KR102267345B1 - Ｔ 세포 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 α 페토프로테인(AFP)으로부터 유도된 HLA-A2 제한 FMNKFIYEI(158-166) 펩티드 에피토프를 결합하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 바람직한 TCR은 우수한 결합 특성 및 이러한 AP 에피토프에 대한 특이성 프로파일을 나타낸다. 본 발명의 T 세포 수용체는 하나 이상의 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 하나 이상의 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 알파 쇄 가변 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1-112의 서열에 대한 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 상기 베타 쇄 가변 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1 - 112의 서열에 대한 동일성이 90% 이상고인 아미노산 서열을 포함한다.

Description

Ｔ 세포 수용체{T CELL RECEPTORS}
본 발명은 α 페토프로테인(AFP)으로부터 유도된 HLA-A2 제한된 FMNKFIYEI(158-166) 펩티드 에피토프를 결합하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 바람직한 TCR은 이러한 AFP 에피토프에 대한 우수한 결합 특성 및 특이성 프로파일을 나타낸다.
AFP는 태아 발달 동안 발현되고, 태아 혈청의 주 성분이다. 발달 동안 단백질이 난황낭 및 간에 의해 매우 높은 수준으로 생성되고, 이후 억제된다. AFP 발현은 간세포 암종에서 종종 재활성화되고(Butterfield et al. J Immunol., 2001, Apr 15;166(8):5300-8), 고수준의 단백질이 당해 질환에 대한 진단 표지로서 사용된다.
간세포 암종의 5년 생존율은 미국에서 모든 악성 종양중 최저로 보고되어 있고, 전 세계의 연간 발병률은 1백 2십만이며, B형 및 C형 간염의 유행으로 인하여 증가할 가능성이 있다. 치료는 통상적으로 수술을 수반하지만, 이는 질환의 초기 단계에서 수행되는 경우 유리할 뿐이다. 그러므로, 새로운 치료법이 바람직하다.
AFP로부터 유도된 네 가지 에피토프: AFP158, AFP137, AFP325 및 AFP542가 공지되어 있다(Butterfield et al. J Immunol., 2001, Apr 15;166(8):5300-8 및 Butterfield et al. Cancer Res. 1999, 59: 3134-3142). HLA-A2 제한 AFP158 펩티드 FMNKFIYEI(서열 번호 1)는 신규한 면역요법 중재에 적합한 표적을 제공하며; 이 펩티드는 자연적으로 프로세싱되고, HepG2(HLA-A2 양성) 간 암종 라인으로부터 용출되고 질량 분광법에 의하여 검출되었다(Butterfield et al. J Immunol., 2001, Apr 15;166(8):5300-8). T 세포 클론은 AFP158(및 AFP137)에 대하여 상승되었다(Pichard et al. J Immunother. 2008 Apr;31(3):246-53). 그러나, 이 펩티드를 인지하는 T 세포 수용체는 보고된 적이 없다.
본 발명의 제1 측면에 따라, FMNKFIYEI(서열 번호 1) HLA-A2 착체에 결합하는 특성을 갖고, 하나 이상의 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 하나 이상의 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하는 인공(non-naturally occurring) 및/또는 정제 및/또는 조작(engineered) T 세포 수용체(TCR)로서,
상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1 - 112의 서열에 대한 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고/하거나,
상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1 - 112의 서열에 대한 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하는, T 세포 수용체가 제공된다.
본 발명의 일부 양태에서, 알파 쇄 가변 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 112에 대한 서열 동일성이 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100%이다.
베타 쇄 가변 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1 내지 112에 대한 서열 동일성이 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100%일 수 있다.
TCR은 국제 면역유전학(IMGT) TCR 명명법을 사용하여 기재되고, TCR 서열의 IMGT 공공 데이터베이스에 연결한다. 자연(native) 알파-베타 이종이량체성(heterodimeric) TCR은 알파 쇄 및 베타 쇄를 갖는다. 대체적으로, 각각의 쇄는 가변, 접합 및 불변 부위를 포함하고, 베타 쇄는 또한 변수와 접합 부위 사이의 짧은 다양성 부위를 통상적으로 함유하지만, 이러한 다양성 부위는 접합 부위의 일부로서 종종 고려된다. 각각의 가변 부위는 골격 서열에 매봉된 3개의 CDR(상보성 결정 부위)을 포함하며, 하나는 CDR3이라고 명명된 과가변 부위이다. 이의 골격, CDR1 및 CDR2 서열에 의하여, 부분적으로는 정의된 CDR3 서열에 의하여 구별되는 몇 가지 유형의 알파 쇄 가변(Vα) 부위 및 몇 가지 유형의 베타 쇄 가변(Vβ) 부위가 존재한다. Vα 유형은 유일 TRAV 수에 의하여 IMGT 명명법에 나와 있다. 따라서, "TRAV21"은 유일 골격 및 CDR1 및 CDR2 서열, 및 TCR에서 TCR로 보존되는 아미노산 서열에 의하여 부분적으로 정의되지만 TCR에서 TCR로 변화하는 아미노산 서열을 또한 포함하는 CDR3 서열을 갖는 TCR Vα 부위를 정의한다. 동일한 방법으로, "TRBV5-1"은 유일 골격 및 CDR1 및 CDR2 서열을 갖지만 부분적으로만 정의된 CDR3 서열을 갖는 TCR Vβ 부위를 정의한다.
TCR의 접합 부위는 유일 IMGT TRAJ 및 TRBJ 명명법에 의하여 유사하게 정의되고, 불변 부위는 IMGT TRAC 및 TRBC 명명법에 의하여 유사하게 정의된다.
베타 쇄 다양성 부위는 약어 TRBD에 의하여 IMGT 명명법에 나와 있고, 언급된 바와 같이, 결합된 TRBD/TRBJ 부위는 접합 부위로서 함께 종종 고려된다.
αβ TCR의 α 및 β 쇄는 일반적으로 각각 두 개의 "도메인" 또는 "부위", 즉, 가변 및 불변 도메인/부위를 갖는 것으로 간주된다. 용어 "도메인(들)" 및 "부위(들)"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 가변 도메인은 가변 부위 및 접합 부위의 연속으로 이루어진다. 그러므로, 본 명세서 및 청구항에서, 용어 "TCR 알파 가변 도메인"은 TRAV 및 TRAJ 부위의 연속을 나타내고, 용어 TCR 알파 불변 도메인은 세포외 TRAC 부위, 또는 C-말단 절단된 TRAC 서열을 나타낸다. 또한, 용어 "TCR 베타 가변 도메인"은 TRBV 및 TRBD/TRBJ 영역의 연속을 나타내고, 용어 TCR 베타 불변 도메인은 세포외 TRBC 부위, 또는 C-말단 절단된 TRBC 서열을 나타낸다.
IMGT 명명법에 의하여 정의된 유일 서열은 익히 공지되어 있고, TCR 분야에서의 작업에 접근 가능하다. 예를 들면, 이는 TMGT 공공 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 문헌["T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8]에는 또한 IMGT 명명법에 의하여 정의된 서열이 개시되어 있지만, 이의 공개 일자 및 결과적인 시간차 때문에, 내부 정보는 때로는 IMGT 데이터베이스를 참조하여 확인될 필요가 있다.
서열 번호: 2 및 3은 각각, 본원에서는 "모(parental)" AFP TCR이라고 하는 것의 알파 및 베타 쇄 세포외 서열이다. 모 AFP TCR은 다음 알파 및 베타 쇄 용법을 갖는다:
알파 쇄: TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC(모 AFP TCR 알파 쇄의 세포외 서열은 도 1(서열 번호 2)에 제시되어 있다). CDR은 서열 번호 2의 아미노산 27-32(CDR1), 50-55(CDR2) 및 90-101(CDR3)에 의하여 정의된다.
베타 쇄: TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2(모 AFP TCR 알파 쇄의 세포외 서열은 도 2(서열 번호 3)에 제시되어 있다). CDR은 서열 번호 3의 아미노산 27-31(CDR1), 49-54(CDR2) 및 92-102(CDR3)에 의하여 정의된다.
(용어 '*01' 및 '*02'는 IMGT 명명법에 의하여 지정된 바와 같은, 이 서열에 대한 하나 초과의 대립 형질 변이체가 존재하고, 위에서 언급된 TCR 클론에 존재하는 것이 *01/ *02 변이체임을 나타냄을 주목한다. 또한, "*" 수식어의 부재는 하나의 대립 형질만이 관련 서열에 대하여 공지되어 있음을 주목한다.)
본 발명의 돌연변이 TCR의 결합 프로파일을 비교할 수 있는 참조 TCR을 제공하기 위하여, 도 3(서열 번호 4)에 제시된 AFP TCR 알파 쇄의 세포외 서열 및 도 4(서열 번호 5)에 제시된 AFP TCR 베타 쇄의 세포외 서열을 갖는 가용성 TCR을 사용하는 것이 편리하다. TCR은 본원에서 "참조 TCR" 또는 "참조 AFP TCR"이라고 한다. 서열 번호 4는 C159가 T159(즉, TRAC의 T48)를 치환한 것을 제외하고 모 알파 쇄 세포외 서열 서열 번호 2과 동일함을 주목한다. 또한, 서열 번호 5는 C169가 S169(즉, TRBC2의 S57)를 치환하고, A187이 C187를 치환하고, D201이 N201을 치환한 것을 제외하고 모 베타 쇄 세포외 서열 서열 번호 3과 동일하다. 모 AFP 알파 및 베타 쇄 세포외 서열에 대한 이들 시스테인 치환은 리폴딩(refolding)된 가용성 TCR, 즉, 세포외 알파 및 베타 쇄를 리폴딩하여 형성된 TCR을 안정화시키는 쇄간 디설파이드 결합의 형성을 가능하게 한다. 참조 TCR로서 안정성 디설파이드 결합된 가용성 TCR의 사용은 결합 친화도 및 결합 반감기의 보다 편리한 평가를 가능하게 한다.
본 발명의 TCR은 T 세포로 형질전환(transformation)되어, 입양 요법(adoptive therapy)으로 공지된 치료 공정에서 환자에 투여하기 위하여, AFP HLA-A2 착체를 제공하는 세포를 파괴할 수 있도록 만든다. 이를 위하여, TCR이 착체에 대하여 특이적인 자연 TCR보다 펩티드-HLA 착체에 대한 보다 높은 친화도 및/또는 보다 낮은 오프-율(off-rate)을 갖는 것이 바람직할 것이다. 친화도의 극적인 증가는 TCR 유전자 변형 CD8 T 세포에서의 항원 특이성 손실과 연관되었고, 이는 이러한 TCR-형질감염된(transfected) CD8 세포의 비특이 활성을 초래할 수 있었다. 그러므로, 착체에 대하여 특이적인 자연 TCR보다 펩티드-HLA 착체에 대하여 다소 높은 친화도 및/또는 보다 느린 오프-율을 갖지만 자연 TCR보다 펩티드-HLA 착체에 대하여 극적으로 높은 친화도 및/또는 극적으로 느린 오프-율을 갖지는 않는 TCR이 입양 요법에 바람직할 것이다[참조: Zhao et al., (2007) J Immunol. 179: 5845-54; Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-31; 및 WO2008/038002].
본 발명의 양태는 모 AFP TCR에 대하여 돌연변이된 TCR을 포함한다. 돌연변이 TCR은 서열 번호 2에 나타낸 넘버링(numbering)을 참조하여, 31Q, 32S, 94D, 95S, 96G, 97Y 및 98A에 상응하는 아미노산 하나 이상에서의 돌연변이를 포함하는 알파 쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 알파 쇄 가변 도메인은 다음 돌연변이중 하나 이상을 가질 수 있다:
Figure 112016012175412-pct00001
위에서 사용된 넘버링(numbering)은 도 1(서열 번호:2)에 나타낸 것과 동일하다.
알파 쇄 가변 도메인은 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19 및 서열 번호 20 중의 어느 하나의 잔기 1-112에 대한 동일성이 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게는, 아미노산 서열은 또한 서열 번호 2의 잔기 1-112에 대한 동일성이 90% 이상이다. 도 5a 및 5b에서 밑줄친 아미노산은 불변성일 수 있다.
한 양태에서, TCR은 서열 번호 11, 서열 번호 12 또는 서열 번호 13의 Q1 내지 H112를 포함하는 알파 쇄 가변 도메인, 및/또는 서열 번호 3의 D1 내지 T112를 포함하는 베타 쇄 가변 도메인을 포함한다.
돌연변이는 이들로 제한되지는 않지만, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 제한 효소 기반 클로닝 또는 라이게이션 독립 클로닝(LIC) 과정을 기반으로 한 것을 포함하는 어떠한 적합한 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이들 방법은 표준 분자 생물학 교재 다수에 상세히 기재되어 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 제한 효소 기반 클로닝에 관한 추가의 세부 사항은 문헌[Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press]을 참고한다. 라이게이션 독립 클로닝(LIC) 과정에 대한 추가의 정보는 문헌[Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6]에서 찾을 수 있다.
또한, 본원에 개시된 어떠한 TCR의 표현형 침묵 변이체(phenotypically silent variant)도 본 발명의 영역 내에 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표현형 침묵 변이체"는 KD의 범위내 FMNKFIYEI(서열 번호 1) HLA-A2 착체에 대한 KD 및/또는 결합 반감기 및 아래에 기재된 결합 반감기를 갖는 TCR를 나타내는 것으로 이해한다. 예를 들면, 당업자에게 공지된 바와 같이, FMNKFIYEI(서열 번호 1) HLA-A2 착체와의 상호 작용에 대한 친화도를 변경하지 않고 위에서 상세히 기재한 것과 비교하여 이의 불변 및/또는 가변 도메인에 변화를 포함하는 TCR를 생성할 수 있다. 이러한 사소한 변이체는 본 발명의 영역에 포함된다. 하나 이상의 보존성 치환이 수행된 TCR 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
당업자에게 명백한 바와 같이, TCR의 결합 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않고, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 잔기에 의하여 이의 C-말단 및/또는 N-말단에 제공된 서열을 절단하는 것이 가능할 수 있다. 모든 이러한 사소한 변이체는 본 발명에 의하여 포함된다.
자연(native) TCR은 이종이량체성 αβ 또는 γδ 형태에 존재한다. 그러나, αα 또는 ββ 동질이량체로 이루어진 재조합 TCR은 펩티드 MHC 분자에 결합하는 것으로 이전에 나타났다. 그러므로, 본 발명의 TCR은 이종이량체성 αβ TCR일 수 있거나 αα 또는 ββ 동질이량체성 TCR일 수 있다.
입양 요법에 사용하기 위하여, αβ 이종이량체성 TCR은 예를 들면, 세포질 및 막관통 도메인 둘 다를 갖는 전장 쇄로 형질감염될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 TCR은 예를 들면, WO 제2006/000830호에 기재된 바와 같이, 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입 디설파이드 결합을 가질 수 있다.
본 발명의 TCR, 특히 알파-베타 이종이량체성 TCR은 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 알파 및 베타 쇄 불변 도메인 서열은 절단 또는 치환에 의하여 변형되어 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 자연 디설파이드 결합을 삭제할 수 있다. 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)은또한 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57에 대한 시스테인 잔기의 치환에 의하여 변형될 수도 있으며, 당해 시스테인은 TCR의 알파와 베타 불변 도메인 사이에 디설파이드 결합을 형성한다.
본 발명의 TCR은 단일 쇄 형식일 수 있으며, 예를 들면, WO 제2004/033685호를 참조한다. 단일 쇄 형식은 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, Vα-Cα-L-Vβ-Cβ형의 αβ TCR 폴리펩티드(여기서, Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 부위이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 부위이고, L은 링커 서열이다)를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 단일 쇄 TCR은 WO 제2004/033685호에 기재된 바와 같이, 각각의 불변 도메인의 잔기들 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다.
본 발명의 TCR은 FMNKFIYEI(서열 번호 1) HLA-A2 착체를 결합하는 특성을 갖는다. 본 발명의 특정한 TCR은 입양 요법에 사용하기에 매우 적합한 것으로 밝혀졌다. 이러한 TCR은 착체에 대한 KD가 모 AFP TCR보다 적은, 예를 들면, 약 1 내지 약 21μM이고/거나, 착체에 대한 결합 반감기(T½)가 0.5 미만 내지 약 2초의 범위일 수 있다. 자연 TCR의 결합 친화도를 증가시키면 이의 펩티드-MHC 리간드에 대한 TCR의 선택도를 종종 감소시키고, 이는 문헌[Zhao Yangbing et al., (J. Immunol, 2007 179: 9, p5845-5854)]에 나타나 있다. 그러나, 본 발명의 특정한 TCR은 FMNKFIYEI HLA-A2 착체에 대해 선택적으로 남아 있지만, 일부 양태에서는, 결합 친화도가 모 AFP TCR보다 높다(실시예 6 참조).
결합 친화도(평형 상수 KD에 대해 반비례) 및 결합 반감기(T½로 나타냄)는 어떠한 적합한 방법으로라도 측정될 수 있다. TCR의 친화도를 배가시키면 KD가 반이 된다는 것이 인정된다. T½은 오프-율(Koff)에 의하여 나뉜 ln2로 계산된다. T½을 이렇게 배가시키면 Koff가 반이된다. TCR에 대한 KD 및 koff 값은 통상적으로 TCR의 가용성 형태, 즉, 절단되어 세포질 및 막관통 도메인 잔기를 제거하는 형태에 대하여 측정된다. 그러므로, 제시된 TCR은 TCR의 가용성 형태가 상기 특징을 갖는 경우, 모 TCR에 대하여 개선된 결합 친화도 및/또는 결합 반감기를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 제시된 TCR의 결합 친화도 또는 결합 반감기는 동일한 검정 프로토콜을 사용하여, 수 회, 예를 들면, 3회 이상 측정되고, 결과를 평균낸다. 바람직한 양태에서, 이러한 측정은 본원에서 실시예 3의 표면 플라즈몬 공명[Surface Plasmon Resonance(BIAcore)] 방법을 사용하여 수행한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 TCR을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 cDNA이다. 일부 양태에서, 본 발명은 발명의 TCR의 α 쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 αβ 쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 α 쇄 가변 도메인과 본 발명의 TCR의 β 쇄 가변 도메인 둘 다를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 핵산은 인공 및/또는 정제 및/또는 조작될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 벡터는 TCR 발현 벡터이다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터, 바람직하게는 TCR 발현 벡터를 하버링(harbouring)하는 세포를 제공한다. 벡터는 단일 개방 리딩 프레임(reading frame), 또는 2개의 개별 개방 리딩 프레임에서 알파 쇄 및 베타 쇄를 각각 인코딩하는 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 측면은 본 발명의 TCR의 알파 쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 본 발명의 TCR의 베타 쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 하버링하는 세포를 제공한다. 이러한 세포는 입양 요법에서 특히 유용하다. 세포는 분리되고/되거나 재조합되고/되거나 인공이고/이거나 조작될 수 있다
본 발명의 TCR은 입양 요법에 유용성을 가지므로, 본 발명은 본 발명의 TCR를 제공하는, 인공 및/또는 정제 및/또는 조작 세포, 특히 T-세포를 포함한다. T 세포를 본 발명의 TCR를 인코딩하는 핵산(예: DNA, cDNA 또는 RNA)으로 형질감염시키기에 적합한 다수의 방법이 존재한다(예를 들면, 다음 참조: Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). 본 발명의 TCR를 발현하는 T 세포는 췌장 및 간의 암과 같은 암의 입양 요법 기반 치료에 사용하기에 적합하다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 입양 요법을 수행할 수 있는 다수의 적합한 방법이 존재한다(예를 들면, 다음 참조: Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).
당해 기술분야에 익히 공지된 바와 같이, 본 발명의 TCR은 형질감염된 세포에 의하여 발현될 때 번역후 변형될 수 있다. 글리코실화는 한 가지 이러한 변형이며, 이는 TCR 쇄내 정의된 아미노산에 대한 올리고당 잔기의 공유 결합을 포함한다. 예를 들면, 아스파라긴 잔기, 또는 세린/트레오닌 잔기는 올리고당 결합에 대한 익히 공지된 위치이다. 특정 단백질의 글리코실화 상태는 단백질 서열, 단백질 형태 및 특정 효소의 유용성을 포함한, 다수의 인자에 좌우된다. 추가로, 글리코실화 상태(즉, 올리고당 유형, 공유 연결 및 총 결합 수)는 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 재조합 단백질을 생성시, 글리코실화를 조절하는 것이 종종 바람직하다. 형질감염된 TCR의 글리코실화는 형질감염된 유전자의 돌연변이에 의하여 조절될 수 있다(Kuball J et al. (2009), J Exp Med 206(2):463-475). 이러한 돌연변이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 TCR은 검출 가능한 표지, 치료제 또는 PK 변형 잔기와 결합될 수 있다.
본 발명의 특정 TCR은 가용성 형태일 수 있다(즉, 막관통 또는 세포질 도메인을 갖지 않음). 안정성을 위하여, 본 발명의 TCR, 바람직하게는 가용성 αβ 이종이량체성 TCR은 예를 들면, WO 제03/020763호에 기재된, 각각의 불변 도메인의 잔기들 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 본 발명의 일부 가용성 TCR은 검출 가능한 표지 또는 치료제를 세포를 제공하는 항원 및 세포를 제공하는 항원을 함유하는 조직에 전달하기 위하여 사용될 수 있는 융합 단백질을 제조하기에 유용하다. 이는 그러므로, (TCR이 FMNKFIYEI(서열 번호 1) HLA-A2 착체; 치료제; 또는 PK 변형 잔기(예를 들면, 페길화(PEGylation)에 의하여)를 제공하는 세포의 존재를 검출하는 데 사용되는 진단 목적에 대하여) 검출 가능한 표지와 결합(공유 결합 또는 기타 결합)될 수 있다.
진단 목적에 대한 검출 가능한 표지는 예를 들면, 형광 표지, 방사성 표지, 효소, 핵산 탐식자 및 대조 시약을 포함한다.
본 발명의 TCR과 결합될 수 있는 치료제는 면역조절제, 방사성 화합물, 효소(예: 퍼포린) 또는 화학 요법제(예: 시스-플라틴)를 포함한다. 목적하는 위치에서 독성 효과가 발휘되는 것을 보장하기 위하여 독소는 TCR에 결합된 리포솜 내부에 존재하여 화합물이 서서히 방출되도록 할 수 있을 것이다. 이는 체내 수송 동안 손상 효과를 방지하고, 독소가 세포를 제공하는 관련 항원에 TCR을 결합시킨 후 최대 효과를 갖는 것을 보장한다.
기타 적합한 치료제는 다음을 포함한다:
Figure 112016012175412-pct00002
소분자 세포독성제, 즉 분자량이 700달톤(Da) 미만인 포유동물 세포를 죽이는 능력을 갖는 화합물. 이러한 화합물은 세포독성 효과를 가질 수 있는 독성 금속을 함유할 수도 있을 것이다. 추가로, 이들 소세포 세포독성제는 또한 프로드럭, 즉 생리학적 조건하에 전환되거나 붕괴되어 세포독성제를 방출하는 화합물을 포함한다. 이러한 제제의 예는 시스-플라틴, 마이탄신 유도체, 라켈마이신, 칼리케아미신, 도세탁셀, 에토포시드, 겜시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미톡산트론, 소르피머 소듐포토프린 II, 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트레이트 글루쿠로네이트, 오리스타틴 E 빈크리스틴 및 독소루비신을 포함한다;
Figure 112016012175412-pct00003
펩티드 세포독소, 즉 포유동물 세포를 죽이는 능력을 갖는 단백질 또는 이의 단편. 예를 들면, 리신(ricin), 디프테리아 독소, 수도모나스 박테리아 엑소톡신 A, DNase 및 RNase;
Figure 112016012175412-pct00004
방사성-핵종, 즉 α 입자, β 입자 또는 γ 선 중 하나 이상의 동시 방출로 붕괴되는 원소들의 불안정성 동위 원소. 예를 들면, 요오드 131, 루테늄 186, 인듐 111, 이트륨 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213; 킬레이트화제가 사용되어 고 친화도 TCR 또는 이의 다량체에 대한 이들 방사성-핵종의 결합을 촉진시킬 수 있다;
Figure 112016012175412-pct00005
면역-자극제, 즉 면역 반응을 자극하는 면역 작동체 분자. 예를 들면, IL-2 및 IFN-γ 등의 시토카인;
Figure 112016012175412-pct00006
초항원 및 이의 돌연변이;
Figure 112016012175412-pct00007
TCR-HLA 융합;
Figure 112016012175412-pct00008
케모카인, 예를 들면, IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등;
Figure 112016012175412-pct00009
항-T 세포 또는 NK 세포 결정자 항체(예: 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16)를 포함하는, 항체 또는 이의 단편;
Figure 112016012175412-pct00010
항체 유사 결합 특징을 갖는 대체 단백질 스캐폴드;
Figure 112016012175412-pct00011
보체 활성제;
Figure 112016012175412-pct00012
이종 단백질 도메인, 동종이계 단백질 도메인, 바이러스성/박테리아성 단백질 도메인, 바이러스성/박테리아성 펩티드.
환자에게 투여하기 위하여, 본 발명의 TCR 또는 세포는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명에 따르는 세포는 통상적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 통상적으로 포함하는 멸균, 약제학적 조성물의 일부로서 제공된다. 이러한 약제학적 조성물은 어떠한 적합한 형태일 수 있다(이를 환자에게 투여하는 목적하는 방법에 따라). 이는 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 일반적으로 밀봉된 용기에 제공되고, 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는 통상적으로(필수적이지는 않지만) 사용 설명서를 포함할 것이다. 이는 복수의 상기 단위 투여 형태를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 어떠한 적합한 경로에 의한, 바람직하게는 비경구(피하, 근육내 또는 바람직하게는 정맥내) 경로에 의한 투여에 적응시킬 수 있다. 이러한 조성물은 약학 기술 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서라도, 예를 들면, 활성 성분을 멸균 조건하에 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 TCR, 약제학적 조성물, 벡터, 핵산 및 세포는 실질적으로 순수한, 예를 들면, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 순수한 형태로 제공될 수 있다.
또한, 다음이 본 발명에 의하여 제공된다:
Figure 112016012175412-pct00013
의학, 바람직하게는 암의 치료 방법에 사용하기 위한, 펩티드-HLA-A2 착체로서 제공된 FMNKFIYEI 펩티드를 결합하는 인공 및/또는 정제 및/또는 조작 TCR, 또는 이러한 TCR을 발현 및/또는 제공하는 세포. 당해 방법은 입양 요법을 포함할 수 있다;
Figure 112016012175412-pct00014
펩티드-HLA-A2 착체로서 제공된 FMNKFIYEI 펩티드를 결합하는 TCR, 또는 이러한 TCR을 발현 및/또는 제공하는 세포의, 암 치료용 의약의 제조에서의 용도;
Figure 112016012175412-pct00015
환자를 펩티드-HLA-A2 착체로서 제공되는 FMNKFIYEI 펩티드를 결합시키는 TCR, 또는 이러한 TCR를 발현 및/또는 제공하는 세포를 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 암 치료 방법.
펩티드-HLA-A2 착체로서 제공되는 FMNKFIYEI 펩티드를 결합시키는 TCR이 본 발명의 TCR인 것이 바람직하다.
본 발명의 이러한 측면의 바람직한 특징은 기타 측면 각각에 대하여 필요한 부분만 약간 수정한다. 본원에서 언급된 공개 문서는 법으로 허용되는 최대 범위로 포함된다. 본원에서 어떠한 문헌의 인용 또는 확인은 이러한 문서가 본 발명에 대한 선행 기술로 사용 가능함을 인정하는 것이 아니다.
도 1(서열 번호 2)은 유전자 사용 TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC를 갖는 모 AFP-특이적 TCR의 알파 쇄의 세포외 부분의 아미노산 서열을 제공한다.
도 2(서열 번호 3)는 유전자 사용 TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2를 갖는 모 AFP-특이적 TCR의 베타 쇄의 세포외 부분의 아미노산 서열을 제공한다.
도 3(서열 번호 4)은 가용성 TCR(본원에서 "참조 TCR"이라고 함)의 알파 쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 당해 서열은 시스테인(밑줄친 굵은 글씨)이 서열 번호 2의 T159(즉, TRAC 불변 부위의 T48)를 치환함을 제외하고 도 1(서열 번호 2)과 동일하다.
도 4(서열 번호 5)는 가용성 TCR(본원에서 "참조 TCR"이라고 함)의 베타 쇄의 아미노산 서열을 제공한다. 당해 서열은 시스테인(밑줄친 굵은 글씨)이 서열 번호 3의 S169(즉, TRBC2 불변 부위의 S57)를 치환하고, A187이 C187을 치환하고, D201이 N201을 치환함을 제외하고 도 2(서열 번호 3)와 동일하다.
도 5a 및 5b(서열 번호 6-20)는 본 발명의 TCR에 존재할 수 있는 돌연변이 알파 쇄의 아미노산 서열을 제공한다. CDR 부위는 밑줄쳐 있고, 모 AFP TcR에 대한 아미노산 변화는 음영 처리되어 있다.
도 6(서열 번호 21) 및 (서열 번호 22)는 각각 도 3 및 4에 나타낸 TCR 알파 및 베타 쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 제공한다.
도 7(서열 번호 23)은 T-세포의 형질도입(transduction)에 대한 모 AFP TCR 유전자에 대한 DNA 서열(밑줄친 굵은 글씨의 포르신 테스코바이러스(Porcine teschovirus)-1 2A 서열을 갖는 알파 쇄-2A-베타 쇄 구성체)을 제공한다.
도 8a 및 8b(서열 번호 24)는 도 7의 DNA 서열로부터 생성된 T-세포 형질도입에 대한 모 AFP TCR의 아미노산 서열을 제공한다. 포르신 테스코바이러스-1 2A 서열은 밑줄친 굵은 글씨이다.
도 9는 표적 세포의 범위에 반응하여 AFP TCR-형질 도입된 T-세포의 IFN-γ 방출이 검정된 ELISPOT 검정의 결과를 나타낸다.
다음의 비제한적 실시예에서 본 발명을 추가로 설명한다.
실시예
실시예 1
pGMT7 -기반 발현 프라스미드로의 모 AFP TCR 알파 및 베타 쇄 가변 부위 서열의 클로닝
참조 AFP TCR 가변 알파 및 TCR 가변 베타 도메인을 AFP T 세포 클론으로부터 분리된 전체 cDNA로부터 PCR 증폭시켰다. 알파 쇄의 경우, 제한 사이트 NdeI를 인코딩하는 알파 쇄 가변 부위 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 A1 gaattccatatgcaaaaagaagttgaacaaaattctggacccctc(서열 번호 25) 및 제한 사이트 SalI를 인코딩하는 알파 쇄 불변 부위 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 A2 ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg(서열 번호 26)를 사용하여 알파 쇄 가변 도메인을 증폭시킨다. 베타 쇄의 경우, 제한 사이트 NdeI를 인코딩하는 베타 쇄 가변 부위 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 B1 gaattccatatggattctggagttacacaaaccccaaagcacctg(서열 번호 27) 및 제한 사이트 AgeI을 인코딩하는 베타 쇄 불변 부위 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 B2 tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc(서열 번호 28)를 사용하여 베타 쇄 가변 도메인을 증폭시킨다.
알파 및 베타 가변 도메인을 문헌(Molecular Cloning a Laboratory Manual Third edition by Sambrook and Russell)에 기재된 표준 방법에 의하여 Cα 또는 Cβ를 함유하는 pGMT7-기반 발현 플라스미드로 클로닝하였다. 어플라이드 바이어시스템즈(Applied Biosystems) 3730xl DNA 애널라이저(Analyzer)를 사용하여 플라스미드를 시퀀싱하였다.
NdeI 및 SalI로 절단된 TCR 알파 쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 pGMT7 + Cα 벡터로 라이게이팅하고, 이를 NdeI 및 ChoI로 절단하였다. NdeI 및 AgeI로 절단된 TCR 베타 쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 개별적인 pGMT7 + Cβ 벡터로 라이게이팅하고, 이를 또한 NdeI 및 AgeI로 절단하였다.
라이게이션
라이게이팅된 플라스미드를 적격(competent) 대장균(E. coli) 균주 XL1-blue 세포로 형질전환시키고, 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 LB/한천 플라이트에서 플레이팅 아웃(plating out)시켰다. 37℃에서 밤새 배양 후, 단일 콜로니를 채취하여 진탕시키면서 37℃에서 밤새 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 LB(Luria bertani) 10㎖에서 성장시켰다. 클로닝된 플라스미드를 미니프렙(Miniprep) 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하고, 플라스미드를 어플라이드 바이오시스템즈 3730xl DNA 애널라이저를 사용하여 시퀀싱하였다.
도 3 및 4는 각각 도 7의 DNA 서열(서열 번호 21)(서열 번호 22) 로부터 생성된, 참조 AFP TCR α 및 β 쇄 세포외 아미노산 서열(각각 서열 번호 4 및 5)을 각각 나타낸다. 모 TCR에 대하여, 시스텐이 알파 및 베타 쇄의 불변 부위에서 치환되어 리폴딩시 인공 쇄간 디설파이드 결합을 제공하여 이종이량체성 TCR을 형성함을 주목한다. 도입된 시스테인은 밑줄친 굵은 글씨로 나타낸다.
실시예 2
가용성 모 AFP TCR 의 발현, 리폴딩 및 정제
실시예 1에서 제조된, 각각 TCR α-쇄 및 β-쇄를 함유하는 발현 플라스미드를 대장균 균주 BL21pLysS로 개별적으로 형질전환시키고, 단일 암피실린-저항성 콜로니를 ~0.6-0.8의 OD600로 TYP(암피실린 100㎍/㎖) 배지 중에서 37℃에서 성장시킨 후, 0.5mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 단백질 발현을 도입하였다. 세포를 벡크만(Beckman) J-6B에서 4000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 도입한지 3시간 후 채취하였다. 세포 펠릿을 MgCl2 및 DNaseI의 존재하에 벅 버스터(Bug Buster)®(Novagen) 25㎖로 용해시켰다. 봉입체 펠릿을 베크만 J2-21 원심분리기에서 13000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 회수하였다. 그 다음, 3개의 세제 세척을 수행하여 세포 파편 및 막 성분을 제거하였다. 매번 봉입체 펠릿을 트리톤(Triton) 완충제(50mM 트리스-HCI pH 8.0, 0.5% 트리톤-X100, 200mM NaCl, 10mM NaEDTA) 중에서 균질화시킨 후, 베크만 J2-21에서 13000rpm에서 15분 동안 원심분리시켜 펠릿화하였다. 그 다음, 다음 완충제: 50mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM NaEDTA 중에서 유사한 세척에 의해 세제 및 염을 제거하였다. 최종적으로, 봉입체를 30㎎ 분액으로 나누고, -70℃에서 냉동시켰다. 봉입체 단백질 수율을 6M 구아니딘-HCl로 가용화시켜 정량화하고, 히타치(Hitachi) U-2001 분광광도계에서 OD 측정을 수행하였다. 그 다음, 소광 계수를 사용하여 단백질 농도를 계산하였다.
대략 TCR β 쇄 15mg 및 TCR α 쇄 15mg 가용화된 봉입체를 냉동 저장물로부터 해동시키고, 구아니딘 용액(6M 구아니딘-하이드로클로라이드, 50mM 트리스 HCl pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM DTT) 10㎖로 희석하여, 완전한 쇄 변성을 보장하였다. 완전히 환원되고 변성된 TCR 쇄를 함유하는 구아니딘 용액을 그 다음, 0.5ℓ의 다음 리폴딩 완충제: 100mM 트리스 pH 8.1, 400mM L-아르기닌, 2mM EDTA, 5M 우레아로 주입하였다. 각각 6.6mM 및 3.7mM의 최종 농도에 대한 산화환원 커플(시스테아민 하이드로클로라이드 및 시스타민 디하이드로클로라이드)을 약 5분 동안 가한 후, 변성 TCR 쇄를 가한다. 용액을 ~30분 동안 방치하였다. 리폴딩된 TCR을 10ℓ H2O에 대하여 스펙트라/포어(Spectra/Por)® 1 막(스펙트럼; 제품 번호 132670)에서 18-20시간 동안 투석하였다. 그 이후, 투석 완충제를 새로운 10mM 트리스 pH 8.1(10ℓ)로 2회 변경하고, 투석을 5℃±3℃에서 추가로 ~8시간 동안 지속하였다.
투석된 리폴드를 POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼 위에 가중시키고 악타(Akta)® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 50개의 컬럼 용적에 걸쳐 10mM 트리스 pH 8.1 중에서 0-500mM NaCl의 구배로 결합 단백질을 용출시켜, 가용성 TCR을 분해 생성물 및 불순물로부터 분리하였다. 피크 분획을 풀링(pooling)하고, 프로테아제 억제제의 칵테일(Calbiochem)을 가하였다. 그 다음, 풀링된 분획을 4℃에서 저장하고, 쿠마시(Coomassie) 착색된 SDS-PAGE에 의하여 분석한 후, 풀링 및 농축시켰다. 최종적으로, 가용성 TCR을 정제하고, PBS 완충제(Sigma) 중에서 예비 평형화된 GE 헬스케어 수퍼덱스(Healthcare Superdex)® 75HR 겔 여과 컬럼을 사용하여 특징화하였다. 약 50kDa의 상대 분자량에서 용출한 피크를 풀링시키고 농축시킨 후, 비아코어(BIAcore)® 표면 플라스몬 공명 분석에 의하여 특징화시켰다.
실시예 3
결합 특징화
비아코어 분석
표면 플라스몬 공명 바이오센서(BIAcore® 3000)를 사용하여 이의 펩티드-MHC 리간드에 대한 가용성 TCR의 결합을 분석할 수 있다. 이는 스트렙타비딘 피복된 결합 표면(센서 칩)에 부동화될 수 있는 가용성 바이오티닐화 펩티드-HLA("pHLA") 착체를 생성하여 촉진된다. 센서 칩은 4개의 상이한 pHLA 착체에 대한 T-세포 수용체 결합의 동시 측정을 가능하게 하는 4개의 개별적인 플로우 셀을 포함한다. pHLA 착체의 수동 주입으로 부동화된 I종 분자의 정확한 수준을 용이하게 조작하도록 한다.
바이오티닐화 I종 HLA-A*02 분자를 구성 아단위 단백질(constituent subunit protein) 및 합성 펩티드를 함유하는 박테리아로 발현된 봉입체로부터 시험관내 리폴딩한 후, 정제하고 시험관내 효소 바이오티닐화시켰다(O’Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). HLA-A*02-중쇄는 적합한 구성체에서 단백질의 막투과 및 세포질 도메인을 대체시키는 C-말단 바이오티닐화 택으로 발현되었다. 박테리아 배양물 ~75㎎/ℓ의 봉입체 발현 수준을 수득하였다. MHC 경쇄 또는 β2-마이크로글로불린은 또한 박테리아 배양물 ~500㎎/ℓ의 수준으로 적합한 구성체로부터의 대장균내 봉입체로서 발현되었다.
대장균 세포를 용해시키고, 봉입체를 약 80% 순도로 정제하였다. 봉입체로부터의 단백질을 6M 구아니딘-HCl, 50mM 트리스 pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM DTT, 10mM EDTA 중에서 변성시키고, 변성 단백질의 단일 펄스를 < 5℃에서 리폴드 완충제로 가하여, 중쇄 30㎎/ℓ, 0.4M L-아르기닌으로의 β2m 30㎎/ℓ, 100mM 트리스 pH 8.1, 3.7mM 시스타민 디하이드로클로라이드, 6.6mM 시스테아민 하이드로클로라이드, HLA-A*02 분자에 의하여 가중되는 데 필요한 AFP 펩티드 4㎎/L의 농도에서 리폴딩하였다. 리폴딩으로 4℃에서 1시간 이상 동안 완료에 이르도록 하였다.
완충제를 10mM 트리스 pH 8.1 10용적 중에서 투석에 의하여 교환하였다. 그 다음, 단백질 용액을 1.5μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통하여 여과하고, POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼(8㎖ 흡착제 용적)으로 가중시켰다. 단백질을 악타® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 pH 8.1 10mM 트리스 중에서 선형 0-500mM NaCl 구배로 용출시켰다. 대략 250mM NaCl에서 용출된 HLA-A*02-펩티드 착체 및 피크 분획을 수집하고, 프로테아제 억제제의 칵테일(Calbiochem)을 가하고, 분획을 얼음 위에서 냉각시켰다.
바이오티닐화 태깅(tagging)된 pHLA 분자를 동일한 완충제 중에서 평형화된 GE 헬스케어 신속 탈염 컬럼을 사용하여 10mM 트리스 pH 8.1, 5mM NaCl으로 완충제 교환하였다. 용출 즉시, 단백질 함유 분획을 얼음 위에서 냉각시키고, 프로테아제 억제제 칵테일(Calbiochem)을 가하였다. 그 다음, 바이오티닐화 시약을 가하였다: 1mM 비오틴, 5mM ATP(pH 8로 완충됨), 7.5mM MgCl2, 및 BirA 효소 5㎍/㎖[문헌(O' Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15)에 따라 정제됨). 혼합물을 실온에서 밤새 배양하였다.
겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 바이오티닐화 pHLA-A*01 분자를 정제하였다. GE 헬스케어 수퍼덱스® 75 HR 10/30 컬럼을 여과 PBS로 예비 평형화시키고, 바이오티닐화 반응 혼합물 1㎖를 가중시키고, 컬럼을 악타® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 PBS로 0.5㎖/min로 전개하였다. 바이오티닐화 pHLA-A*02 분자를 약 15㎖로 단일 피크로서 용출시켰다. 단백질을 함유하는 분획을 풀링시키고, 얼음 위에서 냉각시키고, 프로테아제 억제제 칵테일을 가하였다. 쿠마시 결합 검정(PerBio)을 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 바이오티닐화 pHLA-A*02 분자의 분액을 -20℃에서 냉동시켜 저장하였다.
비아코어® 3000 표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서로 수용체 리간드 상호 작용을 검출하고, 이의 친화도 및 반응 속도 파라미터를 분석하는 데 사용될 수 있는 원리인, 작은 플로우 셀 내에서 센서 표면 부근의 반응 단위(RU)로 나타낸 굴절률 변화를 측정한다. 비아코어® 실험을 흐르는 완충제로서 PBS 완충제(Sigma, pH 7.1-7.5)를 사용하여, 단백질 샘플의 희석액 제조에서, 25℃의 온도에서 수행하였다. 스트렙타비딘을 표준 아민 커플링 방법에 의하여 플로우 셀에 부동화시켰다. pHLA 착체를 비오틴 택을 통하여 부동화시켰다. 그 다음, 일정한 유량에서 상이한 플로우 셀의 표면 위에 가용성 TCR을 통과시키고, 이렇게 하는 데 대한 SPR 반응을 측정하여 검정을 수행하였다.
평형 결합 상수
위의 비아코어® 분석 방법을 사용하여 평형 결합 상수를 측정하였다. 참조 AFP TCR 형태의 디설파이드 결합된 가용성 이종이량체성 형태의 연속 희석액을 제조하고, 2개의 상이한 플로우 셀 위에 5㎕min-1의 일정한 유량으로 주입하며; 하나는 특이적 HLA-A*02 착체 ~1000RU로 피복되고, 두 번째는 비특이적 HLA-A2-펩티드 착체 ~1000RU로 피복되었다. 대조 셀로부터의 측정치를 사용하여 각 농도에 대한 반응을 정규화시켰다. 정규화 데이터 반응을 TCR 샘플의 농도에 대하여 플로팅하고, 비선형 곡선 피팅 모델로 피팅하여 평형 결합 상수, KD를 계산하였다(Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2nd Edition) 1979, Clarendon Press, Oxford). 참조 AFP TCR(실시예 2)로부터의 디설파이드 결합된 가용성 형태는 약 754μM의 KD를 나타내었다. 동일한 비아코어® 데이터로부터 T½은 약 <0.5s였다.
반응 속도 파라미터
위의 비아코어® 분석 방법은 또한 사용하여 평형 결합 상수 및 오프율을 측정하였다.
높은 친화도 TCR(아래 실시예 4 참조)에 대하여 해리율 상수, koff, 및 결합율 상수, kon을 실험적으로 측정하여 KD를 측정하였다. 평형 상수 KD를 koff/kon으로서 계산하였다.
TCR을 2개의 상이한 셀 위에 주입하며, 하나는 FMNKFIYEI HLA-A*02 착체 ~1000 RU로 피복되고, 두 번째는 비특이 HLA-A2-펩티드 착체 ~1000RU로 피복되었다. 유량은 50㎕/min로 설정되었다. 통상적으로 ~ 1μM 농도에서 TCR 250㎕를 주입하였다. 그 다음, 완충제를 반응이 기준선으로 회귀하거나, >2시간이 경과할 때까지 유동시켰다. 운동속도 파라미터를 비아이벨류에이션(BIAevaluation)® 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 해리 상을 반감기의 계산을 가능하게 하는 단일 지수 붕괴 식에 피팅시켰다.
실시예 4
본 발명의 돌연변이 TCR 의 제조
파지 디스플레이는 보다 높은 친화도 돌연변이를 확인하기 위하여 AFP TCR 변이체의 라이브러리를 생성할 수 있는 한 가지 수단이다. 문헌(Li et al, (2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354)에 기재된 TCR 파지 디스플레이 및 스크리닝 방법을 실시예 1의 모 AFP TCR에 적용하였다.
알파 쇄 변이체 도메인 아미노산 잔기 31Q, 32S, 94D, 95S, 96G, 97Y 및 98A(서열 번호 2에 나타낸 넘버링을 사용함)에 하나 이상의 돌연변이를 갖는, 모 AFP TCR과 비교하여 개선된 결합성을 갖는 TCR을 확인하였다. 보다 높은 친화도 TCR의 알파 쇄(서열 번호 6 내지 20)의 가변 부위의 아미노산 서열의 특정 예는 도 5a 및 5b에 나타나 있다. 이들 알파 쇄는 CDR1 및/또는 CDR3에서 돌연변이된다.
본 발명의 다음 TCR에 대하여 TCR α-쇄 및 β-쇄를 각각 함유하는 발현 플라스미드를 실시예 1에서와 같이 제조하였다:
Figure 112016012175412-pct00016
플라스미드를 ~0.6-0.8의 OD600으로 TYP(암피실린 100㎍/㎖) 배지 중에서 37℃에서 성장된 단일 암피실린-저항성 콜로니 및 대장균 균주 BL21pLysS로 개별적으로 형질전환한 후, 0.5mM IPTG으로 단백질 발현을 유도하였다. 세포를 베크만 J-6B에서 4000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 도입후 3시간 채취하였다. 세포 펠릿을 MgCl2 및 DNaseI의 존재하에 벅 버스터®(Novagen) 25㎖로 용해시켰다. 봉입체 펠릿을 베크만 J2-21 원심분리기에서 13000rpm에서 30분 동안 원심분리시켜 회수하였다. 그 다음, 3개의 세제 세척을 수행하여 세포 파편 및 막 성분을 제거하였다. 매번 봉입체 펠릿을 트리톤 완충제(50mM 트리스-HCI pH 8.0, 0.5% 트리톤-X100, 200mM NaCl, 10mM NaEDTA) 중에서 균질화시킨 후, 베크만 J2-21에서 13000rpm에서 15분 동안 원심분리시켜 펠릿화하였다. 그 다음, 다음 완충제: 50mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM NaEDTA 중에서 유사한 세척에 의해 세제 및 염을 제거하였다. 최종적으로, 봉입체를 30㎎ 분액으로 나누고, -70℃에서 냉동시켰다. 봉입체 단백질 수율을 6M 구아니딘-HCl로 가용화시켜 정량화하고, 히타치 U-2001 분광광도계에서 OD 측정을 수행하였다. 그 다음, 소광 계수를 사용하여 단백질 농도를 계산하였다.
본 발명의 각각의 TCR에 대하여 대략 TCR β 쇄 10mg 및 TCR α 쇄 10mg 가용화된 봉입체를 구아니딘 용액(6M 구아니딘-하이드로클로라이드, 50mM 트리스 HCl pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM DTT) 10㎖로 희석하여, 완전한 쇄 변성을 보장하였다. 완전히 환원되고 변성된 TCR 쇄를 함유하는 구아니딘 용액을 그 다음, 0.5ℓ의 다음 리폴딩 완충제: 100mM 트리스 pH 8.1, 400mM L-아르기닌, 2mM EDTA, 5M 우레아로 주입하였다. 각각 6.6mM 및 3.7mM의 최종 농도에 대한 산화환원 커플(시스테아민 하이드로클로라이드 및 시스타민 디하이드로클로라이드)을 약 5분 동안 가한 후, 변성 TCR 쇄를 가한다. 용액을 ~30분 동안 방치하였다. 리폴딩된 TCR을 10ℓ H2O에 대하여 스펙트라/포어(Spectra/Por)® 1 막(스펙트럼; 제품 번호 132670)에서 18-20시간 동안 투석하였다. 그 이후, 투석 완충제를 새로운 10mM 트리스 pH 8.1(10ℓ)로 2회 변경하고, 투석을 5℃±3℃에서 추가로 ~8시간 동안 지속하였다.
투석된 리폴드를 POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼 위에 가중시키고 악타® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 15개의 컬럼 용적에 걸쳐 10mM 트리스 pH 8.1 중에서 0-500mM NaCl의 구배로 결합 단백질을 용출시켜, 가용성 TCR을 분해 생성물 및 불순물로부터 분리하였다. 그 다음, 풀링된 분획을 4℃에서 저장하고, 쿠마시 착색된 SDS-PAGE에 의하여 분석한 후, 풀링 및 농축시켰다. 최종적으로, 가용성 TCR을 정제하고, PBS 완충제(Sigma) 중에서 예비 평형화된 GE 헬스케어 수퍼덱스® 75HR 겔 여과 컬럼을 사용하여 특징화하였다. 약 50kDa의 상대 분자량에서 용출한 피크를 풀링시키고 농축시킨 후, 비아코어® 표면 플라스몬 공명 분석에 의하여 특징화시켰다.
AFP 에피토프에 대한 이렇게 제조된 TCR의 친화도 프로파일을 실시예 3의 방법을 사용하여 검정하고, 참조 TCR과 비교하였다. 결과를 다음 표에 나타낸다:
Figure 112016012175412-pct00017
실시예 5
모 가변 AFP TCR 로 T-세포 형질감염
(a) 293T 세포의 익스프레스-인(Express-In) 매개된 일시적 형질감염에 의한 렌티바이러스성 벡터 제조
제3 세대 렌티바이러스성 패키징 시스템을 사용하여 목적하는 TCR을 인코딩하는 유전자를 함유하는 렌티바이러스성 벡터를 패키징하였다. 293T 세포를 익스프레스-인 매개된 형질감염(Open Biosystems)을 사용하여, 4개의 플라스미드(실시예 5c(아래)에 기재된 TCR 알파 쇄-P2A-TCR 베타 쇄 단일 ORF 유전자를 함유하는 하나의 렌티바이러스성 벡터, 및 감염성이지만 비복제성 렌티바이러스성 입자를 구성하는 데 필요한 기타 성분들을 함유하는 3개의 플라스미드)로 형질감염시켰다.
형질감염을 위하여 지수 성장 상에서 세포가 플레이트 상에 균일하게 분포되어 있고, 합류가 50%를 약간 초과하는, 293T 세포의 하나의 T150 플라스크를 취한다. 익스프레스-인 분액을 실온이 되도록 한다. 멸균 15㎖ 원추형 관에 무혈청 배지(RPMI 1640 + 10mM HEPES) 3㎖를 넣는다. 익스프레스-인 시약 174㎕를 무혈청 배지로 직접 가한다(이는 DNA에 대한 시약의 3.6:1 중량비를 제공함). 관을 3-4회 뒤집어 완전히 혼합하고 실온에서 5-20분 동안 배양한다.
개별적인 1.5㎖ 마이크로튜브에서, 플라스미드 DNA 15㎍을 예비혼합된 패키징 믹스 분액(pRSV.REV(Rev 발현 플라스미드) 18㎍, pMDLg/p.RRE(Gag/Pol 발현 플라스미드) 18㎍, pVSV-G(VSV 당단백질 발현 플라스미드) 7㎍을 함유함)에 통상적으로 ~22㎕로 가하고, 상부 및 하부 피펫팅하여 DNA 믹스의 균질성을 보장한다. 익스프레스-인/무혈청 배지 ~1㎖를 DNA 믹스에 적가한 다음, 약하게 상부 및 하부 피펫팅한 후, 익스프레스-인/무혈청 배지의 잔여물로 다시 옮긴다. 관을 3-4회 뒤집고, 실온에서 15-30분 동안 배양한다.
세포의 플라스크로부터 오래된 배양 배지를 제거한다. 익스프레스-인/배지/DNA(3㎖) 착체를 293 T 세포의 업라이트 플라스크의 기저로 직접 가한다. 서서히, 플라스크를 평평하게 두어 세포를 커버하고, 플라스크를 매우 약하게 흔들어 균일한 분포를 보장한다. 1분 후, 새로운 배양 배지(R10+HEPES: RPMI 1640, 10% 열 불활성화 FBS, 1% Pen/Strep/L-glutamine, 10mM HEPES) 22㎖를 가하고, 배양기로 조심스럽게 회귀한다. 37℃/5% CO2에서 밤새 배양한다. 24시간 후, 패키징된 렌티바이러스성 벡터를 함유하는 배치 채취를 진행한다.
패키징된 렌티바이러스성 벡터를 채취하기 위하여, 세포 배양물 상청액을 0.45μ 나일론 시린지 필터를 통하여 여과하고, 배양 배지는 10,000g에서 18시간 동안(또는 112,000g에서 2시간 동안) 원심분리하고, 대부분의 상청액을 제거하고(펠릿을 건드리지 않도록 주의함), 펠릿을 잔여 상청액 수 ㎖에 재현탁시킨다(통상적으로 관당 출발 용적 약 2 내지 31㎖). 분액 1㎖를 드라이 아이스 상에서 급속 냉동(snap freeze)시키고, -80℃에서 저장한다.
(b) 목적하는 유전자를 함유하는 T 세포의 패키징된 렌티바이러스성 벡터를 사용한 형질도입
패키징된 렌티바이러스성 벡터로 형질도입하기 전에, 건강한 지원자의 혈액으로부터 사람 T 세포(필요에 따라 CD8 또는 CD4 또는 둘 다)를 분리한다. 이들 세포를 계수하고, 예비 세척된 항-CD3/CD28 항체 피복된 마이크로비드(Dynabeads® T cell expander, Invitrogen)를 세포당 3개의 비드의 비로 포함한 48 웰 플레이트에서 ㎖당 50 U/㎖ IL-2를 1×106 세포(0.5㎖/웰)로 함유하는 R10 중에서 밤새 배양한다.
밤새 자극 후, 순수한 패키징된 렌티바이러스성 벡터 0.5㎖를 목적하는 세포로 가한다. 37℃/5% CO2에서 3일 동안 배양한다. 형질도입 3일 후 세포를 계수하고 0.5×106 세포/㎖로 희석한다. IL-2를 필요한 만큼 함유하는 새로운 배지를 가한다. 비드를 형질도입 5-7일 후 제거한다. 세포를 계수하고, 2일 간격으로 IL-2를 함유하는 새로운 배지를 대체시키거나 가한다. 세포를 0.5×106 및 1×106 세포/㎖로 유지한다. 세포를 제3일부터 유동 세포 분석법으로 분석하고, 제5일부터 기능 평가에 대하여 사용하였다(예: IFNγ 방출에 대한 ELISpot, 실시예 6 참조). 제10일부터, 또는 세포가 느리게 분열하여 크기가 감소될 때, 세포를 저장을 위하여 4×106 세포/바이얼 이상의 분액 중에서(90% FBS/10% DMSO 중의 1×107 세포/㎖로) 냉동시킨다.
(c) 위의 방법(a) 및 (b)에 의한 T-세포 형질감염에 대한 모 TCR 유전자
도 7은 모 AFP TCR을 인코딩하는 DNA 서열(서열 번호 23)(최대 사람 세포 발현을 위하여 코돈 최적화됨)이다. 이는 전장 알파 쇄 - 포르신 테스코바이러스- 1 2A - 전장 베타 쇄 단일 개방 리딩 프레임 구성체이다. 2A 서열은 밑줄쳐 있고, 2A 서열의 단백질 가수분해적 제거를 보조하는 퓨린 분할 사이트를 인코딩하는 뉴클레오티드에 의하여 진행된다(도 8a 및 8b(서열 번호 24)에 관하여 아래에 추가로 논의되어 있음). 2A 서열의 3' 말단에서 mRNA의 단백질 번역 동안의 펩티드 결합 스킵핑(skipping)은 두 개의 단백질: 1) 알파 TCR 쇄-2A 융합, 2) 베타 TCR 쇄를 생성한다. 서열 번호 23은 NheI 및 SalI 제한 부위를 포함한다(밑줄).
도 8a 및 8b는 도 7에 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 24)이다.
도 8a 및 8b에서:
M1-Q22는 모 알파 쇄 TCR의 성숙시 제거되는 리더 서열이고;
Q23-S274는 모 알파 쇄 서열에 상응하고;
Q23-N246은 모 알파 쇄 세포외 도메인에 상응하고;
L247-T268은 성숙 TCR의 알파 쇄 막관통 부위이고;
L269-S274는 성숙 TCR의 알파 쇄 세포내 부위이고;
R277-R280은 P2A 서열 A285-P303의, 골지(Golgi) 장치에서, 단백질 가수분해 제거를 보조하는 퓨린 분할 부위이고;
G275, S276, S281 내지 G284는 퓨린 분할 및 P2A 서열의 전체 기능을 가능하게 하는 가요성 링커이고;
R304-V323은 모 베타 쇄 TCR의 성숙시 제거되는 리더 서열이고;
D324-G614는 모 베타 쇄 서열에 상응하고;
D324-E585는 모 베타 쇄 세포외 도메인에 상응하고;
I586-V607은 성숙 TCR의 베타 쇄 막관통 부위이고;
K608-G614는 성숙 TCR의 베타 쇄 세포내 부위이다.
(d) 모 고 친화도 AFP TCR로 형질감염된 T-세포
위의 (a) 및 (b)에 기재된 절차를 따라, 모 AFP 알파-2A-베타 TCR 유전자(서열 번호 23(도 7))를 두 DNA 구성체 모두에 유일한 NheI 및 SalI 제한 부위를 사용하여 pELNSxv 렌티 벡터로 삽입하고, 생성된 T-세포를 형질감염시켰다.
유사하게, T-세포를 모 베타 쇄 서열번호 3의 가변 도메인 서열(D1 내지 T112)과 결합된 서열 번호 6 내지 20중 하나를 갖는 알파 쇄 가변 도메인을 인코딩함을 제외하고, 서열 번호 23(도 7)과 동일한 유전자를 사용한 형질감염에 의하여 생성할 수 있다.
실시예 6
AFP TCR 조작 T 세포의 활성화
다음 검정을 수행하여 종양 세포주에 반응하는 TCR 형질도입된 세포독성 T 림프구(CTL)을 나타내었다. ELISPOT 검정을 사용하여 측정되는 바와 같이, IFN-γ 생성을 세포독성 T 림프구(CTL) 활성화에 대한 판독으로서 사용하였다.
ELISPOT
시약
검정 배지: 10% FCS(Gibco, Cat# 2011-09), 88% RPMI 1640(Gibco, Cat# 42401), 1% 글루타민(Gibco Cat# 25030) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco Cat# 15070-063).
세척 완충제: 0.01M PBS/0.05% Tween 20
PBS(Gibco Cat# 10010)
AEC 기판 세트(BD Bioscience, Cat# 551951)와 결합된, 포획 및 검출 항체, 및 사람 IFN-γ PVDF ELISPOT 96 웰 플레이트를 포함하는 사람 IFNγ ELISPOT 키트(BD Bioscience; Cat# 551849).
방법
표적 세포 제조
이 방법에 사용되는 표적 세포를 자연 에피토프 제공 세포: 둘 다 HLA-A2+ AFP+인HepG2 간세포 암종 세포. HLA-A2+ AFP-인 HEP2 정상 사람 간세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 충분한 표적 세포(50,000 세포/웰)를 메가퓨즈(Megafuge)® 1.0(Heraeus)에서 10분 동안, 1200rpm에서 3회 원심분리하여 세척하였다. 그 다음, 세포를 106 세포/㎖로 검정 배지에 재현탁시켰다.
작동체 세포 제조
당해 방법에 사용된 작동체 세포(T 세포)는 건강한 지원자의 정맥혈로부터의 새로이 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 CD14 및 CD25 마이크로비드 키트(각각 Miltenyi Biotech Cat# 130-050-201 및 130-092-983)를 사용하여 음의 선택하여 수득한, 말초 혈액 림프구(PBL)이었다. 세포를 목적하는 전체 αβ TCR을 형질도입 후 10일에서 13일 사이까지, 인코딩하는 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 형질도입되고(실시예 5에 기재되고 도 7에 나타낸 구성체를 기반으로 한), IL-2 50U/㎖를 함유하는 검정 배지에서 증량된, 항 CD3/CD28 피복된 비드(Dynabeads® T 세포 증량베, Invitrogen)로 자극하였다. 그 다음, 이들 세포를 검정 배지에 넣은 다음, 메가퓨즈® 1.0(Heraeus)에서 10분 동안, 1200rpm에서 원심분리하여 세척하였다. 세포를 최종 필요 농도 4배에서 검정 배지에 재현탁시켰다
플레이트를 다음과 같이 제조하였다: 항-IFN-γ 포획 항체 100㎕를 플레이트당 멸균 PBS 10㎖에 희석하였다. 그 다음, 희석 포획 항체 100㎕를 각 웰로 분배하였다. 그 다음, 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 세척하여[프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스(Ultrawash Plus) 96-웰 플레이트 워셔; Dynex] 포획 항체를 제거하였다. 그 다음, 각 웰에 검정 배지 200㎕를 가하여 플레이트를 차단하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 그 다음, 검정 배지를 플레이트로부터 세척하고(프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스 96-웰 플레이트 워셔, Dynex), 어떠한 잔여 배지라도 종이 타월 상에서 ELISPOT 플레이트를 털고 두드려서 제거하였다.
이어서, 검정의 성분을 다음 순서로 ELISPOT 플레이트에 가하였다:
표적 세포 106 세포/㎖ 50㎕(총 50,000 표적 세포/웰 제공)
배지 50㎕ (검정 배지)
작동체 세포 50㎕(20,000 TCR-형질도입된 PBL 세포/웰)
그 다음, 플레이트를 밤새 배양하였다(37℃/ 5% CO2). 다음 날, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고(프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스 96-웰 플레이트 워셔, Dynex), 종이 타월 상에서 두드려서 건조하여 과량의 세척 완충제를 제거하였다. 그 다음, 주요 검출 항체 100㎕를 각각의 웰에 가하였다. 주요 검출 항체를 제조자의 설명서에 명시된 희석을 사용하여 희석 완충제 10㎖(단일 플레이트에 필요한 용적)로 희석하였다. 그 다음, 플레이트를 실온에서 2시간 이상 배양한 다음, 세척 완충제로 3회 세척하고(프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스 96-웰 플레이트 워셔, Dynex); 과량의 세척 완충제를 종이 타월 상에서 플레이트를 두드려서 제거하였다.
제2 검출을 희석 스트렙타비딘-HRP 100㎕를 각각의 웰에 가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하여 수행하였다 스트렙타비딘-HRP를 제조자의 설명서에 명시된 희석을 사용하여, 희석 완충제 10㎖(단일 플레이트에 필요한 용적)로 희석하였다. 그 다음, 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고(프로그램 1, 플레이트 2형, 울트라워시 플러스 96-웰 플레이트 워셔, Dynex), 종이 타월 상에서 플레이트를 두드려서 과량의 세척 완충제를 제거하였다. 그 다음, 각 웰에 200㎕를 가하고, 종이 타월 상에서 완충제를 털고 두드려서 과량의 완충제를 제거함으로써 플레이트를 PBS로 2회 세척하였다. 사용전 15분 이하로, AEC 색소원 한 방울(20ul)을 AEC 기판 각 1㎖에 가하고, 혼합하였다. 이 용액 10㎖를 각 플레이트에 대하여 제조하고; 웰당 100㎕를 가하였다. 그 다음, 플레이트를 포일을 사용하여 광으로부터 보호하고, 스포트 전개를 정기적으로, 통상적으로 5-20분 내에 발생하여 모니터링하였다. 플레이트를 수돗물에 세척하여 전개 반응을 종결시키고, 건조 진탕시킨 후, 3개의 구성 부분들로 이를 분해하였다. 그 다음, 플레이트를 2시간 이상 동안 실온에서 건조시킨 후, 이뮤노스포트(Immunospot)® 플레이트 리더(Plate reader)(CTL; Cellular Technology Limited)를 사용하여 스포트를 계수하였다.
결과
다양한 AFP-양성 및 대조 종양 세포주에 반응하는 활성화 TCR-형질도입 T 세포에 의한 IFNγ 방출을 ELISPOT 검정에 의하여 시험하였다(위에서 기재한 바와 같음). 각 웰에서 관찰된 ELISPOT 스포트의 수를 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism)®을 사용하여 플로팅하였다.
WT TCR 또는 TCR Nos:1-5 중의 하나를 발현하는 CD4+, CD8+ 또는 혼합 CD4+/CD8+ T 세포(아래 표에 기재된 바와 같음)를 AFP+ HLA:A2+ 종양 세포주 HepG2 또는 AFP- HLA:A2+ HEP2 정상 간세포로 배양하였다. T 세포를 함유하지 않은 샘플을 대조군으로서 사용하였다.
Figure 112016012175412-pct00018
도 9는 위의 표에 기재된 TCR로 형질도입된 T 세포가 AFP 양성 종양 세포(HepG2)에 반응하여 활성화됨을 나타낸다. 이들 가변 TCR의 활성화는 WT TCR에 대해서보다 크다. AFP 음성 정상 간세포(HEP2)에 의한 활성화는 최소로 AFP에 대한 TCR의 특이성을 나타낸다.
<110> Adaptimmune Ltd <120> T cell receptors <130> 15IC15106 <150> 1313377.2 <151> 2013-07-26 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Ile 1 5 <210> 2 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 130 135 140 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 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Ser Leu Leu Val Thr Pro His 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 130 135 140 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 145 150 155 160 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 165 170 175 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 180 185 190 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 14 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 14 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gln Ser Gly 85 90 95 Val Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 130 135 140 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 145 150 155 160 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 165 170 175 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 180 185 190 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 15 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 15 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gln Asn Gly 85 90 95 Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 130 135 140 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 145 150 155 160 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 165 170 175 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 180 185 190 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 16 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 16 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Phe Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 130 135 140 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 145 150 155 160 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 165 170 175 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 180 185 190 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 17 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 17 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Tyr Ser 20 25 30 Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln 65 70 75 80 Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His 100 105 110 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 115 120 125 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 130 135 140 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 145 150 155 160 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 165 170 175 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 180 185 190 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 18 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain variable domain <400> 18 Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser 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Asn Asn Ser Ile 180 185 190 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 195 200 205 <210> 21 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain extracellular domain <400> 21 caaaaagaag ttgagcagaa ttctggaccc ctcagtgttc cagagggagc cattgcctct 60 ctcaactgca cttacagtga ccgaggttcc cagtccttct tctggtacag acaatattct 120 gggaaaagcc ctgagttgat aatgtccata tactccaatg gtgacaaaga agatggaagg 180 tttacagcac agctcaataa agccagccag tatgtttctc tgctcatcag agactcccag 240 cccagtgatt cagccaccta cctctgtgcc gtgaatagtg attccgggta tgcactcaac 300 ttcggcaaag gcacctcgct gttggtcaca ccccatatcc agaaccctga ccctgccgtg 360 taccagctga gagactctaa gtcgagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 420 tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaatgtgtg 480 ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 540 gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 600 agcccagaaa gttcc 615 <210> 22 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor alpha chain extracellular domain <400> 22 gattctggag tcacacaaac cccaaagcac ctgatcacag caactggaca gcgagtgacg 60 ctgagatgct cccctaggtc tggagacctc tctgtgtact ggtaccaaca gagcctggac 120 cagggcctcc agttcctcat tcagtattat aatggagaag agagagcaaa aggaaacatt 180 cttgaacgat tctccgcaca acagttccct gacttgcact ctgaactaaa cctgagctct 240 ctggagctgg gggactcagc tttgtatttc tgtgccagca gcctcggggg ggaatctgag 300 cagtacttcg ggccgggcac caggctcacg gtcacagagg acctgaaaaa cgtgttccca 360 cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca 420 ctggtgtgcc tggccaccgg tttctacccc gaccacgtgg agctgagctg gtgggtgaat 480 gggaaggagg tgcacagtgg ggtctgcaca gacccgcagc ccctcaagga gcagcccgcc 540 ctcaatgact ccagatacgc tctgagcagc cgcctgaggg tctcggccac cttctggcag 600 gacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag 660 tggacccagg atagggccaa acccgtcacc cagatcgtca gcgccgaggc ctggggtaga 720 gcagac 726 <210> 23 <211> 1867 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor fused to porcine teschovirus-1 2A <400> 23 gctagccgcc accatgatga agtccctgcg ggtgctgctg gtcatcctgt ggctgcagct 60 gtcctgggtc tggtcccagc agaaagaggt ggagcagaac agcggccctc tgagcgtgcc 120 cgagggcgct atcgccagcc tgaactgcac ctacagcgac agaggcagcc agagcttctt 180 ctggtacaga cagtacagcg gcaagagccc cgagctgatc atgagcatct acagcaacgg 240 cgacaaagag gacggccggt tcaccgccca gctgaacaag gccagccagt acgtgtccct 300 gctgatccgg gacagccagc ccagcgacag cgccacctac ctgtgcgccg tgaacagcga 360 ctccggctac gccctgaact tcggcaaggg caccagcctg ctggtgacac cccacattca 420 gaaccccgac cccgccgtgt accagctgcg ggacagcaag agcagcgaca agagcgtgtg 480 cctgttcacc gacttcgaca gccagaccaa cgtgtcccag agcaaggaca gcgacgtgta 540 catcaccgac aagaccgtgc tggacatgcg gagcatggac ttcaagagca acagcgccgt 600 ggcctggtcc aacaagagcg acttcgcctg cgccaacgcc ttcaacaaca gcatcatccc 660 cgaggacaca tttttcccaa gccccgagag cagctgcgac gtcaaactgg tggagaagtc 720 cttcgagaca gacaccaacc tgaacttcca gaacctgagc gtgatcggct tcagaatcct 780 gctgctgaag gtggccggct tcaatctgct gatgaccctg cggctgtggt ccagcggcag 840 cagagccaag agaagcggat ccggcgccac caacttcagc ctgctgaagc aggccggcga 900 cgtggaggaa aaccctggcc ctaggatggg cttccggctg ctgtgctgcg tggccttctg 960 cctgctggga gccggccctg tggatagcgg cgtgacccag acccccaagc acctgatcac 1020 cgccaccggc cagagagtga ccctgcgctg cagccctaga agcggcgacc tgtccgtgta 1080 ctggtatcag cagagcctgg accagggact gcagttcctc atccagtact acaacggcga 1140 ggaacgggcc aagggcaaca tcctggaaag attcagcgcc cagcagttcc ccgacctgca 1200 cagcgagctg aacctgagca gcctggaact gggcgactcc gccctgtact tctgcgccag 1260 cagcctgggc ggcgagagcg aacagtactt cggccctggc acccggctga cggtaaccga 1320 ggacctgaag aacgtgttcc ccccagaggt ggccgtgttc gagccctctg aggccgagat 1380 cagccacacc cagaaagcca ccctggtctg cctggccacc ggcttctacc ccgaccacgt 1440 ggaactgtct tggtgggtga acggcaaaga ggtgcacagc ggcgtcagca ccgaccctca 1500 gcccctgaaa gagcagcccg ccctgaacga cagccggtac tgcctgagca gcagactgcg 1560 ggtgtccgcc accttctggc agaacccccg gaaccacttc agatgccagg tgcagttcta 1620 cggcctgagc gagaacgacg agtggaccca ggaccgggcc aagcctgtga cccagatcgt 1680 gtctgccgaa gcatgggggc gcgccgattg cggcttcaca agcgagagct accagcaggg 1740 cgtgctgagc gccaccatcc tgtacgagat cctgctgggc aaggccaccc tgtacgccgt 1800 gctggtgtcc gctctggtgc tgatggccat ggtgaaacgg aaggacagcc ggggctaata 1860 agtcgac 1867 <210> 24 <211> 614 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell receptor fused to porcine teschovirus-1 2A <400> 24 Met Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu 1 5 10 15 Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro 20 25 30 Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser 35 40 45 Asp Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys 50 55 60 Ser Pro Glu Leu Ile Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp 65 70 75 80 Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu 85 90 95 Leu Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Val Asn Ser Asp Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser 115 120 125 Leu Leu Val Thr Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 130 135 140 Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 145 150 155 160 Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr 165 170 175 Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser 180 185 190 Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn 195 200 205 Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro 210 215 220 Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp 225 230 235 240 Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu 245 250 255 Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 260 265 270 Ser Ser Gly Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe 275 280 285 Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 290 295 300 Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala 305 310 315 320 Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr 325 330 335 Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp 340 345 350 Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe 355 360 365 Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu 370 375 380 Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser 405 410 415 Ser Leu Gly Gly Glu Ser Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 420 425 430 Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 435 440 445 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 450 455 460 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 465 470 475 480 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln 485 490 495 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser 500 505 510 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His 515 520 525 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 530 535 540 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 545 550 555 560 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly 565 570 575 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 580 585 590 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys 595 600 605 Arg Lys Asp Ser Arg Gly 610 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 gaattccata tgcaaaaaga agttgaacaa aattctggac ccctc 45 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 26 ttgtcagtcg acttagagtc tctcagctgg tacacg 36 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 gaattccata tggattctgg agttacacaa accccaaagc acctg 45 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 tagaaaccgg tggccaggca caccagtgtg gc 32

Claims (20)

  1. FMNKFIYEI(서열 번호 1)의 아미노산 서열인 HLA-A2 착체에 결합하는 특성을 갖고, 하나 이상의 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및 하나 이상의 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하는 인공 및/또는 정제 및/또는 조작 T 세포 수용체(TCR)로서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 또는 서열 번호 15의 Q1 내지 H112를 포함하고,
    상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열 번호 3의 D1 내지 T112를 포함하는 T 세포 수용체.
  2. 제1항에 있어서,
    알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 갖는 T 세포 수용체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)이 절단 또는 치환에 의하여 변형되어 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 자연 디설파이드 결합을 삭제하는 T 세포 수용체.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)이 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57에 대한 시스테인 잔기의 치환에 의하여 변형되고, 상기 시스테인이 TCR의 상기 알파와 베타 불변 도메인 사이의 디설파이드 결합을 형성하는 T 세포 수용체.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ 또는 Vα-Cα-L-Vβ-Cβ형의 단일 쇄 형식(여기서, Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 부위이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 부위이고, L은 링커 서열이다)인 T 세포 수용체.
  6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    알파-베타 이종이량체인 T 세포 수용체.
  7. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    검출 가능한 표지, 치료제 또는 PK 변형 잔기와 결합된 T 세포 수용체.
  8. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩하는 인공 및/또는 정제 및/또는 조작 핵산.
  9. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 T 세포 수용체(TCR)를 제공하는, 인공 및/또는 정제 및/또는 조작 세포 또는 T-세포.
  10. (a) 단일 개방 리딩 프레임, 또는 2개의 개별 개방 리딩 프레임에서 각각 상기 알파 쇄 및 상기 베타 쇄를 인코딩하는 제8항에 따르는 핵산을 포함하는 TCR 발현 벡터; 또는
    (b) 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 TCR의 상기 알파 쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 T 세포 수용체(TCR)의 상기 베타 쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 하버링하는 세포.
  11. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 T 세포 수용체(TCR), 또는 제7항에 따르는 세포를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물.
  12. 의학에 사용하기 위한, 펩티드-HLA-A2 착체로서 제공되는 FMNKFIYEI(서열 번호 1) 펩티드를 결합하는 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 인공 및/또는 정제 및/또는 조작 TCR.
  13. 제12항에 있어서,
    암 치료 방법에 사용하기 위한, TCR.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 방법이 입양 요법을 포함하는, TCR.
  15. 의학에 사용하기 위한, 펩티드-HLA-A2 착체로서 제공되는 FMNKFIYEI(서열 번호 1) 펩티드를 결합하는 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는, 인공 및/또는 정제 및/또는 조작 TCR을 발현하고/하거나 제공하는, 제 9항에 따르는 세포..
  16. 제15항에 있어서,
    암 치료 방법에 사용하기 위한, 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 방법이 입양 요법을 포함하는, 세포.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
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