 알파 쇄/경쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터 및 본 발명의 TCR/TCR-유사 항체의 베타 쇄/중쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 함유하는 세포를 제공한다. 본 발명의 세포는 단리될 수 있고/있거나 재조합이고/이거나 비-자연적으로 발생하고/하거나 가공될 수 있다.
당업계에 널리 공지된 바와 같이, 폴리펩타이드는 해독 후 변형에 적용될 수 있다. 당화는 하나의 상기 변형이고 이는 TCR/TCR-유사 항체/PD-L1 또는 PD-1 항체 또는 다른 PD-1 작용제에서 한정된 아미노산으로 올리고사카라이드 모이어티의 공유 접착을 포함한다. 예를 들어, 아스파라긴 잔기, 또는 세린/트레오닌 잔기들은 올리고사카라이드 접착을 위해 널리 공지된 위치이다. 특정 단백질의 당화 상태는 다수의 인자들에 의존하고 이는 단백질 서열, 단백질 형태 및 특정 효소의 가용성을 포함한다. 추가로, 당화 상태(즉, 올리고사카라이드 유형, 공유 결합 및 접착의 총수)는 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 재조합 단백질을 생성하는 경우, 당화의 제어가 흔히 요구될 수 있다. 제어된 당화를 사용하여 항체 기반 치료제를 개선시켰다. (참조: Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34.). 본 발명의 가용성 TCR에 대해, 당화는 예를 들어, 특정 세포주 (차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 인간 배아 신장 (HEK) 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는)를 사용하거나 화학적 변형에 의해 제어될 수 있다. 상기 변형은 당화가 약동학을 개선시키고 면역원성을 감소시키고 고유 인간 단백질을 보다 밀접하게 모방할 수 있기 때문에 요구될 수 있다 (참조: Sinclair and Elliott, (2005) Pharm Sci.Aug; 94(8):1626-35).
환자에게 투여하기 위해, 본 발명의 이기능성 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 멸균 약제학적 조성물의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 임의의 적합한 형태 (이것을 환자에게 투여하는 목적하는 방법에 의존하여)일 수 있다. 이것은 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 이는 일반적으로 밀봉된 컨테이너에 제공되고 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 상기 키트는 일반적으로 (필연적이지는 않지만) 사용 지침서를 포함한다. 이것은 다수의 상기 단위 투여 형태를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 임의의 적당한 경로, 예를 들어, 비경구(피하, 근육내, 척수강내 또는 정맥내) 경로, 장 경로 (경구 또는 직장을 포함하는), 흡입 또는 비강내 경로에 의한 투여를 위해 적합화될 수 있다. 상기 조성물은 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 멸균 조건하에서 활성 성분을 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합함에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 물질의 용량은 치료될 질환 또는 장애, 치료될 개체의 연령 및 병태 등에 따라 광범위 한계치 사이에서 다양할 수 있다. 이기능성 결합 폴리펩타이드에 대해 적합한 용량 범위는 25 ng/kg 내지 50 μg/kg 또는 1 μg 내지 1 g의 범위에 있을 수 있다. 담당의는 궁극적으로 사용될 적당한 용량을 결정한다.
본 발명의 이기능성 결합 폴리펩탕드, 약제학적 조성물, 벡터, 핵산 및 세포는 실질적으로 순수한 형태, 예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 순수한 형태로 제공될 수 있다.
추가로, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공되고, 여기서, 이기능성 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 핵산은 단일 개방 판독 프레임으로서 또는 각각 TCR의 알파 쇄 및 베타 쇄를 암호화하는 2개의 개별 개방 판독 프레임으로서 존재할 수 있다.
제1 양상에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 제조하는 방법이 또한 제공되고, 여기서, 상기 방법은 본 발명의 핵산의 발현을 위한 임의의 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 유지하는 단계 및 제1 양상의 이기능성 결합 펩타이드를 단리하는 단계 포함한다.
본 발명의 각각의 양상의 바람직한 특성은 준용적으로 다른 양상의 각각에 대한 것과 같다. 본원에 언급된 당업계의 문헌들은 법에 의해 허용되는 최대 범위까지 인용된다.
[도면의 간단한 설명]
본 발명은 현재 하기의 비제한적인 실시예 및 특성을 참조로 기재되고 여기서:
도 1은 펩타이드 펄스된 표적 세포의 존재하에 가용성 TCR 및 절단된 형태의 PD-L1을 포함하는 본 발명의 이기능성 폴리펩타이드를 사용한 NFAT 리포터 활성의 용량-의존성 억제를 보여준다.
도 2는 펩타이드 펄스된 표적 세포의 존재하에 가용성 TCR 및 PD-1 작용제 scFv 항체 단편을 포함하는 본 발명의 이기능성 폴리펩타이드를 사용한 NFAT 리포터 활성의 억제를 보여준다.
도 3은 펩타이드 펄스된 표적 세포의 존재하에 가용성 TCR 및 PD-1 작용제 scFv 항체 단편을 포함하는 본 발명의 이기능성 폴리펩타이드를 사용한 1차 인간 t 세포 활성화의 억제를 보여준다.
도 4는 펩타이드 펄스된 표적 세포의 존재하에 상이한 특이성을 갖는 2개의 가용성 TCR 및 PD-1 작용제 scFv 항체 단편을 포함하는 본 발명의 이기능성 폴리펩타이드를 사용한 NFAT 리포터 활성의 억제를 보여준다.
실시예
실시예 1
하기의 실시예는 가용성 TCR에 융합된 PD-1 작용제가, 면역 시냅스에 표적화된 경우 T 세포 활성화를 효과적으로 억제할 수 있음을 입증한다.
상기 이기능성 결합 폴리펩타이드에 사용되는 가용성 TCR은 인간 프레-프로 인슐린 (이러한 분자는 WO2015092362에 기재되어 있다)으로부터 유래된 HLA-A*02 제한된 펩타이드를 특이적으로 인식하는 친화성-증진된 버젼의 고유 TCR이다. PD-1 작용제는 PD-1 상호작용 부위를 포함하는 절단된 버젼의 PD-L1의 세포외 영역이다 (참조: Zak et al., Structure 23:2341-2348, 2015). PD-L1은 표준 5개 아미노산 링커를 통해 TCR 알파 쇄의 N-말단부에 융합된다.
Jurkat NFAT 루시퍼라제 PD-1 리포터 검정은 HEK293T 항원 제공 표적 세포의 존재하에 T 세포 NFAT 활성의 TCR-PD1 작용제 융합 분자-매개된 억제를 측정하기 위해 사용되었다.
방법
TCR-PD1 작용제 융합 분자의 발현, 재폴딩 및 정제
TCR-PD1 작용제 융합 분자의 발현은 현탁액-적합화된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (ExpiCHO 발현 시스템, Thermo Fisher)를 기준으로 고수율의 일시적 발현 시스템을 사용하여 수행되었다. 세포는 PD-1 작용제에 융합된 TCR 쇄를 함유하는 포유동물 발현 플라스미드를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 동시 형질감염시켰다. 수거 후, 세포 배양 상등액의 세정은 상등액을 냉장 원심분리기에서 30분 동안 4000-5000 x g에서 원심분리하여 수행하였다. 상등액은 0.22-μm 필터를 통해 여과하고 추가의 정제를 위해 수거하였다.
대안적으로, TCR-PD1 작용제 융합 분자의 발현은 숙주 유기체로서 E. coli를 사용하여 수행하였다. 알파 및 베타 쇄를 함유하는 발현 플라스미드는 별도로 BL21pLysS E. coli 균주에 형질감염시키고 100 μg/mL 앰피실린을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 각각의 형질전환으로부터 루프 가득한 콜로니를 집어내고 OD600이 ~0.5 - 1.0에 도달할 때까지 37℃에서 LB 배지 (100 μg/mL 앰피실린 및 1% 글루코스를 갖는)에서 성장시켰다. LB 스타터 배양물을 이어서 자가유도 배지 (Foremedium)에 첨가하고 세포는 37℃에서 ~3시간 동안 성장시킴에 이어서 30℃에서 밤새 성장시켰다. 세포는 원심분리에 의해 수거하고 버그부스터(Bugbuster) (Novagen)에서 용해시켰다. 봉입체 (Ib)는 2회 Triton 세척(50 mM Tris pH 8.1, 100 mM, NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% Triton)을 수행하여 추출하여 세포 잔해 및 막을 제거하였다. 매번 IB는 5분 동안 10000 g에서 원심분리하여 수거하였다. 세제를 제거하기 위해, IB는 50 mM Tris pH 8.1, 100 mM NaCl 및 10 mM EDTA로 세척하였다. IB는 최종적으로 50 mM Tris pH 8.1, 100 mM NaCl 및 10 mM EDTA 완충액 중에 재현탁시켰다. 단백질 수율을 측정하기 위해, IB는 8M 우레아 완충액 중에 용해시키고 농도는 280nM에서 흡광도에 의해 결정하였다.
재폴딩을 위해, 알파 및 베타 쇄는 1:1 몰비로 혼합하고 6 M 구아니딘-HCl, 50 mM Tris pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM DTT 중에서 37℃에서 30분 동안 변성시켰다. 이어서, 변성된 쇄를 4 M Urea, 100 mM Tris pH 8.1, 0.4 M L-아르기닌, 2 mM EDTA, 1 mM 시스타민 및 10 mM 시스테아민으로 이루어진 재폴딩 완충액에 첨가하고 일정한 교반과 함께 10분 동안 항온처리하였다. 변성된 쇄를 함유하는 재폴딩 완충액은 ~16 시간 동안 H2O의 10x부피, ~7 시간 동안 10 mM Tris pH 8.1의 10x 부피 및 ~16 시간 동안 10 mM Tris pH 8.1의 10x부피에 대하여 Spectra/Por 1 막에서 투석하였다.
포유동물 또는 E. coli 발현 시스템으로부터 수득된 가용성 단백질은 로딩 완충액으로서 20 mM Tris pH 8.1 및 결합 및 용출 완충액으로서 1M NaCl과 함께 20 mM Tris pH 8.1을 사용하는 POROS 50 HQ (Thermo Fisher Scientific) 음이온 교환 컬럼을 사용하는 AKTA 퓨어 (GE healthcare) 상에서 정제하였다. 단백질은 컬럼 상에 로딩하고 0 내지 50%의 용출 완충액의 농도구배로 용출시켰다. 단백질을 함유하는 분획물을 풀링하고 각각 결합 및 용출 완충액으로서 20 mM MES pH 6.0 및 20 mM MES pH 6.0, 1M NaCl을 사용하는 POROS 50 HS (Thermos Fisher Scientific) 컬럼 상에서 제2 단계 양이온 교환 크로마토그래피 중에 20x (부피/부피)로 희석시켰다. 양이온 교환 컬럼으로부터 결합된 단백질은 용출 완충액 0 내지 100% 농도 구배를 사용하여 용출시켰다. 단백질을 함유하는 양이온-교환 분획물을 풀링하고 전개 완충액으로서 PBS를 사용하는 Superdex 200 HR (GE healthcare) 겔 여과 컬럼 상에서 추가로 정제하였다. 겔 여과로부터 양성 분획물을 풀링하고 농축시키고 요구될 때까지 -80℃에서 저장하였다.
Jurkat NFAT Luc-PD-1 리포터 검정
HLA-A*02 양성 HEK293T 표적 세포는 TCR 활성화인자 플라스미드 (BPS Bioscience, Cat no: 60610)로 일시적으로 형질감염시키고 TCR-PD1 작용제 융합 분자에 의해 인식되는 관련 펩타이드로 펄싱하였다. 이어서, 표적 세포는 상이한 농도의 TCR-PD1 작용제 융합 분자로 항온처리하여 동족 펩타이드-HLA-A2 복합체에 결합하도록 하였다. PD-1을 항상성으로 발현하는 Jurkat NFAT Luc PD-1 이펙터 세포는 표적 세포에 첨가하고 NFAT 활성은 18-20 시간 후에 결정하였다. 실험은 세척 유무에 관계없이 (TCR-PD1 작용제 융합 분자 결합 후) 수행하였다. 추가의 대조군은 비-펄스된 표적 세포를 사용하여 수행하였다. TCR 활성화인자/PD-L1 형질감염된 HEK293T A2B2M 표적 세포는 양성 대조군으로서 포함시켰다.
결과
도 1에 나타낸 데이터는 NFAT 리포터 활성의 용량-의존성 억제가 세척 유무에 관계없이 펩타이드-펄스된 표적 세포의 존재하에 TCR-PD1 작용제 융합 분자로 관찰됨을 입증한다. 결정적으로, 최소 억제는 면역 시냅스로의 표적화가 PD-1 작용제 활성에 매우 중요하다는 것을 나타내는 비-펄스된 표적 세포에서 관찰되었다.
실시예 2
하기의 실시예는 가용성 TCR에 융합된 PD-1 작용제가, 면역 시냅스에 표적화된 경우 T 세포 활성화를 효과적으로 억제할 수 있다는 추가의 증거를 제공한다.
본 실시예에 사용된 실험 시스템 및 방법은 이 경우 TCR-PD1 작용제 융합 분자의 PD-1 작용제 부분은 WO2011110621에 기재된 바와 같이 scFv 항체 단편이었다는 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 동일하였다.
실시예 1에 기재된 Jurkat NFAT 루시퍼라제 PD-1 리포터 검정은 HEK293T 항원 제공 표적 세포의 존재하에 T 세포 NFAT 활성의 TCR-PD1 작용제 융합 분자-매개된 억제를 측정하기 위해 사용되었다.
결과
도 2a에 나타낸 바와 같이, NFAT 활성의 상당한 억제 (> 60%)는 100 nM TCR-PD1 작용제 융합 분자로 처리된 펩타이드 펄스된 세포 (표지된 +PPI)에서 관찰된 반면; 최소 억제는 TCR-PD1 작용제 융합 분자로 처리된 비-펄스된 표적 세포 (표지된 -PPI)에서 나타났다. 단독의 가용성 TCR 또는 단독의 PD-1 작용제 (scFv 또는 IgG4 형식 둘 다에서)를 사용한 대조군 실험은 리포터 활성의 억제를 나타내지 않았고 이는 면역 시냅스로의 PD-1 작용제의 표적화가 PD-1 작용제 활성을 위해 요구됨을 나타낸다. 도 2b는 추가로 NFAT 활성의 용량-의존성 억제를 보여준다. 다시 언급하면, TCR-PD1 작용제 융합 분자 형식만이 NFAT 활성을 억제할 수 있다. 비-표적화된 PD-1 작용제 항체는 활성을 억제할 수 없다.
종합해 보면, 이들 결과는 PD-1 작용제의 면역 시냅스로의 표적화가 PD-1 작용제 활성을 위해 중요함을 입증한다.
실시예 3
하기의 실시예는 가용성 TCR에 융합된 PD-1 작용제가, 면역 시냅스에 표적화된 경우 T 세포 활성화를 효과적으로 억제할 수 있다는 추가의 증거를 제공한다.
본 실시예에서 사용된 TCR-PD1 작용제 융합 분자는 실시예 2에서 기재된 바와 동일하고, 여기서, PD1 작용제는 scFv 항체 단편이다.
이 경우에, 대안적 검정은 1차 인간 T 세포 기능에 대한 TCR-PD1 작용제 융합 분자의 효과를 평가하기 위해 사용하였다.
방법
1차 인간 T 세포 검정
1차 인간 T 세포는 범 (pan)-T 세포 단리 키트(Miltenyi, cat no: 130-096-535)를 사용하여 새롭게 제조된 PBMC로부터 단리하였다. HLA-A*02 양성 Raji B 세포(Raji A2B2M)에 사전에 1시간 동안 스타필로코커스 장독소 B (SEB, 100 ng/ml, Sigma S4881)를 부하하고, 이어서 33Gy로 방사선 조사하였다. 사전 활성화를 위해, 1차 인간 T 세포는 24-웰 세포 배양 플레이트 중에서 1x10E6 cells/ml의 각각의 세포 유형을 사용하여 1:1의 비율로 SEB-부하된 Raji A2B2M 표적 세포로 항온처리하였다. 1차 인간 T 세포는 SEB 부하된 Raji A2B2M 세포로 10일 동안 항온처리하고, IL-2 (50 U/ml)를 d 3 및 d 7에 첨가하였다. 10일째 사전 활성화된 T 세포를 세척하고 새로운 배지에 재현탁시켰다. 새로운 Raji A2B2M 세포는 TCR-PD1 작용제 융합 분자에 의해 인식되는 20 μM의 관련 펩타이드로 펄스하거나 2시간 동안 펄스되지 않은 상태로 방치하였다. Raji A2B2M 세포에 최종 1시간의 펩타이드 펄싱을 위해 SEB (10 ng/ml)를 부하하고, 이어서 33Gy로 방사선 조사하였다. Raji A2B2M 세포는 1x10E5 cells/well로 96-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하였고, 이어서 1시간 동안 TCR-PD1 작용제 융합 분자 적정액으로 사전에 항온처리하였다. 사전에 활성화된 T 세포는 1x10E5 cells/well로 Raji A2B2M 표적 세포에 첨가하였다. 상등액을 수거하고 IL-2 수준은 MSD ELISA를 사용하여 결정하였다.
결과
도 3에 나타낸 데이터는 TCR-PD1 작용제 융합 분자가 용량-의존성으로 펩타이드 펄스된 표적 세포의 존재하에 1차 인간 T 세포 IL-2 생성을 억제하는 반면 비-표적화된 TCR-PD1 작용제 융합 분자 (즉, 비-펄스된 표적 세포와 함께) 또는 단독의 PD-1 작용제 scFv는 억제하지 못함을 입증한다. 이들 데이터는 PD-1 작용제의 면역 시냅스로의 표적화가 1차 세포에서 PD-1 작용제 활성을 유도함을 입증한다.
실시예 4:
하기의 실시예는 동일한 기술적 효과가 또 다른 항원을 인식하는 TCR을 사용하여 관찰됨을 입증한다.
본 실시예에 사용된 실험 시스템 및 방법은 실시예 2에 기재된 것들과 동일하다. 이 경우에, PD-1 작용제 항체는 2개의 상이한 가용성 TCR에 융합되었다.
실시예 1에 기재된 Jurkat NFAT 루시퍼라제 PD-1 리포터 검정은 HEK293T 항원 제공 표적 세포의 존재하에 T 세포 NFAT 활성의 TCR-PD1 작용제 융합 분자-매개된 억제를 측정하기 위해 사용되었다.
결과
도 4에 나타낸 바와 같이, 강력한 용량 의존성 억제는 2개의 TCR-PD1 작용제 융합 분자 (TCR 1 또는 TCR 2에 융합된 PD-1 작용제 scFv 항체 단편을 포함하는)가 이들의 각각의 펩타이드 (펩타이드 1 또는 2)의 존재하에 투여되어 관찰되었다. TCR-PD1 작용제 융합 분자 둘 다에 대하여, 최소 활성은 표적화 펩타이드의 존재 없이 연구가 수행된 경우 관찰되었다.
이들 결과는 TCR-PD1 작용제 융합 분자가 상이한 pMHC에 대한 특이성을 갖는 가용성 TCR을 사용하여 상이한 조직으로 지시될 수 있고 T 세포 활성의 표적화된 억제를 촉진시킴을 입증한다.
<110> IMMUNOCORE LIMITED <120> Bifunctional Binding Polypeptides <130> P117978WO <150> GB 1807767.7 <151> 2018-05-14 <150> GB 1819584.2 <151> 2018-11-30 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated fragment PD-L1 <400> 1 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr 115 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full length PD-L1 <400> 2 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 180 185 190 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg 210 215 220

Claims (22)

  1. pMHC 결합 모이어티 및 PD-1 작용제를 포함하는 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 pMHC 결합 모이어티가 TCR 가변 도메인 및/또는 항체 가변 도메인을 포함하는, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 pMHC 결합 모이어티가 T 세포 수용체 (TCR) 또는 TCR-유사 항체인, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pMHC 결합 모이어티가 이종이량체 알파/베타 TCR 폴리펩타이드 쌍인, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pMHC 결합 모이어티가 단일쇄 알파/베타 TCR 폴리펩타이드인, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR이 상기 알파 쇄의 불변 영역과 상기 베타 쇄의 불변 영역 사이에 비-고유 디-설파이드 결합을 포함하는, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR이 펩타이드 항원에 특이적으로 결합하는, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 작용제가 PD-L1 또는 이의 기능성 단편인, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 PD-L1이 하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 이루어진, 이기능성 결합 폴리펩타이드:
    FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPY
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 작용제가 전장 항체 또는 이의 단편인, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PD-1 작용제가 scFv 항체인, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 작용제가 상기 pMHC 결합 모이어티의 C 또는 N 말단에 융합된, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-1 작용제가 링커를 통해 pMHC 결합 모이어티에 융합된, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 링커가 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 길이인, 이기능성 결합 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  17. 제16항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  18. 제16항의 핵산 또는 제17항의 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 임의로, 상기 이기능성 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 단일 개방 판독 프레임으로서 또는 각각 상기 알파 쇄 및 베타 쇄를 암호화하는 2개의 별개의 개방 판독 프레임으로서 존재하는, 숙주 세포.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 핵산의 발현을 위한 임의의 조건하에 제18항의 숙주 세포를 유지하는 단계 및 상기 이기능성 결합 펩타이드를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 의약에 사용하기 위한, 특히 자가면역 질환을 치료하기 위한 또는 통증, 특히 염증과 관련된 통증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드, 제15항의 약제학적 조성물, 제16항의 핵산 및/또는 제17항의 벡터.
  21. 제20항에 있어서, 자가면역 질환이 원형 탈모증, 강직성 척추염, 아토피성 피부염, 그레이브씨 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 1형 당뇨병, 백반증, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 셀리악 질환, 눈 질환 (예를 들어, 포도막염), 피부 낭창 및 낭창성 신염 및 PD-1/PD-L1 길항제에 의해 유발된 암 환자에서 자가면역 질환 중 하나인, 이기능성 결합 폴리펩타이드, 약제학적 조성물, 핵산 및/또는 벡터.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이기능성 결합 폴리펩타이드, 제15항에 따른 약제학적 조성물, 제16항에 따른 핵산 및/또는 제17항의 벡터를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 장애를 치료하는 방법.
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