CN114787182A - 工程化的白细胞介素-2受体β激动剂 - Google Patents

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Abstract

本文提供了工程化的IL2多肽及其融合蛋白。还提供了通过施用工程化的IL2多肽或其融合蛋白来调节免疫反应的方法。工程化的IL2多肽及其融合蛋白显示与IL2Rβ的结合增加，与IL2Rα的结合减少，或两者。

Description

工程化的白细胞介素-2受体β激动剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年8月13日提交的美国临时申请第62/886,148的优先权的权益，所述临时申请据此通过引用以其整体并入。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并据此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称是300096_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文件为230KB，创建于2020年8月13日，并正通过EFS网以电子方式提交。
技术背景
白细胞介素-2(IL2)是调节淋巴细胞增殖和活化的细胞因子。它具有133个氨基酸的长度，结构包括四个反平行的两亲性C-螺旋。IL2通过与IL2受体(IL2R)结合介导其作用，所述受体包括多达三个单独的亚单位。所有三个亚单位(白细胞介素-2受体α链(IL2Rα，或CD25)、白细胞介素-2受体β链(IL2Rβ，或CD122)和白细胞介素-2受体γ链(IL2Rγ，或CD132))的缔合产生了三聚体IL2Rαβγ，其为IL2的高亲和力受体。IL2Rβ与IL2Rγ亚单位的缔合产生二聚体受体IL2Rβγ，并被称为中间亲和力IL2R。IL2Rα亚单位形成单体低亲和力IL2受体。IL2Rα的表达参与免疫抑制调节性T细胞(Treg)的扩增；而二聚体IL2Rβγ在IL2Rα不存在的情况下可导致细胞裂解性CD8+T细胞和NK细胞增殖和杀伤。
发明内容
本公开提供了与野生型IL2相比具有改善的与IL2Rβ的结合和/或与野生型IL2相比具有减少的与IL2Rα的结合的工程化的IL2多肽。
一方面，本公开提供了包含工程化的IL2受体β(IL2Rβ)结合区2的工程化的白细胞介素-2(IL2)多肽，所述工程化的IL2受体β(IL2Rβ)结合区2包含：X1-X2-X3-D-X4-X-5-X6-N-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13(SEQ ID NO:1)，
其中X1、X3、X6、X8、X12和X13各自包含任何残基，
其中X2、X4和X10是不带电荷的残基，
其中X5、X7、X9和X11各自包含不带电荷的非极性残基，并且
其中工程化的IL2多肽以比野生型IL2多肽大至少10倍的KD与IL2Rβ结合。
在某些方面，X1是不带电荷的极性残基、不带电荷的非极性残基、碱性残基或酸性残基；X1选自C、T、G、W、I、S、E和K；或者，X1选自G、K、E、C和T。在某些方面，X2是不带电荷的极性残基或不带电荷的非极性残基；X2选自Y、P、V、W、L、A和G；或者X2选自V、P、W和A。在某些方面，X3是不带电的极性残基、不带电的非极性残基、碱性残基或酸性残基；X3选自S、T、Q、G、M、E、R和K；或者X3选自T、G、S、R和E。在某些方面，X4不是L；X4是不带电的非极性残基或不带电的极性残基；或者X4选自A、V、S和T。在某些方面，X5选自I、L、T和V；或者X5选自I和V。在某些方面，X6是不带电荷的极性残基、碱性残基或酸性残基；X6选自S、T、E、D和R；或者X6选自S、D、E和T。在某些方面，X7选自I、A、M和V；或X7选自I、A和M。在某些方面，X8是不带电的极性残基、不带电的非极性残基、碱性残基或酸性残基；X8选自S、T、N、Q、I、G、E、K和R；或者X8选自I、R、N和T。在某些方面，X9选自V、L和I；或者X9是V。在某些方面，X10是不带电的极性残基或不带电的非极性残基；X10选自N、T、I和L；或者X10选自I和L。在某些方面，X11是不带电的非极性残基；或者X11选自V、A和I。在某些实施方案中，X12是不带电的极性残基、不带电的非极性残基或酸性残基；X12选自Q、L、G、K和R；或者X12选自R、G、Q和K。在某些方面，X13是不带电的非极性残基或碱性残基；X13选自A、D和E；或者X13选自E和A。
在一些方面，本公开提供了工程化的IL2多肽，其包含对至少一个选自以下的残基的取代：R81、P82、R83、L85、I86、S87、I89、N90、I92、V93和L94。在某些方面，R81取代选自R81G、R81K、R81E、R81C和R81T；R83取代选自R83T、R83G、R83S和R83E；L85取代选自L85S、L85A、L85V和L85T；I92取代为I92L；L94取代选自L94R、L94G、L94Q和L94K。在某些方面，工程化的IL2多肽包含对R81和L83的取代。在某些方面，工程化的IL2多肽包含对R81、L83、S87、N90和N94的取代；对R81、L83、S87、N90和V93的取代；对R81、L83、P82和V93的取代；或对R81、L83和N90的取代。
一方面，本公开提供了工程化的白细胞介素-2(IL2)多肽，其包含工程化的IL2受体α(IL2Rα)结合区1基序，所述基序包含选自以下的取代：位置K35处的取代、R38处的取代、F42处的取代、Y45处的取代或其组合，其中与野生型IL2相比，工程化的IL2多肽以至少2倍降低的结合动力学与IL2Rα结合。
在一些方面，本公开提供了括如前所述的工程化的IL2受体β(IL2Rβ)结合区2和如前所述的工程化的IL2受体α(IL2Rα)结合区1在内的工程化的IL2多肽。
在一些方面，本公开提供了如本文提供的与半衰期延长分子融合的工程化的IL2多肽。
在一些方面，本公开提供了包含第一多肽和第二多肽的融合多肽，其中第一多肽包含如本文提供的工程化的IL2多肽。
在一些方面，本公开提供了编码工程化的IL2多肽或其融合多肽的分离的多核苷酸、包含所述分离的多核苷酸的表达载体、或包含所述分离的多核苷酸或表达载体的经修饰的细胞。
在一些方面，本公开提供了药物组合物，其包含工程化的IL2多肽或其融合多肽以及药学上可接受的载剂。
在一些方面，本公开提供了调节有需要的受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的工程化的IL2多肽或其融合多肽或其药物组合物。在某些方面，调节免疫反应包括以下至少一种：增强效应T细胞活性、增强NK细胞活性和抑制调节性T细胞活性。
在一些方面，本公开提供了治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的工程化的IL2多肽或其融合多肽，或其药物组合物。在某些方面，所述疾病是癌症。在某些方面，所述方法还包括施用另外的治疗剂，诸如抗原结合部分、表达嵌合抗原受体的免疫细胞、表达工程化的T细胞受体的免疫细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒、肿瘤微环境(TME)抑制剂或癌症疫苗。在某些方面，所述方法包括向受试者施用包含编码工程化的IL2多肽或其融合多肽的多核苷酸的免疫细胞。
附图说明
图1A示出了IL2的负责结合IL2Rα(实线空心框)、IL2Rβ(虚线框)和IL2Rγ(灰色框)的区域，图1B示出了与IL2结合的IL2Rα、IL2Rβ和IL2Rγ的图形描述，以及图1C示出了IL2的IL2Rα结合位点，突出显示了对IL2Rα相互作用至关重要的IL2的四个残基(K35、R38、F42和Y45)。
图2A至图2B示出了通过ELISA进行的IL2Rα减少的结合突变的鉴定。
图3示出了通过IL2Rα减少的结合突变的表面等离子共振序列比对来进行的IL2Rα减少的结合突变的表征。
图4示出了通过表面等离子体共振进行的IL2Rα减少的结合突变的表征。
图5示出了IL2Rβ激动剂诱变文库
图6示出了大肠杆菌(E.coli)中的IL2Rβ激动剂表达和与IL2Rβ的结合。
图7示出了通过mRNA展示鉴定的IL2Rβ激动剂的IL2Rβ结合区2的多序列比对。
图8示出了大肠杆菌中产生的IL2Rβ激动剂克隆的SDS分析。
图9A至图9B示出了在SPR中野生型IL2针对IL2Rα(图9A)和IL2Rβ(图9B)的传感图和结合动力学。
图10A至图10H示出了在SPR中大肠杆菌产生的野生型IL2和工程化的IL2Rβ激动剂针对IL2Rα的传感图。图10A示出了野生型IL2的传感图；图10B示出了EP001的传感图；图10C示出了EP004的传感图；图10D示出了EP005的传感图；图10E示出了EP002的传感图；图10F示出了EP03的传感图；图10G示出了EPIM-06的传感图；以及图10H示出了EP007的传感图。
图11A至图11H示出了在SPR中大肠杆菌产生的野生型IL2和工程化的IL2Rβ激动剂针对IL2Rβ的传感图。图11A示出了EP003的传感图；图11B示出了EP005的传感图；图11C示出了E002的传感图；图11D示出了EP001的传感图；图11E示出了EP007的传感图；图11F示出了EP006的传感图；图11G示出了EP004的传感图；以及图11H示出了野生型IL2的传感图。
图12A至图12D示出了在SPR中IL2Rβ与哺乳动物产生的野生型IL2(图12A)以及工程化的IL2Rβ激动剂EP0001(图12B)、EP0003(图12C)和EP004(图12D)结合的传感图。
图13A至图13D示出了在SPR中IL2Rα与哺乳动物产生的野生型IL2(图13A)以及工程化的IL2Rβ激动剂EP001(图13B)、EP003(图13C)和EP004(图13D)结合的传感图。
图14A至图14I示出了按照对CD8+T细胞(图14A针对供血者1，图14D针对供血者2，图14G针对供血者3)、NK细胞(图14B针对供血者1，图14E针对供血者2，图14H针对供血者3)和T regs(图14C针对供血者1，图14F针对供血者2，图14I针对供血者3)进行测量的方式，在用野生型IL2和工程化的IL2Rβ激动剂刺激人PBMC后，从供血者1-3测得的pSTAT5表达。
图15A至图15B示出了通过ELISA进行的IL2Rβ激动剂EP001回复突变克隆的与IL2Rα(图15A)和IL2Rβ(图15B)结合的表征。
图16A至图16H示出了通过SPR获得的IL2Rβ激动剂EP001回复突变克隆的IL2Rβ结合传感图。
图17示出了IL2Rα/IL2Rβ克隆的纯化克隆的SDS-PAGE结果的实例。
图18A至图18H示出了通过SPR获得的工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆与人IL2α的结合传感图。
图19A至图19H示出了通过SPR获得的工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆与人IL2β的结合传感图。
图20A至图20G示出了通过SPR获得的工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆与人IL2Rα的单一浓度结合传感图。
图21A至图21G示出了通过SPR获得的工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆与人IL2Rβ的单一浓度结合传感图。
图22A至图22B示出了通过SPR测量的工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆与人IL2Rα(图22A)和IL2Rβ(图22B)的多浓度结合。
图23A至图23E示出了与人IL2Rα的ELISA结合。图23A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变与人IL2Rα的ELISA结合。图23B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变与人IL2Rα的ELISA结合。图23C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变与人IL2Rα的ELISA结合。图23D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变与人IL2Rα的ELISA结合。图23E示出了选定的工程化的IL2Rβ/IL2Rα克隆的剂量依赖性结合。
图24A至图24D示出了与人IL2Rβ的ELISA结合。图24A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变与人IL2Rβ的ELISA结合。图24B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变与人IL2Rβ的ELISA结合。图24C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变与人IL2Rβ的ELISA结合。图24D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变与人IL2Rβ的ELISA结合。
图25A至图25D示出了通过工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆对来自供体656的人CD8+T细胞的p-STAT5活化。图25A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变的对人CD8+T细胞的p-STAT5活化。图25B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变的对人CD8+T细胞的p-STAT5活化。图25C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变的对人CD8+T细胞的p-STAT5活化。图25D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变的对人CD8+T细胞的p-STAT5活化。
图26A至图26D示出了通过工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆进行的来自供体648的人CD8+T细胞的p-STAT5活化。图26A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变的对人CD8+T细胞的p-STAT5活化。图26B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变的对人CD8+T细胞的p-STAT5活化。图26C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变的对人CD8+T细胞的p-STAT5活化。图26D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变的对人CD8+T细胞的p-STAT5活化。
图27A至图27D示出了通过工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆对来自供体656的人NK细胞的p-STAT5活化。图27A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变的对人NK细胞的p-STAT5活化。图25B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变的对人NK细胞的p-STAT5活化。图27C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变的对人NK细胞的p-STAT5活化。图27D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变的对人NK细胞的p-STAT5活化。
图28A至图28D示出了通过工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆对来自供体648的人NK细胞的p-STAT5活化。图28A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变的对人NK细胞的p-STAT5活化。图28B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变的对人NK细胞的p-STAT5活化。图28C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变的对人NK细胞的p-STAT5活化。图28D示出了对EP260及其IL2Rα结合减少的突变的对人NK细胞的p-STAT5活化。
图29A至图29D示出了通过工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆对来自供体656的人T reg细胞的p-STAT5活化。图29A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变的对人T reg细胞的p-STAT5活化。图29B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变的对人T reg细胞的p-STAT5活化。图29C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变的对人T reg细胞的p-STAT5活化。图29D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变的对人T reg细胞的p-STAT5活化。
图30A至图30D示出了通过工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆对来自供体648的人T reg细胞的p-STAT5活化。图30A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变的对人T reg细胞的p-STAT5活化。图30B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变的对人T reg细胞的p-STAT5活化。图30C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变的对人T reg细胞的p-STAT5活化。图30D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变的对人T reg细胞的p-STAT5活化。
图31A至图31D示出了鼠CD8+T细胞的p-STAT5活化。图31A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠CD8+T细胞的p-STAT5活化。图31B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠CD8+T细胞的p-STAT5活化。图31C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠CD8+T细胞的p-STAT5活化。图31D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠CD8+T细胞的p-STAT5活化。
图32A至图32D示出了鼠NK细胞的p-STAT5活化。图32A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠NK细胞的p-STAT5活化。图32B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠NK细胞的p-STAT5活化。图32C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠NK细胞的p-STAT5活化。图32D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠NK细胞的p-STAT5活化。
图33A至图33D示出了鼠调节性T细胞的p-STAT5活化。图33A示出了EP252及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠调节性T细胞的p-STAT5活化。图33B示出了EP253及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠调节性T细胞的p-STAT5活化。图33C示出了EP258及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠调节性T细胞的p-STAT5活化。图33D示出了EP260及其IL2Rα结合减少的突变的对鼠调节性T细胞的p-STAT5活化。
图34示出了鼠CD8+T细胞、NK细胞和Treg的p-STAT5活化的概述。
图35A至图35C示出了单价和二价IL2Rβ激动剂Fc融合蛋白的结构图解。
图36A至图36B示出了纯化的IL2Rβ激动剂Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析。
图37A至图37G示出了通过二价IL2Rβ激动剂Fc融合蛋白的ELISA进行的受体结合分析。
图38A至图38B示出了通过单价IL2Rβ激动剂Fc融合蛋白的ELISA进行的受体结合分析。
图39A至图39D示出了通过SPR进行的对单价IL2RβFc融合蛋白的受体结合分析。
图40A至图40C示出了二价IL2Rβ激动剂Fc-融合蛋白对人PBMC的p-STAT5活化。
图41A至图41C示出了单价IL2Rβ激动剂Fc-融合蛋白对人PBMC的p-STAT5活化。
图42A至图42B示出了IL2Rβ激动剂的鼠i.v.(图42A)和i.p.(图42B)施用的药代动力学。
图43A至图43D示出了在施用IL2Rβ激动剂后肿瘤浸润免疫细胞的归一化计数。
图44A至图44B示出了肿瘤中效应细胞与调节性T细胞的比率。
图45A至图45C示出了效应T细胞和记忆T细胞的百分比。
具体实施方式
IL2一直是有前景的新免疫疗法，但基于野生型人IL2的疗法除了活化效应T细胞和NK细胞以外，还可活化调节性T细胞。IL2对调节性T细胞的活化可阻碍原本可由IL2引发的抗癌反应。因此，需要基于IL2的疗法，其具有减少的调节性T细胞活化和/或效应T细胞、NK细胞或其组合的优先活化。
本文提供了合理设计的IL2Rβ激动剂，其为在IL2Rβ结合区2中具有增强与IL2Rβ的结合的氨基酸取代的工程化的IL2多肽。与野生型IL2相比，工程化的IL2Rβ激动剂提供了增加对NK细胞和效应T细胞刺激的有利方面，但不能增加对调节性T细胞的刺激。因此，工程化的IL2Rβ激动剂可用于调节或活化免疫反应，例如用于治疗癌症。
除非另有说明，否则本文使用的术语“白细胞介素-2”或“IL2”是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如人或小鼠的IL2。该术语涵盖前体或未加工的IL2，以及由细胞加工产生的任何形式的IL2。该术语还涵盖IL2的天然存在的变体，诸如剪接变体或等位基因变体。示例性成熟人IL2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:65。前体或未加工的人IL2显示于SEQ ID NO:66，并且包括成熟IL2多肽中不存在的20个残基的信号肽。“野生型”或“天然的”在用于IL2时意指成熟的IL2分子(例如，SEQ ID NO:65)。如本文中所用，术语“工程化的IL2”或“工程化的IL2多肽”涵盖具有至少一个与天然或野生型IL2不同的残基的IL2，并包括全长IL2、IL2的截短形式以及IL2与另一分子诸如另一多肽连接或融合的形式。工程化的IL2的各种形式的特征在于具有至少一个影响IL2与IL2Rβ和/或IL2Rα相互作用的氨基酸取代。本文所述的各种工程化形式的IL2的鉴定是根据例如SEQ ID NO:22中所示的序列进行的。本文中可使用各种标识符来表示相同的残基取代。例如，从第81位的精氨酸至苏氨酸的取代可以表示为R81T或81T。
IL2Rβ结合区1和IL2Rβ结合区2负责与IL2Rβ的IL2结合。如本文中所用，“IL2Rβ结合区1”是指野生型或天然人IL2的残基11-23。IL2Rβ结合区1的氨基酸序列提供于SEQ IDNO:67中。如本文中所用，“IL2Rβ结合区2”是指野生型或天然人IL2的残基81-95。IL2Rβ结合区2的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:68中。
IL2Rα结合区1和IL2Rα结合区2负责IL2与IL2Rα的结合。如本文中所用，“IL2Rα结合区1”是指野生型或天然人IL2的残基34-45。IL2Rα结合区1的氨基酸序列提供于SEQ IDNO:223中。
如本文中所用，术语“取代”或“残基取代”是指用不同的残基替换天然或野生型残基。
如本文中所用，“任何残基”是指具有二十个典型氨基酸侧链之一的氨基酸残基：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；谷氨酰胺(Gln，Q)；谷氨酸(Glu，E)；甘氨酸(Gly，G)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys,K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser,S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；和缬氨酸(Val，V)。
如本文中所用，“不带电荷的残基”是指在生理pH(pH＝7)下侧链不带电荷的氨基酸残基。不带电荷的残基是：丙氨酸(Ala，A)；天冬酰胺(Asn，N)；半胱氨酸(Cys，C)；谷氨酰胺(Gln，Q)；甘氨酸(Gly，G)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu,L)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser,S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；和缬氨酸(Val，V)。
如本文中所用，“不带电荷的极性残基”是指具有在生理pH(pH＝7)下不带电荷并且是亲水的侧链的氨基酸残基。不带电荷的极性残基是：天冬酰胺(Asn，N)；半胱氨酸(Cys，C)；谷氨酰胺(Gln，Q)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；和酪氨酸(Tyr，Y)。
如本文中所用，“不带电荷的非极性残基”是指具有在生理pH(pH＝7)下不带电荷并且是疏水性的侧链的氨基酸残基。不带电荷的非极性残基是：丙氨酸(Ala，A)；甘氨酸(Gly，G)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu,L)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；色氨酸(Trp，W)；和缬氨酸(Val，V)。
如本文中所用，“碱性残基”是指在生理pH(pH＝7)下具有带正电荷的侧链的氨基酸残基。碱性残基是赖氨酸(Lys，K)；和精氨酸(Arg，R)。
如本文中所用，“酸性残基”是指在生理pH(pH＝7)下具有带负电荷的侧链的氨基酸残基。酸性残基为天冬氨酸(Asp，D)；和谷氨酸(Glu，E)。
“融合多肽”或“融合蛋白”是指由至少两种不同的对应于基因或其片段的DNA序列编码的多肽，所述多肽不是由同一基因天然表达的。融合多肽的一个实例是工程化的IL2-Fc融合多肽，其包含工程化的IL2多肽的氨基酸序列和Fc结构域的氨基酸序列。
“亲和力”是指分子(例如，受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子-X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表示，该常数是解离和缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，只要速率常数的比率保持不变，等效亲和力可以包括不同的速率常数。亲和力可通过本领域技术人员已知的方法(包括本文中描述的那些方法)进行测量。
如本文中所用，“半衰期延长分子”是指当与第二分子连接(例如，共价连接)时，延长第二分子半衰期的分子。半衰期延长分子的实例包括Fc结构域、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合分子、聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)。
如本文中所用，“Fc结构域”或“Fc区”是指“多肽”是来源于免疫球蛋白重链C端区域的多肽，其包含至少一部分恒定区。该术语包括具有天然序列Fc区的多肽或其变体。尽管IgG重链的Fc区的边界可能略有不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在，也可以不存在。美国专利第7,317,091号、美国专利第8,735,545号、美国专利第7,371,826号、美国专利第7,670,600号和美国专利第9,803,023号(所有专利通过引用以其整体并入)中公开了Fc区的实例。
“人血清白蛋白”或“HSA”是指在人血液中发现的血清白蛋白。常用的HSA形式的分子量为66.5kDa，半衰期约为20天。美国专利第8,143,026号和美国专利第7,189,690号公开了HSA分子的实例，所述专利通过引用以其整体并入。
“HSA结合分子”是指与人血清白蛋白(HSA)的分子，诸如具有HSA结合结合域的抗原结合部分。
“聚乙二醇”或“PEG”，也称为聚环氧乙烷或聚氧乙烯，是可用于延长半衰期的聚醚聚合物。
“聚丙二醇”或“PPG”，也称为聚环氧丙烷，是可用于延长半衰期的丙二醇聚合物。
“抗原结合部分”是指提供与抗原表位相互作用的抗原结合分子(例如，抗体)的位点(即，氨基酸残基)。抗原结合部分可以包括一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。抗原结合部分的实例包括免疫球蛋白、Fab分子、scFv、双特异性抗体、双抗体、双特异性T细胞接合物(bi-specific T-cell engager)和纳米抗体。抗原结合部分的具体实例包括纳武单抗、帕博利珠单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、伊匹木单抗、曲美木单抗(tremelimumab)、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗、乌利妥昔单抗和贝伐珠单抗(bevacizumab)。
“免疫球蛋白”是指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是具有二硫键键合的两条轻链和两条重链的异源四聚糖蛋白。从N末端至C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端至C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入五类中的一类，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚类，例如，γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以被指定为两种类型(称为卡巴(κ)和兰姆达(λ))之一。免疫球蛋白包括通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc结构域。
“Fab分子”或“抗原结合片段”是抗体的抗原结合片段，其包括轻链的可变结构域和恒定结构域，以及重链的可变结构域和CH1结构域。
“单链可变结构域”或“scFv”是指抗原结合部分，其包括重链和轻链的可变区，它们通过接头肽连接。
“双特异性抗体”是指具有两个不同抗原结合位点的人工抗体。双特异性抗体可以指具有两个不同抗原结合位点的全免疫球蛋白，或者可以指具有两个抗原结合部分的其它分子，诸如包含两个Fab或两个scFv的融合蛋白。
“双抗体”是指一类二价且双特异性的抗原结合分子。所述片段包含与同一多肽链(VH-VL)上的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不能允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
“双特异性T细胞接合物”是指一类双特异性抗体，其具有与T细胞结合(例如，通过结合CD3)的第一抗原结合部分和结合不同抗原(例如，肿瘤抗原)的第二抗原结合部分。
“纳米体”或“单结构域抗体”是指由单个单体可变抗体结构域组成的抗原结合部分。
“转铁蛋白”是可用于融合蛋白以延长半衰期的铁转运蛋白。人转铁蛋白在血清中的半衰期为12天。
如本文中所用，“细胞因子”是指一类参与细胞信号传导和免疫调节的小(<25kDa)蛋白质。细胞因子包括，例如，IL2、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-18(IL-18)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)和趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19)。
根据任何上述实施方案的“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，诸如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。优选地，受试者是人。
“调节免疫反应”可包括以下一种或多种：一般性增加、效应T细胞反应(例如，针对肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性)增加、B细胞活化增加、淋巴细胞活化和增殖的恢复、IL2受体表达增加、T细胞反应增加、天然杀伤细胞活性或淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞活性增加、调节性T细胞对其它T细胞的反应减弱等。
“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指可起抑制其它T细胞反应作用的特化类型的CD4+T细胞。Treg细胞表达IL2受体(CD25)的α亚单位和转录因子叉头盒P3(FOXP3)(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))，并参与诱导和维持对抗原(包括肿瘤表达的那些抗原)的外周自身耐受性。Treg细胞的功能、发育以及其抑制特性的诱导需要IL2。
“效应T细胞”是指对刺激物诸如IL2起反应的T细胞群体。效应T细胞包括CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助性T细胞。如本文中所用，效应T细胞不包括调节性T细胞。
“天然杀伤细胞”或“NK细胞”是先天免疫系统的组成部分，并且是在排斥肿瘤和病毒感染的细胞方面起主要作用的细胞毒性淋巴细胞。
“治疗(Treatment)”、“治疗(treating)”或“改善(ameliorating)”是指对受试者(例如，患者)的疾患、疾病或病症的医学管理，其可以是治疗性治疗、预防性(prophylactic)治疗/预防性(preventative)治疗或其组合治疗。
“有效量”或“治疗有效量”可以指提供所需生理变化(诸如，抗癌效果)的治疗剂(例如，本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽)的量。期望的生理变化例如可以是疾病症状的减轻，或者疾病严重性的减轻，或者可以是疾病进展的减缓。关于癌症，期望的生理变化可以包括，例如，肿瘤消退、肿瘤进展速度降低、癌症生物标志物水平降低、与癌症相关的症状减轻、转移的预防或延迟或临床缓解。
“检查点抑制剂”是指降低免疫检查点蛋白活性的剂。检查点抑制剂可以是与免疫检查点蛋白结合并降低其活性的抗原结合部分。免疫检查点蛋白包括，例如，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或CD279)、程序性死亡配体1(PD-L1或CD274)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4或CD152)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM3)、淋巴细胞活化3(LAG3或CD223)、B7-H2(ICOSL或CD275)和B7-H3(CD276)。检查点抑制剂的实例包括伊匹木单抗(抗CTLA-4抗体)、纳武单抗(抗PD-1抗体)和帕博利珠单抗(抗PD-1抗体)。
“癌抗原”是指优先被癌细胞表达的分子。癌抗原的实例包括CD19、CD20、ROR1、成纤维细胞活化蛋白-α和癌胚抗原(CEA)。
“溶瘤病毒”是指优先感染并杀死癌细胞的病毒。例如，溶瘤疱疹病毒已被工程化成缺失ICP34.5，导致病毒只能在癌细胞(不能在健康细胞)中复制。溶瘤病毒的实例是用于治疗黑色素瘤的拉他莫基(Talimogene laherparepvec)。
“癌症疫苗”是指向免疫系统呈现癌症表位以引发免疫系统抗癌反应的疫苗。例如，sipuleucel-T是针对转移性前列腺癌的疫苗，其靶向针对前列腺癌抗原前列腺酸性磷酸酶(PAP)的免疫反应。
“嵌合抗原受体”或“CAR”是工程化的抗原结合受体，当在某些类型的免疫细胞中表达时，在抗原结合时活化免疫细胞。CAR通常包含含有抗原结合部分(例如，scFv)的胞外结构域、跨膜结构域和胞内免疫信号传导结构域(例如，包括来自CD3ζ、4-1BB和/或CD28的信号传导结构域)。CAR可由例如T细胞或NK细胞表达，并且可以包括靶向癌抗原诸如CD19或ROR1的抗原结合部分。
“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”是指被从肿瘤组织中分离出来，在体外对其进行操作(例如，使用细胞因子诸如白细胞介素-2进行刺激)，然后回输到患者体内，使得活化的TIL返回肿瘤部位并诱导肿瘤消退的淋巴细胞。
“肿瘤微环境抑制剂”是指抑制一种或多种促进肿瘤生长并存在于肿瘤周围局部环境中的条件或细胞类型的剂。例如，贝伐单抗可以通过减少肿瘤微环境中的血管生成来抑制肿瘤微环境。
在本说明书中，除非另有说明，否则术语“约”意指±所指示的范围、值或结构的20％。术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制到指定的材料或步骤，以及那些实质上不影响要求保护的本发明的基本和新颖特征的材料或步骤。应当理解，如本文中所用，术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”是指列举的组分中的“一个/种或多个/种”。替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文中所用，术语“包括”和“具有”用作同义词，所述术语及其变化形式体旨在解释为非限制性的。术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整体、步骤或组件的存在，但是其不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、组件或其组的存在或添加。
本公开中使用的重组DNA、分子克隆和基因表达技术是本领域已知的，并描述于参考文献，诸如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版，ColdSpring Harbor Laboratory,New York,2001和Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley和Sons,Baltimore,MD,1999中。
工程化的白细胞介素-2多肽
如上所述，本公开的IL2多肽包括具有工程化的IL2受体β(IL2Rβ)结合区2的IL2Rβ激动剂。在一些实施方案中，结合区2包含：
X1-X2-X3-D-X4-X5-X6-N-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13(SEQ ID NO:1)，
其中X1、X3、X6、X8、X12和X13各自包含任何残基，
其中X2、X4和X10是不带电荷的残基，以及
其中X5、X7、X9和X11各自包含不带电荷的非极性残基。
例如，在一些实施方案中，工程化的IL2多肽具有氨基酸序列：APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLX1X2X3DX4X5X6NX7X8X9X10X11X12X13LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:22)，
其中X1、X3、X6、X8、X12和X13各自包含任何残基，
其中X2、X4和X10是不带电荷的残基，以及
其中X5、X7、X9和X11各自包含不带电荷的非极性残基。
在某些实施方案中，X1是不带电荷的极性残基、不带电荷的非极性残基、碱性残基或酸性残基。在一些实施方案中，X1选自C、T、G、W、I、S、E和K。在一些实施方案中，X1选自G、K、E、C和T。在某些实施方案中，X2是不带电荷的极性残基或不带电荷的非极性残基。在一些实施方案中，X2选自Y、P、V、W、L、A和G。在一些实施方案中，X2选自V、P、W和A。在某些实施方案中，X3是不带电荷的极性残基、不带电荷的非极性残基、碱性残基或酸性残基。在一些实施方案中，X3选自S、T、Q、G、M、E、R和K。在一些实施方案中，X3选自T、G、S、R和E。在某些实施方案中，X4不是L。在一些实施方案中，X4是不带电荷的非极性残基或不带电荷的极性残基。在某些实施方案中，X4选自A、V、S和T。在某些实施例中，X5选自I、L、T和V。在一些实施例中，X5选自I和V。在某些实施例中，X6是不带电的极性残基、碱性残基或酸性残基。在某些实施方案中，X6选自S、T、E、D和R。在一些实施方案中，X6选自S、D、E和T。在某些实施方案中，X7选自I、A、M和V。在一些实施方案中，X7选自I、A和M。在某些实施方案中，X8是不带电的极性残基、不带电的非极性残基、碱性残基或酸性残基。在一些实施方案中，X8选自S、T、N、Q、I、G、E、K和R。在一些实施方案中，X8选自I、R、N和T。在某些实施方案中，X9选自V、L和I。在一些实施方案中，X9是V。在某些实施方案中，X10是不带电荷的极性残基或不带电荷的非极性残基。在一些实施方案中，X10选自N、T、I和L。在一些实施方案中，X10选自I和L。在某些实施方案中，X11选自V、A和I。在某些实施方案中，X12是不带电荷的极性残基、不带电荷的非极性残基或酸性残基。在一些实施方案中，X12选自Q、L、G、K和R。在一些实施方案中，X12选自R、G、Q和K。在某些实施方案中，X13是不带电荷的非极性残基或碱性残基。在一些实施方案中，X13选自A、D和E。在一些实施例中，X13选自E和A。
在一些实施方案中，IL2Rβ结合区2选自：GVTDSISNAIVLARE(SEQ ID NO:2)；KWGDAVSNARVLAGE(SEQ ID NO:3)；KWGDAVSNARVLAGA(SEQ ID NO:4)；TLMDTTDNIGVLVRE(SEQID NO:5)；EPSDVISNINVLVQE(SEQ ID NO:6)；SPQDSIENISVLVRE(SEQ ID NO:7)；WASDSIENITLLIQE(SEQ ID NO:8)；CPTDTIENITVLIQE(SEQ ID NO:9)；RYKDSLENMQIIIQE(SEQID NO:10)；TARDAVDNMRVIIQE(SEQ ID NO:11)；TPRDVVENMNVLVLE(SEQ ID NO:12)；TPSDVIENMEVLILD(SEQ ID NO:13)；TPSDAIENINVLIRE(SEQ ID NO:14)；TPSDVIENITVLVQE(SEQ ID NO:15)；GVGDTIDNINVLVKE(SEQ ID NO:16)；IGRDSIDNIKVIVQE(SEQ ID NO:17)；WATDTIRNVEVLVQE(SEQ ID NO:18)；TAEDVVTNITVLVQE(SEQ ID NO:19)；TAEDVISNIRVNVQE(SEQ ID NO:20)；TPSDVIDNVSITVQE(SEQ ID NO:21)；TARDAISNIRVIVQE(SEQ ID NO:210)；RARDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:211)；TPRDAIDNINVIIQE(SEQ ID NO:212)；TPRDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:213)；TPRDAIDNIRVIILE(SEQ ID NO:214)；TARDAISNINVIIQE(SEQ ID NO:215)；和TARDAIDNINVIVQE(SEQ ID NO:216)；和TARDAIDNIRVIVLE(SEQ ID NO:217)。
在一些实施方案中，工程化的IL2Rβ结合区2选自：TPRDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:213)；TPRDAIDNIRVIILE(SEQ ID NO:214)；TARDAISNINVIIQE(SEQ ID NO:215)和TARDAIDNINVIVQE(SEQ ID NO:216)。
在一些实施方案中，工程化的IL2Rβ结合区2选自：GVTDSISNAIVLARE(SEQ ID NO:2)；KWGDAVSNARVLAGA(SEQ ID NO:4)；EPSDVISNINVLVQE(SEQ ID NO:6)；CPTDTIENITVLIQE(SEQ ID NO:9)；TARDAVDNMRVIIQE(SEQ ID NO:11)；GVGDTIDNINVLVKE(SEQ ID NO:16)；TAEDVVTNITVLVQE(SEQ ID NO:19)。
在一些实施方案中，工程化的IL2Rβ结合区2选自：GVTDSISNAIVLARE(SEQ ID NO:2)；CPTDTIENITVLIQE(SEQ ID NO:9)和TARDAVDNMRVIIQE(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽具有SEQ ID NO:23-42中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的IL2Rβ激动剂包括工程化的IL2多肽，其相对于SEQID NO:65包含对选自以下的至少一个残基的取代：R81、P82、R83、L85、I86、S87、I89、N90、I92、V93和L94。在某些实施方案中，至少一个取代是对残基L85的取代。在某些实施方案中，IL2多肽包含对选自以下的至少两个残基的取代：R81、P82、R83、L85、I86、S87、I89、N90、I92、V93和L94。在一些实施方案中，至少两个残基选自R81、R83、L85、I92和L94。在一些实施方案中，IL2多肽包含对选自R81、R83、L85、I92和L94的至少三个残基的取代。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽包含对R81、R83、L85、I92和L94的取代。在一些实施方案中，R81取代选自R81G、R81K、R81E、R81C和R81T。在一些实施方案中，R83取代选自R83T、R83G、R83S和R83E。在一些实施方案中，L85取代选自L85S、L85A、L85V和L85T。在一些实施方案中，I92取代是I92L。在一些实施方案中，L94取代选自L94R、L94G、L94Q和L94K。在一些实施方案中，包含对选自以下的至少一个残基的取代：R81、P82、R83、L85、I86、S87、I89、N90、I92、V93和L94的工程化的IL2多肽具有SEQ ID NO:2-24中的任一个的IL2Rβ结合区2。
在一些实施方案中，与野生型IL2相比，工程化的IL2多肽对IL2Rβ的亲和力增加。在某些实施方案中，工程化的IL2多肽与IL2Rβ的结合的KD是野生型IL2与IL2Rβ的结合的KD的至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少30倍。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽以比野生型IL2高至少30倍的KD与IL2Rβ结合。在一些实施方案中，与野生型IL2相比，工程化的IL2多肽对IL2Rβ的亲和力增加了至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少30倍。
在一些实施方案中，与野生型IL2相比，工程化的IL2多肽对IL2Rα的亲和力减小。在某些实施方案中，与野生型IL2相比，工程化的IL2多肽对IL2Rα的亲和力减小了至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽与野生型IL2相比具有相似的对IL2Rα的亲和力。在某些实施方案中，工程化的IL2多肽对IL2Rα的亲和力与野生型IL2对IL2Rα的亲和力相差不超过±20％、不超过±15％、不超过±10％或不超过±5％。
本公开的一些实施方案提供了包含工程化的IL2受体α(IL2Rα)结合区1的工程化的IL2多肽。工程化的IL2Rα结合区1可包含选自以下的取代：位置K35处的取代、R38处的取代、F42处的取代、Y45处的取代或其组合。在一些实施方案中，与野生型IL2相比，工程化的IL2多肽至少2倍降低的结合动力学与IL2Rα结合。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽可包含位置K35处的取代。在一些实施方案中，位置K35处的取代包括非碱性残基。在一些实施方案中，位置K35处的取代包括不带电荷的残基或酸性残基。在一些实施方案中，位置K35处的取代选自：K35G、K35L、K35S、K35V、K35D、K35E和K35C。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽包含位置R38处的取代。在一些实施方案中，位置R38处的取代包括非碱性残基。在一些实施方案中，位置R38处的取代包括不带电荷的残基或酸性残基。在一些实施方案中，位置R38处的取代选自：R38V、R38D、R38E、R38S、R38I、R38A、R38Y、R38G、R38C和R38N。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽可包含位置F42处的取代。在一些实施方案中，位置F42处的取代包括不带电荷的残基。在一些实施方案中，位置F42处的取代包括碱性残基。在一些实施方案中，位置F42处的取代选自：F42A、F42R、F42G、F42I、F42L、F42P和F42H。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽可包含位置Y45处的取代。在一些实施方案中，位置Y45处的取代包括不带电的残基。在一些实施方案中，位置Y45处的取代包括不带电荷的极性残基或不带电荷的非极性残基。在一些实施方案中，Y45取代是Y45S、Y45P、Y45A、Y45V、Y45C、Y45T和Y45F。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽可包含位置K35处的取代和位置R38处的取代。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽包含K35G取代和R38E取代。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽可包含位置K35处的取代和位置F42处的取代。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽包含K35S取代和F42G取代。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽可包含位置K35处的取代、位置R38处的取代和位置F42处的取代。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽包含K35L取代、R38D取代和F42R取代。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽可包含位置R38处的取代和位置Y45S处的取代。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽包含R38D取代和Y45S取代。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽包含R38V取代和Y45S取代。
在一些实施方案中，与野生型IL2相比，工程化的IL2多肽以至少10倍降低的结合动力学与IL2Rα结合。
在一些实施方案中，IL2Rα结合区1选自：PVLTRMLTIKFY(SEQ ID NO:183)；PKLTRMLTLKFP(SEQ ID NO:184)；PDLTSMLAFKFY(SEQ ID NO:185)；PGLTEMLTFKFY(SEQ IDNO:186)；PSLTRMLTGKFY(SEQ ID NO:187)；PELTIMLTPKFY(SEQ ID NO:188)；PCLTAMLTLKFA(SEQ ID NO:189)；PCLTAMLTLKFA(SEQ ID NO:190)；PKLTRMLTHKFV(SEQ ID NO:191)；PCLTDMLTFKFY(SEQ ID NO:192)；PLLTDMLTRKFY(SEQ ID NO:193)；PLLTDMLTFKFY(SEQ IDNO:194)；PKLTDMLTFKFS(SEQ ID NO:195)；PKLTYMLTRKFY(SEQ ID NO:196)；PKLTRMLTFKFC(SEQ ID NO:197)；PKLTSMLTFKFS(SEQ ID NO:198)；PKLTSMLTFKFS(SEQ ID NO:199)；PKLTYMLTFKFS(SEQ ID NO:200)；PKLTYMLTFKFS(SEQ ID NO:201)；PKLTGMLTFKFS(SEQ IDNO:202)；PKLTVMLTFKFT(SEQ ID NO:203)；PKLTVMLTFKFS(SEQ ID NO:204)；PKLTVMLTFKFP(SEQ ID NO:205)；PKLTVMLTFKFF(SEQ ID NO:206)；PKLTCMLTFKFA(SEQ ID NO:207)；PKLTNMLTFKFA(SEQ ID NO:208)和PKLTNMLTFKFS(SEQ ID NO:209)。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽与SEQ ID NO:22的IL2Rβ结合区2外的残基(即，残基1-80和96-133)共享至少80％，例如至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性，并与IL2Rβ结合。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽与SEQ ID NO:223的IL2Rα结合区1外的残基(即，残基1-33和46-133)共享至少80％，例如至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性并具有减少的与IL2Rα的结合以及与IL2Rβ结合。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:223的IL2Rα结合区1和IL2Rβ结合区2外的残基(即，残基1-33、46-80、96-133)共享至少80％，例如至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性并具有减少的与IL2Rα的结合以及与IL2Rβ结合。在一些实施方案中，本公开提供了工程化的IL2多肽，其包含如前所述的工程化的IL2Rβ结合区2和如前所述的工程化的IL2Rα结合区1。在某些实施方案中，工程化的IL2多肽包含选自以下的工程化的IL2Rα结合区1：PVLTRMLTIKFY(SEQ ID NO:183)；PKLTRMLTLKFP(SEQ ID NO:184)；PDLTSMLAFKFY(SEQ ID NO:185)；PGLTEMLTFKFY(SEQ ID NO:186)；PSLTRMLTGKFY(SEQ ID NO:187)；PELTIMLTPKFY(SEQ ID NO:188)；PCLTAMLTLKFA(SEQ IDNO:189)；PCLTAMLTLKFA(SEQ ID NO:190)；PKLTRMLTHKFV(SEQ ID NO:191)；PCLTDMLTFKFY(SEQ ID NO:192)；PLLTDMLTRKFY(SEQ ID NO:193)；PLLTDMLTFKFY(SEQ ID NO:194)；PKLTDMLTFKFS(SEQ ID NO:195)；PKLTYMLTRKFY(SEQ ID NO:196)；PKLTRMLTFKFC(SEQ IDNO:197)；PKLTSMLTFKFS(SEQ ID NO:198)；PKLTSMLTFKFS(SEQ ID NO:199)；PKLTYMLTFKFS(SEQ ID NO:200)；PKLTYMLTFKFS(SEQ ID NO:201)；PKLTGMLTFKFS(SEQ ID NO:202)；PKLTVMLTFKFT(SEQ ID NO:203)；PKLTVMLTFKFS(SEQ ID NO:204)；PKLTVMLTFKFP(SEQ IDNO:205)；PKLTVMLTFKFF(SEQ ID NO:206)；PKLTCMLTFKFA(SEQ ID NO:207)；PKLTNMLTFKFA(SEQ ID NO:208)和PKLTNMLTFKFS(SEQ ID No:209)；并且包含选自以下的工程化的IL2Rβ结合区2：GVTDSISNAIVLARE(SEQ ID NO:2)；KWGDAVSNARVLAGE(SEQ ID NO:3)；KWGDAVSNARVLAGA(SEQ ID NO:4)；TLMDTTDNIGVLVRE(SEQ ID NO:5)；EPSDVISNINVLVQE(SEQID NO:6)；SPQDSIENISVLVRE(SEQ ID NO:7)；WASDSIENITLLIQE(SEQ ID NO:8)；CPTDTIENITVLIQE(SEQ ID NO:9)；RYKDSLENMQIIIQE(SEQ ID NO:10)；TARDAVDNMRVIIQE(SEQ ID NO:11)；TPRDVVENMNVLVLE(SEQ ID NO:12)；TPSDVIENMEVLILD(SEQ ID NO:13)；TPSDAIENINVLIRE(SEQ ID NO:14)；TPSDVIENITVLVQE(SEQ ID NO:15)；GVGDTIDNINVLVKE(SEQ ID NO:16)；IGRDSIDNIKVIVQE(SEQ ID NO:17)；WATDTIRNVEVLVQE(SEQ ID NO:18)；TAEDVVTNITVLVQE(SEQ ID NO:19)；TAEDVISNIRVNVQE(SEQ ID NO:20)；TPSDVIDNVSITVQE(SEQ ID NO:21)；TARDAISNIRVIVQE(SEQ ID NO:210)；RARDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:211)；TPRDAIDNINVIIQE(SEQ ID NO:212)；TPRDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:213)；TPRDAIDNIRVIILE(SEQ ID NO:214)；TARDAISNINVIIQE(SEQ ID NO:215)；和TARDAIDNINVIVQE(SEQ ID NO:216)；和TARDAIDNIRVIVLE(SEQ ID NO:217)。
在特定实施方案中，工程化的IL2多肽包含选自以下的工程化的IL2Rβ结合区2：GVTDSISNAIVLARE(SEQ ID NO:2)；TARDAVDNMRVIIQE(SEQ ID NO:11)；TPRDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:213)；TPRDAIDNIRVIILE(SEQ ID NO:214)；TARDAISNINVIIQE(SEQ ID NO:215)和TARDAIDNINVIVQE(SEQ ID NO:216)；和如前所述的工程化的IL2Rα结合区1。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽选自SEQ ID NO:147-170中的任一种，任选地包含(或排除)C末端组氨酸标签。在一些实施方案中，C末端组氨酸标签被另一种接头诸如gly-ser接头替代。
工程化的IL2融合多肽
本公开的一些实施方案提供了工程化的IL2融合多肽。工程化的IL2融合多肽可包括如前所述的工程化的IL2多肽，以及至少一个通过肽键或其它化学键联共价连接至工程化的IL2多肽的附加分子。在一些实施方案中，融合多肽的至少一种附加分子是半衰期延长分子。在一些实施方案中，半衰期延长分子包含半衰期延长多肽。在一些实施方案中，半衰期延长多肽包含Fc结构域、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合分子或转铁蛋白。
在某些实施方案中，IL2融合多肽包含Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域来源于IgG抗体。人IgG抗体有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在特定实施方案中，Fc结构域来源于IgG1抗体或IgG4抗体。在一些实施方案中，Fc结构域具有一个或多个降低Fc结构域的效应子功能的取代。降低Fc效应子功能的取代的实例包括L34A、L235A和P329G。“LALAPG”可以指经修饰的Fc结构域，其包括L34A、L235A和P329G中的每一个。在一些实施方案中，Fc结构域包含至少一个氨基酸残基修饰以延长血清半衰期。美国专利第7,317,091号、美国专利第8,735,545号、美国专利第7,371,826号、美国专利第7,670,600号和US 9,803,023中描述了对Fc结构域的代表性修饰。在一些实施方案中，Fc结构域是SEQ IDNO:64。在一些实施方案中，工程化的IL2-Fc融合多肽包含选自SEQ ID NO:39-49的序列。
在一些实施方案中，融合多肽的至少一种附加分子是抗原结合部分。在一些实施方案中，抗原结合部分包括免疫球蛋白、Fab分子、scFv、双特异性T细胞接合物、双抗体、单结构域抗体或纳米抗体。抗原结合部分可以结合例如癌胚抗原(CEA)、GD2或CD20。CEA抗原部分的实例是CH1A1A-2F。GD-2抗原结合部分的实例是达妥昔单抗，CD20抗原结合部分的实例是利妥昔单抗。
在一些实施方案中，融合多肽的至少一种附加分子是细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子选自白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-7、白细胞介素-10和C-C基序趋化因子配体19(CCL19)。在一些实施方案中，融合多肽的附加分子是本文所述的第二工程化的IL2多肽。
在一些实施方案中，半衰期延长分子包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)。
在一些实施方案中，融合多肽是单价融合多肽。单价融合多肽是指具有一个拷贝的工程化的IL2多肽的融合多肽。
在某些实施方案中，单价融合多肽包括与融合配偶体诸如Fc区连接的工程化的IL2多肽。多种接头在本领域是已知的，并且可用于将本文所述的工程化的IL2共价连接至融合配偶体，诸如Fc区。“接头”、“接头序列”在本文中意指连接两个分子并通常用于将两个分子置于优选构型的分子或分子的组(诸如单体或聚合物)。接头可包含提供柔性的氨基酸残基。因此，接头肽可以主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽的长度应足以以这样的方式连接两个分子，即它们相对于彼此采取正确的构象，使得它们保留所需的活性。为此目的，合适的长度包括至少一个但不超过30个氨基酸残基。优选地，接头长度为约1至30个氨基酸，其中长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20个氨基酸的接头是优选的。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:218)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:219)和(GGGS)n(SEQ ID No:220)，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性接头。在一些实施方案中，融合多肽是二价融合多肽。二价融合蛋白可以指包含两个拷贝的工程化的IL2多肽的分子复合物，所述工程化的IL2多肽可以具有相同的序列或不同的序列。分子复合物可以非共价结合。例如，二价融合蛋白可以包括诸如通过一个或多个二硫桥，或通过杵臼结构(knobs-into-holes)化学而非共价地结合在一起的两个Fc区。
制造工程化的IL2多肽的方法
工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽可以通过本领域公知的遗传或化学方法以及通过下面实施例中公开的方法来制备。遗传方法可以包括，例如，编码多肽的DNA的位点特异性诱变、PCR和基因合成。预期的核苷酸变化可以通过测序来验证。天然IL2的核苷酸序列已由Taniguchi等人(Nature 302,305-10(1983))描述，并且编码天然人IL2的核酸可从例如美国典型培养物保藏中心(Rockville Md.)获得。
工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽可以例如通过重组产生或固态肽合成获得。对于重组产生，可以分离编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的多核苷酸，并将其插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中克隆和/或表达。此类多核苷酸可以通过常规方法容易地分离和测序。在某些实施方案中，提供了包含一种或多种本公开的多核苷酸的载体，诸如表达载体。本领域技术人员公知的方法可用于构建含有编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。参见，例如，Maniatis等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MAN UAL(第4版),Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2012)；以及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOG Y,GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1993)中描述的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的多核苷酸(即，编码区)可被克隆到所述表达盒中而与启动子和/或其它转录或翻译控制元件可操作地关联。如本文中所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)没有翻译成氨基酸，但如果存在，其可被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等，都不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如，存在于单个载体上，或者存在于单独的多核苷酸构建体中，例如，存在于单独的(不同的)载体上。此外，任何载体可以包含单个编码区，或者可以包含两个或更多个编码区，例如，本文公开的载体可以编码一个或多个多蛋白，所述多蛋白通过蛋白水解切割在翻译后分离成最终的蛋白质或通过蛋白水解切割共翻译分离成最终的蛋白质。另外，本公开的载体、多核苷酸或核酸可以编码与编码本文公开的多肽或其变体或衍生物的第一或第二多核苷酸融合或未与其融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于特化的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能域。可操作的关联是当基因产物(例如，多肽)的编码区以将基因产物的表达置于一个或多个调节序列的影响或控制之下的方式与一个或多个调控序列关联时。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的键联性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰DN A模板被转录的能力，则两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关联的启动子)是“可操作地关联的”。因此，如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录，那么启动子区域将可操作地与该核酸相关联。启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预定的细胞中指导DNA的大量转录。除了启动子之外，其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号也可与多核苷酸可操作地关联，以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其它转录控制区。本领域技术人员已知多种转录控制区。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒(例如，立即早期启动子，与内含子-A连接)、猿猴病毒40(例如，早期启动子)和逆转录病毒(例如，劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括来源于脊椎动物基因诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如，四环素类诱导型启动子)。类似地，本领域普通技术人员已知多种翻译控制元件。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其它特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本公开的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区相关联，所述附加编码区指导由本公开的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽，则可以将编码信号序列的DNA置于编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的成熟氨基酸的核酸的上游。本领域普通技术人员知道，脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽从翻译的多肽上被切割下来，产生分泌或“成熟”形式的多肽。例如，天然人IL2在多肽的N末端与20个氨基酸的信号序列一起翻译，所述信号序列随后被切掉，产生成熟的133个氨基酸的人IL2。在一些实施方案中，使用天然信号肽，例如IL2信号肽或免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的功能衍生物，所述功能衍生物保留指导与其可操作地关联的多肽分泌的能力。
在一些实施方案中，编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的多核苷酸还包括编码有利于纯化的序列(例如，组氨酸标签)或用于在编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的多核苷酸内或末端标记工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的DNA序列。
在某些实施方案中，提供了包含一种或多种编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合物的载体。宿主细胞可以是可用于产生工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的任何类型的细胞系统。此类细胞可用编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合物的特定表达载体转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐，以获得足够数量的编码工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合物用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌(E.Coli)，或各种真核细胞，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中产生多肽，特别是在不需要糖基化时。表达后，可将多肽以可溶性级分从细菌细胞中分离出来，并可进一步纯化。除了原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于编码抗体的载体的克隆性或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株。用于表达(糖基化的)多肽的适合宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号和第6,417,429号(其描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。也可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚胎肾系(如例如Graham等人，J Gen Virol36,59(1977)中所述的293或293T细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(如，例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述的TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如，例如，Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所描述的)、MRC 5细胞和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于某些适于蛋白质产生的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods inMolecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press,Totowa,N.J.)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如，哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，仅举几个实例，还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
本领域已知在这些系统中表达外源基因的标准技术。表达与抗原结合部分(诸如抗体)融合的重链或轻链的工程化的IL2多肽的细胞可以被工程化，从而也表达另一条抗体链，使得表达的工程化的IL2融合多肽包括具有重链和轻链的抗体。
在一些实施方案中，提供了产生工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在适合于表达工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的条件下，培养包含编码本文提供的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的多核苷酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基，例如，如果宿主细胞分泌多肽的话)中回收并且/或者纯化工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽。
药物组合物
本文提供了包含本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽和药学上可接受的一种或多种稀释剂、一种或多种赋形剂或一种或多种载剂的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含本文公开的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽和附加治疗剂(例如，组合疗法)。在本文中的下文中描述了此类治疗剂的非限制性实例。可以使用一种或多种药学上可接受的载剂以常规方式配制药物组合物，所述载剂包括赋形剂和助剂，所述赋形剂和助剂有利于将工程化的IL2或IL2融合多肽加工成可药用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。任何药学上可接受的技术、载剂和赋形剂都适用于配制本文所述的药物组合物：Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.，编辑，Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,NewYork,N.Y.,1980和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。IL-2组合物的实例描述于美国专利第4,604,377号和第4,766,106号中，所述专利通过引用并入本文。
如本文中所用，“药学上可接受的载剂”和“生理上可接受的载剂”可互换使用，并且包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、此类类似材料及其组合，这对于本领域普通技术人员来说是所知，并且是分子实体和组合物，它们在所用的剂量和浓度下，通常对受者无毒，即，当适当时向动物例如人施用时，不产生不良、过敏或其它不利反应(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版Mack PrintingCompany,1990，第1289-1329页，通过引用并入本文)。除了任何常规载剂与活性成分不相容的情况之外，其在治疗或药物组合物中的应用也在考虑之列。
药物组合物可以包含不同类型的载剂，这取决于其是以固体、液体还是以气溶胶形式施用，以及对于注射等施用途径是否需要无菌。本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽(和任何附加治疗剂)可通过以下途径施用：静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、脉管内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、局部、局域、通过吸入(例如，气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、通过导管、灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞、在乳膏剂中、在脂质组合物(例如，脂质体)中或通过如本领域普通技术人员已知的其它方法或前述方法的任何组合(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，通过引用并入本文)。肠胃外施用，特别是静脉注射，最常用于施用多肽分子，诸如本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽。
肠胃外组合物包括那些设计用于通过注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、硬膜内或腹膜内注射)施用的组合物。对于注射，本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽可以配制在水溶液中，优选配制在生理上相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。所述溶液可以包含配制剂，诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽可呈粉剂形式，用于在使用前用适当的媒介物(例如，无菌无热原水)复原。通过在适当的溶剂中以所需量掺入工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽与以下列举的各种其它成分(根据需要)来制备无菌注射溶液。例如，通过经由无菌过滤膜过滤来容易地实现灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有碱性分散介质和/或另外的成分的无菌媒介物来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥技术和冷冻干燥技术，所述技术产生活性成分外加来自其先前无菌过滤的液体培养基的任何附加的所需成分的粉末。如果需要，应当对液体培养基进行适当缓冲，并且在注射足够的盐水或葡萄糖之前，首先使液体稀释剂等渗。在制造和储存的条件下药物组合物优选是稳定的，并对所述药物组合物进行防腐处理以防诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应保持在最低安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学上可接受的载剂包括但不限于：缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯的对羟基苯甲酸烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；诸如EDTA的螯合剂；诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇的糖类；诸如钠的成盐平衡离子；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或诸如聚乙二醇(PEG)的非离子表面活性剂。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖等。在一些实施方案中，混悬剂还可含有适合的稳定剂，或增加化合物的溶解度以便允许制备高度浓缩溶液的剂。另外，活性化合物的混悬剂可被制备为适当的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(诸如芝麻油)或合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯或三酸甘油酯)或脂质体。
在一些实施方案中，水性混悬剂包含一种或多种聚合物作为助悬剂。聚合物的实例包括水溶性聚合物，诸如纤维素聚合物，例如羟丙基甲基纤维素，和水不溶性聚合物，诸如交联的含羧基聚合物。本文所述的某些药物组合物包含粘膜粘附聚合物，选自例如羧甲基纤维素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸钠和葡聚糖。
在一些实施方案中，药物组合物包含增溶剂以帮助工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的溶解性。术语“增溶剂”通常包括导致形成胶束溶液或剂的真溶液的剂。某些可接受的非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯80，可用作增溶剂。实例包括二醇、聚乙二醇，例如聚乙二醇400和乙二醇醚。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟基甲基氨基甲烷；和缓冲剂，诸如柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠和氯化铵。此类酸、碱和缓冲液的含量应使组合物的pH值保持在可接受的范围内。
在一些实施方案中，药物组合物以使组合物的渗透压浓度达到可接受的范围所需的量包含一种或多种盐。此类盐包括具有钠、钾或铵阳离子以及氯化物、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、硼酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或亚硫酸氢盐阴离子的盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种防腐剂以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，诸如硼酸苯汞和硫柳汞；稳定的二氧化氯；和季铵化合物，诸如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵和西吡氯铵。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂以增强物理稳定性或用于其它目的。合适的非离子表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如，聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如，辛苯昔醇10、辛苯昔醇40。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种抗氧化剂以在需要时增强化学稳定性。合适的抗氧化剂包括，仅举例来说，抗坏血酸和焦亚硫酸钠。
在某些实施方案中，水性混悬剂组合物被包装在单剂量不可再封闭的容器中。或者，使用多剂量可再封闭容器，在这种情况下，通常在组合物中包含防腐剂。
在一些实施方案中，本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽使用持续释放系统，诸如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质递送。各种持续释放材料用于本文中。在一些实施方案中，缓释胶囊将工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽释放几周直至超过100天。根据治疗试剂的化学性质和生物稳定性，采用额外的蛋白质稳定策略。持续释放制剂的合适实例包括包含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品例如膜或微胶囊的形式。在一些实施方案中，可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的剂，例如单硬脂酸铝、明胶或其组合来实现。
在一些实施方案中，本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽可被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中。此类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences(第18版Mack Printing Company,1990)中。
在一些实施方案中，本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽也可被配制成贮库制剂。此类长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽可与合适的聚合或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或作为微溶衍生物，例如作为微溶盐。
包含本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的药物组合物可通过常规混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干方法制备。药物组合物可使用一种或多种生理上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载剂、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可药用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽可被配制成呈游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保持游离酸或碱的生物活性的盐。这些盐包括酸加成盐，例如与蛋白质性质组合物的游离氨基形成的盐，或与无机酸例如盐酸或磷酸形成的盐，或与有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐。用游离羧基形成的盐也可衍生自例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁的无机碱；或诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的此类有机碱。药物盐往往比相应的游离碱形式更易溶于水性溶剂或其它质子溶剂。
在一些实施方案中，本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽被配制用于口服施用。在各种实施方案中，本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽被配制成口服剂型，仅举例来说，包括片剂、粉剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆料、混悬剂等。
在某些实施方案中，通过将一种或多种固体赋形剂与一种或多种本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽混合，任选地研磨所得混合物，并在需要时在加入合适的助剂后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸芯来获得用于口服使用的药物制剂。合适的赋形剂特别地是填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，诸如：例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；或其它填充剂，诸如：聚乙烯吡咯烷酮(PVP或聚维酮)或磷酸钙。在具体实施方案中，任选地加入崩解剂。仅作为实例，崩解剂包括交联的交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐诸如海藻酸钠。
在一些实施方案中，提供具有一种或多种合适的包衣的剂型诸如糖衣丸芯和片剂。在具体实施方案中，浓缩糖溶液用于包被剂型。糖溶液任选地含有其它组分，诸如仅作为实例的阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。出于识别目的，染料和/或色素也任选地被添加到包衣中。另外，染料和/或色素可选地用于表征活性剂剂量的不同组合。
在某些实施方案中，将治疗有效量的本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽中的至少一种配制成其它口服剂型。口服剂型包括由明胶制成的推入适配胶囊(push-fit capsule)，以及由明胶和增塑剂诸如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。在特定的实施方案中，推入适配胶囊包含与一种或多种填充剂混合的活性成分。填充剂包括乳糖、粘合剂诸如淀粉和/或润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁，以及任选的稳定剂。在一些实施方案中，软胶囊包含一种或多种溶解或悬浮在合适液体中的活性剂。合适的液体可包括一种或多种脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，任选地加入稳定剂。
在一些实施方案中，治疗有效量的本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽中的至少一种被配制用于口腔或舌下施用。适于口腔或舌下施用的制剂包括，仅举例来说，片剂、锭剂或凝胶。
在一些实施方案中，局部施用工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽。本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽被配制成各种可局部施用的组合物，诸如溶液、混悬剂、洗剂、凝胶、糊剂、药棒、香膏、乳膏或软膏。此类药物组合物任选含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽被配制用于透皮施用。在具体实施方案中，透皮制剂采用透皮给药装置和透皮递送贴剂，并且可以是溶解和/或分散在聚合物或粘合剂中的亲脂性乳剂或缓冲水溶液。在各种实施方案中，此类贴剂被构造用于药剂的连续、脉动或按需递送。在另外的实施方案中，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的透皮递送通过离子电渗贴剂等方式完成。在某些实施方案中，透皮贴剂提供工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的受控递送。在具体实施方案中，通过使用速率控制膜或通过将工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽捕获在聚合物基质或凝胶中来减缓吸收速率。在替代实施方案中，吸收增强剂用于增加吸收。吸收增强剂或载剂包括有助于通过皮肤的可吸收的药学上可接受的溶剂。例如，在一个实施方案中，透皮装置呈绷带的形式，其包含背衬元件、含有工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽并任选地含有载剂的贮库、任选的以受控和预定的速率在延长的时间段内将工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽递送至宿主皮肤的速率控制屏障和将装置固定至皮肤的工具。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽被配制成通过吸入施用。适于吸入施用的各种形式包括但不限于气雾剂、雾剂或粉剂。工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的药物组合物可方便地以气溶胶喷雾形式，使用合适的喷射剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)从加压包装或喷雾器中递送。在具体实施方案中，加压气溶胶的剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。在某些实施方案中，配制用于吸入器或吹入器的诸如(仅以举例的方式)明胶的胶囊和药筒，其包含工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的粉末混合物和合适的粉末基质，诸如乳糖或淀粉。
在一些实施方案中，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽被配制在诸如灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气溶胶、栓剂、果冻栓剂或保留灌肠剂等直肠组合物中，所述组合物包含诸如可可脂或其它甘油酯等常规栓剂基质，以及诸如聚乙烯吡咯烷酮、PEG等合成聚合物。在组合物的栓剂形式中，首先熔化低熔点蜡，诸如但不限于脂肪酸甘油酯任选地与可可脂组合的混合物。
在某些实施方案中，本文所述的制剂包含一种或多种抗氧化剂、金属螯合剂、含硫醇化合物和/或其它通用稳定剂。此类稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油，(b)约0.1％至约1％w/v甲硫氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v单硫代甘油，(d)约1mM至约10mM EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨醇酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨醇酯20，(h)精氨酸，(I)肝素，(j)硫酸葡聚糖，(k)环糊精，(l)戊聚糖多硫酸酯和其它类肝素，(m)诸如镁和锌等二价阳离子；或(n)其组合。
在一些实施方案中，在本公开的药物组合物中提供的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的浓度低于100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％,14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物中提供的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的浓度高于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％19％、18.75％、18.50％、18.25％18％、17.75％、17.50％、17.25％17％、16.75％、16.50％、16.25％16％、15.75％、15.50％、15.25％15％、14.75％、14.50％、14.25％14％、13.75％、13.50％、13.25％13％、12.75％、12.50％、12.25％12％、11.75％、11.50％、11.25％11％、10.75％、10.50％、10.25％10％、9.75％、9.50％、9.25％9％、8.75％、8.50％、8.25％8％、7.75％、7.50％、7.25％7％、6.75％、6.50％、6.25％6％、5.75％、5.50％、5.25％5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物中提供的工程经的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的浓度在约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％、约1％至约10％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物中提供的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的浓度在约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物中提供的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的量等于或少于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物中提供的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物中提供的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的量在0.0001g至10g、0.0005g至9g、0.001g至8g、0.005g至7g、0.01g至6g、0.05g至5g、0.1g至4g、0.5g至4g或1g至3g的范围内。
治疗和使用的方法
在本公开的一些实施方案中，本文提供了调节有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文前述的工程化的IL2多肽、工程化的IL2融合多肽或其药物组合物。在某些实施方案中，调节免疫反应包括以下至少一种：增强效应T细胞活性、增强NK细胞活性和抑制调节性T细胞活性。在本公开的一些实施方案中，本文提供了如前所述的工程化的IL2多肽、如前所述的融合多肽和/或如前所述的药物组合物，其用于调节有需要的受试者的免疫反应的方法。在一些实施方案中，调节免疫反应包括与WTIL2相比，增加STAT5的磷酸化。
在本公开的一些实施方案中，所述实施方案是治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文中前述的工程化的IL2多肽、工程化的IL2融合多肽或其药物组合物。在本公开的一些实施方案中，本文提供了如前所述的工程化的IL2多肽、如前所述的融合多肽和/或如前所述的药物组合物，其用于治疗受试者疾病的方法。所述方法中设想的疾病或疾患的非限制性实例包括增殖性病症(诸如癌症)和免疫抑制。
在一些实施方案中，所述实施方案是治疗增殖性病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文中前述的工程化的IL2多肽、工程化的IL2融合多肽或其药物组合物。在某些实施方案中，增殖性病症是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、肾细胞癌和肾癌。还包括癌前状态或病变和癌症转移。其它细胞增殖性病症包括但不限于位于以下部位的肿瘤：腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部区域和泌尿生殖系统。类似地，还可治疗其它细胞增殖性病症诸如高丙种球蛋白血症、淋巴增殖性病症、副蛋白血症、紫癜、结节病、塞扎里综合征、瓦尔登斯特朗巨球蛋白血症(Waldenstron's Macroglobulinemia)、戈谢病、组织细胞增多症以及除了瘤形成以外的位于上述器官系统中的任何其它细胞增殖性疾病。
在一些实施方案中，治疗或调节免疫反应的方法还包括向受试者施用治疗有效量的至少一种附加治疗剂(例如，组合疗法)。在某些实施方案中，附加治疗剂是抗癌剂。抗癌剂的实例包括检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)、化学治疗剂、抑制肿瘤微环境的剂、癌症疫苗(例如，Sipuleucel-T)、溶瘤病毒(例如，拉他莫基)、表达嵌合抗原受体的免疫细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。在某些实施方案中，另外的治疗剂是包括抗原结合部分在内的分子。在某些具体实施方案中，抗原结合部分选自单结构域抗体、Fab分子、scFv、双抗体、纳米抗体、双特异性T细胞接合物或免疫球蛋白。在某些实施方案中，抗原结合部分对肿瘤抗原(例如，癌胚抗原、成纤维细胞活化蛋白-α、CD20)或检查点蛋白(例如，CTLA-4、PD-1或PD-L1)是特异性的。在一些实施方案中，附加治疗剂包括表达嵌合抗原受体的免疫细胞、表达工程化的T细胞受体的免疫细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞。在某些实施方案中，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽可由被转染、转导或以其它方式引入表达嵌合抗原受体的免疫细胞、表达工程化的T细胞受体的免疫细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞中的多核苷酸编码。在此类实施方案中，免疫细胞可以是表达装甲嵌合抗原受体的细胞(armored chimeric antigenreceptor-expressing cell)。多核苷酸还可在工程化的IL2多肽编码序列的直接上游编码分泌信号(例如，天然IL2信号序列或来源于另一种蛋白质的信号序列)，以允许细胞分泌工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽。
在一些实施方案中，治疗或调节免疫反应的方法包括向受试者施用工程化的IL2多肽，该多肽具有SEQ ID NO:1的IL2Rβ结合区2。在某些实施方案中，治疗或调节免疫反应的方法包括向受试者施用工程化的IL2多肽，该多肽具有SEQ ID NO:2-21中的任一个的IL2Rβ结合区2。在某些实施方案中，该方法包括向受试者施用SEQ ID NO:23-42中的任一个、SEQ ID NO:44-63中的任一个、SEQ ID NO:147-170中的任一个的工程化的IL2多肽(任选包含C端组氨酸标签)，或SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:145的Fc融合多肽。在某些实施方案中，治疗或调节免疫反应的方法包括向受试者施用SEQID NO:22的或SEQ ID NO:23-42中的任一个的工程化的IL2多肽。在某些实施方案中，治疗或调节免疫反应的方法包括向受试者施用SEQ ID NO:51的工程化的IL2融合多肽。在某些实施方案中，治疗或调节免疫反应的方法包括向受试者施用SEQ ID NO:43的或SEQ ID NO:44-63中的任一个的工程化的IL2融合多肽。
合适的施用途径包括但不限于静脉内、肠胃外、透皮、口服、经直肠、气溶胶、经眼、经肺、经粘膜、经阴道、经耳、经鼻和局部施用。另外，仅举例来说，肠胃外递送包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射，以及硬膜内、直接脑室内、腹膜内、淋巴管内和鼻内注射。
在某些实施方案中，全身施用工程化的IL2多肽或IL2融合多肽。在某些实施方案中，本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽以局部而非全身方式，例如通过将工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽直接注射到器官、组织或肿瘤中来施用。在一些实施方案中，长效制剂通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。此外，在一些实施方案中，将药物在靶向药物递送系统中递送，例如在包被有器官特异性或细胞特异性抗体的脂质体中施用。在此类实施方案中，脂质体被靶向器官并被器官选择性吸收。在一些实施方案中，本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽以快速释放制剂的形式、延长或持续释放制剂的形式、以中间释放制剂的形式或以贮库制剂的形式提供。在一些实施方案中，局部施用本文所述的工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽。
工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽(单独的使用或与一种或多种其它附加治疗剂组合使用的)的适当剂量将取决于疾病或疾患的类型、施用途径、受试者的体重、疾病的严重程度和进展、多肽是出于预防还是治疗目的施用、先前或同时进行的治疗干预、受试者的临床病史和对工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的反应以及主治医生的判断。负责施用的医生将能够确定组合物中一种或多种活性成分的浓度和用于待治疗受试者的适当给药。本文设想了包括但不限于在不同时间点单次或多次施用、推注施用和脉冲输注的各种给药方案。
工程化的IL2多肽的单次施用范围可以是约50,000IU/kg至约1,000,000IU/kg或更多的工程化的IL2多肽。这可以一天重复数次(例如，每天2-4次)，持续数天(例如，连续3-5天)，然后可以在休息一段时间(例如，7-14天)后重复一次或多次。因此，治疗有效量可以包括在一段时间内仅一次施用或多次施用(例如，在约5-20天内约10至30次单次施用，每次给予约600,000IU/kg的IL2)。当以融合多肽的形式施用时，工程化的IL2融合多肽的治疗有效量可以低于非融合工程化的IL2多肽(例如，10,000IU/kg至约600,000IU/kg)。类似地，如上所述，可将工程化的IL2融合多肽一次或通过一系列治疗向患者施用。
在某些实施方案中，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的日剂量范围为约1μg/kg至约100mg/kg或更高。对于数天或更长时间内的重复施用(这取决于疾患)，将通常维持治疗直至疾病症状发生所需的抑制(例如，肿瘤皱缩)。在一些实施方案中，工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽的单剂量在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在一些实施例中，剂量可以是每次施用约1μg/kg/体重、约5μg/kg/体重、约10μg/kg/体重、约50μg/kg/体重、约100μg/kg/体重、约200μg/kg/体重、约350μg/kg/体重、约500μg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、约10mg/kg/体重、约50mg/kg/体重、约100mg/kg/体重、约200mg/kg/体重、约350mg/kg/体重、约500mg/kg/体重至约1000mg/kg/体重，以及可从其中导出的任何范围。在可从本文所列数字导出的范围的非限制性实例中，可基于上述数字，施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。此类剂量可以间歇施用，例如每天2-3次、每周一次或每三周一次。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，也可以使用其它给药方案。
本文所述的工程化的IL2多肽和工程化的IL2融合多肽可以以有效实现预期目的的量使用。为了用于治疗或预防疾病状况，以治疗有效量施用工程化的IL2多肽或工程化的IL2融合多肽或其药物组合物。治疗有效量的确定，尤其是根据本文提供的细节的确定，在本领域技术人员的能力范围内。
对于全身性施用，治疗有效量最初可以从体外测定诸如细胞培养测定中来估计。然后可在动物模型中配制剂量来实现包括如在细胞培养中测定的IC50的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更准确地测定人中的有用剂量。还可使用本领域公知的技术，从体内数据(例如，动物模型)估计初始剂量。基于动物数据，本领域普通技术人员可以容易地优化向人的施用。剂量量和间隔可各自被调节，以提供足以维持治疗效果的工程化的IL2多肽和工程化的IL2融合多肽的血浆水平。血浆中的水平可以例如通过HPLC来测量。
实施例
实施例1
鉴定IL2Rα减少的结合突变的文库策略
基于IL2与IL2Rα相互作用的结构建模，合理设计了用于鉴定IL2Rα减少的结合剂的IL2突变文库(图1A及图1B)。简言之，IL2的K35、R38、F42和Y45残基被鉴定为与IL2Rα相互作用的重要残基(图1C)。在这些残基上携带两个、三个和四个随机突变的诱变寡核苷酸用于构建文库(表1)。
表1.合理设计的IL2Rα减少的诱变文库
Figure BDA0003560282560000501
表2.用于IL-2Rα-减少的结合文库的诱变寡核苷酸设计
Figure BDA0003560282560000502
Figure BDA0003560282560000511
大写的核苷酸三聚体以50％WT和50％NNS，或70％WT和30％NNS混合，其中“N”指任何核苷酸，“S”指G或C。通过以WT IL2序列作为模板对上述诱变寡聚物进行多步PCR和重叠PCR，构建了三个文库。文库1包括诱变寡核苷酸1-6，文库2包括诱变寡核苷酸7-9，文库3包括诱变寡核苷酸10-11(表2)。这些诱变文库已被进一步修饰，以在N末端处具有体外转录和翻译信号。为了选择和纯化的目的，flag-标签序列也被添加到C末端。
实施例2
IL2Rα减少的结合克隆的选择和鉴定
使用mRNA展示技术从三个IL2诱变文库中选择具有IL2Rα减少的结合的IL2突变体。简言之，首先将DNA文库转录成mRNA文库，然后通过嘌呤霉素接头共价偶联将其翻译成mRNA-IL2突变体融合文库。将文库纯化并转化为mRNA/cDNA融合文库。用人和小鼠IgG(阴性蛋白)反向选择融合文库以除去非特异性结合剂，然后针对IL2Rα反向选择三次。收集文库流过物(flow through)(未结合的分子)，并进行PCR以回收IL2Rα未结合的分子，然后进行凝胶纯化。将回收的混合物克隆到pET22b载体中，并在大肠杆菌Rosetta II链中表达。在IL2Rα结合ELISA中测试单个克隆的上清液。图2A示出了所选IL2克隆的上清液对IL2Rα的ELISA结果。图2B示出了针对与上清液结合的IL2Rα绘制的克隆表达。图3示出了用IL2Rα减少的结合鉴定的克隆的序列比对。
实施例3
IL2Rα减少的结合克隆的结合动力学分析
IL2Rα减少的结合克隆与IL2Rα的结合动力学使用SPR技术，利用Biacore T200软件版本2.0进行评估。对于每个循环，在蛋白质A传感器芯片上于1X HBSP缓冲液中，在流动池2上以10uL/min的流速捕获1ug/mL的人IL2Rα，持续60秒。将100nM的每种HIS和Flag标签纯化的IL2突变体以30uL/min的流速注射到参考流动池1和IL2Rα捕获流动池2上，持续150秒，然后洗涤300秒。然后用甘氨酸pH 2.0以30uL/min的流速再生流动池60秒。对于每个样品都包含HBSP+缓冲液作为基线对照。以96孔的形式设置了所述测定。动力学数据用Biacore T200评估软件3.0进行了分析。特异性结合反应单位是通过从IL2Rα流动池2中减去与参考流动池1的结合并减去缓冲液对照而获得的。将WT IL2包括作为对照。测定每个IL2Rα减少的结合克隆的相对反应(RU)(图4，表3)。
表3.IL2Rα减少的结合克隆的结合动力学分析
Figure BDA0003560282560000521
Figure BDA0003560282560000531
实施例4
产生IL2Rβ激动剂的文库策略
工程化的IL2Rβ结合激动剂通过理性IL2诱变文库设计产生，随后通过mRNA展示技术平台进行选择。简言之，通过结构分析，鉴定了IL2Rβ的两个WT IL2结合区：IL2Rβ结合区1“QLQLEHLLLDLQM”(SEQ ID NO:67)和IL2Rβ结合区2“RPRDLISNINVIVLE”(SEQ ID NO:68)。为了产生包括针对IL2Rβ结合区1、IL2Rβ结合区2或IL2Rβ结合区1和IL2Rβ结合区2的突变的诱变文库，设计了编码这两个区域的序列的两个诱变寡核苷酸(寡核苷酸1、寡核苷酸2)(表4)。对于寡核苷酸1和寡核苷酸2序列，具有以小写字母显示的核苷酸的每个密码子三聚体是50％WT和50％NNS的混合物(其中“N”指任何核苷酸，“S”指G或C)。编码WT IL2序列的其它寡核苷酸(寡核苷酸3至寡核苷酸12)是从用于诱变文库组装的WT区域设计的(表4)。使用这些寡核苷酸构建了三个诱变文库(图5)。使用利用诱变寡核苷酸1和寡核苷酸3-12的重叠PCR策略构建了文库4。使用利用诱变寡核苷酸2和寡核苷酸3-9、11和12的重叠PCR策略构建了文库5。使用利用诱变寡核苷酸1和2以及寡核苷酸3-8、11和12的重叠PCR策略构建了文库6。这三个诱变文库被进一步修饰，使其在N末端具有体外转录和翻译信号，并在C末端具有Flag-标签，以便用mRNA展示进行选择。
表4.用于IL-2Rβ激动剂文库的诱变寡核苷酸设计
Figure BDA0003560282560000541
Figure BDA0003560282560000551
实施例5
IL2Rβ激动剂克隆的选择和鉴定
mRNA展示技术平台被用于从三个IL2诱变文库鉴定IL2Rβ激动剂。首先将DNA文库转录成mRNA文库，然后通过嘌呤霉素通过接头通过共价偶联将其翻译成mRNA-IL2突变体融合文库。然后将文库纯化并转化为mRNA/cDNA融合文库(参见，例如，美国专利第6,258,558号，据此通过引用并入)。首先用人IgG(阴性蛋白)对融合文库进行反向选择以去除非特异性结合物，然后进行反向选择以去除IL2Rα结合剂，随后针对捕获在蛋白G磁珠上的重组IL2Rβ/Fc蛋白进行选择。回收IL2Rβ结合剂并通过PCR扩增进行富集。总共进行了五轮选择来产生与IL2Rβ结合的高度富集的工程化的IL2突变体。
经五轮选择后，将富集的文库克隆到细菌周质表达载体pET22b中，并将其转化到TOP10感受态大肠杆菌细胞中。每种工程化的IL2分子被工程化为具有C末端flag标签和6xHIS标签以用于纯化和测定检测。汇集来自TOP10细胞的克隆，制备miniprep DNA，随后将其转化到大肠杆菌Rosetta II菌株中进行表达。挑选、生长单个克隆，并用0.25mM IPTG在96孔平板中诱导表达。在30℃下诱导16至24小时后收集上清液，用于鉴定结合剂的测定。
用夹心ELISA测定评估含有工程化的IL2突变体的上清液以筛选表达。简言之，将抗HIS标签抗体(R&D Systems)在每孔50μL的总体积中以2μg/mL的于1X PBS的终浓度固定在96孔平板中。将平板在4℃孵育过夜，然后用每孔200μL的superblock封闭1小时。向每个孔中加入100μL的1:10 1X PBST稀释的上清液，并振荡孵育1小时。通过加入50μl的以1:5000在1X PBST中稀释的抗Flag HRP进行1小时来检测工程化的IL2突变体的表达水平。在每个步骤之间，使用洗板机用1X PBST洗涤平板三次。然后用50μL TMB底物对平板显影5分钟，并通过加入50μL 2N硫酸停止显影。使用Biotek平板读取器在OD450 nm处读取平板，并用Prism 8.1软件分析数据。
接下来筛选了单个克隆的IL2Rβ结合。IL2Rβ结合筛选ELISA被开发用来鉴定单个工程化的IL2突变体。简言之，分别以2μg/mL的于1X PBS中的终浓度用总体积为每孔50μL的人Fc和人IL2Rβ固定96孔平板。将平板在4℃孵育过夜，然后用每孔200μL的superblock封闭1小时。将100μl上清液加入到Fc和IL2Rβ固定的孔中，并振荡孵育1小时。通过加入50μL的以1:5000于1X PBST中稀释的抗Flag HRP来检测工程化的IL2突变体结合。在每一步之间，在洗板机中用1X PBST洗涤平板三次。然后用50μL TMB底物对平板显影5分钟，并通过加入50μL 2N硫酸停止显影。使用Biotek平板读数器在OD450 nm处读取平板，并分析结合和选择性。用Prism8.1软件绘制表达与IL2Rβ结合的相关性。
从文库5中鉴定出高IL2Rβ结合克隆(显示在垂直OD450 nm截止线的右侧)，以进一步表征为工程化的IL2Rβ激动剂(图6)。克隆的IL2Rβ结合活性通常与克隆的表达水平相关。与IL2 WT相比，IL2Rβ结合区2的多重序列比对揭示了高度保守和高度变化的氨基酸，以及独立鉴定多次的克隆序列(图7)。从文库4和6中没有鉴定出特异性IL2Rβ结合克隆。
实施例6
IL2Rβ激动剂克隆在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的产生
为了在大肠杆菌中产生IL2Rβ激动剂，将每个工程化的激动剂克隆的甘油原液接种到TB培养基中进行过夜生长。第二天，将来自过夜培养物的细胞接种到TB培养基中，并生长至OD600为0.6至0.8的细胞密度。加入IPTG直至终浓度为1mM，以在30℃过夜培养期间诱导表达。通过离心收集上清液。根据制造商的方案，通过Ni-Sepharose(GE Healthcare)亲和柱纯化工程化的激动剂。工程化的激动剂的纯度通过Flag-标签亲和柱纯化(Sigma)来进一步提高。将每种激动剂浓缩并装载到AKTA中的Sephadex 200Increase 10/300GL柱中，用于尺寸排阻色谱柱纯化。将激动剂的高度均一的单体峰级分各自汇集并浓缩。根据标准方案，使用内毒素去除树脂(Pierce)进一步去除内毒素。最终的内毒素水平低于10EU/mg。通过LC-MS光谱分析和SDS凝胶证实了蛋白质纯度(图8)。将蛋白质各自储存在1X PBS缓冲液中，用于结合和功能分析。
为了在哺乳动物细胞中产生IL2Rβ激动剂，对对应于氨基酸序列的DNA序列进行了密码子优化、合成所述DNA序列并将其亚克隆到pCDNA3.4(Invitrogen)中。根据标准方案，将每个工程化的IL2多肽在游离型系统(Invitrogen)中的ExpiHEK293-F细胞中进行了瞬时表达。将细胞在上述条件下生长了七天，然后进行收获。通过离心收集上清液，并通过0.2μmPES膜进行了过滤。激动剂首先通过Ni Sepharose Excel树脂柱(GE Healthcare)纯化，然后用7k Da Zeba柱将缓冲液交换成PBS pH 7.4+300mM NaCl(总计)中。然后将每种多肽浓缩至1mL，通过Superdex 200Increase 10/300GL柱(GE Healthcare)纯化至均一。将单体峰级分汇集并浓缩。最终纯化的蛋白质含有少于10EU/mg的内毒素。通过LC-MS光谱分析确认IL2多肽身份，并通过SDS凝胶电泳分析纯度。将蛋白质在1X PBS/300nM NaCl缓冲液中储存，用于结合、功能和机制分析。
实施例7
使用表面等离子体共振对IL2Rβ激动剂克隆进行结合动力学分析
大肠杆菌产生的WT IL2和EP001-EP007的结合动力学利用用于大肠杆菌细胞中产生的工程化的IL2多肽和哺乳动物细胞中产生的工程化的IL2多肽的Biacore T200，通过表面等离子体共振技术进行评估。使用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，在蛋白质A传感器芯片上于1X HBST缓冲液中，在流动池2上以10μL/min的流速捕获1μg/mL的人IL2Rβ或IL2Rα，持续60秒。将二倍系列稀释的HIS标签纯化的工程化的IL2突变体以30μL/min的流速注射到参考流动池1和IL2Rβ或IL2Rα捕获流动池2上持续150秒，然后洗涤300秒。然后用甘氨酸pH 2以30μL/min的流速再生流动池持续40秒。对于每个IL2Rβ激动剂克隆96孔平板形式，测定从0nM至100nM的8个浓度点。动力学数据用Biacore T200评估软件3000进行分析。特异性结合反应单位是从靶流动池2减去与参考流动池1的结合而得到的。
WT IL2用于验证结合方案，并作为对照包含在每次运行中(图9A及图9B)。显示了大肠杆菌和哺乳动物产生的IL2Rβ激动剂与IL2Rα(图10A至图10H针对大肠杆菌产生的，图12A至图12D针对哺乳动物产生的)和IL2Rβ(图11A至图11H针对大肠杆菌产生的，图13A至图13D针对哺乳动物产生的)结合的结合动力学的代表性传感图。概述了大肠杆菌产生的IL2(表5)和哺乳动物产生的IL2(表6)的结合动力学。
IL2Rβ激动剂EP001、EP006和EP007未显示出可检测的IL2Rα结合或IL2Rα结合的显著减少(大于20倍的减少)，但与WT IL2相比，IL2Rβ结合显著增加(表5，表6)。相反地，与野生型IL2相比，IL2Rβ激动剂EP002、EP003、EP004和EP005并未显示IL2Rα结合的显著减少(小于20倍的减少)，但与WT IL2相比，IL2Rβ结合显著增加(表5，表6)。
表5.大肠杆菌产生的IL2Rβ激动剂克隆的IL2R结合动力学概述
Figure BDA0003560282560000591
表6.哺乳动物产生的IL2Rβ激动剂克隆的IL2R结合动力学概述
Figure BDA0003560282560000592
实施例8
人PBMC的IL2Rβ激动剂P-STAT5的活化
从三个独立供体的外周血中分离出人PBMC，并将其在75μL的培养基中以250,000个细胞/孔铺在96孔平板中。将细胞在37℃下静置1h。在37℃下于25μL中用4倍浓度的人WTIL2和工程化的His-Flag标记的IL2刺激细胞20min。立即对受刺激的PBMC进行固定，透化，对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)和p-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+CD56-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD3-CD56+。调节性T细胞被定义为CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+。测定p-STAT5+细胞的百分比，并将其相对于每次IL2滴定绘图(图14A至图14C针对供血者1，图14D至图14F针对供血者2，图14G至图14I针对供血者3)。使用Prism软件确定P-STAT5活化的EC50值(表7)。
表7.人CD8+T细胞、NK细胞和Treg的P-STAT5活化的概述
Figure BDA0003560282560000601
实施例9
IL2Rβ激动剂回复突变克隆的合理生成
进行了合理设计的IL2Rβ激动剂回复突变策略，以产生一系列IL2Rβ激动剂候选突变。EP001含有R81T、P82A、L85A、I86V、S87D、I89M、N90R、V93I和L94Q突变。为每个候选者设计了4个至WT IL2的回复突变。对于所有突变，I86和I89都回复突变为WT IL2的86I和89I。然后将系统性回复突变与86I和89I组合应用于另外两个残基。总共设计了21个回复突变组合，突变是以EP001为模板通过定点诱变产生的(表8)。诱变后对IL2Rβ激动剂回复突变克隆进行序列验证。
表8.引入EP0001的回复突变
81 82 85 86 87 89 90 93 94
WT IL2 R P L I S I N V L
EP001 T A A V D M R I Q
EP242 T A A I S I R V Q
EP243 R P A I D I R I Q
EP244 R A L I D I R I Q
EP245 R A A I S I R I Q
EP246 R A A I D I N I Q
EP247 R A A I D I R V Q
EP248 R A A I D I R I L
EP249 T P L I D I R I Q
EP250 T P A I S I R I Q
EP251 T P A I D I N I Q
EP252 T P A I D I R V Q
EP253 T P A I D I R I L
EP254 T A L I S I R I Q
EP255 T A L I D I N I Q
EP256 T A L I D I R V Q
EP257 T A L I D I R I L
EP258 T A A I S I N I Q
EP260 T A A I S I R I L
EP261 T A A I D I N V Q
EP262 T A A I D I N I L
EP263 T A A I D I R V L
实施例10
IL2Rβ激动剂回复突变克隆的表征
通过ELISA表征了EP001回复突变克隆的与IL2Rβ和IL2Rα受体的结合活性。简言之，在25uL/孔的总体积中以2ug/mL的于1XPBS中的终浓度用人IL2Rα和IL2RβFc融合蛋白固定384孔平板。将平板在4C下孵育过夜，并用每孔80uL的superblock封闭1小时。将纯化的EP001回复突变克隆从100nM连续稀释至0nM。将每种稀释液以一式两份平行加入至IL2Rα或IL2Rβ孔中。通过在1X PBST中加入25uL以1:5000稀释的抗Flag HRP来检测IL2突变体结合。在每个步骤之间，使用洗板机用1X PBST洗涤平板三次。然后用25uL TMB底物对平板显影5分钟，并通过加入25ul 2N硫酸停止显影。使用Biotek平板读数器在OD450 nm处读取平板，并用Prism 8.1软件分析EC50，以生成EC50值(图15A针对IL2Rα，图15B针对IL2Rβ，概述于表9中)。
表9.回复突变克隆的结合活性
Figure BDA0003560282560000621
Figure BDA0003560282560000631
实施例11
利用表面等离子体共振研究IL2Rβ激动剂回复突变克隆的结合动力学
EP001回复突变克隆的结合动力学分析已用Biacore T200通过SPR技术进行了评估。使用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，在蛋白质A传感器芯片上于1X HBSP缓冲液中，在流动池2上以10uL/min的流速捕获1ug/mL的人IL2Rβ，持续60秒。将100nM的HIS和Flag标签纯化的每种IL2突变体进行2倍连续稀释，并以30uL/min的流速注射到参考流动池1和IL2Rβ捕获流动池2上持续150秒，然后洗涤300秒。然后用甘氨酸pH2以30uL/min的流速再生流动池60秒。以96孔形式用8个连续稀释浓度点设置了所述测定。动力学数据用Biacore T200评估软件3.0进行了分析。特异性结合反应单位是从靶流动池2减去与参考流动池1的结合而得到的(图16A至图16F，表10)。
表10.回复突变克隆的结合动力学的概述。(NA：数据不可用；*：从稳态亲和拟合测 量的KD)
Figure BDA0003560282560000632
Figure BDA0003560282560000641
实施例12
具有降低的IL2Rα活性的工程化的IL2Rβ激动剂
首先在大肠杆菌中表达了通过mRNA文库选择和筛选产生的具有潜在减少或消除的IL2Rα结合的IL2突变，并根据制造商的方案通过Ni-Sepharose(GE Healthcare)亲和柱和Flag标签亲和柱纯化(Sigma)对其进了行纯化。然后选择通过Biacore SPR结合和ELISA结合两者证实的IL2Rα结合活性显著降低的IL2突变来产生IL2Rα结合活性降低的IL2Rβ激动剂。简言之，通过定点诱变技术将突变引入pCDNA3.4哺乳动物表达载体中的IL2Rβ激动剂构建体，并通过DNA序列分析进行确认(表11)。根据标准方案，将每个工程化的IL2多肽在游离型系统(Invitrogen)中的ExpiHEK293-F细胞中进行了瞬时表达。将细胞在上述条件下生长5天，然后收获。通过离心收集上清液，并通过0.2μm PES膜进行了过滤。首先通过NiSepharose Excel树脂柱(GE Healthcare)纯化激动剂，然后通过Superdex 200Increase10/300GL柱(GE Healthcare)进一步纯化至超过95％的均一性(图17)。最终纯化的蛋白质的内毒素含量低于10EU/mg。将蛋白质在1X PBS缓冲液中储存，用于结合、功能和机制分析。
表11.具有IL2Rα减少的结合突变的工程化的IL2Rβ激动剂
Figure BDA0003560282560000642
Figure BDA0003560282560000651
实施例13
使用表面等离子体共振对工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆进行结合动力学分析
IL2Rβ激动剂与IL2Rα活性降低突变的受体结合活性的动力学分析已利用BiacoreT200通过SPR技术进行了评估。使用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，在蛋白质A传感器芯片上于1XHBSP缓冲液中，在流动池2上以10ul/min的流速捕获1ug/mL的人IL2Rβ，持续60秒。将100nM的HIS和Flag标签纯化的每种IL2突变体进行2倍连续稀释，并以30ul/min的流速注射到参考流动池1和IL2Rβ捕获流动池2上持续150秒，然后洗涤300秒。然后用甘氨酸pH2以30ul/min的流速再生流动池60秒。以96孔形式用8个连续稀释浓度点设置了所述测定。动力学数据用Biacore T200评估软件3.0进行了分析。特异性结合反应单位是从靶流动池2减去与参考流动池1的结合而得到的。图18A至图18H示出了工程化的IL2Rβ/α克隆与IL2Rα的滴定结合，图19A至图19H示出了工程化的IL2Rβ/α克隆与IL2Rβ的滴定结合。克隆的描述以及动力学数据的概述示于表12中。
表12.工程化的IL2Rβ/IL2Rα克隆与人IL2Rα的结合动力学概述
Figure BDA0003560282560000661
NA：数据不可用。ND:无法检测的结合。低:低于10RU的结合信号。
图20A至图20G示出了IL2Rα单一浓度结合，图21A至图21G示出了IL2Rβ单一浓度结合，图22A和图22B示出了IL2Rα多浓度结合，这概述于表13中)。
表13.通过SPR研究的工程化的IL2Rβ/IL2Rα克隆与人IL2R的结合动力学的概述
Figure BDA0003560282560000662
Figure BDA0003560282560000671
ND:无法检测的结合。低:低于5RU的结合信号
实施例14
工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆的ELISA结合分析
将重组Fc标记的人IL2Rα和IL2Rβ在25uL 1X PBS中加入384孔平板的孔中，并在4℃下孵育过夜以包被平板。用0.05％Tween20/1X PBS洗涤平板三次。在RT下用100uLSuperBlock封闭平板1h，然后用0.05％Tween20/1X PBS洗涤3次。将IL2突变体在0.05％Tween 20/1X PBS中从1000nM稀释至0nM，并在室温下加入至平板中进行2h。然后用0.05％Tween20/1X PBS洗涤平板6次。将抗HisTag-HRP在0.05％Tween20/1X PBS中以1:5000稀释，并在RT下加入到平板中1h。然后用0.05％Tween 20/1X PBS洗涤平板6次，并加入TMB以显蓝色。用2N硫化氢停止反应，在BioTek平板读数器上读取450nm处的吸光度。绘制了人IL2Rα的单点吸光度以及人IL2Rα和IL2Rβ的滴定(图23A至图23E针对IL2Rα，图24A至24D针对IL2Rβ)。显示了ELISA结合的EC50值的概述(表14)。
表14.与人IL2Rα和IL2Rβ的ELISA结合的概述
Figure BDA0003560282560000672
实施例15
工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆对人PBMC的P-STAT5活化
从两个供体的外周血中分离出人PBMC，并将其在75μL的培养基中以250,000个细胞/孔铺在96孔平板中。将细胞在37℃下静置1h。在37℃下于25μL中用4倍浓度的人IL2 WT和工程化的His-Flag标记的IL2刺激细胞20min。立即对受刺激的PBMC进行固定，透化，对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)和p-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+CD56-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD3-CD56+。调节性T细胞被定义为CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+。测定p-STAT5+细胞的百分比，并将其相对于每次IL2滴定绘图(图25A至图25D针对供体656CD8+T细胞，图26A至图26D针对供体648CD8＝+T细胞，图27A至图27D针对供体656NK细胞，图28A至图28D针对供体648NK细胞，图29A至图29D针对供体656调节性T细胞，图30A至图30D针对供体648调节性T细胞)。每种细胞类型的P-STAT5活化的EC50值的概述示于表15(针对供血者1)和表16(针对供血者2)中。
表15.供体1的人CD8+T细胞、NK细胞和Treg的P-STAT5活化的概述。
Figure BDA0003560282560000681
Figure BDA0003560282560000691
表16.供体2的人CD8+T细胞、NK细胞和Treg的P-STAT5活化的概述。
Figure BDA0003560282560000692
Figure BDA0003560282560000701
实施例16
工程化的IL2Rα/IL2Rβ克隆对鼠细胞的P-STAT5活化
将鼠脾细胞在75μL培养基中以250,000个细胞/孔铺在96孔平板中。将细胞在37℃下静置1h。在37℃下于25μL中用4倍浓度的人IL2 WT和工程化的His-Flag标记的IL2刺激细胞20min。立即对受刺激的小鼠腺细胞进行固定，透化，对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)和p-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+CD56-CD4-CD8+。测定p-STAT5+细胞的百分比，并将其相对于每次IL2滴定作图(图31A至图31D)。每种细胞类型的P-STAT5活化的EC50值的概述示于图34中。
将分离的NK细胞或小鼠调节性T细胞在75μL培养基中以20,000个细胞/孔铺在96孔平板中。将细胞在37℃下静置1h。在37℃下于25μL中用4倍浓度的人IL2 WT和工程化的His-Flag标记的IL2刺激细胞20min。立即对受刺激的小鼠NK细胞或小鼠调节性T细胞进行固定，透化，对P-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。测定p-STAT5+细胞的百分比，并将其相对于每次IL2滴定作图(图32A至图32D、图33A至图33D)。
每种细胞类型的P-STAT5活化的EC50值的概述示于图34中。
实施例17
IL2Rβ激动剂FC融合蛋白的设计
为了产生二价IL2Rβ激动剂Fc-融合蛋白，将编码EP003(SEQ ID NO:2)、EP007(SEQID NO:4)、EP002(SEQ ID NO:6)、EP004(SEQ ID NO:09)、EP001(SEQ ID NO:11)、EP006(SEQID NO:16)、EP009(SEQ ID NO:18)和EP005(SEQ ID NO:19)的工程化的IL2多肽的蛋白质序列与人IgG1同种型的恒定框架序列的N-末端位点融合，以产生工程化的激动剂-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:44、46、48、51、53、58和61)。引入人IgG1中的L234A、L235A和P329G突变以消除补体结合和Fc-γ依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应(Lo等人，JBC2017)(图35A)。
为了产生单价IL2Rβ激动剂Fc-融合蛋白，将编码EP003(SEQ ID NO:2)、EP007(SEQID NO:4)、EP002(SEQ ID NO:6)、EP004(SEQ ID NO:09)、EP001(SEQ ID NO:11)、EP006(SEQID NO:16)、EP009(SEQ ID NO:18)和EP005(SEQ ID NO:19)的工程化的IL2多肽的蛋白质序列与相应的人IgG1和IgG4同种型的恒定框架序列的N-末端位点融合，以产生工程化的激动剂-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:44、46、48、51、53、58和61)。将S354C、T366W和K409A的杵突变(knob mutation)引入构建体。将Y349C、T366S、L368A、F405K、Y407V的臼突变(holemutation)分别引入IgG1和IgG4的CH2和CH3片段。引入人IgG1中的L234A、L235A和P329G突变以消除补体结合和Fc-γ依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应(Lo等人，JBC，2017年)(图35B及图35C)。然后用针对哺乳动物细胞表达优化的密码子合成编码完整Fc融合激动剂蛋白的DNA，并将其亚克隆到pCDNA3.4(Invitrogen)中。
实施例18
IL2Rβ激动剂FC融合蛋白的产生
对于二价IL2-Fc融合蛋白的产生，根据标准方案，将激动剂在游离型系统(Invitrogen)中的ExpiHEK293-F细胞中瞬时表达。将细胞在上述条件下生长七天，然后进行收获。通过离心收集上清液，并通过0.2μm PES膜进行了过滤。首先通过MabSelectPrismA蛋白A树脂(GE Health)纯化了Fc融合激动剂。用100mM Gly pH2.5+150mM NaCl洗脱蛋白质，并用20mM柠檬酸盐pH 5.0+300mM NaCl进行快速中和。然后将激动剂蛋白浓缩至1mL，并通过Superdex 200Increase 10/300GL柱进一步纯化。将单体峰级分汇集并浓缩。最终纯化的蛋白质的内毒素含量低于10EU/mg，并保存在20mM柠檬酸盐pH 5.0+300mM NaCl中。将纯化的IL2-Fc融合激动剂在SDS凝胶(4-12％Bis-Tris Bolt凝胶，含有MES运行缓冲液)上运行，比较在还原条件对比非还原条件下处理的每个样品(图36A)。
对于单价IL2-Fc融合蛋白的产生，将相应IgG1和IgG4骨架形式的“杵”和“臼”构建体以1:1的比率转染至ExpiHEK293-F细胞中。将细胞在上述条件下生长5天，然后收获。通过离心收集上清液，并通过0.2μm PES膜进行了过滤。首先通过MabSelect PrismA蛋白A树脂(GE Health)纯化了Fc融合激动剂。用100mM Gly pH2.5+150mM NaCl洗脱蛋白质，并用20mM柠檬酸盐pH 5.0+300mM NaCl进行快速中和。然后将激动剂蛋白浓缩至1mL，并通过Superdex 200Increase 10/300GL柱进一步纯化。将单体峰级分汇集并浓缩。最终纯化的蛋白质的内毒素含量低于10EU/mg，并保存在20mM柠檬酸盐pH 5.0+300mM NaCl中。将纯化的单价IL2-Fc融合激动剂在SDS凝胶(4-12％Bis-Tris Bolt凝胶，含有MES运行缓冲液)上运行，比较在还原条件对比非还原条件下处理的每个样品(图36B)。
实施例19
IL2Rβ激动剂FC-融合蛋白的ELISA结合分析
对于二价Fc融合蛋白，将人IL2Rα和人IL2Rβ在25μL/孔的总体积中以2μg/mL的于1x PBS中的终浓度固定在384孔平板中。将平板在4℃孵育过夜，然后用每孔80μL的superblock封闭1小时。将100nM的纯化的工程化的IL2突变Fc融合蛋白以3倍连续稀释12次。将每种稀释液平行加入IL2Rα和IL2Rβ孔中。通过加入50μL的以1:5000在1x PBST中稀释的抗人Fc HRP来检测工程化的IL2突变体结合。在每个步骤之间，用1x PBST在洗板机中洗涤平板3次。然后用25μl TMB底物对平板显影5分钟，并通过加入25μl 2N硫酸停止显影。使用Biotek平板读取器在OD450 nm处读取平板，并用Prism 8.1软件分析EC50。绘制人IL2Rα和IL2Rβ的吸光度相对于IL-2浓度的关系图(图37A至图37G)。显示了ELISA结合的EC50值的概述(表17)。
表17.二价IL2RβFc融合蛋白的受体结合分析的概述
Figure BDA0003560282560000731
对于单价Fc融合蛋白，将重组His标记的人IL2Rα和IL2Rβ于25uL 1X PBS中加入到384孔平板的孔中，并在4℃孵育过夜以包被平板。用0.05％Tween20/1X PBS洗涤平板三次。在RT下用100uL SuperBlock封闭平板1h，然后用0.05％Tween20/1X PBS洗涤3次。将IL2突变体在0.05％Tween 20/1X PBS中从1000nM稀释至0nM，并在室温下加入至平板中进行2h。然后用0.05％Tween20/1X PBS洗涤平板6次。将抗HisTag-HRP在0.05％Tween20/1X PBS中以1:5000稀释，并在RT下加入到平板中1h。然后用0.05％Tween20/1X PBS洗涤平板6次，加入TMB以显蓝色。用2N硫化氢停止反应，在BioTek平板读数器上读取450nm处的吸光度。绘制人IL2Rα和IL2Rβ的吸光度相对于IL2浓度的关系图(图38A至图38B)。显示了ELISA结合的EC50值的概述(表18)。
表18.单价IL2RβFc融合蛋白的受体结合分析的概述
Figure BDA0003560282560000741
实施例20
单价IL2RβFC融合蛋白的结合动力学
单价IL2RβFc融合蛋白的结合动力学已利用Biacore T200通过SPR技术进行了分析。简言之，将抗hFc抗体固定在流动池1和流动池2上。对于每个循环，在固定有抗hFc的芯片上于1XHBSP缓冲液中，在流动池2上以10ul/min的流速捕获1ug/mL的人IL2 Fc融合蛋白，持续60秒。将100nM IL2Rα-HIS标记的或IL2Rβ-HIS标记的进行2倍连续稀释并注射到参照流动池1上，并在流动池2中以30ul/min的流速捕获IL2 Fc融合蛋白150秒。最后一次注射后应用300秒洗涤。以96孔形式用8个连续稀释浓度点设置了所述测定。动力学数据用BiacoreT200评估软件3.0进行了分析。特异性结合反应单位是从靶流动池2减去与参考流动池1的结合而得到的(图39A至39D)。
实施例21
IL2Rβ激动剂FC融合蛋白对人PBMC的P-STAT5活化
从外周血中分离出人PBMC，并将其在75μL的培养基中以250,000个细胞/孔铺在96孔平板中。将细胞在37℃下静置1h。在37℃下于25μl中用4倍浓度的人WT IL2和IL2Rβ激动剂Fc-融合蛋白刺激细胞20min。立即对受刺激的PBMC进行固定，透化，对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)和p-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+CD56-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD3-CD56+。调节性T细胞被定义为CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+。测定p-STAT5+细胞的百分比，并将其相对于每次IL2滴定绘图(图40A至图40C针对二价融合蛋白，图41A至图41C针对二价融合蛋白；关于概述参见表19)。
表19.IL2Rβ激动剂Fc融合蛋白对人PBMC的P-STAT5活化的概述
Figure BDA0003560282560000751
Figure BDA0003560282560000761
实施例22
IL2Rβ激动剂的小鼠体内药代动力学分析
向C57BL/6小鼠i.v.或i.p.注射了10ug的于200uL盐水中的IL2-WT、EP001或EP003。在0min、10min、30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h和48h时收集血液，并立即离心分离出血浆。为了测定IL2-WT和EP001的血浆浓度，连续稀释血浆，并使用Duoset IL2ELISA试剂盒(R&D Systems)按照说明分析血浆。通过比较来自血浆与在同等稀释的未处理C57BL/6小鼠血浆中制备的掺加对照的吸光度值，测定IL2-WT、EP001和EP001浓度。将IL2浓度相对于时间以对数标度绘图(图42A至图42B；表20)。
表20.
Figure BDA0003560282560000762
实施例23
IL2Rβ激动剂小鼠体内肿瘤细胞浸润
将100,000个于50％基质凝胶中的MC38细胞皮下注射到7周龄雌性C57BL/6小鼠的背侧。用测径器测量肿瘤。当达到100mm3的平均体积时，用32ug的WT IL2、EP001、EP003或EP004 BID处理小鼠5天。第6天，处死小鼠，并通过流式细胞术分析肿瘤浸润性免疫细胞。对用于流式细胞术的肿瘤切片进行称重以获得归一化的细胞计数。CD4+T细胞被定义为CD45+CD3+CD49b-CD4+CD8-。CD8+T细胞定义为CD45+CD3+CD49b-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD45+CD3-CD49b+。调节性T细胞NK细胞被定义为CD45+CD3+CD49b-CD4+CD8-FOXP3+。原初T细胞被定义为CD44loCD62Lhi。效应T细胞被定义为CD44hiCD62Llo，并且中央记忆T细胞定义为CD44hiCD62Lhi。将肿瘤浸润免疫细胞的归一化计数(图43A至图43D)、效应细胞与调节性细胞的比率(图44A及图44B)和T细胞亚型(图45A至图45C)相对于IL2克隆治疗组作图。
序列表
<110> 艾佩斯瑞生物制药公司(Elpis Biopharmaceuticals)
<120> 工程化的白细胞介素-2受体β激动剂
<130> 300096.401WO
<140> PCT
<141> 2020-08-13
<150> US 62/886,148
<151> 2019-08-13
<160> 220
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 变体
<222> 1,3,6, 8, 12, 13
<223> Xaa = 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 2,4,10
<223> Xaa = 任何不带电荷的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 5,7,9,11
<223> Xaa = 不带电荷的非极性氨基酸
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP003 IL2Rβ BR2)
<400> 2
Gly Val Thr Asp Ser Ile Ser Asn Ala Ile Val Leu Ala Arg Glu
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP008 IL2Rβ BR2)
<400> 3
Lys Trp Gly Asp Ala Val Ser Asn Ala Arg Val Leu Ala Gly Glu
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP007 IL2Rβ BR2)
<400> 4
Lys Trp Gly Asp Ala Val Ser Asn Ala Arg Val Leu Ala Gly Ala
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP0021 IL2Rβ BL2)
<400> 5
Thr Leu Met Asp Thr Thr Asp Asn Ile Gly Val Leu Val Arg Glu
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP002 IL2Rβ BR2)
<400> 6
Glu Pro Ser Asp Val Ile Ser Asn Ile Asn Val Leu Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP018 IL2Rβ BR2)
<400> 7
Ser Pro Gln Asp Ser Ile Glu Asn Ile Ser Val Leu Val Arg Glu
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP011 IL2Rβ BR2)
<400> 8
Trp Ala Ser Asp Ser Ile Glu Asn Ile Thr Leu Leu Ile Gln Glu
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP004 IL2Rβ BR2)
<400> 9
Cys Pro Thr Asp Thr Ile Glu Asn Ile Thr Val Leu Ile Gln Glu
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP016 IL2Rβ BR2)
<400> 10
Arg Tyr Lys Asp Ser Leu Glu Asn Met Gln Ile Ile Ile Gln Glu
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP001 IL2Rβ BR2)
<400> 11
Thr Ala Arg Asp Ala Val Asp Asn Met Arg Val Ile Ile Gln Glu
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP017 IL2Rβ BR2)
<400> 12
Thr Pro Arg Asp Val Val Glu Asn Met Asn Val Leu Val Leu Glu
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP012 IL2Rβ BR2)
<400> 13
Thr Pro Ser Asp Val Ile Glu Asn Met Glu Val Leu Ile Leu Asp
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP013 IL2Rβ BR2)
<400> 14
Thr Pro Ser Asp Ala Ile Glu Asn Ile Asn Val Leu Ile Arg Glu
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP015 IL2Rβ BR2)
<400> 15
Thr Pro Ser Asp Val Ile Glu Asn Ile Thr Val Leu Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP006 IL2Rβ BR2)
<400> 16
Gly Val Gly Asp Thr Ile Asp Asn Ile Asn Val Leu Val Lys Glu
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP019 IL2Rβ BR2)
<400> 17
Ile Gly Arg Asp Ser Ile Asp Asn Ile Lys Val Ile Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP009 IL2Rβ BR2)
<400> 18
Trp Ala Thr Asp Thr Ile Arg Asn Val Glu Val Leu Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP005 IL2Rβ BR2)
<400> 19
Thr Ala Glu Asp Val Val Thr Asn Ile Thr Val Leu Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP010 IL2Rβ BR2)
<400> 20
Thr Ala Glu Asp Val Ile Ser Asn Ile Arg Val Asn Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(EP014 IL2Rβ BR2)
<400> 21
Thr Pro Ser Asp Val Ile Asp Asn Val Ser Ile Thr Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列(IL2Rβ激动剂)
<220>
<221> 变体
<222> 81, 83, 86, 88, 92, 93
<223> Xaa = 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 82, 84, 90
<223> Xaa = 任何不带电荷的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 85, 87, 89, 91
<223> Xaa = 任何不带电荷的非极性氨基酸
<400> 22
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 23
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP003
<400> 23
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Gly Val Thr Asp Ser Ile Ser Asn Ala Ile Val Leu Ala Arg Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 24
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP008
<400> 24
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Glu
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Lys Trp Gly Asp Ala Val Ser Asn Ala Arg Val Leu Ala Gly Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 25
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP007
<400> 25
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Glu Thr Gln Leu Gln Leu Lys His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Lys Trp Gly Asp Ala Val Ser Asn Ala Arg Val Leu Ala Gly Ala Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 26
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP020
<400> 26
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Leu Met Asp Thr Thr Asp Asn Ile Gly Val Leu Val Arg Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 27
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP002
<400> 27
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Glu Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Glu Pro Ser Asp Val Ile Ser Asn Ile Asn Val Leu Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 28
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP018
<400> 28
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Glu Thr Gln Leu Gln Leu Lys His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Ser Pro Gln Asp Ser Ile Glu Asn Ile Ser Val Leu Val Arg Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 29
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP011
<400> 29
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Trp Ala Ser Asp Ser Ile Glu Asn Ile Thr Leu Leu Ile Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 30
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP004
<400> 30
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Cys Pro Thr Asp Thr Ile Glu Asn Ile Thr Val Leu Ile Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 31
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP016
<400> 31
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Tyr Lys Asp Ser Leu Glu Asn Met Gln Ile Ile Ile Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 32
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP001
<400> 32
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Ala Arg Asp Ala Val Asp Asn Met Arg Val Ile Ile Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 33
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP017
<400> 33
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Pro Arg Asp Val Val Glu Asn Met Asn Val Leu Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 34
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP012
<400> 34
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Pro Ser Asp Val Ile Glu Asn Met Glu Val Leu Ile Leu Asp Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 35
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP013
<400> 35
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Pro Ser Asp Ala Ile Glu Asn Ile Asn Val Leu Ile Arg Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 36
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP015
<400> 36
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Pro Ser Asp Val Ile Glu Asn Ile Thr Val Leu Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 37
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP006
<400> 37
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Gly Val Gly Asp Thr Ile Asp Asn Ile Asn Val Leu Val Lys Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 38
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP019
<400> 38
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Ile Gly Arg Asp Ser Ile Asp Asn Ile Lys Val Ile Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 39
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP009
<400> 39
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Trp Ala Thr Asp Thr Ile Arg Asn Val Glu Val Leu Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 40
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP005
<400> 40
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Ala Glu Asp Val Val Thr Asn Ile Thr Val Leu Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 41
<400> 41
000
<210> 42
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP014
<400> 42
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Pro Ser Asp Val Ile Asp Asn Val Ser Ile Thr Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 43
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列IL2Rβ激动剂-Fc融合物
<220>
<221> 变体
<222> 81, 83, 86, 88, 92, 93
<223> Xaa = 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 82, 84, 90
<223> Xaa = 任何不带电荷的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 85, 87, 89, 91
<223> Xaa = 任何不带电荷的非极性残基
<400> 43
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
130 135 140
Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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<211> 365
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
260 265 270
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
275 280 285
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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100 105 110
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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<220>
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
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Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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195 200 205
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<220>
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<400> 50
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Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
165 170 175
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
195 200 205
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
210 215 220
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP004-Fc融合物, EP078
<400> 51
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100 105 110
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Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
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Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
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Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP016-Fc融合物, EP094
<400> 52
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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Arg Tyr Lys Asp Ser Leu Glu Asn Met Gln Ile Ile Ile Gln Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
130 135 140
Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 53
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP001-Fc融合物, EP079
<400> 53
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Ala Arg Asp Ala Val Asp Asn Met Arg Val Ile Ile Gln Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
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Ile Ser Thr Leu Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
130 135 140
Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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355 360 365
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Arg Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
130 135 140
Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
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195 200 205
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210 215 220
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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<220>
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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<220>
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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<220>
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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<220>
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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340 345 350
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<211> 365
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<220>
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<400> 60
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Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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<210> 61
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP005-Fc融合物, EP084
<400> 61
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
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Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 62
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP010-Fc融合物, EP088
<400> 62
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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65 70 75 80
Thr Ala Glu Asp Val Ile Ser Asn Ile Arg Val Asn Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
130 135 140
Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 63
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP014-Fc融合物, EP092
<400> 63
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Pro Ser Asp Val Ile Asp Asn Val Ser Ile Thr Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
130 135 140
Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 64
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列Fc结构域
<400> 64
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 65
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 66
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列WT IL2 IL2R β结合环1
<400> 67
Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
1 5 10
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列WT IL2 IL2R β结合环2
<400> 68
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
1 5 10 15
<210> 69
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸1
<400> 69
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 60
ttgaatggaa ttaat 75
<210> 70
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸2
<400> 70
agcaaaaact ttcacttaag acccagggac ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg 60
gaactaaagg gatctgaaac a 81
<210> 71
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸3
<400> 71
caattactat ttacaattac aatggctagc gcacctactt caagttctac aaagaaaaca 60
<210> 72
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸4
<400> 72
cttgggcatg taaaacttaa atgtgagcat cctggtgagt ttgggattct tgtaattatt 60
aattccattc aaaat 75
<210> 73
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸5
<400> 73
aagttttaca tgcccaagaa ggccacagaa ctgaaacatc ttcagtgtct agaagaagaa 60
ctcaaacctc 70
<210> 74
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸6
<400> 74
taagtgaaag tttttgcttt gagctaaatt tagcacttcc tccagaggtt tgagttcttc 60
<210> 75
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸7
<400> 75
ctaaagggat ctgaaacaac attcatgtgt gaatatgctg atgagacagc aaccattgta 60
gaatttctga acaga 75
<210> 76
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸8
<400> 76
agatggtgca gccacagttc gagtcagtgt tgagatgatg ctttgacaaa aggtaatcca 60
tctgttcaga aattctac 78
<210> 77
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸9
<400> 77
agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac tgctggattt acagatgatt 60
ttgaatggaa ttaat 75
<210> 78
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸10
<400> 78
agcaaaaact ttcacttaag acccagggac ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg 60
gaactaaagg gatctgaaac a 81
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸11
<400> 79
aagttttaca tgcccaag 18
<210> 80
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列诱变寡核苷酸12
<400> 80
taagtgaaag tttttgc 17
<210> 81
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP100
<400> 81
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Val Leu Thr Arg Met Leu Thr Ile Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 81
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP101
<400> 82
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Leu Lys Phe Pro Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 83
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP102
<400> 83
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Asp Leu Thr Ser Met Leu Ala Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 84
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP103
<400> 84
Ser Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Gly Leu Thr Glu Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 85
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP104
<400> 85
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Ser Leu Thr Arg Met Leu Thr Gly Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 86
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP105
<400> 86
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Glu Leu Thr Ile Met Leu Thr Pro Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 87
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP106
<400> 87
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Cys Leu Thr Ala Met Leu Thr Leu Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 88
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP107
<400> 88
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Cys Leu Thr Ala Met Leu Thr Leu Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 89
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP108
<400> 89
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr His Lys Phe Val Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 90
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP109
<400> 90
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Cys Leu Thr Asp Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 91
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP110
<400> 91
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Leu Leu Thr Asp Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 92
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP111
<400> 92
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Leu Leu Thr Asp Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 93
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP112
<400> 93
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Asp Met Leu Thr Phe Lys Phe Ser Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 94
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP113
<400> 94
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Tyr Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 95
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP114
<400> 95
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Cys Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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100 105 110
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100 105 110
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<220>
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100 105 110
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP125
<400> 106
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP126
<400> 107
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP213 (WT IL2-IgG4-Fc，杵突变：S354C, T366W, K409A)
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65 70 75 80
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
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Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
325 330 335
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340 345 350
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355 360
<210> 109
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP214 (IgG4-Fc，臼突变：Y349C, T366S, L368A, F405K, Y407V)
<400> 109
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Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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130 135 140
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 110
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP215 (EP001-IgG4-Fc，杵突变：S354C, T366W, K409A)
<400> 110
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
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Asn Pro Lys Leu Thr Glu Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Thr Ala Arg Asp Ala Val Asp Asn Met Arg Val Ile Ile Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu
260 265 270
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
355 360
<210> 111
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP216 (EP003-IgG4-Fc，杵突变：S354C, T366W, K409A
<400> 111
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Gly Val Thr Asp Ser Ile Ser Asn Ala Ile Val Leu Ala Arg Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu
260 265 270
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
355 360
<210> 112
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP219
<400> 112
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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65 70 75 80
Gly Val Thr Asp Ser Ile Ser Asn Ala Ile Val Leu Ala Arg Glu Leu
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100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu
260 265 270
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
355 360
<210> 113
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP220
<400> 113
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Ala Arg Asp Ala Val Asp Asn Met Arg Val Ile Ile Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu
260 265 270
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
355 360
<210> 114
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP221
<400> 114
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1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe
65 70 75 80
Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
355 360
<210> 115
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP221
<400> 115
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165 170 175
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195 200 205
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245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu
260 265 270
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
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290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
355 360
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<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP223
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP224
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<211> 141
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP226
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<211> 161
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 121
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130 135 140
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145 150 155 160
His
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<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP243
<400> 122
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
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Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
His
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<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP244
<400> 123
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 124
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP245
<400> 124
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Ala Arg Asp Ala Ile Ser Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
Ile Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 125
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP246
<400> 125
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
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100 105 110
Ile Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
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Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 126
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP247
<400> 126
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
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Asn Phe His Leu Arg Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
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His
<210> 127
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP248
<400> 127
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
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Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
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Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
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Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
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Asn Phe His Leu Arg Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
Ile Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
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130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
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His
<210> 128
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP249
<400> 128
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
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Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
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Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
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100 105 110
Ile Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
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His
<210> 129
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP250
<400> 129
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
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Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
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145 150 155 160
His
<210> 130
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP251
<400> 130
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Pro Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Ile Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 131
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP252
<400> 131
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Pro Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
Val Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 132
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP253
<400> 132
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Pro Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
Ile Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 133
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP254
<400> 133
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
Ile Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 134
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP255
<400> 134
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Leu Ile Asp Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Ile Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 135
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP256
<400> 135
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Leu Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
Val Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 136
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP257
<400> 136
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Leu Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
Ile Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 137
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP258
<400> 137
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Ala Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Ile Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 138
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP260
<400> 138
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Gln Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 139
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP261
<400> 139
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Ala Ile Ser Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
Ile Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 140
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP262
<400> 140
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Ile Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 141
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP263
<400> 141
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 142
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP280 (IgG1_Fc；臼突变：Y349C, T366S, L368A, F405K, Y407V;ADCC突变：L234A, L235A, P329G)
<400> 142
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 143
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP290 (WT-IL2-IgG1-Fc, T3A, C125S; Fc杵突变：S354C, T366W,K409A; ADCC突变：L234A, L235A, P329G)
<400> 143
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 144
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP291 (EP003-IL2-IgG1-Fc, T3A, C125S; Fc杵突变：S354C,T366W, K409A; ADCC突变：L234A, L235A, P329G
<400> 144
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Gly Val Thr Asp Ser Ile Ser Asn Ala Ile Val Leu Ala Arg Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 145
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP297 (EP001-IL2-IgG1-Fc, T3A, C125S; Fc杵突变：S354C,T366W, K409A; ADCC突变：L234A, L235A, P329G)
<400> 145
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Glu Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Ala Arg Asp Ala Val Asp Asn Met Arg Val Ile Ile Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 146
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP321 (具有C125S突变的WT-IL2)
<400> 146
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His His
130 135 140
<210> 147
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP329
<400> 147
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Gly Leu Thr Glu Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Asn Val Ile Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His His
130 135 140
<210> 148
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP330
<400> 148
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Gly Leu Thr Glu Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Thr Ala Arg Asp Ala Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Ile Gln Glu Leu
85 90 95
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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His His
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 164
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130 135 140
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<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP347
<400> 165
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<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 167
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100 105 110
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<210> 168
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP350
<400> 168
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1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His His
130 135 140
<210> 169
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP351
<400> 169
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser His His His His His His
130 135 140
<210> 170
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP352
<400> 170
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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<220>
<223> 合成序列
<220>
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<222> (1)...(66)
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<210> 172
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(66)
<223> n = A,T,C或G
<400> 172
aactacaaga accccnnsct gacccggatg ctgaccnnsa agttctacat gcctaagaag 60
gccacc 66
<210> 173
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(66)
<223> n = A,T,C或G
<400> 173
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<223> 合成序列
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1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Pro Cys Leu Thr Ala Met Leu Thr Leu Lys Phe Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 191
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr His Lys Phe Val
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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Pro Cys Leu Thr Asp Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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<223> 合成序列
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Cys
1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Pro Lys Leu Thr Ser Met Leu Thr Phe Lys Phe Ser
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Pro Lys Leu Thr Tyr Met Leu Thr Phe Lys Phe Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Pro Lys Leu Thr Gly Met Leu Thr Phe Lys Phe Ser
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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Pro Lys Leu Thr Val Met Leu Thr Phe Lys Phe Ser
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成序列
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Pro Lys Leu Thr Val Met Leu Thr Phe Lys Phe Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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Pro Lys Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Ala
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 208
Pro Lys Leu Thr Asn Met Leu Thr Phe Lys Phe Ala
1 5 10
<210> 209
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 209
Pro Lys Leu Thr Asn Met Leu Thr Phe Lys Phe Ser
1 5 10
<210> 210
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP242 β区2基序
<400> 210
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1 5 10 15
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP247 β区2
<400> 211
Arg Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile Val Gln Glu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP251 β区2
<400> 212
Thr Pro Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Asn Val Ile Ile Gln Glu
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP252 β区2
<400> 213
Thr Pro Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 214
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP253 β区2
<400> 214
Thr Pro Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile Ile Leu Glu
1 5 10 15
<210> 215
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP258 β区2
<400> 215
Thr Ala Arg Asp Ala Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Ile Gln Glu
1 5 10 15
<210> 216
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP260 β区2
<400> 216
Thr Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Asn Val Ile Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 217
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列EP263 β区2
<400> 217
Thr Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile Val Leu Glu
1 5 10 15
<210> 218
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 218
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 219
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 219
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 220
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 220
Gly Gly Gly Ser
1

Claims (120)

1.一种工程化的白细胞介素-2(IL2)多肽，其包含工程化的IL2受体β(IL2Rβ)结合区2基序，所述工程化的IL2受体β(IL2Rβ)结合区2基序包含:
X1-X2-X3-D-X4-X-5-X6-N-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13(SEQ ID NO:1)，
其中X1、X3、X6、X8、X12和X13各自包含任何残基，
其中X2、X4和X10是不带电荷的残基，
其中X5、X7、X9和X11各自包含不带电荷的非极性残基，并且
其中所述工程化的IL2多肽以比野生型IL2多肽大至少10倍的KD与IL2Rβ结合。
2.如权利要求1所述的工程化的IL2多肽，其中X1是不带电荷的极性残基、不带电荷的非极性残基、碱性残基或酸性残基。
3.如权利要求1或2所述的工程化的IL2多肽，其中X1选自C、T、G、W、I、S、E和K。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X1选自G、K、E、C和T。
5.如权利要求1-4中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X2是不带电荷的极性残基或不带电荷的非极性残基。
6.如权利要求1-5中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X2选自Y、P、V、W、L、A和G。
7.如权利要求1-6中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X2选自V、P、W和A。
8.如权利要求1-7中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X3是不带电荷的极性残基、不带电荷的非极性残基、碱性残基或酸性残基。
9.如权利要求1-8中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X3选自S、T、Q、G、M、E、R和K。
10.如权利要求1-9中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X3选自T、G、S、R和E。
11.如权利要求1-10中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X4不是L。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X4是不带电荷的非极性残基或不带电荷的极性残基。
13.如权利要求1-12中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X4选自A、V、S和T。
14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X5选自I、L、T和V。
15.如权利要求1-14中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X5选自I和V。
16.如权利要求1-15中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X6是不带电荷的极性残基、碱性残基或酸性残基。
17.如权利要求1-16中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X6选自S、T、E、D和R。
18.如权利要求1-17中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X6选自S、D、E和T。
19.如权利要求1-18中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X7选自I、A、M和V。
20.如权利要求1-19中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X7选自I、A和M。
21.如权利要求1-20中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X8是不带电荷的极性残基、不带电荷的非极性残基、碱性残基或酸性残基。
22.如权利要求1-21中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X8选自S、T、N、Q、I、G、E、K和R。
23.如权利要求1-22中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X8选自I、R、N和T。
24.如权利要求1-23中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X9选自V、L和I。
25.如权利要求1-24中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X9是V。
26.如权利要求1-25中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X10是不带电荷的极性残基或不带电荷的非极性残基。
27.如权利要求1-26中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X10选自N、T、I和L。
28.如权利要求1-27中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X10选自I和L。
29.如权利要求1-28中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X11选自V、A和I。
30.如权利要求1-29中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X12是不带电荷的极性残基、不带电荷的非极性残基或酸性残基。
31.如权利要求1-30中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X12选自Q、L、G、K和R。
32.如权利要求1-31中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X12选自R、G、Q和K。
33.如权利要求1-32中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X13是不带电荷的非极性残基或碱性残基。
34.如权利要求1-33中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X13选自A、D和E。
35.如权利要求1-33中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中X13选自E和A。
36.如权利要求1所述的工程化的IL2多肽，其中所述工程化的IL2Rβ结合区2选自：GVTDSISNAIVLARE(SEQ ID NO:2)；KWGDAVSNARVLAGE(SEQ ID NO:3)；KWGDAVSNARVLAGA(SEQID NO:4)；TLMDTTDNIGVLVRE(SEQ ID NO:5)；EPSDVISNINVLVQE(SEQ ID NO:6)；SPQDSIENISVLVRE(SEQ ID NO:7)；WASDSIENITLLIQE(SEQ ID NO:8)；CPTDTIENITVLIQE(SEQID NO:9)；RYKDSLENMQIIIQE(SEQ ID NO:10)；TARDAVDNMRVIIQE(SEQ ID NO:11)；TPRDVVENMNVLVLE(SEQ IDNO:12)；TPSDVIENMEVLILD(SEQ ID NO:13)；TPSDAIENINVLIRE(SEQ ID NO:14)；TPSDVIENITVLVQE(SEQ ID NO:15)；GVGDTIDNINVLVKE(SEQ ID NO:16)；IGRDSIDNIKVIVQE(SEQ ID NO:17)；WATDTIRNVEVLVQE(SEQ ID NO:18)；TAEDVVTNITVLVQE(SEQ ID NO:19)；TAEDVISNIRVNVQE(SEQ ID NO:20)和TPSDVIDNVSITVQE(SEQ ID NO:21)；TARDAISNIRVIVQE(SEQ ID NO:210)；RARDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:211)；TPRDAIDNINVIIQE(SEQ ID NO:212)；TPRDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:213)；TPRDAIDNIRVIILE(SEQ ID NO:214)；TARDAISNINVIIQE(SEQ ID NO:215)；和TARDAIDNINVIVQE(SEQ ID NO:216)；和TARDAIDNIRVIVLE(SEQ ID NO:217)。
37.如权利要求1所述的工程化的IL2多肽，其中所述工程化的IL2Rβ结合区2选自：TPRDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:213)；TPRDAIDNIRVIILE(SEQ ID NO:214)；TARDAISNINVIIQE(SEQ ID NO:215)和TARDAIDNINVIVQE(SEQ ID NO:216)。
38.如权利要求1所述的工程化的IL2多肽，其中所述工程化的IL2Rβ结合区2选自：GVTDSISNAIVLARE(SEQ ID NO:2)；KWGDAVSNARVLAGA(SEQ ID NO:4)；EPSDVISNINVLVQE(SEQID NO:6)；CPTDTIENITVLIQE(SEQ ID NO:9)；TARDAVDNMRVIIQE(SEQ ID NO:11)；GVGDTIDNINVLVKE(SEQ ID NO:16)；TAEDVVTNITVLVQE(SEQ ID NO:19)。
39.如权利要求1所述的工程化的IL2多肽，其中所述工程化的IL2Rβ结合区2选自：GVTDSISNAIVLARE(SEQ ID NO:2)；CPTDTIENITVLIQE(SEQ ID NO:9)和TARDAVDNMRVIIQE(SEQ ID NO:11)。
40.一种工程化的IL2多肽，其包含对选自以下的至少一个残基的取代：R81、P82、R83、L85、I86、S87、I89、N90、I92、V93和L94。
41.如权利要求40所述的工程化的IL2多肽，其中所述至少一个残基是L85。
42.如权利要求40所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含对选自以下的至少两个残基的取代：R81、P82、R83、L85、I86、S87、I89、N90、I92、V93和L94。
43.如权利要求42所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含对R81和L85的取代。
44.如权利要求43所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽还包含对S87、N90和L94的取代。
45.如权利要求43所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽还包含对S87、N90和V93的取代。
46.如权利要求43所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽还包含对P82和V93的取代。
47.如权利要求46所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽还包含对N90的取代。
48.如权利要求42所述的工程化的IL2多肽，其中所述至少两个残基选自R81、R83、L85、I92和L94。
49.如权利要求40所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含对选自R81、R83、L85、I92和L94的至少三个残基的取代。
50.如权利要求40所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含对R81、R83、L85、I92和L94的取代。
51.如权利要求40所述的工程化IL2多肽，其中：
(a)所述R81取代选自R81G、R81K、R81E、R81C和R81T；
(b)所述R83取代选自R83T、R83G、R83S和R83E；
(c)所述L85取代选自L85S、L85A、L85V和L85T；
(d)所述I92取代为I92L；以及
(e)所述L94取代选自L94R、L94G、L94Q和L94K。
52.如权利要求1-51中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中与所述野生型IL2相比，所述工程化的IL2多肽对IL2Rβ的亲和力增加。
53.如权利要求52所述的工程化的IL2多肽，其中与所述野生型IL2相比，所述工程化的IL2多肽对IL2Rβ的亲和力增加至少10倍。
54.如权利要求1-53中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中与所述野生型IL2相比，所述工程化的IL2多肽对IL2Rα的亲和力减小。
55.如权利要求1-54中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中所述工程化的IL2多肽与所述野生型IL2相比对IL2Rα具有相似的亲和力。
56.一种工程化的白细胞介素-2(IL2)多肽，其包含工程化的IL2受体α(IL2Rα)结合区1，所述工程化的IL2受体α(IL2Rα)结合区1包含选自以下的取代：位置K35处的取代、R38处的取代、F42处的取代、Y45处的取代或其任何组合，其中与野生型IL2相比，所述工程化的IL2多肽以至少2倍降低的结合动力学与IL2Rα结合。
57.如权利要求56所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含位置K35处的取代。
58.如权利要求57所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置K35处的取代包括非碱性残基。
59.如权利要求57所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置K35处的取代包括不带电荷的残基或酸性残基。
60.如权利要求57所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置K35处的取代选自：K35G、K35L、K35S、K35V、K35D、K35E和K35C。
61.如权利要求56-60中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含位置R38处的取代。
62.如权利要求61所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置R38处的取代包括非碱性带电荷的残基。
63.如权利要求61所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置R38处的取代包括不带电荷的残基或酸性残基。
64.如权利要求61所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置R38处的取代选自：R38V、R38D、R38E、R38S、R38I、R38A、R38Y、R38G、R38C或R38N。
65.如权利要求56-64中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含位置F42处的取代。
66.如权利要求65所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置F42处的取代包括不带电荷的残基。
67.如权利要求65所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置F42处的取代包括带正电荷的残基。
68.如权利要求65所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置F42处的取代选自：F42A、F42R、F42G、F42I、F42L、F42P和F42H。
69.如权利要求56-68中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含位置Y45处的取代。
70.如权利要求69所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置Y45处的取代包括不带电荷的残基。
71.如权利要求69所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置Y45处的取代包括不带电荷的极性残基或不带电荷的非极性残基。
72.如权利要求69所述的工程化的IL2多肽，其中所述位置Y45处的取代是Y45S、Y45P、Y45A、Y45V、Y45C、Y45T和Y45F。
73.如权利要求56-72中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含位置K35处的取代和位置R38处的取代。
74.如权利要求73所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含K35G取代和R38E取代。
75.如权利要求56-74中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含位置K35处的取代和位置F42处的取代。
76.如权利要求75所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含K35S取代和F42G取代。
77.如权利要求56-76中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含位置K35处的取代、位置R38处的取代和位置F42处的取代。
78.如权利要求77中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含K35L取代、R38D取代和F42R取代。
79.如权利要求56-78中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含位置R38处的取代和位置Y45S处的取代。
80.如权利要求79中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含R38D取代和Y45S取代。
81.如权利要求79中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含R38V取代和Y45S取代。
82.如权利要求56-81中任一项所述的工程化的IL2多肽，所述工程化的IL2多肽包含在位置K35、R38、F42和Y45中的至少一个位置处的取代，其中：
i)所述位置K35处的取代选自：K35G、K35L、K35S、K35V、K35D、K35E和K35C；
ii)所述位置R38处的取代选自：R38V、R38D、R38E、R38S、R38I、R38A、R38Y、R38G、R38C或R38N；
iii)所述位置F42处的取代选自：F42A、F42R、F42G、F42I、F42L、F42P和F42H；以及
iv)所述位置Y45处的取代是Y45S、Y45P、Y45A、Y45V、Y45C、Y45T和Y45F。
83.如权利要求82所述的工程化的IL2多肽，其中所述取代在位置K35、R38、F42和Y45中的至少2个、至少3个或全部4个位置处。
84.如权利要求56-83中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中与野生型IL2相比，所述工程化的IL2多肽以至少10倍降低的结合动力学与IL2Rα结合。
85.如权利要求56-84中任一项所述的工程化的IL2多肽，其中所述工程化的IL2Rα结合区1选自：PVLTRMLTIKFY(SEQ ID NO:183)；PKLTRMLTLKFP(SEQ ID NO:184)；PDLTSMLAFKFY(SEQ ID NO:185)；PGLTEMLTFKFY(SEQ ID NO:186)；PSLTRMLTGKFY(SEQ ID NO:187)；PELTIMLTPKFY(SEQ ID NO:188)；PCLTAMLTLKFA(SEQ ID NO:189)；PCLTAMLTLKFA(SEQ IDNO:190)；PKLTRMLTHKFV(SEQ ID NO:191)；PCLTDMLTFKFY(SEQ ID NO:192)；PLLTDMLTRKFY(SEQ ID NO:193)；PLLTDMLTFKFY(SEQ ID NO:194)；PKLTDMLTFKFS(SEQ ID NO:195)；PKLTYMLTRKFY(SEQ ID NO:196)；PKLTRMLTFKFC(SEQ ID NO:197)；PKLTSMLTFKFS(SEQ IDNO:198)；PKLTSMLTFKFS(SEQ ID NO:199)；PKLTYMLTFKFS(SEQ ID NO:200)；PKLTYMLTFKFS(SEQ ID NO:201)；PKLTGMLTFKFS(SEQ ID NO:202)；PKLTVMLTFKFT(SEQ ID NO:203)；PKLTVMLTFKFS(SEQ ID NO:204)；PKLTVMLTFKFP(SEQ ID NO:205)；PKLTVMLTFKFF(SEQ IDNO:206)；PKLTCMLTFKFA(SEQ ID NO:207)；PKLTNMLTFKFA(SEQ ID NO:208)和PKLTNMLTFKFS(SEQ ID NO:209)。
86.一种工程化的IL2多肽，其包含权利要求1-55中任一项所述的工程化的IL2受体β(IL2Rβ)结合区2和权利要求56-85中任一项所述的工程化的IL2受体α(IL2Rα)结合区1。
87.如权利要求86所述的工程化的IL2多肽，其中所述工程化的IL2Rα结合区1选自：PVLTRMLTIKFY(SEQ ID NO:183)；PKLTRMLTLKFP(SEQ ID NO:184)；PDLTSMLAFKFY(SEQ IDNO:185)；PGLTEMLTFKFY(SEQ ID NO:186)；PSLTRMLTGKFY(SEQ ID NO:187)；PELTIMLTPKFY(SEQ ID NO:188)；PCLTAMLTLKFA(SEQ ID NO:189)；PCLTAMLTLKFA(SEQ ID NO:190)；PKLTRMLTHKFV(SEQ ID NO:191)；PCLTDMLTFKFY(SEQ ID NO:192)；PLLTDMLTRKFY(SEQ IDNO:193)；PLLTDMLTFKFY(SEQ ID NO:194)；PKLTDMLTFKFS(SEQ ID NO:195)；PKLTYMLTRKFY(SEQ ID NO:196)；PKLTRMLTFKFC(SEQ ID NO:197)；PKLTSMLTFKFS(SEQ ID NO:198)；PKLTSMLTFKFS(SEQ ID NO:199)；PKLTYMLTFKFS(SEQ ID NO:200)；PKLTYMLTFKFS(SEQ IDNO:201)；PKLTGMLTFKFS(SEQ ID NO:202)；PKLTVMLTFKFT(SEQ ID NO:203)；PKLTVMLTFKFS(SEQ ID NO:204)；PKLTVMLTFKFP(SEQ ID NO:205)；PKLTVMLTFKFF(SEQ ID NO:206)；PKLTCMLTFKFA(SEQ ID NO:207)；PKLTNMLTFKFA(SEQ ID NO:208)和PKLTNMLTFKFS(SEQ IDNo:209)；并且其中所述工程化的IL2Rβ结合区2选自：GVTDSISNAIVLARE(SEQ ID NO:2)；KWGDAVSNARVLAGE(SEQ ID NO:3)；KWGDAVSNARVLAGA(SEQ ID NO:4)；TLMDTTDNIGVLVRE(SEQID NO:5)；EPSDVISNINVLVQE(SEQ ID NO:6)；SPQDSIENISVLVRE(SEQ ID NO:7)；WASDSIENITLLIQE(SEQ ID NO:8)；CPTDTIENITVLIQE(SEQ ID NO:9)；RYKDSLENMQIIIQE(SEQID NO:10)；TARDAVDNMRVIIQE(SEQ ID NO:11)；TPRDVVENMNVLVLE(SEQ ID NO:12)；TPSDVIENMEVLILD(SEQ ID NO:13)；TPSDAIENINVLIRE(SEQ ID NO:14)；TPSDVIENITVLVQE(SEQ ID NO:15)；GVGDTIDNINVLVKE(SEQ ID NO:16)；IGRDSIDNIKVIVQE(SEQ ID NO:17)；WATDTIRNVEVLVQE(SEQ ID NO:18)；TAEDVVTNITVLVQE(SEQ ID NO:19)；TAEDVISNIRVNVQE(SEQ ID NO:20)和TPSDVIDNVSITVQE(SEQ ID NO:21)；TARDAISNIRVIVQE(SEQ ID NO:210)；RARDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:211)；TPRDAIDNINVIIQE(SEQ ID NO:212)；TPRDAIDNIRVIVQE(SEQ ID NO:213)；TPRDAIDNIRVIILE(SEQ ID NO:214)；TARDAISNINVIIQE(SEQ ID NO:215)；和TARDAIDNINVIVQE(SEQ ID NO:216)；和TARDAIDNIRVIVLE(SEQ ID NO:217)。
88.一种融合多肽，其包含与半衰期延长分子融合的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽。
89.如权利要求88所述的融合多肽，其中所述半衰期延长分子包括半衰期延长多肽。
90.如权利要求88所述的融合多肽，其中所述半衰期延长多肽包括Fc结构域、人血清白蛋白(HSA)、HSA结合分子或转铁蛋白。
91.如权利要求88所述的融合多肽，其中所述半衰期延长多肽包含Fc结构域。
92.如权利要求88所述的融合多肽，其中所述半衰期延长分子包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)。
93.一种融合多肽，其包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包括权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽。
94.如权利要求93所述的融合多肽，其中所述第二多肽包括抗原结合部分。
95.如权利要求94所述的融合多肽，其中所述抗原结合部分包括免疫球蛋白。
96.如权利要求95所述的融合多肽，其中所述抗原结合部分包括Fab分子、scFv、双特异性T细胞接合物、双抗体、单结构域抗体或纳米抗体。
97.如权利要求93所述的融合多肽，其中所述第二多肽包括细胞因子。
98.如权利要求97所述的融合多肽，其中所述第二多肽包括白细胞介素2、白细胞介素-15、白细胞介素-7、白细胞介素-10或C-C基序趋化因子配体19(CCL19)。
99.如权利要求93所述的融合多肽，其中所述第二多肽包括权利要求1-87中任一项所述的第二工程化的IL2多肽。
100.一种分离的多核苷酸，其编码至少一种权利要求1-99中任一项所述的多肽。
101.一种表达载体，其包含权利要求100所述的多核苷酸。
102.一种经修饰的细胞，其包含权利要求100所述的分离的多核苷酸或权利要求101所述的表达载体。
103.如权利要求102所述的经修饰的细胞，其还包含工程化的T细胞受体或嵌合抗原受体。
104.一种药物组合物，其包含权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽，或权利要求88-99中任一项所述的融合多肽和药学上可接受的载剂。
105.如权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、如权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或如权利要求104的药物组合物，其用于调节有需要的受试者的免疫反应的方法。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述调节免疫反应包括以下至少一种：增强效应性T细胞活性、增强NK细胞活性和抑制调节性T细胞活性。
107.如权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、如权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或如权利要求104所述的药物组合物，其用于治疗有需要的受试者的疾病的方法。
108.根据权利要求107使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述疾病包括癌症或免疫抑制。
109.根据权利要求108使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述癌症包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌或黑色素瘤。
110.根据权利要求107-109中任一项使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述受试者用附加治疗剂治疗。
111.根据权利要求110使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述附加治疗剂包括抗原结合部分。
112.根据权利要求111使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述抗原结合部分包括单结构域抗体、Fab分子、scFv、双抗体、纳米抗体、双特异性T细胞接合物或免疫球蛋白。
113.根据权利要求111或112使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述抗原结合部分针对肿瘤抗原。
114.根据权利要求110使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述附加治疗剂包括表达嵌合抗原受体的免疫细胞、表达工程化的T细胞受体的免疫细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。
115.根据权利要求114使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述免疫细胞包含编码权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽或权利要求88-99中任一项所述的融合多肽的多核苷酸。
116.根据权利要求110使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述附加治疗剂包括免疫检查点抑制剂。
117.根据权利要求116使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述检查点抑制剂包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM3抑制剂、LAG3抑制剂、B7-H2抑制剂或B7-H3抑制剂。
118.根据权利要求110使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述附加治疗剂包括溶瘤病毒。
119.根据权利要求110使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述附加治疗剂包括肿瘤微环境(TME)抑制剂。
120.根据权利要求110使用的权利要求1-87中任一项所述的工程化的IL2多肽、权利要求88-99中任一项所述的融合多肽或权利要求104所述的药物组合物，其中所述附加治疗剂包括癌症疫苗。
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