BR102020018270A2 - Imunocitocinas - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se à terapia combinada de imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 específicas com anticorpos específicos que se ligam ao PD-L1 humano.

Description

IMUNOCITOCINAS

[001] A presente invenção refere-se à terapia combinada de imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 específicas com anticorpos específicos que se ligam ao PD-L1 humano.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer é a principal causa de morte em países economicamente desenvolvidos e a segunda principal causa de morte em países em desenvolvimento. Apesar dos recentes avanços da quimioterapia e do desenvolvimento de agentes direcionados em nível molecular para interferir com a transdução e a regulagem de sinais de crescimento em células de câncer, o prognóstico de pacientes com câncer avançado em geral permanece ruim. Consequentemente, existe a necessidade médica urgente e persistente de desenvolvimento de novas terapias que possam ser adicionadas aos tratamentos existentes para aumentar a sobrevivência sem causar toxicidade inaceitável

IL-2 E IMUNOCITOCINAS BASEADAS EM IL-2 DIRECIONADAS À PD-1

[003] A interleucina 2 (IL-2) é uma citocina que ativa linfócitos e células Natural Killer (NK). Demonstrou-se que a IL-2 possui atividade antitumoral; entretanto, altos níveis de IL-2 geram toxicidade pulmonar e a atividade antitumoral de IL-2 é limitada por uma série de circuitos retroalimentados (feedback loops) inibitórios.

[004] Com base em sua eficácia antitumoral, o tratamento com IL-2 em altas doses (aldesleuquina, comercializada como Proleukin®) foi aprovado para uso em pacientes com carcinoma de células renais (RCC) metastático e melanoma maligno nos Estados Unidos e para pacientes com RCC metastático na União Europeia. Entretanto, como consequência do modo de ação da IL-2, a aplicação sistêmica e não direcionada da IL-2 pode comprometer consideravelmente a imunidade antitumoral pela indução de células Treg e AICD. Uma preocupação adicional de tratamento com IL-2 sistêmico refere-se a severos efeitos colaterais mediante administração intravenosa, que incluem severos eventos cardiovasculares, edema pulmonar, hepáticos, gastrointestinais (GI), neurológicos e hematológicos (Resumo de Características de Produto do Proleukin® (aldesleukin) [SmPC] : http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/19322/SPC/ (acesso em 27 de maio de 2013)). Foram testados regimes em baixa dosagem de IL-2 em pacientes, embora à custa de resultados terapêuticos abaixo do ideal. Em conjunto, as abordagens terapêuticas utilizando IL-2 podem ser úteis para terapia contra câncer caso os riscos associados à sua aplicação possam ser superados. São descritos imunoconjugados que compreendem uma porção de ligação ao antígeno direcionada à PD-1 e uma porção efetora baseada na IL-2, por exemplo, no documento WO 2018/184964 A1.

PD-L1 E ANTICORPOS PARA PD-L1

[005] A proteína 1 de morte celular programada (PD-1 ou CD279) é um membro inibidor da família de receptores CD28, que também inclui CD28, CTLA-4, ICOS e BTLA. A proteína PD-1 é um receptor da superfície celular e é expressa em células B ativadas, células T e células mieloides (Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14:391779-82; Bennett et al. (2003) J. Immunol. 170: 711-8). A estrutura de PD-1 é uma proteína transmembranar monomérica tipo 1, consistindo em um domínio extracelular tipo variável de imunoglobulina e um domínio citoplasmático contendo um motivo de inibição baseado em imunorreceptor tirosina (ITIM) e um motivo de troca baseado em imunorreceptor tirosina (ITSM). Dois ligantes para PD-1 foram identificados, PD-L1 e PD-L2, que mostraram regular negativamente a ativação de células T após a ligação à PD-1 (Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al (2002) Eur J Immunol 32: 634-43). Ambos ligantes, PD-L1 e PD-L2, são homólogos B7 que se ligam à PD-1, mas não se ligam a outros membros da família CD28. Um ligante para PD-1, PD-L1 é abundante em uma variedade de cânceres humanos (Dong et al (2002) Nat. Med 8: 787-9). A interação entre PD-1 e PD-L1 resulta em uma diminuição nos linfócitos infiltrantes do tumor, uma diminuição na proliferação mediada por receptor de células T e evasão imune pelas células cancerosas (Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81: 281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54: 307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 5094- 100). A supressão imune pode ser revertida inibindo a interação local de PD-1 com PD-L1, e o efeito é aditivo quando a interação de PD-1 com PD-L2 também é bloqueada (Iwai et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66). Os anticorpos que se ligam à PD-1 estão descritos, por exemplo, no documento WO 2017/055443 A1.

PD-L1 E ANTICORPOS CONTRA PD-L1

[006] O fornecimento de dois sinais distintos para as células T é um modelo amplamente aceito para a ativação de linfócitos T em repouso pelas células apresentadoras de antígenos (APCs). Lafferty et al, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975).

[007] Este modelo prevê ainda a discriminação de próprio (self) e não próprio (non-self) e tolerância imune. Bretscher et al, Science 169: 1042- 1049 (1970); Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al, J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987). O sinal primário, ou sinal antígenoespecífico, é transduzido através do receptor de células T (TCR) após o reconhecimento do peptídeo antígeno exógeno apresentado no contexto do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). O segundo ou sinal coestimulador é fornecido a células T pelas moléculas coestimuladoras expressas sobre as células apresentadoras de antígenos (APCs), e induz as células T a promoverem a expansão clonal, secreção de citocinas e função efetora. Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996). Na ausência de coestimulação, as células T podem tornar-se refratárias à estimulação pelo antígeno, não montando uma resposta imune eficaz, e podendo resultar ainda na exaustão ou tolerância aos antígenos estranhos

[008] O modelo simples de dois sinais pode ser uma simplificação excessiva, pois a força do sinal TCR na verdade tem uma influência quantitativa na ativação e diferenciação de células T. Viola et al., Science 273: 104-106 (1996); Sloan-Lancaster, Nature 363: 156-159 (1993). Além disso, a ativação de células T pode ocorrer mesmo na ausência de sinal coestimulante caso a resistência de sinal de TCR seja alta. De forma mais importante, as células T recebem ambos os sinais coestimulantes secundários, positivo e negativo. A regulação destes sinais, positivo e negativo, é crítica para maximizar as respostas imunoprotetoras no hospedeiro, mantendo ao mesmo tempo a tolerância imune e prevenindo a autoimunidade.

[009] Sinais secundários negativos parecem ser necessários para a indução da tolerância das células T, enquanto que os sinais positivos promovem a ativação das células-T. Embora o modelo de dois sinais simples ainda forneça uma explicação válida para linfócitos naïves, a resposta imune do hospedeiro é um processo dinâmico, e sinais coestimuladores também podem ser fornecidos para as células-T expostas ao antígeno.

[010] O mecanismo de coestimulação é de interesse terapêutico, pois a manipulação de sinais coestimuladores tem mostrado fornecer um meio para aumentar ou terminar a resposta imune baseada em células. Recentemente, descobriu-se que a disfunção de células T ou anergia ocorre concomitantemente com a expressão induzida e sustentada do receptor inibitório, polipeptídeo 1 de morte celular programada (PD-1). Como resultado, a terapia de direcionamento de PD-1 e de outras moléculas que sinalizam através de interações com PD-1, tal como o ligante da proteína de morte programada 1 (PD-L1) e ligante da proteína de morte programada 2 (PD-L2) são uma área de grande interesse. A inibição da sinalização de PD-L1 foi proposta como um meio para aumentar a imunidade de células T no tratamento do câncer (por exemplo, imunidade para tumores) e infecção, incluindo infecções agudas e crônicas (por exemplo, persistentes). Entretanto, como um produto terapêutico ideal direcionado para um alvo neste processo ainda não é comercializado, existe uma significativa necessidade médica não atendida. Os anticorpos contra PD-L1 estão descritos, por exemplo, no documento WO 2010/077634.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[011] A presente invenção compreende a terapia combinada de imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano para uso no tratamento do câncer ou tumor, para uso na prevenção ou tratamento de metástase, para uso no estímulo de função ou de resposta imune, tal como atividade de células T.

[012] A invenção compreende o uso de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada a células T ou PD-1 para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento do câncer ou tumor, para uso na prevenção ou tratamento de metástases, ou para uso na estimulação de uma função ou resposta imune, como a atividade de células T, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 é administrada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano.

[013] A invenção compreende o uso de um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento do câncer ou tumor, para uso na prevenção ou tratamento de metástases, ou para uso na estimulação de uma função ou resposta imune, como a atividade de células T, em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 é administrado em combinação com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1.

[014] A invenção compreende um método de tratamento do câncer ou tumor, um método de prevenção ou tratamento de metástases, ou um método de estimulação de uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, cujo método compreende a administração da terapia combinada de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano

[015] A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14; e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é caracterizado por compreender; a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16; ou b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20.

[016] Em exemplos de realização da invenção, uma terapia combinada de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, tal como descrito no presente pedido, é para uso no tratamento do câncer. PD-1 pode ser apresentado em um ambiente de células tumorais. O câncer pode ser selecionado a partir dos grupos que consistem em câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, melanoma, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal, melanoma, câncer pancreático, carcinoma gástrico, câncer de esôfago, mesotelioma, câncer de próstata, leucemia, linfomas, mielomas.

[017] Em um exemplo de realização da invenção, uma terapia combinada de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, tal como descrito no presente pedido, é para uso na prevenção ou tratamento de metástases.

[018] Em um exemplo de realização da invenção, uma terapia combinada de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, tal como descrito no presente pedido, é para uso no tratamento ou retardamento da progressão de uma doença imunorrelacionada, tal como imunidade tumoral.

[019] Em um exemplo de realização da invenção, uma terapia combinada de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, tal como descrito no presente pedido, é para uso na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como atividade de célula T.

[020] A presente invenção compreende uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1, em que a imunocitocina é administrada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano conforme descrito acima para uso:

• i) na inibição do crescimento tumoral; e/ou
• ii) aumento da sobrevida mediana e/ou geral de pacientes com um tumor; em que PD-1 é apresentado em células imunes, particularmente células T, em um ambiente de células tumorais, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2; ou b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9; ou c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; ou d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14; e o anticorpo que se liga ao DP-L1 humana utilizado na terapia combinada é caracterizado por compreender; a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16; ou b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20.

[021] A invenção pode compreender uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1, em que a imunocitocina é administrada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano tal como descrito na presente invenção, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é caracterizado em compreendendo um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16.

[022] A invenção compreende preferencialmente uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1, em que a imunocitocina e é administrada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; e em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é o Atezolizumabe.

[023] O componente anticorpo da imunocitocina e o anticorpo podem ser da subclasse IgG1 humana ou da subclasse IgG4 humana. O anticorpo pode ter função efetora reduzida ou mínima. A função efetora mínima pode resultar de uma mutação de Fc sem função efetora. Em um exemplo de realização, a mutação de Fc sem função efetora é L234A/L235A ou L234A/L235A/P329G ou N297A ou D265A/N297A.

[024] Em outro aspecto da invenção, a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 é administrada a um paciente em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano como descrito na presente invenção, em que o paciente é tratado ou foi pré-tratado com imunoterapia. A referida imunoterapia pode compreender transferência de células adotivas, administração de anticorpos monoclonais, administração de citocinas, administração de uma vacina contra o câncer, terapias de engajamento de células T ou qualquer combinação das mesmas. A transferência de células adotivas pode compreender a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T modificadas de receptor de célula T (TCR), linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), receptor de antígeno quimérico (CAR) células assassinas naturais (natural killer - NK) CARmodificadas, células transduzidas com receptor de células T (TCR) ou células dendríticas ou qualquer combinação das mesmas.

[025] A invenção compreende ainda:
A) um método para
i) inibir o crescimento tumoral;
ii) aumentar a sobrevida mediana e/ou geral de pacientes com um tumor;
em que PD-1 é apresentado em células imunes, particularmente células T, em que uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 é administrada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano;
ou
B) um método de tratamento de um paciente com um tumor, em que PD-1 é expresso no ambiente de células tumorais, e em que uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 é administrada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano,
em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2; ou b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9; ou c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; ou d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14;
e o anticorpo que se liga ao DP-L1 humana utilizado na terapia combinada é caracterizado por compreender; a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16; ou b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20.

[026] As terapias combinadas das imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 e anticorpos aqui descritos mostram benefícios para pacientes que precisam de uma terapia que visa um antígeno apresentado em uma célula tumoral ou em um ambiente de célula tumoral. As terapias combinadas das imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 e anticorpos descritos na presente invenção mostram benefícios para os pacientes que necessitam de uma terapia que tem DP-1 como alvo. As imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 de acordo com a invenção mostram eficácia no aumento da sobrevida mediana e/ou global de indivíduos com um tumor que expressa um alvo e são especialmente úteis, inter alia, no tratamento de câncer e metástase em combinação com anticorpos anti-PD-L1 aqui descritos. As imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 específicas de acordo com a invenção mostram eficácia na atividade inibidora do crescimento tumoral contra tumores, em que PD-1 é expressa em um ambiente de células tumorais e são especialmente úteis, inter alia, no tratamento de cânceres e metástases em combinação com os anticorpos antiPD-L1 específicos descrito na presente invenção. Os anticorpos específicos que se ligam ao PD-L1 humano, particularmente atezolizumabe, de acordo com a invenção mostram eficácia no aumento da sobrevida mediana e/ou global de indivíduos com tumor, em que a proteína PD-1 é expressa no ambiente de células tumorais e são especialmente úteis, inter alia, no tratamento de cânceres e metástases em combinação com as imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 específicas descritas na presente invenção.

[027] Em um exemplo de realização da invenção, é fornecida a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano como descrito na presente invenção, para uso como uma terapia combinada na prevenção ou tratamento de metástases, ou para uso como uma terapia combinada na estimulação de uma função ou resposta imune, como a atividade das células T, em que o paciente é tratado ou foi pré-tratado com imunoterapia. A referida imunoterapia pode compreender transferência de células adotivas, administração de anticorpos monoclonais, administração de citocinas, administração de uma vacina contra o câncer, terapias de engajamento de células T ou qualquer combinação das mesmas. A transferência de células adotivas pode compreender a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T modificadas de receptor de célula T (TCR), linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), receptor de antígeno quimérico (CAR) células assassinas naturais (natural killer - NK) CAR-modificadas, células transduzidas com receptor de células T (TCR) ou células dendríticas ou qualquer combinação das mesmas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[028] A Fig. 1 apresenta os resultados de um experimento de eficácia com muPD1-IL2v e Mab muPD-L1 como agentes isolados e em um cenário de terapia combinada. A linhagem de células de carcinoma colorretal transfectante MC38-CEA foi injetada subcutaneamente em camundongos Black 6 para estudar a inibição do crescimento tumoral em um modelo subcutâneo. O tamanho do tumor foi medido usando um paquímetro. A terapia foi iniciada quando os tumores atingiram 150 mm3 . A quantidade de anticorpos injetados por camundongo foi de 0,5 mg/kg para muPD1-IL2v (qw) e 10 mg/kg para muPD-L1 para a primeira administração seguida por 5 mg/kg (2qw) nas administrações posteriores. O tratamento durou 2 semanas. No grupo de tratamento combinado, os anticorpos foram administrados concomitantemente. A combinação muPD-IL2v + Mab muPD-L1 mediou eficácia superior em termos de inibição do crescimento tumoral em comparação com grupos veículos, muPD1-IL2v e muPD-L1 como agentes únicos.

[029] As Figuras 2A-C mostram que o tratamento com PD1-IL2v resulta na expansão de células T CD8+ específicas para o antígeno TAG no baço e aumenta os infiltrados de células T CD8+ em tumores de camundongos RipTag5. Os camundongos RipTag5 portadores de tumores foram tratados com os fármacos indicados por 14 dias. A Fig.2A apresenta a frequência de células T CD8+ no baço determinada por citometria de fluxo. A Fig. 2B apresenta a frequência de células T CD8+ específicas para antígeno TAG no baço, mostrada como porcentagem do total de células T CD8+ . A Fig.2C apresenta a imuno-histoquímica (IHQ) de tumores corados para PanNET com os anticorpos indicados (n = 3-5; barra de escala = 200μm)

[030] As Figuras 3A-E apresentam a eficácia terapêutica aumentada após a combinação de PD1-IL2v com um anti-PD-L1. Camundongos RipTag5 portadores de tumor foram submetidos a tratamentos com os fármacos e a progressão do tumor foi monitorada por ultrassom. A Fig.3A apresenta a curva de crescimento tumoral dos camundongos não tratados (n = 3). A Fig.3B apresenta curvas de crescimento tumoral de camundongos RipTag5 tratados com PD1-IL2v (n = 6). A Fig.3C apresenta a IHQ de tumores não tratados e recidivados do tratamento com PD1-IL2v corados com os anticorpos indicados (n = 3; barra de escala = 50 μm). A Fig.3D apresenta curvas de crescimento tumoral de camundongos tratados com um anti-PDL1 (n = 4). A Fig.3E apresenta curvas de crescimento tumoral de camundongos RipTag5 tratados com PD1-IL2v e anti-PDL1 (n = 7).

[031] As Figuras 4A-B mostram que a terapia combinada com anti-PD-L1 melhora a eficácia de PD1-IL2v. A Fig. 4A apresenta a taxa de resposta representada como gráfico de sobrevida. Dois camundongos no PDIL2v e um camundongo no grupo de tratamento PD1-IL2v + anti-PD-L1 desenvolveram hiperglicemia grave devido à resposta completa e tiveram que ser sacrificados. Esses camundongos ainda foram considerados respondedores completos no gráfico. A Fig. 4B apresenta imagens de ultrassom de tumores após 0 e 2 semanas de tratamento PD1-IL2v e PD1- IL2v + anti-PD-L1. Análise Estatística: teste de Log-rank Mantel-Cox, * p <0,02. Número de camundongos: anti-PD-L1 n = 4, PD1-IL2v n = 10, PD1- IL2v + anti-PD-L1 n = 7.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO VIA DA IL-2

[032] A capacidade da IL-2 de expandir e ativar populações de linfócitos e células NK, tanto in vitro quanto in vivo, explica os efeitos antitumorais da IL-2. Entretanto, como o mecanismo regulador para evitar reações imunológicas excessivas e potencial de autoimunogenicidade, a IL-2 gera morte celular induzida por ativação (AICD) e torna as células T ativadas susceptíveis a apoptose mediada por Fas.

[033] Além disso, IL-2 é envolvida na manutenção e expansão de células Treg CD25+ CD4+ (Fontenot, J. D., Rasmussen, J. P., Gavin, M. A. et al, A function for interleukin 2 in Foxp3 expressing regulatory T cells, Nat. Immunol. 2005; 6: 1142-1151; D’Cruz, L. M., Klein, L., Development and function of agonist-induced CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the absence of interleukin 2 signaling, Nat. Immunol. 2005; 6: 1152-1159; Maloy, K. J., Powrie, F., Fueling regulation: IL-2 keeps CD4+ Treg cells fit, Nat. Immunol. 2005; 6: 1071-1072). Estas células evitam que células T efetoras se autodestruam ou destruam o alvo, seja por meio de contato entre células ou pela liberação de citocinas imunossupressoras, tais como IL-10 ou fator de crescimento de transformação (TGF)-β. Demonstrou-se que a depleção de células Treg aumenta a imunidade antitumoral induzida por IL-2 (Imai, H., Saio, M., Nonaka, K. et al, Depletion of CD4+CD25+ regulatory T cells enhances interleukin-2- induced antitumor immunity in a mouse model of colon adenocarcinoma, Cancer Sci. 2007; 98: 416-423).

[034] A IL-2 também desempenha papel significativo na diferenciação de células T CD8+ durante a expansão primária e secundária de células T CD8+ . Aparentemente a IL-2 é responsável pela expansão ideal e geração de funções efetoras após desafio antigênico primário. Durante a fase de contração de uma reação imunológica na qual a maior parte das células T CD8+ específicas de antígenos desaparece por meio de apoptose, sinais IL-2 são capazes de resgatar células T CD8+ da morte celular e fornecer aumento durável das células T CD8+ de memória. No estágio de memória, frequências de células T CD8+ podem ser amplificadas pela administração de IL-2 exógeno. Além disso, somente células T CD8+ que receberam sinais IL-2 durante o priming inicial são capazes de mediar a expansão secundária eficiente após desafio antigênico renovado. Os sinais de IL-2 durante diferentes fases de reação imunológica são, portanto, fundamentais na otimização de funções de células T CD8+ , de forma a afetar reações primárias e secundárias dessas células T (Adv. Exp. Med. Biol. 2010; 684: 28-41, The role of interleukin-2 in memory CD8 cell differentiation, Boyman, O. L., Cho, J. H., Sprent, J.).

[035] Com base em sua eficácia antitumoral, o tratamento com IL-2 em altas doses (aldesleuquina, comercializada como Proleukin®) foi aprovado para uso em pacientes com carcinoma de células renais (RCC) metastático e melanoma maligno nos Estados Unidos e para pacientes com RCC metastático na União Europeia. Entretanto, como consequência do modo de ação da IL-2, a aplicação sistêmica e não direcionada da IL-2 pode comprometer consideravelmente a imunidade antitumoral pela indução de células Treg e AICD. Uma preocupação adicional de tratamento com IL-2 sistêmico refere-se a severos efeitos colaterais mediante administração intravenosa, que incluem severos eventos cardiovasculares, edema pulmonar, hepáticos, gastrointestinais (GI), neurológicos e hematológicos (Resumo de Características de Produto do Proleukin (aldesleukin) [SmPC] : http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/19322/SPC/ (acesso em 27 de maio de 2013)). Foram testados regimes em baixa dosagem de IL-2 em pacientes, embora à custa de resultados terapêuticos abaixo do ideal. Em conjunto, as abordagens terapêuticas utilizando IL-2 podem ser úteis para terapia contra câncer caso os riscos associados à sua aplicação possam ser superados.

[036] Imunoconjugados que compreendem uma porção de ligação ao antígeno direcionada à PD-1 e uma porção efetora baseada na citocina IL-2, incluindo uma IL-2 mutante, são descritos, por exemplo, no documento WO 2018/184964.

[037] Particularmente, a IL-2 mutante (variante) (por exemplo, um mutante quádruplo conhecido como IL-2 qm) foi projetada para superar as limitações da IL-2 tipo selvagem (por exemplo, aldesleuquina) ou imunocitocinas baseadas em IL-2 de primeira geração por meio de eliminação da ligação à subunidade IL-2Rα (CD25). Esta IL-2 qm mutante foi acoplada a vários anticorpos que visam tumores, como o anticorpo humanizado direcionado contra CEA e um anticorpo direcionado contra FAP, descritos nos documentos WO 2012/146628 e WO 2012/107417. Além disso, a região Fc do anticorpo foi modificada para evitar a ligação a receptores Fcγ e ao complexo C1q. Demonstrou-se em experimentos in vitro e in vivo não clínicos que as imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas a tumor resultantes (por exemplo, imunocitocina com IL-2 variante direcionada a CEA e imunocitocina com IL-2 variante direcionada a FAP) são capazes de eliminar células tumorais.

[038] As imunocitocinas resultantes representam, portanto, uma classe de imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas que abordam as capacidades de IL-2 pela eliminação da ligação à subunidade IL-2Rα (CD25):

[039] A expressão “IL-2” ou “IL-2 humana” designa a proteína IL2 humana, incluindo as forma tipo selvagem e variantes que compreendem uma ou mais mutações na sequência de aminoácidos da IL-2 tipo selvagem, conforme exibido, por exemplo, nas SEQ ID NO: 2 que possui a substituição C125A para evitar a formação de dímeros de IL-2 ligados com dissulfeto. A IL-2 pode também sofrer mutação para remover sítios de N e/ou O-glicosilação.

VIA PD-1/PD-L1/PD-L2:

[040] Um importante sinal de coestimulação negativa que regula a ativação de células T é fornecido pelo receptor 1 de morte programada (PD1) (CD279) e seus parceiros de ligação PD-L1 (B7-H1, CD274; SEQ ID NO: 88) e PD-L2 (B7-DC, CD273). O papel regulador negativo da PD-1 foi revelado por modelos nocautes para PD-1 (Pdcd1-/- ), que são propensos a autoimunidade. Nishimura et al., Immunity 11: 141-51 (1999); Nishimura et al., Science 291: 319-22 (2001). O PD-1 está relacionado ao CD28 e CTLA-4, mas carece da cisteína proximal da membrana que permite a homodimerização. O domínio citoplasmático da PD-1 contém um motivo de inibição imunorreceptor baseado em tirosina (ITIM, V/IxYxxL/V). O PD-1 se liga apenas ao PD-L1 e PD-L2. Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000); Dong et al., Nature Med. 5: 1365- 1369 (1999); Latchman et al., Nature Immunol. 2: 261-268 (2001); Tseng et al., J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001).

[041] O PD-1 pode ser expresso em células T, células B, células T assassinas naturais (NK), monócitos ativados e células dendríticas (DCs). O PD-1 é expresso por ativado, mas não por células T CD4+ e CD8+ humanas não estimuladas, células B e células mieloides. Isso contrasta com a expressão mais restrita de CD28 e CTLA-4. Nishimura et al., Int. Immunol. 8: 773-80 (1996); Boettler et al., J. Virol. 80: 3532-40 (2006). Existem pelo menos 4 formas variantes de PD-1 que foram clonadas a partir de células T humanas ativadas, incluindo transcritos que carecem do(s) (i) éxon 2, (ii) éxon 3, (iii) éxons 2 e 3 ou (iv) éxons 2 a 4 . Nielsen et al., Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005). Com a exceção de PD-1 Δex3, todas as variantes são expressas em níveis semelhantes à PD-1 de comprimento total em células mononucleares de sangue periférico em repouso (PBMCs). A expressão de todas as variantes é significativamente induzida após a ativação de células T humanas com antiCD3 e anti-CD28. Os variantes PD-1Δex3 não possuem um domínio transmembrana e se assemelham ao CTLA-4 solúvel, que desempenha um papel importante na autoimunidade. Ueda et al., Nature 423: 506-11 (2003). Esta variante é enriquecida no fluido sinovial e soro de pacientes com artrite reumatoide. Wan et al., J. Immunol. 177: 8844-50 (2006).

[042] Os dois ligantes de PD-1 diferem em seus padrões de expressão. O PD-L1 é constitutivamente expresso em células T e B de camundongos, CDs, macrófagos, células-tronco mesenquimais e mastócitos derivados da medula óssea. Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002). O PD-L1 é expresso em uma ampla gama de células não hematopoiéticas (por exemplo, córnea, pulmão, epitélio vascular, células não parenquimatosas hepáticas, células estaminais mesenquimais, ilhotas pancreáticas, sinciciotrofoblastos placentais, queratinócitos, etc.) [Keir et al., Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)] , e é regulado positivamente em diversos tipos de células após a ativação. Ambos interferons (IFNs), tipo I e tipo II, aumentam o PD-L1. Eppihimer et al., Microcirculation 9: 133-45 (2002); Schreiner et al., J. Neuroimmunol. 155: 172-82 (2004). A expressão de PD-L1 em linhagens de células diminui quando MyD88, TRAF6 e MEK são inibidos. Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007). JAK2 também foi implicado na indução PD-L1. Lee et al., FEBS Lett. 580: 755-62 (2006); Liu et al., Blood 110: 296-304 (2007). A perda ou inibição da fosfatase e do homólogo de tensina (PTEN), uma fosfatase celular que modifica a sinalização da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e Akt, aumentou a expressão de PD-L1 pós-transcrição em cânceres. Parsa et al., Nat. Med. 13: 84-88 (2007).

[043] A expressão de PD-L2 é mais restrita do que PD-L1. PD-L2 é induzivelmente expresso em DC, macrófagos e mastócitos derivados da medula óssea. O PD-L2 também é expresso em cerca de metade a dois terços das células B1 peritoneais em repouso, mas não nas células B B2 convencionais. Zhong et al., Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007). As células B1 PD-L2+ se ligam à fosfatidilcolina e podem ser importantes para respostas imunes inatas contra antígenos bacterianos. A indução de PD-L2 por IFN-gama é parcialmente dependente de NF-κB. Liang et al., Eur. J. Immunol. 33: 2706- 16 (2003). O PD-L2 também pode ser induzido em monócitos e macrófagos por GM-CF, IL-4 e IFN-gama. Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002); Loke et al., PNAS 100:5336-41 (2003).

[044] A sinalização típica do PD-1 tem um efeito maior na produção de citocinas do que na proliferação celular, com efeitos significativos na produção de IFN-gama, TNF-alfa e IL-2. A sinalização inibitória mediada por PD-1 também depende da força da sinalização TCR, com maior inibição administrada em baixos níveis de estimulação TCR. Essa redução pode ser superada pela coestimulação através de CD28 [Freeman et al., J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)] ou a presença de IL-2 [Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)] .

[045] Existem mais evidencias de que a sinalização através de PD-L1 e PD-L2 pode ser bidirecional. Isto é, além de modificar a sinalização TCR ou BCR, a sinalização também pode ser entregue de volta às células que expressam PD-L1 e PD-L2. Embora o tratamento de células dendríticas com um anticorpo anti-PD-L2 naturalmente humano isolado de um paciente com macroglobulinemia de Waldenstrom não tenha regulado as moléculas coestimuladoras MHC II ou B7, tais células produziram maior quantidade de citocinas pró-inflamatórias, particularmente TNF-alfa e IL -6, e estimulam a proliferação de células T. Nguyen et al., J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002). O tratamento de camundongos com este anticorpo também (1) aumentou a resistência ao melanoma b16 transplantado e rapidamente induziu CTLs tumorespecíficos. Radhakrishnan et al., J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al., Cancer Res. 64: 4965-72 (2004); Heckman et al., Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007); (2) bloqueou o desenvolvimento da doença inflamatória das vias aéreas em um modelo de camundongo de asma alérgica. Radhakrishnan et al., J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al., J. Allergy Clin. Immunol. 116: 668-74 (2005).

[046] Outras evidências de sinalização reversa em células dendríticas (“DC's”) resultam de estudos com DCs derivadas da medula óssea cultivadas com PD-1 solúvel (domínio EC do PD-1 fundido na região constante de Ig - “s-PD-1”). Kuipers et al., Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006). Este sPD1 inibiu a ativação das DCs e aumentou a produção de IL-10, de forma reversível através da administração de anti-PD-1.

[047] Além disso, vários estudos mostram um receptor para PDL1 ou PD-L2 que é independente de PD-1. B7.1 já foi identificado como parceiro de ligação para PD-L1. Butte et al., Immunity 27: 111-22 (2007). Estudos de reticulação química sugerem que PD-L1 e B7.1 podem interagir através de seus domínios semelhantes à IgV. As interações de B7.1:PD-L1 podem induzir um sinal inibitório em células T. A ligação de PD-L1 em células T CD4+ por B7.1 ou a ligação de B7.1 em células T CD4+ por PD-L1 proporciona um sinal inibitório. As células T que não possuem CD28 e CTLA-4 mostram diminuição da proliferação e produção de citocinas quando estimuladas por esferas revestidas com anti-CD3 mais B7.1. Nas células T que carecem de todos os receptores para B7.1 (ou seja, CD28, CTLA-4 e PD-L1), a proliferação e a produção de citocinas não foram mais inibidas por esferas revestidas com anti-CD3 mais B7.1. Isso indica que B7.1 atua especificamente através de PDL1 na célula T na ausência de CD28 e CTLA-4. De forma semelhante, as células T que não possuem PD-1 apresentaram diminuição da proliferação e produção de citocinas quando estimuladas na presença de esferas revestidas com anti-CD3 mais PD-L1, demonstrando o efeito inibitório da ligação de PDL1 em B7.1 sobre as células T. Quando as células T que carecem de todos os receptores conhecidos para PD-L1 (ou seja, sem PD-1 e B7.1), a proliferação das células T não sofre mais danos pelas esferas revestidas anti-CD3 mais PDL1. Assim, PD-L1 pode exercer um efeito inibitório sobre as células T, seja através de B7.1 ou PD-1.

[048] A interação direta entre B7.1 e PD-L1 sugere que a compreensão atual da coestimulação é incompleta e ressalta o significado da expressão dessas moléculas nas células T. Estudos com células T PD-L1-/- indicam que o PD-L1 nas células T pode reduzir a produção de citocinas das células T. Latchman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004). Como PD-L1 e B7.1 são expressos em células T, células B, DCs e macrófagos, existe o potencial para interações direcionais entre B7.1 e PD-L1 nesses tipos de células. Além disso, PD-L1 em células não hematopoiéticas podem interagir com B7.1, bem como PD-1 nas células T, aumentando a questão de saber se PD-L1 está envolvido em sua regulação. Uma possível explicação para o efeito inibitório da interação B7.1: PD-L1 é que a célula T PD-L1 pode atrapalhar ou separar a APC B7.1 da interação com CD28.

[049] Como resultado, o antagonismo da sinalização através de PD-L1, incluindo o bloqueio de PD-L1 a partir da interação com PD-1, B7.1 ou ambos, impede, desse modo, que PD-L1 envie um sinal coestimulador negativo para células T e outras células apresentadoras de antígenos, provavelmente para aumentar a imunidade em resposta a infecção (por exemplo, aguda e crônica) e imunidade tumoral. Além disso, os anticorpos anti-PD-L1 da presente invenção, podem ser combinados com antagonistas de outros componentes da sinalização PD-1:PD-L1, por exemplo, anticorpos anti-PD-1 e anticorpos anti-PD-L2.

[050] O termo “PD-L1 humano” refere-se à proteína humana PDL1 (SEQ ID NO: 4, tipicamente da sinalização de PD-1). Conforme utilizado na presente invenção, “ligação ao PD-L1 humano” ou “ligação específica ao PD-L1 humano” ou “que se liga ao PD-L1 humano” ou “anticorpo anti-PD-L1” referemse a um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno CSF-1R com uma afinidade de ligação de valor KD de 1,0 x 10-8 mol/L ou menos, em uma forma de realização com um valor KD de 1,0 x 10-9 mol/L ou menos. A afinidade de ligação é determinada com um ensaio de ligação padrão, tal como pela técnica de ressonância plasmônica de superfície (Biacore®, GE-Healthcare Uppsala, Suécia). Assim, um “anticorpo de ligação ao PD-L1 humano”, tal como utilizado na presente invenção, referem-se a um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno PD-L1 humano com uma afinidade de ligação de uma KD de 1,0 x 10-8 mol/L ou menos (em uma forma de realização 1,0 x 10-8 mol/L – 1,0 x 10-13 mol/L), em uma forma de realização, com uma KD 1,0 x 10-9 mol/L ou menos (em uma forma de realização 1,0 x 10-9 mol/L - 1,0 x 10-13 mol/L).

[051] Conforme descrito em detalhes no presente pedido, os inventores descobriram que a IL-2 mutante direcionada o PD-1 fornece efeitos terapêuticos superiores in vivo quando utilizada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1.

[052] A capacidade da IL-2 de expandir e ativar linfócitos e células assassinas naturais (NK) destaca a atividade antitumoral da IL-2. Demonstrou-se que IL-2 mutantes projetadas para eliminar a ligação da IL-2 à subunidade IL-2α (CD25) superam as limitações de IL-2 e, como parte de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada a tumor, tal como imunocitocina com IL-2 variante direcionada ao CEA ou imunocitocina com IL-2 variante direcionada à FAP, são capazes de eliminar células tumorais.

IMUNOCITOCINAS E ANTICORPOS:

[053] A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 utilizada na terapia combinada descrita no presente pedido compreende:
- um anticorpo que se liga às células imunes expressando PD-1 ou PD-L1, particularmente de células T, ou em um ambiente de células tumorais, ou um fragmento de ligação ao antígeno, e
- uma IL-2 mutante (variante), particularmente uma IL-2 humana mutante, possuindo afinidade de ligação reduzida para a subunidade α do receptor de IL-2 (quando comparada com a IL-2 tipo selvagem, por exemplo, IL-2 humana mostrada como SEQ ID NO: 2), tal como uma IL-2 compreendendo:

• i) uma, duas ou três substituições de aminoácidos em uma, duas ou três posições selecionadas a partir das posições correspondentes ao resíduos 42, 45 e 72 da IL-2 humana exibida como SEQ ID NO: 2, tais como três substituições em três posições, como as substituições de aminoácidos específicas F42A, Y45A e L72G; ou
• ii) as características descritas em (i) mais uma substituição de aminoácidos em posição correspondente ao resíduo 3 da IL2 humana exibida como SEQ ID NO: 2, por exemplo, a substituição de aminoácidos específica T3A; ou
• iii) quatro substituições de aminoácidos em posições correspondentes aos resíduos 3, 42, 45 e 72 de IL-2 humana exibida como SEQ ID NO: 2, por exemplo, as substituições de aminoácidos específicas T3A, F42A, Y45A e L72G.

[054] A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 utilizada na terapia combinada descrita no presente pedido pode compreender:
um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo que se liga à PD-1 apresentada sobre uma célula imune, particularmente células T, ou em um ambiente de células tumorais e um domínio Fc que consiste em duas subunidades e compreende uma modificação promotora da heterodimerização de duas cadeias polipeptídicas não idênticas; e uma IL-2 mutante, particularmente uma IL-2 humana mutante, possuindo afinidade de ligação reduzida para a subunidade α do receptor de IL2 (quando comparada com a IL-2 tipo selvagem, por exemplo, IL-2 humana mostrada como SEQ ID NO: 2), tal como uma IL-2 compreendendo:

• i) uma, duas ou três substituições de aminoácidos em uma, duas ou três posições selecionadas a partir das posições correspondentes ao resíduos 42, 45 e 72 da IL-2 humana exibida como SEQ ID NO: 2, tais como três substituições em três posições, como as substituições de aminoácidos específicas F42A, Y45A e L72G; ou
• ii) as características descritas em (i) mais uma substituição de aminoácidos em posição correspondente ao resíduo 3 da IL2 humana exibida como SEQ ID NO: 2, por exemplo, a substituição de aminoácidos específica T3A; ou
• iii) quatro substituições de aminoácidos em posições correspondentes aos resíduos 3, 42, 45 e 72 de IL-2 humana exibida como SEQ ID NO: 2, por exemplo, as substituições de aminoácidos específicas T3A, F42A, Y45A e L72G.

[055] Uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 utilizada na terapia combinada pode compreender: a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2; ou b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9; ou c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; ou d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14.

[056] Em alguns exemplos de realização, a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 utilizada na terapia combinada compreende as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9.

[057] Estas imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD1, em conjunto com as suas partes componentes de porções de ligação de antígenos, domínios Fc e porções efetoras, são descritas como exemplos dos imunoconjugados descritos no documento WO 2018/184964. As imunocitocinas específicas “proteína de fusão IgG-IL-2 qm direcionada ao CEA” baseadas no anticorpo anti-CEA CH1A1A 98/99 2F1 e o mutante quádruplo de IL-2 (qm) (SEQ ID NO: 3) que possui as sequências exibidas como SEQ ID NO: 7, 8 e 9 estão descritos, por exemplo, nos Exemplos 1 e 2 do documento WO 2018/184964.

[058] Imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 específicas descritas no documento WO 2018/184964 são caracterizadas por compreenderem as sequências de polipeptídeos a seguir conforme descrito no presente:

[059] Conforme descrito no documento WO 2012/146628, a IL-2 mutante possui afinidade de ligação reduzida à subunidade α do receptor de IL2. Juntamente com as subunidades β e γ (também conhecidas como CD122 e CD132, respectivamente), a subunidade α (também conhecida como CD25) forma o receptor de IL-2 com alta afinidade heterotrimérica, enquanto o receptor dimérico que consiste apenas das subunidades β e γ é denominado receptor de IL-2 com afinidade intermediária. Conforme descrito no documento WO 2012/146628, um polipeptídeo mutante IL-2 com ligação reduzida à subunidade α do receptor de IL-2 possui capacidade reduzida de indução da sinalização de IL-2 em células T reguladoras, induz menos morte celular induzida por ativação (AICD) em células T e possui perfil de toxicidade in vivo reduzido, em comparação com polipeptídeo IL-2 tipo selvagem. O uso desse mutante de IL-2 com toxicidade reduzida é particularmente vantajoso em imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1, que possuem meia-vida sérica longa devido à presença de um domínio Fc. A IL-2 mutante pode compreender pelo menos uma mutação de aminoácidos que reduz ou elimina a afinidade do mutante IL-2 à subunidade α do receptor de IL-2 (CD25), mas preserva a afinidade do mutante IL-2 ao receptor de IL-2 com afinidade intermediária (que consiste das subunidades β e γ do receptor de IL-2), em comparação com IL-2 tipo selvagem. Uma ou mais mutações de aminoácidos podem ser substituições de aminoácidos. A IL-2 mutante pode compreender uma, duas ou três substituições de aminoácidos em uma, duas ou três posições selecionadas a partir das posições correspondentes aos resíduos 42, 45 e 72 da IL-2 humana (exibida como SEQ ID NO: 2). A IL-2 mutante pode compreender três substituições de aminoácidos nas posições correspondentes ao resíduo 42, 45 e 72 da IL-2 humana. A IL-2 mutante pode ser uma IL-2 humana mutante. A IL-2 mutante pode ser IL-2 humana que compreende as substituições de aminoácidos F42A, Y45A e L72G. A IL-2 mutante pode compreender adicionalmente uma mutação de aminoácido em posição correspondente à posição 3 da IL-2 humana, o que elimina o sítio de Oglicosilação da IL-2. Particularmente, a mutação de aminoácido adicional mencionada é uma substituição de aminoácido que substitui um resíduo de treonina por um resíduo de alanina. Uma IL-2 mutante particular útil na presente invenção compreende quatro substituições de aminoácidos em posições correspondentes aos resíduos 3, 42, 45 e 72 da IL-2 humana (exibida como SEQ ID NO: 2). As substituições específicas de aminoácidos são T3A, F42A, Y45A e L72G. Conforme demonstrado nos Exemplos do documento WO 2012/146628, o referido polipeptídeo de IL-2 mutante quádruplo (Il-2 qm) não exibe ligação detectável para CD25, capacidade reduzida de induzir apoptose em células T, capacidade reduzida de induzir sinalização de IL-2 em células Treg e um perfil de toxicidade in vivo reduzido. Entretanto, ele retém a capacidade de ativar a sinalização de IL-2 em células efetoras, induzir a proliferação de células efetoras e gerar IFN-γ como citocina secundária pelas células NK. A IL-2 mutante de acordo com qualquer uma das descrições acima pode compreender mutações adicionais que fornecem vantagens adicionais tais como aumento da expressão ou estabilidade. Por exemplo, a cisteína na posição 125 pode ser substituída por um aminoácido neutro, tal como alanina, para evitar a formação de dímeros de IL-2 ligados por ligações dissulfídicas.Assim, a IL-2 mutante pode compreender uma mutação de aminoácido adicional em uma posição correspondente ao resíduo 125 da IL-2 humana. A mutação de aminoácido adicional mencionada pode ser a substituição de aminoácidos C125A. A IL-2 mutante pode compreender a sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 3.

[060] Em exemplos de realização preferidos o direcionamento para a proteína PD-1 da imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 pode ser conseguido pelo direcionamento à PD-1 conforme descrito no documento WO 2018/1184964. O direcionamento de PD-1 pode ser alcançado com um anticorpo anti -PD-1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Um anticorpo anti-PD-1 pode compreender uma sequência da região variável de cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 5 ou uma variante desta que retém a funcionalidade. Um anticorpo anti-PD-1 pode compreender uma sequência da região variável de cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 6 ou uma variante desta que retém a funcionalidade. Um anticorpo anti -PD-1 pode compreender uma sequência de região variável de cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 5, ou uma sequência de região variável de cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 6, ou variantes das mesmas que retêm funcionalidade. Um anticorpo anti-PD-1 pode compreender a sequência da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:5 e a sequência da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO:6.

[061] A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 pode compreender uma sequência polipeptídica selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou uma variante da mesma que mantenha a funcionalidade. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 pode compreender uma sequência polipeptídica em que uma cadeia pesada Fab específica para CEA partilha uma ligação peptídica carboxi-terminal com uma subunidade de domínio Fc compreendendo uma modificação hole. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 pode incluir a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, ou uma variante da mesma que mantenha a funcionalidade. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 pode compreender uma cadeia leve Fab específica para PD-1. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à CEA pode compreender a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou uma variante da mesma que mantenha a funcionalidade. Os polipeptídeos podem estar covalentemente ligados, por exemplo, por uma ligação dissulfídica. As cadeias polipeptídicas do domínio Fc podem incluir as substituições de aminoácidos L234A, L235A, e P329G (que podem ser referidas como LALA P329G).

[062] Tal como descrito no documento WO 2018/184964, a imunocitocinas IL-3 variante direcionada à PD-1 pode ser uma proteína de fusão de IgG–IL-2 qm direcionada à PD-1, tendo as sequências apresentadas como SEQ ID NOs: 7, 8 e 9 (conforme descrito, por exemplo, no Exemplo 1 do documento WO 2018/184964). A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 com as sequências mostradas como SEQ ID NOs: 7, 8 e 9 é referida no presente documento como “PD1 -IL2v”.

[063] A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 utilizada na terapia combinada descrita na presente invenção pode compreender um anticorpo que se liga a um antígeno apresentado sobre células imunes, particularmente células T, ou em um ambiente de células tumorais, e uma IL-2 mutante com afinidade de ligação reduzida para a subunidade do receptor de IL-2. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 utilizada pode consistir essencialmente de um anticorpo que se liga à PD-1 apresentada sobre células imunes, particularmente células T, ou em um ambiente de células tumorais, e uma IL-2 mutante com afinidade de ligação reduzida para a subunidade do receptor de IL-2. O anticorpo pode ser um anticorpo IgG, particularmente um anticorpo IgG1. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 pode compreender um único mutante de IL-2 com afinidade de ligação reduzida para a subunidade do receptor de IL-2 (ou seja, não mais do que uma porção mutante da IL-2 está presente).

[064] Conforme descrito na presente invenção, a imunocitocina IL-1 variante direcionada à PD-1 utilizado na terapia combinada aqui descrita pode compreender um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo que se liga à células imunes, particularmente células T, ou em um ambiente de células tumorais e um domínio Fc que consiste em duas subunidades e compreende uma modificação promotora da heterodimerização de duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A imunocitocina IL-1 variante direcionada à PD-1 utilizada na terapia combinada aqui descrita pode compreender um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo que se liga a células imunes, particularmente de células T, ou em um ambiente de células tumorais e uma subunidade de domínio Fc compreendendo uma mutação knob (protuberância, de acordo com a tecnologia knob-into-hole), um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo que se liga a células imunes, particularmente células T, ou em um ambiente de células tumorais e uma subunidade de domínio Fc compreendendo uma mutação hole (cavidade), e um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo que se liga a células imunes, particularmente células T, ou em um ambiente de células tumorais, e uma IL-2 mutante com afinidade de ligação reduzida para a subunidade do receptor de IL-2. Assim, uma imunocitocina pode compreender um domínio Fc compreendendo uma modificação que promove a heterodimerização de duas cadeias polipeptídicas não idênticas. Uma “modificação que promove a heterodimerização” é uma manipulação do esqueleto peptídico ou das modificações pós-tradução de um polipeptídeo que reduz ou previne a associação do polipeptídeo com um polipeptídeo idêntico para formar um homodímero. Uma modificação que promove a heterodimerização, tal como utilizado na presente invenção, inclui particularmente modificações separadas feitas para cada um dos dois polipeptídeos desejados para formar um dímero, em que as modificações são complementares entre si de modo a promover a associação dos dois polipeptídeos. Por exemplo, uma modificação que promove a heterodimerização pode alterar a estrutura ou carga de um ou ambos os polipeptídeos desejados para formar um dímero, de modo a tornar a sua associação estéricamente ou eletrostaticamente favorável, respectivamente. A heterodimerização ocorre entre dois polipeptídeos não idênticos, como duas subunidades de um domínio Fc em que outros componentes imunoconjugados fundidos a cada uma das subunidades (por exemplo, porção de ligação ao antígeno, porção efetora) não são iguais. Nos imunoconjugados de acordo com a presente invenção, a modificação que promove a heterodimerização está no domínio Fc. Em alguns exemplos de realização, a heterodimerização promotora da modificação compreende uma mutação de aminoácido, especificamente uma substituição de aminoácido. Em um exemplo de realização específico, a modificação que promove a heterodimerização compreende uma mutação de aminoácidos separada, especificamente uma substituição de aminoácidos em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. O sítio de interação proteína-proteína mais amplo entre as duas cadeias polipeptídicas de um domínio Fc da IgG humana está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um exemplo de realização, a referida modificação é no domínio CH3 do domínio Fc. Em um exemplo de realização específico, a referida modificação é uma modificação denominada “knob-into-hole”, que compreende uma modificação formando uma protuberância (knob) em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação formando uma cavidade (hole) na outra das duas subunidades do domínio Fc.

[065] A tecnologia knob-into-hole está descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.731.168; US 7.695.936; e em Ridgway et al, Prot Eng. 9, 617- 621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De modo geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“knob”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade/orifício (“hole“) correspondente na interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância pode ser posicionada na cavidade a fim de promover a formação de heterodímero e impedir a formação de homodímero. As protuberâncias são construídas pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais pequenas na interface do primeiro polipeptídeo por aminoácidos com cadeias laterais maiores (por exemplo, a tirosina ou triptofano). As “cavidades” (hole) compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de aminoácidos com cadeias laterais grandes por aminoácidos com cadeias laterais menores (por exemplo, alanina ou treonina). A protuberância e a cavidade podem ser feitas através da alteração de ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese sítio-específica, ou por síntese peptídica. Um exemplo de realização específico de uma modificação knob compreende a substituição de aminoácidos T366W em uma das duas subunidades do domínio Fc, e a modificação hole compreende as substituições de aminoácidos T366S, L368A e Y407V na outra dentre as duas subunidades do domínio Fc. Em outro exemplo de realização específico, a subunidade do domínio Fc compreendendo a modificação knob compreende adicionalmente a substituição de aminoácido S354C, e a subunidade do domínio Fc compreendendo a modificação hole compreende adicionalmente a substituição de aminoácidos Y349C. A introdução destes dois resíduos de cisteína resulta na formação de uma ponte de bissulfeto entre as duas subunidades da região Fc, estabilizando adicionalmente o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)). A numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Uma “subunidade” de um domínio Fc, conforme utilizado no presente, refere-se a um dos dois polipeptídeos que formam o domínio Fc dimérico, ou seja, um polipeptídeo compreendendo as regiões constantes Cterminais de uma cadeia pesada da imunoglobulina, capaz de realizar autoassociação estável. Por exemplo, uma subunidade de um domínio Fc de IgG compreende uma CH2 de IgG e um domínio constante CH3 de IgG.

[066] Em um exemplo de realização alternativo, uma modificação promotora da heterodimerização de duas cadeias polipeptídicas não idênticas compreende uma modificação que medeia efeitos de direcionamento eletrostático, conforme descrito, por exemplo, no documento WO 2009/089004. Em geral, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas cadeias polipeptídicas por resíduos de aminoácidos carregados de modo que a formação de homodímeros se torna eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização eletrostaticamente favorável.

[067] Um mutante de IL-2 que possui afinidade de ligação reduzida para a subunidade do receptor de IL-2 pode ser fundido ao aminoácido carbóxi-terminal da subunidade do domínio Fc que compreende a modificação knob. Sem desejar estar limitado pela teoria, a fusão da IL-2 mutante à subunidade contendo modificação “knob” do domínio Fc irá minimizar a geração imunoconjugados com imunocitocinas compreendendo dois polipeptídeos IL-2 mutantes (choque estérico de dois polipeptídeos contendo modificações “knob”).

[068] O domínio Fc da imunocitocina pode ser modificado/manipulado para ter afinidade de ligação alterada para um receptor de Fc, especificamente afinidade de ligação alterada para um receptor Fcγ, em comparação com um domínio Fc não manipulado, conforme descrito no documento WO 2012/146628. A ligação do domínio Fc a um componente do complemento, especificamente ao C1q, pode ser alterada, conforme descrito no documento WO 2012/146628. O domínio Fc confere ao imunoconjugado propriedades farmacocinéticas favoráveis, incluindo uma meia-vida sérica longa que contribui para a boa acumulação no tecido alvo e uma relação de distribuição tecido/sangue favorável. Ao mesmo tempo, ele pode, no entanto, levar ao direcionamento indesejável do imunoconjugado para células que expressam receptores Fc ao invés de direcionar para as células contendo antígenos preferenciais. Além disso, a coativação das vias de sinalização dos receptores Fc pode levar à liberação de citocinas que, em combinação com a porção efetora e a meia-vida longa do imunoconjugado, resulta na ativação excessiva de receptores de citocinas e efeitos colaterais graves sobre a administração sistêmica. De acordo com isto, foi descrito que os imunoconjugados IgG-IL-2 convencionais estão associados a reações de infusão (vide, por exemplo, King et al., J Clin Oncol. 22, 4463-4473 (2004)).

[069] Consequentemente, o domínio Fc da imunocitocina pode ser manipulado para ter afinidade de ligação reduzida a um receptor de Fc. Em uma desses exemplos de realização, o domínio Fc compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do domínio Fc para um receptor de Fc. Normalmente, a mesma uma ou mais mutações de aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em um exemplo de realização a referida mutação de aminoácidos reduz a afinidade do domínio Fc para o receptor de Fc em pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes. Em exemplos de realização em que há mais do que uma mutação de aminoácidos que reduz a afinidade de ligação do domínio de Fc ao receptor Fc, a combinação destas mutações de aminoácidos pode reduzir a afinidade de ligação do domínio Fc para o receptor Fc em pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 50 vezes. Em um exemplo de realização, o imunoconjugado compreendendo um domínio Fc modificado exibe menos do que 20%, particularmente menos do que 10%, e mais particularmente menos do que 5% da afinidade de ligação para um receptor Fc quando comparado a um imunoconjugado compreendendo um domínio Fc não modificado. Em um exemplo de realização, o receptor Fc é um receptor Fc de ativação. Em um exemplo de realização específico, o receptor Fc é um receptor Fcγ, mais especificamente um receptor FcγRIIIa, FcγRI ou FcγRIIa. Preferencialmente, a ligação a cada um destes receptores é reduzida. Em alguns exemplos de realização, a afinidade de ligação a um componente do complemento, especificamente a afinidade de ligação ao C1q, também está reduzida. Em um exemplo de realização, a afinidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) não está reduzida. Uma ligação substancialmente similar ao FcRn, ou seja, a preservação da afinidade de ligação do domínio Fc para o referido receptor, é obtida quando o domínio Fc (ou um imunoconjugado compreendendo o referido domínio Fc) exibe mais do que cerca de 70% da afinidade de ligação de uma forma não modificada do domínio Fc (ou imunoconjugado compreendendo a referida forma não modificada do domínio Fc) para o FcRn. Os domínios Fc, ou imunoconjugados da invenção compreendendo os referidos domínios Fc, podem apresentar mais do que cerca de 80%, ou mesmo mais do que cerca de 90% de tal afinidade. Em um exemplo de realização a mutação de aminoácidos é uma substituição de aminoácido. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição P329. Em um exemplo de realização mais específico a substituição de aminoácido é a P329A ou P329G, particularmente a P329G. Em um exemplo de realização, o domínio Fc compreende uma substituição de um aminoácido adicional em uma posição selecionada a partir de S228, E233, L234, L235, N297 e P331. Em um exemplo de realização mais específico a substituição de aminoácido adicional é S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ou P331S. Em um exemplo de realização específico, o domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos nas posições P329, L234 e L235. Em um exemplo de realização mais específico, o domínio Fc compreende as mutações de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“LALA P329G”). Esta combinação de substituições de aminoácidos aboli quase que completamente a ligação de um domínio Fc de IgG humana ao receptor Fcγ, conforme descrito no documento WO 2012/130831, integralmente incorporado ao presente pela referência. A publicação WO 2012/130831 também descreve métodos de preparação de tais domínios Fc mutantes e métodos para a determinação de suas propriedades, tal como funções de ligação aos receptores Fc ou funções efetoras. A numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[070] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos no estado da técnica e tal como descrito no documento WO 2012/146628. Os métodos genéticos podem incluir a mutagênese sítio-especifica da sequência de DNA codificante, PCR, síntese gênica, e similares. As alterações de nucleotídeos corretas podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.

[071] Em um exemplo de realização, o domínio Fc é modificado para ter uma redução na função efetora em comparação com um domínio Fc não modificado, conforme descrito no documento WO 2012/146628. A função efetora diminuída pode incluir, mas não está limitada a, uma ou mais das seguintes: diminuição da citotoxicidade dependente de complemento (CDC), diminuição da citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), diminuição da fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP), diminuição da secreção de citocinas, diminuição da captação de antígeno mediada por complexo imune pelas células apresentadoras de antígeno, diminuição da ligação de células NK, diminuição da ligação aos macrófagos, diminuição da ligação aos monócitos, diminuição da ligação às células polimorfonucleares, diminuição do sinal de indução de apoptose direta, diminuição da reticulação aos anticorpos ligados ao alvo, diminuição da maturação de células dendríticas, ou diminuição do priming de células T.

[072] Anticorpos IgG4 exibem afinidade de ligação aos receptores Fc reduzida e funções efetoras reduzidas, em comparação com os anticorpos IgG1 . Assim, em alguns exemplos de realização o domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas de ativação de célula T da invenção é um domínio Fc de IgG4 , particularmente um domínio Fc de IgG4 humana. Em um exemplo de realização, o domínio Fc de IgG4 compreende as substituições de aminoácidos na posição S228, especialmente a substituição de aminoácido S228P. Para reduzir ainda mais a sua afinidade de ligação a um receptor Fc e/ou a sua função efetora, em um exemplo de realização o domínio Fc da IgG4 compreende uma substituição de aminoácido na posição L235, especificamente a substituição de aminoácido L235E. Em outro exemplo de realização, o domínio Fc da IgG4 compreende uma substituição de aminoácido na posição P329, especificamente a substituição de aminoácido P329G. Em um exemplo de realização particular, o domínio Fc da IgG4 compreende as substituições de aminoácidos nas posições S228, L235 e P329, especificamente as substituições de aminoácidos S228P, L235E e P329G. Tal domínio Fc de IgG4 mutante e suas propriedades de ligação aos receptores Fcγ encontram-se descritos no Pedido De Patente Europeu WO 2012/130831, integralmente incorporado ao presente pela referência.

[073] O anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada descrita na presente invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em: 243.55.S70, 243.55.H1, 243.55.H12, 243.55.H37, 243.55.H70, 243.55.H89, 243.55.S1, 243.55.5, 243.55.8, 243.55.30, 243.55.34, 243.55.S37, 243.55.49, 243.55.51, 243.55.62, e 243.55.84.

[074] Esses anticorpos estão descritos no documento WO 2010/77634 (as sequências são exibidas na Figura 11 do documento WO 2010/77634).

[075] Em um exemplo de realização da invenção a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada descrita na presente invenção é caracterizada por compreender a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14; e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é caracterizado por compreender; a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16; ou b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20.

[076] Em um exemplo de realização, a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada descrita na presente invenção é caracterizada por compreender o domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e o domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2.

[077] Em um exemplo de realização, a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada descrita na presente invenção é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9.

[078] Em um exemplo de realização, o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16.

[079] Em um exemplo de realização preferido da invenção, a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 utilizada na terapia combinada descrita na presente invenção é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16.

[080] Em um exemplo de realização preferencial da invenção, a imunocitocina com IL-2 variante direcionada a PD1 usada na terapia combinada descrita na presente invenção é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é o atezolizumabe.

DEFINIÇÕES

[081] O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange diferentes estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando, a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

[082] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab’, Fab’- SH, F(ab’)2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, vide Hudson et al. Nat. Med. 9:129- 134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, vide, por exemplo, Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg & Moore., (Springer-Verlag, Nova Iorque), págs. 269-315 (1994); vide também o WO 93/16185; e as Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para uma discussão sobre os fragmentos Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopo que se ligam a receptores de resgate (salvage) e têm meia vida in vivo aumentada, consulte patente US 5.869.046. Os diacorpos (diabodies) são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, a Patente EP 404.097; o documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinados exemplos de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, vide, por exemplo, Patente US 6.248.516 B1). Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, Escherichia coli ou fagos), conforme descrito na presente invenção.

[083] A expressão “domínio de ligação de antígenos” ou “porção de ligação ao antígeno de um anticorpo”, quando utilizada no presente, designa a parte de um anticorpo que compreende a área que se liga especificamente a um antígeno e é complementar a ele, no todo ou em parte. A expressão referese, portanto, aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (também denominado de regiões variáveis). Particularmente, um domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve (VL) de anticorpo e uma região variável da cadeia pesada (VH) de anticorpo. A porção de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende os resíduos de aminoácidos a partir das “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”. As regiões denominadas de “arcabouço”, “estruturais”, “framework” (FR) são aquelas regiões de domínio variável que não são resíduos da região hipervariável conforme definido na presente invenção. Portanto, as cadeias leves e pesadas de domínios variáveis de um anticorpo compreendem, da direção N- para a C-terminal, os domínios, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. Especialmente, a CDR3 da cadeia pesada é a região que mais contribui para ligação ao antígeno e define as propriedades do anticorpo. As regiões CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat, et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) e/ou os resíduos a partir de uma “alça hipervariável”.

[084] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões conservadas denominadas regiões estruturais ou arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman & Co., página 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno.

[085] O termo “epítopo” denota um determinante proteico de um antígeno, tal com CEA ou PD-L1 humano, capaz de ligar especificamente a um anticorpo. Os epítopos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares e, geralmente, os epítopos possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de que na presença de solventes desnaturantes a ligação com primeiro (isto é, epítopo conformacional), mas não com último (isto é, epitopo não conformacional) é perdida.

[086] O termo “domínio Fc” ou “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina contendo pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões de Fc de sequências nativas e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar levemente, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir da Cis226, ou a partir da Pro230 até a região carboxi-terminal da cadeia pesada. Entretanto, a lisina C-terminal (Lis447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra maneira, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. O domínio Fc de um anticorpo não está envolvido diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno, mas apresenta diversas funções efetoras. Um “domínio Fc de um anticorpo” é uma expressão bem conhecida pelos técnicos hábeis no assunto e definida com base na clivagem de anticorpos pela papaína. Dependendo da sequência de aminoácido da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. De acordo com as regiões constantes de cadeia pesada as diferentes classes de imunoglobulinas são denominadas de α, δ, ε, γ, e µ, respectivamente. O domínio Fc de um anticorpo está diretamente envolvido na ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo) e CDC (citotoxicidade dependente de complemento) com base na ativação do complemento, ligação do C1q e ligação do receptor Fc. A ativação do complemento (CDC) é iniciada pela ligação do fator do complemento C1q com o domínio Fc da maior parte das subclasses de anticorpos IgG. Embora a influência de um anticorpo sobre o sistema complemento é dependente de certas condições, a ligação ao C1q é causada por sítios de ligação definidos no domínio Fc. Tais sítios de ligação são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, em Boackle, R.J., et al, Nature 282 (1979) 742-743;. Lukas, T.J., et al, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., e Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al, Mol.. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al, J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al, Immunology 86 (1995) 319-324; e EP 0307434. Tais sítios de ligação são, por exemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat E.A., vide acima). Os anticorpos das subclasses IgG1, IgG2, IgG3 geralmente mostram ativação do complemento e ligação ao C1q e C3, ao passo que a subclasse IgG4 não ativa o sistema complemento e não se liga ao C1q e/ou C3.

[087] Em um exemplo de realização, o componente anticorpo de uma imunocitocina ou um anticorpo descrito na presente invenção compreende um domínio Fc derivado de origem humana e, preferencialmente, todas as outras partes das regiões constantes humanas. Conforme utilizado no presente o termo “domínio Fc derivado de origem humana” denota uma domínio Fc que é um domínio Fc de um anticorpo humano da subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, e preferencialmente um domínio Fc da subclasse IgG1 humana, um domínio Fc mutado da subclasse IgG1 humana (em um exemplo de realização com uma mutação L234A + L235A) um domínio Fc da subclasse IgG4 humana ou um domínio Fc mutado da subclasse IgG4 humana (em um exemplo de realização com uma mutação S228P). Em uma forma de realização, os referidos anticorpos têm uma função efetora reduzida ou mínima. Em uma forma de realização, a função efetora mínima resulta de uma mutação de Fc sem função efetora. Em um exemplo de realização, a mutação de Fc sem função efetora é L234A/L235A ou L234A/L235A/P329G ou N297A ou D265A/N297A. Em uma forma de realização, a mutação de Fc sem função efetora é selecionada para cada um dos anticorpos, independentemente entre si, a partir do grupo compreendendo (ou consistindo em) L234A/L235A, L234A/L235A/P329G, N297A e D265A/N297A (numeração EU).

[088] Em um exemplo de realização, o componente anticorpo das imunocitocinas ou anticorpos descritos no presente são da classe IgG humana (ou seja, de subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4).

[089] Em um exemplo de realização preferido, o componente anticorpo das imunocitocinas ou anticorpos descritos no presente são da subclasse IgG1 humana ou da subclasse IgG4 humana. Em um exemplo de realização, o componente anticorpo das imunocitocinas ou anticorpos descritos no presente são de subclasse IgG1 humana. Em um exemplo de realização, o componente anticorpo das imunocitocinas ou anticorpos descritos no presente são de subclasse IgG4 humana.

[090] Em um exemplo de realização, um componente anticorpo de uma imunocitocina ou anticorpo descrito no presente é caracterizado pelas cadeias constantes serem de origem humana. Tais cadeias constantes são bem conhecidas no estado da técnica e descritas, por exemplo, por Kabat, E.A., (vide, por exemplo, Johnson, G. e Wu, T., T., Acid Nuceic Res. 28 (2000) 214-218).

[091] O termo “ácido nucleico” ou “molécula de ácido nucleico”, conforme usado no presente documento, pretende abranger as moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou fita dupla, mas é preferencialmente um DNA de fita dupla.

[092] O termo “aminoácido” conforme utilizando neste pedido indica o grupo de α-aminoácidos carboxi de ocorrência natural compreendendo alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cys ou Cis, C), glutamina (Gln, Q), ácido glutâmico (Glu, E), glicina (Gly ou Gli, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys ou Lis, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe ou Fen, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Thr ou Tre, T ), triptofano (Trp, W), tirosina (Tir, Y) e valina (Val, V).

[093] O “percentual (%) de identidade da sequência de aminoácidos” com relação a uma sequencia polipeptídica é definido no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento da técnica, por exemplo, o uso de softwares de computador publicamente disponíveis, tais como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Para os propósitos da presente invenção, no entanto, os valores da % de identidade da sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 é de autoria da Genentech, Inc. e o código fonte foi apresentado com a documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington, DC, 20559, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam. Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para a comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma determinada sequência de aminoácido A que contenha certa % de identidade de sequência de aminoácidos com, ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B ) é calculado da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y em que, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondentes idênticos pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento A e B do programa e em que Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Será compreendido que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não é igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos de B para A. A menos que especificamente indicado em contrário, todos os valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos, tal como descrito no parágrafo anterior, pelo uso do programa ALIGN-2. Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo que possui uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção, pretende-se dizer que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência exceto que a sequência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações pontuais para cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos de até 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições 5’ ou 3’ terminal da sequência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Como uma questão prática, se qualquer sequência polinucleotídica particular, é, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos da presente invenção, isto pode ser determinado convencionalmente pelo uso de programas de computador conhecidos, tal como os discutidos acima para polipeptídeos (por exemplo, ALIGN-2)

[094] O termo “cassete de expressão” refere-se a um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permite a transcrição de um ácido nucleico específico em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plastidial, vírus, ou fragmento de ácido nucleico. Normalmente, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em determinados exemplos de realização, o conjunto de expressão de acordo com a presente invenção compreende sequências polinucleotídicas que codificam os polipeptídeos descritos no presente ou seus fragmentos.

[095] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” é sinônimo de “construção de expressão” e refere-se a uma molécula de DNA que é usada para introduzir e direcionar a expressão de um gene específico ao qual está operacionalmente ligada em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. O vetor de expressão compreende um cassete de expressão. Os vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de mRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula-alvo, a molécula de ácido ribonucleico ou proteína que é codificada pelo gene é produzida pela transcrição celular e/ou maquinário de tradução. Em um exemplo de realização, o vetor de expressão compreende um cassete de expressão que compreende sequências polinucleotídicas que codificam os polipeptídeos descritos no presente ou seus fragmentos.

[096] O termo “artificial” designa uma composição sintética ou não derivada de células hospedeiras, tal como um oligonucleotídeo sintetizado quimicamente.

[097] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizado para gerar os polipeptídeos descritos na presente invenção. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é manipulada para permitir a produção de um polipeptídeo com oligossacarídeos modificados em sua região Fc. Em determinados exemplos de realização, as células hospedeiras foram adicionalmente manipulados para expressar níveis elevados de um ou mais polipeptídeos possuindo atividade de β(1,4)-Nacetilglucosaminiltransferase III (GnTIII). Em determinados exemplos de realização, as células hospedeiras foram adicionalmente manipulados para expressar níveis elevados de um ou mais polipeptídeos possuindo atividade αmanosidase II (ManII). As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, tais como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongos P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura , células de inseto e células vegetais, para citar apenas algumas, como também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido vegetal ou animal cultivado.

[098] As imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 descritas na invenção podem ser obtidas, por exemplo, pela síntese peptídica em estado sólido (por exemplo, pela síntese em fase sólida de Merrifield) ou pela produção recombinante. Para a produção recombinante um ou mais polinucleotídeo que codifica a Imunocitocina (fragmento), por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem adicional e/ou para a expressão em uma célula hospedeira. Esse polinucleotídeo pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais. Em um exemplo de realização é fornecido um vetor, de preferência um vetor de expressão, que compreende um ou mais dos polinucleotídeos. Os métodos que são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto podem ser usados para construir vetores de expressão contendo a sequência codificante de um imunoconjugado (fragmento) juntamente com os sinais de controle transcricional/traducional apropriados. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação in vivo/recombinação genética. Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY. (1989) e Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY (1989). O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus, ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vetor de expressão inclui um cassete de expressão em que o polinucleotídeo codificante da imunocitocina (fragmento) (ou seja, a região codificante) é clonado em associação operável com um promotor e/ou outros elementos de controle da transcrição ou da tradução. Conforme utilizado na presente invenção, uma “região codificante” ou “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons que são traduzidos em aminoácidos. Embora um “códon de parada” ou “códon de terminação” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificante, se presente, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores da transcrição, íntrons, regiões 5' e 3' não traduzidas, e similares, não são parte de uma ‘região codificante’. Duas ou mais regiões codificantes podem estar presentes em uma única construção de polinucleotídeos, por exemplo, em um único vetor, ou em construções polinucleotídicas separadas, por exemplo, em (diferentes) vetores separados. Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codificante, ou pode compreender duas ou mais regiões codificantes, por exemplo, um vetor pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são pós- ou cotraducionalmente separados nas proteínas finais pela clivagem proteolítica. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico pode codificar regiões codificantes heterólogas, fundidas ou não fundidas com um polinucleotídeo que codifica a imunocitocina (fragmento), ou uma forma variante ou um derivado do mesmo.As regiões codificantes heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados tal como um peptídeo sinal de secreção ou um domínio funcional heterólogo. Uma associação operável é quando uma região codificante de um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, é associado a uma ou mais sequências reguladoras, de tal maneira que coloca a expressão do produto do gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tal como uma região codificante do polipeptídeo e um promotor associado a esta) estão “operacionalmente associados”, se a indução da função promotora resulta na transcrição de mRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão no controle da expressão do produto do gene, ou não interfere com a capacidade do DNA molde de ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição do referido ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor ‘célula-específico’, que controla a transcrição substancial do DNA apenas em células pré-determinadas. Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, facilitadores/acentuadores (enhancers), operadores, repressores, e sinais de terminação da transcrição, podem estar operacionalmente associados com o polinucleotídeo para controlar a transcrição célula-específica. Os promotores adequados e outras regiões de controle da transcrição são divulgados na presente invenção. Diversas regiões de controle da transcrição são conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto. Dentre estas podemos citar, sem se limitar, as regiões de controle da transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não se limitando a, promotor e segmentos acentuadores/facilitadores (enhancers) de citomegalovírus (por exemplo, o promotor precoce imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (por exemplo, o promotor precoce), e retrovírus (por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle da transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados como a actina, proteína de choque térmico, hormônio do crescimento bovino e αglobina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas. Regiões de controle da transcrição adequadas adicionais incluem promotores e facilitadores tecidoespecíficos, bem como promotores indutíveis (por exemplo, promotores indutíveis por tetraciclinas). De forma similar, uma variedade de elementos de controle da tradução é conhecida pelos técnicos hábeis no assunto. Estes incluem, mas não se limitam a, sítios de ligação ao ribossomo e de início da tradução, códons de terminação e elementos derivados de sistemas virais (em particular, um sítio interno de entrada de ribossomo, ou IRES, também referido como sequência CITE). O cassete de expressão também pode incluir outros recursos, como uma origem de replicação, e/ou elementos de integração cromossômica, tal como as repetições terminais longas retrovirais (LTRs) ou repetições terminais invertidas (ITRs) de vírus adeno-associado (AAV).

[100] O polinucleotídeo e as regiões codificantes de ácido nucleico descritos na presente invenção podem ser associados com regiões codificantes adicionais que codificam peptídeos de secreção ou de sinal, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo. Por exemplo, se é desejada a secreção da imunocitocina, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico codificante da imunocitocina ou de um fragmento desta. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência de comando de secreção, que é clivada a partir da proteína madura, quando a exportação da cadeia de proteína em crescimento através do retículo endoplasmático rugoso é iniciada. Os técnicos hábeis estão ientes de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados têm, em geral, um peptídeo de sinal fundido com a extremidade N- terminal do polipeptídeo, e que é clivado a partir do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou “madura” do polipeptídeo. Em determinados exemplos de realização, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo de sinal da cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina é utilizado, ou um derivado funcional desta sequência que retenha a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo ao qual está operacionalmente associada. Alternativamente, um peptídeo sinal heterólogo de mamífero, ou um derivado funcional do mesmo, pode ser utilizado. Por exemplo, a sequência líder tipo-selvagem pode ser substituída pela sequência líder do ativador de plasminogênio tecidual humano (TPA) ou o β-glucuronidase de camundongo.

[101] O DNA codificante de uma sequência de proteína curta que pode ser utilizado para facilitar a posterior purificação (por exemplo, um marcador histidina) ou auxiliar na marcação da imunocitocina pode ser incluído dentro ou nas extremidades do polinucleotídeo codificante da imunocitocina (fragmento).

[102] Em um exemplo de realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais polinucleotídeos descritos na invenção. Em determinados exemplos de realização, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores descritos na presente invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas na presente invenção em relação aos polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em tal exemplo de realização uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada com) um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica (parte de) uma imunocitocina descrita na presente invenção. Conforme utilizado no presente, o termo “célula hospedeira” referese a qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulada para gerar as imunocitocinas da presente invenção ou fragmentos dessas. As células hospedeiras adequadas para a replicação e para suportar a expressão de imunocitocinas são bem conhecidas no estado da técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas, conforme apropriado, com o vetor de expressão particular, e grandes quantidades de células contendo vetor podem ser cultivadas em fermentadores de larga escala para se obter quantidades suficientes de imunocitocinas para aplicações clínicas. As células hospedeiras adequadas incluem micro-organismos procarióticos, como E. coli, ou várias células eucarióticas, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de insetos, ou similares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação não é necessária. Após a expressão, o polipeptídeo pode ser isolado a partir da pasta celular de bactérias em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado. Além dos procariotos, os micróbios eucariotos como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores codificantes de polipeptídeos, incluindo as cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Vide, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006). Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos (glicosilados) podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovírus que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros. Consulte, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (que descrevem a tecnologia PLANTIBODIES® para produção de anticorpos em plantas transgênicas). As células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, a linhagem de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão pode ser útil. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 conforme descrito em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células rim de hamster neonato (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod 23:243- 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células humanas de carcinoma cervical (HeLa); células de rim de cão (MDCK); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A); células pulmonares humanas (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562);. células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al, Annals NY Acad.Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub et al, Proc Acad Nat. Sci USA 77:4216 (1980)) e linhagem de células de mieloma, como a NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de proteína, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Humana Press, Fairfield, NJ, págs 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, células de leveduras, células de insetos, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, ou planta transgênica ou cultura ou tecido de planta ou animal. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, de preferência uma célula de mamífero, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), célula de rim embrionário humano (HEK) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, SP20).

[103] As tecnologias-padrão para expressar genes exógenos em tais sistemas são conhecidas no estado da técnica. As células que expressam um polipeptídeo compreendendo a cadeia pesada ou leve de um anticorpo podem ser manipuladas de modo a expressarem também as outras cadeias de anticorpo de tal modo que o produto expresso é um anticorpo que tem tanto a cadeia pesada quanto a cadeia leve.

[104] É fornecido um método de produção de imunocitocinas descritas na presente invenção, em que o método compreende o cultivo de células hospedeiras que compreendem um polinucleotídeo que codifica a imunocitocina, conforme fornecido no presente, sob condições apropriadas para expressão da imunocitocina e recuperação da imunocitocina da célula hospedeira (ou meio de cultivo de células hospedeiras).

[105] Os componentes da imunocitocina são geneticamente fundidos entre si. As imunocitocinas podem ser concebidas de tal forma que os seus componentes estejam fundidos diretamente uma ao outro ou indiretamente por meio de uma sequência ligante. A composição e o comprimento do ligante podem ser determinados de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica e a eficácia do mesmo pode ser testada. Sequências adicionais podem também ser incluídas para incorporar um sítio de clivagem para separar os componentes individuais da fusão, se desejado, por exemplo, uma sequência de reconhecimento de endopeptidase.

[106] A imunocitocina compreende pelo menos uma região variável de anticorpo capaz de ligar um determinante antigênico. As regiões variáveis podem formar parte de, e serem derivadas de anticorpos de ocorrência natural ou de anticorpos que não ocorrem naturalmente e fragmentos dos mesmos. Os métodos para produzir anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais são bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Harlow e Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Os anticorpos de ocorrência não natural podem ser construídos utilizando a síntese de peptídeo em fase-sólida, podem ser produzidos de forma recombinante (por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.186.567) ou podem ser obtidos, por exemplo, por rastreio de bibliotecas combinatórias que compreendem cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis (vide, por exemplo, a Patente US 5.969.108 de McCafferty). As porções de ligação a antígenos e métodos de produção das mesmas também estão descritos em detalhes na Publicação PCT WO 2011/020783, cujo teor completo é incorporado ao presente como referência.

[107] Um anticorpo, fragmento de anticorpo, domínio de ligação ao antígeno ou região variável de qualquer espécie de animal pode ser utilizado nas imunocitocinas da invenção. Os anticorpos, fragmentos de anticorpos, domínios de ligação ao antígeno ou regiões variáveis não limitantes úteis na presente invenção podem ser de origem murina, primata, ou de origem humana. Quando a imunocitocina é para uso humano, uma forma quimérica do anticorpo pode ser utilizada onde as regiões constantes do anticorpo são de origem humana. A forma humanizada ou totalmente humana de anticorpo também pode ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, a Patente US 5.565.332 – de Winter). A humanização pode ser obtida por meio de vários métodos, incluindo, mas não se limitando a: (a) enxertar CDRs não humanas (por exemplo, anticorpo doador) na região de arcabouço (framework) humana (por exemplo, anticorpo receptor) e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos da estrutura central críticos (por exemplo, aqueles que são importantes para manter boa afinidade de ligação ao antígeno ou funções do anticorpo), (b) enxertar apenas as regiões determinantes de especificidade não humanas (SDRs ou a-CDRs, os resíduos críticos para a interação anticorpo-antígeno) na região do arcabouço (framework) humana e regiões constantes, ou (c) transplantando os domínios variáveis não humanos inteiros, mas “camuflando” eles com uma seção semelhante à humana pela substituição de resíduos de superfície. Os anticorpos humanizados e métodos para a preparação dos mesmos são revistos, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), e encontram-se descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988);. Queen et al, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10.029-10.033 (1989), Patente US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321, e US 7.087.409;. Jones et al, Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al, Proc Natl Acad Sci USA 81, 6851-6855 (1984);. Morrison e Oi, Adv. Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31 (3), 169-217 (1994);. Kashmiri et al, Methods 36, 25-34 (2005) (descrevendo enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28, 489-498 (1991) (descrevendo o técnica de “resurfacing”);. Dall'Acqua et al, Methods 36, 43-60 (2005) (descrevendo “FR shuffling”); e Osbourn et al, Methods 36, 61-68 (2005) e Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de “seleção orientada” para o shuffling de FR). Os anticorpos humanos e regiões variáveis humanas podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica. Anticorpos humanos estão descritos de modo geral em van Dijk e van Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008). As regiões variáveis humanas podem formar parte de, e serem derivadas de anticorpos monoclonais humanos criados pelo método do hibridoma (vide, por exemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). Os anticorpos e regiões variáveis de humanos podem ser preparados pela administração de um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico (vide, por exemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). Os anticorpos humanos e regiões variáveis humanas também podem ser gerados isolando as sequências da região variável do clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição em fagos de origem humana (vide, por exemplo, Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed, Human Press, Totowa, NJ, 2001);. e McCafferty et al, Nature 348, 552-554, Clackson et al, Nature 352, 624-628 (1991)). O fago normalmente exibe fragmentos de anticorpo, como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. Uma descrição detalhada da preparação de porções de ligação a antígenos para imunoconjugados por meio de exibição de fagos pode ser encontrada nos Exemplos anexos da publicação PCT WO 2011/020783.

[108] Em certos exemplos de realização, os anticorpos são manipulados para terem afinidade de ligação aprimorada de acordo, por exemplo, com os métodos divulgados na publicação PCT WO 2011/020783 (consulte os Exemplos relacionados à maturação de afinidade) ou Pedido de Patente Norte-Americano US 2004/0132066, cujo teor é integralmente incorporado ao presente como referência. A capacidade da imunocitocina se ligar a um determinante antigênico específico pode ser mensurada por meio de um ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) ou outras técnicas familiares para um técnico hábil no assunto, por exemplo, a técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (analisada em um instrumento BIACORE T100) (Liljeblad et al., Glico J 17, 323-329 (2000)), e ensaios de ligação tradicionais (Heeley., Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Os ensaios de competição podem ser utilizados para identificar um anticorpo, fragmento de anticorpo, domínio de ligação ao antígeno ou domínio variável que compete com um anticorpo de referência pela ligação a um antígeno específico, por exemplo, um anticorpo que compete com o anticorpo CH1A1A 98/99 2F1 pela ligação ao CEA. Em determinados exemplos de realização, tal anticorpo competidor se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, uma cadeia linear ou um epítopo conformacional) ao qual o anticorpo de referência se liga. Métodos exemplares detalhados para o mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” Em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Em um ensaio de competição exemplar, o antígeno imobilizado (por exemplo, CEA) é incubado em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga ao antígeno (por exemplo, anticorpo CH1A1A 98/99 2F1) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo pela ligação ao antígeno. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, o antígeno imobilizado é incubado com uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação, sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, o excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade de marcador associada com antígeno imobilizado é mensurada. Se a quantidade de marcador associado com antígeno imobilizado for substancialmente reduzida na amostra teste em relação à amostra controle, então isso indica que o segundo anticorpo compete com o primeiro anticorpo pela ligação ao antígeno. Vide Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

[109] As imunocitocinas preparadas conforme descrito na presente invenção podem ser purificadas por técnicas conhecidas pelos especialistas no assunto, tal como a cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho, e técnicas similares. As condições reais utilizadas para purificar uma proteína particular dependerão, em parte, de fatores como a carga líquida, a hidrofobicidade, a hidrofilicidade, e etc, e serão evidentes para os especialistas no assunto. Para a purificação usando a cromatografia de afinidade, pode ser usado um anticorpo, um ligante, um receptor ou antígeno ao qual a imunocitocina se liga. Por exemplo, para a purificação da imunocitocina da invenção por cromatografia de afinidade, uma matriz com a proteína A ou proteína G pode ser usada. A cromatografia de afinidade em Proteína A ou G Sequencial e a cromatografia de exclusão por tamanho podem ser usadas para isolar a imunocitocina essencialmente conforme descrito nos Exemplos do documento WO 2012/146628. A pureza da imunocitocina pode ser determinada por qualquer um dentre uma variedade de métodos bem conhecidos, incluindo a análise por eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão, e similares. As imunocitocinas podem ser exibidas, por exemplo, intactas e adequadamente montadas, conforme demonstrado por SDS-PAGE redutor.

[110] As imunocitocinas com IL-2 variante direcionadas à PD-1 descritas na presente invenção podem ser preparadas conforme descrito nos exemplos do documento WO 2018/184964.

[111] Os anticorpos descritos na presente invenção são preferencialmente produzidos por meios recombinantes. Tais métodos são amplamente conhecidos no estado da técnica e compreendem a expressão de proteínas em células procariotas e eucariotas, com o posterior isolamento do polipeptídeo anticorpo e, normalmente, purificação para uma pureza farmaceuticamente aceitável. Para a expressão de proteína, os ácidos nucleicos que codificam as cadeias leves e pesadas ou fragmentos das mesmas são inseridos em vetores de expressão por meio de métodos padrões. A expressão é realizada em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas apropriadas, tais como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, leveduras ou células de E. coli, e o anticorpo é recuperado a partir das células (a partir do sobrenadante ou após a lise celular).

[112] A produção recombinante de anticorpos é bem conhecida no estado da técnica e descrita, por exemplo, nos artigos de revisão de Makrides, S.C., Expr Protein. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

[113] Os anticorpos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. A purificação é realizada a fim de eliminar outros componentes celulares ou outros contaminantes como, por exemplo, outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por técnicas padrão, incluindo o tratamento alcalino/SDS, bandeamento CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose, e outras técnicas bem conhecidas. Vide, Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova Iorque (1987).

[114] A expressão em células NS0 é descrita, por exemplo, por Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. A expressão transitória é descrita, por exemplo, por Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. A clonagem de domínios variáveis é descrita por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; e Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77- 87. Um sistema preferido de expressão transitória (HEK 293) é descrita por Schlaeger, E.-J., e Christensen, K., em: Cytotechnology 30 (1999) 71-83 e por Schlaeger, E.-J., em: J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

[115] Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de acordo com a invenção são combinados com sequências promotoras, de iniciação da tradução, região constante, região 3’ não traduzida, poliadenilação e terminação da transcrição para formar construções de vetor de expressão. As construções de expressão das cadeias pesada e leve podem ser combinadas em um único vetor, cotransfectadas, serialmente transfectadas, ou separadamente transfectadas em células hospedeiras que são então fundidas para formar uma única célula hospedeira que expressa ambas as cadeias.

[116] As sequências de controle que são adequadas para procariotos incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, um sítio de ligação ao ribossomo. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, acentuadores (enhancers) e sinais de poliadenilação.

[117] Um ácido nucleico está “operacionalmente ligado” quando ele é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA de uma pré-sequência ou um líder de secreção está operacionalmente ligado ao DNA que codifica um polipeptídeo se ele é expresso na forma de pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou amplificador está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora caso ele afete a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação caso ele esteja posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, “operacionalmente ligado” significa que as sequências de DNA ligadas são contíguas e, no caso do líder de secreção, significa que é contíguo e está dentro do quadro de leitura. Os amplificadores ou acentuadores (enhancers), entretanto, não necessitam ser contíguos. A ligação é realizada por meio de ligação em sítios de restrição convenientes. Caso estes sítios não existam, adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são utilizados de acordo com a prática convencional.

[118] Os anticorpos monoclonais são apropriadamente separados do meio de cultura por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade. O DNA e RNA que codificam os anticorpos monoclonais são rapidamente isolados e sequenciados utilizando procedimentos convencionais. As células de hibridoma podem servir como fonte de tal DNA e RNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser inserido em vetores de expressão, que são transfectados em seguida nas células hospedeiras, tais como células HEK 293, células CHO ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem a proteína de imunoglobulina para obter a síntese de anticorpos monoclonais recombinantes nas células hospedeiras.

[119] Conforme utilizado no presente documento, as expressões “célula”, “linhagem celular” e “cultura de células” são usadas de maneira indistinta e todas estas designações incluem as progênies das ditas células. Desse modo, as palavras “transformantes” e “células transformadas” incluem a célula primária em questão e as culturas derivadas dela, independentemente do número de transferências ao qual elas foram submetidas. Deve se compreender também que toda progênie pode não ser exatamente idêntica quanto ao conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou acidentais. São incluídas as progênies variantes que possuem a mesma função ou atividade biológica, conforme selecionado na célula transformada inicial.

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[120] A presente invenção compreende um método de tratamento de pacientes necessitados de terapia, caracterizado pela administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz da terapia combinada de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano de acordo com a presente invenção.

[121] A presente invenção compreende o uso de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano de acordo com a presente invenção para a terapia combinada descrita.

[122] Um exemplo de realização preferido da presente invenção é a terapia combinada de imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano de acordo com a presente invenção para uso no tratamento do câncer ou de tumores.

[123] Um exemplo de realização da presente invenção é, portanto, uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 descrita na presente invenção para uso no tratamento do câncer ou tumor em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito na presente invenção.

[124] Outro exemplo de realização da presente invenção é um anticorpo anti-PD-L1 descrito no presente para uso no tratamento do câncer ou tumor em combinação com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita.

[125] O câncer ou tumor pode apresentar um antígeno em um ambiente de células tumorais, por exemplo, sobre células T PD-1 + . A proteína PD-1 como alvo da terapia combinada pode ser apresentada no ambiente de células tumorais, por exemplo, em células T PD-1 + . O tratamento pode ser de tumor sólido. O tratamento pode ser de um carcinoma. O câncer pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer da cabeça e do pescoço, câncer do pulmão não pequenas células, câncer de mama, câncer pancreático, câncer do fígado e câncer gástrico. O câncer pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer gástrico, câncer de mama, câncer da cabeça e do pescoço, câncer de pele, câncer de fígado, câncer renal, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer cerebral e câncer de músculo esquelético.

[126] O termo “câncer” conforme utilizado no presente pode ser, por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquioalveolares, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma de colo do útero, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, Doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer de uretra, câncer de pênis, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer das vias biliares, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitoma, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisário, linfomas, leucemias linfocítica, incluindo as versões refratárias de qualquer um dos cânceres descritos acima, ou uma combinação de um ou mais cânceres descritos acima. Em um exemplo de realização preferido, esse câncer é câncer de mama, câncer colorretal, melanoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão ou câncer de próstata. Em um exemplo de realização preferido, tal câncer é um câncer de mama, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de pulmão ou câncer de próstata. Em outro exemplo de realização preferido, esse câncer é câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, melanoma, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal, câncer pancreático, carcinoma gástrico, câncer de esôfago, mesotelioma, câncer de próstata, leucemia, linfoma, mielomas.

[127] Um exemplo de realização da presente invenção é uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 descrita na presente invenção em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito na presente invenção para uso no tratamento de qualquer um dos cânceres ou tumores descritos acima.

[128] Outro exemplo de realização da presente invenção é um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito na presente invenção em combinação com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 conforme descrita na presente invenção para uso no tratamento de qualquer um dos cânceres ou tumores descritos acima.

[129] A presente invenção compreende a terapia combinada com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 descrita no presente com um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito no presente para o tratamento do câncer.

[130] A presente invenção compreende a terapia combinada com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 descrita na presente invenção com um anticorpo anti-PD-L1 descrito na presente invenção para prevenção ou tratamento de metástases.

[131] A presente invenção compreende a terapia combinada de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 descrita na presente invenção com um anticorpo anti-PD-L1 descrito na presente invenção para uso na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T.

[132] A presente invenção compreende um método de tratamento do câncer em um paciente com tal necessidade, caracterizado pela administração ao paciente de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 descrita no presente pedido e um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito no presente pedido.

[133] A presente invenção compreende um método para a prevenção ou tratamento de metástases em um paciente com tal necessidade, caracterizado pela administração ao paciente de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 descrita no presente pedido e um anticorpo antiPD-L1 conforme descrito no presente pedido.

[134] A invenção compreende um método para estimular uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, em um paciente com tal necessidade, caracterizado pela administração ao paciente de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 descrita no presente pedido e um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito no presente pedido.

[135] A invenção compreende uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 como descrita na presente invenção para uso no tratamento do câncer em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 aqui descrito, ou alternativamente para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 como aqui descrito.

[136] A invenção compreende uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita para uso na prevenção ou tratamento de metástases em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 aqui descrito, ou alternativamente para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de metástases em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 como aqui descrito.

[137] A invenção compreende uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita para uso na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 aqui descrito, ou alternativamente para a fabricação de um medicamento para uso na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito na presente invenção.

[138] A invenção compreende um anticorpo anti-PD-L1 aqui descrito para uso no tratamento do câncer em combinação com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita, ou alternativamente para a fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer em combinação com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita.

[139] A invenção compreende um anticorpo anti-PD-L1 aqui descrito para uso na prevenção ou tratamento de metástases em combinação com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita, ou alternativamente para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de metástases em combinação com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita

[140] A invenção compreende um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito neste documento para uso na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, em combinação com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita, ou alternativamente para o fabrico de um medicamento para uso na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, em combinação com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita

[141] Em um exemplo de realização preferido da invenção, a imunocitocina IL-1 variante direcionada à PD-1 utilizada nos tratamentos combinados descritos acima e usos médicos de diferentes doenças é uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado em tais tratamentos combinados é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL da SEQ ID NO: 16.

[142] Em um exemplo de realização preferido da invenção, a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada nos tratamentos combinados descritos acima e usos médicos de diferentes doenças é uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1, caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado em tais tratamentos combinados é o atezolizumabe.

[143] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição, tal como uma composição farmacêutica, que contém uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 conforme descrita no presente pedido e um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano ou a porção de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito no presente pedido, formulado juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[144] Conforme utilizado no presente, “veículo farmaceuticamente aceitável” inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de retardamento de absorção/reabsorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo é adequado para injeção ou infusão.

[145] A composição da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Como será apreciado pelo técnico hábil no assunto, o via e/ou modo de administração varia de acordo com os resultados desejados.

[146] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pó estéril para a preparação de dispersões ou soluções injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacologicamente ativas é conhecido no estado da técnica. Além de água, a veículo pode ser, por exemplo, uma solução salina tamponada isotônica.

[147] Independentemente da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser utilizados em uma forma hidratada adequada, e/ou composições farmacêuticas da presente invenção, são formulados em formas farmacêuticas ditas farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos pelos técnicos do assunto.

[148] Os atuais níveis de dosagem dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a se obter uma quantidade de ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente (quantidade eficaz). O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições especificas empregadas da presente invenção, ou o éster, o seu sal ou amida deste, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico que está sendo empregada, o uso de outras drogas, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições específicas, idade, sexo, peso, condição geral de saúde e histórico médico, do paciente antes de ser tratado, e fatores bem conhecidos nas artes médicas.

[149] Em um aspecto, a presente invenção fornece um kit destinado ao tratamento de doenças, que compreende, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, (a) uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 conforme descrita no presente pedido e (b) um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano conforme descrito no presente pedido e que compreende ainda, opcionalmente, (c) uma bula que compreende instruções impressas orientando o uso do tratamento combinado como método para o tratamento da doença. Além disso, o kit pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no seu interior, em que a composição compreende um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano conforme descrito no presente; (b) um segundo recipiente com uma composição contida no seu interior, em que a composição compreende uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 conforme descrita no presente; e, opcionalmente, (c) um terceiro recipiente com uma composição contida no seu interior, em que a composição compreende um agente citotóxico ou outro terapêutico adicional. O kit neste exemplo de realização pode compreender ainda uma bula indicando que a composição pode ser usada para tratar uma condição específica. Alternativamente ou adicionalmente, o kit pode compreender ainda um terceiro (ou quarto) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[150] Em um aspecto, a presente invenção fornece um kit destinado ao tratamento de doenças, que compreende (a) um recipiente que compreende uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 conforme descrito na presente invenção e (b) uma bula que compreende instruções orientando o uso da imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 na terapia combinada com um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito no presente pedido como método de tratamento da doença

[151] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit destinado ao tratamento de uma doença, compreendendo (a) um recipiente que compreende um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito no presente e (b) uma bula que compreende instruções orientando o uso do anticorpo anti-PD-L1 em uma terapia combinada com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 conforme descrito no presente como método para tratar a doença.

[152] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um medicamento destinado ao tratamento de doenças, que compreende uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 descrita na presente invenção, em que o mencionado medicamento destina-se a uso na terapia combinada com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano conforme descrito na presente invenção e compreende opcionalmente uma bula que compreende instruções impressas orientando o uso do tratamento combinado como método de tratamento da doença.

[153] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um medicamento destinado ao tratamento de uma doença, que compreende um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano conforme descrito no presente, em que o medicamento mencionado destina-se ao uso na terapia combinada com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 tal como descrita na presente invenção e compreende opcionalmente uma bula que compreende instruções impressas orientando o uso do tratamento combinado como método de tratamento da doença.

[154] O termo “um método de tratamento” ou equivalente, quando aplicado, por exemplo, ao câncer se refere a um procedimento ou curso de ação que é projetado para reduzir ou eliminar o número de células cancerosas em um paciente, ou aliviar os sintomas de um câncer. Um “método para o tratamento” do câncer ou outra doença proliferativa não significa necessariamente que as células cancerosas ou o distúrbio sejam de fato eliminados, de modo que na verdade o número de células ou o distúrbio podem ser reduzidos, ou os sintomas do câncer ou distúrbio podem ser atenuados. Frequentemente, um método de tratamento do câncer será realizado mesmo com uma baixa probabilidade de sucesso, mas que, dado o histórico médico e expectativa de sobrevida estimada de um paciente, é, no entanto, considerado por induzir um curso de ação benéfico no geral.

[155] Os termos “administrados em combinação com” ou “coadministração”, “coadministrados”, “terapia combinada” ou “tratamento combinado” referem-se à administração da imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 conforme descrita na presente invenção e do anticorpo que se liga ao PD-L1 humano conforme descrito na presente invenção, por exemplo, como formulações/aplicações separadas (ou como uma única formulação/aplicação). A coadministração pode ser simultânea ou sequencial em qualquer ordem, onde existe preferencialmente um período de tempo, enquanto ambos os agentes ativos (ou todos) exercem simultaneamente suas atividades biológicas. Os referidos agentes ativos são coadministrados simultaneamente ou sequencialmente (por exemplo, através de uma infusão contínua intravenosa (iv). Quando ambos os agentes terapêuticos são coadministrados sequencialmente a dose é administrada no mesmo dia em duas administrações separadas, ou um dos agentes é administrado no dia 1 e o segundo é coadministrado no dia 2 ao dia 7, de preferência no dia 2-4. Assim, em um exemplo de realização, o termo “sequencialmente” significa até 7 dias após a dose do primeiro componente (citocina ou anticorpo), e preferencialmente dentro de 4 dias após a dose do primeiro componente, e o termo “simultaneamente” significa ao mesmo tempo. O termo “coadministração” em relação às doses de manutenção da referida imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L1 indica que as doses de manutenção podem ser coadministradas simultaneamente, se o ciclo de tratamento é adequado para ambas as drogas, por exemplo, semanalmente. Alternativamente, as doses de manutenção são coadministradas sequencialmente; doses de imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 e anticorpo anti-PD-L1, por exemplo, são administradas em semanas alternadas.

[156] É evidente que os anticorpos são administrados ao paciente em uma “quantidade terapeuticamente eficaz” (ou simplesmente “quantidade eficaz”), que é a quantidade do respectivo composto ou combinação que irá provocar a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animal ou humano, que está sendo procurada pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico.

[157] A quantidade de coadministração e o tempo de coadministração dependerão do tipo (espécie, sexo, idade, peso, etc) e da condição do paciente sendo tratado e da gravidade da doença ou condição sendo tratada. A referida imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 e/ou anticorpo anti-PD-L11 são adequadamente coadministrados ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos, tal como no mesmo dia, no dia seguinte ou em intervalos semanais.

[158] Além da imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD1 em combinação com o anticorpo anti-PD-L1, um agente quimioterápico adicional também pode ser administrado.

[159] Em um exemplo de realização, tais agentes quimioterápicos adicionais, que podem ser administrados com a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 aqui descrita e o anticorpo anti-PD-L1 aqui descrito, incluem, mas não estão limitados a agentes antineoplásicos incluindo agentes alquilantes incluindo: mostradas nitrogenadas, como mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan e clorambucila; nitrosoureias, como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (metilCCNU); Temodal (TM) (temozolamida), etileniminas/metilmelamina, tais como a trimetilenemelamina (TEM), trietileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); sulfonatos de alquila como busulfan; triazinas como dacarbazina (DTIC); antimetabolitos incluindo análogos de ácido fólico tais como metotrexato e trimetrexato, análogos de pirimidina como 5- fluorouracila (5FU), fluorodeoxiuridina, gemcitabina, arabinosídeos de citosina (AraC, citarabina), 5-azacitidina, 2,2'-difluorodesoxicitidina, análogos de purina tais como 6-mercaptopurina, 6-tioguamina, azatioprina, T-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina e 2- clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA); produtos naturais, incluindo fármacos antimitóticos, como paclitaxel, alcaloides da vinca incluindo vinblastina (VLB), vincristina e vinorelbina, taxotere, estramustina e fosfato de estramustina; Pipodofilotoxinas como etoposido e teniposido; antibióticos como a actinomicina D, daunomicina (rubidomicina), doxorrubicina, mitoxantrona, idarubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C e actinomicina; enzimas tais como L-asparaginase; modificadores de resposta biológica tais como interferon alfa, IL-2, G-CSF e GM-CSF; agentes diversos, incluindo complexos de coordenação de platina como oxaliplatina, cisplatina e carboplatina, antracenadiononas como a mitoxantrona, ureia substituída tal como hidroxiureia, derivados de metil-hidrazina incluindo N-metil-hidrazina (MIH) e procarbazina, supressores adrenocorticoides como mitotano (o, pDDD) e aminoglutetimida; hormônios e antagonistas, incluindo antagonistas de adrenocorticoesteroides, tais como prednisona e equivalentes, dexametasona e aminoglutetimida; GemzarTM (gemcitabina), progestina, como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona e acetato de megestrol; estrógeno tal como equivalentes de dietilestilbestrol e etinilestradiol; antiestrogênio como o tamoxifeno; andrógenos, incluindo propionato de testosterona e fluofimeterona/equivalentes; antiandrogênios tais como flutamida, análogos do hormônio de liberação de gonadotropina e leuprolida; e antiandrógenos não esteroides, como a flutamida. As terapias que visam o mecanismo epigenético incluindo, mas não se limitando a, inibidores da histona desacetilase, agentes de desmetilantes (por exemplo, Vidaza) e terapias de liberação da repressão transcricional (ATRA) também podem ser combinadas com as proteínas de ligação ao antígeno. Em uma forma de realização, o agente quimioterápico é selecionado a partir do grupo que consiste em taxanos (como, por exemplo, paclitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotere), paclitaxel modificado (por exemplo, Abraxane e Opaxio), doxorrubicina, sunitinib (Sutent), sorafenib (Nexavar) e outros inibidores de multiquinase, oxaliplatina, cisplatina e carboplatina, etoposido, gemcitabina e vinblastina. Em uma forma de realização, o agente quimioterápico é selecionado a partir do grupo que consiste em taxanos (como, por exemplo, taxol (paclitaxel), docetaxel (Taxotere), paclitaxel modificado (por exemplo, Abraxane e Opaxio). Em uma forma de realização, o agente quimioterápico adicional é selecionado a partir de 5-fluorouracila (5-FU), leucovorina, irinotecano ou oxaliplatina. Em uma forma de realização, o agente quimioterápico é 5-fluorouracila, leucovorina e irinotecano (FOLFIRI). Em uma forma de realização, o agente quimioterápico é 5-fluorouracila e oxaliplatina (FOLFOX).

[160] Exemplos específicos de terapias combinadas com agentes quimioterápicos adicionais incluem, por exemplo, terapias com taxanos (por exemplo, docetaxel ou paclitaxel) ou um paclitaxel modificado (por exemplo, Abraxane ou Opaxio), doxorrubicina, capecitabina e/ou bevacizumabe (Avastin) para o tratamento do câncer de mama; terapias com carboplatina, oxaliplatina, cisplatina, paclitaxel, doxorrubicina (ou doxorrubicina modificada (Caelyx ou Doxil)), ou topotecano (Hycamtin) para tratamento do câncer de ovário, terapias com inibidor multiquinase, MKI (Sutent, Nexavar ou 706) e/ou doxorrubicina para tratamento do câncer renal; terapias com oxaliplatina, cisplatina e/ou radiação para o tratamento de carcinoma de células escamosas; terapias com taxol e/ou carboplatina para o tratamento do câncer de pulmão.

[161] Portanto, em uma forma de realização, o agente quimioterápico adicional é selecionado a partir do grupo de taxanos (docetaxel ou paclitaxel ou paclitaxel modificado (Abraxane ou Opaxio), doxorrubicina, capecitabina e/ou bevacizumabe para o tratamento do câncer de mama.

[162] Em um exemplo de realização, a terapia combinada de imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 / anticorpo PD-L1 é aquela na qual nenhum agente quimioterápico é administrado.

[163] A invenção compreende também um método para o tratamento de um paciente que sofre de tal doença, tal como descrito na presente invenção.

[164] A presente invenção fornece ainda um método de fabricação de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 da presente invenção conforme descrita no presente pedido e um anticorpo anti-PD-L1 da presente invenção conforme descrito no presente pedido, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável e o uso da imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 e do anticorpo anti-PD-L1 de acordo com a presente invenção para este método.

[165] A presente invenção fornece ainda o uso de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 de acordo com a presente invenção conforme descrito no presente e um anticorpo anti-PD-L1 de acordo com a presente invenção conforme descrito no presente em quantidade eficaz para a fabricação de um agente farmacêutico, preferencialmente em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de pacientes que sofrem de câncer.

TERAPIA CELULAR

[166] Em alguns exemplos de realização, a imunoterapia é uma imunoterapia de ativação. Em alguns exemplos de realização, a imunoterapia é fornecida como um tratamento contra o câncer. Em alguns exemplos de realização, a imunoterapia compreende a transferência de células adotivas.

[167] Em alguns exemplos de realização, a transferência de células adotivas compreende a administração de uma célula T que expressa o receptor de antígeno quimérico (célula T CAR). Um profissional versado na técnica reconhecerá que CARs são um tipo de receptor direcionado ao antígeno composto de domínios de sinalização de células T intracelulares fundidos às porções de ligação ao tumor extracelulares, mais comumente fragmentos variáveis de cadeia única (scFvs) de anticorpos monoclonais.

[168] Os CARs reconhecem diretamente os antígenos da superfície celular, independentemente da apresentação mediada pelo MHC, permitindo o uso de uma única construção de receptor específica para qualquer antígeno em todos os pacientes. Os CARs iniciais fundiram domínios de reconhecimento de antígeno à cadeia de ativação de CD3 do complexo de receptor de célula T (TCR). Embora esses CARs de primeira geração induziam a função efetora de células T in vitro, eles foram amplamente limitados pela eficácia antitumoral pobre em cenários in vivo. As iterações CAR subsequentes incluíram sinais coestimuladores secundários em tandem com CD3, incluindo domínios intracelulares de CD28 ou uma variedade de moléculas da família de receptores de TNF, como 4-1BB (CD137) e OX40 (CD134). Além disso, os receptores de terceira geração incluem dois sinais coestimuladores além de CD3, mais comumente de CD28 e 4-1BB. Os CARs de segunda e terceira geração melhoram dramaticamente a eficácia antitumoral, em alguns casos induzindo remissões completas em pacientes com câncer avançado. Em um exemplo de realização, uma célula T CAR é uma célula imunorresponsiva modificada para expressar CARs, que é ativada quando os CARs se ligam ao seu antígeno.

[169] Em um exemplo de realização, uma célula T CAR é uma célula imunorresponsiva que compreende um receptor de antígeno, que é ativado quando seu receptor se liga ao seu antígeno. Em um exemplo de realização, as células T CAR usadas nas composições e métodos divulgados na presente invenção são células T CAR de primeira geração. Em outro exemplo de realização, as células T CAR usadas nas composições e métodos divulgados na presente invenção são células T CAR de segunda geração. Em outro exemplo de realização, as células T CAR usadas nas composições e métodos divulgados na presente invenção são células T CAR de terceira geração. Em outro exemplo de realização, as células T CAR usadas nas composições e métodos divulgados na presente invenção são células T CAR de quarta geração.

[170] Em alguns exemplos de realização, a transferência de células ativas compreende a administração de células T modificadas por receptor de célula T (TCR). Um técnico hábil apreciará que células T modificadas com TCR são produzidas pelo isolamento de células T a partir de tecido tumoral e o isolamento de suas cadeias TCRα TCRβ. TCRa e TCRβ são posteriormente clonadas e transfectadas em células T isoladas do sangue periférico, que então expressam TCRα e TCRβ a partir das células T que reconhecem o tumor.

[171] Em alguns exemplos de realização, a transferência de células adotivas compreende a administração de linfócitos infiltrantes do tumor (TIL). Em alguns exemplos de realização, a transferência de células adotivas compreende a administração de células NK modificadas com receptor de antígeno quimérico (CAR). Um técnico hábil no assunto reconhecerá que células NK CAR-modificadas compreendem células NK isoladas a partir do paciente ou células NK manipuladas disponíveis comercialmente que expressam um CAR que reconhece uma proteína específica do tumor.

[172] Em alguns exemplos de realização, a transferência de células adotivas compreende a administração de células dendríticas.

[173] Em alguns exemplos de realização, a imunoterapia compreende a administração de uma vacina contra o câncer. Um profissional versado na técnica apreciaria que uma vacina contra o câncer expõe o sistema imunológico a um antígeno específico do câncer e um adjuvante. Em alguns exemplos de realização, a vacina contra o câncer é selecionada a partir de um grupo que compreende: sipuleucel-T, GVAX, ADXS11-001, ADXS31-001, ADXS31-164, vacina ALVAC-CEA, vacina AC, talimogene laherparepvec, BiovaxID, Prostvac, CDX110, CDX1307, CDX1401, CimaVax-EGF, CV9104, DNDN, NeuVax, Ae-37, GRNVAC, tarmogens, GI-4000, GI-6207, GI-6301, ImPACT Therapy, IMA901, hepcortespenlisimut-L, Stimuvax, DCVax-L, DCVaxDirect, DCVax Prostate,CBLI, Cvac, RGSH4K, SCIB1, NCT01758328 e PVX410.

[174] Os exemplos, listagem de sequências e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é estabelecido nas reivindicações anexas. Deve-se compreender que modificações nos procedimentos estabelecidos podem ser feitas sem nos afastarmos do espírito da presente invenção.

[175] Nas declarações a seguir, são descritos exemplos de realização específicos da invenção:
1. A) Uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à DP1 em combinação com um anticorpo que se liga ao DP-L1 humano para uso no tratamento do câncer, na prevenção ou tratamento de metástases, ou na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T;
ou
B) o uso de um imunocitocina com IL-2 variante direcionada à DP-1 para a fabricação de um medicamento para uso no tratamento do câncer, na prevenção ou tratamento de metástases, ou na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como atividade de células T; ou
C) uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 para uso no tratamento do câncer, na prevenção ou tratamento de metástases ou na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T; em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 é administrada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano;
em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou
• b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou
• c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou
• d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14,

e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada é caracterizado por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16, ou
• b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20;

2. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano ou uso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SE Q ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16;
3. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano ou uso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é atezolizumabe;
4. A Imunocitocina com IL-2 variante direcionada à DP-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao DP-L1 humana ou uso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, caracterizado pelo fato do componente anticorpo da imunocitocina e o anticorpo serem da subclasse IgG1 humana ou subclasse IgG4 humana;
5. A Imunocitocina com IL-2 variante direcionada à DP-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano e o uso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, caracterizado pelo fato de que os referidos anticorpos tem função efetora reduzida ou mínima;
6. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano ou uso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que a função efetora mínima resulta de uma mutação de Fc sem função efetora;
7. A imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano ou uso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, em que a mutação de Fc sem função efetora é L234A/L235A ou L234A/L235A/P329G ou N297A ou D265A/N297A (numeração EU);
8. A) Um método para tratar o câncer, prevenir ou tratar metástases, ou estimular uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, em que PD-1 é apresentado em um ambiente de células tumorais;
em que uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 é administrada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano,
ou
B) um método para tratar um paciente com um tumor, em que PD-1 é apresentado em um ambiente de células tumorais, e em que uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 é administrada em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano; em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou
• b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou
• c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou
• d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14,

e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada é caracterizado por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16, ou
• b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20;

9. Um método para o tratamento do câncer em um paciente com tal necessidade, para a prevenção ou tratamento de metástases em um paciente com tal necessidade, ou para estimular uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, em um paciente com tal necessidade, compreendendo a administração ao paciente de uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 e um anticorpo anti-PD-L1, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou
• b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou
• c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou
• d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14,

e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada é caracterizado por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16, ou
• b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20;

10. O método de acordo com o exemplo de realização 9, para o tratamento do câncer;
11. O método de acordo com o exemplo de realização 10, caracterizado por ser para o tratamento do câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, melanoma, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal, melanoma, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer esofágico, mesotelioma, câncer de próstata, leucemia, linfomas, mielomas;
12. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 8 a 11, caracterizado pela imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16;
13. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 8 a 12, caracterizado pela imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada ser caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é atezolizumabe;
14. O método de acordo com qualquer um dos exemplos realização de 8 a 13, caracterizado pelo componente anticorpo da imunocitocina e o anticorpo serem da subclasse IgG1 humana ou subclasse IgG4 humana;
15. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 8 a 14, caracterizado pelos referidos anticorpos terem função efetora reduzida ou mínima;
16. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 8 a 15, caracterizado pela função efetora mínima resultar de uma mutação de Fc sem função efetora;
17. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 8 a 16, caracterizado pela mutação de Fc sem função efetora ser L234A/L235A ou L234A/L235A/P329G ou N297A ou D265A/N297A (numeração EU);
18. O método, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 8 a 17, caracterizado pela referida imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano serem administrados de modo simultâneo ou sequencial;
19. O método de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 8 a 18, caracterizado por compreender ainda a administração de um agente quimioterápico ao referido paciente;
20. Um kit destinado ao tratamento do câncer em um paciente com tal necessidade, destinado a prevenção ou tratamento de metástases em um paciente com tal necessidade, ou destinado a estimular uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, em um paciente com tal necessidade, que compreende, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, (a) uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1; (b) um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano; e (c) opcionalmente, uma bula que compreende instruções impressas que orientam o uso da imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 e do anticorpo que se liga ao PD-L1 humano em tratamento combinado; em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou
• b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou
• c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou
• d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14,

e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada é caracterizado por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16, ou
• b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20;

21. Um kit para o tratamento do câncer em um paciente com tal necessidade, para a prevenção ou tratamento de metástases em um paciente com tal necessidade, ou para estimular uma resposta ou função imunológica, tal como atividade de células T, compreendendo (a) um recipiente compreendendo um imunocitocina IL-1 variante direcionada à PD-1, e (b) uma bula ou folheto informativo que compreende instruções orientando o uso da imunocitocina com IL-2 variante direcionada à DP-1 em uma terapia combinada com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano como um método para tratar a doença, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou
• b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou
• c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou
• d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14,

e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada é caracterizado por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16, ou
• b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20;

22. Um kit destinado ao tratamento do câncer em um paciente com tal necessidade, destinado a prevenção ou tratamento de metástases em um paciente com tal necessidade, ou destinado a estimular uma função ou resposta imune, tal como a atividade de células T, compreendendo (a) um recipiente que compreende um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, e (b) uma bula ou folheto informativo compreendendo instruções orientando o uso do anticorpo que se liga ao PD-L1 humano em uma terapia combinada com uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 como método para o tratamento da doença,
em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou
• b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou
• c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou
• d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14,

e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada é caracterizado por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16, ou
• b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20;

23. O kit de acordo com o exemplo de realização de 21 a 22, para o tratamento do câncer;
24. O kit de acordo com o exemplo de realização 23, caracterizado por ser para o tratamento do câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, melanoma, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal, melanoma, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer esofágico, mesotelioma, câncer de próstata, leucemia, linfomas, mielomas;
25. O kit de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 21 a 24, caracterizado pela imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16;
26. O kit de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 21 a 24, caracterizado pela imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada ser caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é atezolizumabe;
27. O kit de acordo com qualquer um dos exemplos realização de 21 a 26, caracterizado pelo componente anticorpo da imunocitocina e o anticorpo serem da subclasse IgG1 humana ou subclasse IgG4 humana;
28. O kit de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 21 a 27, caracterizado pelos referidos anticorpos terem função efetora reduzida ou mínima;
29. O kit de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 21 a 28, caracterizado pela função efetora mínima resultar de uma mutação de Fc sem função efetora;
30. O kit de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 21 a 29, caracterizado pela mutação de Fc sem função efetora ser L234A/L235A ou L234A/L235A/P329G ou N297A ou D265A/N297A (numeração EU);
31. Medicamento destinado ao tratamento do câncer em pacientes com tal necessidade, para a prevenção ou tratamento de metástases em um paciente com tal necessidade, para o tratamento de doenças inflamatórias em um paciente com tal necessidade, para o tratamento ou retardamento da progressão de uma doença imunorrelacionada, como imunidade tumoral em um paciente com tal necessidade, ou para estimular uma função ou resposta imune, como a atividade de células T, compreendendo uma imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 em que o referido medicamento é para uso em uma terapia combinada com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano e, opcionalmente, compreende uma bula compreendendo instruções impressas que orientam o uso da imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano em um tratamento combinado,
em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou
• b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou
• c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou
• d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14,

e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada é caracterizado por compreender;

• a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16, ou
• b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20;

32. O medicamento de acordo com o exemplo de realização 31, para o tratamento do câncer;
33. O medicamento de acordo com o exemplo de realização 32, caracterizado por ser para o tratamento do câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, melanoma, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, câncer colorretal, melanoma, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer esofágico, mesotelioma, câncer de próstata, leucemia, linfomas, mielomas;
34. O medicamento de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 31 a 33, caracterizado pela imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é caracterizado por compreender um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16;
35. O medicamento de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 31 a 33, caracterizado pela imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada ser caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é atezolizumabe;
36. O medicamento de acordo com qualquer um dos exemplos realização de 31 a 35, caracterizado pelo componente anticorpo da imunocitocina e o anticorpo serem da subclasse IgG1 humana ou subclasse IgG4 humana;
37. O medicamento de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 31 a 36, caracterizado pelos referidos anticorpos terem função efetora reduzida ou mínima;
38. O medicamento de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 31 a 37, caracterizado pela função efetora mínima resultar de uma mutação de Fc sem função efetora;
39. O medicamento de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 31 a 38, caracterizado pela mutação de Fc sem função efetora ser L234A/L235A ou L234A/L235A/P329G ou N297A ou D265A/N297A (numeração EU);
40. As combinações para uso ou usos de um medicamento ou usos de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 39 compreendendo tratamento ou pré-tratamento com imunoterapia;
41. O exemplo de realização 40, caracterizado pela referida imunoterapia poder compreender transferência de células adotivas, administração de anticorpos monoclonais, administração de citocinas, administração de uma vacina contra o câncer, terapias de engajamento de células T ou qualquer combinação das mesmas;
42. O exemplo de realização 41, caracterizado pela transferência de células adotivas poder compreender a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T modificadas de receptor de célula T (TCR), linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), receptor de antígeno quimérico (CAR) células assassinas naturais (natural killer - NK) CAR-modificadas, células transduzidas com receptor de células T (TCR) ou células dendríticas ou qualquer combinação das mesmas. EXEMPLOS

[176] O imunoconjugado PD-1-IL2v substituto murino foi testado sozinho e em combinação com o Mab PD-L1 substituto murino quanto à sua eficácia antitumoral em um modelo de camundongo singênico e um modelo de camundongo transgênico RT5

MATERIAIS PD1-IL2V E MUPD1-IL2V

[177] O cassete de expressão para a proteína de fusão da cadeia pesada de anticorpo – interleucina-2 (IL-2) [região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 humano, cadeia pesada da IgG1 humana (com mutações L234A, L235A e P329G (numeração EU) para remoção de funções efetoras e mutações S354C e T366W (numeração EU) para heterodimerização (“knob”)), ligante (G4S)3 e IL-2v humana (carregando as mutações T3A, F42A, Y45A, L72G e C125A)] , o cassete de expressão para a cadeia pesada de anticorpo [região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 humano e cadeia pesada da IgG1 humana (com mutações L234A, L235A e P329G (numeração EU) para a remoção das funções efetoras, mutações Y349C, T366S, L368A e Y410V (numeração EU) para heterodimerização (“hole”) e, opcionalmente, mutações H435R e Y436F (numeração EU)] e o cassete de expressão para a cadeia leve de anticorpo [região variável de cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 humano, e região constante Ckappa humana] e as proteínas foram produzidas por síntese gênica.

[178] Eles foram clonados por digestão com HindIII e Nhel em um vetor de expressão sob o controle do promotor CMV seguido por um íntron A e terminado pelo sinal BGH-poli A. O vetor continha ainda um gene bacteriano de resistência à ampicilina e uma origem de replicação de E. coli.

[179] A proteína de fusão PD1-IL-2v humana (SEQ ID NOs 7, 8 e 9) foi gerada por cotransfecção de células HEK293F (Invitrogen) com os vetores descritos acima na proporção de 1:1:1 em frascos de agitação. Após uma semana, o sobrenadante foi coletado e filtrado através de filtros estéreis.

[180] A proteína de fusão foi purificada a partir do sobrenadante por uma combinação de cromatografia por afinidade em proteína A e cromatografia por exclusão de tamanho. O produto obtido foi caracterizado pela identidade por espectrometria de massa e propriedades analíticas como pureza por eletroforese capilar (CE-SDS), teor de monômero e estabilidade.

[181] A proteína de fusão PD1-IL2v substituta murina (SEQ ID NOs 12, 13 e 14) foi produzida de forma análoga. A molécula substituta compreende um anticorpo murino IgG1 anti-PD-1 de camundongo (com mutações Fc para remoção da função efetora e para heterodimerização) e interleucina-2 murina com mutações análogas à molécula humana

[182] Ambas as proteínas de fusão puderam ser produzidas com bons rendimentos e são estáveis.

[183] Os anticorpos anti-PD-L1 com reação cruzada humano/camundongo foram usados nos estudos. Por exemplo, um anticorpo substituto anti-PD-L1 de camundongo baseado no anticorpo YW243.55.S70 PD-L1 descrito no documento WO 2010/077634 (sequência apresentada na Figura 11), nomeado de YW243.55.S70 PD-L1 muIgG1, foi gerado para uso em modelos de tumor in vivo. Este anticorpo continha uma mutação DAPG para abolir a interação FcγR. A região variável de YW243.55.S70 foi ligada a um domínio constante de IgG1 murino com mutações DAPG na porção Fc.

[184] As sequências polipeptídicas de YW243.55.S70 PD-L1 muIgG1 são as seguintes:
YW243.55.S70 PD-L1 muIgG1 DAPG HC (SEQ ID NO:21): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPG GFDYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPV TVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPAS STKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISK DAPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEF KCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFF PEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFT CSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK.

[185] YW243.55.S70 PD-L1 muIgG1 LC (SEQ ID NO:22): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEI KRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRN EC.

EXEMPLO 1 MODELO SINGÊNICO SUBCUTÂNEO COLORRETAL MC38

[186] O imunoconjugado PD1-IL2V substituto murino (muPD1- IL2v: SEQ ID NOs 12, 13, 14) foi testado na linhagem de células colorretais MC38 de camundongo injetada subcutaneamente em camundongos Black 6. O anticorpo anti-PD-L1 PD-L1 6E11 muIgG1 foi usado neste estudo (SEQ ID NOs 21, 22)

[187] A linhagem de células de carcinoma colorretal MC38 foi cultivada em meio DMEM contendo 10% de SBF (Gibco) a 37 ºC em uma atmosfera saturada de água a 5% de CO2. A passagem 11 foi utilizada para transplante, com viabilidade de 91%. 5x105 células por animal foram injetadas subcutaneamente em 100 µL de meio de cultura de células RPMI (Gibco) no flanco de camundongos usando uma seringa de tuberculina de 1 mL (BD Biosciences).

[188] Camundongos Black 6 fêmeas com 6-8 semanas de idade no início do experimento (Charles Rivers, Lyon, França) foram mantidos sob condições livres de patógenos-específicos com ciclos diários de 12 h luz/12 h escuro de acordo com as diretrizes compromissadas (GV-Solas ; Felasa; TierschG). Após a chegada os animais foram mantidos por uma semana para se habituarem ao novo ambiente e para a observação. Foi realizado o monitoramento contínuo da saúde regularmente.

[189] Os camundongos receberam injeções subcutâneas no dia 0 do estudo com 1x105 células MC38, e foram os camundongos foram randomizados e pesados. Uma semana após a injeção de células tumorais (volume tumoral > 150 mm3 ), os camundongos foram injetados i.v. com muPD1-IL2v, muPD-L1-Mab ou a combinação de muPD1-IL2v + muPD-L1 Mab por duas semanas. Todos os camundongos receberam injeções i.v. de 200 μL da solução apropriada. Os camundongos no grupo de veículo foram injetados com tampão histidina e os grupos de tratamento com a construção muPD1-IL2v 0,5 mg/kg qw ou muPD-L1 Mab 10 mg/kg iv uma vez e em seguida 5 mg/kg 2qw ou a combinação muPD1- IL-2v + muPD-L1 Mab. Para se obter a quantidade adequada de imunoconjugado por 200 μL, as soluções de estoque foram diluídas com tampão histidina quando necessário.

[190] A Figura 1 e a Tabela 1A mostram que a combinação de Mab muPD-IL2v e muPD-L1 medeia uma eficácia superior em termos de inibição do crescimento tumoral em comparação com os tratamentos com Mab sozinhos, muPD1-IL2v e muPD-L1.

EXEMPLO 2 MODELO DE CAMUNDONGO TRANSGÊNICO RIP-TAG5 (RT5) DE PANNET MÉTODOS

[191] Modelo De Camundongo Transgênico Rip-Tag5 (RT5) de PanNET. A geração de camundongos Rip-Tag5 foi previamente descrita (J Clin Invest. 1996;97(1):54-64. https://doi.org/10.1172/JCI118406). Os camundongos Rip-Tag5 neste estudo foram feitos em um fundo genético C57B6/N. Os experimentos com animais foram conduzidos sob as licenças VD3133 e VD3475 aprovadas.

[192] Ensaio de droga Pré-clínico em camundongos RT5. Para incluir camundongos Rip-Tag5 no ensaio, os camundongos com 22 semanas de idade foram selecionados para a presença de PanNET por imagem de ultrassom usando um sistema Vevo2100 com um transdutor MS550D de 40 MHz (Visual Sonic). Os camundongos Rip-Tag5 foram atribuídos aleatoriamente aos diferentes grupos de tratamento com base na carga tumoral cumulativa. Para os estudos de longo prazo, os tumores foram monitorados a cada duas semanas.

[193] Fármacos e regime de dosagem. Todos os fármacos usados no Exemplo 2 eram moléculas substitutas para murinos, embora não seja explicitamente declarado aqui. Foram utilizados os anticorpos anti-PD-L1 murinos “6E11 ligante muIgG2a (PGLALA)” abreviado como 6E11-muIgG2a, “6E11 ligante muIgG1 (DAPG)” abreviado como 6E11-muIgG1 e “YW243.55.S70 ligante muIgG1” (DAPG) abreviado como S70-muIgG1.

[194] No tratamento anti-DP-L1 de quatro camundongos RipTag5 resultando na Figura 3D os anticorpos anti-PD-L1 murino foram administrados de acordo com a tabela 2.

[195] No tratamento combinado com PD1-IL2v e anti-PD-L1 de sete camundongos Rip-Tag5 resultando na Figura 3E os anticorpos anti-PD-L1 murino foram administrados de acordo com a tabela 3.

[196] Os fármacos foram administrados por injeção i.p. com as seguintes quantidades por camundongo: anti-PD1-baixo: 22,75 µg, q1wk (equimolar ao PD1-IL2v), anti-PD1-alto: 250 µg, q1wk (dose terapêutica), DP47-IL2v: 25 µg, q1wk, PD1-IL2v: 25 µg, q1wk, anti-PDL1: primeira dose 250 µg, seguida por 125 µg, duas vezes por semana, por um período de oito semanas.

[197] Citometria de Fluxo: As suspensões de células únicas de baços foram geradas esmagando o baço através de um filtro de células de 40 µm. Após a lise dos glóbulos vermelhos com tampão PD PharmLyse (BD Biosciences 555899), os esplenócitos foram bloqueados com anti-CD16/32 de camundongo (BioLegend, número de cat. 101302). A coloração para evidenciar células vivas/mortas foi realizada com coloração de viabilidade fixável 780 (BD 565388). Células T CD8+ específicas para TAG foram coradas com multímero SV40 TAG (APC-MHC-H2Kb-VVYDFLKC, Universidade de Lausanne), seguido por coloração de anticorpos contra antígenos de superfície. Proteínas intracelulares foram coradas após fixação e permeabilização usando o kit de coloração Foxp3 (Invitrogen, número de cat.: 00-5523-00) de acordo com as instruções do fabricante. O painel consistiu nos seguintes anticorpos: CD4- BV510 (BioLegend, número de cat.: 100553), CD8-BB515 (BD Biosciences, número de cat.: 564422), PD1-PE-Cy7 (BioLegend, número de cat.: 109110), LAG3-BV421 (BioLegend, número de cat.: 125221), TIGIT-PE-Dazzle 594 (BioLegend, número de cat.: 142109), CD28-BB700 (BD Biosciences, número de cat.: 566513), ICOS-BV785 (BioLegend, número de cat.: 313534), KLRG1- BV711 (BioLegend, número de cat.: 138427), CD25-APC-R700 (BD Biosciences, número de cat.: 565135), CD127-BV650 (BioLegend, número de cat.: 135043), CD27-BUV395 (BD Biosciences, número de cat.: 740247), Foxp3-PE (Invitrogen, número de cat.: 12-5773-82). As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo BD LSR Fortessa e os dados foram processados com o software FlowJo e GraphPad Prism.

[198] Imuno-histoquímica. Os tumores foram incluídos em OCT e congelados em gelo seco. Os cortes histológicos de 10 µm de espessura fixados em metanol foram submetidos à coloração com CD8-FITC (BioLegend, número de cat.: 100705), PD1-PE (BioLegend, número de cat.: 12-9981-82), CD31-FITC (PD Biosciences, número de cat.: 553372), PDL1-PE (Invitrogen, número de cat.: 12-5982-82), antígeno T (TAG, produção interna), anti-coelho Alexa Fluor 647 (anticorpo secundário para TAG, Abcam, número de cat: ab150075) e contrastado com DAPI (Roche número de cat.: 10236276001). Os cortes foram fotografados em um microscópio Leica DM5500 e um scanner de lâmina Olympus VS120. As imagens foram processadas com Adobe Photoshop e software QuPath

[199] Ensaio de droga Pré-clínico em camundongos Rip-Tag5. Para incluir camundongos Rip-Tag5 no ensaio, os camundongos com 22 semanas de idade exibindo níveis de glicose sanguínea abaixo de 7 mmol/L foram selecionados para a presença de tumores de ilhota PanNET por imagem de ultrassom usando um sistema Vevo2100 com um transdutor MS550D de 40 MHz (Visual Sonic). Os camundongos Rip-Tag5 foram atribuídos aleatoriamente aos diferentes grupos de tratamento com base na carga tumoral cumulativa. A carga tumoral média inicial foi de 28 mm2 , a idade inicial média de 25 semanas e o nível de glicose inicial médio foi de 5,8 mmol/L para os estudos de eficácia de longo prazo. Os tumores foram monitorados por ultrassom a cada duas semanas ou a cada quatro semanas para respondedores completos por no máximo 16 semanas. Os níveis de glicose no sangue foram monitorados semanalmente usando um glicosímetro Accu-Chek (Roche). Os critérios para o desfecho foram definidos pela carga tumoral, hipoglicemia (glicose no sangue igual ou inferior a 3 mmol/L), estado geral de saúde e perda de peso corporal (mais de 15%).

RESULTADOS

[200] Para avaliar o impacto da molécula biespecífica PD1-IL2v no direcionamento de células T CD8+ , camundongos Rip-Tag5 portadores de tumor foram tratados com PD1-IL2v por 14 dias. A expansão das células T CD8+ totais e células T CD8+ reativas contra o antígeno tumoral TAG no baço foi determinada por citometria de fluxo e comparada aos tratamentos com agente único anti-PD1, DP47-IL2v, anti-PDL1 e ao tratamento combinado antiPD1 + DP47-IL2v. Para anti-PD1 foram usadas duas concentrações; a antiPD1-baixa é equimolar a PD1 na molécula biespecífica e a dose anti-PD1-alta é a dose terapêutica usada para este medicamento. O tratamento de DP47- IL2v sozinho ou combinado com anti-PD1 resultou em um aumento de 3 a 4 vezes no total de células T CD8+ em comparação com camundongos controle não tratados (Fig. 2A). Da mesma forma, o tratamento com PD1-IL2v levou a uma expansão de 2,5 vezes do total de células T CD8+ no baço de camundongos Rip-Tag5 (Fig. 2A). Embora DP47-IL2v aumentou potentemente a população total de células T CD8+ , as células T CD8 + TAG-específicas foram expandidas apenas após o tratamento com PD1-IL2v, quando a molécula de IL2v foi ligada à porção PD1. A geração aumentada de células T CD8+ específicas para o antígeno tumoral após o tratamento com PD1-IL2v se traduziu em uma infiltração aumentada de células T CD8+ no local do tumor, enquanto os tratamentos de anti-PD1 combinado com DP47-IL2v aumentaram modestamente o nível de células T CD8+ intratumoral (Fig. 2C). O termo “antiPD”, conforme usado, por exemplo, em anti-PD-L1 ou anti-PD1, é abreviado como “aPD” na Fig. 2A-C, Fig. 3D e Fig. 4A-B.

[201] Para avaliar a eficácia de PD1-IL2v em um ambiente terapêutico, camundongos Rip-Tag5 foram tratados com PD1-IL2v por oito semanas. Os camundongos Rip-Tag5 foram incluídos em ensaios baseados no tamanho do tumor determinado por ultrassom e o crescimento do tumor foi monitorado durante um período de 12 semanas. A carga tumoral inicial cumulativa variou de 20 a 40 mm2 . Os tumores neuroendócrinos pancreáticos (PanNET) que se desenvolvem em camundongos RipTag5 cresceram a uma taxa de tempo de duplicação de quatro semanas em camundongos não tratados (Fig. 3A). O tratamento de PD1-IL2v levou à redução do tamanho tumoral em todos os camundongos. Após uma diminuição inicial nas primeiras quatro semanas de tratamento, 50% dos camundongos adquiriram resistência a PD1-IL2v e os tumores progrediram (Fig. 3B).

[202] Para investigar os mecanismos de resistência adquirida à terapia PD1-IL2v, os tumores resistentes à PD-IL2v foram analisados. As análises desses tumores recidivantes revelaram uma regulação positiva de PDL1, em particular na vasculatura tumoral positiva para CD31 (Fig. 3C). Tumores PanNET não tratados foram corados negativamente para PDL1, indicando que a regulação positiva observada de PDL1 após PD1-IL2v poderia ser um mecanismo de resistência (Fig. 3C). Nossa hipótese é que a combinação de PD1-IL2v com anti-PDL1 poderia resultar em um benefício terapêutico aditivo, prevenindo a recidiva do tumor. Embora a monoterapia antiPDL1 em camundongos Rip-Tag5 portadores de tumor não resultou na regressão do tumor (Fig. 3D), uma terapia anti-PDL1 combinada com PD1-IL2v melhorou substancialmente a monoterapia PD1-IL2v. Ao longo do intervalo de tempo observado de 12 semanas, todos os camundongos tratados com PD1- IL2v combinado com anti- PDL1 mostraram regressão tumoral sem desenvolvimento de resistência à terapia combinada (Fig. 3E). A análise das curvas de crescimento do tumor revelou que, em comparação com PD1-IL2v, a terapia combinada resultou em uma taxa de regressão tumoral aumentada nas primeiras duas semanas de tratamento, indicando que o bloqueio de PDL1 em um ponto de tempo precoce pode ser necessário para melhorar a monoterapia de PD1-IL2v. Coletivamente, os dados revelaram que a combinação de PD1- IL2v com um anti- PDL1 aumenta a eficácia terapêutica de PD1-IL2v e evita a recidiva do tumor em um modelo de camundongo PanNET.

[203] Os camundongos Rip-Tag5 portadores de tumores foram submetidos ao tratamento medicamentoso combinado de PD1-IL2v e anti-PDL1, e a progressão do tumor foi monitorada por exames de imagem por ultrassom durante 16 semanas. A Fig. 4A apresenta a taxa de resposta representada como gráfico de sobrevida. Dois camundongos no PD-IL2v e um camundongo no grupo de tratamento PD1-IL2v + anti-PD-L1 desenvolveram hiperglicemia grave devido à resposta completa e tiveram que ser sacrificados. Esses camundongos ainda foram considerados respondedores completos no gráfico. A Figura 4B mostra imagens de ultrassom representativas de tumores após 0 e 2 semanas de tratamento anti-PD-L1 e PD1-IL2v + anti-PD-L1, incluindo um respondedor completo após tratamento com PD1-IL2v combinado com anti-PD-L1.

Claims (16)

1. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano para uso como uma terapia combinada no tratamento do câncer, para uso como uma terapia combinada na prevenção ou tratamento de metástases, para uso como uma terapia combinada para estimular uma função ou resposta imune, tal como atividade de células T; em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender;

   • a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou
   • b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou
   • c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou
   • d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14,

   e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada que compreende;

   • a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15, e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16, ou
   • b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19, e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20.
2. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga a PD-L1 humano de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser para uso no tratamento do câncer.
3. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com anticorpo que se liga a PD-L1 humano de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser usada no tratamento do câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de ovário, melanoma, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de cabeça e do pescoço, câncer colorretal, melanoma, câncer pancreático, carcinoma gástrico, câncer de esôfago, mesotelioma, câncer de próstata, leucemia, linfomas e mielomas.
4. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga a PD-L1 humano de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser usada na prevenção ou tratamento de metástases.
5. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga a PD-L1 humano de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser para uso no tratamento ou retardamento da progressão de uma doença imunorrelacionada, tal como imunidade tumoral.
6. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga a PD-L1 humano de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser para uso na estimulação de uma função ou resposta imune, tal como atividade de células T.
7. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, caracterizada por ser para o uso:

   • i) na inibição do crescimento tumoral; e/ou
   • ii) no aumento da sobrevida mediana e/ou geral de pacientes com um tumor;

   
   em que PD-1 é apresentado sobre células imunes, particularmente células T, ou em ambiente de células tumorais; em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada que compreende;

   • a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 5 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 6, e a sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 2, ou
   • b) uma sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9, ou
   • c) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, ou
   • d) as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14,

   
   e o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano utilizado na terapia combinada que compreende;

   • a) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15, e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16, ou
   • b) um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 19, e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 20.
8. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada que compreende um domínio variável de cadeia pesada VH de SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve VL de SEQ ID NO: 16.
9. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a imunocitocina com IL-2 variante direcionada à PD-1 usada na terapia combinada é caracterizada por compreender as sequências polipeptídicas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9, e em que o anticorpo que se liga ao PD-L1 humano usado na terapia combinada é Atezolizumabe.
10. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo componente anticorpo da imunocitocina e o anticorpo serem da subclasse IgG1 humana ou da subclasse IgG4 humana.
11. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à DP-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelos referidos anticorpos possuírem função efetora reduzida ou mínima
12. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga a PD-L1 humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela função efetora mínima resultar de uma mutação de Fc sem função efetora.
13. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga a PD-L1 humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela mutação de Fc sem função efetora ser L234A/L235A ou L234A/L235A/P329G ou N297A ou D265A/N297A.
14. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à DP-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo paciente ser tratado ou ter sido pré-tratado com imunoterapia.
15. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela referida imunoterapia compreender a transferência de células adotivas, a administração de anticorpos monoclonais, a administração de citocinas, a administração de uma vacina contra o câncer, terapias de engajamento de células T ou qualquer combinação das mesmas.
16. IMUNOCITOCINA com IL-2 variante direcionada à PD-1 em combinação com um anticorpo que se liga ao PD-L1 humano, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela transferência de células adotivas compreender a administração de células T que expressam receptor de antígeno quimérico (células T CAR), células T modificadas com receptor de célula T (TCR), linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), células natural killer modificadas com receptor de antígeno quimérico (CAR), células transduzidas com receptor de células T (TCR) ou células dendríticas ou qualquer combinação das mesmas

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