CN111153984A - T细胞受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合衍生自甲胎蛋白(AFP)的HLA‑A2限制的FMNKFIYEI(158‑166)肽表位的T细胞受体(TCR)。本发明的某些优选的TCR显示对该AFP表位的出色结合性质和特异性概况。本发明的T细胞受体包含至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个TCRβ链可变结构域，该α链可变结构域包含与SEQ ID No:2的氨基酸残基1‑112的序列有至少90％相同性的氨基酸序列，和/或该β链可变结构域包含与SEQ ID No:3的氨基酸残基1‑112的序列有至少90％相同性的氨基酸序列。

Description

T细胞受体
本发明涉及结合衍生自甲胎蛋白(AFP)的HLA-A2限制的FMNKFIYEI(158-166)肽表位的T细胞受体(TCR)。本发明的某些优选的TCR显示对该AFP表位的出色结合性质和特异性概况。
AFP在胎儿发育期间表达并且是胎儿血清的主要成份。在发育期间，该蛋白由卵黄囊和肝脏以高水平产生并且在之后被抑制。AFP表达经常在肝细胞癌中再激活(Butterfield等，J Immunol.,2001年4月15日；166(8):5300-8)并且高水平的该蛋白质被用作疾病的诊断标志物。
在美国，肝细胞癌是报告5年存活率最低的所有恶性肿瘤之一，总的每年发病为120万，并且由于乙型肝炎和丙型肝炎的流行而可能上升。治疗一般包括手术，然而，这只是在疾病的早期进行时有益。因此，需要新的治疗。
存在4种已知的衍生自AFP的表位：AFP158、AFP137、AFP325和AFP542(Butterfield等，J Immunol.,2001年4月15日；166(8):5300-8和Butterfield等，Cancer Res.1999,59:3134-3142)。HLA-A2限制的AFP158表位FMNKFIYEI(SEQ ID No:1)提供了新型免疫治疗介入的合适靶标；该肽经天然加工并从HepG2(HLA-A2阳性)干细胞系中洗脱并通过质谱检测(Butterfield等，J Immunol.,2001年4月15日；166(8):5300-8)。已经针对AFP158(和AFP137)生成T细胞克隆(Pichard等，J Immunother.2008年4月；31(3):246-53)。然而，还未报道识别这种肽的T细胞受体。
按照本发明的第一个方面，提供了一种非天然产生和/或纯化和/或工程改造的T细胞受体(TCR)，其具有结合FMNKFIYEI(SEQ ID No:1)HLA-A2复合物的性质并且包含至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个TCRβ链可变结构域，
α链可变结构域包含与SEQ ID No:2的氨基酸残基1-112的序列有至少90％相同性的氨基酸序列，和/或
β链可变结构域包含与SEQ ID No:3的氨基酸残基1-112的序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方式中，α链可变结构域具有与SEQ ID No:2的氨基酸残基1-112至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。
β链可变结构域具有与SEQ ID No:3的氨基酸残基1-112至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。
使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名描述TCR并且连接到TCR序列的IMGT公共数据库。天然α-β异二聚体TCR具有α链和β链。广泛地，各链包含可变、连接和恒定区，并且β链通常含有可变区和连接区之间的短多变区，但是该多变区通常被认为是连接区的部分。各可变区包含包埋于构架序列中的3个CDR(互补决定区)，一个是称为CDR3的高变区。存在几种类型的α链可变区(Vα)和几种类型的β链可变区(Vβ)，它们通过它们的构架、CDR1和CDR2序列，以及通过部分限定的CDR3序列区分。Vα型在IMGT命名中由独特的TRAV数指代。因此，“TRAV21”定义具有独特构架和CDR1以及CDR2序列和CDR3序列的TCR Vα，该CDR3部分被氨基酸序列定义，该氨基酸序列在TCR之间保守，但是其也包含TCR之间变化的氨基酸序列。以相同的方式，“TRBV5-1”定义了具有独特的构架与CDR1和CDR2序列，但是仅仅有部分定义的CDR3序列的TCR Vβ区。
类似地，TCR的连接区由独特IMGT TRAJ和TRBJ命名所定义，并且恒定区由IMGTTRAC和TRBC命名所定义。
β链多变区在IMGT命名中以缩写TRBD提及并且如上所述，级联的TRBD/TRBJ区通常一起被认为是连接区。
αβTCR的α和β链一般被认为各自具有称为可变和恒定结构域/区的2个“结构域”或“区”。术语“结构域”和“区”在本文中可互换使用。可变结构域由可变区和连接区的级联组成。在本申请的说明书和权利要求中，术语“TCRα可变结构域”因此是指TRAV和TRAJ区的级联，并且术语TCRα恒定结构域是指胞外TRAC区或者是指C-末端截短的TRAC序列。类似地，术语“TCRβ可变结构域”是指TRBV和TRBD/TRBJ区的级联，并且术语TCRβ恒定结构域是指胞外TRBC区或者是指C-末端截短的TRBC序列。
由IMGT命名定义的独特序列是TCR领域工作人员广泛熟知并可得的。例如，可在IMGT公共数据库中检索到它们。《T细胞受体资料手册》(T cell Receptor Factsbook)，(2001)LeFranc和LeFranc，学术出版社(Academic Press)，ISBN 0-12-441352-8也公开了由IMGT命名定义的序列，但是由于其出版日期和随后的时间延迟，其中的信息有时需要通过参考IMGT数据库来确认。
SEQ ID NO：2和3分别是在本文中称为“亲本”AFP TCR的α和β链胞外序列。亲本AFPTCR具有以下的α和β链：
α链：TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC(图1给出了亲本AFP TCRα链的胞外序列(SEQID No:2))。由SEQ ID NO:2的氨基酸27-32(CDR1)、50-55(CDR2)和90-101(CDR3)定义CDR。
β链：TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2(图2给出了亲本AFP TCRα链的胞外序列(SEQ ID No:3))。由SEQ ID NO:3的氨基酸27-31(CDR1)、49-54(CDR2)和92-102(CDR3)定义CDR。
(注：术语“*01”和“*02”表示该序列如IMGT命名所示存在超过一种等位基因变体，并且是在上述的TCR克隆中存在的*01/*02变体。也请注意没有限定符“*”表示相关序列仅已知一种等位基因。)
出于提供可与本发明的突变TCR的结合概况比较的参考TCR的目的，使用具有图3给出的AFP TCRα链的胞外序列(SEQ ID No:4)和图4给出的AFP TCRβ链的胞外序列(SEQ IDNo:5)是便利的。该TCR在本文中称为“参考TCR”或“参考AFP TCR”。注意到SEQ ID No:4与亲本α链胞外序列SEQ ID No:2相同，除了C159已被T159所取代(即，TRAC的T48)。类似地，SEQID No:5与亲本β链胞外序列SEQ ID No:3相同，除了C169已被S169(即，TRBC2的S57)所取代，A187已被C187所取代并且D201已被N201所取代。这些与亲本AFPα和β链胞外序列相关的半胱氨酸取代能够形成链间二硫键，其使得重折叠的可溶性TCR稳定化，即通过重折叠胞外α和β链形成的TCR。使用稳定的二硫键连接的可溶性TCR作为参考TCR能够更方便地评价结合亲和性和结合半衰期。
本发明的TCR可被转化到T细胞中，使它们能够破坏呈递AFP HLA-A2复合物的细胞，用于给予处于称为过继性疗法的治疗过程中的患者。处于该目的，将希望如果该TCR对肽-HLA复合物有比对该复合物有特异性的天然TCR有更高的亲和性和/或较低的解离速率。亲和性的显著增加已与TCR基因修饰的CD8 T细胞中抗原特异性的损失关联，其可能导致这些TCR-转染的CD8细胞的非特异性激活。因此，对肽-HLA复合物具有比对该复合物具有特异性的天然TCR稍高的亲和性和/或稍低的解离速率，而不是对肽-HLA复合物具有比天然TCR明显高的亲和性和/或明显低的解离速率的TCR将优选用于过继性疗法(参见Zhao等，(2007)J Immunol.179:5845-54；Robbins等，(2008)J Immunol.180:6116-31；和WO2008/038002)。
本发明的实施方式包括相对于亲本AFP TCR突变的TCR。突变的TCR可包含α链可变结构域，参考SEQ ID No:2所示的编号，其在对应于31Q、32S、94D、95S、96G、97Y和98A的氨基酸的一个或多个中包含突变。例如，α链可变结构域可具有以下突变中的一个或多个：
残基编号
31Q F Y
32S A
94D Q
95S N
96G S
97Y V
98A S
上述使用的编号与图1所示的相同(SEQ ID No:2)。
α链可变结构域可包含与SEQ ID No:6、SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10、SEQ ID No:11、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:17、SEQ ID No:18、SEQ ID No:19和SEQ ID No:20中任意的残基1-112有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同性的氨基酸序列，并且优选地，该氨基酸序列也与SEQ ID No:2的残基1-112具有至少90％相同性。图5中带下划线的氨基酸可以是非变异的。
在一个实施方式中，TCR包含α链可变结构域，该α链可变结构域包含ID No:11、SEQID No:12或SEQ ID No:13的Q1至H112，和/或β链可变结构域，该β链可变结构域包含SEQ IDNO:3的D1至T112。
可使用任意合适的方法进行突变，包括但不限于，基于聚合酶链反应(PCR)、基于限制性酶的克隆或连接独立克隆(LIC)法的那些方法。这些方法在许多的标准分子生物学教科书中有详细描述。对于聚合酶链反应(PCR)和基于限制性酶的克隆的进一步详述，参见Sambrook和Russell,(2001)《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning–A LaboratoryManual)(第3版)，CSHL出版社。关于连接独立克隆(LIC)过程的其他信息可在Rashtchian，(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6中发现。
本文所述的任意TCR的表型沉默变体也在本发明的范围内。本文所用的术语“表型沉默变体”理解为是指具有在本文下述的KD和结合半衰期范围内的对FMNKFIYEI(SEQ IDNo:1)HLA-A2复合物的KD和/或结合半衰期的那些TCR。例如，如本领域技术人员所知，可能产生与上文详述的那些TCR相比在其恒定区和/或可变结构域掺入变化而没有改变与FMNKFIYEI(SEQ ID No:1)HLA-A2复合物的相互作用所需的亲和性的TCR。这类试验变体包括在本发明的范围内。其中已经进行一个或多个保守取代的那些TCR也形成本发明的部分。
可能能够在其C-末端和/或N-末端提供的序列截短1、2、3、4、5或更多个残基，而不显著影响TCR的结合性质，这对本领域技术人员而言将是明显的。本发明包括了所有这类试验变体。
天然TCR以异二聚体αβ或γδ的形式存在。然而，之前已经显示由αα或ββ同二聚体组成的重组TCR与肽MHC分子结合。因此，本发明的TCR可以是异二聚体αβ TCR或者可以是αα或ββ同二聚体TCR。
为了在过继性疗法中使用，αβ异二聚体TCR可以例如以具有胞质和跨膜结构域的全长链转染。在某些实施方式中，本发明的TCR可以是在相应的恒定结构域的残基之间导入二硫键，例如，如WO 2006/000830所述。
本发明的TCR，尤其是αβ异二聚体TCR可包含α链TRAC恒定结构域序列和/或β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列。可通过截短或取代来修饰α和β链恒定结构域序列以删除TRAC的外显子2的Cys4和TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键。也可通过用半胱氨酸残基取代TRAC的Thr 48和TRBC1或TRBC2的Ser 57来修饰α和/或β链恒定结构域序列，所述半胱氨酸在TCR的α和β恒定结构域之间形成二硫键。
本发明的TCR也可以是单链形式，例如，参见WO 2004/033685。单链形式包括Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ、Vα-Cα-L-Vβ-Cβ形式的αβTCR多肽，其中Vα和Vβ分别是TCRα和β可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和β恒定区，且L是接头序列。在某些实施方式中，本发明的单链TCR可以在相应的恒定结构域的残基之间导入二硫键，如WO 2004/033685所述。
本发明的TCR具有结合FMNKFIYEI(SEQ ID No:1)HLA-A2复合物的性质。本发明的某些TCR已被发现高度适用于过继性疗法。这类TCR对复合物的KD可低于亲本AFP TCR，例如约1μM至约21μM，和/或对复合物的结合半衰期(T1/2)低于0.5秒至约2秒范围内的。增加天然TCR的结合亲和性通常降低了TCR对其肽-MHC配体的特异性，并且这在Zhao Yangbing等(J.Immunol,2007 179:9,p5845-5854)中被证明。然而，本发明的某些TCR保留对FMNKFIYEIHLA-A2复合物的选择性，尽管在一些实施方式中，具有比亲本AFP TCR更高的结合亲和性(参见实施例6)。
可通过任意合适的方法来确定结合亲和性(与平衡常数KD呈反比)和结合半衰期(表示为T1/2)。将理解TCR的亲和性翻倍导致KD减半。T1/2计算为ln2除以解离速率(koff)。因此，T1/2翻倍导致koff减半。通常对TCR的可溶形式测量TCR的KD和koff值，即截短以去除胞质和跨膜结构域残基的那些形式。因此，将理解如果该TCR的可溶形式具有所述的性质，则给定的TCR具有对亲本TCR改善的结合亲和性和/或结合半衰期。优选地，使用相同的试验方案多次，例如3次或更多次测量给定的TCR的结合亲和性或结合半衰期，并且取结果的平均值。在优选的实施方式中，使用本文实施例3的表面等离振子共振(BIAcore)方法来进行这些测量。
在另一个方面，本发明提供了编码本发明的TCR的核酸。一些实施方式中，该核酸是cDNA。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明的TCR的α链可变结构域的序列的核酸。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明的TCR的β链可变结构域的序列的核酸。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明的TCR的α链可变结构域和本发明的TCR的β链可变结构域的序列的核酸。该核酸可以是非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的。
在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核酸的载体。优选地，该载体是TCR表达载体。
本发明还提供了含有本发明的载体，优选TCR表达载体的细胞。该载体可包含在单个开放阅读框，或2个不同的开放阅读框(分别是α链和β链)中编码的本发明的核酸。另一个方面提供了含有第一表达载体和第二表达载体的细胞，该第一表达载体包含编码本发明的TCR的α链的核酸，该第二表达载体包含编码本发明的TCR的β链的核酸。这类细胞可特别用于过继性疗法。这类细胞可以是经分离和/或重组和/或非天然产生和/或经工程改造的。
因为本发明的TCR在过继性疗法中有效用，本发明包括呈递本发明的TCR的非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的细胞，尤其是T细胞。存在多种适用于用编码本发明的TCR的核酸(如DNA、cDNA或RNA)转染T细胞的方法(参见例如Robbins等，(2008)JImmunol.180:6116-6131)。表达本发明的TCR的T细胞将适用于癌症如胰腺癌和肝癌的基于过继性疗法的治疗。如本领域技术人员所知，存在多种可进行过继性疗法的合适方法(参见例如Rosenberg等，(2008)Nat Rev Cancer 8(4):299-308)。
本领域熟知当由转染的细胞表达时，本发明的TCR可经过翻译后修饰。糖基化是一种这类修饰，其包括寡糖部分与TCR链中限定的氨基酸共价接合。例如，天冬氨酸残基或丝氨酸/苏氨酸残基是供于寡糖接合的熟知位置。特定蛋白质的糖基化状态取决于多种因素，包括蛋白质序列、蛋白质构象和某些酶的可及性。此外，糖基化状态(即寡糖类型、共价连接和接合总数)可能影响蛋白质功能。因此，在产生重组蛋白质时，通常需要控制糖基化。可通过对转染的基因的突变来控制转染的TCR的糖基化(Kuball J等，(2009),J Exp Med 206(2):463–475)。本发明也包括这类突变。
本发明的TCR可与可检测标记物、治疗剂或PK修饰部分相联。
本发明的某些TCR可以是可溶形式(即，没有跨膜或胞质结构域)。为了稳定，本发明的TCR和优选的可溶性αβ异二聚体TCR可以在相应的恒定结构域的残基之间导入二硫键，例如，如WO 03/020763所述。一些本发明的可溶性TCR可用于制备融合蛋白质，其可用于向抗原呈递细胞和含有抗原呈递细胞的组织递送可检测的标记物或治疗剂。因此，它们可与可检测的标记物相联(共价或其他)(用于诊断目的，其中使用TCR来检测呈递FMNKFIYEI(SEQ ID No 1)HLA-A2复合物的细胞、治疗剂或PK修饰部分(例如通过PEG化)是否存在)。
诊断目的的可检测标记物包括，例如，荧光标记物、放射性标记物、酶、核酸探针和造影剂。
可与本发明的TCR相联的治疗剂包括免疫调节剂、放射性化合物、酶(例如穿孔蛋白)或化疗剂(例如顺铂)。为了确保毒性作用在所需的位置中发挥，毒素可以在与TCR连接的脂质体内使得缓释该化合物。这将防止体内运输期间的破坏作用并确保毒素在TCR与相关的抗原呈递细胞结合之后具有最大的效果。
其他合适的治疗剂包括：
·小分子细胞毒性剂，即具有杀死哺乳动物细胞的能力的分子量小于700道尔顿的化合物。这类化合物也可含有具有细胞毒性作用的毒性金属。此外，应理解这些小分子细胞毒剂包括前药，即在生理条件下衰减或经转化以释放细胞毒剂的化合物。这类试剂的示例包括顺铂、美登素衍生物、雷查霉素、卡奇霉素、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer光卟啉钠II、替莫唑胺、拓扑替康、葡糖醛酸三甲曲沙、耳他汀E长春新碱和多柔比星；
·肽细胞毒素，即具有杀死哺乳动物细胞的能力的蛋白质或其片段。例如，蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；
·放射性核素，即元素的不稳定同位素，其衰减同时发射α或β颗粒、或γ射线中的一种或多种。例如，碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；螯合剂可用于促进这些放射性核素与高亲和性TCR或其多聚体的联系；
·免疫刺激物，即刺激免疫应答的免疫效应分子。例如，细胞因子如IL-2和IFN-γ，
·超抗原或其突变体；
·TCR-HLA融合体；
·细胞因子如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；
·抗体或其片段，包括抗-T细胞或NK细胞决定抗体(例如，抗-CD3、抗-CD28或抗-CD16)；
·具有类抗体结合特性的替代性蛋白质支架
·补充活化剂；
·异种蛋白质结构域、同种异体蛋白质结构域、病毒/细菌蛋白质结构域、病毒/细菌肽。
对于给予患者，本发明的TCR或细胞可在药物组合物中与一种或多种药学上可接受的运载体或赋形剂一起提供。本发明的细胞通常将以无菌的药物组合物的部分提供，其通常包含药学上可接受的运载体。这种药物组合物可以是任意合适的形式，(取决于将其给予患者所需的方法)。可以单位剂型提供，通常以密封的容器提供或可以试剂盒的部分提供。这种试剂盒将通常(虽然不必然)包括使用说明。其可包括多种所述的单位剂型。
药物组合物可适应通过任意合适的途径给药，优选通过胃肠外(包括皮下、肌内或优选静脉内)途径。这类制剂可通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成分与运载体或赋形剂在无菌条件下混合。
可以基本纯的形式提供本发明的TCR、药物组合物、载体、核酸和细胞，例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。
本发明还提供：
·非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的TCR，其结合以肽-HLA-A2复合物呈递的FMNKFIYEI肽，或表达和/或呈递这种TCR的细胞，用于医药，优选用于治疗癌症的方法。该方法还包括过继性疗法；
·结合以肽-HLA-A2复合物呈递的FMNKFIYEI肽的TCR、或表达和/或呈递这种TCR的细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途；
·一种治疗患者中癌症的方法，包括给予患者结合以肽-HLA-A2复合物呈递的FMNKFIYEI肽的TCR、或表达和/或呈递这种TCR的细胞。
结合以肽-HLA-A2复合物呈递的FMNKFIYEI肽的TCR优选是本发明的TCR。
本发明各方面的优选特征可经修改作为各其他方面。本文所述的出版文献以法律允许的最大程度纳入本文。该申请文件中任何文献的引用或鉴定并非承认这类文献是本发明的现有技术。
附图说明
图1(SEQ ID NO:2)给出了使用基因TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC的亲本AFP-特异性TCR的α链的胞外部分的氨基酸序列。
图2(SEQ ID NO:3)给出了使用基因TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2的亲本AFP-特异性TCR的β链的胞外部分的氨基酸序列。
图3(SEQ ID NO:4)给出了可溶性TCR的α链的氨基酸序列(在本文中称为“参考TCR”)。该序列与图1的序列(SEQ ID No:2)相同，除了半胱氨酸(加粗并带下划线)取代SEQID No:2的T159(即TRAC恒定区的T48)。
图4(SEQ ID NO:5)给出了可溶性TCR的β链的氨基酸序列(在本文中称为“参考TCR”)。该序列与图2的序列(SEQ ID No:3)相同，除了半胱氨酸(加粗并带下划线)取代SEQID No:3的S169(即TRBC2恒定区的S57)并且A187取代C187且D201取代N201。
图5(SEQ ID No:6-20)给出了可在本发明的TCR中存在的突变的α链的氨基酸序列。CDR区域带下划线并且相对于亲本AFP TCR的氨基酸变化用阴影表示。
图6(SEQ ID NO:21)和(SEQ ID No:22)给出了分别在图3和图4中显示的编码TCRα和β链的DNA序列。
图7(SEQ ID NO:23)给出了用于转导T细胞的亲本AFP TCR基因的DNA序列(α链-2A-β链构建体，其中猪捷申病毒-1 2A序列加粗并带下划线)。
图8(SEQ ID NO:24)给出了从图7的DNA序列产生的用于转导T细胞的亲本AFP TCR的氨基酸序列。猪捷申病毒-1 2A序列加粗并带下划线。
图9显示了ELISPOT试验的结果，其中评价了响应一定范围的靶细胞的AFP TCR-转导的T细胞的IFN-γ释放。
下列非限制性实施例进一步说明了本发明。
实施例
实施例1
将亲本AFP TCRα和β链可变区序列克隆至基于pGMT7的表达质粒
从AFP T细胞克隆中分离的总cDNA中PCR扩增参考AFP TCR可变α和TCR可变β结构域。在α链的情况中，使用编码限制性位点NdeI的α链可变区序列特异性寡核苷酸A1gaattccatatgcaaaaagaagttgaacaaaattctggacccctc(SEQ ID No:25)和编码限制性位点SalI的α链恒定区序列特异性寡核苷酸A2ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg(SEQ ID No:26)来扩增α链可变结构域。在β链的情况中，使用编码限制性位点NdeI的β链可变区序列特异性寡核苷酸B1 gaattccatatggattctggagttacacaaaccccaaagcacctg(SEQ ID No:27)和编码限制性位点Age1的β链恒定区序列特异性寡核苷酸B2tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc(SEQ ID No:28)来扩增α链可变结构域。
通过标准方法将α或β可变结构域克隆到含有Cα或Cβ的基于pGMT7的表达质粒中，这类标准方法描述于(Sambrook和Russell的《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloninga Laboratory Manual)第3版)。使用应用生物系统3730xl DNA分析仪来对质粒进行测序。
用NdeI和SalI切割的编码TCRα链的DNA序列连接到用NdeI和XhoI切割的pGMT7+Cα载体中。用NdeI和AgeI切割的编码TCRβ链的DNA序列连接到用NdeI和AgeI切割的pGMT7+Cβ载体中。
连接
将连接的质粒转化到感受态大肠杆菌菌株XL1-蓝细胞中并接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂平板上。在37℃下过夜孵育之后，挑取单个菌落并在37℃下在10ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中振荡过夜生长。使用Miniprep试剂盒(恰根公司(Qiagen))纯化克隆的质粒并且使用应用生物系统3730xl DNA分析仪来对质粒进行测序。
图3和4分别显示分别从图7的DNA序列(SEQ ID No:21)(SEQ ID No:22)中产生的参考AFP TCRα和β链胞外氨基酸序列(分别是SEQ ID No:4和5)。注意到，相对于亲本TCR，半胱氨酸α在和β链的恒定区中被取代以在重折叠时提供人工链间二硫键以形成异二聚TCR。导入的半胱氨酸以粗体和下划线显示。
实施例2
可溶性亲本AFP TCR的表达、重折叠和纯化
实施例1制备的分别含有TCRα-链和β-链的表达质粒分开转化到大肠杆菌菌株BL21pLysS中，并且在用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达之前，使单个抗氨苄青霉素菌落在37℃下在TYP(氨苄青霉素100μg/ml)培养基中生长至约0.6至0.8的OD600。在诱导后3小时通过在Beckman J-6B中4000rpm离心30分钟来收获细胞。用在MgCl2和DNA酶I存在下用25ml Bug
Figure BDA0002362688780000121
(诺瓦基公司(Novagen))来裂解细胞团块。通过在Beckman J2-21离心机中以13000rpm离心30分钟来回收包涵体团块。进行3次去污剂洗涤以去除细胞碎片和膜组分。每次在通过在Beckman J2-21中13000rpm下离心15分钟来成块之前包涵体团块在曲通缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0，0.5％曲通-X100，200mM NaCl，10mM NaEDTA)中均质化。然后通过在以下缓冲液中类似的洗涤来去除去污剂和盐：50mM Tris-HCl pH 8.0，1mM NaEDTA。最后，包涵体分成30mg的等份并在-70℃下冷冻。通过用6M盐酸胍溶解来定量包涵体蛋白质产率并且在日立(Hitachi)U-2001分光光度计上取得OD测量值。然后使用消光系数来计算蛋白质浓度。
大约15mg的TCRβ链和15mg的TCRα链溶解的包涵体从冻存物中融化并稀释到10ml的胍溶液(6M盐酸胍，50mM Tris HCl pH 8.1，100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT)中以确保完全链变性。含有完全还原并变性的TCR链的胍溶液然后注入0.5升的以下重折叠缓冲液中：100mM Tris pH 8.1，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿素。在加入变性的TCR链之前约5分钟加入终浓度分别为6.6mM和3.7mM的氧化还原对(盐酸半胱胺和二盐酸胱胺)。将溶液放置约30分钟。重折叠的TCR在Spectra/Por
Figure BDA0002362688780000131
1膜(斯派公司(Spectrum)；产品编号132670)上用10L H2O透析18-20小时。在这段时间之后，2次将透析缓冲液改成新鲜的10mM Tris pH8.1(10L)并且在5℃±3℃下继续透析另外约8小时。
通过将经透析的重折叠物加载到
Figure BDA0002362688780000132
50HQ阴离子交换柱并使用
Figure BDA0002362688780000133
纯化仪(GE医疗公司(GE Healthcare))在50个柱体积的含0-500mM NaCl的10mM Tris pH 8.1的梯度洗脱结合的蛋白质来从降解产物和杂质中分离可溶性TCR。收集峰组分并且加入蛋白酶抑制剂的混合物(卡巴开公司(Calbiochem))。收集的组分然后储存在4℃下并在收集和浓缩之前通过考马斯染色SDS-PAGE来分析。最后，使用在PBS缓冲液(西格玛公司(Sigma))中预平衡的GE医疗公司的
Figure BDA0002362688780000134
75HR凝胶过滤柱来纯化和表征可溶性TCR。在由
Figure BDA0002362688780000135
表面等离振子共振分析表征之前，收集并浓缩大约50kDa的相对分子量处洗脱的峰。
实施例3
结合表征
BIAcore分析
表面等离振子共振生物传感器(
Figure BDA0002362688780000136
3000)可用于分析可溶性TCR与其肽-MHC配体的结合。这通过产生可溶性生物素化的肽-HLA(“pHLA”)复合物来促进，该复合物可固定于链霉亲和素包被的结合表面(传感器芯片)。传感器芯片包含4个单独的流动池，其能够同时测量结合4种不同的pHLA复合物的T-细胞受体。手动注射pHLA复合物允许易于操作固定的I类分子的精确水平。
生物素化的I类HLA-A*02分子在体外从含有组分亚基蛋白质和合成肽的细菌表达的包涵体重折叠，之后进行纯化和体外酶促生物素化(O’Callaghan等，(1999)Anal.Biochem.266:9-15)。表达带有C-末端生物素化标签的HLA-A*02-重链，其标签代替合适的构建体中的蛋白质的跨膜和胞质结构域。得到约75mg/升细菌培养物的包涵体表达水平。MHC轻链或β2-微球蛋白在大肠杆菌中也以包涵体形式从合适的构建体表达，水平为约500mg/升细菌培养物。
大肠杆菌细胞经裂解并且将包涵体纯化至大约80％的纯度。来自包涵体的蛋白质在6M盐酸胍，50mM Tris pH 8.1，100mM NaCl，10mM DTT，10mM EDTA中变性，并且通过在<5℃下向重叠缓冲液中加入单个脉冲的变性蛋白质来在30mg/升重链，30mg/升β2m的浓度下在0.4M L-精氨酸，100mM Tris pH 8.1，3.7mM二盐酸胱胺，6.6mM盐酸半胱胺，4mg/L的用HLA-A*02分子加载的AFP肽中重折叠。重折叠允许在4℃下持续至少1小时以完成。
通过在10倍体积的10mM Tris pH 8.1中透析来交换缓冲液。然后蛋白质溶液滤过1.5μm乙酸纤维素过滤器并加载在
Figure BDA0002362688780000141
50HQ阴离子交换柱(8ml床体积)上。使用
Figure BDA0002362688780000142
纯化仪(GE医疗公司)用10mM Tris pH 8.1中0-500mM NaCl的线性梯度来洗脱蛋白质。HLA-A*02-肽复合物在约250mM NaCl处洗脱，并且收集峰组分，加入蛋白酶抑制剂的混合物(卡巴开公司)并且在冰上冷却该组分。
生物素化标记的pHLA分子使用相同缓冲液平衡的GE医疗快速脱盐柱缓冲液交换成10mM Tris pH 8.1，5mM NaCl。洗脱之后含蛋白质的组分立即在冰上冷却并且加入蛋白酶抑制剂混合物(卡巴开公司)。然后加入生物素化试剂：1mM生物素，5mM ATP(缓冲至pH8)，7.5mM MgCl2，和5μg/ml BirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)Anal.Biochem.266:9-15纯化)。然后该混合物在允许的室温下孵育过夜。
使用凝胶过滤色谱纯化生物素化的pHLA-A*01分子。用经过滤的PBS预平衡GE医疗
Figure BDA0002362688780000151
75HR 10/30柱并且加载1ml的生物素化反应混合物并且用
Figure BDA0002362688780000152
纯化仪(GE医疗公司)以0.5ml/分钟向柱上加PBS。以约15ml洗脱单个峰的生物素化的pHLA-A*02分子。收集含有蛋白质的组分，在冰上冷却，并且加入蛋白酶抑制剂混合物。使用考马斯结合试验(PerBio)来确定蛋白质浓度并且等份的生物素化的pHLA-A*02分子在–20℃下冷冻储存。
Figure BDA0002362688780000154
3000表面等离振子共振(SPR)生物传感器测量以小流动池内的传感器表面附近的反应单位(RU)表示的折射率的变化，这是一种可用于检测受体配体相互作用并分析它们的亲和性和动力学参数的原理。
Figure BDA0002362688780000155
实验在25℃的温度下使用PBS缓冲液(西格玛公司，pH 7.1-7.5)作为运行缓冲液进行，并且该缓冲液用于制备蛋白质样品的稀释物。通过标准胺偶联方法将链霉亲和素固定于流动池。pHLS复合物通过生物素标签固定。然后通过将可溶性TCR以恒定流速通过不同流动池的表面上，测量该操作中的SPR反应来进行试验。
平衡结合常数
上述
Figure BDA0002362688780000156
分析方法用于确定平衡结合常数。制备参考AFP TCR的二硫键连接的可溶性异二聚体形式的连续稀释物并且以5μl/分钟的恒定流速注入2个不同的流动池中；一个包被约1000RU的特异性HLA-A*02复合物，第二个包被约1000RU的非特异性HLA-A2–肽复合物。使用来自对照池的测量值来对各浓度标准化反应。标准化的数据反应对TCR样品的浓度作图并且拟合至非线性曲线拟合模型以计算平衡结合常数KD(Price和Dwek，《生物化学家的生理化学原理和问题》(Principles and Problems in Physical Chemistry forBiochemists)(第2版)1979，牛津，克拉仁敦出版社(Clarendon Press))。参考AFP TCR的二硫键连接的可溶形式(实施例2)证明大约754μM的KD。从相同的
Figure BDA0002362688780000153
数据中，T1/2大约<0.5秒。
动力学参数
上述
Figure BDA0002362688780000161
分析方法也用于确定平衡结合常数和解离速率。
对于高亲和性TCR(参见下文实施例4)，通过实验测量解离速率常数koff和结合速率常数kon来确定KD。平衡常数KD计算为koff/kon。
TCR注射在2个不同的池上，一个包被约1000RU的FMNKFIYEI HLA-A*02的复合物，第二个包被约1000RU的非特异性HLA-A2-肽复合物。流速设定为50μl/分钟。通常注射约250μl的1μM浓度的TCR。然后缓冲液流过直至反应已经回到基线或已消逝超过2小时。使用
Figure BDA0002362688780000163
软件来计算动力学参数。解离期拟合至能够计算半衰期的单指数衰减等式。
实施例4
本发明的突变TCR的制备
噬菌体展示是可生成AFP TCR变体的文库以鉴定更高亲和性突变体的一种方式。(Li等，(2005)Nature Biotech 23(3):349-354)中描述的TCR噬菌体展示和筛选方法应用于实施例1的亲本AFP TCR。
鉴定了具有与亲本AFP TCR相比改进的结合的TCR，其具有α链可变结构域氨基酸残基31Q、32S、94D、95S、96G、97Y和98A(使用SEQ ID No:2中所示的编号)中的一个或多个突变。图5显示了更高亲和性TCR的α链的可变区的氨基酸序列(SEQ ID No:6至20)的具体示例。这些α链在CDR1和/或CDR3中突变。
如实施例1所述制备分别含有TCRα-链和β-链的表达质粒的本发明的以下TCR：
Figure BDA0002362688780000162
Figure BDA0002362688780000171
质粒分开转化到大肠杆菌菌株BL21pLysS，并且单个氨苄青霉素抗性菌落在37℃下在TYP(氨苄青霉素100μg/ml)培养基中生长至约0.6-0.8的OD600，之后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。在诱导后3小时通过在Beckman J-6B中4000rpm离心30分钟来收获细胞。用在MgCl2和DNA酶I存在下用25ml Bug
Figure BDA0002362688780000172
(诺瓦基公司(Novagen))来裂解细胞团块。通过在Beckman J2-21离心机中以13000rpm离心30分钟来回收包涵体团块。进行3次去污剂洗涤以去除细胞碎片和膜组分。每次在通过在Beckman J2-21中13000rpm下离心15分钟来成块之前包涵体团块在曲通缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，0.5％曲通-X100，200mM NaCl，10mM NaEDTA)中均质化。然后通过在以下缓冲液中类似的洗涤来去除去污剂和盐：50mMTris-HCl pH 8.0，1mM NaEDTA。最后，包涵体分成30mg等份并在-70℃下冷冻。通过用6M盐酸胍溶解来定量包涵体蛋白质产率并且在日立(Hitachi)U-2001分光光度计上取得OD测量。然后使用消光系数来计算蛋白质浓度。
本发明的各TCR的大约10mg的TCRβ链和10mg的TCRα链溶解的包涵体稀释到10ml的胍溶液(6M盐酸胍，50mM Tris HCl pH 8.1，100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT)中以确保完全链变性。含有完全还原并变性的TCR链的胍溶液然后注入0.5升的以下重折叠缓冲液中：100mM Tris pH 8.1，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿素。在加入变性的TCR链之前约5分钟加入终浓度分别为6.6mM和3.7mM的氧化还原对(盐酸半胱胺和二盐酸胱胺)。将溶液放置约30分钟。重折叠的TCR在
Figure BDA0002362688780000181
Figure BDA0002362688780000182
1膜(斯派公司(Spectrum)；产品编号132670)上用10L H2O透析18-20小时。在这段时间之后，2次将透析缓冲液改成新鲜的10mM Tris pH 8.1(10L)并且在5℃±3℃下继续透析另外约8小时。
通过将经透析的重折叠物加载到
Figure BDA0002362688780000183
15HQ阴离子交换柱并使用
Figure BDA0002362688780000184
纯化仪(GE医疗公司(GE Healthcare))在50个柱体积的含0-500mM NaCl的10mM Tris pH 8.1的梯度洗脱结合的蛋白质来从降解产物和杂质中分离可溶性TCR。收集的组分然后储存在4℃下并在收集和浓缩之前通过考马斯染色SDS-PAGE来分析。最后，使用在PBS缓冲液(西格玛公司(Sigma))中预平衡的GE医疗公司的
Figure BDA0002362688780000185
75HR凝胶过滤柱来纯化和表征可溶性TCR。在由
Figure BDA0002362688780000186
表面等离振子共振分析表征之前，收集并浓缩大约50kDa的相对分子量处洗脱的峰。
使用实施例3的方法评价了如此制备的TCR对AFP表位的亲和性概况，并且与参考TCR比较。结果示于下表：
Figure BDA0002362688780000187
Figure BDA0002362688780000191
实施例5
用亲本和变体AFP TCR转染T细胞
(a)通过Express-In介导的293T细胞的瞬时转染的慢病毒载体制备
使用第三代慢病毒包装系统来包装含有编码所需的TCR的基因的慢病毒载体。使用Express-In介导的转染(开放应用系统公司(Open Biosystems))用4个质粒(一个是实施例5c所述(下文)的含有TCRα链-P2A-TCRβ链的单ORF基因的慢病毒载体，并且3个质粒含有构成感染性而非复制型慢病毒颗粒所需的其他组件)转染293T细胞。
对于转染，取一个处于对数生长阶段的293T细胞的T150烧瓶，细胞均匀分布在平板上，并且稍稍超过50％融合。将Express-In等份置于室温。在无菌的15ml锥形管中放入3ml的无血清培养基(RPMI 1640+10mM HEPES)。将174μl的Express-In试剂直接加入无血清培养基(这提供了3.6:1的试剂与DNA的重量比)。通过将管翻转3-4次并在室温下孵育5-20分钟来充分混合。
在分开的1.5ml微管中，向预混合的包装混合物等份(含有18μg pRSV.REV(Rev表达质粒)，18μg pMDLg/p.RRE(Gag/Pol表达质粒，7μg pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒)中加入15μg的质粒DNA，通常约22μl，并且吹打以确保DNA混合物的均匀性。向DNA混合物中滴加约1ml的Express-In/无血清培养基，然后温和吹打，之后转移回剩余的Express-In/无血清培养基。翻转管3-4次并在室温下孵育15-30分钟。
从细胞烧瓶中去除旧的培养基。向烧瓶中加入Express-In/培养基/DNA(3ml)直接加到293T细胞的直立烧瓶的底部。将烧瓶缓慢平放以覆盖细胞并且非常温和地摇晃烧瓶以确保均匀分布。在1分钟后加入22ml的新鲜培养基(R10+HEPES:RPMI 1640，10％热失活的FBS，1％Pen/Strep/L-谷氨酰胺，10mM HEPES)并小心地返回孵育器中。在37℃/5％CO2下过夜孵育。在24小时之后，进而收获含有包装的慢病毒载体的培养基。
为了收获包装的慢病毒载体，过滤细胞培养上清通过0.45微米的尼龙注射器滤器，将培养基在10000g下离心18小时(或112000g下2小时)，去除大部分的上清(小心不要破坏团块)并将团块悬浮在剩下的几ml(通常约2ml，从每管31ml的起始体积)上清中。1ml等份在干冰上速冻并在-80℃下储存。
(b)用含有感兴趣的基因的包装的慢病毒载体转导T细胞
在用包装的慢病毒载体转导之前，从健康志愿者的血液中分离人T细胞(CD8或CD4或两者，取决于要求)。这些细胞计数并以1x106个细胞/ml(0.5ml/孔)在48孔平板中在含有50U/ml IL-2的R10中过夜孵育，该48孔平板以每个细胞3个珠的比例含有预先洗涤的抗-CD3/CD28抗体包被的微珠(
Figure BDA0002362688780000201
T细胞增殖器(expander)，英杰公司(Invitrogen))。
在过夜刺激之后，0.5ml的净包装的慢病毒载体加至所需的细胞。在37℃/5％CO2下孵育3天。转导后3天对细胞计数并稀释至0.5x106个细胞/ml。如果需要加入含IL-2的新鲜培养基。转导后5-7天去除珠。以2天的间隔对细胞计数并置换或添加含IL-2的新鲜培养基。将细胞保持在0.5x106和1x106个细胞/ml之间。从第3天开始可通过流式细胞术分析细胞，并且从第5天开始可用于功能试验(例如，针对IFNγ释放的ELISpot，参见实施例6)。从第10天开始，或当细胞缓慢分裂并在尺寸上减小时，以至少4x106个细胞/管(90％FBS/10％DMSO中1x107个细胞/ml)的等份冷冻细胞用于储存。
(c)用于通过上述方法(a)和(b)的T细胞转染的亲本TCR基因
图7是编码亲本AFP TCR(为最大化人细胞表达经密码子优化)的DNA序列(SEQ IDNo:23)。其是全长α链-猪捷申病毒-1 2A–全长β链单开放阅读框构建体。2A序列带下划线，并且前面是编码弗林蛋白酶切割位点的核苷酸以辅助2A序列的蛋白水解去除(下文参考图8进一步描述)(SEQ ID No:24)。蛋白质的mRNA翻译期间在2A序列的3’末端处的肽结合省略产生2种蛋白质：1)αTCR链-2A融合体，2)βTCR链。SEQ ID NO:23包括NheI和SalI限制性位点(带下划线)。
图8显示对应于图7的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)。
在图8中：
M1-Q22是前导序列，其在亲本α链TCR成熟后被去除；
Q23-S274对应于亲本α链序列；
Q23-N246对应于亲本α链胞外结构域；
L247-T268是成熟TCR的α链跨膜区；
L269-S274是成熟TCR的α链胞内区；
R277-R280是弗林蛋白酶切割位点以辅助高尔基体中P2A序列A285-P303的蛋白水解去除；
G275、S276、S281至G284是柔性接头，允许P2A序列和弗林蛋白酶切割的完全功能；
R304-V323是前导序列，其在亲本β链TCR成熟后被去除；
D324-G614对应于亲本β链序列；
D324-E585对应于亲本β链胞外结构域；
I586-V607是成熟TCR的β链跨膜区；
K608-G614是成熟TCR的β链胞内区。
(d)用亲本和高亲和性AFP TCR转染的T细胞
在上述(a)和(b)中所述的过程之后，亲本AFPα-2A-βTCR基因(SEQ ID No:23(图7))使用对2种DNA构建体而言独特的NheI和SalI限制性位点插入pELNSxv lenti载体中，并且产生转染的T细胞。
类似地，可通过用与SEQ ID No:23(图7)相同的基因转染产生T细胞，除了它们编码α链可变结构域，该结构域具有与亲本β链SEQ ID No:3的可变结构域序列(D1至T112)关联的SEQ ID No:6至20之一。
实施例6
AFP TCR工程改造的T细胞的激活
进行以下的试验以证明响应肿瘤细胞系的TCR-转导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活。使用ELISPOT试验测量的IFN-γ产生用作细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激活的读出。
ELISPOT
试剂
试验基质：10％FCS(吉布可公司(Gibco)，目录号2011-09)，88％RPMI 1640(吉布可公司，目录号42401)，1％谷氨酰胺(吉布可公司，目录号25030)和1％青霉素/链霉亲和素(吉布可公司，目录号15070-063)。
洗涤缓冲液：0.01M PBS/0.05％吐温20
PBS(吉布可公司，目录号10010)
人IFNγELISPOT试剂盒(BD生物科技公司(BD Bioscience)；目录号551849)含有捕获和检测抗体和人IFN-γPVDF ELISPOT 96孔平板，以及相关的AEC底物组(BD生物科技公司，目录号551951)
方法
靶细胞制备
该方法中使用的靶细胞是天然表位呈递细胞：HepG2肝细胞癌细胞，其同时是HLA-A2+AFP+。HLA-A2+AFP-的HEP2正常人肝细胞用作阴性对照。通过在
Figure BDA0002362688780000223
1.0(贺利氏公司(Heraeus))中1200rpm下3次离心10分钟来洗涤足量的靶细胞(50000个细胞/孔)。细胞以106个细胞/ml在试验基质中重悬。
效应细胞制备
本方法所用效应细胞(T细胞)是外周血淋巴细胞(PBL)，其通过使用CD14和CD25微珠试剂盒(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech)，目录号分别是130-050-201和130-092-983)从来自健康志愿者的静脉血的新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)中负选择。细胞用抗CD3/CD28包被的珠(
Figure BDA0002362688780000221
T细胞增殖器，英杰公司)刺激，用携带编码感兴趣的全αβTCR的基因的慢病毒转导(基于实施例5所述和图7所示的构建体)，并且在转导后10至13天在含50U/ml IL-2的试验基质中增殖。这些细胞然后置于试验基质中，之后通过在
Figure BDA0002362688780000222
1.0(贺利氏公司)中1200rpm下离心10分钟来洗涤。然后以4倍的最终需要浓度在试验基质中重悬细胞。
如下准备平板：每块平板中，100μl抗-IFN-γ捕获抗体稀释到10ml无菌PBS中。100μl经稀释的捕获抗体然后分散到各孔中。然后，平板在4℃下孵育过夜。孵育之后，洗涤平板(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus96-孔平板洗涤器；丹尼克斯公司(Dynex))以去除捕获抗体。然后通过向各孔中加入200μl的试验基质来封闭平板并在室温下孵育2小时。然后从平板(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔平板洗涤器；丹尼克斯公司)上洗去试验基质并且通过在纸巾上轻弹和拍打ELISPOT平板来去除任何残留的基质。
然后将试验的组分以以下顺序加入ELISPOT平板：
50μl的靶细胞106个细胞/ml(给出总共50000个靶细胞/孔)
50μl基质(试验基质)
50μl效应细胞(20000TCR-转导的PBL个细胞/孔)
然后平板孵育过夜(37℃/5％CO2)。第二天，用洗涤缓冲液洗涤平板3次(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔平板洗涤器；丹尼克斯公司)并且在纸巾上拍干以去除过量的洗涤缓冲液。然后将100μL一级检测抗体加入各孔。使用生产商说明中的稀释将一级检测抗体稀释到10ml的稀释缓冲液中(单块平板所需的体积)。平板然后在室温下孵育至少2小时，之后用洗涤缓冲液洗涤3次(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus 96-孔平板洗涤器；丹尼克斯公司)；通过在纸巾上拍打平板来去除过量的洗涤缓冲液。
通过向各孔中加入100μl稀释的链霉亲和素-HRP来进行二级检测并且在室温下孵育平板1小时。使用生产商说明中的稀释将链霉亲和素-HRP稀释到10ml的稀释缓冲液中(单块平板所需的体积)。然后用洗涤缓冲液洗涤平板3次(程序1，平板类型2，Ultrawash Plus96-孔平板洗涤器；丹尼克斯公司)并且在纸巾上拍打以去除过量的洗涤缓冲液。然后通过向各孔中加入200μl的PBS洗涤平板2次，轻弹去除缓冲液并且在纸巾上拍打以去除过量的缓冲液。在使用前不到15分钟，向各1ml的AEC底物中加入1滴(20ul)AEC发色团并混合。各平板制备10ml的该溶液；每孔加入100μl。然后使用箔使平板避光，并且定期监测点显影，通常在5-20分钟内发生。在自来水中洗涤平板以终止显影反应，并在它们分解成3个组件部分之前振摇干燥。平板然后允许的室温下干燥持续至少2个小时，之后使用
Figure BDA0002362688780000231
酶标仪(CTL；细胞技术有限公司(Cellular Technology Limited))来对点进行计数。
结果
通过ELISPOT试验测试(如上所述)响应多种AFP-阳性和对照肿瘤细胞系的激活的TCR-转导的T细胞的IFNγ释放。使用Graph Pad
Figure BDA0002362688780000242
对各孔中观察到的ELISPOT点的数量进行作图。
表达WT TCR或1-5号TCR(如下表所述)之一的CD4+、CD8+或混合的CD4+/CD8+ T细胞与AFP+ HLA:A2+肿瘤细胞系HepG2或与AFP-HLA:A2+HEP2正常肝细胞孵育。不含T细胞的样品用作对照。
Figure BDA0002362688780000241
图9显示了用上表所述的TCR转导的T细胞响应AFP阳性肿瘤细胞(HepG2)激活。这些变体TCE的激活超过WT TCR。AFP阴性正常肝细胞(HEP2)的激活最小，证明TCR对AFP的特异性。
序列表
<110> 艾达普特免疫有限公司（Adaptimmune Ltd）
<120> T细胞受体
<130> P58244WO/NJL
<150> GB1313377.2
<151> 2013-07-26
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Ile
1 5
<210> 2
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 3
<211> 242
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln
35 40 45
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly
85 90 95
Gly Glu Ser Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr
100 105 110
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
115 120 125
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130 135 140
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
180 185 190
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
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Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
210 215 220
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
225 230 235 240
Ala Asp
<210> 4
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链胞外结构域
<400> 4
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Asp Ser Gly
85 90 95
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130 135 140
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195 200 205
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体β链氨基酸胞外结构域
<400> 5
Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln
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Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe
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Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
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Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
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Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
225 230 235 240
Ala Asp
<210> 6
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 6
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
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Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ala
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
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Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 7
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
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Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
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Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
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<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 8
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Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
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<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 9
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ala
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
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Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
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<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 11
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gln Ser Gly
85 90 95
Tyr Ser Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 12
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 12
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gln Ser Ser
85 90 95
Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 13
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 13
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ala
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gln Ser Gly
85 90 95
Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
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130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
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195 200 205
<210> 14
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 14
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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<210> 15
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 15
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gln Asn Gly
85 90 95
Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His
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Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
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130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
<210> 16
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 16
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Phe Ser
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Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
<210> 17
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 17
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Tyr Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Asp Ser Gly
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 18
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 18
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Tyr Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Asp Ser Ser
85 90 95
Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 19
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 19
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Tyr Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Val Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 20
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链可变结构域
<400> 20
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Tyr Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Ser Gln Ser Gly
85 90 95
Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro His
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 21
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链胞外结构域
<400> 21
caaaaagaag ttgagcagaa ttctggaccc ctcagtgttc cagagggagc cattgcctct 60
ctcaactgca cttacagtga ccgaggttcc cagtccttct tctggtacag acaatattct 120
gggaaaagcc ctgagttgat aatgtccata tactccaatg gtgacaaaga agatggaagg 180
tttacagcac agctcaataa agccagccag tatgtttctc tgctcatcag agactcccag 240
cccagtgatt cagccaccta cctctgtgcc gtgaatagtg attccgggta tgcactcaac 300
ttcggcaaag gcacctcgct gttggtcaca ccccatatcc agaaccctga ccctgccgtg 360
taccagctga gagactctaa gtcgagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 420
tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaatgtgtg 480
ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 540
gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 600
agcccagaaa gttcc 615
<210> 22
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T细胞受体α链胞外结构域
<400> 22
gattctggag tcacacaaac cccaaagcac ctgatcacag caactggaca gcgagtgacg 60
ctgagatgct cccctaggtc tggagacctc tctgtgtact ggtaccaaca gagcctggac 120
cagggcctcc agttcctcat tcagtattat aatggagaag agagagcaaa aggaaacatt 180
cttgaacgat tctccgcaca acagttccct gacttgcact ctgaactaaa cctgagctct 240
ctggagctgg gggactcagc tttgtatttc tgtgccagca gcctcggggg ggaatctgag 300
cagtacttcg ggccgggcac caggctcacg gtcacagagg acctgaaaaa cgtgttccca 360
cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca 420
ctggtgtgcc tggccaccgg tttctacccc gaccacgtgg agctgagctg gtgggtgaat 480
gggaaggagg tgcacagtgg ggtctgcaca gacccgcagc ccctcaagga gcagcccgcc 540
ctcaatgact ccagatacgc tctgagcagc cgcctgaggg tctcggccac cttctggcag 600
gacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag 660
tggacccagg atagggccaa acccgtcacc cagatcgtca gcgccgaggc ctggggtaga 720
gcagac 726
<210> 23
<211> 1867
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合猪捷申病毒-1 2A的T细胞受体
<400> 23
gctagccgcc accatgatga agtccctgcg ggtgctgctg gtcatcctgt ggctgcagct 60
gtcctgggtc tggtcccagc agaaagaggt ggagcagaac agcggccctc tgagcgtgcc 120
cgagggcgct atcgccagcc tgaactgcac ctacagcgac agaggcagcc agagcttctt 180
ctggtacaga cagtacagcg gcaagagccc cgagctgatc atgagcatct acagcaacgg 240
cgacaaagag gacggccggt tcaccgccca gctgaacaag gccagccagt acgtgtccct 300
gctgatccgg gacagccagc ccagcgacag cgccacctac ctgtgcgccg tgaacagcga 360
ctccggctac gccctgaact tcggcaaggg caccagcctg ctggtgacac cccacattca 420
gaaccccgac cccgccgtgt accagctgcg ggacagcaag agcagcgaca agagcgtgtg 480
cctgttcacc gacttcgaca gccagaccaa cgtgtcccag agcaaggaca gcgacgtgta 540
catcaccgac aagaccgtgc tggacatgcg gagcatggac ttcaagagca acagcgccgt 600
ggcctggtcc aacaagagcg acttcgcctg cgccaacgcc ttcaacaaca gcatcatccc 660
cgaggacaca tttttcccaa gccccgagag cagctgcgac gtcaaactgg tggagaagtc 720
cttcgagaca gacaccaacc tgaacttcca gaacctgagc gtgatcggct tcagaatcct 780
gctgctgaag gtggccggct tcaatctgct gatgaccctg cggctgtggt ccagcggcag 840
cagagccaag agaagcggat ccggcgccac caacttcagc ctgctgaagc aggccggcga 900
cgtggaggaa aaccctggcc ctaggatggg cttccggctg ctgtgctgcg tggccttctg 960
cctgctggga gccggccctg tggatagcgg cgtgacccag acccccaagc acctgatcac 1020
cgccaccggc cagagagtga ccctgcgctg cagccctaga agcggcgacc tgtccgtgta 1080
ctggtatcag cagagcctgg accagggact gcagttcctc atccagtact acaacggcga 1140
ggaacgggcc aagggcaaca tcctggaaag attcagcgcc cagcagttcc ccgacctgca 1200
cagcgagctg aacctgagca gcctggaact gggcgactcc gccctgtact tctgcgccag 1260
cagcctgggc ggcgagagcg aacagtactt cggccctggc acccggctga cggtaaccga 1320
ggacctgaag aacgtgttcc ccccagaggt ggccgtgttc gagccctctg aggccgagat 1380
cagccacacc cagaaagcca ccctggtctg cctggccacc ggcttctacc ccgaccacgt 1440
ggaactgtct tggtgggtga acggcaaaga ggtgcacagc ggcgtcagca ccgaccctca 1500
gcccctgaaa gagcagcccg ccctgaacga cagccggtac tgcctgagca gcagactgcg 1560
ggtgtccgcc accttctggc agaacccccg gaaccacttc agatgccagg tgcagttcta 1620
cggcctgagc gagaacgacg agtggaccca ggaccgggcc aagcctgtga cccagatcgt 1680
gtctgccgaa gcatgggggc gcgccgattg cggcttcaca agcgagagct accagcaggg 1740
cgtgctgagc gccaccatcc tgtacgagat cctgctgggc aaggccaccc tgtacgccgt 1800
gctggtgtcc gctctggtgc tgatggccat ggtgaaacgg aaggacagcc ggggctaata 1860
agtcgac 1867
<210> 24
<211> 614
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合猪捷申病毒-1 2A的T细胞受体
<400> 24
Met Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro
20 25 30
Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser
35 40 45
Asp Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys
50 55 60
Ser Pro Glu Leu Ile Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp
65 70 75 80
Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu
85 90 95
Leu Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala
100 105 110
Val Asn Ser Asp Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly Thr Ser
115 120 125
Leu Leu Val Thr Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser Gly Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
275 280 285
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
290 295 300
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
305 310 315 320
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
325 330 335
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
340 345 350
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
355 360 365
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
370 375 380
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
385 390 395 400
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Gly Glu Ser Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
420 425 430
Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
435 440 445
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
450 455 460
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
465 470 475 480
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
485 490 495
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
500 505 510
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
515 520 525
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
530 535 540
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
545 550 555 560
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
565 570 575
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
580 585 590
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
595 600 605
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
610
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 25
gaattccata tgcaaaaaga agttgaacaa aattctggac ccctc 45
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 26
ttgtcagtcg acttagagtc tctcagctgg tacacg 36
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 27
gaattccata tggattctgg agttacacaa accccaaagc acctg 45
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 28
tagaaaccgg tggccaggca caccagtgtg gc 32

Claims (20)

1.一种非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的T细胞受体(TCR)，其具有结合FMNKFIYEI(SEQ ID No:1)HLA-A2复合物的性质，并且包含至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个TCRβ链可变结构域，
所述α链可变结构域包含与SEQ ID No:2的氨基酸残基1-112的序列有至少90％相同性的氨基酸序列，和/或
所述β链可变结构域包含与SEQ ID No:3的氨基酸残基1-112的序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含对应于31Q、32S、94D、95S、96G、97Y和98A的氨基酸中一个或多个中的突变。
3.如权利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含至少一个以下突变：
残基编号 31Q F Y 32S A 94D Q 95S N 96G S 97Y V 98A S
。
4.如前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含与以下任一序列的残基1-112有至少90％相同性的氨基酸序列：SEQ ID No:6、SEQ ID No:7、SEQID No:8、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10、SEQ ID No:11、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQID No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID No:17、SEQ ID No:18、SEQ ID No:19和SEQ ID No:20。
5.如前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含SEQ IDNo:11、SEQ ID No:12或SEQ ID No:13的Q1至H112，和/或所述β链可变结构域包含SEQ IDNO:3的D1至T112。
6.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含ID No:2的氨基酸残基1-112，并且所述β链可变结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸残基1-112。
7.如前述权利要求中任一项所述的TCR，所述TCR具有α链TRAC恒定结构域序列和/或β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列。
8.如权利要求7所述的TCR，其特征在于，通过截短或取代来修饰所述α和/或β链恒定结构域序列，以删除TRAC的外显子2的Cys4和TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键。
9.如权利要求7或8所述的TCR，其特征在于，通过用半胱氨酸残基取代TRAC的Thr 48和TRBC1或TRBC2的Ser 57来修饰所述α和/或β链恒定结构域序列，所述半胱氨酸在所述TCR的α和β恒定结构域之间形成二硫键。
10.如前述权利要求中任一项所述的TCR，所述TCR是Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ或Vα-Cα-L-Vβ-Cβ型的单链形式，其中Vα和Vβ分别是TCRα和β可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和β恒定区，且L是接头序列。
11.如权利要求1-9中任一项所述的TCR，所述TCR是α-β异二聚体。
12.如前述权利要求中任一项所述的TCR，所述TCR与可检测标记物、治疗剂或PK修饰部分相联。
13.非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的编码前述权利要求中任一项所述的TCR的核酸。
14.非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的细胞，尤其是T细胞，所述细胞呈递权利要求1-12中任一项所述的TCR。
15.一种细胞，所述细胞含有
(a)TCR表达载体，所述表达载体包含在单个开放阅读框或分别在2个不同的开放阅读框中编码α链和β链的权利要求13所述的核酸；或
(b)包含编码权利要求1-12中任一项所述的TCR的α链的核酸的第一表达载体，和包含编码权利要求1-12中任一项所述的TCR的β链的核酸的第二表达载体。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的TCR或权利要求14或15所述的细胞以及一种或多种药学上可接受的运载体或赋形剂。
17.一种非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的TCR，其结合以肽-HLA-A2复合物形式呈递的FMNKFIYEI(SEQ ID No:1)肽，或表达和/或呈递这种TCR的细胞，其用于医药。
18.如权利要求17所述应用的TCR或细胞，其用于治疗癌症的方法。
19.如权利要求18所述应用的TCR或细胞，其特征在于，所述方法包括过继性疗法。
20.如权利要求17-19中任一项所述应用的TCR或细胞，其特征在于，所述TCR如权利要求1-12中任一项所述和/或所述细胞如权利要求14或15所述。
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