JP2022045530A - Ｐｄ－１標的化ｉｌ－２変異体免疫サイトカインとヒトｐｄ－ｌ１に対する抗体との併用療法 - Google Patents

Abstract

【課題】進行がん患者の生存率を高めるために既存の治療法に追加することができる新規治療法の提供。【解決手段】がんの治療の併用療法、転移の予防若しくは治療における併用療法、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激する併用療法、としての使用のための、特定の配列を有するヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせた、特定の配列を有するＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインの提供。【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトの掲載日：２０２０年３月１１日（その後、２０２０年４月６日、４月３０日、６月３日に投稿後更新） ウェブサイトのアドレス（ＵＲＬ）：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０４３０３８５８ 公開者：エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 公開された発明の内容：エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフトが上記ウェブサイトにおいて、進行性および／または転移性固形腫瘍の参加者におけるＲＯ７２８４７５５単独またはアテゾリズマブとの併用での安全性および抗腫瘍活性を評価する研究について公開した。

本発明は、特異的ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する特異的抗体との併用療法に関する。

発明の背景
がんは経済先進国における死因の第１位であり、発展途上国における死因の第２位である。化学療法の最近の進歩と、がん細胞の増殖シグナルの伝達及び制御を妨げる分子レベルを標的とした薬剤の開発にもかかわらず、進行がん患者の予後は一般的に不良なままである。その結果、許容できない毒性を引き起こすことなく生存率を高めるために既存の治療法に追加することができる新規治療法を開発するための持続的かつ緊急の医学的必要性がある。

ＩＬ－２及びＰＤ－１を標的としたＩＬ－２ベースの免疫サイトカイン
インターロイキン２（ＩＬ－２）は、リンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化するサイトカインである。ＩＬ－２は抗腫瘍活性を有することが示されている；しかしながら、高レベルのＩＬ－２は肺毒性を導き、ＩＬ－２の抗腫瘍活性は、多くの抑制性フィードバックループにより制限される。

その抗腫瘍効果に基づき、高用量ＩＬ‐２（アルデスロイキン、プロロイキン（登録商標）として市販）治療は、米国で転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）及び悪性黒色腫の患者、欧州連合で転移性ＲＣＣ患者での使用が承認されている。しかしながら、ＩＬ－２の作用機序の結果として、ＩＬ－２の全身的かつ非標的化された適用は、Ｔｒｅｇ細胞及びＡＩＣＤの誘導を介して抗腫瘍免疫をかなり損なう可能性がある。全身性ＩＬ－２治療のさらなる懸念は、重度の心血管系、肺水腫、肝臓、消化管（ＧＩ）、神経系及び血液学的事象を含む、静脈内投与時の重度の副作用に関連している（プロロイキン（アルデスロイキン）製品概要［ＳｍＰＣ］：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｅｍｃ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ／１９３２２／ＳＰＣ／（２０１３年５月２７日にアクセス））。低用量ＩＬ－２レジメンは、最適以下の治療結果を犠牲にしながらも、患者において試験されている。まとめると、ＩＬ‐２を利用した治療アプローチは、その適用に伴う責任を克服できれば、がん治療に有用である可能性がある。ＰＤ－１標的化抗原結合部分及びＩＬ－２ベースのエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートは、例えば、国際公開第２０１８／１８４９６４号（Ａ１）に記載されている。

ＰＤ－１及びＰＤ－１抗体
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１又はＣＤ２７９）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡをも含む、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ－１は細胞表面受容体であり、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞に発現している（Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8）。ＰＤ‐１の構造は単量体１型膜貫通蛋白質であり、１つの免疫グロブリン可変様細胞外ドメインと、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞質ドメインとからなる。ＰＤ－１に対する２つのリガンド、ＰＤ－Ｌｌ及びＰＤ－Ｌ２が同定されており、これらは、ＰＤ－１に結合するとＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al (2002) Eur J Immunol 32:634-43)）。ＰＤ－ＬｌとＰＤ－Ｌ２は両方ともＰＤ－１に結合するＢ７ホモログであるが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しない。ＰＤ－１の１つのリガンドであるＰＤ－Ｌｌは、様々なヒトがんに豊富に存在する（Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9）。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体を介した増殖の減少、及びがん性細胞による免疫回避をもたらす（Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100）。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の局所的な相互作用を阻害することで逆転させることができ、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２の相互作用も同様に遮断されると、その効果は相加的である（Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66）。ＰＤ－１に結合する抗体は、例えば、国際公開第２０１７／０５５４４３号（Ａ１）に記載されている。

ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ１抗体
Ｔ細胞に対する２つの異なるシグナルの共刺激又は提供は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による静止Ｔリンパ球のリンパ球活性化の広く受け入れられたモデルである。Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975)。

このモデルはさらに、非自己からの自己の区別と免疫寛容とを提供する。Bretscher et al., Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)。一次シグナル、又は抗原特異的シグナルは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）との関連で提示される外来抗原ペプチドの認識に続いて、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して伝達される。二次シグナル、又は共刺激シグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される共刺激分子によりＴ細胞に送達され、Ｔ細胞を誘導してクローン増殖、サイトカイン分泌、及びエフェクター機能を促進する。Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996)。共刺激がない場合、Ｔ細胞は抗原刺激に対して不応性となり、効果的な免疫応答を開始せず、さらに外来抗原に対する枯渇又は寛容をもたらす可能性がある。

ＴＣＲシグナルの強度は実際にＴ細胞の活性化及び分化に対して定量的な影響を有するため、単純な２シグナルモデルは過度の単純化となり得る。Viola et al., Science 273: 104-106 (1996); Sloan-Lancaster, Nature363: 156-159 (1993)。さらに、Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲシグナル強度が高い場合、共刺激シグナルがない場合においても起こり得る。さらに重要なことに、Ｔ細胞は正及び負の両方の二次共刺激シグナルを受け取る。このような正及び負のシグナルの調節は、宿主の防御免疫応答を最大化し、一方で免疫寛容を維持し、自己免疫を防ぐために重要である。

負の二次シグナルはＴ細胞寛容の誘導に必要であると思われ、一方正のシグナルはＴ細胞の活性化を促進する。単純な２シグナルモデルは依然としてナイーブリンパ球の有効な説明を提供するが、宿主の免疫応答は動的な過程であり、共刺激シグナルが抗原曝露Ｔ細胞にも提供され得る。

共刺激の機構は、共刺激シグナルの操作が、細胞に基づく免疫応答を増強するか又は終了させる手段を提供することを示しているため、治療上興味深いものである。最近、Ｔ細胞の機能障害又はアネルギーが、抑制受容体、すなわちプログラム死１ポリペプチド（ＰＤ－１）発現の誘導及び維持と同時に起こることが発見された。結果として、治療標的のＰＤ－１と、ＰＤ－１との相互作用を介してシグナル伝達する他の分子、例えばプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）及びプログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）は、非常に興味深い分野である。ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の阻害は、がん並びに急性及び慢性（例えば持続性）感染を含む感染の治療のためのＴ細胞免疫（例えば，腫瘍免疫）を増強する手段として提案されてきた。しかしながら、この経路において標的に向けられた最適な治療は未だ商品化されておらず、重要な満たされていない医学的必要性が存在している。ＰＤ－Ｌ１に対する抗体は、例えば国際公開第２０１０／０７７６３４号に記載されている。

発明の概要
本発明は、がん若しくは腫瘍の治療における使用のため、転移の予防若しくは治療における使用のため、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することにおける使用のための、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体との併用療法を含む。

本発明は、がん若しくは腫瘍の治療における使用のため、転移の予防若しくは治療における使用のため、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することにおける使用のための医薬の製造のための、ＰＤ－１又はＴ細胞標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインの使用を含み、ここで、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて投与される。

本発明は、がん若しくは腫瘍の治療における使用のため、転移の予防若しくは治療における使用のため、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することにおける使用のための、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体の使用を含み、ここで、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせて投与される。

本発明は、がん若しくは腫瘍の治療方法、転移の予防若しくは治療方法、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激する方法を含み、この方法は、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体との併用療法を投与することを含む。

併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号２のポリペプチド配列、又はｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又はｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又はｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列を含むことを特徴とし；併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又はｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。

本発明の実施態様では、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインとの併用療法は、がんの治療における使用のためのものである。ＰＤ－１は、腫瘍細胞環境において提示され得る。がんは、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓がん、胃がん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫からなる群から選択され得る。

本発明の実施態様では、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインとの併用療法は、転移の予防又は治療における使用のためのものである。

本発明の実施態様では、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインとの併用療法は、腫瘍免疫など、免疫関連疾患を治療すること又はその進行を遅延させることにおける使用のためのものである。

本発明の実施態様では、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインとの併用療法は、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のためのものである。

本発明は、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含み、ここで、免疫サイトカインは、
ｉ）腫瘍における腫瘍増殖の阻害；及び／又は
ｉｉ）腫瘍を有する対象の生存期間中央値及び／又は全生存期間を向上させること
における使用のために、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて投与され；
ここで、ＰＤ－１は、腫瘍細胞環境において、免疫細胞、特にＴ細胞上に提示され、ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号２のポリペプチド配列、又はｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又はｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又はｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列を含むことを特徴とし；
かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又はｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。

本発明は、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含むことができ、ここで、免疫サイトカインは、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて投与され、ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。

本発明は、好ましくは、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含み、ここで、免疫サイトカインは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて投与され、ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし；かつ併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体はアテゾリズマブである。

免疫サイトカインの抗体成分及び抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであり得る。抗体は、低減した又は最小のエフェクター機能を有し得る。最小のエフェクター機能は、エフェクターのない（ｅｆｆｅｃｔｏｒｌｅｓｓ）Ｆｃ変異に起因する可能性がある。エフェクターのないＦｃ変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａであり得る。

本発明のさらなる態様では、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて患者に投与され、ここで、患者は免疫療法で治療されているか、又は前治療されていた。前記免疫療法は、養子細胞移入、モノクローナル抗体の投与、サイトカインの投与、がんワクチンの投与、Ｔ細胞関与療法、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。養子細胞移入は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）修飾Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入細胞、若しくは樹状細胞、又はそれらの任意の組み合わせの投与を含み得る。

本発明はさらに
Ａ）
ｉ）腫瘍増殖の阻害；
ｉｉ）腫瘍を有する対象の生存期間中央値及び／又は全生存期間を向上させること
のための方法であって；
ここで、ＰＤ－１が免疫細胞、特にＴ細胞上に提示され、ここで、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて投与される方法、
又は
Ｂ）腫瘍を有する患者の治療方法であって、ここで、ＰＤ－１が腫瘍細胞環境において発現され、ここで、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて投与される方法
を含み、
ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号２のポリペプチド配列、又はｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又はｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又はｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、
かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又はｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。

本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと抗体の併用療法は、腫瘍細胞上に、又は腫瘍細胞環境において提示された抗原を標的とする治療を必要とする患者に利益を示す。本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと抗体の併用療法は、ＰＤ－１標的化療法を必要とする患者に利益を示す。本発明によるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、標的発現腫瘍を有する対象の生存期間中央値及び／又は全生存期間を向上させることにおいて有効性を示し、とりわけ、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた、がん及び転移の治療において特に有用である。本発明による特異的ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、腫瘍に対する腫瘍増殖阻害活性において有効性を示し、ここで、ＰＤ－１は、腫瘍細胞環境において発現され、とりわけ、本明細書に記載の特異的抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた、がん及び転移の治療において特に有用である。本発明による、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する特異的抗体、特にアテゾリズマブは、腫瘍を有する対象の生存期間中央値及び／又は全生存期間を向上させることにおいて有効性を示し、ここで、ＰＤ－１は腫瘍細胞環境において発現され、とりわけ、本明細書に記載の特異的ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせた、がん及び転移の治療において特に有用である。

本発明の実施態様では、転移の予防若しくは治療における併用療法としての使用のため、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することにおける併用療法としての使用のための、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが提供され、ここで、患者は免疫療法で治療されているか、又は免疫療法で前治療されていた。前記免疫療法は、養子細胞移入、モノクローナル抗体の投与、サイトカインの投与、がんワクチンの投与、Ｔ細胞関与療法、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。養子細胞移入は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）修飾Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入細胞、若しくは樹状細胞、又はそれらの任意の組み合わせの投与を含み得る。

ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ及びｍｕＰＤ－Ｌ１ Ｍａｂを単剤として、並びに併用設定において用いた有効性実験の結果を示す。ＭＣ３８結腸直腸癌細胞株をＢｌａｃｋ ６マウスの皮下に注射し、皮下モデルにおける腫瘍増殖抑制を検討した。腫瘍サイズはキャリパーを使用して測定した。腫瘍が１５０ｍｍ^３に達した時点で治療を開始した。マウス１匹あたりに注射した抗体の量は、ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖについては０．５ｍｇ／ｋｇを週１回（ｑｗ）、ｍｕＰＤ－Ｌ１については初回投与で１０ｍｇ／ｋｇ、その後５ｍｇ／ｋｇを週１回（２ｑｗ）であった。治療は２週間続いた。併用群では、抗体が同時に投与された。ｍｕＰＤ－ＩＬ２ｖ＋ｍｕＰＤ－Ｌ１ Ｍａｂの組み合わせは、ビヒクル、ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ、及びｍｕＰＤ－Ｌ１ Ｍａｂ単剤群と比較して、腫瘍増殖阻害に関して優れた有効性を媒介した。 ＰＤ１－ＩＬ２ｖ治療は、脾臓におけるＴＡＧ抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖をもたらし、ＲｉｐＴａｇ５マウスの腫瘍におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤を増加させることを示している。腫瘍を有するＲｉｐＴａｇ５マウスを、示された薬物で１４日間治療した。図２Ａは、フローサイトメトリーによって測定された脾臓におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を示している。図２Ｂは、脾臓におけるＴＡＧ抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を、総ＣＤ８＋ Ｔ細胞のパーセンテージで示している。図２Ｃは、示された抗体で染色されたＰａｎＮＥＴ腫瘍のＩＨＣを示している（ｎ＝３－５；スケールバー＝２００μｍ）。 ＰＤ１－ＩＬ２ｖと抗ＰＤ－Ｌ１の併用による治療効果の増加を示している。腫瘍を有するＲｉｐＴａｇ５マウスを薬物治療に供し、腫瘍の進行を超音波画像検査によってモニターした。図３Ａは、未治療マウス（ｎ＝３）の腫瘍成長曲線を示す。図３Ｂは、ＰＤ１－ＩＬ２ｖで治療されたＲｉｐＴａｇ５マウスの腫瘍増殖曲線を示す。図３Ｃは、示された抗体で染色された未治療及びＰＤ１－ＩＬ２ｖ再発腫瘍のＩＨＣを示す（ｎ＝３；スケールバー＝５０μｍ）。図３Ｄは、抗ＰＤＬ１で治療されたマウスの腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝４）。図３Ｅは、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ及び抗ＰＤＬ１で治療されたＲｉｐＴａｇ５マウスの腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝７）。 抗ＰＤ－Ｌ１との併用療法がＰＤ１－ＩＬ２ｖの有効性を改善することを示す。図４Ａは、生存率グラフとして表された奏効率を示す。ＰＤ－ＩＬ２ｖの２匹のマウスとＰＤ１－ＩＬ２ｖ＋抗ＰＤ－Ｌ１治療群の１匹のマウスは、完全寛解のために重度の高血糖を発症し、安楽死させなければならなかった。これらのマウスは、グラフでは依然として完全なレスポンダーとみなされた。図４Ｂは、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ及びＰＤ１－ＩＬ２ｖ＋抗ＰＤ－Ｌ１治療の０週間及び２週間後の腫瘍の超音波画像を示す。統計解析：ログランクＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定、^＊ｐ＜０．０２。マウスの数：抗ＰＤ－Ｌ１ ｎ＝４、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ ｎ＝１０、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ＋抗ＰＤ－Ｌ１ ｎ＝７。

発明の詳細な記載
ＩＬ－２経路
ＩＬ－２がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でリンパ球及びＮＫ細胞集団を拡大及び活性化する能力は、ＩＬ－２の抗腫瘍効果を説明している。しかし、過剰な免疫応答や潜在的な自己免疫を防ぐための調節機構として、ＩＬ－２は活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を引き起こし、活性化されたＴ細胞をＦａｓを介したアポトーシスの影響を受けやすくする。

さらに、ＩＬ－２は末梢ＣＤ４^＋ ＣＤ２５^＋ Ｔ_ｒｅｇ細胞の維持と増殖に関与していいる（Fontenot JD, Rasmussen JP, Gavin MA, et al. A function for interleukin 2 in Foxp3 expressing regulatory T cells. Nat Immunol. 2005; 6:1142-1151; D’Cruz LM, Klein L. Development and function of agonist-induced CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the absence of interleukin 2 signaling. Nat Immunol. 2005; 6:1152 1159; Maloy KJ, Powrie F. Fueling regulation: IL-2 keeps CD4+ T_reg cells fit. Nat Immunol. 2005; 6:1071-1072）。これらの細胞は、細胞間接触、又はＩＬ－１０やトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－βなどの免疫抑制性サイトカインの放出を介して、エフェクターＴ細胞が自己又は標的を破壊するのを抑制する。Ｔ_ｒｅｇ細胞の枯渇は、ＩＬ－２誘導抗腫瘍免疫を増強することが示された（Imai H, Saio M, Nonaka K, et al. Depletion of CD4+CD25+ regulatory T cells enhances interleukin-2-induced antitumor immunity in a mouse model of colon adenocarcinoma. Cancer Sci. 2007; 98:416-423）。

ＩＬ－２は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の一次及び二次増殖中のメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞分化においても重要な役割を果たす。ＩＬ－２は、一次抗原曝露後のエフェクター機能の最適な拡大及び生成に関与していると思われる。ほとんどの抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞がアポトーシスによって消失する免疫応答の収縮期に、ＩＬ－２シグナルがＣＤ８＋ Ｔ細胞を細胞死から救済し、記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞の持続的な増加をもたらすことができる。記憶段階では、外因性ＩＬ－２の投与によってＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度を増強することができる。さらに、最初のプライミングの間にＩＬ－２シグナルを受け取ったＣＤ８＋ Ｔ細胞のみが、新たな抗原曝露後の効率的な二次拡大を媒介することができる。このように、免疫応答の異なる段階におけるＩＬ－２シグナルは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞機能を最適化する上で重要であり、それによってこれらのＴ細胞の一次応答及び二次応答の両方に影響を及ぼす（Adv Exp Med Biol. 2010;684:28-41. The role of interleukin-2 in memory CD8 cell differentiation. Boyman O1, Cho JH, Sprent J）。

その抗腫瘍効果に基づき、高用量ＩＬ‐２（アルデスロイキン、プロロイキン（登録商標）として市販）治療は、米国で転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）及び悪性黒色腫患者、欧州連合で転移性ＲＣＣ患者への使用が承認されている。しかしながら、ＩＬ－２の作用機序の結果として、ＩＬ－２の全身的かつ非標的化された適用は、Ｔｒｅｇ細胞及びＡＩＣＤの誘導を介して抗腫瘍免疫をかなり損なう可能性がある。全身性ＩＬ－２治療のさらなる懸念は、重度の心血管系、肺水腫、肝臓、消化管（ＧＩ）、神経系及び血液学的事象を含む、静脈内投与時の重度の副作用に関連している（プロロイキン（アルデスロイキン）製剤特性概要［ＳｍＰＣ］：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｅｍｃ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ／１９３２２／ＳＰＣ／（２０１３年５月２７日にアクセス））。低用量ＩＬ－２レジメンは、最適以下の治療結果を犠牲にしながらも、患者において試験されている。まとめると、ＩＬ‐２を利用した治療アプローチは、その適用に伴う責任を克服できれば、がん治療に有用である可能性がある。

ＰＤ－１標的化抗原結合部分と、例えば変異体ＩＬ－２を含むＩＬ－２ベースのエフェクター部分とを含むイムノコンジュゲートは、例えば、国際公開第２０１８／１８４９６４号（Ａ１）に記載されている。

特に、変異体ＩＬ－２（例えば、ＩＬ－２ ｑｍとして知られる４重変異体）は、ＩＬ－２Ｒαサブユニット（ＣＤ２５）への結合を排除することによって、野生型ＩＬ－２（例えば、アルデスロイキン）又は第１世代のＩＬ－２ベースの免疫サイトカインの制限を克服するように設計されている。この変異体ＩＬ－２ ｑｍは、国際公開第２０１２／１４６６２８号及び国際公開第２０１２／１０７４１７号に記載されているＣＥＡに対するヒト化抗体及びＦＡＰに対する抗体などの様々な腫瘍標的抗体に結合されている。さらに、抗体のＦｃ領域は、Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑ複合体への結合を妨げるように修飾されている。得られた腫瘍標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン（例えば、ＣＥＡ標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及びＦＡＰ標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン）は、非臨床のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ実験において、腫瘍細胞を排除できることが示されている。

したがって、得られた免疫サイトカインは、ＩＬ－２－Ｒαサブユニット（ＣＤ２５）への結合を排除することによって、ＩＬ－２の不利益に対処する、標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインのクラスを代表する。

用語「ＩＬ－２」又は「ヒトＩＬ－２」は、野生型及び野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列に１つ又は複数の変異を含む変異体（例えば、ジスルフィド架橋ＩＬ－２二量体の形成を回避するためのＣ１２５Ａ置換を有する配列番号２に示される変異体）を含むヒトＩＬ－２タンパク質を指す。ＩＬ－２はまた、Ｎ－及び／又はＯ－グリコシル化部位を除去するように変異させてもよい。

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路
Ｔ細胞活性化を調節する重要な負の共刺激シグナルは、プログラム死－１受容体（ＰＤ－１）（ＣＤ２７９）、そのリガンド結合パートナーＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４；配列番号８８）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、ＣＤ２７３）によって提供される。ＰＤ－１の負の調節の役割は、自己免疫を起こしやすいＰＤ－１のノックアウト（Ｐｄｃｄ１－／－）によって明らかになった。Nishimura et al., Immunity 11: 141-51 (1999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001)。ＰＤ－１は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に関連しているが、ホモ二量体化を可能にする、膜に近いシステインを欠いている。ＰＤ－１の細胞質ドメインは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ、Ｖ／ＩｘＹｘｘＬ／Ｖ）を含む。ＰＤ－１はＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２にのみ結合する。Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000); Dong et al., Nature Med. 5: 1365-1369 (1999); Latchman et al., Nature Immunol. 2: 261-268 (2001); Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001)。

ＰＤ－１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、活性化された単球及び樹状細胞（ＤＣ）上に発現し得る。ＰＤ－１は、活性化されたヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄によって発現されるが、刺激されていないヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄によっては発現されない。これは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４のより制限された発現とは対照的である。Nishimura et al., Int. Immunol. 8: 773-80 (1996); Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006)。活性化されたヒトＴ細胞からクローニングされたＰＤ－１の少なくとも４つの変異体があり、それには（ｉ）エクソン２、（ｉｉ）エクソン３、（ｉｉｉ）エクソン２及び３、又は（ｉｖ）エクソン２～４を欠く転写物が含まれる。Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005)。ＰＤ－１Δｅｘ３を例外として、すべての変異体は、静止末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中において完全長ＰＤ－１と同様のレベルで発現される。すべての変異体の発現は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８によるヒトＴ細胞の活性化により有意に誘導された。ＰＤ－１Δｅｘ３変異体は、膜貫通ドメインを欠いており、自己免疫において重要な役割を果たす可溶性ＣＴＬＡ－４に類似している。Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003)。この変異体は、関節リウマチ患者の滑液及び血清中に濃縮される。Wan et al., J. Immunol. 177: 8844-50 (2006)。

２つのＰＤ－１リガンドは、発現パターンが異なる。ＰＤ－Ｌ１は、マウスＴ及びＢ細胞、ＣＤ、マクロファージ、間葉系幹細胞及び骨髄由来のマスト細胞上に恒常的に発現する。Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002)。ＰＤ－Ｌ１は、広範囲の非造血細胞（例えば角膜細胞、肺細胞、血管上皮細胞、肝臓非実質細胞、間葉系幹細胞、膵島、胎盤の合胞体栄養細胞、ケラチノサイト等）上に発現し［Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)］、活性化後多くの細胞型で上方制御される。Ｉ型及びＩＩ型両方のインターフェロンＩＦＮが、ＰＤ－Ｌ１を上方制御する。Eppihimer et al., Microcirculation 9: 133-45 (2002); Schreiner et al., J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004)。ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６及びＭＥＫが阻害されると、細胞株におけるＰＤ－Ｌ１の発現が低下する。Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)。ＪＡＫ２はＰＤ－Ｌ１誘導にも関与している。Lee et al., FEBS Lett. 580: 755-62 (2006); Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007)。ホスファチジルイノシトール ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びＡｋｔシグナル伝達を修飾する細胞ホスファターゼであるホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）の欠失又は抑制は、がんにおける転写後のＰＤ－Ｌ１発現を増加させた。Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-88 (2007)。

ＰＤ－Ｌ２の発現は、ＰＤ－Ｌ１よりも制限されている。ＰＤ－Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ、及び骨髄由来のマスト細胞上に誘導的に発現される。ＰＤ－Ｌ２は、静止腹膜Ｂ１細胞の約半分から３分の２にも発現するが、従来のＢ２ Ｂ細胞上には発現しない。Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007)。ＰＤ－Ｌ２＋Ｂ１細胞は、ホスファチジルコリンに結合し、細菌抗原に対する自然免疫応答にとって重要であり得る。ＩＦＮ－ガンマによるＰＤ－Ｌ２の誘発は、部分的にＮＦ－κＢに依存する。Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706-16 (2003)。ＰＤ－Ｌ２は、ＧＭ－ＣＦ、ＩＬ－４及びＩＦＮ－ガンマにより単球及びマクロファージにも誘発され得る。Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002); Loke et al., PNAS 100:5336-41 (2003)。

ＰＤ－１シグナル伝達は典型的には、細胞増殖よりサイトカイン産生に大きな影響を有し、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ及びＩＬ－２産生に大きな影響を及ぼす。ＰＤ－１を介した抑制性シグナル伝達は、ＴＣＲシグナル伝達の強度にも依存しており、低レベルのＴＣＲ刺激でより大きな抑制性がもたらされる。このような低減は、ＣＤ２８を介した共刺激により［Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)］又はＩＬ－２の存在により［Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)］克服することができる。

ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２によるシグナル伝達が二方向性であるという証拠が増えている。すなわち、ＴＣＲ又はＢＣＲシグナル伝達を改変することに加えて、シグナル伝達はまた、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を発現する細胞に戻るように伝達され得る。ワルデンストレームマクログロブリン血症の患者から単離された天然のヒト抗ＰＤ－Ｌ２抗体による樹状細胞の処理は、ＭＨＣ ＩＩ又はＢ７共刺激分子を上方制御することが見出されなかったが、このような細胞は、より多量の炎症性サイトカイン、特にＴＮＦ－αとＩＬ－６を産生し、Ｔ細胞の増殖を刺激した。Nguyen et al., J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002)。この抗体を用いたマウスの治療はまた、（１）移植されたｂ１６黒色腫に対する抵抗性を高め、腫瘍特異的ＣＴＬを急速に誘導した。Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004); Heckman et al., Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007)；（２）アレルギー性喘息のマウスモデルにおける気道炎症性疾患の発症を遮断した。Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005)。

樹状細胞（「ＤＣ」）への逆シグナル伝達のさらなる証拠は、可溶性ＰＤ－１（Ｉｇ定常領域に融合させたＰＤ－１ ＥＣドメイン－「ｓ－ＰＤ－１」）と共に培養された骨髄由来ＤＣの研究から得られたものである。Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006)。このｓＰＤ－１は、抗ＰＤ－１の投与により可逆的に、ＤＣ活性化を阻害し、ＩＬ－１０産生を増加させた。

さらに、複数の研究は、ＰＤ－１とは無関係である、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の受容体を示している。Ｂ７．１は、ＰＤ－Ｌ１の結合パートナーとして既に同定されている。Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007)。化学的架橋研究は、ＰＤ－Ｌ１及びＢ７．１がそれらのＩｇＶ様ドメインを介して相互作用できることを示唆している。Ｂ７．１：ＰＤ－Ｌ１相互作用は、Ｔ細胞への阻害シグナルを誘導することができる。Ｂ７．１によるＣＤ４＋ Ｔ細胞上でのＰＤ－Ｌ１のライゲーション、又はＰＤ－Ｌ１によるＣＤ４＋ Ｔ細胞上でのＢ７．１のライゲーションは、阻害シグナルを伝達する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３プラスＢ７．１コーティングビーズで刺激されると、増殖及びサイトカイン産生の低減を示す。Ｂ７．１のすべての受容体（すなわち、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、及びＰＤ－Ｌ１）を欠くＴ細胞では、Ｔ細胞の増殖とサイトカイン産生は、もはや抗ＣＤ３プラスＢ７．１コーティングビーズによって阻害されない。これは、Ｂ７．１がＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４の非存在下で、Ｔ細胞上のＰＤ－Ｌ１を介して特異的に作用することを示している。同様に、ＰＤ－１を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３プラスＰＤ－Ｌ１コーティングビーズの存在下で刺激されたとき、増殖とサイトカイン産生の低減を示し、これは、Ｔ細胞上のＢ７．１に対するＰＤ－Ｌ１ライゲーションの抑制効果を実証している。Ｔ細胞がＰＤ－Ｌ１のすべての既知の受容体を欠いている場合（すなわち、ＰＤ－１及びＢ７．１がない場合）、Ｔ細胞の増殖は抗ＣＤ３＋ＰＤ－Ｌ１コーティングビーズによってもはや損なわれなかった。したがって、ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ７．１又はＰＤ－１により、Ｔ細胞に対し抑制効果を発揮することができる。

Ｂ７．１とＰＤ－Ｌ１の間の直接的な相互作用は、共刺激に対する現在の理解が不十分であることを示唆しており、Ｔ細胞上でのこれらの分子の発現に対する重要性を強調している。ＰＤ－Ｌ１－／－ Ｔ細胞の研究は、Ｔ細胞上のＰＤ－Ｌ１がＴ細胞サイトカイン産生を下方制御できることを示している。Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004)。ＰＤ－Ｌ１とＢ７．１の双方がＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージ上に発現することから、これらの細胞型上でＢ７．１とＰＤ－Ｌ１との間の指向性相互作用が存在する可能性がある。加えて、非造血細胞上のＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞上のＢ７．１及びＰＤ－１と相互作用することができ、それらの調節にＰＤ－Ｌ１が関与しているのかどうかという疑問を提起している。Ｂ７．１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の阻害効果の１つの可能な説明は、Ｔ細胞ＰＤ－Ｌ１が、ＣＤ２８との相互作用からＡＰＣ Ｂ７．１を捕捉又は分離させ得るということである。

結果として、ＰＤ－１、Ｂ７．１又はこれらの双方とＰＤ－Ｌ１との相互作用をブロックすることにより、ＰＤ－Ｌ１が負の共刺激シグナルをＴ細胞及び他の抗原提示細胞に送ることを防ぐことを含む、ＰＤ－Ｌ１によるシグナル伝達の拮抗作用は、感染症（例えば急性及び慢性）に反応する免疫及び腫瘍免疫を増強させる可能性が高い。さらに、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の他の成分のアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ－１及び抗ＰＤ－Ｌ２抗体と組み合わせることができる。

用語「ヒトＰＤ－Ｌ１」は、ヒトタンパク質ＰＤ－Ｌ１（配列番号４、典型的にはＰＤ－１シグナル伝達）を指す。本明細書で使用する場合、「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合」又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合」又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する」又は「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０^－８ｍｏｌ／ｌ以下、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０^－９ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性でヒトＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）などの標準的な結合アッセイで決定される。したがって、本明細書で使用される「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体」は、ＫＤ値１．０ｘ１０^－８モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０^－８モル／ｌ～１．０ｘ１０^－１３モル／ｌ）、一実施態様ではＫＤ値１．０ｘ１０^－９モル／ｌ以下（一実施態様では、１．０ｘ１０^－９モル／ｌ～１．０ｘ１０^－１３モル／ｌ）の結合親和性でヒトＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。

特に、本発明者らは、ＰＤ－１を標的とする変異体ＩＬ－２が、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて使用される場合、ｉｎ ｖｉｖｏで優れた治療効果を提供することを発見した。

リンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を増殖及び活性化するＩＬ－２の能力は、ＩＬ－２の抗腫瘍活性の根底にある。ＩＬ－２のＩＬ－２αサブユニット（ＣＤ２５）への結合を排除するように設計されたＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２の制限を克服し、また、ＣＥＡ標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン又はＦＡＰ標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインなど、腫瘍を標的としたＩＬ－２変異体免疫サイトカインの一部として、腫瘍細胞を排除できることが示されている。

免疫サイトカイン及び抗体
本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、
ＰＤ－１発現免疫細胞、特にＴ細胞上に、又は腫瘍細胞環境においてＰＤ－１に結合する抗体、又はその抗原結合断片、及び
ＩＬ－２受容体のαサブユニットへの結合親和性が（野生型ＩＬ－２、例えば配列番号２として示されるヒトＩＬ－２と比較して）低減したＩＬ－２変異体、特にヒトＩＬ－２の変異体であって、以下：
ｉ）配列番号２として示されるヒトＩＬ－２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される１、２又は３つの位置での１、２又は３つのアミノ酸置換、例えば、３つの位置での３つの置換、例えば、特定のアミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ；又は
ｉｉ）ｉ）に記載の特徴に加えて、配列番号２として示されるヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置でのアミノ酸置換、例えば、特定のアミノ酸置換Ｔ３Ａ；又は
ｉｉｉ）配列番号２として示されるヒトＩＬ－２の残基３、４２、４５及び７２に対応する位置での４つのアミノ酸置換、例えば、特定のアミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ
を含むＩＬ－２など
を含む。

本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、
免疫細胞、特にＴ細胞上に、又は腫瘍細胞環境において提示されるＰＤ－１に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、及び２つのサブユニットからなり、２つの非同一のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含むＦｃドメイン、及び
ＩＬ－２受容体のαサブユニットへの結合親和性が（野生型ＩＬ－２、例えば配列番号２として示されるヒトＩＬ－２と比較して）低減したＩＬ－２変異体、特にヒトＩＬ－２の変異体であって、以下：
ｉ）配列番号２として示されるヒトＩＬ－２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される１、２又は３つの位置での１、２又は３つのアミノ酸置換、例えば、３つの位置での３つの置換、例えば、特定のアミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ；又は
ｉｉ）ｉ）に記載の特徴に加えて、配列番号２として示されるヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置でのアミノ酸置換、例えば、特定のアミノ酸置換Ｔ３Ａ；又は
ｉｉｉ）配列番号２として示されるヒトＩＬ－２の残基３、４２、４５及び７２に対応する位置での４つのアミノ酸置換、例えば、特定のアミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ
を含むＩＬ－２など
を含み得る。

併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号２のポリペプチド配列、又はｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又はｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又はｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列を含み得る。

いくつかの実施態様では、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含む。

これらのＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、抗原結合部分の構成部分、Ｆｃドメイン、及びエフェクター部分とともに、国際公開第２０１８／１８４９６４号に記載されているイムノコンジュゲートの例として記載されている。例えば、抗ＣＥＡ抗体ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１及びＩＬ－２四重変異体（ｑｍ）（配列番号３）に基づく特定の免疫サイトカイン「ＰＤ－１標的化ＩｇＧ－ＩＬ－２ ｑｍ融合タンパク質」は、配列番号７及び８及び９として示される配列を有し、例えば、２０１８／１８４９６４の実施例１及び２に記載されている。

２０１８／１８４９６４に記載されている特定のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、本明細書に記載されている以下のポリペプチド配列を含むことを特徴とする：

国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、ＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２受容体のαサブユニットへの結合親和性が低減している。βサブユニット及びγサブユニット（それぞれＣＤ１２２とＣＤ１３２としても知られている）と一緒に、αサブユニット（ＣＤ２５としても知られている）はヘテロ三量体の高親和性ＩＬ－２受容体を形成し、一方、βサブユニットとγサブユニットのみからなる二量体受容体は、中間親和性ＩＬ－２受容体と呼ばれる。国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、ＩＬ－２受容体のαサブユニットへの結合が低減したＩＬ－２変異体ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞においてＩＬ－２シグナル伝達を誘導する能力が低減し、Ｔ細胞において、より少ない活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を誘導し、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロファイルが低減している。毒性が低減されたこのようなＩＬ－２変異体の使用は、Ｆｃドメインの存在に起因する長い血清半減期を有する、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインにおいて特に有利である。ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－と比較して、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のαサブユニットに対するＩＬ－２変異体の親和性を低減されるか又は無効にするが、中間親和性ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２受容体のβサブユニットとγサブユニットからなる）に対するＩＬ－２変異体の親和性は保持する少なくとも１つのアミノ酸変異を含み得る。１つ又は複数のアミノ酸変異は、アミノ酸置換であり得る。ＩＬ－２変異体は、ヒトＩＬ－２（配列番号２として示される）の残基４２、４５、及び７２に対応する位置から選択される１、２又は３つの位置に１、２又は３つのアミノ酸置換を含み得る。ＩＬ－２変異体は、ヒトＩＬ－２の残基４２、４５及び７２に対応する位置に３つのアミノ酸置換を含み得る。ＩＬ－２変異体は、ヒトＩＬ－２の変異体であり得る。ＩＬ－２変異体は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含むヒトＩＬ－２であり得る。ＩＬ－２変異体はさらに、ＩＬ－２のＯ－グリコシル化部位を排除する、ヒトＩＬ－２の３位に対応する位置にアミノ酸変異を含み得る。特に、前記追加のアミノ酸変異は、スレオニン残基をアラニン残基で置換するアミノ酸置換である。本発明において有用な特定のＩＬ－２変異体は、ヒトＩＬ－２（配列番号２として示される）の残基３、４２、４５及び７２に対応する位置に４つのアミノ酸置換を含む。特異的アミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇである。国際公開第２０１２／１４６６２８号の実施例に示されるように、前記四重変異体ＩＬ－２ポリペプチド（ＩＬ－２ ｑｍ）は、ＣＤ２５への検出可能な結合を示さず、Ｔ細胞にアポトーシスを誘導する能力の低減、Ｔ_ｒｅｇ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を誘導する能力の低減、及びｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロファイルの低減を示している。しかしながら、エフェクター細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を活性化し、エフェクター細胞の増殖を誘導し、ＮＫ細胞により二次サイトカインとしてのＩＦＮ－γを生成させる能力を保持している。上記の記載のいずれかによるＩＬ－２変異体は、発現又は安定性の増加などのさらなる利点を提供する追加の変異を含み得る。例えば、位置１２５のシステインは、ジスルフィド架橋ＩＬ－２二量体の形成を回避するために、アラニンなどの中性アミノ酸で置換されてもよい。したがって、ＩＬ－２変異体は、ヒトＩＬ－２の残基１２５に対応する位置に追加のアミノ酸変異を含み得る。前記追加のアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａであり得る。ＩＬ－２変異体は、配列番号３のポリペプチド配列を含み得る。

好ましい実施態様では、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインのＰＤ－１標的化は、国際公開第２０１８／１８４８９６４号に記載されているように、ＰＤ－１を標的化することによって達成され得る。ＰＤ－１標的化は、抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片を用いて達成することができる。抗ＰＤ－１抗体は、配列番号５の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含み得る。抗ＰＤ－１抗体は、配列番号６の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含み得る。抗ＰＤ－１抗体は、配列番号５の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体、及び配列番号６の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含み得る。抗ＰＤ－１抗体は、配列番号５の重鎖可変領域配列及び配列番号６の軽鎖可変領域配列を含み得る。

ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択されるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含み得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ＣＥＡに特異的なＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含み得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７若しくは配列番号８のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含み得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ＰＤ－１に特異的なＦａｂ軽鎖を含み得る。ＣＥＡ標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合され得る。Ｆｃドメインポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（これは、ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇと呼ばれ得る）を含み得る。

国際公開第２０１８／１８４９６４号に記載されているように、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、８、及び９として示される配列を有するＰＤ－１標的化ＩｇＧ－ＩＬ－２ ｑｍ融合タンパク質であり得る（例えば、国際公開第２０１８／１８４９６４号の実施例１に記載されているように）。配列番号７、８及び９として示される配列を有するＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、本明細書において「ＰＤ１－ＩＬ２ｖ」と呼ばれる。

本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、免疫細胞、特にＴ細胞上に、又は腫瘍細胞環境において提示される抗原に結合する抗体と、ＩＬ－２受容体のサブユニットへの結合親和性が低減したＩＬ－２変異体とを含み得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、免疫細胞、特にＴ細胞上に、又は腫瘍細胞環境において提示されるＰＤ－１に結合する抗体と、ＩＬ－２受容体のサブユニットへの結合親和性が低下したＩＬ－２変異体とで本質的に構成され得る。抗体は、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体であり得る。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ＩＬ－２受容体のサブユニットへの結合親和性が低減した単一のＩＬ－２変異体を含み得る（すなわち、１つ以下のＩＬ－２変異体部分が存在する）。

本明細書に記載されるように、本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、免疫細胞、特にＴ細胞に、又は腫瘍細胞環境において結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン、及び２つのサブユニットからなり、２つの非同一のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含むＦｃドメインを含み得る。本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、免疫細胞、特にＴ細胞に、又は腫瘍細胞環境において結合する抗体の重鎖可変ドメイン及びノブ変異を含むＦｃドメインサブユニット、免疫細胞、特にＴ細胞に、又は腫瘍細胞環境において結合する抗体の重鎖可変ドメイン及びホール変異を含むＦｃドメインサブユニット、免疫細胞、特にＴ細胞に、又は腫瘍細胞環境において結合する抗体の軽鎖可変ドメイン、及びＩＬ－２受容体のサブユニットへの結合親和性が低減したＩＬ－２変異体を含み得る。したがって、免疫サイトカインは、２つの同一でないポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含むＦｃドメインを含み得る。「ヘテロ二量体化を促進する修飾」は、ポリペプチと同一のポリペプチドが会合してホモ二量体を形成することを低減する又は妨げる、ペプチド骨格の操作又はポリペプチドの翻訳後修飾である。本明細書で使用されるヘテロ二量体化を促進する修飾は、特に、二量体を形成することが望まれる２つのポリペプチドの各々に対して行われる別個の修飾を含み、ここで、修飾は、２つのポリペプチドの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、ヘテロ二量体化を促進する修飾は、二量体を形成することが望まれるポリペプチドの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それらの会合をそれぞれ立体的に又は静電的に有利にすることができる。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットなど、２つの同一でないポリペプチド間で生じ、ここで、各サブユニット（例えば、抗原結合部分、エフェクター部分）に融合されたさらなるイムノコンジュゲート成分は同一ではない。本発明によるイムノコンジュゲートにおいて、ヘテロ二量体化を促進する修飾は、Ｆｃドメインにある。いくつかの実施様態では、ヘテロ二量体化を促進する修飾は、アミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、ヘテロ二量体化を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に、別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのポリペプチド鎖間の最も広範なタンパク質間相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。特定の実施態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの一方にノブ修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットのうちの他方にホール修飾を含む、ノブ・イントゥー・ホール修飾である。

ノブ・イントゥー・ホール技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621(1996)、及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15(2001)に記載されている。一般に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面において隆起（「ノブ」）及び第２のポリペプチドの接触面において対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、その結果、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、隆起が空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面から小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。隆起と同一か又は類似のサイズの相補的空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することによって、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により改変することにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体をさらに安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。Ｆｃ領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従っている。本明細書で使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定した自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。

別の実施態様では、２つの同一でないポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのポリペプチド鎖の接触面において、荷電したアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。

ＩＬ－２受容体のサブユニットへの結合親和性が低減したＩＬ－２変異体は、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に融合され得る。理論に縛られることを望まないが、ＩＬ－２変異体のＦｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、２つのＩＬ－２変異体ポリペプチドを含むホモ二量体免疫サイトカインの生成をさらに最小限に抑えるであろう（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）。

免疫サイトカインのＦｃドメインは、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性を変化させ、特にＦｃγ受容体への結合親和性を変化させるように操作することができる。Ｆｃドメインの補体成分、特にＣ１ｑへの結合は、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、変化し得る。Ｆｃドメインは、イムノコンジュゲートに、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期及び良好な組織－血液分布比を含む好ましい薬物動態特性を付与する。しかし同時に、それは、好適な抗原保有細胞よりもむしろ、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対するイムノコンジュゲートの望ましくない標的化を導く可能性がある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化は、サイトカイン放出を引き起こす可能性があり、これは、エフェクター部分とイムノコンジュゲートの長い半減期との組み合わせで、サイトカイン受容体の過剰な活性化をもたらし、全身投与されると重篤な副作用を引き起こす。これと一致して、従来のＩｇＧ－ＩＬ－２免疫複合体は注入反応に関連していると説明されている（例えば、King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)を参照）。

したがって、免疫サイトカインのＦｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合親和性が低減するように操作され得る。そのような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同一の１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。一実施態様では、前記アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低減させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低減させる１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１に低減させ得る。一実施態様では、操作されたＦｃドメインを含むイムノコンジュゲートは、操作されていないＦｃドメインを含むイムノコンジュゲートと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より具体的には５％未満を示す。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体、より具体的には、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ受容体である。好ましくは、これらの受容体の各々への結合は低減する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むイムノコンジュゲート）が、Ｆｃドメインの非操作形態（又は、Ｆｃドメインの前記非操作形態を含むイムノコンジュゲート）の約７０％を上回るＦｃＲｎに対する結合親和性を示すときに達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のイムノコンジュゲートは、そのような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示し得る。一実施態様では、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５でのアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ）を含む。アミノ酸置換のこの組み合わせは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号はまた、そのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定するための方法を記載している。Ｆｃ領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従っている。

変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知であり、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、遺伝学的又は化学的方法を使用して、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝学的方法は、コードするＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。

一実施態様では、Ｆｃドメインは、国際公開第２０１２／１４６６２８号に記載されているように、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクター機能が低減するように操作されている。エフェクター機能の低減は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を含むことができる。

ＩｇＧ_４抗体は、ＩｇＧ_１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を示す。よって、いくつかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_４ Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８でのアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はそのエフェクター機能をさらに低減させるために、一実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５でのアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様では、ＩｇＧ_４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５、及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換、具体的にはＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇのアミノ酸置換を含む。そのようなＩｇＧ_４ Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる欧州特許出願番号国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。

本明細書に記載の併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、２４３．５５．Ｓ７０、２４３．５５．Ｈ１、２４３．５５．Ｈ１２、２４３．５５．Ｈ３７、２４３．５５．Ｈ７０、２４３．５５．Ｈ８９、２４３．５５．Ｓ１、２４３．５５．５、２４３．５５．８、２４３．５５．３０、２４３．５５．３４、２４３．５５．Ｓ３７、２４３．５５．４９、２４３．５５．５１、２４３．５５．６２、及び２４３．５５．８４からなる群より選択される。

これらの抗体は、国際公開第２０１０／７７６３４号に記載される（配列は国際公開第２０１０／７７６３４号の図１１に示されている）。

本発明の一実施態様では、本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号２のポリペプチド配列、又はｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又はｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又はｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又はｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。

一実施態様では、本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、並びに配列番号２のポリペプチド配列を含むことを特徴とする。

ある実施態様では、本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とする。

一実施態様では、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。

本発明の好ましい実施態様では、本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。

本発明の好ましい実施態様では、本明細書に記載の併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体はアテゾリズマブである。

定義
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む。

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合し、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、 Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６（Ｂ１）号を参照のこと）。抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含むがこれらに限定されない様々な技術により作製することができる。

本明細書で使用される場合の用語「抗原結合ドメイン」又は「抗体の抗原結合部分」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、かつ抗原の一部又は全部に相補的である領域を含む抗体の部分を指す。したがって、この用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義されるような超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端までのドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、抗体の特性を定義する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義及び／又は「超可変ループ」からの残基に従って決定される。

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。

用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる、ＣＥＡ又はヒトＰＤ－Ｌ１などの抗原のタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループからなり、通常、エピトープは特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。コンフォメーションエピトープと非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下では、前者への結合が失われるが後者への結合は失われないという点で区別される。

本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化し得るが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶと定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在してなくともよい。本明細書に特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従っている。抗体のＦｃドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与していないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃドメイン」は、当業者にはよく知られた用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。抗体又は免疫グロブリンは、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じてＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスに分類され、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。重鎖定常領域に従って、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、補体因子Ｃ１ｑがほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃドメインに結合することによって開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃドメインに定義された結合部位によって引き起こされる。そのような結合部位は当技術分野で知られており、例えば、Boackle, R.J., et al., Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；ＥＰ０３０７４３４により記載されている。そのような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９である（番号付けはＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．のＥＵインデックスに従う。上記を参照）。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、並びにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、一方、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。

一実施態様では、本明細書に記載の免疫サイトカインの抗体成分又は抗体は、ヒト起源に由来するＦｃドメイン、及び好ましくはヒト定常領域の他のすべての部分を含む。本明細書で使用される場合、用語「ヒト起源由来のＦｃドメイン」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃドメイン、好ましくは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ１サブクラスの変異Ｆｃドメイン（一実施態様ではＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラスのＦｃドメイン又はヒトＩｇＧ４サブクラスの変異Ｆｃドメイン（一実施態様ではＳ２２８Ｐに変異を有する）のいずれかであるＦｃドメインを指す。一実施態様では、前記抗体は、低減した又は最小のエフェクター機能を有する。一実施態様では、最小のエフェクター機能は、エフェクターのないＦｃ変異に起因する。一実施態様では、エフェクターのないＦｃ変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである。一実施態様では、エフェクターのないＦｃ変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ及びＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＥＵ番号付け）を含む（からなる）群から、互いに独立して抗体のそれぞれについて選択される。

一実施態様では、本明細書に記載の免疫サイトカインの抗体成分又は抗体は、ヒトＩｇＧクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラス）のものである。

好ましい実施態様では、本明細書に記載の免疫サイトカインの抗体成分又は抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施態様では、本明細書に記載の免疫サイトカインの抗体成分又は抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。一実施態様では、本明細書に記載の免疫サイトカインの抗体成分又は抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。

一実施態様では、本明細書に記載の免疫サイトカインの抗体成分又は抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴とする。そのような定常鎖は、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．により記載されている（例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照）。

本明細書で使用される用語「核酸」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシアルファ－アミノ酸の群を意味する。

参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、ユーザー文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、ここで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）のＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされていなければならない。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの（又はこれに対する）％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと（又はこれに対して）特定の％アミノ酸配列同一性を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａ、ということもできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一の一致としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がその参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに５個までの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がその参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドを欠失させるか又は別のヌクレオチドで置換しても良く、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような改変は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続した群として散在してもよい。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ－２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。

用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本明細書に記載のポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。

用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子を導入し、その発現を誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクター、及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施形態では、発現ベクターは、本明細書に記載のポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

用語「人工」とは、合成の、又は非宿主細胞由来の組成物、例えば化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを指す。

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドを生成するために使用することができる任意の種類の細胞系である。一実施形態では、宿主細胞は、ポリペプチドのＦｃ領域に修飾オリゴ糖を有するポリペプチドの産生を可能にするように操作される。特定の実施態様では、宿主細胞は、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する１つ又は複数のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作されている。特定の実施態様では、宿主細胞は、α－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する１つ又は複数のポリペプチドの増加したレベルを発現するようにさらに操作されている。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等の哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。

本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上述したように、免疫サイトカイン（断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定され得る。一実施態様では、１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともにイムノコンジュゲート（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であり得るか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、免疫サイトカイン（断片）（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えばベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、ベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、免疫サイトカイン（断片）、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域には、限定されないが、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインなどの特殊なエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、１つ又は複数の制御配列と結合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに結合しているプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写に影響を与えることができる場合には、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に結合しているであろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン－Ａと連結した最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ－αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写調節領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンを誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。また、発現カセットは、例えば複製起点及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆位末端配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込みエレメントといった他の特徴を含んでいてもよい。

本明細書に記載のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、免疫サイトカインの分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、免疫サイトカイン又はその断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る排出輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを知っている。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作動可能に結合している、ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。

後の精製を容易にするため（例えばヒスチジンタグ）又は免疫サイトカインの標識化における補助のために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡが、免疫サイトカイン（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれ得る。

さらなる実施態様では、本明細書に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本明細書に記載の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。１つのそのような実施態様では、宿主細胞は、本明細書に記載の免疫サイトカイン（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、免疫サイトカイン又はその断片を生成するように操作され得る任意の種類の細胞系を指す。免疫サイトカインの複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当技術分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大規模な発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させて、臨床応用に十分な量の免疫サイトカインを得ることができる。適切な宿主細胞には、大腸菌などの原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などの様々な真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でない場合、細菌中で産生され得る。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌などの真核微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生を結果として生じる菌類及び酵母菌株を含む、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。植物細胞培養物を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照のこと。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。

これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術は当技術分野で知られている。抗体の重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方を発現するように操作することができる。

本明細書に記載の免疫サイトカインを産生する方法が提供され、ここで、方法は、免疫サイトカインの発現に適した条件下で、本明細書で提供される免疫サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から免疫サイトカインを回収することを含む。

免疫サイトカインの構成要素は、通常互いに融合している。免疫サイトカインは、その構成要素が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野でよく知られた方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。必要に応じて、融合物の個々の成分を分離するための切断部位を組み込むために、例えばエンドペプチダーゼ認識配列などの追加の配列も含まれ得る。

免疫サイトカインは、少なくとも、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然の抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Harlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え的に産生することができ、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許第５９６９１０８号を参照）。抗原結合部分及びそれを生成するための方法はまた、ＰＣＴ公開国際公開第２０１１／０２０７８３号に詳細に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の免疫サイトカインには、任意の動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を使用することができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。免疫サイトカインがヒトでの使用を意図している場合、抗体の定常領域がヒト由来であるキメラ形態の抗体を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当技術分野でよく知られている方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それらの方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴うか又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様部分で「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」ことが含まれる。ヒト化抗体及びその製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、さらに、例えば、Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号； Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）移植について記載）；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)（「リサーフェイシング」について記載）；Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)（「ＦＲシャフリング」について記載）；Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005)及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)（ＦＲシャフリングへの「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」アプローチについて記載）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で知られた様々な技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、そのような抗体から由来することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原曝露に応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照）。ファージは通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。ファージディスプレイによるイムノコンジュゲートのための抗原結合部分の調製の詳細な説明は、ＰＣＴ公開国際公開第２０１１／０２０７８３号に添付された実施例に見出すことができる。

特定の実施態様では、抗体は、例えば、国際公開第２０１１／０２０７８３号（親和性成熟に関連する実施例を参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示された方法に従って、増強された結合親和性を有するように操作される。免疫サイトカインが特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００システムで解析）（Liljeblad 、et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。競合アッセイを、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定するため、例えばＣＥＡへの結合についてＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１抗体と競合する抗体を同定するために使用することができる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）によるＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第６６巻の「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化された抗原（例えば、ＣＥＡ）は、抗原に結合する第１の標識抗体（例えば、ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１抗体）及び抗原への結合について第１の抗体と競合する能力について試験される第２の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化された抗原が、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体が、抗原への結合において第１の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。

本明細書で記載のように調製される免疫サイトカインは、当技術分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、免疫サイトカインが結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、免疫サイトカインのアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用され得る。連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的に国際公開第２０１２／１４６６２８号の実施例に記載されているように免疫サイトカインを単離することができる。免疫サイトカインの純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。例えば、免疫サイトカインは、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示されるように、インタクトで適切に組み立てられていることが示され得る。

本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、国際公開第２０１８／１８４９６４号の実施例に記載されているように調製することができる。

本明細書に記載の抗体は、好ましくは組換え手段によって産生される。そのような方法は、当技術分野において広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現、それに続く抗体ポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。タンパク質発現のために、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸は、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、適切な原核又は真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母又は大腸菌細胞で行われ、抗体は、これらの細胞から（上清から又は細胞溶解後に）回収される。

抗体の組換え産生は、当技術分野でよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説記事に記載されている。

抗体は、全細胞中に、細胞溶解物中に、又は部分的に精製されたか若しくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。精製は、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知のその他の技術を含む標準的な技術により除去するために実施される。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照。

ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．によるＣｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１－８３、並びにＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．によるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１－１９９に記載されている。

本発明による重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組み合わされて、発現ベクターコンストラクトを形成する。重鎖発現コンストラクト及び軽鎖発現コンストラクトは、単一のベクターに組み込まれ、宿主細胞にコトランスフェクト、連続トランスフェクト又は別々にトランスフェクトされ、その後融合されて、双方の鎖を発現する単一の宿主細胞を形成することができる。

原核生物に適切な制御配列は、例えばプロモーター、任意選択的にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、その核酸は「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合は、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合は、コード配列に作動可能に連結されており、又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置されている場合は、コード配列に作動可能に連結されている。通常、「作動可能に連結」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続していて、かつリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも連続している必要はない。連結は、都合よい制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、慣行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。

モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーといった一般的な免疫グロブリン精製手順により、培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、一般的な手順を使用し、容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として機能し得る。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され、その後、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又は骨髄腫細胞中にトランスフェトされ、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。

本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は互換的に用いられ、すべてのそのような名称は子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、初代の対象細胞と、導入回数に関係なく、これに由来する培養物とを含む。また、意図的な又は偶然の突然変異に起因して、すべての子孫がＤＮＡ量において厳密に同一でなくてもよいことが理解される。元々の形質転換細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。

治療方法及び組成物
本発明は、本発明によるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体との、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインの併用療法の治療的有効量を患者に投与することを特徴とする、治療を必要とする患者を治療するための方法を含む。

本発明は、記載された併用療法のための本発明によるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を伴うＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインの使用を含む。

本発明の１つの好ましい実施態様は、がん又は腫瘍の治療における使用のための、本発明のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体とのＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインの併用療法である。

したがって、本発明の一実施態様は、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたがん又は腫瘍の治療における使用のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインである。

本発明の別の実施態様は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせたがん又は腫瘍の治療における使用のための、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。

がん又は腫瘍は、腫瘍細胞環境において、例えばＰＤ－１＋ Ｔ細胞上に抗原を提示し得る。併用療法の標的としてのＰＤ－１は、腫瘍細胞環境において、例えばＰＤ－１＋ Ｔ細胞において提示され得る。治療は固形腫瘍に対するものであり得る。治療は癌に対するものであり得る。がんは、結腸直腸がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん及び胃がんからなる群から選択され得る。がんは、肺がん、結腸がん、胃がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がん、肝臓がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、脳がん、骨格筋がんからなる群から選択され得る。

本明細書で使用される用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病（任意の、上記がんの難治性型、又は上記がんのうちの１つ又は複数の組み合わせを含む）であり得る。好ましい一実施態様では、そのようながんは、乳がん、結腸直腸がん、黒色腫、頭頚部がん、肺がん又は前立腺がんである。好ましい一実施態様では、そのようながんは、乳がん、卵巣がん、子宮頚がん、肺がん又は前立腺がんである。別の好ましい実施態様では、そのようながんは、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、黒色腫がん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頚部がん、結腸直腸がん、膵臓がん、胃がん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫である。

本発明の実施態様は、上記のがん又は腫瘍のいずれかの治療における使用のための、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインである。

本発明の別の実施態様は、上記のがん又は腫瘍のいずれかの治療における使用のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせた、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。

本発明は、がんの治療のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用療法を含む。

本発明は、転移の予防又は治療のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用療法を含む。

本発明は、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用療法を含む。

本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を患者に投与することを特徴とする、それを必要とする患者におけるがんの治療のための方法を含む。

本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を患者に投与することを特徴とする、それを必要とする患者における転移の予防又は治療のための方法を含む。

本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を患者に投与することを特徴とする、それを必要とする患者において、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激するための方法を含む。

本発明は、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたがんの治療における使用のための、あるいは、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたがんの治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含む。

本発明は、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた転移の予防又は治療における使用のための、あるいは、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた転移の予防又は治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含む。

本発明は、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための、あるいは、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせた、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための医薬の製造のための、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含む。

本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせたがんの治療における使用のための、あるいは、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせたがんの治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせた転移の予防又は治療における使用のための、あるいは、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせた転移の予防又は治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせた、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能の刺激における使用のための、あるいは、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと組み合わせた、Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための医薬の製造のための、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

本発明の好ましい実施態様では、上記の併用治療及び異なる疾患の医学的使用において使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とするＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインであり、そのような併用治療で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする。

本発明の好ましい実施態様では、上記の併用治療及び異なる疾患の医学的使用において使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とするＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインであり、そのような併用治療で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、アテゾリズマブである。

別の態様では、本発明は、組成物、例えば、薬学的に許容される担体と一緒に調製された、本明細書に記載のＰＤ－１標的ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合部分を含む薬学的組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合する、任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤並びに吸収／再吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、注射又は注入に適している。

本発明の組成物は、当技術分野で知られている様々な方法によって投与することができる。当業者により認識されているように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化するであろう。

薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液若しくは分散液の調製用の滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で知られている。水の他に、担体は、例えば等張緩衝生理食塩水とすることができる。

選択された投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られている一般的な方法により薬学的に許容される剤形に製剤化される。

本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性でなく（有効量）、特定の患者、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するために効果的な有効成分の量を得るために変化させてもよい。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、使用される特定の組成物と併用で用いられる他の薬物、化合物、及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態、及び既往歴、並びに医学の技術分野において周知である同様の要因を含む多様な薬物動態因子に依存するであろう。

一態様では、本発明は、疾患の治療を目的とした、同じ容器中又は別個の容器中に、（ａ）本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン、（ｂ）本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を含み、任意で、（ｃ）疾患を治療するための方法としての併用治療の使用を指示する印刷された説明書を含む添付文書をさらに含むキットを提供する。さらに、キットは、（ａ）組成物がその中に含まれる第１の容器であって、該組成物が本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を含む、第１の容器；（ｂ）組成物が含まれる第２の容器であって、該組成物が本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含む、第２の容器；及び任意で、（ｃ）組成物がその中に含まれる第３の容器であって、該組成物がさらなる細胞傷害性剤又は他の治療剤を含む、第３の容器を含み得る。本発明のこの実施態様におけるキットは、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに備えてもよい。代替的に又は追加的に、キットは、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第３の（又は第４の）容器をさらに備えてもよい。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。

一態様では、本発明は、（ａ）本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含む容器、及び（ｂ）疾患を治療するための方法としての、本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との併用療法におけるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインの使用を指示する説明書を含む添付文書を含む、疾患の治療を目的としたキットを提供する。

別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む容器、及び（ｂ）疾患を治療するための方法としての、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインとの併用療法における抗ＰＤ－Ｌ１抗体の使用を指示する説明書を含む添付文書を含む、疾患の治療を目的としたキットを提供する。

さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含む、疾患の治療を目的とした医薬であって、前記医薬が、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体との併用療法における使用のためのものである医薬を提供し、かつ任意で、疾患を治療するための方法としての併用治療の使用を指示する印刷された説明書を含む添付文書を含む。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を含む、疾患の治療を目的とした医薬であって、前記医薬が、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインとの併用療法における使用のためのものである医薬を提供し、かつ任意で、疾患を治療するための方法としての併用治療の使用を指示する印刷された説明書を含む添付文書を含む。

用語「治療方法」又はこれと同義の用語は、例えばがんに適用される場合、患者におけるがん細胞の数を減少若しくは消滅させるように、又はがんの症状を緩和するように設計された手順又は一連の行為を指す。がん又は他の増殖性疾患の「治療方法」は、がん細胞若しくは他の疾患が実際に取り除かれること、細胞の数若しくは疾患が実際に低減されること、又はがん若しくは他の疾患の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味しない。がんの治療方法はしばしば、成功の可能性が低くても実施されるであろうが、それは、患者の病歴及び推定余命を考慮して、それでも全体的に有益な作用過程を誘導するとみなされている。

「と組み合わせて投与される」又は「共投与」、「共投与する」、「併用療法」又は「併用治療」という用語は、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び本明細書に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体の、例えば、別々の製剤／適用としての（又は単一の製剤／適用としての）投与を指す。共投与は、同時であっても又は任意の順序で逐次的であってもよいが、両方（又はすべて）の活性剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間があることが好ましい。前記活性剤は、同時に又は逐次的に（例えば、持続注入を介して静脈内（ｉ．ｖ．）に）共投与される。両方の治療剤が逐次的に共投与される場合、用量は、同じ日に２回の別々の投与で投与されるか、又は一方の薬剤が１日目に投与され、第２の薬剤が２日目から７日目、好ましくは２日目から４日目に共投与される。このように、一実施態様では、用語「逐次的に」は、第１の成分の投与後７日以内、好ましくは第１の成分の投与後４日以内を意味し；用語「同時に」は、同じ時点でを意味する。ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の維持用量に関する「共投与」という用語は、治療サイクル（例えば毎週）が両方の薬物にとって適切である場合、維持用量が同時に共投与され得ることを意味する。又は、維持用量は逐次的に共投与され、例えば、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと抗ＰＤ－Ｌ１抗体の用量が隔週で投与される。

それぞれの化合物の量又は併用量が、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医によって求められている組織、系、動物若しくはヒトの生物学的又は医学的奏功を引き出すであろう、「治療的有効量」（又は単に「有効量」）で、抗体が患者に投与されることは自明である。

共投与の量及び共投与のタイミングは、治療される患者のタイプ（人種、性別、年齢、体重など）及び状態、並びに治療される疾患又は状態の重症度に依存するであろう。前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、一度に、又は一連の治療にわたって、例えば、同日又は翌日に、又は１週間間隔で患者に適切に共投与される。

抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインに加えて、化学療法剤も投与することができる。

一実施態様では、本明細書に記載のＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び本明細書に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と共に投与することができるそのような追加の化学療法剤は、限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタードを含むアルキル化剤を含む抗新生物剤；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）等のニトロソ尿素）；テモダール（Ｔｅｍｏｄａｌ）（ＴＭ）（テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ））、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルテレタミン）等のエチレンイミン／メチルメラミン；ブスルファンなどのアルキルスルホネート；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジン；葉酸アナログ、例えばメトトレキサート及びトリメトレキサート、ピリミジンアナログ、例えば５－フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５－アザシチジン、２，２’－ジフルオロデオキシシチジン、プリンアナログ、例えば６－メルカプトプリン、６－チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｍｎｅ）、アザチオプリン、Ｔ－デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリトロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２－ＣｄＡ）を含む代謝拮抗薬；抗有糸分裂薬、例えばパクリタキセル、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチンを含む天然物；ピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びテニポシド；抗生物質、例えばアクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシン；酵素、例えばＬ－アスパラギナーゼ；生体応答修飾物質、例えばインターフェロン－アルファ、ＩＬ－２、Ｇ－ＣＳＦ、及びＧＭ－ＣＳＦ；白金配位錯体、例えばオキサリプラチン、シスプラチン、及びカルボプラチン、アントラセンジオン、例えばミトキサントロン、置換尿素、例えばヒドロキシウレア、Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、例えばミトタン（ｏ、ｐ－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドを含む様々な薬剤；副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、例えばプレドニゾンとその等価物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドを含むホルモン及びアンタゴニスト；ジェムザール（ＴＭ）（ゲムシタビン）、プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロンアセテート及び酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン；テストステロンプロピオナート及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリド；並びに非ステロイド性抗アンドロゲン、例えばフルタミドが挙げられる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、脱メチル化剤（例えばＶｉｄａｚａ）及び転写抑制解除（ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＡＴＲＡ）療法を含むがこれらに限定されないエピジェネティックなメカニズムを標的とする療法も、抗原結合タンパク質と組み合わせることができる。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン類（例えばパクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）パクリタキセル（例えばアブラキサン及びオパキシオ））、ドキソルビシン、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）及び他の多種キナーゼ阻害剤、オキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン及びビンブラスチンから成る群より選択される。一実施態様では、化学療法剤は、タキサン類（例えばタキソール（パクリタキセル）、ドセタキセル（タキソテール）、改変されたパクリタキセル（例えばアブラキサン及びオパキシオ）から成る群より選択される。一実施態様では、追加的化学療法剤は、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン又はオキサリプラチンから選択される。一実施態様では、化学療法剤は、５－フルオロウラシル、ロイコボリン、及びイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）である。一実施態様では、化学療法剤は、５－フルオロウラシル及びオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）である。

追加的化学療法剤との併用療法の特定の例は、例えば、乳がんの治療のためのタキサン（例えばドセタキセル又はパクリタキセル）又は修飾されたパクリタキセル（例えばアブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン）、カペシタビン及び／又はベバシズマブ（アバスチン）を用いる療法；卵巣がんのためのカルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン（又は修飾されたドキソルビシン（Ｃａｅｌｙｘ又はドキシル）），又はトポテカン（ハイカムチン）を用いる療法；腎臓がんの治療のための多種キナーゼ阻害剤、ＭＫＩ、（スーテント、ネクサバール又は７０６）、及び／又はドキソルビシンを用いる療法；扁平上皮癌の治療のためのオキサリプラチン、シスプラチン、及び／又は放射線を用いる療法；肺がんの治療のためのタキソール及び／又はカルボプラチンを用いる療法を含む。

したがって、一実施態様では、追加的化学療法剤は、乳がんの治療のためのタキサン（ドセタキセル又はパクリタキセル又は修飾されたパクリタキセル（アブラキサン又はオパキシオ）、ドキソルビシン、カペシタビン及び／又はベバシズマブの群から選択される。

一実施態様では、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン／ＰＤ－Ｌ１抗体併用療法は、化学療法剤が投与されないものである。

本発明はまた、本明細書に記載されるような疾患に罹患した患者の治療のための方法を含む。

本発明はさらに、本明細書に記載の本発明によるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン、及び本明細書に記載の本発明による抗ＰＤ－Ｌ１抗体の有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む薬学的組成物の製造のための方法と、そのような方法のための、本明細書に記載の本発明によるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体の使用とを提供する。

本発明は、がんに罹患している患者の治療のための、好ましくは薬学的に許容される担体と一緒の医薬品の製造のための、本明細書に記載の本発明によるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及び本明細書に記載の本発明による抗ＰＤ－Ｌ１抗体の有効量での使用をさらに提供する。

細胞療法
いくつかの実施態様では、免疫療法は、活性化免疫療法である。いくつかの実施態様では、免疫療法は、がん治療として提供される。いくつかの実施態様では、免疫療法は養子細胞移入を含む。

いくつかの実施態様では、養子細胞移入は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）の投与を含む。当業者は、ＣＡＲが、細胞外腫瘍結合部分、最も一般的にはモノクローナル抗体からの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に融合された細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインから構成される一種の抗原標的化受容体であることを理解するであろう。

ＣＡＲは、ＭＨＣを介した提示とは無関係に、細胞表面抗原を直接認識し、すべての患者において任意の所定の抗原に特異的な単一の受容体構築物の使用を可能にする。初期のＣＡＲは、抗原認識ドメインをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のＣＤ３活性化鎖に融合させた。これらの第１世代のＣＡＲは、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＴ細胞のエフェクター機能を誘導したが、ｉｎ ｖｉｖｏでは抗腫瘍効果が乏しいため、大きく制限されていた。その後のＣＡＲの反復には、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）やＯＸ４０（ＣＤ１３４）などの様々なＴＮＦ受容体ファミリー分子からの細胞内ドメインを含む、ＣＤ３とタンデムでの二次共刺激シグナルが含まれている。さらに、第３世代の受容体は、ＣＤ３に加えて、最も一般的にはＣＤ２８及び４－１ＢＢからの２つの共刺激シグナルを含む。第２世代及び第３世代のＣＡＲは、抗腫瘍効果を劇的に改善し、場合によっては進行がん患者の完全寛解を誘導する。一実施態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現するように改変された免疫応答性細胞であり、これは、ＣＡＲがその抗原に結合するときに活性化される。

一実施態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原受容体を含む免疫応答性細胞であり、受容体がその抗原に結合すると活性化される。一実施態様では、本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＡＲ Ｔ細胞は、第１世代のＣＡＲ Ｔ細胞である。別の実施態様では、本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＡＲ Ｔ細胞は、第２世代のＣＡＲ Ｔ細胞である。別の実施態様では、本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＡＲ Ｔ細胞は、第３世代のＣＡＲ Ｔ細胞である。別の実施態様では、本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＡＲ Ｔ細胞は、第４世代のＣＡＲ Ｔ細胞である。

いくつかの実施態様では、養子細胞移入は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）修飾Ｔ細胞を投与することを含む。当業者は、ＴＣＲ修飾Ｔ細胞が、腫瘍組織からＴ細胞を単離し、それらのＴＣＲａ及びＴＣＲβ鎖を単離することによって製造されることを理解するであろう。これらのＴＣＲａ及びＴＣＲβは、後にクローン化され、末梢血から単離されたＴ細胞にトランスフェクトされ、その後、腫瘍を認識するＴ細胞からＴＣＲａ及びＴＣＲβを発現する。

いくつかの実施態様では、養子細胞移入は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を投与することを含む。いくつかの実施態様では、養子細胞移入は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾ＮＫ細胞を投与することを含む。当業者は、ＣＡＲ修飾ＮＫ細胞が、患者から単離されたＮＫ細胞、又は腫瘍特異的タンパク質を認識するＣＡＲを発現するように操作された市販のＮＫを含むことを理解するであろう。

いくつかの実施態様では、養子細胞移入は樹状細胞を投与することを含む。

いくつかの実施態様では、免疫療法は、がんワクチンの投与を含む。当業者は、がんワクチンが免疫系をがん特異的抗原及びアジュバントに曝露することを理解するであろう。いくつかの実施態様では、がんワクチンは、ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ、ＧＶＡＸ、ＡＤＸＳ１１－００１、ＡＤＸＳ３１－００１、ＡＤＸＳ３１－１６４、ＡＬＶＡＣ－ＣＥＡ ｖａｃｃｉｎｅ、ＡＣ Ｖａｃｃｉｎｅ、ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ、ＢｉｏｖａｘＩＤ、Ｐｒｏｓｔｖａｃ、ＣＤＸ１１０、ＣＤＸ１３０７、ＣＤＸ１４０１、ＣｉｍａＶａｘ－ＥＧＦ、ＣＶ９１０４、ＤＮＤＮ、ＮｅｕＶａｘ、Ａｅ－３７、ＧＲＮＶＡＣ、ｔａｒｍｏｇｅｎｓ、ＧＩ－４０００、ＧＩ－６２０７、ＧＩ－６３０１、ＩｍＰＡＣＴ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＩＭＡ９０１、ｈｅｐｃｏｒｔｅｓｐｅｎｌｉｓｉｍｕｔ－Ｌ、Ｓｔｉｍｕｖａｘ、ＤＣＶａｘ－Ｌ、ＤＣＶａｘ－Ｄｉｒｅｃｔ、ＤＣＶａｘ Ｐｒｏｓｔａｔｅ，ＣＢＬＩ、Ｃｖａｃ、ＲＧＳＨ４Ｋ、ＳＣＩＢ１、ＮＣＴ０１７５８３２８、及びＰＶＸ－４１０を含む群から選択される。

以下の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順において修正を行うことができることが理解される。

以下の記述において、本発明の実施態様が説明される。
１． Ａ）がんの治療、転移の予防若しくは治療、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することにおける使用のための、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン；
又は
Ｂ）がんの治療、転移の予防若しくは治療、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することにおける使用のための、医薬の製造のためのＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインの使用；
又は
Ｃ）がんの治療、転移の予防若しくは治療、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することにおける使用のための、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン
であって；
ここで、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて投与され；
ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、
ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び配列番号２のポリペプチド配列、又は
ｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列
を含むことを特徴とし、
かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、
ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とする。
２． 併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン、又は前述の実施態様のいずれか一項に従った使用。
３． 併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体がアテゾリズマブである、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン、又は前述の実施態様のいずれか一項に従った使用。
４． 免疫サイトカインの抗体成分及び抗体が、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン、又は前述の実施態様のいずれか一項に従った使用。
５． 前記抗体が、低減した又は最小のエフェクター機能を有することを特徴とする、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン、又は前述の実施態様のいずれか一項に従った使用。
６． 最小のエフェクター機能が、エフェクターのないＦｃ変異に起因する、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン、又は前述の実施態様のいずれか一項に従った使用。
７． エフェクターのないＦｃ変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＥＵ番号付け）である、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン、又は前述の実施態様のいずれか一項に従った使用。
８． Ａ）がんの治療、転移の予防若しくは治療、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することのための方法であって、ここで、ＰＤ－１が腫瘍細胞環境において提示され；
ここで、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて投与される、
方法、
又は
Ｂ）腫瘍を有する患者の治療方法であって、ここで、ＰＤ－１が腫瘍細胞環境において提示され、ここで、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせて投与される方法
であって；
ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインは、
ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び配列番号２のポリペプチド配列、又は
ｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列
を含むことを特徴とし、
かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体は、
ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とする。
９． それを必要とする患者におけるがんの治療のため、それを必要とする患者における転移の予防若しくは治療のため、又はそれを必要とする患者において、Ｔ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激するための方法であって、
ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと抗ＰＤ－Ｌ１抗体を患者に投与することを含み、
ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、
ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び配列番号２のポリペプチド配列、又は
ｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列
を含むことを特徴とし、
かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、
ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とする、
方法。
１０． がんの治療のための、実施態様９に記載の方法。
１１． 乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓がん、胃がん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫の治療のための、実施態様１０に記載の方法。
１２． 併用療法で使用されるＰＤ１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、実施態様８から１１のいずれか一項に記載の方法。
１３． 併用療法で使用されるＰＤ１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体がアテゾリズマブである、実施態様８から１２のいずれか一項に記載の方法。
１４． 免疫サイトカインの抗体成分及び抗体が、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする、実施態様８から１３のいずれか一項に記載の方法。
１５． 前記抗体が、低減した又は最小のエフェクター機能を有することを特徴とする、実施態様８から１４のいずれか一項に記載の方法。
１６． 最小のエフェクター機能が、エフェクターのないＦｃ変異に起因する、実施態様８から１５のいずれか一項に記載の方法。
１７． エフェクターのないＦｃ変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＥＵ番号付け）である、実施態様８から１６のいずれか一項に記載の方法。
１８． 前記ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及びヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、同時に又は逐次的に投与される、実施態様８から１７のいずれか一項に記載の方法。
１９． 前記患者に化学療法剤を投与することをさらに含む、実施態様８から１８のいずれか一項に記載の方法。
２０． それを必要とする患者におけるがんの治療、それを必要とする患者における転移の予防若しくは治療、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することを目的とし、同じ容器中又は別個の容器中に、（ａ）ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインと、（ｂ）ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と、任意で、（ｃ）併用治療における、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及びヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体の使用を指示する印刷された説明書を含む添付文書とを含む
キットであって、
ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、
ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び配列番号２のポリペプチド配列、又は
ｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列
を含むことを特徴とし、
かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、
ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とする
キット。
２１． それを必要とする患者におけるがんの治療、それを必要とする患者における転移の予防若しくは治療、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することを目的とし、（ａ）ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含む容器と、（ｂ）疾患を治療するための方法としての、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体との併用療法におけるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインの使用を指示する説明書を含む添付文書とを含む、キットであって、
ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、
ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び配列番号２のポリペプチド配列、又は
ｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列
を含むことを特徴とし、
かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、
ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とする
キット。
２２． それを必要とする患者におけるがんの治療、それを必要とする患者における転移の予防若しくは治療、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することを目的とし、（ａ）ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を含む容器、及び（ｂ）疾患を治療するための方法としての、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインとの併用療法におけるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体の使用を指示する説明書を含む添付文書を含む
キットであって、
ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、
ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び配列番号２のポリペプチド配列、又は
ｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列
を含むことを特徴とし、
かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、
ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とする
キット。
２３． がんの治療のための、実施態様２１から２２に記載のキット。
２４． 乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓がん、胃がん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫の治療のための、実施態様２３に記載のキット。
２５． 併用療法で使用されるＰＤ１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、実施態様２１から２４のいずれか一項に記載のキット。
２６． 併用療法で使用されるＰＤ１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体がアテゾリズマブである、実施態様２１から２４のいずれか一項に記載のキット。
２７． 免疫サイトカインの抗体成分及び抗体が、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする、実施態様２１から２６のいずれか一項に記載のキット。
２８． 前記抗体が、低減した又は最小のエフェクター機能を有することを特徴とする、実施態様２１から２７のいずれか一項に記載のキット。
２９． 最小のエフェクター機能が、エフェクターのないＦｃ変異に起因する、実施態様２１から２８のいずれか一項に記載のキット。
３０． エフェクターのないＦｃ変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＥＵ番号付け）である、実施態様２１から２９のいずれか一項に記載のキット。
３１． それを必要とする患者におけるがんの治療、それを必要とする患者における転移の予防若しくは治療、それを必要とする患者における炎症性疾患の治療、それを必要とする患者における腫瘍免疫などの免疫関連疾患を治療すること又はその進行を遅延させること、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することを目的とし、
ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインを含む
医薬であって、
ここで、前記医薬は、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体との併用療法における使用のためのものであり、任意で、併用治療における、ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン及びヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体の使用を指示する印刷された説明書を含む添付文書を含み、
ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、
ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び配列番号２のポリペプチド配列、又は
ｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又は
ｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列
を含むことを特徴とし、
かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、
ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ
を含むことを特徴とする
医薬。
３２． がんの治療のための、実施態様３１に記載の医薬。
３３． 乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓がん、胃がん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫の治療のための、実施態様３２に記載の医薬。
３４． 併用療法で使用されるＰＤ１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、実施態様３１から３３のいずれか一項に記載の医薬。
３５． 併用療法で使用されるＰＤ１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体がアテゾリズマブである、実施態様３１から３３のいずれか一項に記載の医薬。
３６． 免疫サイトカインの抗体成分及び抗体が、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする、実施態様３１から３５のいずれか一項に記載の医薬。
３７． 前記抗体が、低減した又は最小のエフェクター機能を有することを特徴とする、実施態様３１から３６のいずれか一項に記載の医薬。
３８． 最小のエフェクター機能が、エフェクターのないＦｃ変異に起因する、実施態様３１から３７のいずれか一項に記載の医薬。
３９． エフェクターのないＦｃ変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＥＵ番号付け）である、実施態様３１から３８のいずれか一項に記載の医薬。
４０． 免疫療法による治療又は前治療を含む、実施態様１から３９のいずれかに記載の使用又は医薬の使用又は使用のための組み合わせ。
４１． 前記免疫療法が、養子細胞移入、モノクローナル抗体の投与、サイトカインの投与、がんワクチンの投与、Ｔ細胞関与療法、又はそれらの任意の組み合わせを含む、実施態様４０。
４２． 養子細胞移入が、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）修飾Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入細胞、若しくは樹状細胞、又はそれらの任意の組み合わせの投与を含む、実施態様４１。

実施例
マウスサロゲートＰＤ－１－ＩＬ２ｖイムノコンジュゲートを単独で、及びマウスサロゲートＰＤ－Ｌ１ Ｍａｂと組み合わせて、同系マウスモデル及びＲＴ５トランスジェニックマウスモデルにおける抗腫瘍効果について試験した。

材料
ＰＤ１－Ｉｌ２ｖ及びｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ
抗体重鎖のための発現カセット－インターロイキン－２（ＩＬ－２）融合タンパク質［抗ヒトＰＤ－１抗体の重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１重鎖（エフェクター機能の除去のための変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）、並びにヘテロ二量体化（「ノブ」）のための変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を有する）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー、及びヒトＩＬ－２ｖ（Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ、及びＣ１２５Ａの変異を有する）］、抗体重鎖のための発現カセット［抗ヒトＰＤ－１抗体の重鎖可変領域、及びヒトＩｇＧ１重鎖（エフェクター機能の除去のための変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）、ヘテロ二量体化（「ホール」）のための変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４１０Ｖ（ＥＵ番号付け）、並びに任意選択的に変異Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ（ＥＵ番号付け）を有する］及び抗体軽鎖のための発現カセット［抗ヒトＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域、及びヒトＣｋａｐｐａ定常領域］。遺伝子合成によって生成された。

それらはそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ消化を介して、ＣＭＶプロモーターとそれに続くＩｎｔｒｏｎＡの制御下で発現ベクターにクローン化され、ＢＧＨ－ポリＡシグナルによって終結した。ベクターはさらに、細菌のアンピシリン耐性遺伝子と大腸菌からの複製起点を含んでいた。

ヒトＰＤ１－ＩＬ－２ｖ融合タンパク質（配列番号７、８及び９）は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を上記のベクターと１：１：１の比率で振とうフラスコ中で同時導入することにより生成された。１週間後、上清を回収し、滅菌フィルターを介してろ過した。

融合タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって上清から精製された。得られた生成物は、質量分析による同一性、及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）による純度、単量体含有量及び安定性などの分析特性について特徴づけられた。

マウスサロゲートＰＤ１－ＩＬ２ｖ融合タンパク質（配列番号１２、１３及び１４）も同様に産生された。サロゲート分子は、マウスＩｇＧ１抗マウスＰＤ－１抗体（エフェクター機能の除去のため及びヘテロ二量体化のためのＦｃ変異を有する）及びヒト分子に類似した変異を有するマウスインターロイキン－２を含む。

両方の融合タンパク質は、良好な収率で産生することができ、安定している。

ヒト／マウス交差反応性抗ＰＤ－Ｌ１抗体を研究に使用した。例えば、国際公開第２０１０／０７７６３４号（配列は図１１に示される）に記載されているＹＷ２４３．５５．Ｓ７０ＰＤ－Ｌ１抗体に基づく抗マウスＰＤ－Ｌ１サロゲート抗体であって、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０ ＰＤ－Ｌ１ ｍｕＩｇＧ１と呼ばれるものが、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおける使用のために生成された。この抗体は、ＦｃγＲ相互作用を無効にするＤＡＰＧ変異を含んでいた。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０の可変領域は、ＤＡＰＧ Ｆｃ変異を有するマウスＩｇＧ１定常ドメインに結合していた。

ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０ ＰＤ－Ｌ１ｍｕＩｇＧ１のポリペプチド配列は以下の通りである。
ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０ ＰＤ－Ｌ１ ｍｕＩｇＧ１ ＤＡＰＧ ＨＣ（配列番号２１）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＡＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ

ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０ ＰＤ－Ｌ１ ｍｕＩｇＧ１ ＬＣ（配列番号２２）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ

実施例１
ＭＣ３８結腸直腸皮下同系モデル
マウスサロゲートＰＤ１－ＩＬ２ｖイムノコンジュゲート（ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ：配列番号１２、１３、１４）を、Ｂｌａｃｋ６マウスに皮下注射されたマウス結腸直腸ＭＣ３８細胞株で試験した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤ－Ｌ１ ６Ｅ１１ ｍｕＩｇＧ１を、この研究において使用した（配列番号２１、２２）。

ＭＣ３８結腸直腸癌腫瘍細胞株は、１０％のＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ中で、３７℃、５％のＣＯ２の水飽和雰囲気中で常套的に培養された。継代１１は、９１％の生存率で、移植のために使用された。１匹あたり５ｘ１０^５個の細胞を、１ｍｌのツベルクリンシリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、１００μｌのＲＰＭＩ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中でマウスの脇腹に皮下注射した。

実験開始時に６～８週齢のメスのＢｌａｃｋ ６（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）は、特定の病原体がない条件下で、コミットされたガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、毎日１２時間の明所／１２時間の暗所のサイクルで維持された。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために維持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。

マウスは、試験日０日目に５ｘ１０^５個のＭＣ３８細胞を皮下注射し、無作為化し、体重を測定した。腫瘍細胞注射（腫瘍体積＞１５０ｍｍ^３）の１週間後、マウスに、ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ｍｕＰＤ－Ｌ１－Ｍａｂ、又はｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ＋ｍｕＰＤ－Ｌ１－Ｍａｂの組み合わせを２週間、静脈内注射した。すべてのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。ビヒクル群のマウスにはヒスチジン緩衝液を注射し、治療群にはｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ構築物０．５ｍｇ／ｋｇを週１回（ｑｗ）、又はｍｕＰＤ－Ｌ１ Ｍａｂ１０ｍｇ／ｋｇを静注で（ｉｖ）１回、その後５ｍｇ／ｋｇを週２回（２ｑｗ）注射し、あるいはｍｕＰＤ１－ＩＬ－２ｖ＋ｍｕＰＤ－Ｌ１ Ｍａｂの組み合わせを注射した。２００μｌあたり適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要に応じてストック溶液をヒスチジン緩衝液で希釈した。

図１及び表１Ａは、ｍｕＰＤ－ＩＬ２ｖとｍｕＰＤ－Ｌ１ Ｍａｂの組み合わせが、ｍｕＰＤ１－ＩＬ２ｖ及びｍｕＰＤ－Ｌ１Ｍａｂの単独と比較して腫瘍増殖阻害に関して優れた有効性を媒介したことを示している。

実施例２
ＰａｎＮＥＴのＲｉｐ－Ｔａｇ５（ＲＴ５）トランスジェニックマウスモデル
方法
ＰａｎＮＥＴのＲｉｐ－Ｔａｇ５（ＲＴ５）トランスジェニックマウスモデル。Ｒｉｐ－Ｔａｇ５マウスの生成は以前に記載されている（J Clin Invest. 1996;97(1):54-64。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７２／ＪＣＩ１１８４０６）。この研究のＲｉｐ－Ｔａｇ５マウスは、Ｃ５７Ｂ６／Ｎバックグラウンドであった。動物実験は、承認されたライセンスＶＤ３１３３及びＶＤ３４７５の下で実施された。

ＲＴ５マウスでの前臨床薬物試験。Ｒｉｐ－Ｔａｇ５マウスを試験に登録するために、２２週齢のマウスをＭＳ５５０Ｄ ４０ＭＨｚトランスデューサー（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃ）を備えたＶｅｖｏ２１００システムを使用した超音波画像検査によってＰａｎＮＥＴの存在についてスクリーニングした。Ｒｉｐ－Ｔａｇ５は、累積腫瘍負荷に基づいて、異なる治療群に無作為に割り当てられた。長期研究のために、腫瘍は２週間ごとにモニターされた。

薬と投薬計画。実施例２で使用されたすべての薬物は、本明細書で明示的に述べられていないが、マウスサロゲート分子であった。マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体であって、６Ｅ１１－ｍｕＩｇＧ２ａと略される「６Ｅ１１バインダーｍｕＩｇＧ２ａ（ＰＧＬＡＬＡ）」、６Ｅ１１－ｍｕＩｇＧ１と略される「６Ｅ１１バインダーｍｕＩｇＧ１（ＤＡＰＧ）」及びＳ７０－ｍｕＩｇＧ１と略される「ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０バインダーｍｕＩｇＧ１（ＤＡＰＧ）」が使用された。

図３Ｄをもたらす４匹のＲｉｐ－Ｔａｇ５マウスの抗ＰＤ－Ｌ１治療において、マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体が表２に従って投与された。

図３Ｅをもたらす７匹のＲｉｐ－Ｔａｇ５マウスのＰＤ１－ＩＬ２ｖ及び抗ＰＤ－Ｌ１の併用治療において、マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体が表３に従って投与された。

薬物は、マウスあたり次の量の腹腔内注射によって投与した：抗ＰＤ１－低：２２．７５μｇ、週１回（ｑ１ｗｋ）（ＰＤ１－ＩＬ２ｖに対して等モル）、抗ＰＤ１－高：２５０μｇ、週１回（ｑ１ｗｋ）（治療用量）、ＤＰ４７－ＩＬ２ｖ：２５μｇ、週１回（ｑ１ｗｋ）、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ：２５μｇ、週１回（ｑ１ｗｋ）、抗ＰＤＬ１：初回投与量は２５０μｇ、続いて１２５μｇを８週間の期間、週２回。

フローサイトメトリー。脾臓の単細胞懸濁液は、４０μｍのセルストレーナーを通して脾臓をすりつぶすことによって生成された。ＰＤ ＰｈａｒｍＬｙｓｅ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５５８９９）で赤血球を溶解した後、脾細胞を抗マウスＣＤ１６／３２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０１３０２）でブロックした。生／死染色は、固定可能な生存率染色７８０（ＢＤ ５６５３８８）を用いて実施された。ＴＡＧ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞をＳＶ４０ＴＡＧマルチマー（ＡＰＣ－ＭＨＣ－Ｈ２Ｋｂ－ＶＶＹＤＦＬＫＣ、ローザンヌ大学）で染色した後、表面抗原に対する抗体を染色した。Ｆｏｘｐ３染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号００－５５２３－００）を製造元の指示に従って使用して、固定化及び透過処理後に細胞内タンパク質を染色した。パネルは以下の抗体で構成されていた：ＣＤ４－ＢＶ５１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００５５３）、ＣＤ８－ＢＢ５１５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６４４２２）、ＰＤ１－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０９１１０）、ＬＡＧ３－ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１２５２２１）、ＴＩＧＩＴ－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ ５９４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１４２１０９）、ＣＤ２８－ＢＢ７００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６６５１３）、ＩＣＯＳ－ＢＶ７８５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１３５３４）、ＫＬＲＧ１－ＢＶ７１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１３８４２７）、ＣＤ２５－ＡＰＣ－Ｒ７００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６５１３５）、ＣＤ１２７－ＢＶ６５０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１３５０４３）、ＣＤ２７－ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号７４０２４７）、Ｆｏｘｐ３－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２－５７７３－８２）。試料は、ＢＤＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析され、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアとＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍで処理された。

免疫組織化学。腫瘍はＯＣＴに埋め込まれ、ドライアイス上で凍結された。厚さ１０μｍのメタノール固定切片が、ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７０５）、ＰＤ１－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１２－９９８１－８２）、ＣＤ３１－ＦＩＴＣ（ＰＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５３３７２）、ＰＤＬ１－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２－５９８２－８２）、Ｔ抗原（ＴＡＧ、自社生産）、抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（ＴＡＧの二次抗体、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５００７５）による染色に供され、ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１０２３６２７６００１）により対比染色された。切片は、ライカＤＭ５５００顕微鏡とオリンパスＶＳ１２０スライドスキャナーで画像化された。画像は、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐとＱｕＰａｔｈソフトウェアで処理された。

Ｒｉｐ－Ｔａｇ５マウスにおける前臨床薬物試験。Ｒｉｐ－Ｔａｇ５マウスを試験に登録するために、７ｍｍｏｌ／Ｌ未満の血糖値を示す２２週齢のマウスを、ＭＳ５５０Ｄ ４０ＭＨｚトランスデューサー（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃ）を備えたＶｅｖｏ２１００システムを使用した超音波画像検査によってＰａｎＮＥＴ膵島腫瘍の存在についてスクリーニングした。Ｒｉｐ－Ｔａｇ５マウスは、累積腫瘍負荷に基づいて、異なる治療群に無作為に割り当てられた。長期有効性試験において、平均開始時腫瘍負荷は２８ｍｍ２、平均開始時年齢は２５週、平均開始時血糖値は５．８ｍｍｏｌ／Ｌであった。腫瘍は、最大１６週間、完全なレスポンダーについて２週間ごと又は４週間ごとに、超音波画像検査によってモニターされた。Ａｃｃｕ－Ｃｈｅｋ血糖計（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、血糖値を毎週モニターした。エンドポイントの基準は、腫瘍負荷、低血糖（３ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血糖値）、一般的な健康状態、及び体重減少（１５％以上）によって定義された。

結果
ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の標的化に対する二重特異性分子ＰＤ１－ＩＬ２ｖの影響を評価するために、腫瘍を有するＲｉｐ－Ｔａｇ５マウスをＰＤ１－ＩＬ２ｖで１４日間処理した。脾臓における総ＣＤ８^＋Ｔ細胞及び腫瘍抗原ＴＡＧに対して反応性のＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーにより決定し、抗ＰＤ１、ＤＰ４７－ＩＬ２ｖ、抗ＰＤＬ１の単剤治療及び抗ＰＤ１＋ＤＰ４７－ＩＬ２ｖの併用治療と比較した。抗ＰＤ１については、２つの濃度を使用した；抗ＰＤ１－ｌｏｗは二重特異性分子のＰＤ１と等モルであり、抗ＰＤ１－ｈｉｇｈはこの薬物に使用される治療用量である。ＤＰ４７－ＩＬ２ｖを単独で、又は抗ＰＤ１と組み合わせた治療は、未治療のコントロールマウスと比較して、総ＣＤ８^＋Ｔ細胞が３～４倍増加した（図２Ａ）。同様に、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ治療は、Ｒｉｐ－Ｔａｇ５マウスの脾臓における総ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の２．５倍の増殖をもたらした（図２Ａ）。ＤＰ４７－ＩＬ２ｖは総ＣＤ８^＋ Ｔ細胞集団を強力に増加させた一方で、ＴＡＧ特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、ＩＬ２ｖ分子がＰＤ１部分に連結されている場合、ＰＤ１－ＩＬ２ｖによる治療時にのみ増殖した。ＰＤ１－ＩＬ２ｖ治療による腫瘍抗原特異的ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の生成の増加は、腫瘍部位でのＣＤ８^＋ Ｔ細胞の浸潤の増加につながったが、ＤＰ４７－ＩＬ２ｖと組み合わせた抗ＰＤ１の治療では、腫瘍内ＣＤ８^＋ Ｔ細胞をわずかに増加させた（図２Ｃ）。例えば、抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＰＤ１において使用されるような「抗ＰＤ」という用語は、図２Ａ－Ｃ、図３Ｄ及び図４Ａ－Ｂにおいて「ａＰＤ」と略される。

治療設定におけるＰＤ１－ＩＬ２ｖの有効性を評価するために、Ｒｉｐ－Ｔａｇ５マウスを、ＰＤ１－ＩＬ２ｖで８週間治療した。Ｒｉｐ－Ｔａｇ５マウスは、超音波画像検査によって決定された腫瘍の大きさに基づいて試験に登録され、腫瘍の増殖は１２週間にわたってモニターされた。累積開始時腫瘍負荷は、２０～４０ｍｍ^２の範囲であった。ＲｉｐＴａｇ５マウスで発生する膵神経内分泌腫瘍（ＰａｎＮＥＴ）は、未治療のマウスでは４週間の倍加時間で増殖した（図３Ａ）。ＰＤ１－ＩＬ２ｖの治療は、すべてのマウスで腫瘍サイズの縮小をもたらした。最初の４週間における最初の減少の後、マウスの５０％がＰＤ１－ＩＬ２ｖに対する抵抗性を獲得し、腫瘍が進行した（図３Ｂ）。

ＰＤ１－ＩＬ２ｖ療法に対する獲得耐性のメカニズムを調べるために、ＰＤ－ＩＬ２ｖに耐性のある腫瘍を分析した。これらの再発腫瘍の分析により、特にＣＤ３１陽性腫瘍血管系におけるＰＤＬ１の上方制御が明らかになった（図３Ｃ）。未治療のＰａｎＮＥＴ腫瘍はＰＤＬ１に対して陰性に染色され、ＰＤ１－ＩＬ２ｖで観察されたＰＤＬ１の上方制御が耐性のメカニズムである可能性があることを示している（図３Ｃ）。我々は、ＰＤ１－ＩＬ２ｖと抗ＰＤＬ１の組み合わせは、腫瘍の再発を防ぐ相加的な治療効果をもたらす可能性があると仮説を立てた。腫瘍を有するＲｉｐ－Ｔａｇ５マウスにおける抗ＰＤＬ１単剤療法は、腫瘍縮小をもたらさなかったが（図３Ｄ）、ＰＤ１－ＩＬ２ｖと組み合わせた抗ＰＤＬ１は、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ単剤療法を実質的に改善した。観察された１２週間の時間範囲にわたって、抗ＰＤＬ１と組み合わせたＰＤ１－ＩＬ２ｖで治療されたすべてのマウスは、併用療法に対する耐性の発達なしに腫瘍縮小を示した（図３Ｅ）。腫瘍増殖曲線の分析により、ＰＤ１－ＩＬ２ｖと比較して、併用療法は治療の最初の２週間以内に腫瘍縮小率の向上をもたらすことが明らかとなり、早期の時点でＰＤＬ１をブロックすることが、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ単剤療法を改善するために必要である可能性があることを示している。まとめると、データは、ＰＤ１－ＩＬ２ｖを抗ＰＤＬ１と組み合わせると、ＰＤ１－ＩＬ２ｖの治療効果が高まり、ＰａｎＮＥＴのマウスモデルで腫瘍の再発を防ぐことが明らかになった。

担がんＲｉｐ－Ｔａｇ５マウスをＰＤ１－ＩＬ２ｖと抗ＰＤ－Ｌ１の併用薬物治療に供し、腫瘍の進行を超音波画像検査によって１６週間モニターした。図４Ａは、生存率グラフとして表した奏効率を示す。ＰＤ－ＩＬ２ｖの２匹のマウスとＰＤ１－ＩＬ２ｖ＋抗ＰＤ－Ｌ１治療群の１匹のマウスは、完全寛解のために重度の高血糖を発症し、安楽死させなければならなかった。これらのマウスは、グラフでは依然として完全なレスポンダーとみなされた。図４Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ１－ＩＬ２ｖ＋抗ＰＤ－Ｌ１治療の０週間及び２週間後の腫瘍の代表的な超音波画像を示しており、これには、抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わせたＰＤ１－ＩＬ２ｖ治療時の完全なレスポンダーが含まれる。

Claims (16)

1. がんの治療における併用療法としての使用のための、転移の予防若しくは治療における併用療法としての使用のための、又はＴ細胞活性などの免疫応答若しくは機能を刺激することにおける併用療法としての使用のための、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインであって、
   ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、
   ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び配列番号２のポリペプチド配列、又は
   ｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は
   ｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又は
   ｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列
   を含むことを特徴とし、
   かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、
   ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
   ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ
   を含むことを特徴とする
   ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
2. がんの治療における使用のための、請求項１に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
3. 乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、メラノーマがん、膀胱がん、腎がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓がん、胃がん、食道がん、中皮腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫の治療における使用のための、請求項２に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
4. 転移の予防又は治療における使用のための、請求項１に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
5. 腫瘍免疫など、免疫関連疾患を治療すること又はその進行を遅延させることにおける使用のための、請求項１に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
6. Ｔ細胞活性などの免疫応答又は機能を刺激することにおける使用のための、請求項１に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
7. ｉ）腫瘍における腫瘍増殖の阻害；及び／又は
   ｉｉ）腫瘍を有する対象の生存期間中央値及び／又は全生存期間を向上させること
   における使用のための、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインであって；
   ここで、ＰＤ－１が、免疫細胞、特にＴ細胞上に、又は腫瘍細胞環境において提示され、
   ここで、併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、
   ａ）配列番号５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号６の軽鎖可変ドメインＶＬ、及び配列番号２のポリペプチド配列、又は
   ｂ）配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号９のポリペプチド配列、又は
   ｃ）配列番号７、及び配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列、又は
   ｄ）配列番号１２、及び配列番号１３及び配列番号１４のポリペプチド配列
   を含むことを特徴とし、
   かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、
   ａ）配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬ、又は
   ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号２０の軽鎖可変ドメインＶＬ
   を含むことを特徴とする
   ＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
8. 併用療法で使用されるＰＤ１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ、併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体が、配列番号１５の重鎖可変ドメインＶＨ及び配列番号１６の軽鎖可変ドメインＶＬを含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
9. 併用療法で使用されるＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカインが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９のポリペプチド配列を含むことを特徴とし、かつ併用療法で使用されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体がアテゾリズマブである、請求項１から８のいずれか一項に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
10. 免疫サイトカインの抗体成分及び抗体が、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
11. 前記抗体が、低減した又は最小のエフェクター機能を有することを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
12. 最小のエフェクター機能が、エフェクターのないＦｃ変異に起因する、請求項１１に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
13. エフェクターのないＦｃ変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ又はＮ２９７Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａである、請求項１から１２のいずれか一項に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
14. 患者が免疫療法で治療されているか、又は免疫療法で前治療されていた、請求項１から１３のいずれか一項に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
15. 前記免疫療法が、養子細胞移入、モノクローナル抗体の投与、サイトカインの投与、がんワクチンの投与、Ｔ細胞関与療法、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。
16. 養子細胞移入が、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）修飾Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）形質導入細胞、若しくは樹状細胞、又はそれらの任意の組み合わせの投与を含む、請求項１５に記載のヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体と組み合わせたＰＤ－１標的化ＩＬ－２変異体免疫サイトカイン。

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