KR20220044534A - 조작된 인터류킨-2 수용체 베타 효능제 - Google Patents

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KR20220044534A
KR20220044534A KR1020227007082A KR20227007082A KR20220044534A KR 20220044534 A KR20220044534 A KR 20220044534A KR 1020227007082 A KR1020227007082 A KR 1020227007082A KR 20227007082 A KR20227007082 A KR 20227007082A KR 20220044534 A KR20220044534 A KR 20220044534A
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양 첸
케하오 자오
크리스티나 스완슨
제나 응우옌
네이선 칼렌
사무엘 클레멘트 하산
닝 장
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엘피스 바이오파마슈티컬즈
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Abstract

본 명세서에는 조작된 IL2 폴리펩타이드 및 이의 융합 단백질이 제공된다. 또한, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 이의 융합 단백질을 투여함으로써 면역 반응을 조절하는 방법이 제공된다. 조작된 IL2 폴리펩타이드 및 이의 융합 단백질은 IL2Rβ에 대한 증가된 결합, IL2Rα에 대한 감소된 결합, 또는 둘 다를 나타낸다.

Description

조작된 인터류킨-2 수용체 베타 효능제
관련 출원에 대한 상호 참조문헌
본 출원은 2019년 8월 13일자로 출원된 미국 가출원 제62/886,148호에 대한 우선권의 혜택을 주장하고, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록에 관한 서술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 사본 대신 텍스트 포맷으로 제공되고, 이에 의해 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 서열 목록을 포함한 텍스트 파일의 명칭은 300096_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 230 KB이고, 2020년 8월 13일에 작성되고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.
인터류킨-2(IL2)는 림프구 증식 및 활성화를 조절하는 사이토카인이다. 이는 133개의 아미노산의 길이를 가지며, 구조는 4개의 역평행, 양친매성 C-나선을 포함한다. IL2는 IL2 수용체(IL2R)에 대한 결합에 의해 이의 작용을 매개하고, 이는 최대 3개의 개개 하위단위를 포함한다. 모두 3개의 하위단위, 즉, 인터류킨-2 수용체 알파 사슬(IL2Rα 또는 CD25), 인터류킨-2 수용체 베타 사슬(IL2Rβ 또는 CD122), 및 인터류킨-2 수용체 감마 사슬(IL2Rγ 또는 CD132)의 결합은 트라이머 IL2Rαβγ를 생성하는데, 이는 IL2에 대한 고친화력 수용체이다. IL2Rβ 및 IL2Rγ 하위단위의 결합은 다이머 수용체 IL2Rβγ를 생성하고, 중간 친화력 IL2R로 명명된다. IL2Rα 하위단위는 모노머 저친화력 IL2 수용체를 형성한다. IL2Rα의 발현은 면역억제 조절 T 세포(Treg)의 확장에 관여하고, 다이머 IL2Rβγ는 세포용해 CD8+ T 세포 및 NK 세포 증식을 야기시킬 수 있고, IL2Rα의 부재 하에서의 사멸을 야기시킬 수 있다.
본 개시내용은 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rβ에 대한 개선된 결합 및/또는 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rα에 대한 감소된 결합을 갖는 조작된 IL2 폴리펩타이드를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 하기 서열번호 1을 포함하는 조작된 IL2 수용체 β(IL2Rβ) 결합 영역 2를 포함하는 조작된 인터류킨-2(IL2) 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2보다 적어도 10배 더 큰 KD로 IL2Rβ에 결합한다:
X1-X2-X3-D-X4-X5-X6-N-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13 (서열번호 1)
여기서, X1, X3, X6, X8, X12 및 X13은 각각 임의의 잔기를 포함하고,
X2, X4 및 X10은 하전되지 않은 잔기이고,
X5, X7, X9 및 X11은 각각 하전되지 않은, 비극성 잔기이다.
특정 양태에서, X1은 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기이거나; X1은 C, T, G, W, I, S, E 및 K로부터 선택되거나; X1은 G, K, E, C 및 T로부터 선택된다. 특정 양태에서, X2는 하전되지 않은 극성 잔기 또는 하전되지 않은 비극성 잔기이거나; X2는 Y, P, V, W, L, A 및 G로부터 선택되거나; X2는 V, P, W 및 A로부터 선택된다. 특정 양태에서, X3은 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기이거나; X3은 S, T, Q, G, M, E, R 및 K로부터 선택되거나; X3은 T, G, S, R 및 E로부터 선택된다. 특정 양태에서, X4는 L이 아니거나; X4는 하전되지 않은 비극성 잔기 또는 하전되지 않은 극성 잔기이거나; X4는 A, V, S 및 T로부터 선택된다. 특정 양태에서, X5는 I, L, T 및 V로부터 선택되거나; X5는 I 및 V로부터 선택된다. 특정 양태에서, X6은 하전되지 않은 극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기이거나; X6은 S, T, E, D 및 R로부터 선택되거나; X6은 S, D, E 및 T로부터 선택된다. 특정 양태에서, X7은 I, A, M 및 V로부터 선택되거나; X7은 I, A 및 M으로부터 선택된다. 특정 양태에서, X8은 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기이고; X8은 S, T, N, Q, I, G, E, K 및 R로부터 선택되거나; X8은 I, R, N 및 T로부터 선택된다. 특정 양태에서, X9는 V, L 및 I로부터 선택되거나; X9는 V이다. 특정 양태에서, X10은 하전되지 않은 극성 잔기 또는 하전되지 않은 비극성 잔기이거나; X10은 N, T, I 및 L로부터 선택되거나; X10은 I 및 L로부터 선택된다. 특정 양태에서, X11은 하전되지 않은 비극성 잔기이거나; X11은 V, A 및 I로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X12는 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 또는 산성 잔기이거나; X12는 Q, L, G, K 및 R로부터 선택되거나; X12는 R, G, Q 및 K로부터 선택된다. 특정 양태에서, X13은 하전되지 않은 비극성 잔기 또는 염기성 잔기이거나; X13은 A, D 및 E로부터 선택되거나; X13은 E 및 A로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 R81, P82, R83, L85, I86, S87, I89, N90, I92, V93 및 L94로부터 선택된 적어도 하나의 잔기에 대한 치환을 포함하는 조작된 IL2 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 양태에서, R81 치환은 R81G, R81K, R81E, R81C 및 R81T로부터 선택되고, R83 치환은 R83T, R83G, R83S 및 R83E로부터 선택되고; L85 치환은 L85S, L85A, L85V 및 L85T로부터 선택되고; I92 치환은 I92L이고; L94 치환은 L94R, L94G, L94Q 및 L94K로부터 선택된다. 특정 양태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 R81 및 L83에 대한 치환을 포함한다. 특정 양태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 R81, L83, S87, N90 및 N94에 대한 치환; R81, L83, S87, N90 및 V93에 대한 치환; R81, L83, P82 및 V93에 대한 치환; 또는 R81, L83 및 N90에 대한 치환을 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 위치 K35에서의 치환, R38에서의 치환, F42에서의 치환, Y45에서의 치환, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 치환을 포함하는, 조작된 IL2 수용체 α(IL2Rα) 결합 영역 1 모티프를 포함하는 조작된 인터류킨-2 (IL2) 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 적어도 2배 감소된 결합 동역학으로 IL2Rα에 결합한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 전술된 바와 같은 조작된 IL2 수용체 β(IL2Rβ) 결합 영역 2 및 전술된 바와 같은 조작된 IL2 수용체 α(IL2Rα) 결합 영역 1을 포함하는 조작된 IL2 폴리펩타이드를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 반김기 연장 분자에 융합된, 본 명세서에 제공된 조작된 IL2 폴리펩타이드를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서, 제1 폴리펩타이드는 본 명세서에 제공된 조작된 IL2 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 이의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 포함하는 변형된 세포를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 이의 융합 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 대상체에 치료학적 유효량의 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 이의 융합 폴리펩타이드, 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 면역 반응의 조절은 이펙터 T 세포 활성의 향상, NK 세포 활성의 향상, 및 조절 T 세포 활성의 억제 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 질환 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 대상체에 치료학적 유효량의 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 이의 융합 폴리펩타이드, 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 질환은 암이다. 특정 양태에서, 방법은 추가 치료제, 예를 들어, 항원 결합 모이어티, 키메라 항원 수용체를 발현시키는 면역 세포, 조작된 T 세포 수용체를 발현시키는 면역 세포, 종양 침윤 림프구, 면역 관문 저해제, 종양 용해성 바이러스, 종양 미세환경(tumor microenvironment: TME) 저해제, 또는 암 백신을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 방법은 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 이의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 면역 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
도 1a는 IL2Rα(실선 오픈 박스), IL2Rβ(점선 박스), 및 IL2Rγ(회색 박스)를 결합을 담당하는 IL2의 영역을 도시한 것이고, 도 1b는 IL2에 결합된 IL2Rα, IL2Rβ, 및 IL2Rγ의 그래픽 도식을 도시한 것이고, 도 1c는 IL2Rα 상호작용을 위해 중요한 IL2의 4개의 잔기(K35, R38, F42 및 Y45)를 강조한 IL2의 IL2Rα 결합 사이트를 도시한 것이다.
도 2a 및 도 2b는 ELISA에 의한 IL2Rα 감소된 결합 돌연변이의 식별을 도시한 것이다.
도 3은 IL2Rα 감소된 결합 돌연변이의 표면 플라스몬 공명 서열 정렬에 의한 IL2Rα-감소된 결합 돌연변이의 특징분석을 도시한 것이다.
도 4는 표면 플라스몬 공명에 의한 IL2Rα-감소된 결합 돌연변이의 특징분석을 도시한 것이다.
도 5는 IL2Rβ 효능제 돌연변이유발 라이브러리(agonist mutagenic library)를 도시한 것이다.
도 6은 이.콜라이(E. coli)에서 IL2Rβ 효능제 발현 및 IL2Rβ에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 7은 mRNA 디스플레이를 통해 식별된 IL2Rβ 효능제에 대한 IL2Rβ 결합 영역 2의 다수의 서열 정렬을 도시한 것이다.
도 8은 이.콜라이에서 생성된 IL2Rβ 효능제 클론의 SDS 합성을 도시한 것이다.
도 9a 및 도 9b는 SPR에서 IL2Rα(도 9a) 및 IL2Rβ(도 9b)에 대한 야생형 IL2의 센서그램 및 결합 동역학을 도시한 것이다.
도 10a 내지 도 10h는 SPR에서 IL2Rα에 대한 이.콜라이 생성된 야생형 IL2 및 조작된 IL2Rβ 효능제의 센서그램을 도시한 것이다. 도 10a는 야생형 IL2의 센서그램을 도시한 것이고; 도 10b는 EP001의 센서그램을 도시한 것이고; 도 10c는 EP004의 센서그램을 도시한 것이고; 도 10d는 EP005의 센서그램을 도시한 것이고; 도 10e는 EP002의 센서그램을 도시한 것이고; 도 10f는 EP03의 센서그램을 도시한 것이고; 도 10g는 EPIM-06의 센서그램을 도시한 것이고; 도 10h는 EP007의 센서그램을 도시한 것이다.
도 11a 내지 도 11h는 SPR에서 IL2Rβ에 대한 이.콜라이 생성된 야생형 IL2 및 조작된 IL2Rβ 효능제의 센서그램을 도시한 것이다. 도 11a는 EP003의 센서그램을 도시한 것이고; 도 11b는 EP005의 센서그램을 도시한 것이고; 도 11c는 E002의 센서그램을 도시한 것이고; 도 11d는 EP001의 센서그램을 도시한 것이고; 도 11e는 EP007의 센서그램을 도시한 것이고; 도 11f는 EP006의 센서그램을 도시한 것이고; 도 11g는 EP004의 센서그램을 도시한 것이고; 도 11h는 야생형 IL2의 센서그램을 도시한 것이다.
도 12a 내지 도 12d는 SPR에서 포유류 생성된 야생형 IL2(도 12a) 및 조작된 IL2Rβ 효능제 EP0001(도 12b), EP0003(도 12c) 및 EP004(도 12d)에 대한 IL2Rβ 결합의 센서그램을 도시한 것이다.
도 13a 내지 도 13d는 SPR에서 포유류 생성된 야생형 IL2(도 13a) 및 조작된 IL2Rβ 효능제 EP001(도 13b), EP003(도 13c) 및 EP004(도 13d)에 대한 IL2Rα 결합의 센서그램을 도시한 것이다.
도 14a 내지 도 14i는 CD8+ T 세포(도 14a는 혈액 공여자 1, 도 14d는 혈액 공여자 2, 도 14g는 혈액 공여자 3), NK 세포(도 14b는 혈액 공여자 1, 도 14e는 혈액 공여자 2 및 도 14h는 혈액 공여자 3) 및 Treg(도 14c는 혈액 공여자 1, 도 14f는 혈액 공여자 2 및 도 14i는 혈액 공여자 3)에 대해 측정한 경우, 야생형 IL2 및 조작된 IL2Rβ 효능제와 함께 인간 PBMC의 자극 후, 혈액 공여자 1 내지 3으로부터 측정한 경우 pSTAT5 발현을 도시한 것이다.
도 15a 및 도 15b는 ELISA에 의한 IL2Rα(도 15a) 및 IL2Rβ(도 15b)에 대한 결합을 위한 IL2Rβ 효능제 EP001 역-돌연변이 클론의 ELISA에 의한 특징분석을 도시한 것이다.
도 16a 내지 도 16h는 SPR에 의한 IL2Rβ 효능제 EP001 역-돌연변이 클론의 IL2Rβ 결합 센서그램을 도시한 것이다.
도 17은 IL2Rα/IL2Rβ 클론의 정제된 클론에 대한 SDS-PAGE 결과의 예를 도시한 것이다.
도 18a 내지 도 18h는 SPR에 의한 인간 IL2α에 대한 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론의 결합 센서그램을 도시한 것이다.
도 19a 내지 도 19h는 SPR에 의한 인간 IL2β에 대한 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론의 결합 센서그램을 도시한 것이다.
도 20a 내지 도 20g는 SPR에 의한 인간 IL2Rα에 대한 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론의 단일 농도 결합을 도시한 것이다.
도 21a 내지 도 21g는 SPR에 의한 인간 IL2Rβ에 대한 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론의 단일 농도 결합을 도시한 것이다.
도 22a 내지 도 22b는 SPR에 의한 인간 IL2Rα(도 22a) 및 IL2Rβ(도 22b)에 대한 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론의 다중-농도 결합을 도시한 것이다.
도 23a 내지 도 23e는 인간 IL2Rα에 대한 ELISA 결합을 도시한 것이다. 도 23a는 인간 IL2Rα에 대한 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이의 ELISA 결합을 도시한 것이다. 도 23b는 인간 IL2Rα에 대한 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이의 ELISA 결합을 도시한 것이다. 도 23c는 인간 IL2Rα에 대한 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이의 ELISA 결합을 도시한 것이다. 도 23d는 인간 IL2Rα에 대한 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이의 ELISA 결합을 도시한 것이다. 도 23e는 선택된 조작된 IL2Rβ/IL2Rα 클론에 대한 용량 의존 결합을 도시한 것이다.
도 24a 내지 도 24d는 인간 IL2Rβ에 대한 ELISA 결합을 도시한 것이다. 도 24a는 인간 IL2Rβ에 대한 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이의 ELISA 결합을 도시한 것이다. 도 24b는 인간 IL2Rβ에 대한 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이의 ELISA 결합을 도시한 것이다. 도 24c는 인간 IL2Rβ에 대한 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이의 ELISA 결합을 도시한 것이다. 도 24d는 인간 IL2Rβ에 대한 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이의 ELISA 결합을 도시한 것이다.
도 25a 내지 도 25d는 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론에 의한, 공여자 656으로부터의 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 25a는 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 25b는 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 25c는 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 25d는 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 26a 내지 도 26d는 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론에 의한, 공여자 648로부터의 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 26a는 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 26b는 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 26c는 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 26d는 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 27a 내지 도 27d는 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론에 의한, 공여자 656으로부터의 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 27a는 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 25b는 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 27c는 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 27d는 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 28a 내지 도 28d는 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론에 의한, 공여자 648로부터의 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 28a는 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 28b는 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 28c는 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 28d는 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 29a 내지 도 29d는 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론에 의한, 공여자 656으로부터의 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 29a는 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 29b는 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 29c는 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 29d는 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 30a 내지 도 30d는 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론에 의한, 공여자 648로부터의 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 30a는 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 30b는 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 30c는 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 30d는 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 인간 Treg 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 31a 내지 도 31d는 뮤린 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다도 31a는 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 31b는 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 31c는 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 31d는 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 CD8+ T 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 32a 내지 도 32d는 뮤린 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 32a는 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 32b는 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 32c는 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 32d는 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 NK 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 33a 내지 도 33d는 뮤린 T 조절 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 33a는 EP252 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 T 조절 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 33b는 EP253 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 T 조절 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 33c는 EP258 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 T 조절 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다. 도 33d는 EP260 및 이의 IL2Rα 결합 감소 돌연변이에 대한 뮤린 T 조절 세포의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 34는 뮤린 CD8+ T 세포, NK 세포, 및 Treg의 p-STAT5 활성화의 요약을 도시한 것이다.
도 35a 내지 도 35c는 1가 및 2가 IL2Rβ 효능제 Fc 융합 단백질의 구조 다이아그램을 도시한 것이다.
도 36a 및 도 36b는 정제된 IL2Rβ 효능제 Fc 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다.
도 37a 내지 도 37g는 2가 IL2Rβ 효능제 Fc 융합 단백질의 ELISA에 의한 수용체 결합 분석을 도시한 것이다.
도 38a 및 도 38b는 1가 IL2Rβ 효능제 Fc 융합 단백질의 ELISA에 의한 수용체 결합 분석을 도시한 것이다.
도 39a 내지 도 39d는 SPR에 의한 1가 IL2Rβ Fc 융합 단백질의 수용체 결합 분석을 도시한 것이다.
도 40a 내지 도 40c는 2가 IL2Rβ 효능제 Fc-융합 단백질에 의한 인간 PBMC의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 41a 내지 도 41c는 1가 IL2Rβ 효능제 Fc-융합 단백질에 의한 인간 PBMC의 p-STAT5 활성화를 도시한 것이다.
도 42a 및 도 42b는 IL2Rβ 효능제의 뮤린 i.v.(도 42a) 및 i.p.(도 42b) 투여에 대한 약동학을 도시한 것이다.
도 43a 내지 도 43d는 IL2Rβ 효능제의 투여 후 종양 침습 면역 세포의 정규환된 카운트를 도시한 것이다.
도 44a 및 도 44b는 종양에서 T 조절 세포에 대한 이펙터 세포의 비율을 도시한 것이다.
도 45a 내지 도 45c는 이펙터 및 기억 T 세포의 백분율을 도시한 것이다.
IL2는 유망한 새로운 면역요법이지만, 야생형 인간 IL2를 기반으로 한 요법은 이펙터 T 세포 및 NK 세포를 활성화하는 것 이외에 T 조절 세포를 활성화할 수 있다. IL2에 의한 T 조절 세포의 활성화는 그 밖에 IL2에 의해 유도될 수 있는 항암 반응을 방해할 수 있다. 이에 따라, T 조절 세포의 활성화 감소 및/또는 T 이펙터 세포, NK 세포 또는 이들의 조합의 우선적 활성화를 갖는 IL2-기반 요법이 요구된다.
본 명세서에는 합리적으로 설계된 IL2Rβ 효능제가 제시되고, 이는 IL2Rβ에 대한 결합을 향상시키는 IL2Rβ 결합 영역 2에서 아미노산 치환을 갖는 조작된 IL2 폴리펩타이드이다. 조작된 IL2Rβ 효능제는 T 조절 세포가 아닌, 야생형 IL2와 비교하여 NK 세포 및 T 이펙터 세포의 자극을 증가시키는 장점을 제공한다. 이에 따라, 조작된 IL2Rβ 효능제는 예를 들어, 암의 치료를 위해 면역 반응을 조절 또는 활성화하는 데 유용한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인터류킨-2 또는 "IL2"는 달리 명시하지 않는 한, 인간과 같은 포유동물 또는 마우스를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 IL2를 지칭한다. 이러한 용어는 전구체 또는 처리되지 않은 IL2뿐만 아니라 세포 처리부터 형성된 임의의 형태의 IL2를 포함한다. 이러한 용어는 또한, IL2의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 성숙한 인간 IL2의 아미노산 서열은 서열번호 65에 나타나 있다. 전구체 또는 처리되지 않은 인간 IL2는 서열번호 66에 나타나 있고, 20-잔기 신호 펩타이드를 포함하고, 이는 성숙한 IL2 폴리펩타이드에 존재하지 않는다. IL2를 참조하여 사용될 때 "야생형" 또는 "천연"은 성숙한 IL2 분자(예를 들어, 서열번호 65)를 의미하도록 의도된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "조작된 IL2" 또는 "조작된 IL2 폴리펩타이드"는 천연 또는 야생형 IL2와 상이하고, 전장 IL2, IL2의 절단된 형태, 및 IL2가 다른 분자, 예를 들어, 다른 폴리펩타이드와 연결 또는 융합된 형태를 갖는 IL2를 포함한다. 다양한 형태의 조작된 IL2는 IL2Rβ 및/또는 IL2Rα와 IL2의 상호작용에 영향을 미치는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에 기술된 IL2의 다양한 조작된 형태의 식별은 예를 들어, 서열번호 22에 나타낸 서열과 관련하여 이루어진다. 다양한 식별자는 동일한 잔기 치환을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 위치 81에서 아르기닌에서 트레오닌에 대한 치환은 R81T 또는 81T로서 지시될 수 있다.
IL2Rβ 결합 영역 1 및 IL2Rβ 결합 영역 2은 IL2Rβ에 대한 IL2 결합을 담당한다. 본 명세서에서 사용되는 "IL2Rβ 결합 영역 1"은 야생형 또는 천연 인간 IL2의 잔기 11 내지 23을 지칭한다. IL2Rβ 결합 영역 1의 아미노산 서열은 서열번호 67에 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 "IL2Rβ 결합 영역 2"는 야생형 또는 천연 인간 IL2의 잔기 81 내지 95를 지칭한다. IL2Rβ 결합 영역 2의 아미노산 서열은 서열번호 68에 제공된다.
IL2Rα 결합 영역 1 및 IL2Rα 결합 영역 2는 IL2Rα에 대한 IL2 결합을 담당한다. 본 명세서에 사용되는 "IL2Rα 결합 영역 1"은 야생형 또는 천연 인간 IL2의 잔기 34 내지 45를 지칭한다. IL2Rα 결합 영역 1의 아미노산 서열은 서열번호 223에 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치환" 또는 "잔기 치환"은 천연 또는 야생형 잔기의 상이한 잔기로의 대체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "임의의 잔기"는 하기 20개의 정형적인 아미노산 측쇄 중 하나를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다: 알라닌(Ala, A); 아르기닌(Arg, R); 아스파라긴(Asn, N); 아스파르트산(Asp, D); 시스테인(Cys, C); 글루타민(Gln, Q); 글루탐산(Glu, E); 글리신(Gly, G); 히스티딘(His, H); 아이소류신(Ile, I); 류신(Leu, L); 라이신(Lys, K); 메티오닌(Met, M); 페닐알라닌(Phe, F); 프롤린(Pro, P); 세린(Ser, S); 트레오닌(Thr, T); 트립토판(Trp, W); 티로신(Tyr, Y); 및 발린(Val, V).
본 명세서에서 사용되는 "하전되지 않은 잔기"는 생리 pH(pH=7)에서 전하를 유지하지 않는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다. 하전되지 않은 잔기는 알라닌(Ala, A); 아스파라긴(Asn, N); 시스테인(Cys, C); 글루타민(Gln, Q); 글리신(Gly,G); 히스티딘(His, H); 아이소류신(Ile, I); 류신(Leu, L); 메티오닌(Met, M); 페닐알라닌(Phe, F); 프롤린(Pro, P); 세린(Ser, S); 트레오닌(Thr, T); 트립토판(Trp, W); 티로신(Tyr, Y); 및 발린(Val, V)이다.
본 명세서에서 사용되는 "하전되지 않은 극성 잔기"는 생리 pH(pH=7)에서 전하를 유지하지 않고 친수성인 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다. 하전되지 않은 극성 잔기는 아스파라긴(Asn, N); 시스테인(Cys, C); 글루타민(Gln, Q); 세린(Ser, S); 트레오닌(Thr, T); 및 티로신(Tyr, Y)이다.
본 명세서에서 사용되는 "하전되지 않은 비극성 잔기"는 생리 pH(pH=7)에서 전하를 유지하지 않고 소수성인 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다. 하전되지 않은 비극성 잔기는 알라닌(Ala, A); 글리신(Gly, G); 히스티딘(His, H); 아이소류신(Ile, I); 류신(Leu, L); 메티오닌(Met, M); 페닐알라닌(Phe, F); 프롤린(Pro, P); 트립토판(Trp, W); 및 발린(Val, V)이다.
본 명세서에서 사용되는 "염기성 잔기"는 생리 pH(pH=7)에서 양전하를 유지하는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다. 염기성 잔기는 라이신(Lys, K); 및 아르기닌(Arg, R)이다.
본 명세서에서 사용되는 "산성 잔기"는 생리 pH(pH=7)에서 음전하를 유지하는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다. 산성 잔기는 아스파르트산(Asp, D); 및 글루탐산(Glu, E)이다.
"융합 폴리펩타이드" 또는 "융합 단백질"은 동일한 유전자로부터 자연적으로 발현되지 않은, 유전자 또는 이의 단편에 해당하는 적어도 2개의 상이한 DNA 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 폴리펩타이드의 예는 조작된 IL2-Fc 융합 폴리펩타이드이고, 이는 조작된 IL2 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 Fc 도메인의 아미노산 서열을 포함한다.
"친화력"은 분자(예를 들어, 수용체)의 단일 결합 사이트와 이의 결합 파트너(예를 들어, 리간드) 사이의 비-공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 "결합 친화력"은 내재 결합 친화력을 지칭하고, 결합쌍의 구성원(예를 들어, 수용체 및 리간드) 간의 1:1 상호작용을 반영한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자-X의 친화력은 일반적으로, 해리 상수(KD)로 표현될 수 있으며, 이는 해리 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 Kon)의 비율이다. 이에 따라, 속도 상수의 비율이 동일하게 유지되는 한, 동등한 친화력은 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화력은 본 명세서에 기술된 것을 포함하는, 당업자에 의해 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "반감기 연장 분자"는 제2 분자에 (예를 들어, 공유적으로) 부착될 때, 제2 분자의 반감기를 연장하는 분자를 지칭한다. 반감기 연장 분자의 예는 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민(HSA), HSA 결합 분자, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역으로부터 유도된 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 용어는 천연 Fc 영역, 또는 이의 변형체를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대개 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단으로 연장하도록 규정된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. Fc 영역의 예는 미국 특허 제7,317,091호; 미국 특허 제8,735,545호; 미국 특허 제7,371,826호; 미국 특허 제7,670,600호; 및 미국 특허 제9,803,023호에 개시되어 있으며, 이러한 문헌 모두는 전문이 참조에 의해 원용된다.
"인간 혈청 알부민" 또는 "HSA"는 인간 혈액에서 발견되는 혈청 알부민을 지칭한다. HSA의 통상적으로 사용되는 형태는 66.5 kDa의 분자량 및 대략 20일의 반감기를 갖는다. HSA 분자의 예는 미국 특허 제8,143,026호 및 미국 특허 제7,189,690호에 개시되어 있으며, 이러한 문헌은 전문이 참조에 의해 원용된다.
"HSA 결합 분자"는 인간 혈청 알부민(HSA), 예를 들어, HSA 결합 도메인을 갖는 항원 결합 모이어티에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다.
폴리에틸렌 옥사이드로도 지칭되는 "폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 반감기를 연장하기 위해 사용될 수 있는 폴리에테르 폴리머이다.
폴리프로필렌 옥사이드로도 지칭되는 "폴리프로필렌 글리콜" 또는 "PPG"는 반감기를 연장하기 위해 사용될 수 있는 프로필렌 글리콜의 폴리머이다.
"항원 결합 모이어티"는 항원 에피토프와 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자(예를 들어, 항체)의 부위(즉, 아미노산 잔기)를 지칭한다. 항원 결합 모이어티는 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역으로도 불리워짐)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 항원 결합 모이어티의 예는 면역글로불린, Fab 분자, scFv, 이중특이 항체, 이중체, 이중특이 T-세포 결합체, 및 나노바디를 포함한다. 항원 결합 모이어티의 특정 예는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 리툭시맙, 옥렐리주맙, 이보누투주맙, 오파투무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 우블리툭시맙, 및 베바시주맙을 포함한다.
"면역글로불린"은 자연 발생 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 일 예로서, IgG 부류의 면역글로불린은 디설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 헤테로테트라머 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 중쇄 각각은 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리워지는 가변 영역(VH)을 가지고, 이후에, 중쇄 불변 영역으로도 불리워지는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 각각은 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리워지는 가변 영역(VL)을 가지고, 이후에, 경쇄 불변 영역으로도 불리워지는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)로 불리워지는, 5개 부류 중 하나로 지정될 수 있으며, 이들 중 일부는 하위부류, 예를 들어, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 이의 불변 도메인의 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리워지는, 2개의 타입 중 하나로 지정될 수 있다. 면역글로불린은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인을 포함한다.
"Fab 분자" 또는 "항원 결합 단편"은 경쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인, 및 중쇄의 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 항체의 항원 결합 단편이다.
"단쇄 가변 도메인" 또는 "scFv"는 링커 펩타이드에 의해 연결된, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함하는 항원 결합 모이어티를 지칭한다.
"이중특이 항체"는 2개의 상이한 항원 결합 사이트를 갖는 인공 항체를 지칭한다. 이중특이 항체는 2개의 상이한 항원 결합 사이트를 갖는 전체 면역글로불린 단백질을 지칭할 수 있거나, 2개의 항원 결합 모이어티를 갖는 다른 분자, 예를 들어, 2개의 Fab 또는 2개의 scFv를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 수 있다.
"이중체"는 2가 및 이중특이인 항원 결합 분자의 부류를 지칭한다. 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬 상에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다(VH-VL). 동일한 사슬 상에 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루고, 2개의 항원-결합 사이트를 생성하게 한다.
"이중특이 T-세포 결합체"는 (예를 들어, CD3을 결합시킴으로써) T 세포에 결합하는 제1 항원 결합 모이어티, 및 상이한 항원(예를 들어, 종양 항원)과 결합하는 제2 항원 결합 모이어티를 갖는 이중특이 항체의 부류를 지칭한다.
"나노바디" 또는 "단일 도메인 항체"는 단일 모노머 가변 항체 도메인으로 이루어진 항원 결합 모이어티를 지칭한다.
"트랜스페린"은 반감기를 연장하기 위해 융합 단백질에서 사용될 수 있는 철분 수송체 단백질이다. 인간 트랜스페린은 혈청에서 12일의 반감기를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 "사이토카인"은 세포 신호전달 및 면역조절에 관여되는 작은(<25 kDa) 단백질의 부류를 지칭한다. 사이토카인은 예를 들어, IL2, 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-17(IL-17), 인터류킨-18(IL-18), 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, TGF-β1, TGF-β2, 및 TGF-β3, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2(CCL2) 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 포함한다.
상기 실시형태 중 어느 하나에 따른 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
"면역 반응을 조절하는"은 일반적 증가, T 이펙터 세포 반응(예를 들어, 종양 세포 및 바이러스 감염된 세포에 대한 세포독성)의 증가, B 세포 활성화의 증가, 림프구 활성화 및 증식의 복원, IL2 수용체의 발현 증가, T 세포 반응성의 증가, 자연 살해 세포 활성 또는 림포카인-활성화된 킬러(LAK) 세포 활성의 증가, 다른 T 세포에 대한 조절 T 세포 반응의 감소 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
"조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 다른 T 세포의 반응을 억제하는 기능을 할 수 있는 특수한 타입의 CD4+ T 세포를 지칭한다. Treg 세포는 IL2 수용체(CD25)의 α-하위단위 및 전사 인자 포크헤드 박스 P3(FOXP3)을 발현시키고(Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)), 종양에 의해 발현되는 것을 포함하는, 항원에 대한 말초 자가-내서의 유도 및 유지와 관련이 있다. Treg 세포는 이의 기능 및 발달 및 이의 억제 특징의 유도를 위해 IL2를 필요로 한다.
"T 이펙터 세포"는 IL2와 같은, 자극에 반응하는 T 세포의 집단을 지칭한다. T 이펙터 세포는 CD8+ 세포독성 T 세포 및 CD4+ 헬퍼 T 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 T 이펙터 세포는 T 조절 세포를 포함하지 않는다.
"자연 살해 세포" 또는 "NK 세포"는 선천적 면역계의 성분이고, 종양 및 바이러스 감염된 세포의 거부반응에서 중요한 역할을 하는 세포독성 림프구이다.
"치료," "치료하는" 또는 "개선하는"은 대상체(예를 들어, 환자)의 병태, 질환, 또는 질환의 의학적 관리를 지칭하고, 이는 치료적, 예방적(prophylactic/preventative) 또는 이들의 병용 치료일 수 있다.
"유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 항암 효과와 같은 원하는 생리학적 변화를 제공하는 치료제(예를 들어, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드)의 양을 지칭할 수 있다. 원하는 생리학적 변화는 예를 들어, 질환 증상의 감소, 또는 질환 중증도의 감소일 수 있거나, 질환 진행의 감소일 수 있다. 암과 관련하여, 원하는 생리학적 변화는 예를 들어, 종양 회귀, 종양 진행 속도 감소, 암 바이오마커 수준의 감소, 암과 관련된 증상의 감소, 전이의 예방 또는 지연, 또는 임상적 증상 완화를 포함할 수 있다.
"관문 저해제"는 면역 관문 단백질의 활성을 감소시키는 제제를 지칭한다. 관문 저해제는 면역 관문 단백질에 결합하고 이의 활성을 감소시키는 항원 결합 모이어티일 수 있다. 면역 관문 단백질는 예를 들어, 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1 또는 CD279), 프로그래밍된 사멸-리간드 1(PD-L1 또는 CD274), 세포독성 T-림프구-관련 항원 4(CTLA-4 또는 CD152), T-세포 면역글로불린 뮤신-3(TIM3), 림프구 활성화 3(LAG3 또는 CD223), B7-H2(ICOSL 또는 CD275), 및 B7-H3(CD276)을 포함한다. 관문 저해제의 예는 이필리무맙(항-CTLA-4 항체), 니볼루맙(항-PD-1 항체), 및 펨브롤리주맙(항-PD-1 항체)을 포함한다.
"암 항원"은 암 세포에 의해 우선적으로 발현되는 분자를 지칭한다. 암 항원의 예는 CD19, CD20, ROR1, 섬유아세포 활성화 단백질-α, 및 암배 항원(CEA)을 포함한다.
"종양 용해성 바이러스"는 암 세포를 우선적으로 감염시키고 사멸시키는 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, 종양용해성 헤르페스 바이러스는 ICP34.5를 결실하도록 조작되어, 암(건강한 세포가 아님)에서만 복제되는 바이러스를 생성한다. 종양 용해성 바이러스의 예는 탈리모겐 라헤르파렙벡(Talimogene laherparepvec)이고, 이는 흑색종을 치료하기 위해 사용되는 것이다.
"암 백신"은 면역계로부터 항암 반응을 이끌어 내기 위해 면역계에 대한 암 에피토프를 제시하는 백신을 지칭한다. 예를 들어, 시풀루셀-T는 전이성 전립선암에 대한 백신이고, 이는 전립선암 전립선산 포스파타제(PAP)에 대한 면역 반응을 표적화한다.
"키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 특정 타입의 면역 세포에서 발현될 때, 항원 결합 시에 면역 세포를 활성화시키는 조작된 항원 결합 수용체이다. CAR은 통상적으로, 항원 결합 모이어티(예를 들어, scFv), 막관통 도메인, 및 세포내 면역 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ, 4-1BB 및/또는 CD28로부터의 신호전달 도메인을 포함함)을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. CAR은 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포에 의해 발현될 수 있고, CD19 또는 ROR1과 같은, 암 항원을 표적화하는 항원 결합 모이어티를 포함할 수 있다.
"종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"은 시험관 내에서 조작된(예를 들어, 인터류킨-2와 같은 사이토카인을 사용하여 자극된), 종양 조직으로부터 단리되고 이후에, TIL의 활성화가 종양 부위로 돌아가고 종양 재발을 유도하도록 환자에게 다시 주입되는 림프구를 지칭한다.
"종양 미세환경 저해제"는 종양 성장을 증진시키는 하나 이상의 조건 또는 세포 타입을 저해하고 종양을 둘러싸는 국소 환경에 존재하는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, 베바시주맙은 종양 미세환경에서 혈관신생을 감소시킴으로써 종양 미세환경을 저해할 수 있다.
본 설명에서, 용어 "약"은 달리 명시하지 않는 한, 명시된 범위, 값, 또는 구조의 ±20%를 의미한다. 용어 "...로 본질적으로 이루어진"은 청구범위를 특정 물질 또는 단계, 및 청구된 발명의 기본 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 본 명세서에서 사용되는 단수 용어가 열거된 성분들 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하다(include)" 및 "갖는다"는 동의어로 사용되고, 이러한 용어 및 이의 변형은 비제한적인 것으로서 이해될 것이다. 용어 "포함하다(comprise)"는 청구항에서 언급되는 기술된 특징, 정수, 단계, 또는 성분의 존재를 의미하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분, 또는 이의 그룹의 존재 또는 첨가를 배제하지 않는다.
본 개시내용에서 사용되는 재조합 DNA, 분자 클로닝 및 유전자 발현 기술은 당업계에 공지되어 있고, 참고문헌, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001, 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD, 1999]에 기술되어 있다.
조작된 인터류킨-2 폴리펩타이드
상기에 주지된 바와 같이, 본 개시내용의 IL2 폴리펩타이드는 조작된 IL2 수용체 β(IL2Rβ) 결합 영역 2를 갖는 IL2Rβ 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 영역 2는 서열번호 1을 포함한다:
X1-X2-X3-D-X4-X5-X6-N-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13 (서열번호 1)
여기서, X1, X3, X6, X8, X12 및 X13은 각각 임의의 잔기를 포함하고,
X2, X4 및 X10은 하전되지 않은 잔기이고,
X5, X7, X9 및 X11은 각각 하전되지 않은, 비극성 잔기이다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 아미노산 서열: APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLX1X2X3DX4X5X6NX7X8X9X10X11X12X13LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(서열번호 22)를 가지며,
여기서, X1, X3, X6, X8, X12 및 X13은 각각 임의의 잔기를 포함하고,
X2, X4 및 X10은 하전되지 않은 잔기이고,
X5, X7, X9 및 X11은 각각 하전되지 않은, 비극성 잔기이다.
특정 실시형태에서, X1은 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기이다. 일부 실시형태에서, X1은 C, T, G, W, I, S, E 및 K로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X1은 G, K, E, C 및 T로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X2는 하전되지 않은 극성 잔기 또는 하전되지 않은 비극성 잔기이다. 일부 실시형태에서, X2는 Y, P, V, W, L, A 및 G로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X2는 V, P, W 및 A로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X3은 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기이다. 일부 실시형태에서, X3은 S, T, Q, G, M, E, R 및 K로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X3은 T, G, S, R 및 E로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X4는 L이 아니다. 일부 실시형태에서, X4는 하전되지 않은 비극성 잔기 또는 하전되지 않은 극성 잔기이다. 일부 실시형태에서, X4는 A, V, S 및 T로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X5는 I, L, T 및 V로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X5는 I 및 V로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X6은 하전되지 않은 극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기이다. 일부 실시형태에서, X6은 S, T, E, D 및 R로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X6은 S, D, E 및 T로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X7은 I, A, M 및 V로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X7은 I, A 및 M으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X8은 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기이다. 일부 실시형태에서, X8은 S, T, N, Q, I, G, E, K 및 R로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X8은 I, R, N 및 T로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X9는 V, L 및 I로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X9는 V이다. 특정 실시형태에서, X10은 하전되지 않은 극성 잔기 또는 하전되지 않은 비극성 잔기이다. 일부 실시형태에서, X10은 N, T, I 및 L로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X10은 I 및 L로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X11은 V, A 및 I로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X12는 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 또는 산성 잔기이다. 일부 실시형태에서, X12는 Q, L, G, K 및 R로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X12는 R, G, Q 및 K로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, X13은 하전되지 않은 비극성 잔기 또는 염기성 잔기이다. 일부 실시형태에서, X13은 A, D 및 E로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, X13은 E 및 A로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IL2Rβ 결합 영역 2는 GVTDSISNAIVLARE(서열번호 2); KWGDAVSNARVLAGE(서열번호 3); KWGDAVSNARVLAGA(서열번호 4); TLMDTTDNIGVLVRE(서열번호 5); EPSDVISNINVLVQE(서열번호 6); SPQDSIENISVLVRE(서열번호 7); WASDSIENITLLIQE(서열번호 8); CPTDTIENITVLIQE(서열번호 9); RYKDSLENMQIIIQE(서열번호 10); TARDAVDNMRVIIQE(서열번호 11); TPRDVVENMNVLVLE(서열번호 12); TPSDVIENMEVLILD(서열번호 13); TPSDAIENINVLIRE(서열번호 14); TPSDVIENITVLVQE(서열번호 15); GVGDTIDNINVLVKE(서열번호 16); IGRDSIDNIKVIVQE(서열번호 17); WATDTIRNVEVLVQE(서열번호 18); TAEDVVTNITVLVQE(서열번호 19); TAEDVISNIRVNVQE(서열번호 20); TPSDVIDNVSITVQE(서열번호 21); TARDAISNIRVIVQE(서열번호 210); RARDAIDNIRVIVQE(서열번호 211); TPRDAIDNINVIIQE(서열번호 212); TPRDAIDNIRVIVQE(서열번호 213); TPRDAIDNIRVIILE(서열번호 214); TARDAISNINVIIQE(서열번호 215); 및 TARDAIDNINVIVQE(서열번호 216); 및 TARDAIDNIRVIVLE(서열번호 217)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2는 TPRDAIDNIRVIVQE(서열번호 213); TPRDAIDNIRVIILE(서열번호 214); TARDAISNINVIIQE(서열번호 215); 및 TARDAIDNINVIVQE(서열번호 216)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2는 GVTDSISNAIVLARE(서열번호 2); KWGDAVSNARVLAGA(서열번호 4); EPSDVISNINVLVQE(서열번호 6); CPTDTIENITVLIQE(서열번호 9); TARDAVDNMRVIIQE(서열번호 11); GVGDTIDNINVLVKE(서열번호 16); TAEDVVTNITVLVQE(서열번호 19)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2는 GVTDSISNAIVLARE(서열번호 2); CPTDTIENITVLIQE(서열번호 9); 및 TARDAVDNMRVIIQE(서열번호 11)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 서열번호 23 내지 42 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 IL2Rβ 효능제는 서열번호 65에 비해, R81, P82, R83, L85, I86, S87, I89, N90, I92, V93 및 L94로부터 선택된 적어도 하나의 잔기에 대한 치환을 포함하는 조작된 IL2 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 치환은 잔기 L85에 대한 치환이다. 특정 실시형태에서, IL2 폴리펩타이드는 R81, P82, R83, L85, I86, S87, I89, N90, I92, V93 및 L94로부터 선택된 적어도 2개의 잔기에 대한 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 잔기는 R81, R83, L85, I92 및 L94로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, IL2 폴리펩타이드는 R81, R83, L85, I92 및 L94로부터 선택된 적어도 3개의 잔기에 대한 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 R81, R83, L85, I92 및 L94에 대한 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, R81 치환은 R81G, R81K, R81E, R81C 및 R81T로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, R83 치환은 R83T, R83G, R83S 및 R83E로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, L85 치환은 L85S, L85A, L85V 및 L85T로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, I92 치환은 I92L이다. 일부 실시형태에서, L94 치환은 L94R, L94G, L94Q 및 L94K로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, R81, P82, R83, L85, I86, S87, I89, N90, I92, V93 및 L94로부터 선택된 적어도 하나의 잔기에 대한 치환을 포함하는 조작된 IL2 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 24 중 어느 하나의 IL2Rβ 결합 영역 2를 갖는다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rβ에 대한 증가된 친화력을 갖는다. 특정 실시형태에서, IL2Rβ에 대한 조작된 IL2 폴리펩타이드의 결합은 IL2Rβ에 대한 야생형 IL2의 결합에 비해 적어도 10배 초과, 적어도 15배 초과, 적어도 20배 초과, 적어도 25배 초과, 또는 적어도 30배 초과하는 KD를 갖는다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 적어도 30배 초과의 KD로 IL2Rβ에 결합한다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rβ에 대한 친화력의 적어도 10배 증가, 적어도 15배 증가, 적어도 20배 증가, 적어도 25배 증가, 또는 적어도 30배 증가를 갖는다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rα에 대한 친화력의 감소를 갖는다. 특정 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rα에 대한 친화력의 적어도 5% 감소, 적어도 10% 감소, 적어도 15% 감소, 또는 적어도 20% 감소를 갖는다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rα에 대한 유사한 친화력을 갖는다. 특정 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 IL2Rα에 대한 야생형 IL2의 친화력으로부터 ±20% 이하, ±15% 이하, ±10% 이하, 또는 ±5% 이하만큼 다양한 IL2Rα에 대한 친화력을 갖는다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 조작된 IL2 수용체 α(IL2Rα) 결합 영역 1을 포함하는 조작된 IL2 폴리펩타이드를 제공한다. 조작된 IL2Rα 결합 영역 1은 위치 K35에서의 치환, R38에서의 치환, F42에서의 치환, Y45에서의 치환, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 적어도 2배 감소된 결합 동역학으로 IL2Rα에 결합한다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 위치 K35에서의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 위치 K35에서의 치환은 비-염기성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 K35에서의 치환은 하전되지 않은 잔기 또는 산성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 K35에서의 치환은 K35G, K35L, K35S, K35V, K35D, K35E 및 K35C로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 위치 R38에서의 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 R38에서의 치환은 비-염기성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 R38에서의 치환은 하전되지 않은 잔기 또는 산성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 R38에서의 치환은 R38V, R38D, R38E, R38S, R38I, R38A, R38Y, R38G, R38C 및 R38N으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 위치 F42에서의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 위치 F42에서의 치환은 하전되지 않은 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 F42에서의 치환은 염기성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 F42에서의 치환은 F42A, F42R, F42G, F42I, F42L, F42P 및 F42H로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 위치 Y45에서의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 위치 Y45에서의 치환은 하전되지 않은 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위치 Y45에서의 치환은 하전되지 않은 극성 잔기 또는 하전되지 않은 비극성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, Y45 치환은 Y45S, Y45P, Y45A, Y45V, Y45C, Y45T 및 Y45F이다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 위치 K35에서의 치환 및 위치 R38에서의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 K35G 치환 및 R38E 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 위치 K35에서의 치환 및 위치 F42에서의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 K35S 치환 및 F42G 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 위치 K35에서의 치환, 위치 R38에서의 치환, 및 위치 F42에서의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 K35L 치환, R38D 치환 및 F42R 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 위치 R38에서의 치환 및 위치 Y45S에서의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 R38D 치환 및 Y45S 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 R38V 치환 및 Y45S 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 적어도 10배 감소된 결합 동역학으로 IL2Rα에 결합한다.
일부 실시형태에서, IL2Rα 결합 영역 1은 PVLTRMLTIKFY(서열번호 183); PKLTRMLTLKFP(서열번호 184); PDLTSMLAFKFY(서열번호 185); PGLTEMLTFKFY(서열번호 186); PSLTRMLTGKFY(서열번호 187); PELTIMLTPKFY(서열번호 188); PCLTAMLTLKFA(서열번호 189); PCLTAMLTLKFA(서열번호 190); PKLTRMLTHKFV(서열번호 191); PCLTDMLTFKFY(서열번호 192); PLLTDMLTRKFY(서열번호 193); PLLTDMLTFKFY(서열번호 194); PKLTDMLTFKFS(서열번호 195); PKLTYMLTRKFY(서열번호 196); PKLTRMLTFKFC(서열번호 197); PKLTSMLTFKFS(서열번호 198); PKLTSMLTFKFS(서열번호 199); PKLTYMLTFKFS(서열번호 200); PKLTYMLTFKFS(서열번호 201); PKLTGMLTFKFS(서열번호 202); PKLTVMLTFKFT(서열번호 203); PKLTVMLTFKFS(서열번호 204); PKLTVMLTFKFP(서열번호 205); PKLTVMLTFKFF (서열번호 206); PKLTCMLTFKFA(서열번호 207); PKLTNMLTFKFA(서열번호 208); 및 PKLTNMLTFKFS(서열번호 209)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 서열번호 22의 IL2Rβ 결합 영역 2의 외측 잔기(즉, 잔기 1 내지 80 및 96 내지 133)와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 서열 동일성을 공유하고, IL2Rβ에 결합한다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 서열번호 223의 IL2Rα 결합 영역 1 외측 잔기(즉, 잔기 1 내지 33 및 46 내지 133)와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 서열 동일성을 공유하고, IL2Rα에 대한 감소된 결합을 가지고, IL2Rβ에 결합한다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 서열번호 22 또는 서열번호 223의 IL2Rα 결합 영역 1 및 IL2Rβ 결합 영역 2의 외측 잔기(즉, 잔기 1 내지 33, 46 내지 80, 96 내지 133)와 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 서열 동일성을 공유하고, IL2Rα에 대한 감소된 결합을 가지고, IL2Rβ에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 전술된 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2 및 전술된 조작된 IL2Rα 결합 영역 1을 포함하는 조작된 IL2 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 PVLTRMLTIKFY(서열번호 183); PKLTRMLTLKFP(서열번호 184); PDLTSMLAFKFY(서열번호 185); PGLTEMLTFKFY(서열번호 186); PSLTRMLTGKFY(서열번호 187); PELTIMLTPKFY(서열번호 188); PCLTAMLTLKFA(서열번호 189); PCLTAMLTLKFA(서열번호 190); PKLTRMLTHKFV(서열번호 191); PCLTDMLTFKFY(서열번호 192); PLLTDMLTRKFY(서열번호 193); PLLTDMLTFKFY(서열번호 194); PKLTDMLTFKFS(서열번호 195); PKLTYMLTRKFY(서열번호 196); PKLTRMLTFKFC(서열번호 197); PKLTSMLTFKFS(서열번호 198); PKLTSMLTFKFS(서열번호 199); PKLTYMLTFKFS(서열번호 200); PKLTYMLTFKFS(서열번호 201); PKLTGMLTFKFS(서열번호 202); PKLTVMLTFKFT(서열번호 203); PKLTVMLTFKFS(서열번호 204); PKLTVMLTFKFP(서열번호 205); PKLTVMLTFKFF (서열번호 206); PKLTCMLTFKFA(서열번호 207); PKLTNMLTFKFA(서열번호 208); 및 PKLTNMLTFKFS(서열번호 209)로부터 선택된 조작된 IL2Rα 결합 영역 1을 포함하고, GVTDSISNAIVLARE(서열번호 2); KWGDAVSNARVLAGE(서열번호 3); KWGDAVSNARVLAGA(서열번호 4); TLMDTTDNIGVLVRE(서열번호 5); EPSDVISNINVLVQE(서열번호 6); SPQDSIENISVLVRE(서열번호 7); WASDSIENITLLIQE(서열번호 8); CPTDTIENITVLIQE(서열번호 9); RYKDSLENMQIIIQE(서열번호 10); TARDAVDNMRVIIQE(서열번호 11); TPRDVVENMNVLVLE(서열번호 12); TPSDVIENMEVLILD(서열번호 13); TPSDAIENINVLIRE(서열번호 14); TPSDVIENITVLVQE(서열번호 15); GVGDTIDNINVLVKE(서열번호 16); IGRDSIDNIKVIVQE(서열번호 17); WATDTIRNVEVLVQE(서열번호 18); TAEDVVTNITVLVQE(서열번호 19); TAEDVISNIRVNVQE(서열번호 20); TPSDVIDNVSITVQE(서열번호 21); TARDAISNIRVIVQE(서열번호 210); RARDAIDNIRVIVQE(서열번호 211); TPRDAIDNINVIIQE(서열번호 212); TPRDAIDNIRVIVQE(서열번호 213); TPRDAIDNIRVIILE(서열번호 214); TARDAISNINVIIQE(서열번호 215); 및 TARDAIDNINVIVQE(서열번호 216); 및 TARDAIDNIRVIVLE(서열번호 217)로부터 선택된 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2를 포함한다.
특정 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 GVTDSISNAIVLARE(서열번호 2); TARDAVDNMRVIIQE(서열번호 11); TPRDAIDNIRVIVQE(서열번호 213); TPRDAIDNIRVIILE(서열번호 214); TARDAISNINVIIQE(서열번호 215); 및 TARDAIDNINVIVQE(서열번호 216)로부터 선택된 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2; 및 전술된 조작된 IL2Rα 결합 영역 1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드는 C-말단 히스티딘 태그가 선택적으로 포함된(또는 제외된), 서열번호 147 내지 170 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, C-말단 히스티딘 태그는 다른 링커, 예를 들어, gly-ser 링커로 대체된다.
조작된 IL2 융합 폴리펩타이드
본 개시내용의 일부 실시형태는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 본 명세서에 전술된 바와 같은 조작된 IL2 폴리펩타이드, 및 펩타이드 결합 또는 다른 화학적 연결을 통해 조작된 IL2 폴리펩타이드에 공유 결합된 적어도 하나의 추가 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드의 적어도 하나의 추가 분자는 반감기 연장 분자이다. 일부 실시형태에서, 반감기 연장 분자는 반감기 연장 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 반감기 연장 폴리펩타이드는 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민(HSA), HSA 결합 분자, 또는 트랜스페린을 포함한다.
특정 실시형태에서, IL2 융합 폴리펩타이드는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG 항체로부터 유도된다. 인간 IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 여러 서브클래스를 갖는다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG1 항체 또는 IgG4 항체로부터 유도된다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 치환을 갖는다. Fc 이펙터 기능을 감소시키는 치환의 예는 L34A, L235A 및 P329G를 포함한다. "LALAPG"는 L34A, L235A 및 P329G 각각을 포함하는 변형된 Fc 도메인을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 혈청 반감기를 증가시키기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기 변형을 포함한다. Fc 도메인에 대한 대표적인 변형은 미국 특허 제7,317,091호; 미국 특허 제8,735,545호; 미국 특허 제7,371,826호; 미국 특허 제7,670,600호; 및 US 9,803,023호에 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 서열번호 64이다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2-Fc 융합 폴리펩타이드는 서열번호 39 내지 49로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드의 적어도 하나의 추가 분자는 항원 결합 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 면역글로불린, Fab 분자, scFv, 이중특이 T-세포 결합체, 이중체, 단일 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함한다. 항원 결합 모이어티는 예를 들어, 암배 항원(CEA), GD2, 또는 CD20과 결합할 수 있다. CEA 항원 모이어티의 예는 CH1A1A-2F이다. GD-2 항원 결합 모이어티의 예는 디누툭시맙이고, CD20 항원 결합 모이어티의 예는 리툭시맙이다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드의 적어도 하나의 추가 분자는 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 인터류킨-2, 인터류킨-15, 인터류킨-7, 인터류킨-10, 및 C-C 모티프 케모카인 리간드 19(CCL19)으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드의 추가 분자는 본 명세서에 기술된 제2 조작된 IL2 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, 반감기 연장 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 1가 융합 폴리펩타이드이다. 1가 융합 폴리펩타이드는 조작된 IL2 폴리펩타이드의 하나의 카피를 갖는 융합 폴리펩타이드를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 1가 융합 폴리펩타이드는 Fc 영역과 같은, 융합 파트너에 연결된 조작된 IL2 폴리펩타이드를 포함한다. 다양한 링커는 당업계에 공지되어 있고, Fc 영역과 같은 융합 파트너에 본 명세서에 기술된 조작된 IL2를 공유 결합하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "링커", "링커 서열"은 2개의 분자를 연결시키고 종종 바람직한 구성으로 2개의 분자를 배치시키는 역할을 하는 분자 또는 분자의 그룹(예를 들어, 모노머 또는 폴리머)을 의미한다. 링커는 신축성을 제공하는 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 이에 따라, 링커 펩타이드는 주로 하기 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Gly, Ser, Ala 또는 Thr. 링커 펩타이드는 이러한 것이 원하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 정확한 형태를 가정하는 방식으로 2개의 분자를 연결하기에 적절한 길이를 갖는다. 이러한 목적을 위한 적합한 길이는 적어도 하나 및 30개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게는, 링커는 길이가 약 1 내지 30개의 아미노산이고, 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19 및 20개의 아미노산인 링커가 바람직하다. 유용한 링커는 글리신-세린 폴리머(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n(서열번호 218), (GGGGS)n(서열번호 219) 및 (GGGS)n(서열번호 220)를 포함함, 여기서, n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 다른 신축성 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 2가 융합 폴리펩타이드이다. 2가 융합 단백질은 조작된 IL2 폴리펩타이드의 2개의 카피를 포함하는 분자 복합체를 지칭할 수 있으며, 이는 동일한 서열 또는 상이한 서열을 가질 수 있다. 분자 복합체는 비공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 2가 융합 단백질은 예를 들어, 하나 이상의 다이설파이드 브릿지에 의해, 또는 노브-인투-홀 화학에 의해 비-공유로 함께 결합된 2개의 Fc 영역을 포함할 수 있다.
조작된 IL2 폴리펩타이드를 제조하는 방법
조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 당업계에 널리 공지된 유전적 또는 화학적 방법에 의해 및 하기 실시예에 개시되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열의 부위-특이 돌연변이발생, PCR, 및 유전자 합성을 포함할 수 있다. 의도된 뉴클레오타이드 변화는 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다. 천연 IL2의 뉴클레오타이드 서열은 문헌[Taniguchi et al. (Nature 302, 305-10 (1983))]에 기술되어 있으며, 천연 인간 IL2를 인코딩하는 핵산은 예를 들어, 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection)(Rockville Md.)로부터 입수 가능하다.
조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 재조합 생산 또는 고체-상태 펩타이드 합성에 의해 얻어질 수 있다. 재조합 생산을 위해, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 클로닝 및/또는 발현을 위한 하나 이상의 벡터에 단리 및 삽입될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 기존 절차에 의해 용이하게 단리 및 시퀀싱될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 예를 들어, 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 널리 공지된 방법은 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 코딩 서열 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 함유한 발현 벡터를 작제화하기 위해 사용된다. 이러한 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체 내 재조합/유전적 재조합을 포함한다(예를 들어, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (FOURTH EDITION), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2012); 및 Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1993)]에 기술된 기술)을 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 일부일 수 있고, 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드(즉, 코딩 영역)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동 가능한 연합으로 클로닝되는 발현 카세트를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "코딩 영역"은 아미노산에 번역된 코돈으로 이루어진 핵산의 부분이다. "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)이 아미노산으로 번역되지 않지만, 이는 존재하는 경우, 코딩 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있지만, 임의의 측면 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 사이트, 전사 종결인자, 인트론, 5' 및 3' 비번역 영역 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 둘 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물에, 예를 들어, 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 작제물에, 예를 들어, 별개의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수 있거나, 둘 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 본 명세서의 개시된 것의 벡터는 하나 이상의 폴리단백질을 인코딩할 수 있으며, 이는 단백질용해 절단을 통해 최종 단백질로 번역후 또는 번역과 동시에 분리된다. 또한, 본 개시내용의 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 또는 핵산은 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩하는 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드에 융합 또는 비융합되는, 이종 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종 코딩 영역은 비제한적으로, 특수 요소 또는 모티프, 예를 들어, 분비 신호 펩타이드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동 가능한 결합은 유전자 산물, 예를 들어, 폴리펩타이드에 대한 코딩 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 조절 하에서 유전자 산물의 발현을 배치하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연관된다. 2개의 DNA 단편(예를 들어, 폴리펩타이드 코딩 영역, 및 이와 연관된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 초래하는 경우, 및 2개의 DNA 단편 간의 연결의 특성이 유전자 산물의 발현을 유도하거나 DNA 주형이 전사되는 능력을 간섭하는 발현 조절 서열의 능력을 간섭하지 않는 경우 "작동 가능하게 연관"된다. 이에 따라, 프로모터 영역은, 프로모터가 그러한 핵산의 전사를 달성할 수 있는 경우, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연결될 것이다. 프로모터는 사전결정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 유도하는 세포-특이 프로모터일 수 있다. 프로모터, 예를 들어, 인헨서, 오퍼레이터, 억제 인자 및 전사 종결 신호 이외에, 다른 전사 조절 요소는 세포-특이 전사를 유도하기 위해 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역은 본 명세서에 개시된다. 다양한 전사 조절 영역은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 것은 비제한적으로, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예를 들어, 비제한적으로, 시토메갈로바이러스로부터의 프로모터 및 인헨서(예를 들어, 전초기 프로모터, 인트론-A와 함께), 유인원 바이러스 40(예를 들어, 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들어, 로우스 육종 바이러스)를 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자, 예를 들어, 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈으로부터 유래된 것뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이 프로모터 및 인헨서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들어, 프로모터 유도 가능 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게는, 다양한 번역 조절 요소는 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 것은 리보솜 결합 사이트, 번역 개시 및 종료 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히 내부 리보솜 진입 사이트, 또는 IRES, CITE 서열로도 지칭됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 발현 카세트는 또한, 다른 특징, 예를 들어, 복제 기점, 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어, 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 반전 말단 반복부(ITR)를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 코딩 영역은 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드의 분비를 유도하는, 분비 또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 추가 코딩 영역과 관련이 있다. 예를 들어, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 분비가 요망되는 경우에, 신호 서열을 인코딩하는 DNA는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 성숙한 아미노산을 인코딩하는 핵산의 업스트림에 배치될 수 있다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드가 일반적으로, 분비된 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 번역된 폴리펩타이드로부터 절단된, 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드를 갖는다. 예를 들어, 천연 인간 IL2는 폴리펩타이드의 N-말단에서 20개의 아미노산 신호 서열로 번역되고, 후속하여, 성숙한 133개의 아미노산 인간 IL2를 생산하기 위해 절단된다. 일부 실시형태에서, 천연 신호 펩타이드, 예를 들어, IL2 신호 펩타이드 또는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드, 또는, 이와 작동 가능하게 관련된 폴리펩타이드의 분비를 유도하는 능력을 보유한 그러한 서열의 기능적 유도체가 사용된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 정제를 용이하게 하기 위해(예를 들어, 히스티딘 태그), 또는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 내에 또는 단부에 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 라벨링하기 위해 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 숙주 세포는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 생성하기 위해 사용될 수 있는 임의의 부류의 세포 시스템일 수 있다. 이러한 세포는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합을 인코딩하는 특정 발현 벡터와 적절한 경우에 트랜스펙션되거나 형질도입될 수 있으며, 세포를 함유한 대량의 벡터는 충분한 양의 임상 적용을 위한 인코딩하는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합을 얻기 위해 대규모 발효기를 시딩하기 위해 성장될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예를 들어, 이.콜라이, 또는 다양한 진핵 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 특히, 글리코실화가 필요하지 않을 때 박테리아에서 생산될 수 있다. 발현 후, 폴리펩타이드는 가용성 분획에서 박테리아 세포로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다. 원핵 생물 이외에, 진핵 미생물, 예를 들어, 사상성 진균 또는 효모는 글리코실화 경로가 "인간화"되어 일부 또는 전부 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 폴리펩타이드-인코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. (글리코실화된) 폴리펩타이드의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바쿨로바이러스 균주가 식별되었다. 식물 세포 배양물은 또한, 숙주로서 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호(유전자 도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기술함) 참조). 척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장하도록 구성된 포유류 세포주는 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 변형된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기술된 293 또는 293T 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기술된 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기술됨), MRC 5 세포, 및 FS4 세포를 포함한다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예를 들어, YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0을 포함한다. 단백질 생산을 위해 적합한 특정의 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)]이 참조된다. 숙주 세포는 몇 가지만 언급하면, 배양된 세포, 예를 들어, 포유류 배양 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포, 및 또한 유전자 도입 동물, 유전자 도입 식물 또는 배양 식물 또는 동물 조직을 포함한다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는, 포유류 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프계 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
표준 기술은 이러한 시스템에서 외래 유전자를 발현시키기 위해 당업계에 공지되어 있다. 항체와 같은 항원 결합 모이어티의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나에 융합된 조작된 IL2 폴리펩타이드를 발현시키는 세포는 발현된 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드가 중쇄 및 경쇄 둘 다를 갖는 항체를 포함하도록 항체 사슬 중 다른 하나를 또한 발현시키기 위해 조작될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 발현을 위해 적합한 조건 하에서, 본 명세서에 제공된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로, 숙주 세포(또는 예를 들어, 숙주 세포가 폴리펩타이드를 분비하는 경우, 숙주 세포 배양 배지)로부터 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 회수 및/또는 정제하는 것을 포함한다.
약제학적 조성물
본 명세서에는 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제(들), 부형제(들), 또는 담체(들)를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드 및 추가 치료제(예를 들어, 병용 요법)를 포함한다. 이러한 치료제의 비제한적인 예는 본 명세서의 하기에 기술되어 있다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제제에 조작된 IL2 또는 IL2 융합 폴리펩타이드의 처리를 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다. 임의의 약제학적으로 허용 가능한 기술, 담체 및 부형제는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물을 제형화하는 데 적합한 것으로서 사용된다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)). IL-2 조성물의 예는 미국 특허 제4,604,377호 및 제4,766,106호에 기술되고, 이러한 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 담체" 및 "생리학적으로 허용되는 담체"는 상호 교환가능하게 사용되고, 당업자에게 공지된 바와 같은, 임의의 및 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항박테리아제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 항산화제, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 폴리머, 젤, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 착향제, 염료, 이러한 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함하고, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 비독성인, 즉, 적절한 경우, 예를 들어, 인간과 같은 동물에 투여될 때 부작용, 알레르기 반응 또는 다른 원치 않는 반응을 형성시키지 않는 분자체 및 조성물이다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조, 이러한 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립할 수 없는 것을 제외하고, 치료적 또는 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
약제학적 조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는 지의 여부 및 주사로서의 이러한 투여 경로를 위해 멸균되어야 하는 지의 여부에 따라 상이한 타입의 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드(및 임의의 추가 치료제)는 정맥내, 피부내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 흉막내, 기관내, 비강내, 유리체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 복강내, 결막하, 방광내, 점막, 심낭내, 배꼽내, 안구내, 경구로, 국소로, 국부적으로, 흡입(예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 직접적으로 국소화된 관류 배싱 표적 세포에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크림에서, 지질 조성물(예를 들어, 리소폼)에, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법 또는 전술된 것의 임의의 조합으로 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990], 이러한 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 비경구 투여, 특히, 정맥내 주사는 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드와 같은 폴리펩타이드 분자를 투여하기 위해 가장 일반적으로 사용된다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들어, 피하, 피부내, 병소내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척수강내 또는 복강내 주사에 의해 투여하도록 설계된 것을 포함한다. 주사를 위해, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 수용액, 바람직하게는, 생리학적으로 혼화가능한 완충액, 예를 들어, 한크액, 링거액, 또는 생리 식염수 완충액에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화 제제, 예를 들어, 현탁화, 안정화 및/또는 분산 제제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 무발열원수로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 멸균 주사가능 용액은 필요한 양의 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 필요한 경우, 하기에 열거된 다양한 다른 구성성분을 갖는 적절한 용매에 도입함으로써 제조된다. 멸균성은 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및/또는 다른 구성성분을 함유한 멸균 비히클에 다양한 멸균화된 활성 성분을 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액, 현탁액 또는 에멀션의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 이의 사전에 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 원하는 구성성분의 분말을 생성하는 진공-건조 또는 냉동-건조 기술을 포함한다. 액체 매질은 필요한 경우 적합하게 완충되어야 하고, 충분한 염수 또는 글루코스와 함께 주사하기 전에 액체 희석제가 먼저 등장성을 나타낸다. 약제학적 조성물은 바람직하게, 제조 및 저장 조건 하에서 안정하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존된다. 내독소 오염은 최소한 안전한 수준, 예를 들어, 0.5 ng/㎎ 단백질 미만으로 유지되어야 한다는 것이 인식될 것이다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 M-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 현탁액은 또한, 고도로 농축된 용액을 제조하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어, 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 클리트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다.
일부 실시형태에서, 수성 현탁액은 현탁화제로서 1종 이상의 폴리머를 함유한다. 폴리머의 예는 수용성 폴리머, 예를 들어, 셀룰로스 폴리머, 예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 및 수불용성 폴리머, 예를 들어, 가교된 카복실-함유 폴리머를 포함한다. 본 명세서에 기술된 특정의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 카복시메틸셀룰로스, 카보머(아크릴산 폴리머), 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리아크릴아미드, 폴리카보필, 아크릴 산/부틸 아크릴레이트 코폴리머, 나트륨 알기네이트 및 덱스트란으로부터 선택된, 점막부착성 폴리머를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 용해도를 돕는 가용화제를 포함한다. 용어 "가용화제"는 일반적으로, 작용제의 마이셀 용액 또는 진정한 용액의 형성을 초래하는 작용제를 포함한다. 특정의 허용되는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80은 가용화제로서 유용하다. 예는 글리콜, 폴리글리콜, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 400, 및 글리콜 에테르를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 산, 예를 들어, 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산; 염기, 예를 들어, 나트륨 하이드록사이드, 나트륨 포스페이트, 나트륨 보레이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 및 트리스-하이드록시메틸아미노메탄을 포함하는 1종 이상의 pH 조절제 또는 완충제; 및 완충제, 예를 들어, 시트레이트/덱스트로스, 나트륨 바이카보네이트 및 암모늄 클로라이드를 포함한다. 이러한 산, 염기 및 완충제는 조성물의 pH를 허용되는 범위에서 유지하기 위해 필요한 양으로 포함된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 조성물의 삼투압 농도를 허용되는 범위로 만들기 위해 필요한 양의 1종 이상의 염을 포함한다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 바이카보네이트, 설페이트, 티오설페이트 또는 바이설파이트 음이온을 갖는 염을 포함하고; 적합한 염은 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 티오설페이트, 나트륨 바이설파이트 및 암모늄 설페이트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 미생물 활성을 저해하기 위해 1종 이상의 보존제를 포함한다. 적합한 보존제는 수은-함유 물질, 예를 들어, 메르펜 및 티오메르살; 안정화된 이산화염소; 및 4차 암모늄 화합물, 예를 들어, 벤즈알코늄 클로라이드, 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드 및 세틸피리디늄 클로라이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 물리적 안정성을 향상시키거나 다른 목적을 위해 1종 이상의 계면활성제를 포함한다. 적합한 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세라이드 및 식물성 오일, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (60) 수소화된 캐스터 오일; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들어, 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40을 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 필요한 경우 화학적 안정성을 향상시키기 위해 1종 이상의 항산화제를 포함한다. 적합한 항산화제는 단지 일 예로서, 아스코르브산 및 나트륨 메타바이설파이트를 포함한다.
특정 실시형태에서, 수성 현탁액 조성물은 단일-용량 비-재밀폐 가능 용기에 패키징된다. 대안적으로, 다용량 재밀폐 가능 용기가 사용되고, 이러한 경우에, 조성물에 보존제를 포함하는 것이 통상적이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 치료제를 함유한 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스와 같은 지속 방출 시스템을 사용하여 전달된다. 다양한 지속 방출 물질이 본 명세서에서 유용하다. 일부 실시형태에서, 지속 방출 캡슐은 수 주 내지 최대 100일 이상 동안 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 방출한다. 치료 시약의 화학적 특성 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가 전략이 사용된다. 서방출 제제의 예는 폴리펩타이드를 함유한 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태를 갖는다. 일부 실시형태에서, 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합과 같은 흡수를 지연시키는 제제의 조성물에 사용함으로써 야기될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀션에서 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 또한, 데폿 제제로서 제형화될 수 있다. 이러한 장기 작용 제형은 이식(예를 들어, 피하로 또는 근육내로) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 이에 따라, 예를 들어, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 적합한 폴리머 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일 중 에멀션으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 에멀션화, 캡슐화, 포획화 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제제에 단백질의 처리를 용이하게 하는 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 다르다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 유리산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물에 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 유리산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 염이다. 이러한 것은 산부가염, 예를 들어, 단백질 함유 조성물의 유리 아미노 기와 함께 형성되거나, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산과 함께 형성되는 것을 포함한다. 유리 카복실기와 함께 형성된 염은 또한, 무기 염기, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 하이드록사이드; 또는 유기 염기, 예를 들어, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유도될 수 있다. 약제학적 염은 해당하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자 용매에서 더욱 가용성인 경향이 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 경구 투여를 위해 제형화된다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 단지 일 예로서, 정제, 분말, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 엘릭시르, 슬러리, 좌제 등을 포함하는 경구 투약 형태로 제형화된다.
특정 실시형태에서, 경구 사용을 위한 약제학적 제제는 1종 이상의 고체 부형제를 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드 중 하나 이상과 혼합하고, 선택적으로, 얻어진 혼합물을 그라인딩하고, 필요한 경우 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 수득된다. 적합한 부형제는 특히, 충전제, 예를 들어, 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는 당; 셀룰로스 제제, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트래거캔스, 메틸셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스; 또는 기타, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈(PVP 또는 포비돈) 또는 칼슘 포스페이트이다. 특정 실시형태에서, 붕해제가 선택적으로 첨가된다. 붕해제는 단지 일 예로서, 가교된 크로스카르멜로스 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 이의 염, 예를 들어, 나트륨 알기네이트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 투약 형태, 예를 들어, 당의정 코어 및 정제에는 하나 이상의 적합한 코팅이 제공된다. 특정 실시형태에서, 농축된 당 용액은 투약 형태를 코팅하기 위해 사용된다. 당 용액은 선택적으로, 추가 성분, 예를 들어, 단지 일 예로서, 아라빅 검, 탤크, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 티탄 다이옥사이드, 라커 용액, 및 적합한 유기 또는 용매 혼합물을 함유한다. 염료 및/또는 안료는 또한, 식별 목적을 위해 코팅에 선택적으로 첨가된다. 추가적으로, 염료 및/또는 안료는 활성제 용량의 상이한 조합을 특징화하기 위해 선택적으로 사용된다.
특정 실시형태에서, 치료학적 유효량의 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 다른 경구 투약 형태로 제형화된다. 경구 투약 형태는 젤라틴으로 제조된 푸시 피트 캡슐뿐만 아니라 젤라틴 및 가소제, 예를 들어, 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질, 시일링된 캡슐을 포함한다. 특정 실시형태에서, 푸시 피트 캡슐은 1종 이상의 충전제와 혼합하여 활성 성분을 함유한다. 충전제는 락토스, 결합제, 예를 들어, 전분, 및/또는 윤활제, 예를 들어, 탤크 또는 마그네슘 스테아레이트 및 선택적으로, 안정화제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 연질 캡슐은 적합한 액체 중에 용해 또는 현탁된 1종 이상의 활성제를 함유한다. 적합한 액체는 하나 이상의 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제가 선택적으로 첨가된다.
일부 실시형태에서, 치료학적 유효량의 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 협측 또는 설하 투여를 위해 제형화된다. 협측 또는 설하 투여에 적합한 제형은 단지 일 예로서, 정제, 로젠지, 또는 젤을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 국소로 투여된다. 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 다양한 국소 투여 가능한 조성물, 예를 들어, 용액, 현탁액, 로션, 젤, 페이스트, 의료용 스틱, 밤, 크림 또는 연고로 제형화된다. 이러한 약제학적 조성물인 가용화제, 안정화제, 긴장 강화제, 완충제 및 보존제를 선택적으로 함유한다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 경피 투여를 위해 제형화된다. 특정 실시형태에서, 경피 제형은 경피 전달 디바이스 및 경피 전달 패치를 사용하고, 친지성 에멀션 또는 완충된 수용액일 수 있고/있거나, 폴리머 또는 접착제에 용해 및/또는 분산될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 이러한 패치는 약제학적 제제의 연속적, 박동성, 또는 주문형 전달을 위해 구성된다. 추가 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 경피 전달은 이온삼투 패치 등에 의해 달성된다. 특정 실시형태에서, 경피 패치는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 제어된 전달을 제공한다. 특정 실시형태에서, 흡수 속도는 속도-조절 막을 사용함으로써 또는 폴리머 매트릭스 또는 젤 내에 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 트랩핑함으로써 느려진다. 대안적인 실시형태에서, 흡수 향상제는 흡수를 증가시키기 위해 사용된다. 흡수 향상제 또는 담체는 피부 통과를 보조하는 흡수 가능한 약제학적으로 허용 가능한 용매를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 경피 디바이스는 배킹 부재, 선택적으로 담체를 함께 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 함유한 저장소, 선택적으로, 장기간에 걸쳐 제어되고 사전결정된 속도로 숙주의 피부로 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 전달하기 위한 속도 조절 배리어, 및 피부에 디바이스를 고정시키기 위한 수단을 포함하는 붕대 형태이다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 흡입에 의한 투여를 위해 제형화된다. 흡입에 의한 투여에 적합한 다양한 형태는 에어로졸, 미스트 또는 분말을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 약제학적 조성물은 통상적으로, 적합한 추진제(예를 들어, 다이클로로다이플루오로메탄, 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스)를 사용하는, 가압 팩 또는 네불라이져로부터의 에어로졸 스프레이 제제 형태로 전달될 수 있다. 특정 실시형태에서, 가압 에어로졸의 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정된다. 특정 실시형태에서, 단지 예로서, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴과 같은 캡슐 또는 카트리지는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드와 적합한 분말 베이스, 예를 들어, 락토스 또는 전분의 분말 믹스를 함유하게 제형화된다.
일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 직장 조성물, 예를 들어, 통상적인 좌제 베이스, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드뿐만 아니라, 합성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, PEG 등을 함유한, 관장제, 직장 젤, 직장 발포물, 직장 에어로졸, 좌제, 젤리 좌제, 또는 정체 관정제에 제형화된다. 조성물의 좌제 형태에서, 저용융 왁스, 예를 들어(그러나, 비제한적으로), 선택적으로 코코아 버터와 조합한 지방산 글리세라이드의 혼합물이 먼저 용융된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 제형은 1종 이상의 항산화제, 금속 킬레이트제, 티올 함유 화합물 및/또는 다른 일반 안정화제를 포함한다. 이러한 안정화제의 예는 (a) 약 0.5% 내지 약 2% w/v 글리세롤, (b) 약 0.1% 내지 약 1% w/v 메티오닌, (c) 약 0.1% 내지 약 2% w/v 모노티오글리세롤, (d) 약 1mM 내지 약 10mM EDTA, (e) 약 0.01% 내지 약 2% w/v 아스코르브산, (f) 0.003% 내지 약 0.02% w/v 폴리소르베이트 80, (g) 0.001% 내지 약 0.05% w/v 폴리소르베이트 20, (h) 아르기닌, (i) 헤파린, (j) 덱스트란 설페이트, (k) 사이클로덱스트린, (l) 펜토산 폴리설페이트 및 다른 헤파리노이드, (m) 2가 양이온, 예를 들어, 마그네슘 및 아연; 또는 (n) 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물에서 제공되는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 농도는 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%,14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물에서 제공되는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 농도는 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 초과이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물에서 제공되는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 농도는 대략 0.0001% 내지 대략 50%, 대략 0.001% 내지 대략 40%, 대략 0.01% 내지 대략 30%, 대략 0.02% 내지 대략 29%, 대략 0.03% 내지 대략 28%, 대략 0.04% 내지 대략 27%, 대략 0.05% 내지 대략 26%, 대략 0.06% 내지 대략 25%, 대략 0.07% 내지 대략 24%, 대략 0.08% 내지 대략 23%, 대략 0.09% 내지 대략 22%, 대략 0.1% 내지 대략 21%, 대략 0.2% 내지 대략 20%, 대략 0.3% 내지 대략 19%, 대략 0.4% 내지 대략 18%, 대략 0.5% 내지 대략 17%, 대략 0.6% 내지 대략 16%, 대략 0.7% 내지 대략 15%, 대략 0.8% 내지 대략 14%, 대략 0.9% 내지 대략 12%, 대략 1% 내지 대략 10% w/w, w/v 또는 v/v 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물에서 제공되는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 농도는 대략 0.001% 내지 대략 10%, 대략 0.01% 내지 대략 5%, 대략 0.02% 내지 대략 4.5%, 대략 0.03% 내지 대략 4%, 대략 0.04% 내지 대략 3.5%, 대략 0.05% 내지 대략 3%, 대략 0.06% 내지 대략 2.5%, 대략 0.07% 내지 대략 2%, 대략 0.08% 내지 대략 1.5%, 대략 0.09% 내지 대략 1%, 대략 0.1% 내지 대략 0.9% w/w, w/v 또는 v/v 범위이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물에 제공되는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 양은 10g, 9.5g, 9.0g, 8.5g, 8.0g, 7.5g, 7.0g, 6.5g, 6.0g, 5.5g, 5.0g, 4.5g, 4.0g, 3.5g, 3.0g, 2.5g, 2.0g, 1.5g, 1.0g, 0.95g, 0.9g, 0.85g, 0.8g, 0.75g, 0.7g, 0.65g, 0.6g, 0.55g, 0.5g, 0.45g, 0.4g, 0.35g, 0.3g, 0.25g, 0.2g, 0.15g, 0.1g, 0.09g, 0.08g, 0.07g, 0.06g, 0.05g, 0.04g, 0.03g, 0.02g, 0.01g, 0.009g, 0.008g, 0.007g, 0.006g, 0.005g, 0.004g, 0.003g, 0.002g, 0.001g, 0.0009g, 0.0008g, 0.0007g, 0.0006g, 0.0005g, 0.0004g, 0.0003g, 0.0002g 또는 0.0001g 이하이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물에 제공되는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 양은 0.0001g, 0.0002g, 0.0003g, 0.0004g, 0.0005g, 0.0006g, 0.0007g, 0.0008g, 0.0009g, 0.001g, 0.0015g, 0.002g, 0.0025g, 0.003g, 0.0035g, 0.004g, 0.0045g, 0.005g, 0.0055g, 0.006g, 0.0065g, 0.007g, 0.0075g, 0.008g, 0.0085g, 0.009g, 0.0095g, 0.01g, 0.015g, 0.02g, 0.025g, 0.03g, 0.035g, 0.04g, 0.045g, 0.05g, 0.055g, 0.06g, 0.065g, 0.07g, 0.075g, 0.08g, 0.085g, 0.09g, 0.095g, 0.1g, , 0.15g, 0.2g, 0.25g, 0.3g, 0.35g, 0.4g, 0.45g, 0.5g, 0.55g, 0.6g, 0.65g, 0.7g, 0.75g, 0.8g, 0.85g, 0.9g, 0.95g, 1g, 1.5g, 2g, 2.5, 3g, 3.5, 4g, 4.5g, 5g, 5.5g, 6g, 6.5g, 7g, 7.5g, 8g, 8.5g, 9g, 9.5g 또는 10g 초과이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물에 제공되는 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 양은 0.0001 내지 10g, 0.0005 내지 9g, 0.001 내지 8g, 0.005 내지 7g, 0.01 내지 6g, 0.05 내지 5g, 0.1 내지 4g, 0.5 내지 4g, 또는 1 내지 3g의 범위이다.
치료 및 사용 방법
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 본 개시내용은 면역 반응 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 대상체에 치료학적 유효량의 본 명세서에 전술된 조작된 IL2 폴리펩타이드, 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드, 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 면역 반응의 조절은 이펙터 T 세포 활성의 향상, NK 세포 활성의 향상, 및 조절 T 세포 활성의 억제 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 본 개시내용은 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법에서 사용하기 위한, 전술된 조작된 IL2 폴리펩타이드, 전술된 융합 폴리펩타이드, 및/또는 전술된 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응의 조절은 WT IL2와 비교하여 STAT5 포스포릴화를 증가시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체에 치료학적 유효량의 본 명세서에 전술된 조작된 IL2 폴리펩타이드, 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드, 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 제공된 본 개시내용은 질환에 대해 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 전술된 조작된 IL2 폴리펩타이드, 전술된 융합 폴리펩타이드, 및/또는 전술된 약제학적 조성물을 제공한다. 본 방법에서 고려되는 질환 또는 병태의 비제한적인 예는 증식성 장애, 예를 들어, 암, 및 면역억제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체에 치료학적 유효량의, 본 명세서에 전술된 조작된 IL2 폴리펩타이드, 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드, 또는 이의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 증식성 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 증식성 장애는 암이다. 암의 비제한적인 예는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 대장암, 직장암, 위암, 교모세포종, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포 암종, 피부암, 흑색종, 골암, 신세포 암종 및 신장암을 포함한다. 또한, 전암성 병태 또는 병변 및 암전이가 포함된다. 다른 세포 증식 장애는 복부, 뼈, 유방, 소화기 계통, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역 및 비노생식기 계통에 위치된 신생물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 유사하게는, 다른 세포 중식 장애, 예를 들어, 고감마글로불린혈증, 림프증식성 장애, 파라단백질혈증, 자반병, 사르코이드증, 세자리 증후군, 발덴스트론 마크로글로불린혈증, 고셔병, 조직구증, 및 상기에 나열된 기관계에 위치된 신생물 이외의 임의의 다른 세포 증식 질환이 또한 치료될 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 반응을 치료 또는 조절하는 방법은 대상체에 치료학적 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제(예를 들어, 병용 요법)를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 추가 치료제는 항암제이다. 항암제의 예는 관문 저해제(예를 들어, 항-PD1 항체), 화학치료제, 종양 미세환경을 저해하는 작용제, 암 백신(예를 들어, Sipuleucel-T), 종양 용해성 바이러스(예를 들어, 탈리모겐 라헤르파렙벡), 키메라 항원 수용체를 발현시키는 면역 세포, 및 종양 침윤 림프구를 포함한다. 특정 실시형태에서, 추가 치료제는 항원 결합 모이어티를 포함하는 분자이다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체, Fab 분자, scFv, 이중체, 나노바디, 이중특이 T 세포 결합체, 또는 면역글로불린으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어, 암배 항원, 섬유아세포 활성화 단백질-α, CD20) 또는 관문 단백질(예를 들어, CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1)에 대해 특이적이다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 키메라 항원 수용체를 발현시키는 면역 세포, 조작된 T 세포 수용체를 발현시키는 면역 세포, 또는 종양 침윤 림프구를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체를 발현시키는 면역 세포, 조작된 T 세포 수용체를 발현시키는 면역 세포, 또는 종양 침윤 림프구에 트랜스펙션, 트랜스벡션, 또는 달리 도입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 면역 세포는 장갑 키메라 항원 수용체-발현 세포일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 세포가 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 분비하기 위해, 조작된 IL2 폴리펩타이드 코딩 서열의 바로 업스트림에 분비 신호(예를 들어, 천연 IL2 신호 서열 또는 다른 단백질로부터 유도된 신호 서열)를 추가적으로 인코딩할 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 반응을 치료 또는 조절하는 방법은 대상체에 서열번호 1의 IL2Rβ 결합 영역 두 개를 갖는 조작된 IL2 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 반응을 치료 또는 조절하는 방법은 대상체에 서열번호 2 내지 21 중 어느 하나의 IL2Rβ 결합 영역 두 개를 갖는 조작된 IL2 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 대상체에 서열번호 23 내지 42 중 어느 하나, 서열번호 44 내지 63 중 어느 하나, 서열번호 147 내지 170 중 어느 하나(C-말단 히스티딘 태그가 선택적으로 포함됨)의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 또는 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 144 또는 서열번호 145의 Fc 융합 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 반응을 치료 또는 조절하는 방법은 대상체에 서열번호 22, 또는 서열번호 23 내지 42 중 어느 하나의 조작된 IL2 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 반응을 치료 또는 조절하는 방법은 대상체에 서열번호 51의 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 반응을 치료 또는 조절하는 방법은 대상체에 서열번호 43, 또는 서열번호 44 내지 63 중 어느 하나의 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.
적합한 투여 경로는 정맥내, 비경구, 경피, 경구, 직장, 에어로졸, 안구, 폐, 경점막, 질, 귀, 비강 및 국소 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한, 단지 일 예로서, 비경구 전달은 근육내, 피하, 정맥내, 골수내 주사뿐만 아니라 척수강내, 직접 뇌실내, 복강내, 림프내 및 비강내 주사를 포함한다.
특정 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 IL2 융합 폴리펩타이드는 전신 투여된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 전신 방식보다 국소로, 예를 들어, 장기, 조직, 또는 종양으로의 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 직접 주사를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 장기 작용 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 또한, 일부 실시형태에서, 약물은 표적화된 약물 전달 시스템으로, 예를 들어, 장기 특이적 또는 세포-특이적 항체로 코팅된 리포솜으로 전달된다. 이러한 실시형태에서, 리포솜은 장기에 표적화되고, 장기에 의해 선택적으로 흡수된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 속방출 제형의 형태, 연장 또는 지속 방출 제형의 형태, 중간 방출 제형의 형태, 또는 데폿 제제 형태로 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 국소로 투여된다.
(단독으로 또는 1종 이상의 다른 추가 치료제와 조합하여 사용되는) 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 적절한 투여량은 질환 또는 병태의 타입, 투여 경로, 대상체의 체중, 질환의 중증도 및 진행, 폴리펩타이드가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는 지의 여부, 이전 또는 동시 치료 개입, 대상체의 임상적 이력 및 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 투여를 담당하는 실무자는 치료받는 대상체에 대한 조성물에서 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 투약을 결정할 수 있을 것이다. 다양한 시점, 볼루스 투여, 및 펄스식 주입에 대한 단일 또는 다수 투여를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 투약 스케쥴은 본 명세서에 고려된다.
조작된 IL2 폴리펩타이드의 단일 투여는 약 50,000 IU/㎏ 내지 약 1,000,000 IU/㎏ 또는 그 이상의 조작된 IL2 폴리펩타이드의 범위일 수 있다. 이는 수일 동안(예를 들어, 3 내지 5일 연속) 하루에 여러 차례(예를 들어, 하루에 2 내지 4회) 반복될 수 있고, 이후에, 휴지 기간(예를 들어, 7 내지 14일) 후 1회 이상 반복할 수 있다. 이에 따라, 치료학적 유효량은 단지 단일 투여 또는 소정 기간에 걸쳐 다수 투여를 포함할 수 있다(예를 들어, 약 600,000 IU/㎏의 IL2의 약 10 내지 30 개별 투여, 각각은 5 내지 20일 기간에 걸쳐 제공됨). 융합 폴리펩타이드 형태로 투여될 때, 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 치료학적 유효량은 비-융합 조작된 IL2 폴리펩타이드(예를 들어, 10,000 IU/㎏ 내지 약 600,000 IU/㎏)보다 낮을 수 있다. 유사하게는, 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 한번 또는 상술된 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 일일 투여량은 약 1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위이다. 병태에 따라, 며칠 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 발생(예를 들어, 종양 축소)할 때까지 지속될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 단일 용량은 약 0.005 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위이다. 일부 실시형태에서, 용량은 투여당 약 1 ㎍/㎏/체중, 약 5 ㎍/㎏/체중, 약 10 ㎍/㎏/체중, 약 50 ㎍/㎏/체중, 약 100 ㎍/㎏/체중, 약 200 ㎍/㎏/체중, 약 350 ㎍/㎏/체중, 약 500 ㎍/㎏/체중, 약 1 ㎎/㎏/체중, 약 5 ㎎/㎏/체중, 약 10 ㎎/㎏/체중, 약 50 ㎎/㎏/체중, 약 100 ㎎/㎏/체중, 약 200 ㎎/㎏/체중, 약 350 ㎎/㎏/체중, 약 500 ㎎/㎏/체중, 내지 약 1000 ㎎/㎏/체중, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위일 수 있다. 본 명세서에 나열된 숫자로부터의 유도 가능한 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 ㎎/㎏/체중 내지 약 100 ㎎/㎏/체중, 약 5 마이크로그램/㎏/체중 내지 약 500 밀리그램/㎏/체중 등의 범위는 상기에 기술된 숫자를 기초로 하여 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 하루에 2 내지 3회, 매주, 또는 3주마다 투여될 수 있다. 초기의 더 높은 로딩 용량 이후에, 하나 이상의 적은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다.
본 명세서에 기술된 조작된 IL2 폴리펩타이드 및 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드는 의도된 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 사용될 수 있다. 질환 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위해, 조작된 IL2 폴리펩타이드 또는 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드, 또는 이의 약제학적 조성물은 치료학적 유효량으로 투여된다. 치료학적 유효량의 결정은 특히, 본 명세서에 제공된 세부사항의 측면에서, 당업자의 능력 범위 내에 있다.
전신 투여를 위해, 치료학적 유효량은 초기에 시험관 내 검정, 예를 들어, 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 이후에, 세포 배양물에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 초기 투여량은 또한, 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여, 생체내 데이터, 예를 들어, 동물 모델로부터 추정될 수 있다. 인간에게 투여는 동물 데이터를 기초로 하여 당업자에 의해 용이하게 최적화될 수 있다. 투여량 및 간격 각각은 치료 효과를 유지하기에 충분한, 조작된 IL2 폴리펩타이드 및 조작된 IL2 융합 폴리펩타이드의 혈장 수준을 제공하도록 조정될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들어, HPLC에 의해 측정될 수 있다.
실시예
실시예 1
IL2Rα-감소된 결합 돌연변이를 식별하기 위한 라이브러리 전략
IL2Rα-감소된 결합제를 식별하기 위한 IL2 돌연변이의 라이브러리를 IL2Rα와의 IL2 상호작용의 구조 모델링을 기반으로 합리적으로 설계하였다(도 1a 및 도 1b). 간단하게, IL2의 K35, R38, F42 및 Y45 잔기를 IL2Rα와 상호작용하는 중요한 잔기로서 식별하였다(도 1c). 이러한 잔기에서 2, 3 및 4개의 무작위화된 돌연변이를 보유하는 돌연변이유발 올리고를 라이브러리 구축을 위해 사용하였다(표 1).
Figure pct00001
Figure pct00002
대문자 뉴클레오타이드 트라이머를 50% WT 및 50% NNS, 또는 70% WT 및 30% NNS에서 혼합하였으며, 여기서, "N"은 임의의 뉴클레오타이드를 지칭하고, "S"는 G 또는 C를 지칭한다. 3개의 라이브러리를 다단계 PCR 및 주형으로서 WT IL2 서열과 상기 돌연변이유발 올리고의 중첩 PCR에 의해 구성하였다. 라이브러리 1은 돌연변이유발 올리고 1 내지 6을 포함하고, 라이브러리 2는 돌연변이유발 올리고 7 내지 9를 포함하고, 라이브러리 3은 돌연변이유발 올리고 10 및 11을 포함한다(표 2). 그러한 돌연변이유발 라이브러리는 N-말단에서 시험관 내 전사 및 번역 신호를 갖도록 추가로 변형되었다. 플래그-태그 서열을 또한, 선택 및 정제 목적을 위해 C-말단에 첨가하였다.
실시예 2
IL2Rα-감소된 결합 클론의 선택 및 식별
mRNA 디스플레이 기술을 사용하여 3개의 IL2 돌연변이유발 라이브러리로부터 IL2Rα-감소된 결합을 갖는 IL2 돌연변이체를 선택하였다. 간단하게, DNA 라이브러리를 먼저 mRNA 라이브러리에 전사하고, 이후에, 푸로마이신 링커를 통해 공유 결합함으로써 mRNA-IL2 돌연변이체 융합 라이브러리로 번역하였다. 라이브러리를 정제하고 mRNA/cDNA 융합 라이브러리로 변환하였다. 융합 라이브러리를 인간 및 마우스 IgG(음성 단백질)로 역선택하여 비특이적 결합제를 제거하고, 이후에, IL2Rα에 대해 3회 역선택하였다. 라이브러리 흐름 스루(결합되지 않은 분자)를 수집하고, IL2Rα 결합되지 않은 분자를 회수하기 위해 PCR을 수행하고, 이후에 겔 정제하였다. 회수된 풀을 pET22b 벡터에 서브클로닝하고, 이.콜라이 Rosetta II 가닥에서 발현시켰다. 개개 클론의 상청액을 IL2Rα 결합 ELISA에서 시험하였다. 도 2a는 IL2Rα에 대한 선택된 IL2 클론의 상청액의 ELISA 결과를 도시한 것이다. 도 2b는 상청액과 IL2Rα 결합에 대해 플롯팅된 클론 발현을 도시한 것이다. 도 3은 IL2Rα-감소된 결합으로 식별된 클론의 서열 정렬을 도시한 것이다.
실시예 3
IL2Rα-감소된 결합 클론의 결합 동역학 분석
IL2Rα에 대한 IL2Rα-감소된 결합 클론의 결합 동역학을, Biacore T200, 소프트웨어 버전 2.0을 구비한 SPR 기술을 이용하여 평가하였다. 각 사이클을 위해, 1 ㎍/㎖의 인간 IL2Rα를 단백질 A 센서 칩 상에서 1X HBSP 완충액 중에서 유세포 2 상에 10㎕/분의 유량으로 60초 동안 포획하였다. 100nM의 각 HIS 및 Flag 태그 정제된 IL2 돌연변이체를 150초 동안 30㎕/분의 유량으로 기준 유세포 1 및 IL2Rα 포획된 유세포 2 둘 다 상에 주입하고, 이후에, 300초 동안 세척하였다. 이후에, 유세포를 60초 동안 30㎕/분의 유량으로 글리신 pH 2.0으로 재생하였다. HBSP+ 완충액을 기준선 대조군으로서 각 샘플에 포함하였다. 검정을 96-웰 포맷으로 셋업하였다. 동역학 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어 3.0으로 분석하였다. 특정 결합 반응 단위를 IL2Rα 유세포 2로부터 기준 유세포 1에 대한 결합을 차감 및 완충액 대조군의 차감으로부터 유도하였다. WT IL2를 대조군으로서 포함하였다. 상대 반응(RU)을 각 IL2Rα-감소된 결합 클론에 대해 결정하였다(도 4, 표 3).
Figure pct00003
실시예 4
IL2Rβ 효능제를 생성하기 위한 라이브러리 전략
조작된 IL2Rβ 결합 효능제를 합리적인 IL2 돌연변이유발 라이브러리 설계 이후, mRNA 디스플레이 기술 플랫폼으로의 선택에 의해 생성하였다. 간단하게, 2개의 IL2Rβ에 대한 2개의 WT IL2 결합 영역을 식별하였다: 구조 분석으로부터 IL2Rβ 결합 영역 1 "QLQLEHLLLDLQM"(서열번호 67) 및 IL2Rβ 결합 영역 2 "RPRDLISNINVIVLE"(서열번호 68). IL2Rβ 결합 영역 1, IL2Rβ 결합 영역 2, 또는 IL2Rβ 결합 영역 1 및 IL2Rβ 결합 영역 2에 대한 돌연변이를 포함하는 돌연변이유발 라이브러리의 생산을 위해, 이러한 2개의 영역의 서열을 인코딩하는 2개의 돌연변이유발 올리고머(올리고 1, 올리고 2)를 설계하였다(표 4). 올리고 1 및 올리고 2 서열에 대해, 소문자로 나타낸 뉴클레오타이드를 갖는 각 코돈 트라이머는 50% WT와 50% NNS("N"은 임의의 뉴클레오타이드를 지칭하고, "S"는 G 또는 C를 지칭함)의 혼합물이었다. 추가 올리고머(올리고 3 내지 올리고 12) 코딩 WT IL2 서열을 돌연변이유발 라이브러리 어셈블리를 위해 WT 영역으로부터 설계하였다(표 4). 3개의 돌연변이유발 라이브러리를 3개의 올리고를 사용하여 구축하였다(도 5). 라이브러리 4를 돌연변이유발 올리고 1 및 올리고 3 내지 12로의 중첩된 PCR 전략을 이용하여 구축하였다. 라이브러리 5를 돌연변이유발 올리고 2 및 올리고 3 내지 9, 11, 및 12로의 중첩된 PCR 전략을 이용하여 구축하였다. 라이브러리 6을 돌연변이유발 올리고 1 및 2 및 올리고 3 내지 8, 11 및 12로의 중첩된 PCR 전략을 이용하여 구축하였다. 3개의 돌연변이유발 라이브러리를 mRNA 디스플레이로의 선택을 위해 C-말단에서 Flag-태그 및 N-말단에서 시험관 내 전사 및 번역 신호를 갖도록 추가로 변형하였다.
Figure pct00004
실시예 5
IL2Rβ 효능제 클론의 선택 및 식별
3개의 IL2 돌연변이유발 라이브러리로부터 IL2Rβ 효능제의 식별을 위해 mRNA 디스플레이 기술 플랫폼을 사용하였다. DNA 라이브러리를 먼저, mRNA 라이브러리에 전사시키고, 이후에, 푸로마이신 링커를 통한 공유 결합에 의해 mRNA-IL2 돌연변이체 융합 라이브러리에 번역하였다. 라이브러리를 이후에 정제하고 mRNA/cDNA 융합 라이브러리로 변환시켰다(예를 들어, 미국 특허 제6,258,558호 참조, 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 비특이적 결합제를 제거하기 위해 융합 라이브러리를 먼저 인간 IgG(음성 단백질)로 역선택하고, 이후에, IL2Rα 결합제를 제거하기 위해 역선택하고, 이후에, 단백질 G 자기 비드 상에 포획된 재조합 IL2Rβ/Fc 단백질에 대해 선택하였다. IL2Rβ 결합제를 회수하고, PCR 증폭에 의해 농축하였다. IL2Rβ에 대한 고도로 농축된 조작된 IL2 돌연변이체 결합을 발생시키기 위해 총 5 라운드 선택을 실행하였다.
5 라운드의 선택 후, 농축된 라이브러리를 박테리아 주변세포질 발현 벡터 pET22b에 클로닝하고, TOP10 성분 이.콜라이 세포에 변형시켰다. 정제 및 검정 검출을 위해 C-말단 플래그 및 6xHIS 태그를 갖도록 각 조작된 IL2 분자를 조작하였다. TOP10 세포로부터의 클론을 풀링하고, miniprep DNA를 제조하고, 후속하여, 발현을 위한 이.콜라이 Rosetta II 균주에 변형시켰다. 단일 클론을 선택하고, 성장시키고, 발현을 위해 96-웰 플레이트에서 0.25mM IPTG로 유도하였다. 상청액을 결합제를 식별하기 위한 검정을 위해 30℃에서 16 내지 24시간 인큐베이션 후에 수집하였다.
조작된 IL2 돌연변이체를 함유한 상청액을 발현을 스크리닝하기 위해 샌드위치 ELISA 검정으로 평가하였다. 간단하게, 항-HIS 태그 항체(R&D Systems)를 웰당 50㎕의 최종 부피에서 1X PBS 중 2 ㎍/㎖의 최종 농도로 96-웰 플레이트에 고정하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 이후에, 1시간 동안 웰당 200㎕의 수퍼블록으로 차단하였다. 100㎕의 1:10 1X PBST 희석된 상청액을 각 웰에 첨가하고, 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 동안 1X PBST 중에 1:5000으로 희석된 50㎕의 항-Flag HRP를 첨가함으로써 조작된 IL2 돌연변이체의 발현 수준을 검출하였다. 각 단계 사이에서, 플레이트를 플레이트 세척기를 이용하여 1X PBST로 3회 세척하였다. 이후에, 플레이트를 5분 동안 50㎕의 TMB 기질로 현상시키고, 50㎕의 2N 황산을 첨가하여 중지시켰다. 플레이트를 Biotek 플레이트 판독기를 이용하여 OD450에서 판독하고, 데이터를 Prism 8.1 소프트웨어로 분석하였다.
단일 클론을 다음으로서 IL2Rβ 결합을 위해 스크리닝하였다. IL2Rβ 결합 스크리닝 ELISA를 개개 조작된 IL2 돌연변이체의 식별을 위해 전개하였다. 간단하게, 96-웰 플레이트를 웰당 50㎕의 총 부피에서 1X PBS 중 2 ㎍/㎖의 최종 농도로, 인간 Fc 및 인간 IL2Rβ로 각각 고정시켰다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 이후에, 1시간 동안 웰당 200㎕의 수퍼블록으로 블로킹하였다. 100㎕의 상청액을 Fc 및 IL2Rβ 고정화된 웰 둘 다에 첨가하고, 진탕과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1X PBST 중에 1:5000으로 희석된 50㎕의 항-Flag HRP를 첨가함으로써 조작된 IL2 돌연변이체 결합을 검출하였다. 각 단계 사이에서, 플레이트를 플레이트 세척기에서 1X PBST로 3회 세척하였다. 이후에, 플레이트를 5분 동안 50㎕의 TMB 기질로 현상하고, 50㎕의 2N 황산을 첨가하여 정지시켰다. 플레이트를 Biotek 플레이트 판독기를 이용하여 OD450㎚에서 판독하고, 결합 및 선택성을 분석하였다. 발현과 IL2Rβ 결합의 상관관계를 Prism 8.1 소프트웨어로 플롯팅하였다.
높은 IL2Rβ-결합 클론(수직 OD450㎚ 컷오프의 우측에 나타냄)을 조작된 IL2Rβ 효능제로서 추가 특징화를 위해 라이브러리 5로부터 식별하였다(도 6). 클론의 IL2Rβ-결합 활성은 일반적으로 클론의 발현 수준과 상관 관계를 나타내었다. IL2Rβ 결합 영역 2의 다중 서열 정렬은 IL2 WT와 비교하여 고도로 보존되고 고도로 가변된 아미노산 둘 다뿐만 아니라, 여러 차례 독립적으로 식별된 클론 서열을 나타내었다(도 7). 특정 IL2Rβ-결합 클론이 라이브러리 4 및 6으로부터 식별되지 않았다.
실시예 6
이.콜라이 및 포유류 세포에서 IL2Rβ 효능제 클론의 생성
이.콜라이에서 IL2Rβ 효능제의 생성을 위해, 각 조작된 효능제 클론의 글리코세롤 모액을 밤샘 서장을 위해 TB 배지에 접종하였다. 다음날, 밤새배양된 세포를 TB 배지에 접종하고, 0.6 내지 0.8의 OD600의 세포 밀도까지 성장시켰다. IPTG를 1mM의 최종 농도까지 첨가하여 30℃에서 밤새 배양하는 동안 발현을 유도하였다. 상청액을 원심분리에 의해 수집하였다. 조작된 효능제를 제조업체 프로토콜에 따라 Ni-Sepharose(GE Healthcare) 친화력 칼럼에 의해 정제하였다. 조작된 효능제의 순도를 Flag-태그 친화력 칼럼 정제(Sigma)에 의해 추가로 개선하였다. 효능을 각각 크기 배제 크로마토그래피 칼럼 정제를 위해 AKTA에서 Sephadex 200 Increase 10/300 GL 칼럼에 각각 농축 및 로딩하였다. 효능제의 고균질 모노머 피크 분획을 각각 풀링하고, 농축하였다. 내독소를 표준 프로토콜에 따라 내독소 제거 수지(Pierce)를 사용하여 추가로 제거하였다. 최종 내독소 수준은 10 EU/㎎ 미만이었다. 단백질 순도를 LC-MS 분광 분석 및 SDS 겔에 의해 확인하였다(도 8). 단백질을 각각 결합 및 기능성 분석을 위해 1X PBS 완충액 중에 저장하였다.
포유류 세포에서 IL2Rβ 효능제의 생산을 위해, 아미노산 서열에 해당하는 DNA 서열을 코돈 최적화하고, 합성하고, pCDNA3.4(Invitrogen)으로 서브클로닝하였다. 각 조작된 IL2 폴리펩타이드를 표준 프로토콜에 따라 자유 스타일 시스템(Invitrogen)에서 ExpiHEK293-F 세포 중에서 일시적으로 발현하였다. 세포를 수확 전 7일 동안 상기 조건에서 성장하였다. 상청액을 원심분리에 의해 수집하고, 0.2㎛ PES 막을 통해 여과하였다. 효능제를 먼저 Ni Sepharose Excel 수지 칼럼(GE Healthcare)에 의해 정제하고, 완충액을 7k Da Zeba 칼럼과 함께 PBS pH 7.4 + 300mM NaCl(전체)로 교체하였다. 각 폴리펩타이드를 이후에 1㎖까지 농축하고, Superdex 200 Increase 10/300 GL 칼럼(GE Healthcare)에 의해 균질하게 될 때까지 정제하였다. 모노머 피크 분획을 풀링하고 농축하였다. 최종 정제된 단백질은 10 EU/㎎ 미만의 내독소를 함유하였다. IL2 폴리펩타이드 식별을 LC-MS 분광법 분석에 의해 확인하였고, 순도를 SDS 겔로 분석하였다. 단백질을 결합, 기능성 및 기계 분석을 위해 1X PBS/300nM NaCl 완충액 중에서 저장하였다.
실시예 7
표면 플라스몬 공명을 이용한 IL2Rβ 효능제 클론의 결합 동역학 분석
이.콜라이 생성 WT IL2 및 EP001-EP007의 결합 동역학을 이.콜라이 세포에서 생성된 조작된 IL2 폴리펩타이드 및 포유류 세포에서 생성된 조작된 IL2 폴리펩타이드에 대해 Biacore T200을 구비한 표면 플라스몬 공명 기술에 의해 평가하였다. 검정을 Biacore T200 제어 소프트웨어 버전 2.0으로 실행하였다. 각 사이클을 위해 1 ㎍/㎖의 인간 IL2Rβ 또는 IL2Rα를 단백질 A 센서 칩 상에서 1X HBST 완충제 중 유세포 2 상에 10㎕/분의 유량으로 60초 동안 포획하였다. 2배 연속 희석된 HIS 태그 정제된 조작된 IL2 돌연변이체를 30㎕/분의 유량으로 150초 동안 기준 유세포 1 및 IL2Rβ 또는 IL2Rα 포획된 유세포 2 둘 다 상에 주사하고, 300초 동안 세척하였다. 이후에, 유세포를 30㎕/분의 유량으로 40초 동안 글리신 pH 2로 재생하였다. 0 내지 100nM의 8개의 농도 포인트를 각 IL2Rβ 효능제 클론 96-웰 플레이트 포맷에 대해 검정하였다. 동역학 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어 3000으로 분석하였다. 특정 결합 반응 단위를 표적 유세포 2로부터 기준 유세포 1에 대한 결합의 차감으로부터 유도하였다.
결합 프로토콜을 입증하기 위해 WT IL2를 사용하였고, 대조군으로서 각 실행에서 포함하였다(도 9a 및 도 9b). IL2Rα(이.콜라이 생성에 대해 도 10a 내지 도 10h, 포유류 생성에 대해 도 12a 내지 도 12d), 및 IL2Rβ(이.콜라이 생성에 대해 도 11a 내지 도 11h, 포유류 생성에 대해 도 13a 내지 도 13d)에 대한 이.콜라이 및 포유류 생성 IL2Rβ 효능제 결합의 결합 동역학의 대표 센서그램을 나타낸다. 이.콜라이-생성된 IL2(표 5) 및 포유류-생성된 IL2(표 6)에 대한 결합 동역학을 요약하였다.
IL2Rβ 효능제 EP001, EP006, 및 EP007은 검출 가능하지 않은 IL2Rα 결합 또는 IL2Rα 결합의 유의미한 감소(20배 초과의 감소)를 나타내지만, WT IL2와 비교하여 IL2Rβ 결합의 유의미한 증가를 갖는다(표 5 및 표 6). 반대로, IL2Rβ 효능제 EP002, EP003, EP004, 및 EP005는 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rα의 유의미한 감소(20배 미만 감소)를 나타내지만, WT IL2와 비교하여 IL2Rβ 결합의 유의미한 증가를 갖는다(표 5 및 표 6).
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 8
인간 PBMC에서 IL2Rβ 효능제 P-STAT5 활성화
인간 PBMC를 3개의 별개의 공여자의 말초 혈액으로부터 단리하고, 96-웰 플레이트에서 75㎕의 배지 중에 250,000 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 휴지시켰다. 세포를 37℃에서 20분 동안 25㎕에서 4X 농도로 인간 WT IL2 및 조작된 His-Flag 태그화 IL2로 자극하였다. 자극된 PBMC를 바로 고정시키고, 투과하고, 세포 계통 마커(CD3, CD56, CD4, CD8, FOXP3) 및 p-STAT5에 대해 염색하고, Attune 유세포 분석기 상에서 시각화하였다. CD8+ T 세포를 CD3+CD56-CD4-CD8+로서 규정하였다. NK 세포를 CD3-CD56+로서 규정하였다. T 조절 세포를 CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+로서 규정하였다. p-STAT5+인 세포의 %를 결정하고, 각 IL2 적정에 대해 그래프로 나타내었다(혈액 공여자 1에 대해 도 14a 내지 도 14c, 혈액 공여자 2에 대해 도 14d 내지 도 14f, 혈액 공여자 3에 대해 도 14g 내지 14i). P-STAT5 활성화에 대한 EC50 값을 Prism 소프트웨어를 이용하여 결정하였다(표 7).
Figure pct00007
실시예 9
IL2Rβ 효능제 역-돌연변이 클론의 합리적인 생성
소정 범위의 IL2Rβ 효능제 후보 돌연변이를 생성하기 위해 합리적으로 설계된 IL2Rβ 효능제 역-돌연변이 전략을 수행하였다. EP001은 R81T, P82A, L85A, I86V, S87D, I89M, N90R, V93I 및 L94Q 돌연변이를 함유한다. WT IL2에 대한 4개의 역-돌연변이를 각 후보물에 대해 설계하였다. I86 및 I89를 모든 돌연변이에 대해 WT IL2의 86I 및 89I로 역-돌연변이하였다. 체계적인 역-돌연변이를 이후에 86I 및 89I와 조합하여 다른 2개의 잔기에 적용하였다. 총 21개의 역-돌연변이 조합을 설계하고, 돌연변이를 주형으로서 EP001을 사용하여 부위 유도된 돌연변이유발에 의해 생성하였다(표 8). IL2Rβ 효능제 역-돌연변이 클론을 돌연변이유발 후 서열 입증하였다.
Figure pct00008
실시예 10
IL2Rβ 효능제-역-돌연변이 클론의 특징분석
EP001 역-돌연변이 클론을 ELISA에 의해 IL2Rβ 및 IL2Rα 수용체에 대한 이의 결합 활성에 대해 특징분석하였다. 간단하게, 384 웰 플레이트를 웰당 25uL의 총 부피에서 1X PBS 중 2 ㎍/㎖의 최종 농도에서 인간 IL2Rα 및 IL2Rβ Fc 융합 단백질로 고정시켰다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 1시간 동안 웰당 80uL의 수퍼블록으로 차단하였다. 정제된 EP001 역-돌연변이 클론을 100nM에서 0nM까지 연속적으로 희석하였다. 각 희석을 IL2Rα 또는 IL2Rβ에 나란히 중복하여 첨가하였다. 1X PBST에서 1:5000에서 희석된 25㎕의 항-Flag HRP를 첨가함으로써 IL2 돌연변이체 결합을 검출하였다. 각 단계 사이에서, 플레이트를 플레이트 판독기를 이용하여 1X PBST로 3회 세척하였다. 플레이트를 이후에 5분 동안 25㎕의 TMB 기질로 현상하고, 25㎕의 2N 황산을 첨가함으로써 중지시켰다. 플레이트를 OD450㎚ Biotek 플레이트 판독기에서 판독하고, EC50을 Prism 8.1 소프트웨어로 분석하여 EC50 값을 획득하였다(IL2Rα에 대해 도 15a, IL2Rβ에 대해 도 15b, 표 9에 요약됨).
Figure pct00009
실시예 11
표면 플라스몬 공명을 이용한 IL2Rβ 효능제 역-돌연변이 클론의 결합 동역학
EP001 역-돌연변이 클론의 결합 동역학 분석을 Biacore T200을 구비한 SPR 기술에 의해 평가하였다. 검정을 Biacore T200 제어 소프트웨어 버전 2.0으로 실행하였다. 각 사이클에 대하여, 1 ㎍/㎖의 인간 IL2Rβ를 단백실 A 센서 칩 상에서 1X HBSP 완충액 중 유세포 2에서 10㎕/분의 유량으로 60초 동안 포획하였다. 100nM의 HIS 및 Flag 태그 정제된 각 IL2 돌연변이체를 2배 연속 희석하고, 30㎕/분의 유량으로 150초 동안 기준 유세포 1 및 IL2Rβ 포획된 유세포 2 둘 다 상에 주사하고, 이후에 300초 동안 세척하였다. 이후에, 유세포를 30㎕/분의 유량으로 60초 동안 글리신 pH 2로 재생하였다. 검정을 96-웰 포맷에서 8 연속 희석 농도 포인트로 셋업하였다. 동역학 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어 3.0으로 분석하였다. 특정 결합 반응 단위를 표적 유세포 2로부터 기준 유세포 1에 대한 결합의 차감으로부터 유도하였다(도 16a 내지 도 16f, 표 10).
Figure pct00010
실시예 12
감소된 IL2Rα 활성을 갖는 조작된 IL2Rβ 효능제
mRNA 라이브러리 선택 및 스크린을 통해 생성된 잠재적으로 감소되거나 제거된 IL2Rα 결합을 갖는 IL2 돌연변이를 먼저 이.콜라이에서 발현시키고, 제작업체 프로토콜에 따라 Ni-Sepharose(GE Healthcare) 친화력 칼럼 및 Flag 태그 친화력 칼럼 정제(Sigma)에 의해 정제하였다. Biacore SPR 결합 및 ELISA 결합 둘 다에 의해 확인된 유의미하게 감소된 IL2Rα 결합 활성을 갖는 IL2 돌연변이를 이후에, IL2Rα 결합 활성이 감소된 IL2Rβ 효능제를 생성시키기 위해 선택하였다. 간단하게, 돌연변이를 pCDNA3.4 포유류 발현 벡터에서 IL2Rβ 효능제 작제물에 대한 부위 유도 돌연변이유발 기술에 의해 도입하고, DNA 서열 분석에 의해 확인하였다(표 11). 각 조작된 IL2 폴리펩타이드를 표준 프로토콜에 따라 프리 스타일 시스템(Invitrogen)에서 ExpiHEK293-F 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 세포를 상기 조건에서 수확하기 전 5일 동안 성장시켰다. 상청액을 원심분리에 의해 수집하고, 0.2㎛ PES 막을 통해 여과하였다. 효능제를 먼저 Ni Sepharose Excel 수지 칼럼(GE Healthcare)에 의해 정제하고, Superdex 200 Increase 10/300 GL 칼럼(GE Healthcare)에 의해 95% 초과의 균질성까지 추가로 정제하였다(도 17). 최종 정제된 단백질은 10 EU/㎎ 미만의 내독소를 갖는다. 단백질을 결합, 기능성 및 메커니즘 분석을 위해 1X PBS 완충액 중에 저장하였다.
Figure pct00011
실시예 13
표면 플라스몬 공명을 사용한 조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론의 결합 동역학 분석
IL2Rα 감소된 활성 돌연변이를 갖는 IL2Rβ 효능제의 수용체 결합 활성의 동역학 분석을 Biacore T200을 구비한 SPR 기술에 의해 평가하였다. 검정을 Biacore T200 제어 소프트웨어 버전 2.0으로 실행하였다. 각 사이클에 대하여, 1 ㎍/㎖의 인간 IL2Rβ를 단백질 A 센서 칩 상에서 1XHBSP 완충액 중 유세포 2 상의 10㎕/분의 유량으로 60초 동안 포획하였다. 100nM의 HIS 및 Flag 태그 정제된 각 IL2 돌연변이체를 2배 연색 희석하고, 30㎕/분의 유량으로 150초 동안 기준 유세포 1 및 IL2Rβ 포획된 유세포 2 둘 다 상에 주사하고, 300초 동안 세척하였다. 이후에, 유세포를 30㎕/분의 유량으로 60초 동안 글리신 pH 2로 재생하였다. 검정을 96웰 포맷에서 8 연속 희석 농도 포인트로 셋업하였다. 동역학 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어 3.0으로 분석하였다. 특정 결합 반응 단위를 표적 유세포 2로부터 기준 유세포 1에 대한 결합의 차감으로부터 유도하였다. 도 18a 내지 도 18h는 IL2Rα에 대한 조작된 IL2Rβ/α 클론의 적정된 결합을 도시한 것이고, 도 19a 내지 도 19h는 IL2Rβ에 대한 조작된 IL2Rβ/α 클론의 적정된 결합을 도시한 것이다. 클론의 설명뿐만 아니라 동역학 데이터의 요약을 표 12에 나타내었다.
Figure pct00012
도 20a 내지 도 20g는 IL2Rα 단일 농도 결합을 도시한 것이고, 도 21a 내지 도 21g는 IL2Rβ 단일 농도 결합을 도시한 것이고, 도 22a 및 도 22b는 IL2Rα 다중-농도 결합을 도시한 것으로서, 표 13에 요약되어 있다.
Figure pct00013
실시예 14
조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론의 ELISA 결합 분석
재조합 Fc-태그화 인간 IL2Rα 및 IL2Rβ를 384-웰 플레이트의 웰에 25㎕의 1X PBS 중에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 플레이트를 코팅하였다. 플레이트를 0.05% Tween20/1X PBS로 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 100㎕의 SuperBlock으로 차단하고, 이후에, 0.05% Tween20/1X PBS로 3회 세척하였다. IL2 돌연변이체를 0.05% Tween 20/1X PBS 중에서 1000nM에서 0nM까지 희석시키고, 실온에서 2시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 이후에, 플레이트를 0.05% Tween20/1X PBS로 6회 세척하였다. 항-HisTag-HRP를 0.05% Tween20/1X PBS 중에서 1:5000으로 희석하고, 실온에서 1시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 이후에 0.05% Tween 20/1X PBS로 6회 세척하고, TMB를 첨가하여 청색 칼라를 나타내었다. 반응을 2N 황화수소로 중지시키고, 450㎚에서의 흡광도를 BioTek 플레이트 판독기에서 판독하였다. 인간 IL2Rα에 대한 단일 포인트 흡광도 및 인간 IL2Rα 및 IL2Rβ에 대한 적정을 그래프로 나타내었다(IL2Rα에 대해 도 23a 내지 도 23e, IL2Rβ에 대해 도 24a 내지 도 24d). ELISA 결합의 EC50 값을 요약하였다(표 14).
Figure pct00014
실시예 15
조작된 IL2Rα/IL2Rβ 클론에 의한 인간 PBMC의 P-STAT5 활성화
인간 PBMC를 2 공여자의 말초 혈액으로부터 단리하고, 96-웰 플레이트에서 75㎕의 배지 중에 250,000 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 휴지시켰다. 세포를 37℃에서 20분 동안 25㎕에서 4X 농도로 인간 WT IL2 및 조작도니 His-Flag 태그화 IL2로 자극하였다. 자극된 PBMC를 바로 고정시키고, 투과하고, 세포 계통 마커(CD3, CD56, CD4, CD8, FOXP3) 및 p-STAT5에 대해 염색하고, Attune 유세포 분석기 상에서 시각화하였다. CD8+ T 세포를 CD3+CD56-CD4-CD8+로서 규정하였다. NK 세포를 CD3-CD56+로서 규정하였다. T 조절 세포를 CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+로서 규정하였다. p-STAT5+인 세포의 %를 결정하고, 각 IL2 적정에 대해 그래프로 나타내었다(공여자 656 CD8+ T 세포에 대해 도 25a 내지 도 25d, 공여자 648 CD8=+T 세포에 대해 도 26a 내지 도 26d, 공여자 656 NK 세포에 대해 도 27a 내지 도 27d, 공여자 648 NK 세포에 대해 도 28a 내지 도 28d, 공여자 656 T 조절 세포에 대해 도 29a 내지 도 29d, 및 공여자 648 T 조절 세포에 대해 도 30a 내지 도 30d). 각 세포 타입의 P-STAT5 활성화의 EC50 값의 요약은 혈액 공여자 1에 대해 표 15에 및 혈액 공여자 2에 대해 표 16에 나타나 있다.
Figure pct00015
Figure pct00016
실시예 16
조작된 IL2Rα/IL2Rβ클론에 의한 뮤린 세포의 P-STAT5 활성화
뮤린 비장세포를 96-웰 플레이트에서 75㎕의 배지 중에 250,000 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 휴지시켰다. 세포를 37℃에서 20분 동안 25㎕에서 4X 농도로 인간 WT IL2 및 조작된 His-Flag 태그화 IL2로 자극하였다. 자극된 마우스 비장세포를 바로 고정시키고, 투과하고, 세포 계통 마커(CD3, CD56, CD4, CD8, FOXP3) 및 p-STAT5에 대해 염색하고, Attune 유세포 분석기 상에서 시각화하였다. CD8+ T 세포를 CD3+CD56-CD4-CD8+로서 규정하였다. p-STAT5+인 세포의 %를 결정하고, 각 IL2 적정에 대해 그래프로 나타내었다(도 31a 내지 도 31d). 각 세포 타입에서 P-STAT5 활성화의 EC50 값의 요약은 도 34에 도시되어 있다.
단리된 NK 세포 또는 마우스 T 조절 세포를 96-웰 플레이트에서 75㎕의 배지 중에 20,000 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 휴지시켰다. 세포를 37℃에서 20분 동안 25㎕에서 4X 농도로 인간 IL2 WT 및 조작된 His-Flag 태그화 IL2로 자극하였다. 자극된 마우스 NK 세포 또는 마우스 T 조절 세포를 바로 고정시키고, 투과하고, P-STAT5에 대해 염색하고, Attune 유세포 분석기 상에서 시각화하였다. p-STAT5+인 세포의 %를 결정하고, 각 IL2 적정에 대해 그래프로 나타내었다(도 32a 내지 도 32d, 도 33a 내지 도 33d).
각 세포 타입에서 P-STAT5 활성화의 EC50 값의 요약은 도 34에 도시되어 있다.
실시예 17
IL2Rβ 효능제 Fc-융합 단백질의 설계
2가 IL2Rβ 효능제 Fc-융합 단백질을 생성하기 위해, EP003(서열번호 2), EP007(서열번호 4), EP002(서열번호 6), EP004(서열번호 09), EP001(서열번호 11), EP006(서열번호 16), EP009(서열번호 18), 및 EP005(서열번호 19)의 조작된 IL2 폴리펩타이드를 인코딩하는 단백질 서열을 인간 IgG1 아이소형의 불변 프레임 서열의 N-말단 부위에 융합하여 조작된 효능제-Fc 융합 단백질(서열번호 44, 46, 48, 51, 53, 58, 및 61)을 생성하였다. 인간 IgG1에서 L234A, L235A 및 P329G 돌연변이를 도입하여 상보적 결합 및 Fc-γ 의존 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC) 효과를 제거하였다(Lo et al., JBC 2017)(도 35a).
1가 IL2Rβ 효능제 Fc-융합 단백질을 생성하기 위해, EP003(서열번호 2), EP007(서열번호 4), EP002(서열번호 6), EP004(서열번호 09), EP001(서열번호 11), EP006(서열번호 16), EP009(서열번호 18), 및 EP005(서열번호 19)의 조작된 IL2 폴리펩타이드를 인코딩하는 단백질 서열을 개개 인간 IgG1 및 IgG4 아이소형의 불변 프레임 서열의 N-말단 부위에 융합하여 조작된 효능제-Fc 융합 단백질(서열번호 44, 46, 48, 51, 53, 58, 및 61)을 생성하였다. S354C, T366W 및 K409A의 노브 돌연변이를 작제물에 도입하였다. Y349C, T366S, L368A, F405K, Y407V의 홀 돌연변이를 각각 IgG1 및 IgG4의 CH2 및 CH3 단편에 도입하였다. 인간 IgG1에서 L234A, L235A 및 P329G 돌연변이를 도입하여 상보적 결합 및 Fc-γ 의존 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC) 효과를 제거하였다(Lo et al., JBC 2017)(도 35b 및 35c). 전체 Fc 융합 효능제 단백질을 인코딩하는 DNA를 이후에 포유류 세포 발현을 위해 최적화된 코돈으로 합성하고, pCDNA3.4(Invitrogen)로 서브클로닝하였다.
실시예 18
IL2Rβ 효능제 FC 융합 단백질의 생성
2가 IL2-Fc 융합 단백질 생성에 대하여, 효능제를 표준 프로토콜에 따라 프리 스타일 시스템(Invitrogen)에서 ExpiHEK293-F 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 세포를 상기 조건에서 수확하기 전 7일 동안 성장시켰다. 상청액을 원심분리에 의해 수집하고, 0.2㎛ PES 막을 통해 여과하였다. Fc 융합 효능제를 먼저 MabSelect PrismA 단백질 A 수지(GE Health)에 의해 정제하였다. 단백질을 100mM Gly pH 2.5 + 150mM NaCl로 용리하고, 20mM 시트레이트 pH 5.0 + 300mM NaCl로 빠르게 중화시켰다. 효능제 단백질을 이후에, 1㎖까지 농축하고, Superdex 200 Increase 10/300 GL 칼럼에 의해 추가로 정제하였다. 모노머 피크 분획을 풀링하고, 농축하였다. 최종 정제된 단백질은 10 EU/㎎ 미만의 내독소를 가지고, 20mM 시트레이트 pH 5.0 + 300mM NaCl에서 유지시켰다. 정제된 IL2 - Fc 융합 효능제를 SES 겔(4-12% Bis-Tris Bolt 겔, MES 실행 완충액을 함유함) 상에서 실행하여, 비-환원 조건에 대해 각 환원 하에서 처리된 샘플을 비교하였다(도 36a).
1가 IL2-Fc 융합 단백질 생성에 대하여, 개개 IgG1 및 IgG4 골격 포맷에서 "노브(knob)" 및 "홀(hole)" 작제물을 1:1의 비율로 ExpiHEK293-F 세포에 트랜스펙션하였다. 세포를 상기 조건에서, 수확 전 5일 동안 성장하였다. 상청액을 원심분리에 의해 수집하고, 0.2㎛ PES 막을 통해 여과하였다. Fc 융합 효능제를 먼저 MabSelect PrismA 단백질 A 수지(GE Health)에 의해 정제하였다. 단백질을 100mM Gly pH 2.5 + 150mM NaCl로 용리하고, 20mM 시트레이트 pH 5.0 + 300mM NaCl로 빠르게 중화시켰다. 효능제 단백질을 이후에, 1㎖까지 농축하고, Superdex 200 Increase 10/300 GL 칼럼에 의해 추가로 정제하였다. 모노머 피크 분획을 풀링하고, 농축하였다. 최종 정제된 단백질은 10 EU/㎎ 미만의 내독소를 가지고, 20mM 시트레이트 pH 5.0 + 300mM NaCl에서 유지시켰다. 정제된 IL2 - Fc 융합 효능제를 SES 겔(4-12% Bis-Tris Bolt 겔, MES 실행 완충액을 함유함) 상에서 실행하여, 비-환원 조건에 대해 각 환원 하에서 처리된 샘플을 비교하였다(도 36b).
실시예 19
IL2Rβ 효능제 Fc-융합 단백질의 ELISA 결합 분석
2가 Fc-융합 단백질에 대하여, 인간 IL2Rα, 및 인간 IL2Rβ를 각각 웰당 25㎕의 총 부피에서 1X PBS 중 2 ㎍/㎖의 최종 농도에서 384 웰 플레이트에서 고정시켰다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 1시간 동안 웰당 80㎕의 수퍼블록으로 차단하였다. 100nM에서의 정제된 조작된 IL2 돌연변이체 Fc 융합 단백질을 12회 3배 연속 희석하였다. 각 희석을 IL2Rα 또는 IL2Rβ에 나란히 첨가하였다. 1X PBST에서 1:5000에서 희석된 50㎕의 항-인간 Fc HRP를 첨가함으로써 조작된 IL2 돌연변이체 결합을 검출하였다. 각 단계 사이에서, 플레이트를 플레이트 판독기를 이용하여 1X PBST로 3회 세척하였다. 플레이트를 이후에 5분 동안 25㎕의 TMB 기질로 현상하고, 25㎕의 2N 황산을 첨가함으로써 중지시켰다. 플레이트를 OD450㎚ Biotek 플레이트 판독기에서 판독하고, EC50을 Prism 8.1 소프트웨어로 분석하였다. 인간 IL2Rα 및 IL2Rβ에 대해 IL2 농도에 대한 흡광도를 그래프로 나타내었다(도 37a 및 도 37g). ELISA 결합의 EC50 값을 요약하였다(표 17).
Figure pct00017
1가 Fc-융합 단백질에 대해, 재조합 His-태그화 인간 IL2Rα 및 IL2Rβ를 384-웰 플레이트의 웰에 25㎕의 1X PBS 중에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 플레이트를 코팅하였다. 플레이트를 0.05% Tween20/1X PBS로 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 100㎕의 SuperBlock으로 차단하고, 이후에, 0.05% Tween20/1X PBS로 3회 세척하였다. IL2 돌연변이체를 0.05% Tween 20/1X PBS 중에서 1000nM에서 0nM까지 희석시키고, 실온에서 2시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 이후에, 플레이트를 0.05% Tween20/1X PBS로 6회 세척하였다. 항-HisTag-HRP를 0.05% Tween20/1X PBS 중에서 1:5000으로 희석하고, 실온에서 1시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 이후에 0.05% Tween 20/1X PBS로 6회 세척하고, TMB를 첨가하여 청색 칼라를 나타내었다. 반응을 2N 황화수소로 중지시키고, 450㎚에서의 흡광도를 BioTek 플레이트 판독기에서 판독하였다. 인간 IL2Rα 및 IL2Rβ에 대해 IL2 농도에 대한 흡광도를 그래프로 나타내었다(도 38a 및 도 38b). ELISA 결합의 EC50 값을 요약하였다(표 18).
Figure pct00018
실시예 20
1가 IL2Rβ FC 융합 단백질의 결합 동역학
1가 IL2Rβ Fc 융합 단백질의 결합 동역학을 Biacore T200을 구비한 SPR 기술에 의해 분석하였다. 간단하게, 항-hFc 항체를 유세포 1 및 유세포 2 상에 고정시켰다. 각 사이클에 대하여, 1 ㎍/㎖의 IL2 Fc 융합 단백질을 항-hFc 고정화된 칩 상에서 1X HBSP 완충액 중 유세포 2에서 10㎕/분의 유량으로 60초 동안 포획하였다. 100nM IL2Rα-HIS 태그화 또는 IL2Rβ-HIS 태그화를 2배 연속 희석하고, 기준 유세포 1 및 IL2 Fc 융합 단백질 둘 다 상에 주사하고, 이를 30㎕/분의 유량으로 150초 동안 유세포 2에서 포획하였다. 300초 세척을 마지막 주사 후 적용하였다. 검정을 96 웰 포맷에서 8 연속 희석 농도 포인트로 셋업하였다. 동역학 데이터를 Biacore T200 평가 소프트웨어 3.0으로 분석하였다. 특정 결합 반응 단위를 표적 유세포 2로부터 기준 유세포 1에 대한 결합의 차감으로부터 유도하였다(도 39a 내지 도 39d).
실시예 21
IL2Rβ 효능제 Fc-융합 단백질에 의한 인간 PBMC의 P-STAT5 활성화
인간 PBMC를 말초 혈액으로부터 단리시키고, 96-웰 플레이트에서 75㎕의 배지 중에서 250,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 휴지시켰다. 세포를 37℃에서 20분 동안 25㎕에서 4X 농도에서 인간 IL2 WT 및 IL2Rβ 효능제 Fc-융합 단백질로 자극하였다. 자극된 PBMC를 바로 고정, 투과, 세포주 계통 마커(CD3, CD56, CD4, CD8, FOXP3) 및 p-STAT5에 대해 염색하고, Attune 유세포 분석기에서 시각화하였다. CD8+ T 세포를 CD3+CD56-CD4-CD8+로서 규정하였다. NK 세포를 CD3-CD56+로서 규정하였다. T 조절 세포를 CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+로서 규정하였다. p-STAT5+인 세포의 %를 결정하고, 각 IL2 적정에 대해 그래프로 나타내었다(2가 융합 단백질에 대해 도 40a 내지 도 40c, 및 2가 융합 단백질에 대해 도 41a 내지 도 41c; 요약에 대해 표 19 참조).
Figure pct00019
실시예 22
IL2Rβ 효능제 뮤린 생체 내 약동학 분석
C57BL/6 마우스에 200㎕의 염수 중 10㎍의 IL2-WT, EP001, 또는 EP003을 i.v. 또는 i.p. 주사하였다. 혈액을 0분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간, 24시간 및 48시간에 수집하고, 혈장을 분리하기 위해 바로 원심분리하였다. IL2-WT 및 EP001의 혈장 농도를 결정하기 위해, 혈장을 연속적으로 희석하고, Duoset IL2 ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 설명서에 따라 분석하였다. 동일하게 희석된 처리되지 않은 C57BL/6 마우스 혈장에서 제조된 스파이크 대조군과 혈장으로부터의 흡광도 값을 비교함으로써 IL2-WT, EP001, 및 EP001 농도를 결정하였다. IL2 농도를 로그 스케일로 시간에 대해 플롯팅하였다(도 42a 및 도 42b; 표 20).
Figure pct00020
실시예 23
IL2Rβ 효능제 뮤린 생체 내 종양 세포 침윤
7주령 암컷 C57BL/6 마우스의 등 옆구리에 50% 마트리겔 중 100,000개의 MC38 세포를 피하 주사하였다. 종양을 캘리퍼로 측정하였다. 100 ㎣의 평균 부피에 도달 시에, 마우스를 5일 동안 32㎍의 WT IL2, EP001, EP003 또는 EP004 BID로 치료하였다. 6일에, 마우스를 희생시키고, 종양 침윤 면역 세포를 유세포 분석에 의해 분석하였다. 유세포 분석을 위해 사용되는 종야 섹션을 계량하여 정규화된 세포 카운트를 얻었다. CD4+ T 세포를 CD45+CD3+CD49b-CD4+CD8-로서 규정하였다. CD8+ T 세포를 CD45+CD3+CD49b-CD4-CD8+로서 규정하였다. NK 세포를 CD45+CD3-CD49b+로서 규정하였다. T 조절 세포 NK 세포를 CD45+CD3+CD49b-CD4+CD8-FOXP3+로서 규정하였다. 천연 T 세포를 CD44loCD62Lhi로서 규정하였다. 이펙터 T 세포를 CD44hiCD62Llo로서 규정하였으며, 중추 기억 T 세포를 CD44hiCD62Lhi로서 규정하였다. 종양 침윤 면역 세포의 정규화된 카운트(도 43a 내지 도 43d), 이펙터 세포 대 조절 세포 비(도 44a 및 도 44b) 및 T 세포 서브타입(도 45a 내지 도 45c)을 IL2 클론 치료군에 대해 그래프로 나타내었다.
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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence IL2Rbeta agonist-Fc fusion <220> <221> VARIANT <222> 81, 83, 86, 88, 92, 93 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 82, 84, 90 <223> Xaa = Any uncharged amino acid <220> <221> VARIANT <222> 85, 87, 89, 91 <223> Xaa = any uncharged, nonpolar residue <400> 43 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 130 135 140 Pro Leu 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EP008-Fc fusion, EP086 <400> 45 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Glu 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Lys Trp Gly Asp Ala Val Ser Asn Ala Arg Val Leu Ala Gly Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Arg Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 130 135 140 Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 145 150 155 160 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 165 170 175 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 180 185 190 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 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Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His His 130 135 140 <210> 171 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 171 aactacaaga accccnnsct gaccnnsatg ctgaccttca agttctacat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 172 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 172 aactacaaga accccnnsct gacccggatg ctgaccnnsa agttctacat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 173 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 173 aactacaaga accccnnsct gacccggatg ctgaccttca agttcnnsat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 174 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 174 aactacaaga accccaagct gaccnnsatg ctgaccnnsa agttctacat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 175 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 175 aactacaaga accccaagct gaccnnsatg ctgaccttca agttcnnsat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 176 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 176 aactacaaga accccaagct gacccggatg ctgaccnnsa agttcnnsat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 177 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 177 aactacaaga accccnnsct gaccnnsatg ctgaccnnsa agttctacat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 178 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 178 aactacaaga accccnnsct gacccggatg ctgaccnnsa agttcnnsat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 179 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)...(66) <223> n = A,T,C or G <400> 179 aactacaaga accccaagct gaccnnsatg ctgaccnnsa agttcnnsat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 180 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 180 aactacaaga accccaagct gacccggatg ctgaccgcca agttctacat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 181 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 181 aactacaaga accccaagct gacccggatg ctgaccgcca agttctacat gcctaagaag 60 gccacc 66 <210> 182 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 182 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr 1 5 10 <210> 183 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 183 Pro Val Leu Thr Arg Met Leu Thr Ile Lys Phe Tyr 1 5 10 <210> 184 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 184 Pro 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 191 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr His Lys Phe Val 1 5 10 <210> 192 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 192 Pro Cys Leu Thr Asp Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr 1 5 10 <210> 193 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 193 Pro Leu Leu Thr Asp Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr 1 5 10 <210> 194 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 194 Pro Leu Leu Thr Asp Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr 1 5 10 <210> 195 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 195 Pro Lys Leu Thr Asp Met Leu Thr Phe Lys Phe Ser 1 5 10 <210> 196 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 196 Pro Lys Leu Thr Tyr Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr 1 5 10 <210> 197 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 197 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr 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Claims (120)

  1. 하기 서열번호 1을 포함하는 조작된 IL2 수용체 β(IL2Rβ) 결합 영역 2 모티프를 포함하는 조작된 인터류킨-2(IL2) 폴리펩타이드로서,
    상기 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2보다 적어도 10배 더 큰 KD로 IL2Rβ에 결합하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드:13 (서열번호 1)
    X1-X2-X3-D-X4-X5-X6-N-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13 (서열번호 1)
    상기 서열 중, X1, X3, X6, X8, X12 및 X13은 각각 임의의 잔기를 포함하고,
    X2, X4 및 X10은 하전되지 않은 잔기이고,
    X5, X7, X9 및 X11은 각각 하전되지 않은, 비극성 잔기이다.
  2. 제1항에 있어서, X1이 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X1이 C, T, G, W, I, S, E 및 K로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X1이 G, K, E, C 및 T로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 하전되지 않은 극성 잔기 또는 하전되지 않은 비극성 잔기인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 Y, P, V, W, L, A 및 G로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 V, P, W 및 A로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 S, T, Q, G, M, E, R 및 K로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, X3이 T, G, S, R 및 E로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, X4가 L이 아닌, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X4가 하전되지 않은 비극성 잔기 또는 하전되지 않은 극성 잔기인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, X4가 A, V, S 및 T로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, X5가 I, L, T 및 V로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, X5가 I 및 V로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, X6이 하전되지 않은 극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, X6이 S, T, E, D 및 R로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, X6이 S, D, E 및 T로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, X7이 I, A, M 및 V로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, X7이 I, A 및 M으로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, X8이 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 염기성 잔기, 또는 산성 잔기인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, X8이 S, T, N, Q, I, G, E, K 및 R로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, X8이 I, R, N 및 T로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, X9가 V, L 및 I로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, X9가 V인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, X10이 하전되지 않은 극성 잔기 또는 하전되지 않은 비극성 잔기인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, X10이 N, T, I 및 L로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, X10이 I 및 L로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, X11이 V, A 및 I로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, X12가 하전되지 않은 극성 잔기, 하전되지 않은 비극성 잔기, 또는 산성 잔기인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, X12가 Q, L, G, K 및 R로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, X12가 R, G, Q 및 K로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, X13이 하전되지 않은 비극성 잔기 또는 염기성 잔기인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, X13이 A, D 및 E로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, X13이 E 및 A로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  36. 제1항에 있어서, 상기 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2가 GVTDSISNAIVLARE(서열번호 2); KWGDAVSNARVLAGE(서열번호 3); KWGDAVSNARVLAGA(서열번호 4); TLMDTTDNIGVLVRE(서열번호 5); EPSDVISNINVLVQE(서열번호 6); SPQDSIENISVLVRE(서열번호 7); WASDSIENITLLIQE(서열번호 8); CPTDTIENITVLIQE(서열번호 9); RYKDSLENMQIIIQE(서열번호 10); TARDAVDNMRVIIQE(서열번호 11); TPRDVVENMNVLVLE(서열번호 12); TPSDVIENMEVLILD(서열번호 13); TPSDAIENINVLIRE(서열번호 14); TPSDVIENITVLVQE(서열번호 15); GVGDTIDNINVLVKE(서열번호 16); IGRDSIDNIKVIVQE(서열번호 17); WATDTIRNVEVLVQE(서열번호 18); TAEDVVTNITVLVQE(서열번호 19); TAEDVISNIRVNVQE(서열번호 20); 및 TPSDVIDNVSITVQE(서열번호 21); TARDAISNIRVIVQE(서열번호 210); RARDAIDNIRVIVQE(서열번호 211); TPRDAIDNINVIIQE(서열번호 212); TPRDAIDNIRVIVQE(서열번호 213); TPRDAIDNIRVIILE(서열번호 214); TARDAISNINVIIQE(서열번호 215); 및 TARDAIDNINVIVQE(서열번호 216); 및 TARDAIDNIRVIVLE(서열번호 217)로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  37. 제1항에 있어서, 상기 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2가 TPRDAIDNIRVIVQE(서열번호 213); TPRDAIDNIRVIILE(서열번호 214); TARDAISNINVIIQE(서열번호 215); 및 TARDAIDNINVIVQE(서열번호 216)로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  38. 제1항에 있어서, 상기 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2가 GVTDSISNAIVLARE(서열번호 2); KWGDAVSNARVLAGA(서열번호 4); EPSDVISNINVLVQE(서열번호 6); CPTDTIENITVLIQE(서열번호 9); TARDAVDNMRVIIQE(서열번호 11); GVGDTIDNINVLVKE(서열번호 16); TAEDVVTNITVLVQE(서열번호 19)로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  39. 제1항에 있어서, 상기 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2가 GVTDSISNAIVLARE(서열번호 2); CPTDTIENITVLIQE(서열번호 9); 및 TARDAVDNMRVIIQE(서열번호 11)로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  40. R81, P82, R83, L85, I86, S87, I89, N90, I92, V93 및 L94로부터 선택된 적어도 하나의 잔기에 대한 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  41. 제40항에 있어서, 상기 적어도 하나의 잔기가 L85인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  42. 제40항에 있어서, R81, P82, R83, L85, I86, S87, I89, N90, I92, V93 및 L94로부터 선택된 적어도 2개의 잔기에 대한 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  43. 제42항에 있어서, R81 및 L85에 대한 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  44. 제43항에 있어서, S87, N90 및 L94에 대한 치환을 추가로 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  45. 제43항에 있어서, S87, N90 및 V93에 대한 치환을 추가로 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  46. 제43항에 있어서, P82 및 V93에 대한 치환을 추가로 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  47. 제46항에 있어서, N90에 대한 치환을 추가로 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  48. 제42항에 있어서, 상기 적어도 2개의 잔기가 R81, R83, L85, I92 및 L94로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  49. 제40항에 있어서, R81, R83, L85, I92 및 L94로부터 선택된 적어도 3개의 잔기에 대한 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  50. 제40항에 있어서, R81, R83, L85, I92 및 L94에 대한 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  51. 제40항에 있어서,
    (a) 상기 R81 치환이 R81G, R81K, R81E, R81C 및 R81T로부터 선택되고;
    (b) 상기 R83 치환이 R83T, R83G, R83S 및 R83E로부터 선택되고;
    (c) 상기 L85 치환이 L85S, L85A, L85V 및 L85T로부터 선택되고;
    (d) 상기 I92 치환이 I92L이고; 그리고
    (e) 상기 L94 치환이 L94R, L94G, L94Q 및 L94K로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 IL2 폴리펩타이드가 상기 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rβ에 대한 증가된 친화력을 갖는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  53. 제52항에 있어서, 상기 조작된 IL2 폴리펩타이드가 상기 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rβ에 대해 10배 증가된 친화력을 갖는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 IL2 폴리펩타이드가 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rα에 대해 감소된 친화력을 갖는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 IL2 폴리펩타이드가 야생형 IL2와 비교하여 IL2Rα에 대해 유사한 친화력을 갖는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  56. 위치 K35에서의 치환, R38에서의 치환, F42에서의 치환, Y45에서의 치환, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 치환을 포함하는 조작된 IL2 수용체 α(IL2Rα) 결합 영역 1을 포함하는 조작된 인터류킨-2(IL2) 폴리펩타이드로서, 상기 조작된 IL2 폴리펩타이드는 야생형 IL2와 비교하여 적어도 2배 감소된 결합 동역학으로 IL2Rα에 결합하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  57. 제56항에 있어서, 위치 K35에서의 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  58. 제57항에 있어서, 상기 위치 K35에서의 치환이 비-염기성 잔기를 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  59. 제57항에 있어서, 상기 위치 K35에서의 치환이 하전되지 않은 잔기 또는 산성 잔기를 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  60. 제57항에 있어서, 상기 위치 K35에서의 치환이 K35G, K35L, K35S, K35V, K35D, K35E 및 K35C로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 R38에서의 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  62. 제61항에 있어서, 상기 위치 R38에서의 치환이 비-염기성 하전된 잔기를 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  63. 제61항에 있어서, 상기 위치 R38에서의 치환이 하전되지 않은 잔기 또는 산성 잔기를 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  64. 제61항에 있어서, 상기 위치 R38에서의 치환이 R38V, R38D, R38E, R38S, R38I, R38A, R38Y, R38G, R38C 또는 R38N으로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  65. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 F42에서의 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  66. 제65항에 있어서, 상기 위치 F42에서의 치환이 하전되지 않은 잔기를 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  67. 제65항에 있어서, 상기 위치 F42에서의 치환이 양으로 하전된 잔기를 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  68. 제65항에 있어서, 상기 위치 F42에서의 치환이 F42A, F42R, F42G, F42I, F42L, F42P 및 F42H로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  69. 제56항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 Y45에서의 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  70. 제69항에 있어서, 상기 Y45에서의 치환이 하전되지 않은 잔기를 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  71. 제69항에 있어서, 상기 위치 Y45에서의 치환이 하전되지 않은 극성 잔기 또는 하전되지 않은 비극성 잔기를 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  72. 제69항에 있어서, 상기 위치 Y45에서의 치환이 Y45S, Y45P, Y45A, Y45V, Y45C, Y45T 및 Y45F인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  73. 제56항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 K35에서의 치환 및 위치 R38에서의 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  74. 제73항에 있어서, K35G 치환 및 R38E 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  75. 제56항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 K35에서의 치환 및 위치 F42에서의 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  76. 제75항에 있어서, K35S 치환 및 F42G 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  77. 제56항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 K35에서의 치환, 위치 R38에서의 치환, 및 위치 F42에서의 위치를 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  78. 제77항에 있어서, K35L 치환, R38D 치환 및 F42R 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  79. 제56항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 R38에서의 치환 및 위치 Y45S에서의 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  80. 제79항에 있어서, R38D 치환 및 Y45S 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  81. 제79항에 있어서, R38V 치환 및 Y45S 치환을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  82. 제56항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 K35, R38, F42 및 Y45 중 적어도 하나에서 치환을 포함하되,
    i) 상기 위치 K35에서의 치환은 K35G, K35L, K35S, K35V, K35D, K35E 및 K35C로부터 선택되고;
    ii) 상기 위치 R38에서의 치환은 R38V, R38D, R38E, R38S, R38I, R38A, R38Y, R38G, R38C 또는 R38N으로부터 선택되고;
    iii) 상기 위치 F42에서의 치환은 F42A, F42R, F42G, F42I, F42L, F42P 및 F42H로부터 선택되고; 그리고
    iv) 상기 위치 Y45에서의 치환은 Y45S, Y45P, Y45A, Y45V, Y45C, Y45T 및 Y45F인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  83. 제82항에 있어서, 상기 치환이 위치 K35, R38, F42 및 Y45 중 적어도 2, 적어도 3, 또는 4개 모두인, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  84. 제56항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 IL2 폴리펩타이드가 야생형 IL2와 비교하여 적어도 10배 감소된 결합 동역학으로 IL2Rα에 결합하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  85. 제56항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 IL2Rα 결합 영역 1이 PVLTRMLTIKFY(서열번호 183); PKLTRMLTLKFP(서열번호 184); PDLTSMLAFKFY(서열번호 185); PGLTEMLTFKFY(서열번호 186); PSLTRMLTGKFY(서열번호 187); PELTIMLTPKFY(서열번호 188); PCLTAMLTLKFA(서열번호 189); PCLTAMLTLKFA(서열번호 190); PKLTRMLTHKFV(서열번호 191); PCLTDMLTFKFY(서열번호 192); PLLTDMLTRKFY(서열번호 193); PLLTDMLTFKFY(서열번호 194); PKLTDMLTFKFS(서열번호 195); PKLTYMLTRKFY(서열번호 196); PKLTRMLTFKFC(서열번호 197); PKLTSMLTFKFS(서열번호 198); PKLTSMLTFKFS(서열번호 199); PKLTYMLTFKFS(서열번호 200); PKLTYMLTFKFS(서열번호 201); PKLTGMLTFKFS(서열번호 202); PKLTVMLTFKFT(서열번호 203); PKLTVMLTFKFS(서열번호 204); PKLTVMLTFKFP(서열번호 205); PKLTVMLTFKFF(서열번호 206); PKLTCMLTFKFA(서열번호 207); PKLTNMLTFKFA(서열번호 208); 및 PKLTNMLTFKFS(서열번호 209)로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  86. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항의 상기 조작된 IL2 수용체 β(IL2Rβ) 결합 영역 2 및 제56항 내지 제85항 중 어느 한 항의 상기 조작된 IL2 수용체 α(IL2Rα) 결합 영역 1을 포함하는, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  87. 제86항에 있어서, 상기 조작된 IL2Rα 결합 영역 1이 PVLTRMLTIKFY(서열번호 183); PKLTRMLTLKFP(서열번호 184); PDLTSMLAFKFY(서열번호 185); PGLTEMLTFKFY(서열번호 186); PSLTRMLTGKFY(서열번호 187); PELTIMLTPKFY(서열번호 188); PCLTAMLTLKFA(서열번호 189); PCLTAMLTLKFA(서열번호 190); PKLTRMLTHKFV(서열번호 191); PCLTDMLTFKFY(서열번호 192); PLLTDMLTRKFY(서열번호 193); PLLTDMLTFKFY(서열번호 194); PKLTDMLTFKFS(서열번호 195); PKLTYMLTRKFY(서열번호 196); PKLTRMLTFKFC(서열번호 197); PKLTSMLTFKFS(서열번호 198); PKLTSMLTFKFS(서열번호 199); PKLTYMLTFKFS(서열번호 200); PKLTYMLTFKFS(서열번호 201); PKLTGMLTFKFS(서열번호 202); PKLTVMLTFKFT(서열번호 203); PKLTVMLTFKFS(서열번호 204); PKLTVMLTFKFP(서열번호 205); PKLTVMLTFKFF(서열번호 206); PKLTCMLTFKFA(서열번호 207); PKLTNMLTFKFA(서열번호 208); 및 PKLTNMLTFKFS(서열번호 209)로부터 선택되고; 그리고
    상기 조작된 IL2Rβ 결합 영역 2가 GVTDSISNAIVLARE(서열번호 2); KWGDAVSNARVLAGE(서열번호 3); KWGDAVSNARVLAGA(서열번호 4); TLMDTTDNIGVLVRE(서열번호 5); EPSDVISNINVLVQE(서열번호 6); SPQDSIENISVLVRE(서열번호 7); WASDSIENITLLIQE(서열번호 8); CPTDTIENITVLIQE(서열번호 9); RYKDSLENMQIIIQE(서열번호 10); TARDAVDNMRVIIQE(서열번호 11); TPRDVVENMNVLVLE(서열번호 12); TPSDVIENMEVLILD(서열번호 13); TPSDAIENINVLIRE(서열번호 14); TPSDVIENITVLVQE(서열번호 15); GVGDTIDNINVLVKE(서열번호 16); IGRDSIDNIKVIVQE(서열번호 17); WATDTIRNVEVLVQE(서열번호 18); TAEDVVTNITVLVQE(서열번호 19); TAEDVISNIRVNVQE(서열번호 20); 및 TPSDVIDNVSITVQE(서열번호 21); TARDAISNIRVIVQE(서열번호 210); RARDAIDNIRVIVQE(서열번호 211); TPRDAIDNINVIIQE(서열번호 212); TPRDAIDNIRVIVQE(서열번호 213); TPRDAIDNIRVIILE(서열번호 214); TARDAISNINVIIQE(서열번호 215); 및 TARDAIDNINVIVQE(서열번호 216); 및 TARDAIDNIRVIVLE(서열번호 217)로부터 선택된, 조작된 IL2 폴리펩타이드.
  88. 반감기 연장 분자에 융합된 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  89. 제88항에 있어서, 상기 반감기 연장 분자가 반감기 연장 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  90. 제88항에 있어서, 상기 반감기 연장 폴리펩타이드가 Fc 도메인, 인간 혈청 알부민(HSA), HSA 결합 분자, 또는 트랜스페린을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  91. 제88항에 있어서, 상기 반감기 연장 폴리펩타이드가 Fc 도메인을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  92. 제88항에 있어서, 상기 반감기 연장 분자가 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  93. 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드로서, 상기 제1 폴리펩타이드는 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  94. 제93항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드가 항원 결합 모이어티를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  95. 제94항에 있어서, 상기 항원 결합 모이어티가 면역글로불린을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  96. 제95항에 있어서, 상기 항원 결합 모이어티가 Fab 분자, scFv, 이중특이 T-세포 결합체, 이중체, 단일 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  97. 제93항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드가 사이토카인을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  98. 제97항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드가 인터류킨 2, 인터류킨-15, 인터류킨-7, 인터류킨-10, 또는 C-C 모티프 케모카인 리간드 19(CCL19)를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  99. 제93항에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드가 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 제2 조작된 IL2 폴리펩타이드를 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  101. 제100항의 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  102. 제100항의 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 제101항의 상기 발현 벡터를 포함하는 변형된 세포.
  103. 제102항에 있어서, 조작된 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 추가로 포함하는 변형된 세포.
  104. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 상기 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 상기 융합 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  105. 면역 반응 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  106. 제105항에 있어서, 상기 면역 반응의 조절이 이펙터 T 세포 활성의 향상, NK 세포 활성의 향상 및 조절 T 세포 활성의 억제 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  107. 질환 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  108. 질환이 암 또는 면역억제를 포함하는, 제107항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  109. 암이 유방암, 췌장암, 폐암, 교모세포종, 신세포 암종, 또는 흑색종을 포함하는, 제108항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  110. 대상체가 추가 치료제로 치료되는, 제107 내지 제109항 중 어느 한 항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  111. 추가 치료제가 항원 결합 모이어티를 포함하는, 제110항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  112. 항원 결합 모이어티가 단일 도메인 항체, Fab 분자, scFv, 이중체, 나노바디, 이중특이 T 세포 결합체, 또는 면역글로불린을 포함하는, 제111항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  113. 항원 결합 모이어티가 종양 항원으로 유도되는, 제111 또는 제112항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  114. 추가 치료제가 키메라 항원 수용체를 발현시키는 면역 세포, 조작된 T 세포 수용체를 발현시키는 면역 세포, 또는 종양 침윤 림프구를 포함하는, 제110항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  115. 면역 세포가 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 상기 조작된 IL2 폴리펩타이드, 또는 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 상기 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 제114항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  116. 추가 치료제가 면역 관문 저해제를 포함하는, 제110항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  117. 관문 저해제가 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, TIM3 저해제, LAG3 저해제, B7-H2 저해제 또는 B7-H3 저해제를 포함하는, 제116항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  118. 추가 치료제가 종양 용해성 바이러스를 포함하는, 제110항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  119. 추가 치료제가 종양 미세환경(tumor microenvironment: TME) 저해제를 포함하는, 제110항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
  120. 추가 치료제가 암 백신을 포함하는, 제110항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조작된 IL2 폴리펩타이드, 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드 또는 제104항의 약제학적 조성물.
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