KR20160058767A - Ｔ 세포 수용체 - Google Patents

Ｔ 세포 수용체 Download PDF

Info

Publication number
KR20160058767A
KR20160058767A KR1020167005733A KR20167005733A KR20160058767A KR 20160058767 A KR20160058767 A KR 20160058767A KR 1020167005733 A KR1020167005733 A KR 1020167005733A KR 20167005733 A KR20167005733 A KR 20167005733A KR 20160058767 A KR20160058767 A KR 20160058767A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tcr
seq
amino acid
chain
sequence
Prior art date
Application number
KR1020167005733A
Other languages
English (en)
Inventor
퀸 수
피터 몰로이
나다니엘 리디
Original Assignee
이뮤노코어 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이뮤노코어 리미티드 filed Critical 이뮤노코어 리미티드
Publication of KR20160058767A publication Critical patent/KR20160058767A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/05—Epstein-Barr virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16271—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 엡스타인 바 바이러스(EBV)로부터의 LMP2A 단백질로부터 유도된 HLA-A2 제한 CLGGLLTMV 펩티드를 결합하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 본 발명의 TCR은 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 가변 도메인을 포함한다. 특정 바람직한 TCR은 또한 펩티드-HLA-A2 착체로서 제공되는 자연 펩티드 변이체 SLGGLLTMV 및 CLGGLITMV를 결합한다. 본 발명의 TCR은 LMP2A 에피토프에 대한 우수한 특이성 프로파일을 나타내고, 착체에 대한 결합 친화도를 가져서 도 3에 제공된 자연 EBV LMP2A TCR 알파 쇄의 세포외 서열(서열 번호 4) 및 도 4에 제공된 자연 EBV LMP2A TCR 베타 쇄의 세포외 서열(서열 번호 5)을 갖는 가용성 참조 TCR과 비교하여 착체를 인식하는 능력이 강화된다.

Description

Ｔ 세포 수용체{T CELL RECEPTORS}
본 발명은 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV)로부터의 LMP2A 단백질로부터 유도된 HLA-A2 제한 CLGGLLTMV 펩티드를 결합하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것으로서, 당해 TCR은 자연(native) LMP2A TCR 알파 및/또는 베타 가변 도메인에 대하여 돌연변이되는 알파 및/또는 베타 가변 도메인을 포함한다. 특정한 바람직한 TCR은 또한 펩티드-HLA-A2 착체로서 제시되는 자연(natural) 펩티드 변이체 SLGGLLTMV 및 CLGGLITMV를 결합한다. 본 발명의 TCR은 LMP2A 에피토프에 대한 우수한 특이성 프로파일을 나타내고, 착체에 대한 결합 친화도를 가져서 아래에 기재된 참조 EBV LMP2A TCR과 비교하여 착체를 인지하는 능력이 강화된다.
엡스타인 바 바이러스(EBV)는 전세계적으로 가장 일반적인 사람 바이러스중 하나이고, 대부분의 사람들은 일생 동안 언젠가는 EBV에 감염되게 된다. 미국에서는 35 내지 40세의 성인중 무려 95%가 감염된 적이 있다. 청소년기 또는 이른 성인기의 EBV는 발열, 인후염 및 부은 임파선을 포함한 증상들을 동반한 사례의 35 내지 50%에서 전염성 단핵구증을 유발한다. 증상들은 통상적으로 1 또는 2개월 이내에 사라지지만, EBV는 개인의 여생 동안 목 및 혈액내 몇 가지 세포에 휴면 또는 잠복 상태로 잔존한다. 주기적으로, 바이러스는 재활성화될 수 있지만, 통상적으로 질병의 증상은 없다. EBV는 또한 신체 면역계의 일부 세포에서 일생의 휴면 감염을 정한다. 많은 건강한 사람들은 평생 간헐적으로 바이러스를 운반하고 전파할 수 있다. 이들은 통상 사람 대 사람 전염에 대한 주요 병원소이다.
EBV 감염은 단핵구증, 버킷(Burkitt) 림프종, 비인두암(NPC) 및 호지킨 림프종(HL)을 포함한, 다수의 악성 및 비-악성 질환과 연관되었다(Kutok, J. L. et al. Annu Rev Pathol 2006. 1: 375-404). 또한 EBV-관련 자가면역에 대한 증거도 존재한다.
LMP2A는 모든 II형 및 III형 질환/악성 종양에서 발현되는 몇 개의 EBV 유전자중 하나이다. LMP2A는 B 세포-수용체 신호전달의 음성 조정자로서 작용하고, 티로신 키나제의 격리(sequestering)를 통한 세포 생존을 촉진시키는 막관통 단백질이다. HLA-A2 제한 펩티드, CLGGLLTMV(서열 번호 1)는 생체외 개인의 60-75%에서 검출 가능한 에피토프 특이적 세포독성 T 림프구로, 잠복성 질환에서 가장 면역우성인 LMP 에피토프이다. CLGGLLTMV 펩티드는, 에피토프가 NPC 및 HL 환자로부터 검사한 생검에서 보존되고, 기타 EBV 잠재 에피토프와 함께, 면역학적으로 취약하므로, NPC 및 HL 치료에 대한 잠재적 표적인 것으로 오랫동안 나타났다.
그러므로, HLA-A2 제한 CLGGLLTMV 펩티드(자연 변이체 SLGGLLTMV(서열 번호 17) 및 CLGGLITMV(서열 번호 18)를 포함)는 본 발명의 EBV TCR이 표적으로 할 수 있는 적합한 질환 표지를 제공한다. 본 발명의 TCR은 T-세포로 형질전환되어, 입양 요법(adoptive therapy)으로 공지된 치료 공정에서 환자에 투여하기 위하여, 세포들이 상기 HLA 착체를 제시하는 EBV 감염 세포를 파괴하도록 할 수 있다. 이를 위하여, TCR은 상기 착체에 대하여 특이적인 자연 TCR보다 펩티드-HLA 착체에 대한 보다 높은 친화도 및/또는 보다 낮은 오프-율(off-rate)을 갖는 것이 바람직할 것이다. 친화도의 극적인 증가는 TCR 유전자 변형 CD8+ T 세포에서의 항원 특이성 손실과 연관되었고, 이는 이러한 TCR 형질감염 CD8+ 세포의 비특이 활성을 초래하여, 상기 착체에 대해 특이성인 자연 TCR보다는 펩티드-HLA 착체에 대해 다소 높은 친화도 및/또는 느린 오프율을 갖지만, 자연 TCR보다는 펩티드-HLA 착체에 대한 극적으로 높은 친화도 및/또는 극적으로 낮은 오프율을 갖지 않는 TCR이 입양 요법에 대하여 바람직할 것이다[참조: Zhao et al., (2007) J Immunol. 179: 5845-54; Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-31; 및 WO2008/038002]. 본 발명의 일부 TCR은 EBV 감염 세포에 대한 세포독성 또는 면역 작동제를 전달하는 목적에 유용할 수 있다. 이러한 용도에 대하여, TCR은 상기 착체에 특이적인 자연 TCR보다 펩티드-HLA 착체에 대한 현저하게 높은 친화도 및/또는 보다 느린 오프율을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들면, 결합 친화도는 아래에 기재된 참조 EBV LMP2A TCR의 2배 이상일 수 있다.
TCR은 국제 면역 유전학(IMGT) TCR 명명법을 사용하여 기재되며, TCR 서열의 IMGT 공용 데이터베이스에 연결된다. 자연 알파-베타 이종이량체성 TCR은 알파 쇄 및 베타 쇄를 갖는다. 대략적으로, 각각의 쇄는 가변 영역, 접합 영역 및 불변 영역을 포함하고, 베타 쇄는 또한 통상적으로 가변 영역과 접합 영역 사이의 짧은 다양성 영역을 함유하지만, 이러한 다양성 영역은 종종 접합 영역의 일부로서 고려된다. 각각의 가변 영역은 골격 서열에 매봉된 세 개의 CDR(상보성 결정 영역)을 포함하며, 하나는 CDR3으로 명명된 초가변 영역이다. 이의 골격, CDR1 및 CDR2 서열에 의하여, 그리고 부분 정의된 CDR3 서열에 의하여 구별되는 몇 가지 유형의 알파 쇄 가변(Vα) 영역 및 몇 가지 유형의 베타 쇄 가변(Vβ) 영역이 존재한다. Vα형은 IMGT 명명법에서 독특한 TRAV 수로 나타낸다. 따라서, "TRAV21"은 특이(unique) 골격 및 CDR1 및 CDR2 서열, 및 TCR로부터 TCR로 보존되는 아미노산 서열에 의하여 부분적으로 정의되지만 또한 TCR에서 TCR로 변화하는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 서열을 갖는 TCR Vα 영역을 정의한다. 동일한 방법으로, "TRBV5-1"은 특이 골격 및 CDR1 및 CDR2 서열을 갖지만, CDR3 서열은 부분 정의된, TCR Vβ 영역을 정의한다.
TCR의 접합 영역은 독특한 IMGT TRAJ 및 TRBJ 명명법에 의하여 유사하게 정의되고, 불변 영역은 IMGT TRAC 및 TRBC 명명법에 의하여 유사하게 정의된다.
베타 쇄 다양성 영역은 IMGT 명명법에서 약어 TRBD로 나타내고, 언급된 바와 같이, 연결 TRBD/TRBJ 영역은 종종 접합 영역으로서 함께 고려된다.
αβ TCR의 α 및 β 쇄는 일반적으로 각각 두 개의 "도메인", 즉 가변 및 불변 도메인을 갖는다고 간주된다. 가변 도메인은 가변 영역 및 접합 영역의 연결로 이루어진다. 본 명세서 및 특허청구범위에서, 용어 "TCR 알파 가변 도메인"은 그러므로, TRAV 및 TRAJ 영역의 연결을 나타내고, 용어 TCR 알파 불변 도메인은 세포외 TRAC 영역, 또는 C-말단 절단(truncated) TRAC 서열을 나타낸다. 또한, 용어 "TCR 베타 가변 도메인"은 TRBV 및 TRBD/TRBJ 영역의 연결을 나타내고, 용어 TCR 베타 불변 도메인은 세포외 TRBC 영역, 또는 C-말단 절단 TRBC 서열을 나타낸다.
IMGT 명명법에 의하여 정의된 특이 서열은 널리 공지되어 있으며, TCR 분야에서의 작업자들에게 접근 가능하다. 예를 들면, 이들은 IMGT 공용 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 문헌["T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8]에는 또한 IMGT 명명법에 의하여 정의된 서열이 기재되어 있지만, 이의 공개일자 및 결과적인 시간차 대문에, 내부 정보는 때로는 IMGT 데이터베이스를 참조하여 확인할 필요가 있다.
본 발명자들은 자연 EBV LMP2A TCR(Clone SB34, John Miles, Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Australia)을 수득하였다. 이 TCR의 DNA 및 상응하는 아미노산 서열은 다음 웹사이트, http://www.tcells.org/scientific/johnmiles/로부터 다운로드할 수 있고, 다음의 알파 및 베타 쇄 용법을 갖는다:
알파 쇄: TRAV12-3*01/TRAJ41*01/TRAC(자연 EBV LMP2A TCR 알파 쇄의 세포외 서열을 도 1에 제시한다(서열 번호 2)). CDR은 서열 번호 2의 아미노산 27-32(CDR1), 50-54(CDR2) 및 90-102(CDR3)에 의하여 정의된다.
베타 쇄: TRBV11-2*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2(자연 EBV LMP2A TCR 알파 쇄의 세포외 서열을 도 2에 제시한다(서열 번호 3)). CDR은 서열 번호 3의 아미노산 27-31(CDR1), 49-54(CDR2) 및 94-102(CDR3)에 의하여 정의된다.
(주, 용어 '*01'은 IMGT 명명법에 의하여 지정된 바와 같이, 이 서열에 대하여 하나 초과의 대립형질 변이가 존재하고, 이는 위에서 나타낸 TCR 클론에 존재하는 *01 변이임을 나타낸다. 또한, "*"한정자의 부재는 단지 한 개의 대립형질이 관련 서열에 대하여 공지되어 있음을 의미함에 주목한다.)
용어 "야생형(wild type) TCR", "자연(native) TCR", "야생형 EBV LMP2A TCR" 및 "자연 EBV LMP2A TCR"은 본원에서 동의어로 사용되어 세포외 알파 및 베타 쇄 서열 번호 2 및 3을 갖는 이러한 자연 발생 TCR을 각각 나타낸다.
본 발명의 TCR의 결합 프로파일이 비교될 수 있는 참조 TCR을 제공하기 위하여, 도 3에 제시된 자연 EBV LMP2A TCR 알파 쇄의 세포외 서열(서열 번호 4) 및 도 4에 제시된 자연 EBV LMP2A TCR 베타 쇄의 세포외 서열(서열 번호 5)을 갖는 가용성 TCR을 사용하는 것이 편리하다. 상기 TCR은 본원에서 "참조 TCR" 또는 "참조 EBV LMP2A TCR"이라고 한다. 서열 번호 4는 C161이 T161(즉, TRAC의 T48)을 치환함을 제외하고 자연 알파 쇄 세포외 서열(서열 번호 2)과 동일함을 주목한다. 또한, 서열 번호 5는 C169가 S169(즉, TRBC2의 S57)를 치환하였고, A187이 C187을 치환하였고, D201이 N201을 치환함을 제외하고 자연 베타 쇄 세포외 서열(서열 번호 3)과 동일하다. 자연 알파 및 베타 쇄 세포외 서열에 대한 이러한 시스테인 치환은 리폴딩된(refolded) 가용성 TCR, 즉 세포외 알파 및 베타 쇄를 리폴딩하여 형성된 TCR을 안정화시키는 쇄간 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 한다. 안정성 디설파이드 결합 가용성 TCR을 참조 TCR로서 사용하면 결합 친화도 및 결합 반감기의 보다 편리한 평가가 가능하다.
본 발명의 제1 측면에 따라, CLGGLLTMV(서열 번호 1) HLA-A2 착체에 결합하는 특성을 갖고, TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)로서,
상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1-113의 서열에 대한 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하고/거나,
상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1-112의 서열에 대한 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하고,
상기 알파 쇄 가변 도메인이 다음 돌연변이:
Figure pct00001
중의 하나 이상을 갖고/거나,
상기 베타 쇄 가변 도메인이 다음 돌연변이:
Figure pct00002
중의 하나 이상을 갖는, TCR이 제공된다.
본 발명의 TCR은 자연 발생이 아니고/거나 정제되고/되거나 조작(engineering)될 수 있다. 본 발명의 TCR은 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 베타 쇄 가변 도메인에 존재하는 하나 초과의 돌연변이를 가질 수 있다. 특정 양태에서, 하나 또는 둘 다의 가변 도메인에 2-20, 3-15, 4-12 또는 4-10개의 돌연변이가 존재한다. 하나 또는 둘 다의 가변 도메인에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 돌연변이가 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 TCR의 α 쇄 가변 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1-113의 서열에 대한 동일성이 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 단 상기 α 쇄 가변 도메인은 위에서 개략된 돌연변이들 중의 하나 이상을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 TCR의 β 쇄 가변 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1-112의 서열에 대한 동일성이 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 단 상기 β 쇄 가변 도메인은 위에서 개략된 돌연변이들 중의 하나 이상을 갖는다.
또한, 본원에 개시된 어떠한 TCR의 표현형 침묵 변이체(phenotypically silent variant)도 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표현형 침묵 변이체"는 KD의 범위내 CLGGLLTMV(서열 번호 1) HLA-A2 착체에 대한 KD 및/또는 결합 반감기 및 아래에 기재된 결합 반감기를 갖는 TCR를 나타내는 것으로 이해한다. 예를 들면, 당업자에게 공지된 바와 같이, CLGGLLTMV(서열 번호 1) HLA-A2 착체와의 상호 작용에 대한 친화도를 변경하지 않고 위에서 상세히 기재한 것과 비교하여 이의 불변 및/또는 가변 도메인에 변화를 포함하는 TCR를 생성할 수 있다. 이러한 사소한 변이체는 본 발명의 범위에 포함된다. 하나 이상의 보존성 치환이 수행된 TCR 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
돌연변이는 이들로 제한되지는 않지만, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 제한 효소 기반 클로닝 또는 라이게이션 독립 클로닝(LIC) 과정을 기반으로 한 것을 포함하는 어떠한 적합한 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이들 방법은 표준 분자 생물학 교재 다수에 상세히 기재되어 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 제한 효소 기반 클로닝에 관한 추가의 세부 사항은 문헌[Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press]을 참고한다. 라이게이션 독립 클로닝(LIC) 과정에 대한 추가의 정보는 문헌[Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 TCR은 CLGGLLTMV(서열 번호 1) HLA-A2 착체, 또는 자연 변이체 SLGGLLTMV(서열 번호 17) 및 CLGGLITMV(서열 번호 18)를 결합하는 성질을 갖는다. 본 발명의 특정 TCR은 기타 비관련 에피토프에 비하여 이들 에피토프에 대해 매우 특이성인 것으로 나타났고, 따라서 이들 에피토프를 나타내는 세포 및 조직에 치료제 또는 검출 표지를 전달하기 위한 표적 벡터로서 특히 적합하다. 본 발명의 TCR의 맥락에서의 특이성은 EBV LMP2A 음성 표적 세포, 특히 비암(non-cancerous) 사람 세포를 인식하는 최소의 능력을 가지면서, EBV LMP2A 항원 양성 HLA-A2 양성 표적 세포를 인식하는 이의 능력에 관한 것이다. 특이성은, 예를 들면, 실시예 6에 기재된 것과 같은 세포 검정에서 측정될 수 있다. 본 발명의 특정 TCR은 입양 요법에서 사용하기에 매우 적합한 것으로 나타났다. 이러한 TCR은 착체에 대한 KD가 23μ 미만, 예를 들면, 약 0.1 내지 약 22μM이고/이거나, 착체에 대한 결합 반감기(T½)가 약 3초 내지 약 12분의 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 TCR은 착체에 대한 KD가 약 0.5 내지 약 15μM, 약 1 내지 약 10μM 또는 약 2 내지 약 5μM일 수 있다. 본 발명의 TCR은 착체에 대한 KD가 약 3μM일 수 있다. 본 발명의 특정 TCR은 검출 표지 또는 치료제와 결합시 치료법 및/또는 진단법으로서 사용하기에 매우 적합한 것으로 밝혀졌다. 이러한 TCR은 착체에 대한 KD가 약 10pM 내지 약 200nM의 범위이고 T½이 약 10분 내지 약 60시간일 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 TCR은 착체에 대한 KD가 약 12pM 내지 약 100nM, 약 15pM 내지 약 1nM, 약 20pM 내지 약 0.5nM, 약 30pM 내지 약 0.1nM 또는 약 40pM 내지 약 50pM일 수 있다.
세포를 제공하는 항원에 치료제를 전달하기 위한 표적제로서 사용하기 위하여, 상기 TCR은 가용성 형태(즉, 막관통 또는 세포질 도메인을 갖지 않음)일 수 있다. 안정성을 위하여, 본 발명의 TCR 및 바람직하게는 가용성 αβ 이종이량체성 TCR은, 예를 들면, WO 제03/020763호에 기재된 바와 같은, 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 본 발명의 αβ 이종이량체에 존재하는 불변 도메인중 하나 또는 둘 다는 예를 들면, 15개 이하, 또는 10개 이하, 또는 8개 이하의 아미노산에 의하여, C 말단 또는 C 말단들에서 절단될 수 있다. 입양 요법에서 사용하기 위하여, αβ 이종이량체성 TCR은, 예를 들면, 세포질 및 막관통 도메인을 둘 다 갖는 전장 쇄로서 형질감염될 수 있다.
본 발명의 TCR은 αβ 이종이량체일 수 있거나, 단일 쇄 형식일 수 있다. 단일 쇄 형식은 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ 또는 Vα-L-Vβ-Cβ형의 αβ TCR 폴리펩티드(여기서, Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 영역이고, L은 링커 서열이다)를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 단일 쇄 TCR은 WO 제2004/033685호에 기재되어 있는 바와 같이, 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다.
일부 양태에서, 알파 쇄 가변 도메인은 서열 번호 6 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 Q1 내지 P113의 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이거나, 100%일 수 있다. 도 5에서 밑줄친 아미노산은 불변체일 수 있다
일부 양태에서, 베타 쇄 가변 도메인은 서열 번호 13의 E1 내지 T112의 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상이거나, 100%일 수 있다. 도 6에서 밑줄친 아미노산은 불변체일 수 있다.
본 발명의 TCR의 하위 분류에서, 알파 쇄 가변 도메인은 서열 번호 6 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11 또는 서열 번호 12의 Q1 내지 P113을 포함할 수 있고/거나; 베타 쇄는 서열 번호 13의 E1 내지 T112를 포함할 수 있다. 본 발명의 TCR은 서열 번호 9의 Q1 내지 P113을 포함하는 알파 쇄 가변 도메인 및 서열 번호 13의 E1 내지 T112를 포함하는 베타 쇄를 포함할 수 있다. 본 발명의 TCR은 서열 번호 7의 Q1 내지 P113을 포함하는 알파 쇄 가변 도메인 및 서열 번호 13의 E1 내지 T112를 포함하는 베타 쇄를 포함할 수 있다.
당업자에게 명백한 바와 같이, TCR의 결합 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않고, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 잔기에 의해, 이의 C-말단 및/또는 N-말단에 제공되는 서열을 절단하는 것이 가능할 수 있다. 모든 이러한 사소한 변이체가 본 발명에 포함된다.
본 발명의 알파-베타 이종이량체성 TCR은 통상적으로 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 포함한다. 알파 및 베타 쇄 불변 도메인 서열은 절단 또는 치환에 의하여 변형되어 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 자연 디설파이드 결합을 삭제할 수 있다. 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)은 또한 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57에 대한 시스테인 잔기의 치환에 의하여 변형될 수도 있으며, 상기 시스테인은 TCR의 알파와 베타 불변 도메인 사이의 디설파이드 결합을 형성한다.
본 발명의 특정 TCR은 참조 EBV LMP2A TCR보다 실질적으로 높은 CLGGLLTMV-HLA-A2 착체에 대한, 결합 친화도 및/또는 결합 반감기를 갖는다. 자연 TCR의 결합 친화도를 증가시키면, 이의 펩티드-MHC 리간드에 대한 TCR의 선택도가 종종 감소되고, 이는 문헌[참조: Zhao Yangbing et al., The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, US, vol. 179, No.9, 1 November 2007, 5845-5854]에 입증되어 있다. 그러나, 본 발명의 TCR은 일부 양태에서는, 모 자연 TCR보다 결합 친화도가 실질적으로 더 높음에도 불구하고, CLGGLLTMV-HLA-A2 착체에 대해 선택적인 것으로 잔존한다.
결합 친화도(평형 상수 KD에 반비례) 및 결합 반감기(T½로 나타냄)는 어떠한 적합한 방법으로라도 측정될 수 있다. TCR의 친화도가 2배가 되면 KD는 반이 된다는 것이 인정된다. T½는 오프율(Koff)로 나눈 ln2로 계산된다. 그러므로, T½이 2배가 되면 Koff는 반이 된다. TCR에 대한 KD 및 Koff 값은 통상적으로 TCR의 가용성 형태, 즉 절단되어 세포질 및 막관통 도메인 잔기를 제거하는 형태에 대하여 측정된다. 그러므로, 제시된 TCR은, TCR의 가용성 형태가 요건을 만족시키는 경우, CLGGLLTMV-HLA-A2 착체에 대한 결합 친화도 및/또는 결합 반감기를 갖는 요건을 충족시킨다는 것을 이해해야 한다. 바람직하게는, 제시된 TCR의 결합 친화도 또는 결합 반감기는 동일한 검정 프로토콜을 사용하여 수 회, 예를 들면, 3회 이상 측정되고, 결과의 평균을 취한다. 바람직한 양태에서, 이러한 측정은 본원 실시예 3의 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance, BIAcore) 방법을 사용하여 수행한다. 참조 CLGGLLTMV-HLA-A2 TCR의 KD는 상기 방법으로 측정하여 약 23μM이고, 이의 T½은 약 3s이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 TCR을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 cDNA이다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 α 쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 β 쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 핵산은 인공이고/이거나 정제되고/되거나 조작될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 당해 벡터는 TCR 발현 벡터이다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터, 바람직하게는 TCR 발현 벡터를 하버링(harbouring)하는 세포를 제공한다. 당해 벡터는 단일 개방 리딩 프레임(reading frame), 또는 2개의 개별 개방 리딩 프레임에서 알파 쇄 및 베타 쇄를 각각 인코딩하는 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 측면은 본 발명의 TCR의 알파 쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 본 발명의 TCR의 베타 쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 하버링하는 세포를 제공한다. 이러한 세포는 입양 요법에서 특히 유용하다. 본 발명의 세포는 분리되고/되거나 재조합되고/되거나 인공이고/이거나 조작될 수 있다
본 발명의 TCR은 입양 요법에 유용성을 가지므로, 본 발명은 본 발명의 TCR를 제공하는, 인공 및/또는 정제 및/또는 조작 세포, 특히 T-세포를 포함한다. T 세포를 본 발명의 TCR를 인코딩하는 핵산(예: DNA, cDNA 또는 RNA)으로 형질감염시키기에 적합한 다수의 방법이 존재한다(예를 들면, 다음 참조: Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). 본 발명의 TCR를 발현하는 T 세포는 EBV 감염의 입양 요법 기반 치료에서 사용하기에 적합하다. 당업자에게 공지되는 바와 같이, 입양 요법을 수행할 수 있는 다수의 적합한 방법이 존재한다(예를 들면, 다음 참조: Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).
본 발명의 일부 가용성 TCR은 검출 가능한 표지 또는 치료제를 세포를 제공하는 항원 및 세포를 제공하는 항원을 함유하는 조직에 전달하는 데 유용하다. 이는 그러므로, 검출 가능한 표지(TCR이 CLGGLLTMV-HLA-A2 착체를 제공하는 세포의 존재를 검출하는 데 사용되는 진단 목적으로); 치료제; 또는 PK 변형 잔기(예를 들면, 페길화(PEGylation)에 의하여)와 결합(공유 결합 또는 기타 결합)될 수 있다.
진단 목적의 검출 가능한 표지는 예를 들면, 형광 표지, 방사성 표지, 효소, 핵산 탐침 및 대조 시약을 포함한다.
본 발명의 TCR과 결합될 수 있는 치료제는 면역조절제, 방사성 화합물, 효소(예: 퍼포린) 또는 화학 요법제(예: 시스-플라틴)를 포함한다. 목적하는 위치에서 독성 효과가 발휘되는 것을 보장하기 위하여 독소는 TCR에 결합된 리포솜 내부에 존재하여 화합물이 서서히 방출되도록 할 수 있을 것이다. 이는 체내 수송 동안 손상 효과를 방지하고, 독소가 세포를 제공하는 관련 항원에 TCR을 결합시킨 후 최대 효과를 갖는 것을 보장한다.
기타 적합한 치료제는 다음을 포함한다:
Figure pct00003
소분자 세포독성제, 즉 분자량이 700달톤 미만인 포유동물 세포를 죽이는 능력을 갖는 화합물. 이러한 화합물은 세포독성 효과를 가질 수 있는 독성 금속을 함유할 수도 있을 것이다. 추가로, 이들 소분자 세포독성제는 또한 프로드럭, 즉 생리학적 조건하에 전환되거나 붕괴되어 세포독성제를 방출하는 화합물을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 이러한 제제의 예는 시스-플라틴, 마이탄신 유도체, 라켈마이신, 칼리케아미신, 도세탁셀, 에토포시드, 겜시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미톡산트론, 소르피머 소듐포토프린 II, 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트레이트 글루쿠로네이트, 오리스타틴 E 빈크리스틴 및 독소루비신을 포함한다;
Figure pct00004
펩티드 세포독소, 즉 포유동물 세포를 죽이는 능력을 갖는 단백질 또는 이의 단편. 예를 들면, 리신, 디프테리아 독소, 수도모나스 박테리아 엑소톡신 A, DNase 및 RNase;
Figure pct00005
방사성-핵종, 즉 α 입자, β 입자 또는 γ 선 중 하나 이상의 동시 방출로 붕괴되는 원소들의 불안정성 동위 원소. 예를 들면, 요오드 131, 루테늄 186, 인듐 111, 이트륨 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213; 킬레이트화제가 사용되어 고 친화도 TCR 또는 이의 다량체에 대한 이들 방사성-핵종의 결합을 촉진시킬 수 있다;
Figure pct00006
면역-자극제, 즉 면역 반응을 자극하는 면역 작동체 분자. 예를 들면, IL-2 및 IFN-γ 등의 시토카인;
Figure pct00007
초항원 및 이의 돌연변이;
Figure pct00008
TCR-HLA 융합;
Figure pct00009
케모카인, 예를 들면, IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등;
Figure pct00010
항-T 세포 또는 NK 세포 결정자 항체(예: 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16)를 포함하는, 항체 또는 이의 단편;
Figure pct00011
항체 유사 결합 특징을 갖는 대체 단백질 스캐폴드;
Figure pct00012
보체 활성제;
Figure pct00013
이종 단백질 도메인, 동종이계 단백질 도메인, 바이러스성/박테리아성 단백질 도메인, 바이러스성/박테리아성 펩티드.
하나의 바람직한 양태는 (통상적으로 알파 또는 베타 쇄의 N- 또는 C-말단으로의 융합에 의하여)항-CD3 항체, 또는 당해 항-CD3 항체의 기능성 단편 또는 변이체와 결합된 본 발명의 TCR에 의하여 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 이러한 단편 및 변이체를 포함한다. 항-CD3 항체의 예는 이들로 제한되지는 않지만, OKT3, UCHT-1, BMA-031 및 12F6을 포함한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체 단편 및 변이체/유사체는, 몇 가지 예를 들면, 미니바디(minibody), Fab 단편, F(ab')2 단편, dsFv 및 scFv 단편, 나노바디스(Nanobodies)™(Ablynx(벨기에)에서 판매하는 이들 구성물은 낙타과(camelid)(낙타 또는 라마) 항체로부터 유도된 합성 단일 면역글로불린 가변 중 도메인을 포함한다) 및 도메인 항체(친화도 만기 단일 면역글로불린 가변 중 도메인 또는 면역글로불린 가변 광 도메인을 포함하는, Domantis(벨기에)) 또는 아피바디스(Affibodies)(조작 단백질 A 스캐폴드를 포함하는 아피바디(스웨덴) 또는 안티칼린스(Anticalins)(조작 안티칼린을 포함하는 Pieris(독일))와 같은 항체 유사 결합 특징을 나타내는 대안적 단백질 스캐폴드를 포함한다.
TCR과 항-CD3 항체의 연결은 링커 서열을 통하여 직접 또는 간접적일 수 있다. 링커 서열은 가요성을 제한할 가능성이 있는 벌키한 측쇄를 갖지 않는 글리신, 알라닌 및 세린 등의 아미노산으로 주로 구성된다는 점에서, 통상적으로 가요성이다. 링커 서열의 사용 가능한 또는 최적의 길이는 용이하게 측정된다. 종종 링커 서열은 아미노산 길이가 약 12 미만, 예를 들면, 10 미만, 또는 5-10이다. 본 발명의 TCR에 사용될 수 있는 적합한 링커는, 이들로 제한되지는 않지만, GGGGS(서열 번호 23), GGGSG(서열 번호 24), GGSGG(서열 번호 25), GSGGG(서열 번호 26), GSGGGP(서열 번호 27), GGEPS(서열 번호 28), GGEGGGP(서열 번호 29) 및 GGEGGGSEGGGS(서열 번호 30)를 포함한다(WO 제2010/133828호에 기재된 바와 같음).
본 발명의 항-CD3-TCR 융합 구성체의 특정 양태는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10 또는 서열 번호 11 또는 서열 번호 12로부터 선택된 알파 쇄 가변 도메인 및 항-CD3에 상응하는 아미노산 서열에 융합된 TCR 베타 쇄 서열 번호 13을 갖는 것을 포함한다. 알파 쇄 서열의 1 위치에서 아미노산은 A 및 G로부터 선택되는 대체 아미노산으로 대체될 수 있다.
보다 특히, 본 발명의 TCR-항 CD3 융합은,
(i) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체된다);
(ii) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 1 위치의 아미노산은 A로 대체된다);
(iii) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 1 위치의 아미노산은 G로 대체된다);
(iv) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 알파 쇄의 C-말단은 서열 번호 4의 넘버링을 기준으로, F200 내지 S207을 포함하는 8개의 아미노산에 의하여 절단된다);
(v) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 1 위치의 아미노산은 A로 대체되고, 알파 쇄의 C-말단은 서열 번호 4의 넘버링을 기준으로, F200 내지 S207을 포함하는 8개의 아미노산에 의하여 절단된다);
(vi) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 1 위치의 아미노산은 G로 대체되고, 알파 쇄의 C-말단은 서열 번호 4의 넘버링을 기준으로, F200 내지 S207을 포함하는 8개의 아미노산에 의하여 절단된다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 TCR 알파 쇄 아미노산 서열; 및/또는
(vii) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이다);
(viii) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 I이다);
(ix) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 Q이다);
(x) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이고, 108-131 위치의 아미노산은 RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG(서열 번호 31)로 대체되고, 254-258 위치의 아미노산은 GGEGGGSEGGGS(서열 번호 30)로 대체된다);
(xi) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이고, 257 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
(xii) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이고, 256 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
(xiii) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이고, 255 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
(xiv) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 A 및 Q이고, 257 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
(xv) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 A 및 Q이고, 256 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
(xvi) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 A 및 Q이고, 255 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
(xvii) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 I이고, 257 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
(xviii) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 I이고, 256 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
(xix) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 I이고, 255 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 TCR 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
위와 관련하여, 이러한 TCR-항 CD3 융합의 예는 다음과 같다:
알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (vii)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (x)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (ix)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (v)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (viii)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (vii)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xi)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xii)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xiii)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xiv)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xv)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xvi)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (v)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xvii)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (v)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xviii)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (v)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xix)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xi)인 TCR-항 CD3 융합;
알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xii)인 TCR-항 CD3 융합; 및
알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xiii)인 TCR-항 CD3 융합.
몇 가지 목적으로, 본 발명의 TCR은 몇 개의 TCR을 포함하는 착체로 응집되어 다가 TCR 착체를 형성할 수 있다. 다가 TCR 착체의 생성에 사용될 수 있는 다량체화 도메인을 함유하는 다수의 사람 단백질이 존재한다. 예를 들면, 단량체성 scFv 단편과 비교하여 증가된 혈청 존속 및 현저히 감소된 오프율을 나타내는 scFv 항체 단편의 사량체를 생성하는 데 이용된 p53의 사량체화 도메인(Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). 헤모글로빈 또한 이러한 종류의 적용에 사용될 수 있는 사량체화 도메인을 갖는다. 본 발명의 다가 TCR 착체는 본 발명의 T 세포 수용체 이종이량체 또는 비-다량체성 야생형과 비교하여 CLGGLLTMV-HLA-A2 착체에 대한 강화된 결합능을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 TCR의 다가 착체 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따르는 이러한 다가 TCR 착체는 시험관내 또는 생체내 특정 항원을 제공하는 세포를 추적 또는 표적화하기에 특히 유용하고, 또한 이러한 용도를 갖는 추가의 다가 TCR 착체의 생성을 위한 중간체로서도 유용하다.
당해 기술분야에 익히 공지되어 있는 바와 같이, TCR은 번역후 변형시킬 수 있다. 글리코실화는 이러한 한 가지 변형으로, 이는 TCR 쇄내 정의된 아미노산에 대한 올리고당 일부의 공유 결합을 포함한다. 예를 들면, 아스파라긴 잔기, 또는 세린/트레오닌 잔기는 올리고당 부착에 대한 익히 공지된 위치이다. 특정 단백질의 글리코실화 상태는 단백질 서열, 단백질 형태 및 특정한 효소의 이용 가능성을 포함한, 다수의 인자에 좌우된다. 추가로, 글리코실화 상태(즉, 올리고당 유형, 공유 결합 및 부착 총 수)는 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 재조합 단백질을 생성시, 글리코실화 제어가 종종 바람직하다. 제어된 글리코실화는 항체 기반 요법을 개선시키는 데 사용되어 왔다(Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar;8(3):226-34.).
본 발명의 가용성 TCR에 대하여 글리코실화는 예를 들면, 특정 세포주를 사용하여 생체내에서, 또는 화학적 변형에 의하여 시험관내에서 제어될 수 있다. 이러한 변형은, 글리코실화가 약동학을 개선시키고, 면역원성을 감소시키고, 자연 사람 단백질을 보다 근접하게 모방할 수 있으므로, 바람직하다(Sinclair AM and Elliott S., Pharm Sci. 2005 Aug; 94(8):1626-35).
환자에게 투여하기 위하여, 본 발명의 TCR(바람직하게는 검출 가능한 표지 또는 치료제와 결합되거나 형질감염된 T 세포에서 발현됨) 또는 본 발명의 세포는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물에 제공될 수 있다. 본 발명에 따르는, 치료 또는 이미징 TCR, 또는 세포는 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 통상적으로 포함하는 멸균성 약제학적 조성물의 일부로서 공급된다. 이러한 약제학적 조성물은 (이를 환자에게 투여하는 목적하는 방법에 따라) 어떠한 적합한 형태라도 될 수 있다. 이는 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 일반적으로 밀봉 용기에 제공되고, 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는 통상적으로(반드시 그렇지는 않지만) 사용 설명서를 포함할 것이다. 이는 복수의 상기 단위 투여 형태를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 어떠한 적합한 경로, 바람직하게는 비경구(피하, 근육내 또는 바람직하게는 정맥내) 경로로 투여하기 위해 조정할 수 있다. 이러한 조성물은 약학 기술분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서라도, 예를 들면, 멸균 조건하에 활성 성분을 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 물질의 투여량은 치료되는 질환 또는 장애, 치료되는 개인의 연령 및 상태 등에 따라 넓은 한도에서 변화될 수 있고, 항-CD3 항체와 결합된 본 발명의 가용성 TCR에 적합한 용량 범위는 25ng/kg 내지 50㎍/kg일 수 있다. 전문의가 사용되는 적합한 투여량을 최종적으로 측정한다.
본 발명의 TCR, 약제학적 조성물, 벡터, 핵산 및 세포는 실질적으로 순수한 형태로, 예를 들면, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 순수하게 제공될 수 있다.
또한, 본 발명에 의하여,
Figure pct00014
의약, 바람직하게는 EBV 감염을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 펩티드-HLA-A2 착체로서 제공되는 CLGGLLTMV 펩티드(EBV LMP2A 단백질로부터 유도됨)를 결합하는 TCR, 또는 이러한 TCR을 발현하고/하거나 제공하는 세포(당해 TCR은 인공이고/거나 정제되고/거나 조작될 수 있음);
Figure pct00015
EBV 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에서의, 펩티드-HLA-A1 착체로서 제공되는 CLGGLLTMV 펩티드(EBV LMP2A 단백질로부터 유도됨)를 결합하는 TCR, 또는 TCR을 발현하고/하거나 제공하는 세포의 용도;
Figure pct00016
환자에게 펩티드-HLA-A2 착체로서 제공되는 CLGGLLTMV 펩티드(EBV LMP2A 단백질로부터 유도됨)를 결합하는 TCR, 또는 TCR을 발현하고/하거나 제공하는 세포를 투여함을 포함하는, 환자의 EBV 감염을 치료하는 방법이 제공된다.
펩티드-HLA-A2 착체로서 제공되는 CLGGLLTMV 펩티드(EBV LMP2A 단백질로부터 유도됨)를 결합하는 TCR이 본 발명의 TCR인 것이 바람직하다.
본 발명의 각각의 측면의 바람직한 특징은 기타 측면 각각에 대하여 필요한 부분만 약간 수정한 것과 같다. 본원에서 언급된 선행 기술 문서는 법에 의하여 허용되는 전체 범위로 인용된다.
도 1(서열 번호 2)은 유전자 사용 TRAV12-3*01/TRAJ41*01/TRAC를 갖는 야생형 EBV LMP2A-특이 TCR의 알파 쇄의 세포외 부분의 아미노산 서열을 제공한다.
도 2(서열 번호 3)는 야생형 EBV LMP2A-특이 TCR TRBV11-2*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2 베타 쇄 아미노산 서열의 베타 쇄의 세포외 부분의 아미노산 서열을 제공한다.
도 3(서열 번호 4)은 가용성 TCR(본원에서 "참조 TCR"이라고 함)의 알파 쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 서열은 시스테인(밑줄친 굵은 글씨)이 서열 번호 2의 T161(즉, TRAC 불변 영역의 T48)을 치환함을 제외하고 도 1과 동일하다.
도 4(서열 번호 5)는 가용성 TCR(본원에서 "참조 TCR"이라고 함)의 베타 쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 서열은 시스테인(밑줄친 굵은 글씨)이 서열 번호 3의 S169(즉, TRBC2 불변 영역의 S57)를 치환하고, A187이 C187을 치환하고, D201이 N201을 치환함을 제외하고 도 2와 동일하다.
도 5(서열 번호: 6-12)는 본 발명의 TCR에 존재할 수 있는 알파 쇄의 아미노산 서열을 제공한다. CDR 영역을 형성하는 부분 서열(subsequence), 또는 CDR 영역의 상당 부분이 밑줄쳐 있다. 자연 알파 쇄(서열 번호 2)에 대해 돌연변이된 잔기에 음영 처리되어 있다. 도 3에 관하여 언급된 도입된 시스테인은 굵은 글씨로 밑줄쳐 있는 것으로 나타난다.
도 6(서열 번호 13)은 본 발명의 TCR에 존재할 수 있는 베타 쇄의 아미노산 서열을 제공한다. CDR 영역을 형성하는 부분 서열, 또는 CDR 영역의 상당 부분이 밑줄쳐 있다. 자연 알파 쇄(서열 번호 2)에 대하여 돌연변이된 잔기에 음영 처리되어 있다. 도입된 시스테인(도 4에 대하여 언급됨)은 굵은 글씨로 밑줄쳐 있는 것으로 나타나고, 또한 도 2의 야생형 서열에 대하여, C187은 A187로 돌연변이 되었고, D201은 N201을 치환하여 이들 베타 쇄를 갖는 어떠한 알파-베타 TCR에서라도 쌍을 이루지 않은 시스테인을 제거한다.
도 7(서열 번호 14 및 서열 번호 15)은 도 3 및 4에 대한 TCR 알파 및 베타 쇄을 각각 인코딩하는 DNA 서열을 제공한다(도입된 시스테인은 굵게 나타나 있음).
도 8(서열 번호 16)은 EBV LMP2A β 쇄의 N-말단에 링커 즉 GGGGS(밑줄쳐 있음)을 통하여 융합된 항-CD3 scFv 항체 단편(굵은 활자)의 아미노산 서열을 제공한다. EBV LMP2A TCR β 쇄는 도 6(서열 번호 13)의 쇄이다.
도 9a 및 9b는 실시예 5에 따라 제조된 TCR-scFv 항체 융합에 대한 실시예 6에 기재된 검정의 결과를 나타낸다.
본 발명을 다음 실시예에서 추가로 설명한다.
실시예
실시예 1
참조 EBV LMP2A TCR 알파 및 베타 쇄 가변 영역 서열의 pGMT7 -기반 발현 플라스미드로의 클로닝
참조 EBV LMP2A TCR 가변 알파 및 TCR 가변 베타 도메인은 EBV LMP2A T 세포 클론(Clone SB34, John Miles and Scott Burrows, Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Australia)으로부터 분리된 전체 cDNA로부터 증폭된 PCR이었다. 알파 쇄의 경우, 제한 부위 NdeI를 인코딩하는 알파 쇄 가변 영역 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 A1 gaattccatatgcaaaaagaagttgaacaagatcctggaccactc(서열 번호 19) 및 제한 부위 SalI를 인코딩하는 알파 쇄 불변 영역 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 A2 ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg(서열 번호 20)가 알파 쇄 가변 도메인을 증폭시키는 데 사용된다. 베타 쇄의 경우, 제한 부위 NdeI를 인코딩하는 베타 쇄 가변 영역 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 B1 gaattccatatggaagctggagttgctcaatctcccagatataag(서열 번호 21) 및 제한 부위 Age1을 인코딩하는 베타 쇄 불변 영역 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 B2 tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc(서열 번호 22)가 베타 쇄 가변 도메인을 증폭시키는 데 사용된다.
알파 및 베타 가변 도메인은 문헌에 기재된 표준 방법(Molecular Cloning a Laboratory Manual Third edition by Sambrook and Russell)에 의하여 Cα 또는 Cβ를 함유하는 pGMT7-기반 발현 프라스미드로 클로닝되었다. 플라스미드를 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 3730xl DNA 애널라이저(Analyzer)를 사용하여 시퀀싱하였다.
NdeI 및 SalI로 절단된 TCR 알파 쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 pGMT7 + Cα 벡터로 라이게이팅(ligating)하고, 이를 NdeI 및 XhoI로 절단하였다. NdeI 및 AgeI로 절단된 TCR 베타 쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 개별 pGMT7 + Cβ 벡터로 라이게이팅시키고, 이 역시 NdeI 및 AgeI로 절단하였다.
라이게이션
라이게이팅된 플라스미드를 적격 대장균(E. coli) XL1-blue 세포로 형질전환시키고, 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 LB/한천 플레이트에서 플레이팅 아웃(plating out)시켰다. 37℃에서 밤새 배양 후, 단일 콜로니를 채취하여 진탕시키면서 37℃에서 밤새 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 LB 10㎖에서 성장시켰다. 클로닝된 플라스미드를 미니프렙(Miniprep) 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하고, 플라스미드를 어플라이드 바이오시스템즈 3730xl DNA 애널라이저를 사용하여 시퀀싱하였다.
도 3 및 4는 각각 도 7의 DNA 서열(서열 번호 14)(서열 번호 15)로부터 생성된, 참조 EBV LMP2A TCR α 및 β 쇄 세포외 아미노산 서열(각각 서열 번호 4 및 5)을 각각 나타낸다. 자연 TCR에 대하여, 시스테인이 알파 및 베타 쇄의 불변 부위에서 치환되어 리폴딩시 인공 쇄간 디설파이드 결합을 제공하여 이종이량체성 TCR을 형성함을 주목한다. 도입된 시스테인은 밑줄친 굵은 글씨로 나타낸다. 도 7의 DNA 서열에서의 제한 효소 재인식 서열은 밑줄쳐 있다.
실시예 2
가용성 참조 EBV LMP2A TCR 의 발현, 리폴딩 및 정제
실시예 1에서 제조된, 각각 TCR α-쇄 및 β-쇄를 함유하는 발현 플라스미드를 대장균 균주 BL21pLysS로 개별적으로 형질전환시키고, 단일 암피실린-저항성 콜로니를 ~0.6-0.8의 OD600로 TYP(암피실린 100㎍/㎖) 배지 중에서 37℃에서 성장시킨 후, 0.5mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 세포를 벡크만(Beckman) J-6B에서 4000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 도입한지 3시간 후 채취하였다. 세포 펠릿을 MgCl2 및 DNaseI의 존재하에 벅 버스터(Bug Buster, Novagen) 25㎖로 용해시켰다. 봉입체 펠릿을 베크만 J2-21 원심분리기에서 13000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 회수하였다. 그 다음, 3개의 세제 세척을 수행하여 세포 파편 및 막 성분을 제거하였다. 매번 봉입체 펠릿을 트리톤(Triton) 완충제(50mM 트리스-HCI pH 8.0, 0.5% 트리톤-X100, 200mM NaCl, 10mM NaEDTA) 중에서 균질화시킨 후, 베크만 J2-21에서 13000rpm에서 15분 동안 원심분리시켜 펠릿화하였다. 그 다음, 다음 완충제: 50mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM NaEDTA 중에서 유사한 세척에 의해 세제 및 염을 제거하였다. 최종적으로, 봉입체를 30㎎ 분액으로 나누고, -70℃에서 냉동시켰다. 봉입체 단백질 수율을 6M 구아니딘-HCl로 가용화시켜 정량화하고, 히타치(Hitachi) U-2001 분광광도계에서 OD 측정을 수행하였다. 그 다음, 소광 계수를 사용하여 단백질 농도를 계산하였다.
대략 TCR β 쇄 15mg 및 TCR α 쇄 15mg 가용화된 봉입체를 냉동 저장물로부터 해동시키고, 구아니딘 용액(6M 구아니딘-하이드로클로라이드, 50mM 트리스 HCl pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM DTT) 10㎖로 희석하여, 완전한 쇄 변성을 보장하였다. 완전히 환원되고 변성된 TCR 쇄를 함유하는 구아니딘 용액을 그 다음, 0.5ℓ의 다음 리폴딩 완충제: 100mM 트리스 pH 8.1, 400mM L-아르기닌, 2mM EDTA, 5M 우레아로 주입하였다. 각각 6.6mM 및 3.7mM의 최종 농도에 대한 산화환원 커플(시스테아민 하이드로클로라이드 및 시스타민 디하이드로클로라이드)을 약 5분 동안 가한 후, 변성 TCR 쇄를 가하였다. 용액을 ~30분 동안 방치하였다. 리폴딩된 TCR을 10ℓ H2O에 대하여 스펙트라/포어(Spectra/Por)® 1 막(Spectrum; 제품 번호 132670)에서 18-20시간 동안 투석하였다. 그 이후, 투석 완충제를 새로운 10mM 트리스 pH 8.1(10ℓ)로 2회 변경하고, 투석을 5℃±3℃에서 추가로 ~8시간 동안 지속하였다.
투석된 리폴드를 POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼 위에 가중시키고 악타(Akta)® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 50개의 컬럼 용적에 걸쳐 10mM 트리스 pH 8.1 중에서 0-500mM NaCl의 구배로 결합 단백질을 용출시켜, 가용성 TCR을 분해 생성물 및 불순물로부터 분리하였다. 피크 분획을 풀링(pooling)하고, 프로테아제 억제제의 칵테일(Calbiochem)을 가하였다. 그 다음, 풀링된 분획을 4℃에서 저장하고, 쿠마시(Coomassie) 착색된 SDS-PAGE에 의하여 분석한 후, 풀링 및 농축시켰다. 최종적으로, 가용성 TCR을 정제하고, PBS 완충제(Sigma) 중에서 예비 평형화된 GE 헬스케어 수퍼덱스(Healthcare Superdex)® 75HR 겔 여과 컬럼을 사용하여 특징화하였다. 약 50kDa의 상대 분자량에서 용출한 피크를 풀링시키고 농축시킨 후, 비아코어(BIAcore)® 표면 플라스몬 공명 분석에 의하여 특징화시켰다.
실시예 3
결합 특징화
비아코어 분석
표면 플라스몬 공명 바이오센서(BIAcore® 3000)를 사용하여 이의 펩티드-MHC 리간드에 대한 가용성 TCR의 결합을 분석할 수 있다. 이는 스트렙타비딘 피복된 결합 표면(센서 칩)에 부동화될 수 있는 가용성 바이오티닐화 펩티드-HLA("pHLA") 착체를 생성하여 촉진된다. 센서 칩은 4개의 상이한 pHLA 착체에 대한 T-세포 수용체 결합의 동시 측정을 가능하게 하는 4개의 개별적인 플로우 셀을 포함한다. pHLA 착체의 수동 주입으로 부동화된 I종 분자의 정확한 수준을 용이하게 조작하도록 한다.
바이오티닐화 I종 HLA-A*02 분자를 구성 아단위 단백질 및 합성 펩티드를 함유하는 박테리아로 발현된 봉입체로부터 시험관내 리폴딩한 후, 정제하고 시험관내 효소 바이오티닐화시켰다(O’Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). HLA-A*02-중쇄는 적합한 구성체에서 단백질의 막투과 및 세포질 도메인을 대체시키는 C-말단 바이오티닐화 택으로 발현되었다. 박테리아 배양물 ~75㎎/ℓ의 봉입체 발현 수준을 수득하였다. MHC 경쇄 또는 β2-마이크로글로불린은 또한 박테리아 배양물 ~500㎎/ℓ의 수준으로 적합한 구성체로부터의 대장균 내 봉입체로서 발현되었다.
대장균 세포를 용해시키고, 봉입체를 약 80% 순도로 정제하였다. 봉입체로부터의 단백질을 6M 구아니딘-HCl, 50mM 트리스 pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM DTT, 10mM EDTA 중에서 변성시키고, 변성 단백질의 단일 펄스를 < 5℃에서 리폴드 완충제로 가하여, 중쇄 30㎎/ℓ, 0.4M L-아르기닌으로의 β2m 30㎎/ℓ, 100mM 트리스 pH 8.1, 3.7mM 시스타민 디하이드로클로라이드, 6.6mM 시스테아민 하이드로클로라이드, HLA-A*02 분자에 의하여 가중되는 데 필요한 EBV LMP2A 펩티드 4㎎/L의 농도에서 리폴딩하였다. 리폴딩으로 4℃에서 1시간 이상 동안 완료에 이르도록 하였다.
완충제를 10mM 트리스 pH 8.1 10용적 중에서 투석에 의하여 교환하였다. 그 다음, 단백질 용액을 1.5μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과하고, POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼(8㎖ 상 용적)으로 가중시켰다. 단백질을 악타® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 pH 8.1 10mM 트리스 중에서 선형 0-500mM NaCl 구배로 용출시켰다. 대략 250mM NaCl에서 용출된 HLA-A*02-펩티드 착체 및 피크 분획을 수집하고, 프로테아제 억제제의 칵테일(Calbiochem)을 가하고, 분획을 얼음 위에서 냉각시켰다.
바이오티닐화 태깅(tagging)된 pHLA 분자를 동일한 완충제 중에서 평형화된 GE 헬스케어 신속 탈염 컬럼을 사용하여 10mM 트리스 pH 8.1, 5mM NaCl으로 완충제 교환하였다. 용출 즉시, 단백질 함유 분획을 얼음 위에서 냉각시키고, 프로테아제 억제제 칵테일(Calbiochem)을 가하였다. 그 다음, 바이오티닐화 시약을 가하였다: 1mM 비오틴, 5mM ATP(pH 8로 완충됨), 7.5mM MgCl2, 및 BirA 효소 5㎍/㎖[문헌(O' Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15)에 따라 정제됨). 혼합물을 실온에서 밤새 배양하였다.
겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 바이오티닐화 pHLA-A*01 분자를 정제하였다. GE 헬스케어 수퍼덱스® 75 HR 10/30 컬럼을 여과 PBS로 예비 평형화시키고, 바이오티닐화 반응 혼합물 1㎖를 가중시키고, 컬럼을 악타® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 PBS로 0.5㎖/min로 전개하였다. 바이오티닐화 pHLA-A*02 분자를 약 15㎖로 단일 피크로서 용출시켰다. 단백질을 함유하는 분획을 풀링시키고, 얼음 위에서 냉각시키고, 프로테아제 억제제 칵테일을 가하였다. 쿠마시 결합 검정(PerBio)을 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 바이오티닐화 pHLA-A*02 분자의 분액을 -20℃에서 냉동 상태로 저장하였다.
비아코어® 3000 표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서로 수용체 리간드 상호 작용을 검출하고, 이의 친화도 및 반응 속도 파라미터를 분석하는 데 사용될 수 있는 원리인, 작은 플로우 셀 내에서 센서 표면 부근의 반응 단위(RU)로 나타낸 굴절률 변화를 측정한다. 비아코어® 실험을 흐르는 완충제로서 PBS 완충제(Sigma, pH 7.1-7.5)를 사용하여, 단백질 샘플의 희석액 제조에서, 25℃의 온도에서 수행하였다. 스트렙타비딘을 표준 아민 커플링 방법에 의하여 플로우 셀에 부동화시켰다. pHLA 착체를 비오틴 택을 통하여 부동화시켰다. 그 다음, 일정한 유량에서 상이한 플로우 셀의 표면 위에 가용성 TCR을 통과시키고, 이렇게 하는 데 대한 SPR 반응을 측정하여 검정을 수행하였다.
평형 결합 상수
위의 비아코어® 분석 방법을 사용하여 평형 결합 상수를 측정하였다. 참조 EBV LMP2A TCR의 디설파이드 결합된 가용성 이종이량체성 형태의 연속 희석액을 제조하고, 2개의 상이한 플로우 셀 위에 5㎕min-1의 일정한 유량으로 주입하며; 하나는 특이적 HLA-A*02 착체 ~1000RU로 피복되고, 두 번째는 비특이적 HLA-A2-펩티드 착체 ~1000RU로 피복되었다. 대조 셀로부터의 측정치를 사용하여 각 농도에 대한 반응을 정규화시켰다. 정규화 데이터 반응을 TCR 샘플의 농도에 대하여 플로팅하고, 비선형 곡선 피팅 모델로 피팅하여 평형 결합 상수, KD를 계산하였다(Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2nd Edition) 1979, Clarendon Press, Oxford).
반응 속도 파라미터
위의 비아코어® 분석 방법을 또한 사용하여 평형 결합 상수 및 오프율을 측정하였다.
높은 친화도 TCR(아래 실시예 4 참조)에 대하여 해리율 상수, koff 및 결합율 상수, kon을 실험적으로 측정하여 KD를 측정하였다. 평형 상수 KD를 koff/kon으로서 계산하였다.
TCR을 2개의 상이한 셀 위에 주입하며, 하나는 EVDPIGHLY HLA-A*01 착체 ~1000 RU로 피복되고, 두 번째는 비특이 HLA-A1-펩티드 착체 ~1000RU로 피복되었다. 유량은 50㎕/min로 설정되었다. 통상적으로 ~ 1μM 농도에서 TCR 250㎕를 주입하였다. 그 다음, 완충제를 반응이 기준선으로 회귀하거나, >2시간이 경과할 때까지 유동시켰다. 반응 속도 파라미터를 비아이벨류에이션(BIAevaluation)® 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 해리 상을 반감기의 계산을 가능하게 하는 단일 지수 붕괴 식에 피팅시켰다.
실시예 4
본 발명의 TCR 의 제조
본 발명의 다음 TCR에 대하여 각각 TCR α-쇄 및 β-쇄를 함유하는 발현 플라스미드를 실시예 1에서와 같이 제조하였다:
Figure pct00017
플라스미드를 ~0.6-0.8의 OD600으로 TYP(암피실린 100㎍/㎖) 배지 중에서 37℃에서 성장된 단일 암피실린-저항성 콜로니 및 대장균 균주 BL21pLysS로 개별적으로 형질전환한 후, 0.5mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 세포를 베크만 J-6B에서 4000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 도입한지 3시간 후 채취하였다. 세포 펠릿을 MgCl2 및 DNaseI의 존재하에 벅 버스터®(Novagen) 25㎖로 용해시켰다. 봉입체 펠릿을 베크만 J2-21 원심분리기에서 13000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 회수하였다. 그 다음, 3개의 세제 세척을 수행하여 세포 파편 및 막 성분을 제거하였다. 매번 봉입체 펠릿을 트리톤 완충제(50mM 트리스-HCI pH 8.0, 0.5% 트리톤-X100, 200mM NaCl, 10mM NaEDTA) 중에서 균질화시킨 후, 베크만 J2-21에서 13000rpm에서 15분 동안 원심분리시켜 펠릿화하였다. 그 다음, 다음 완충제: 50mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM NaEDTA 중에서 유사한 세척에 의해 세제 및 염을 제거하였다. 최종적으로, 봉입체를 30㎎ 분액으로 나누고, -70℃에서 냉동시켰다. 봉입체 단백질 수율을 6M 구아니딘-HCl로 가용화시켜 정량화하고, 히타치 U-2001 분광광도계에서 OD 측정을 수행하였다. 그 다음, 소광 계수를 사용하여 단백질 농도를 계산하였다.
본 발명의 각각의 TCR에 대하여 대략 TCR β 쇄 10mg 및 TCR α 쇄 10mg 가용화된 봉입체를 구아니딘 용액(6M 구아니딘-하이드로클로라이드, 50mM 트리스 HCl pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM DTT) 10㎖로 희석하여, 완전한 쇄 변성을 보장하였다. 완전히 환원되고 변성된 TCR 쇄를 함유하는 구아니딘 용액을 그 다음, 0.5ℓ의 다음 리폴딩 완충제: 100mM 트리스 pH 8.1, 400mM L-아르기닌, 2mM EDTA, 5M 우레아로 주입하였다. 각각 6.6mM 및 3.7mM의 최종 농도에 대한 산화환원 커플(시스테아민 하이드로클로라이드 및 시스타민 디하이드로클로라이드)을 약 5분 동안 가한 후, 변성 TCR 쇄를 가하였다. 용액을 ~30분 동안 방치하였다. 리폴딩된 TCR을 10ℓ H2O에 대하여 스펙트라/포어(Spectra/Por)® 1 막(스펙트럼; 제품 번호 132670)에서 18-20시간 동안 투석하였다. 그 후, 투석 완충제를 새로운 10mM 트리스 pH 8.1(10ℓ)로 2회 변경하고, 투석을 5℃±3℃에서 추가로 ~8시간 동안 지속하였다.
투석된 리폴드를 POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼 위에 가중시키고 악타® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 15개의 컬럼 용적에 걸쳐 10mM 트리스 pH 8.1 중에서 0-500mM NaCl의 구배로 결합 단백질을 용출시켜, 가용성 TCR을 분해 생성물 및 불순물로부터 분리하였다. 그 다음, 풀링된 분획을 4℃에서 저장하고, 쿠마시 착색된 SDS-PAGE에 의하여 분석한 후, 풀링 및 농축시켰다. 최종적으로, 가용성 TCR을 정제하고, PBS 완충제(Sigma) 중에서 예비 평형화된 GE 헬스케어 수퍼덱스® 75HR 겔 여과 컬럼을 사용하여 특징화하였다. 약 50kDa의 상대 분자량에서 용출한 피크를 풀링시키고 농축시킨 후, 비아코어® 표면 플라스몬 공명 분석에 의하여 특징화시켰다.
EBV LMP2A 에피토프에 대한 이렇게 제조된 TCR의 친화도 프로파일을 실시예 3의 방법을 사용하여 검정하고, 참조 TCR과 비교하였다. 결과를 다음 표에 나타낸다:
Figure pct00018
실시예 5
가용성 항- CD3 scFv - EBV LMP2A TCR 융합의 발현, 리폴딩 및 정제
알파 쇄 및 항-CD3 scFv-TCR 베타 쇄 융합을 포함하는 TCR을 아래에 기재한 바와 같이 생성하였다.
알파 쇄 서열은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12로부터 선택되었다. 베타 쇄 서열은 서열 번호 13이었다. 이 서열은 링커를 통하여 항-CD3 scFV 서열로 융합되었다. 링커는 GGGGS(서열 번호 23), GGGSG(서열 번호 24), GGSGG(서열 번호 25), GSGGG(서열 번호 26), GSGGGP(서열 번호 27), GGEPS(서열 번호 28), GGEGGGP(서열 번호 29) 및 GGEGGGSEGGGS(서열 번호 30)로 이루어진 그룹으로부터 선택되었다. 항-CD3 scFV 서열(도 8에 나타냄)의 1 위치의 아미노산은 D 또는 A이고, 2위치의 아미노산은 I 또는 Q였다.
구성체를 다음과 같이 제조하였다:
라이게이션
위에서 기재된 (a) TCR Vα 쇄 및 (b) TCR Vβ 쇄 융합 서열을 인코딩하는 합성 유전자를 각각 pGMT7 + Cα 벡터 및 pGMT7-기반 발현 플라스미드로 개별적으로 라이게이팅하였으며, 이는 대장균 BL21-DE3(pLysS)에서의 고도의 발현을 위한 T7 프로모터를 함유한다(Pan et al., Biotechniques (2000) 29 (6): 1234-8).
발현
발현 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3) Rosetta pLysS로 개별적으로 형질전환시키고, 단일 암피실린-저항성 콜로니를 ~0.6-0.8의 OD600로 TYP(암피실린 100㎍/㎖) 배지 중에서 37℃에서 성장시킨 후, 0.5mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 세포를 벡크만 J-6B에서 4000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 도입한지 3시간 후 채취하였다. 세포 펠릿을 MgCl2 및 DNase의 존재하에 벅 버스터®(NovaGen) 25㎖로 용해시켰다. 봉입체 펠릿을 베크만 J2-21 원심분리기에서 13000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 회수하였다. 그 다음, 3개의 세제 세척을 수행하여 세포 파편 및 막 성분을 제거하였다. 매번 봉입체 펠릿을 트리톤(Triton) 완충제(50mM 트리스-HCI pH 8.0, 0.5% 트리톤-X100, 200mM NaCl, 10mM NaEDTA) 중에서 균질화시킨 후, 베크만 J2-21에서 13000rpm에서 15분 동안 원심분리시켜 펠릿화하였다. 그 다음, 다음 완충제: 50mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM NaEDTA 중에서 유사한 세척에 의해 세제 및 염을 제거하였다. 최종적으로, 봉입체를 30㎎ 분액으로 나누고, -70℃에서 냉동시켰다.
리폴딩
대략 TCR α 쇄 20mg 및 scFv-TCR β 쇄 40mg 가용화된 봉입체를 냉동 저장물로부터 해동시키고, 구아니딘 용액(6M 구아니딘-하이드로클로라이드, 50mM 트리스 HCl pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM DTT) 20㎖로 희석하고, 37℃ 수욕에서 30분-1시간 동안 배양하여 완전한 쇄 변성을 보장하였다. 완전히 환원되고 변성된 TCR 쇄를 함유하는 구아니딘 용액을 그 다음, 1ℓ의 다음 리폴딩 완충제: 100mM 트리스 pH 8.1, 400mM L-아르기닌, 2mM EDTA, 5M 우레아로 주입하였다. 산화환원 커플(시스테아민 하이드로클로라이드 및 시스타민 디하이드로클로라이드(각각 10mM 및 2.5mM의 최종 농도로))을 약 5분 동안 가한 후, 변성 TCR α 및 scFv-TCR β 쇄를 가하였다. 용액을 ~30분 동안 방치하였다. 리폴딩된 scFv-TCR을 10ℓ H2O에 대하여 투석 튜빙 셀룰로스 막(Sigma-Aldrich; 제품 번호 D9402)에서 18-20시간 동안 투석하였다. 그 이후, 투석 완충제를 새로운 10mM 트리스 pH 8.1(10ℓ)로 2회 변경하고, 투석을 5℃±3℃에서 추가로 ~8시간 동안 지속하였다. 가용성이고 정확히 폴딩된 scFv-TCR을 아래에 기재된 바와 같은 3단계 정제 방법에 의하여 분해 생성물 및 불순물로부터 분리하였다.
제1 정제 단계
투석된 리폴드(10mM Tris pH 8.1중)를 POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼 및 악타 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 6개의 컬럼 용적에 걸쳐 0-500mM NaCl의 구배로 용출시킨 결합 단백질에 가중시켰다. 피크 분획(전도도 ~20mS/cm에서 용출)을 4℃에서 저장하였다. 피크 분획을 인스턴트 블루 스테인(Instant Blue® Stain, Novexin) 착색된 SDS-PAGE에 의하여 분석한 후, 풀링시켰다.
제2 정제 단계
scFv-TCR 융합의 pI에 따라, 음이온 교환 풀링 분획을 20mM MES pH 6-6.5으로 희석하여 완충제 교환하였다. 희석 풀링 분획(20mM MES pH 6-6.5중)을 POROS® 50HS 양이온 교환 컬럼에 가중시키고, 악타® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 6개의 컬럼 용적에 걸쳐 0-500mM NaCl의 구배로 결합 단백질을 용출시켜 가용성이고 정확하게 폴딩된 scFv-TCR을 분해 생성물 및 불순물로부터 분리하였다. 피크 분획(전도도 ~10mS/cm에서 용출)을 4℃에서 저장하였다.
최종 정제 단계
제2 정제 단계로부터의 피크 분획을 인스턴트 블루® 스테인(Novexin) 착색된 SDS-PAGE에 의하여 분석한 후 풀링시켰다. 그 다음, 풀링 분획을 최종 정제 단계에 대하여 농축시키고, 이 때 가용성 scFv-TCR을 정제하고 PBS 완충제(Sigma)에서 예비 평형된 수퍼덱스® S200 겔 여과 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 특징화하였다. 약 78kDa의 상대 분자량에서 용출하는 피크를 인스턴트 블루® 스테인(Novexin) 착색된 SDS-PAGE에 의하여 분석한 후, 풀링하였다.
실시예 6
펩티드 펄스화 T2 세포 및 3개의 세포주: IM9 , HCT116 및 colo205 에 대한 항-CD3 scFv - EBV LMP2A 고 친화도 TCR 융합에 의한 T 세포의 리디렉션( Redirection )
5개의 항-CD3 scFv-EBV LMP2A TCR 융합을 실시예 5에 기재된 바와 같이 생성하였다. 알파 및 베타 쇄의 서열은 다음과 같았다:
Figure pct00019
다음 검정을 수행하여 특이 펩티드-MHC 재인식을 통한 항-CD3 scFv- EBV LMP2A TCR 융합에 의한 세포독성 T 림프구(CTL)의 활성을 입증하였다. ELISPOT 검정에 의하여 측정된, IFN-γ 생성을 CTL 활성에 대한 리드-아웃(read-out) 및 융합 단백질의 항-CD3 scFv 부분의 효능의 가능한 평가로서 사용하였다.
검정 배지: 10% FCS(Heat Inactivated, Sera Laboratories lnternational, cat# EU-000-Fl), 88% RPMI 1640(Invitrogen, cat# 42401018), 1% 글루타민(Invitrogen, cat# 25030024) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(lnvitrogen, cat#15070063).
세척 완충제: 탈이온수로 보충된, 0.05% Tween-20을 함유하는, 1xPBS 새쉐이(Sigma, cat# P3813)
PBS(lnvitrogen, cat# 10010015)
희석 완충제: PBS 및 10% FCS(Heat Inactivated)
사람 IFNγ ELISPOT PVDF-효소 키트(BD Biosciences, cat# 551849)는 필요한 모든 기타 시약(포획 및 검출 항체, 스트렙타비딘-HRP 및 사람 IFN-γ PVDF ELISPOT 96 웰 플레이트로서 기재 용액)을 함유한다.
방법
표적 세포 제조
표적 세포를 항원에 대한 특이적인 프라이머 및 표준 과정을 사용하여 정량적 RT-PCR에 의한 EBV LMP2A 항원 발현에 대하여 특징화시켰다. 이 검정에서 사용된 IM9 표적 세포는 EBV LMP2A를 발현하는 것으로 나타났고; colo205 결장 세포주는 EBV LMP2A -ve였다. 충분한 표적 세포(검정에서 50,000 세포/웰을 감안)를 메가퍼지(Megafuge 1.0, Heraeus)에서 5분 동안 1200rpm에서 3회 원심분리하여 세척하였다. 그 다음, 세포를 106 세포/ml의 밀도로 검정 배지에 재현탁시켰다.
작동 세포 제조
당해 방법에 사용된 작동 세포(T 세포)는 말초 혈액 단구 세포(PBMC)였다. PBMC를 림포프렙(Lymphoprep, Axis-Shields, cat# NYC-1114547) 및 로이코셉(Leucosep) 관(Greiner, cat# 227290)을 이용한 표준 과정을 사용하여 혈액으로부터 분리하였다. 작동 세포를 해동하고, 검정 배지에 위치시킨 후, 메가퍼지 1.0(Heraeus)에서 10분 동안 1300rpm에서 원심분리시켜 세척하였다. 그 다음, 세포를 검정 배지에 4x 최종 필요 농도에서 재현탁시켰다.
시약/시험 화합물 제조
항-CD3 scFv- EBV LMP2A TCR 융합 단백질의 다양한 농도(10 nM 내지 0.1 pM)를 검정 배지로 희석하여 제조하여 4x 최종 농도를 제공하였다.
ELISPOT
플레이트를 다음과 같이 제조하였다: 항-IFN-γ 또는 항-GrB 포획 항체 100㎕를 플레이트당 멸균 PBS 10㎖에 희석하였다. 희석된 포획 항체 100㎕를 그다음, 각각의 웰에 분배하였다. 그 다음, 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 세척하여(프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스(Ultrawash Plus) 96-웰 플레이트 워셔; Dynex) 포획 항체를 제거하였다. 그 다음, 검정 배지 200㎕를 각각의 웰에 가하여 플레이트를 차단하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 그 다음, 검정 배지를 플레이트로부터 세척하고(프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스 96-웰 플레이트 워셔, Dynex) 어떠한 잔존하는 배지라도 종이 타월 위에서 ELISPOT 플레이트를 털고 두드려서 제거하였다.
그 다음, 검정 성분들을 다음 순서로 ELISPOT 플레이트에 가하였다:
표적 세포 106 세포/㎖ 50㎕(총 50,000 표적 세포/웰 제공)
시약 50㎕(항-CD3 scFv-TCR 융합; 농도 변화)
배지 50㎕(검정 배지)
작동 세포 50㎕(20,000 PBMC 세포/웰)
그 다음, 플레이트를 밤새 배양하였다(37℃/5% CO2). 다음날, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고(프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스 96-웰 플레이트 워셔, Dynex), 종이 타월 위에서 두두려 건조시켜 과량의 세척 완충제를 제거하였다. 그 다음, 제1 검출 항체 100㎕를 각각의 웰에 가하였다. 제1 검출 항체를 제조자의 설명서에 명시된 희석을 사용하여 희석 완충제 10㎖(단일 플레이트에 필요한 용적)로 희석하였다. 그 다음, 플레이트를 실온에서 2시간 이상 동안 배양한 후, 세척 완충제로 3회 세척하고(프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스 96-웰 플레이트 워셔, Dynex); 종이 타월 위에서 플레이트를 두드려서 과량의 세척 완충제를 제거하였다.
희석 스트렙타비딘-HRP 100㎕를 각각의 웰에 가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하여 제2 검출을 수행하였다. 스트렙타비딘-HRP를 제조자의 설명서에 명시된 희석을 사용하여, 희석 완충제 10㎖로 희석하였다(단일 플레이트에 필요한 용적). 그 다음, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고(프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스 96-웰 플레이트 워셔, Dynex), 종이 타월 위에서 두드려서 과량의 세척 완충제를 제거하였다. 그 다음, 플레이트를 각각의 웰에 200㎕를 가하고, 완충제를 털어내고, 종이 타월 위에서 두드려서 과량의 완충제를 제거함으로써, PBS로 2회 세척하였다. 사용전 15분 이내에, AEC 색소원 한 방울(20ul)을 AEC 기재 각 1㎖에 가하고, 혼합하였다. 이 용액 10㎖를 각각의 플레이트에 대하여 제조하고; 100㎕를 웰당 가하였다. 그 다음, 플레이트를 포일(foil)을 사용하여 광으로부터 보호하고, 스폿 전개를 정기적으로, 통상적으로 5-20분 내에 모니터링하였다. 플레이트를 수돗물로 세척하여 전개 반응을 종료시키고, 건조 상태로 진탕시켜 3개의 성분 부분으로의 분해시켰다. 그 다음, 플레이트를 실온에서 2시간 이상 동안 건조시켜 이뮤노스폿 플레이트 리더(Immunospot Plate reader, CTL; Cellular Technology Limited)를 사용하여 스폿을 계수하였다.
결과
항-CD3 scFv- EBV LMP2A TCR 융합을 ELISPOT 검정(위에 기재한 바와 같음)에 의하여 시험하였다. 각각의 웰에서 관찰된 스폿 수를 프리즘(Prism, Graph Pad)을 사용하여 융합 구성체의 농도에 대하여 플롯팅하였다(도 9a 및 9b 참조). 이러한 용량-반응 곡선으로부터, EC50 값을 측정하였다(EC50은 최대 반응의 50%를 유도하는 항-CD3 scFv-EBV LMP2A TCR 융합의 농도에서 측정된다).
도 9a 및 9b의 그래프는 세포주 IM9를 제공하는 EBV LMP2A의 존재하에 상이한 항-CD3 scFv- EBV LMP2A 고 친화도 TCR에 의하여 T 세포의 특이 활성화를 나타낸다. 데이터는 각각의 경우 3개 이상의 개별 검정을 나타낸다.
도 9a 및 9b로부터의 데이터는 다음 EC50 값을 수득한다; a29b1-antiCD3에 대한 1430pM, a32b1-antiCD3에 대한 681pM, a37b1-antiCD3에 대한 1980pM, a38b-antiCD3에 대한 66.7pM 및 a42b1-antiCD3에 대한 439pM.
SEQUENCE LISTING <110> Immunocore Ltd <120> T cell receptors <130> P57437WO/NJL <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Epstein Barr Virus <400> 1 Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val 1 5 <210> 2 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Ser Ala Phe Gln Tyr 20 25 30 Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Met Ser Ala Glu Ala Asn 85 90 95 Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr 100 105 110 Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 3 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Ala Gly Val Ala Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Arg 1 5 10 15 Gln Ser Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ile Ser Gly His Ala Thr Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Ile Leu Gly Gln Gly Pro Lys Leu Leu Ile Gln 35 40 45 Phe Gln Asn Asn Gly Val Val Asp Asp Ser Gln Leu Pro Lys Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Leu Lys Gly Val Asp Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ala Lys Leu Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140 Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 145 150 155 160 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 180 185 190 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 210 215 220 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240 Ala Asp <210> 4 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain extracellular domain <400> 4 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Ser Ala Phe Gln Tyr 20 25 30 Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Met Ser Ala Glu Ala Asn 85 90 95 Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr 100 105 110 Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 5 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor beta chain extracellular domain <400> 5 Glu Ala Gly Val Ala Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Arg 1 5 10 15 Gln Ser Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ile Ser Gly His Ala Thr Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Ile Leu Gly Gln Gly Pro Lys Leu Leu Ile Gln 35 40 45 Phe Gln Asn Asn Gly Val Val Asp Asp Ser Gln Leu Pro Lys Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Leu Lys Gly Val Asp Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ala Lys Leu Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140 Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 145 150 155 160 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu 180 185 190 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 210 215 220 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240 Ala Asp <210> 6 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 6 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Ser Ala Phe Gln Tyr 20 25 30 Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Met Ser Ala Glu Ala His 85 90 95 Gln Pro Tyr Arg Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr 100 105 110 Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 7 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 7 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Ser Ala Phe Gln Tyr 20 25 30 Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Leu Pro Gly Gly Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Met Ser Ala Asp Ala Tyr 85 90 95 Gly His Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr 100 105 110 Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 8 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 8 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Ser Ala Phe Gln Tyr 20 25 30 Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Gln Phe Gln Asp Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Met Ser Ala Glu Ala His 85 90 95 Gln Pro Tyr Arg Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr 100 105 110 Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 9 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 9 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Pro His Met Ala Tyr 20 25 30 Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Met Ser Ala Asp Ala Tyr 85 90 95 Gly His Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr 100 105 110 Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 10 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 10 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Pro His Met Ala Tyr 20 25 30 Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Met Ser Ala Glu Ala His 85 90 95 Gln Pro Tyr Arg Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr 100 105 110 Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 11 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 11 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Pro His Met Ala Tyr 20 25 30 Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Gln Phe Gln Asp Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Met Ser Ala Asp Ala Tyr 85 90 95 Gly His Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr 100 105 110 Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 12 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 12 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Pro His Met Ala Tyr 20 25 30 Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Gln Phe Gln Asp Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Met Ser Ala Glu Ala His 85 90 95 Gln Pro Tyr Arg Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr 100 105 110 Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 115 120 125 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 130 135 140 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 145 150 155 160 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 165 170 175 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 13 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor beta chain variable domain <400> 13 Glu Ala Gly Val Ala Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Arg 1 5 10 15 Gln Ser Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ile Ser Gly His Ala Thr Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Ile Leu Gly Gln Gly Pro Lys Leu Leu Ile Gln 35 40 45 Phe Val Val Ala Ala Ser Val Asp Asp Ser Gln Leu Pro Lys Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Glu Arg Leu Lys Gly Val Asp Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Pro Ala Lys Leu Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr 100 105 110 Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 115 120 125 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 130 135 140 Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 145 150 155 160 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu 180 185 190 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 195 200 205 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 210 215 220 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 225 230 235 240 Ala Asp <210> 14 <211> 627 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain extracellular domain <400> 14 atgcaaaaag aagttgaaca agatcctgga ccactcagtg ttccagaggg agccatcgtt 60 tctctcaact gcacttacag caacagtgct tttcaatact tcatgtggta cagacagtat 120 tccagaaaag gccctgagtt gctgatgtac acatactcca gtggtaacaa agaagatgga 180 aggtttacag cacaggtcga taaatccagc aagtatatct ccttgttcat cagagactca 240 cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gcaatgagcg cggaagcaaa ttccgggtat 300 gcactcaact tcggcaaagg cacctcgctg ttggtcacac cccatatcca gaaccctgac 360 cctgccgtgt accagctgag agactctaag tcgagtgaca agtctgtctg cctattcacc 420 gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac 480 aaatgtgtgc tagacatgag gtctatggac ttcaagagca acagtgctgt ggcctggagc 540 aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc 600 ttcttcccca gcccagaaag ttcctaa 627 <210> 15 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor beta chain extracellular domain <400> 15 atggaagctg gagttgccca gtctcccaga tataagatta tagagaaaag gcagagtgtg 60 gctttttggt gcaatcctat atctggccat gctacccttt actggtacca gcagatcctg 120 ggacagggcc caaagcttct gattcagttt cagaataacg gtgtagtgga tgattcacag 180 ttgcctaagg atcgattttc tgcagagagg ctcaaaggag tagactccac tctcaagatc 240 cagcctgcaa agcttgagga ctcggccgtg tatctctgtg ccagcagcct tggcgggtac 300 gagcagtact tcgggccggg caccaggctc acggtcacag aggacctgaa aaacgtgttc 360 ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 420 acactggtgt gcctggccac cggtttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 480 aatgggaagg aggtgcacag tggggtctgc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 540 gccctcaatg actccagata cgctctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 600 caggaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 660 gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 720 agagcagact aa 732 <210> 16 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T cell receptor anti-CD3 fusion protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X at position 1 = D or A X at position 2 = I or Q <400> 16 Xaa Xaa Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn 180 185 190 Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe 225 230 235 240 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Glu Ala Gly Val Ala Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Ile Glu 260 265 270 Lys Arg Gln Ser Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ile Ser Gly His Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Ile Leu Gly Gln Gly Pro Lys Leu Leu 290 295 300 Ile Gln Phe Val Val Ala Ala Ser Val Asp Asp Ser Gln Leu Pro Lys 305 310 315 320 Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Leu Lys Gly Val Asp Ser Thr Leu Lys 325 330 335 Ile Gln Pro Ala Lys Leu Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser 340 345 350 Ser Leu Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 355 360 365 Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 370 375 380 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 385 390 395 400 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 405 410 415 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro 420 425 430 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser 435 440 445 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe 450 455 460 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 465 470 475 480 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 485 490 495 Gly Arg Ala Asp 500 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Epstein Barr Virus <400> 17 Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Epstein Barr Virus <400> 18 Cys Leu Gly Gly Leu Ile Thr Met Val 1 5 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 19 gaattccata tgcaaaaaga agttgaacaa gatcctggac cactc 45 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 20 ttgtcagtcg acttagagtc tctcagctgg tacacg 36 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 21 gaattccata tggaagctgg agttgctcaa tctcccagat ataag 45 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 22 tagaaaccgg tggccaggca caccagtgtg gc 32 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 24 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 25 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 26 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 27 Gly Ser Gly Gly Gly Pro 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 28 Gly Gly Glu Pro Ser 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 29 Gly Gly Glu Gly Gly Gly Pro 1 5 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 30 Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifical sequence <400> 31 Arg Thr Ser Gly Pro Gly Asp Gly Gly Lys Gly Gly Pro Gly Lys Gly 1 5 10 15 Pro Gly Gly Glu Gly Thr Lys Gly Thr Gly Pro Gly Gly 20 25

Claims (20)

  1. CLGGLLTMV(서열 번호 1) HLA-A2 착체에 결합하는 특성을 갖고, TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)로서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1-113의 서열에 대한 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하고/거나,
    상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1-112의 서열에 대한 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 다음 돌연변이:
    Figure pct00020

    중의 하나 이상을 갖고/거나,
    베타 쇄 가변 도메인이 다음 돌연변이:
    Figure pct00021

    중의 하나 이상을 갖는, TCR.
  2. 제1항에 있어서, (i) 상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열 번호 6의 Q1 내지 P113; 서열 번호 7의 Q1 내지 P113, 서열 번호 8의 Q1 내지 P113, 서열 번호 9의 Q1 내지 P113, 서열 번호 10의 Q1 내지 P113, 서열 번호 11의 Q1 내지 P113 또는 서열 번호 12의 Q1 내지 P113을 포함하고, (ii) 상기 베타 쇄가 서열 번호 13의 E1 내지 T112를 포함하는 TCR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 갖는, 알파-베타 이종이량체인 TCR.
  4. 제3항에 있어서, 상기 알파 및 베타 쇄 불변 도메인 서열이 절단 또는 치환에 의하여 변형되어 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이에 자연 디설파이드 결합을 제거하는 TCR.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)이 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57에 대한 시스테인 잔기의 치환으로 변형되며, 상기 시스테인이 TCR의 알파와 베타 불변 도메인 사이에 디설파이드 결합을 형성하는 TCR.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ 또는 Vα-L-Vβ-Cβ형의 단일 쇄 형식인(여기서, Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 영역이고, L은 링커 서열이다) TCR.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지, 치료제 또는 PK 변형 잔기와 결합된 TCR.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, TCR의 알파 또는 베타 쇄의 C- 또는 N-말단에 공유 결합된 항-CD3 항체를 포함하는 TCR.
  9. 제8항에 있어서, 항-CD3 항체에 융합된 알파 쇄 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 및 베타 쇄 서열 번호 13을 갖는 TCR.
  10. 제9항에 있어서, 상기 베타 쇄가 링커 서열을 통하여 상기 항-CD3 항체 서열에 연결되는 TCR.
  11. 제10항에 있어서, 상기 링커 서열이 GGGGS(서열 번호 23), GGGSG(서열 번호 24), GGSGG(서열 번호 25), GSGGG(서열 번호 26), GSGGGP(서열 번호 27), GGEPS(서열 번호 28), GGEGGGP(서열 번호 29) 및 GGEGGGSEGGGS(서열 번호 30)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 TCR.
  12. 제8항에 있어서, (a) 알파 쇄 아미노산 서열 및 (b) 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열을 포함하는 TCR로서, 상기 알파 쇄 서열이,
    (i) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체된다);
    (ii) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 1 위치의 아미노산은 A로 대체된다);
    (iii) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 1 위치의 아미노산은 G로 대체된다);
    (iv) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 알파 쇄의 C-말단은 서열 번호 4의 넘버링을 기준으로, F200 내지 S207을 포함하는 8개의 아미노산에 의하여 절단된다);
    (v) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 1 위치의 아미노산은 A로 대체되고, 알파 쇄의 C-말단은 서열 번호 4의 넘버링을 기준으로, F200 내지 S207을 포함하는 8개의 아미노산에 의하여 절단된다); 및
    (vi) TCR 알파 쇄 서열(서열 번호 2 또는 서열 번호 4)(여기서, 아미노산 1 내지 113은 서열 번호 9의 아미노산 1-113으로 대체되고, 1 위치의 아미노산은 G로 대체되고, 알파 쇄의 C-말단은 서열 번호 4의 넘버링을 기준으로, F200 내지 S207을 포함하는 8개의 아미노산에 의하여 절단된다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고/거나;
    상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이,
    (vii) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이다);
    (viii) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 I이다);
    (ix) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 Q이다);
    (x) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이고, 108-131 위치의 아미노산은 RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG(서열 번호 31)로 대체되고, 254-258 위치의 아미노산은 GGEGGGSEGGGS(서열 번호 30)로 대체된다);
    (xi) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이고, 257 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
    (xii) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이고, 256 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
    (xiii) TCR 베타 쇄-항-CD3 서열(서열 번호 16)(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 D 및 I이고, 255 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
    (xiv) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 A 및 Q이고, 257 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
    (xv) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 A 및 Q이고, 256 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
    (xvi) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 A 및 Q이고, 255 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
    (xvii) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 I이고, 257 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다);
    (xviii) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 I이고, 256 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다); 및
    (xix) 서열(서열 번호 16)을 갖는 TCR 베타 쇄-항-CD3(여기서, 1 및 2 위치의 아미노산은 각각 A 및 I이고, 255 위치의 아미노산은 S이고, 258 위치의 아미노산은 G이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 TCR.
  13. 제12항에 있어서, 알파 쇄 서열과 베타 쇄-항-CD3 서열의 조합이,
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (vii)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (x)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (ix)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (v)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (viii)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (vii)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xi)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xii)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (i)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xiii)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xiv)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xv)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xvi)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (v)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xvii)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (v)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xviii)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (v)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xix)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xi)인 조합;
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xii)인 조합; 및
    상기 알파 쇄 아미노산 서열이 (vi)이고, 상기 베타 쇄-항-CD3 아미노산 서열이 (xiii)인 조합으로부터 선택되는 TCR.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 TCR을 인코딩하는 핵산.
  15. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 TCR을 제공하는, 인공이고/거나 정제되고/거나 조작된 세포, 특히 T-세포.
  16. (a) 알파 쇄 및 베타 쇄를 각각 인코딩하는 단일 개방 리딩 프레임, 또는 2개의 개별 개방 리딩 프레임에서 제14항에 따르는 핵산을 포함하는 TCR 발현 벡터; 또는
    (b) 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 TCR의 알파 쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 TCR의 베타 쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 하버링하는 세포.
  17. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 TCR 또는 제15항 또는 제16항에 따르는 세포를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 의약에 사용하기 위하여, 펩티드-HLA-A2 착체로서 제공되는 CLGGLLTMV 펩티드(EBV LMP2A 단백질로부터 유도됨)를 결합하는 TCR 또는 이러한 TCR을 발현하고/거나 제공하는 세포.
  19. 제18항에 있어서, EBV 감염을 치료하는 방법에 사용하기 위한, TCR 또는 세포.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 TCR이 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르고/거나, 상기 세포가 제15항 또는 제16항에 따르는 TCR 또는 세포.
KR1020167005733A 2013-08-12 2014-08-12 Ｔ 세포 수용체 KR20160058767A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1314404.3A GB201314404D0 (en) 2013-08-12 2013-08-12 T Cell Receptors
GB1314404.3 2013-08-12
PCT/GB2014/052464 WO2015022520A1 (en) 2013-08-12 2014-08-12 T cell receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160058767A true KR20160058767A (ko) 2016-05-25

Family

ID=49262046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167005733A KR20160058767A (ko) 2013-08-12 2014-08-12 Ｔ 세포 수용체

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20160199479A1 (ko)
EP (1) EP3033353A1 (ko)
JP (1) JP2016528244A (ko)
KR (1) KR20160058767A (ko)
CN (1) CN106414482A (ko)
AU (1) AU2014307725A1 (ko)
BR (1) BR112016002687A2 (ko)
CA (1) CA2920444A1 (ko)
EA (1) EA201690180A1 (ko)
GB (1) GB201314404D0 (ko)
HK (1) HK1221724A1 (ko)
MX (1) MX2016001837A (ko)
PH (1) PH12016500272A1 (ko)
SG (1) SG11201600849UA (ko)
WO (1) WO2015022520A1 (ko)
ZA (1) ZA201600959B (ko)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106279404A (zh) * 2015-05-20 2017-01-04 广州市香雪制药股份有限公司 一种可溶且稳定的异质二聚tcr
WO2017048593A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors recognizing hla-cw8 restricted mutated kras
WO2017079747A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Regents Of The University Of Minnesota Activation of resident memory t cells for cancer immunotherapy
GB201520191D0 (en) * 2015-11-16 2015-12-30 Cancer Rec Tech Ltd T-cell receptor and uses thereof
DK3494133T3 (da) * 2016-08-02 2022-09-19 Us Health Anti-kras-g12d-t-cellereceptorer
GB201709866D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Immunocore Ltd T cell receptors
DE102017114737A1 (de) * 2017-06-30 2019-01-03 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie
CA3071583A1 (en) * 2017-08-03 2019-02-07 Regents Of The University Of Minnesota Activation of resident memory t cells for the treatment of cancer
CN110818802B (zh) * 2018-08-08 2022-02-08 华夏英泰（北京）生物技术有限公司 一种嵌合t细胞受体star及其应用
CN109306005B (zh) * 2018-09-30 2019-11-15 清华大学 一种eb病毒特异性t细胞抗原受体及其应用
WO2020133050A1 (zh) * 2018-12-27 2020-07-02 深圳华大生命科学研究院 Ebv表位高亲和力t细胞受体
GB201904328D0 (en) * 2019-03-28 2019-05-15 Immunocore Ltd Specific binding molecules
GB201909509D0 (en) * 2019-07-02 2019-08-14 Immunocore Ltd Peptide-MHC complexes
EP3786178A1 (en) 2019-08-30 2021-03-03 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Tcr constructs specific for ebv-derived antigens
WO2021211455A1 (en) * 2020-04-13 2021-10-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hla class i-restricted t cell receptors against lmp2
CN111440246B (zh) * 2020-04-16 2022-03-18 成都仕康美生物科技有限公司 靶向HLA-B的嵌合抗原受体、编码基因、CAR-Tregs细胞及其制备方法、用途
JP2024518378A (ja) 2021-05-05 2024-05-01 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー Ｐｒａｍｅに特異的に結合する抗原結合タンパク質
EP4091627A1 (en) 2021-05-21 2022-11-23 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Tcr constructs specific for magea4-derived epitopes
WO2023122337A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Sana Biotechnology, Inc. Chimeric antigen receptor (car) t cells for treating autoimmune disease and associated methods
WO2023242343A1 (en) * 2022-06-15 2023-12-21 Immunoscape Pte. Ltd. Human t cell receptors specific for antigenic peptides derived from mitogen-activated protein kinase 8 interacting protein 2 (mapk8ip2), epstein-barr virus or human endogenous retrovirus, and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0223399D0 (en) * 2002-10-09 2002-11-13 Avidex Ltd Receptors
GB0917094D0 (en) * 2009-09-29 2009-11-11 Ucl Biomedica Plc T-cell receptor
GB0917090D0 (en) * 2009-09-29 2009-11-11 Ucl Biomedica Plc T-cell receptor
CN110951690A (zh) * 2010-09-20 2020-04-03 生物技术细胞和基因治疗公司 抗原特异性t细胞受体和t细胞表位

Also Published As

Publication number Publication date
BR112016002687A2 (pt) 2017-09-12
US20160199479A1 (en) 2016-07-14
PH12016500272A1 (en) 2016-05-02
CA2920444A1 (en) 2015-02-19
SG11201600849UA (en) 2016-03-30
WO2015022520A1 (en) 2015-02-19
JP2016528244A (ja) 2016-09-15
ZA201600959B (en) 2017-11-29
HK1221724A1 (zh) 2017-06-09
EA201690180A1 (ru) 2016-07-29
AU2014307725A1 (en) 2016-03-03
CN106414482A (zh) 2017-02-15
MX2016001837A (es) 2016-05-24
GB201314404D0 (en) 2013-09-25
EP3033353A1 (en) 2016-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11753456B2 (en) T cell receptors
US11725040B2 (en) T cell receptors
KR20160058767A (ko) Ｔ 세포 수용체
KR102267345B1 (ko) Ｔ 세포 수용체
JP6751391B2 (ja) Ｔ細胞受容体
CN110023330B (zh) T细胞受体
WO2013041865A1 (en) T cell receptors
MX2012000155A (es) Receptores de celulas t.

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid