KR20240024241A

KR20240024241A - 인터루킨 15 변이체

Info

Publication number: KR20240024241A
Application number: KR1020247002540A
Authority: KR
Inventors: 기 루크 미셸 드 마르티노프; 이레나 애드킨스; 울리히 뫼비우스; 다비드 베샤르; 에바 네드베도바; 주자나 안토소바; 사르카 페추코바; 렌카 키리흐 사딜코바; 로저 렌조 빌리; 루카스 바머르트; 로렌츠 발트마이어; 이바 발렌토바; 시모나 호스코바
Original assignee: 싸이튠 파마; 소티오 바이오테크 에이.에스.
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2024-02-23
Also published as: WO2022268991A1; JP2024526080A; CA3220418A1; CN117597355A; MX2023015400A; AU2022299404A1; EP4359429A1; AU2022299404A9; IL309522A; BR112023027305A2

Abstract

본 발명은 균질성을 향상시키기 위해 아미노산 치환을 포함하는 인터루킨 15(IL-15) 변이체 및 이의 IL-15 변이체를 포함하는 접합체 및 융합 단백질을 제공한다. 또한, 이러한 IL-15 변이체의 발현을 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포뿐만 아니라 이러한 IL-15 변이체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

Description

인터루킨 15 변이체

본 발명은 균질성을 향상시키기 위해 아미노산 치환을 포함하는 인터루킨 15 (IL-15) 변이체 및 이의 IL-15 변이체를 포함하는 접합체 및 융합 단백질을 제공한다. 또한, 이러한 IL-15 변이체의 발현을 위한 핵산, 벡터 및 숙주 세포뿐만 아니라 이러한 IL-15 변이체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

인터루킨 15 (Interleukin 15, IL-15)는 자연적으로 발생하는 사이토카인 (cytokine)으로 세포 독성 림프구와 기억 표현형 CD8⁺ T 세포의 생성을 유도하고 자연 살해 (Natural Killer, NK) 세포의 증식과 유지를 자극하지만, 인터루킨 2와 달리 활성화에 의한 세포 사멸을 매개하지 않고, 지속적으로 트레그 (Tregs)를 활성화하지 않으며 모세혈관 누출 증후군을 덜 유발한다 (Waldmann 외. 2020).

특히 암치료에서 IL-15 및 증가하는 수의 IL-15 유사체/초작용제 (analogs/superagonists)의 효과와 한계를 입증하는 광범위한 전임상 및 임상 연구가 수행되었으며, 이에 대해 Robinson과 Schluns가 검토하였다 (Robinson and Schluns 2017).

인터루킨 2 (IL-2)와 마찬가지로, IL-15는 α, β 및 γ 서브 유닛을 가진 이종 삼중 수용체 (heterotrimeric receptors)를 통해 작용하는 반면에 IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-21과도 공유되는 공통 감마 사슬 수용체 (γ_c 또는 γ)와 IL-2/IL-15Rβ (IL-2Rβ, CD122로도 알려져 있음)를 공유한다. 세 번째 서브유닛으로, 이종삼중 수용체 (heterotrimeric receptors)는 IL-2 또는 IL-15에 대한 특정 서브유닛, 즉 IL-2Rα(CD25) 또는 IL-15Rα(CD215)를 포함한다. 다운스트림 (downstream)에 있는 IL-2와 IL-15 이종삼중 수용체는 세포 내 신호 전달을 위해 JAK1 (야누스 키나아제 1), JAK 3, 및 STAT3/5 (신호 전달자 및 전사 3 및 5의 활성화제) 분자를 공유하여 유사한 기능을 수행하지만 두 사이토카인은 Waldmann (2015, 표 1 참조) 및 Conlon (2019)이 검토한 것처럼 서로 다른 역할을 수행한다.

따라서, IL-2, IL-15 또는 이의 유도체의 결합에 의한 서로 다른 이종삼중 수용체의 활성화는 잠재적으로 면역 체계의 특정 조절 및 잠재적 부작용을 초래할 수 있다. 최근에는 IL-15 또는 IL-15 변이체를 포함하는 새로운 화합물이 NK 세포와 CD8⁺ T 세포의 활성화를 구체적으로 표적으로 하는 것을 목표로 설계되었다. 이러한 화합물은 중간 친화력 IL-2/IL-15Rβγ, 즉 IL-2/IL-15Rβ와 γ_c 서브유닛으로 구성된 수용체를 표적으로 하는 화합물로, NK 세포, CD8⁺ T 세포, NKT 세포 및 γδ T 세포에서 발현된다. 이는 IL-15 전달을 통한 안전하고 강력한 면역 자극을 위해 매우 중요한데, 설계된 화합물인 SO-C101(RLI-15), ALT-803 및 hetIL-15는 이미 IL-15Rα 서브유닛을 포함하고 있어 항원 제시 세포에 의한 α 서브유닛의 전달을 모사할 수 있다. SO-C101은 IL-15Rα의 공유 결합된 스시+ 도메인을 구성하기 때문에 중간 친화도 IL-15Rβγ에만 결합한다. 결과적으로 SO-C101은 IL-15Rα나 IL-2Rα에는 결합하지 않는다. 마찬가지로, ALT-803과 hetIL-15는 각각 IL-15Rα 스시 도메인 (sushi domain) 또는 용해성 IL-15Rα (soluble IL-15Rα)를 가지고 있으므로 중간 친화력 (mid-affinity) IL-15Rβγ 수용체에 결합한다. 따라서 IL-15 및 IL-15 유사체/초작용제 (analogs/superagonists)는 암 및 감염성 질환 치료를 위한 임상 단계의 유망한 개발 후보 물질이다.

그러나, IL-15와 IL-15 초작용제는 발현 (expression), 정제 (purification), 보관 (storage) 및 전달 (delivery) 과정에서 이질성 (heterogeneities)이 축적되어 약효에 악영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 이질성의 예로는 다양한 수준의 글리코실화 (glycosylation), 아스파라긴 또는 글루타민의 탈아미드화 (deamidation of asparagines or glutamines) 또는 히스티딘 (histidines), 메티오닌 (methionines), 시스테인 (cysteines), 트립토판 (tryptophans) 또는 티로신 (tyrosines)의 산화, 아미드 질소기가 산소와 교환되어 극성 아미드가 음전하를 띤 카르복실산으로 변하는 경우 등이 있다. 이러한 변화는 의약품의 이질성을 유발하고 면역원성 증가, 즉 약물의 약효를 제한하는 항약물 항체 생성의 위험을 안고 있다. 따라서 이질성을 줄이면서도 본질적으로 활성을 유지하고 유사한 수준으로 발현되는 IL-15 및 IL-15 초강력 항체의 변형을 제공해야 할 필요성이 지속적으로 제기되고 있다.

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놀랍게도 발명자들은 아스파라긴 77 (Asparagine 77, N77)의 탈아미드화 및 IL-15의 글리코실화를 상당히 감소시키는 아미노산 치환의 특정 조합을 가진 IL-15 변이체를 확인하였다. 놀랍게도 IL-15 변이체는 인터루킨 15 수용체 알파와의 융합 단백질에서 성숙한 인간 IL-15에 비해 활성이 비슷하고 발현 수준이 비슷하며 생체 내 반감기가 더 길다는 사실이 밝혀졌다.

글리코실화 패턴의 감소 또는 변화는 시험관 내 및 생체 내 단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있으며, 단백질의 글리코실화는 일반적으로 생체 내 반감기를 증가시키고 단백질의 물리적 불안정성을 방지하는 것 (Sola and Grienebow 2009)으로 알려져 있지만, 놀랍게도 발명자들은 G78과 N79의 결합 치환이 예상치 못한 여러 가지 이점을 가져온다는 것을 발견하였다. 구체적으로, 이 두 부위를 돌연변이하면 탈아미드화가 감소하고 글리코실화가 감소하며 IL-15 변이체의 균질성 (homogeneity)이 증가한다. 동시에, 이러한 아미노산 잔기를 치환해도 IL-15 활성의 효능에는 영향을 미치지 않고 탈아미드화 이외의 다른 안정성 매개변수에도 영향을 미치지 않으며, 심지어 인터루킨 15 수용체 α와 융합 단백질의 생체 내 반감기가 성숙한 IL-15에 비해 증가한다. 특히나 후자가 유리하다. IL-15 또는 IL-15/IL-15Rα 초작용제의 생체 내 반감기를 늘리는 것은 일반적으로 반감기가 매우 짧기 때문에 유익한 것으로 간주되며, 연구자들은 생체 내 반감기를 늘리기 위해 다양한 원리를 사용하였으며, 예를 들어, 용해성 IL-15Rα와 복합체를 형성하거나 (WO2007/001677), IL-15/IL-15Rα 스시 접합체를 Fc 단편에 결합하거나 (WO 2008/143794A1), 또는 페길레이트 IL-15 (WO 2015/153753a2)와 결합하는 등의 방법을 사용하였다. 또한, 발명가들은 이러한 결합 치환이 제조 과정에서 IL-15의 안정성을 증가시키는 반면 야생형 IL-15는 이러한 조건에서 분해된다는 사실을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 특히 IL-15 변이체 및 이러한 IL-15 변이체를 포함하는 접합체 (conjugate)를 제공한다. 이러한 변이체 및 접합체는 새로운 종양 적응증 및 환자 그룹의 치료에 사용될 수 있다.

정의 (Definitions), 약어 (abbreviations) 및 두문자어 (acronyms)

"인터루킨-15 (Interleukin-15)", "IL-15" 또는 "IL15"는 NCBI 참조서열 NP_000576.1 또는 UniProt ID P40933 (서열번호 1)에 기술된 인간 사이토카인을 의미한다. 인터루킨-15의 전구체 단백질은 162개의 아미노산을 가지고, 이는 긴 48-aa 펩타이드 리더 (peptide leader)를 가지고 114-aa 성숙 단백질 (서열번호 2)로 귀결되고, 여기서 성숙은 48개 아미노산의 신호 펩타이드 (서열번호 1)가 누락된 IL-15 단백질을 의미한다. mRNA의 전체 코딩 서열은 NCBI GenBank Reference U14407.1에 설명되어 있다.

“IL-15 변이체” 또는 “IL-15 변이체”는 성숙한 인간 IL-15의 아미노산 서열 (114 aa)(서열번호 2)과 적어도 92 %, 바람직하게는 적어도 96 %, 더욱 바람직하게는 적어도 98 %, 가장 바람직하게는 적어도 99 %의 동일성 비율을 갖는 단백질을 의미한다. 바람직하게는, IL-15 변이체는 IL-15 활성의 적어도 10 %, 더욱 바람직하게는 적어도 25 %, 더욱더 바람직하게는 적어도 50 %, 그리고 가장 바람직하게는 80 %를 갖는다. 더욱 바람직하게는, IL-15 변이체는 인간 IL-15 활성의 적어도 0.1 %, 바람직하게는 1 %, 더욱 바람직하게는 적어도 10 %, 더욱 바람직하게는 적어도 25 %, 더욱 바람직하게는 적어도 50 %, 및 가장 바람직하게는 적어도 80 %를 갖는다. 인터루킨은 매우 낮은 농도에서도 작용하는 매우 강력한 분자로, 특히 더 많은 양을 투여하거나 반감기를 연장하여 활성 손실을 보완하면 인간 IL-15의 0.1 %와 같은 낮은 활성도에서도 충분히 강력한 효과를 발휘할 수 있다.

Hori 등 (1987)이 기술한 바와 같이 IL-15의 활성은 kit225 세포의 증식 유도에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 비색법 또는 형광과 같은 방법을 사용하여 IL-2 또는 IL-15 자극으로 인한 증식 활성화를 확인하는데, 예를 들어 Soman 등이 CTLL-2 세포를 사용하여 설명한 것처럼 (Soman et al. 2009) IL-2 또는 IL-15 자극으로 인한 증식 활성화를 확인한다. 키트 225 세포와 같은 세포주 대신 인간 말초혈액 단핵세포 (PBMC, human peripheral blood mononuclear cells) 또는 버피코트 (buffy coats)를 사용할 수 있다. IL-15의 활성을 측정하기 위해 선호되는 바이오 분석법은 STAT5-RE CTLL-2 세포를 사용하는 IL-2/IL-15 바이오 분석 키트 (Promega 카탈로그 번호 CS2018B03/B07/B05)이다.

IL-15 뮤테인 (IL-15 muteins)은 표준 유전공학 방법으로 생성될 수 있으며, 당업자에게는 WO 2005/085282, US 2006/0057680, WO 2008/143794, WO 2009/135031, WO 2014/207173, WO 2016/142314, WO 2016/060996, WO 2017/046200, WO 2018/071918, WO 2018/071919, US 2018/0118805 등이 잘 알려져있다. IL-15 변이체는 당업자에게 공지된 화학적 변형, 예를 들어 페길화 (PEGylation) 또는 기타 번역 후 변형 (other posttranslational modifications) (WO 2017/112528A2, WO 2009/135031A1를 참고)에 의해 추가로 생성될 수 있다.

"IL-15Rα"는 인간 IL-15 수용체 α 또는 CD215를 의미하며, NCBI 참조 서열 AAI21142.1 또는 UniProt ID Q13261 (서열번호 4)에 설명되어 있다. 전구체 단백질 (precursor protein)은 267개의 아미노산을 가지고, 이는 30-aa 펩타이드 리더를 가지고 231-aa 성숙한 단백질로 귀결된다. 이 단백질의 mRNA는 NCBI GenBank Reference HQ401283.1에 설명되어 있다. IL-15Rα 스시 도메인 (또는 IL-15Rα_sushi, 서열번호 5)은 IL-15에 결합하는데 필수적인 IL-15Rα의 도메인이다 (Wei et al. 2001). 스시 도메인 및 힌지 영역의 일부를 포함하는 스시 + 단편 (서열번호 6)은 IL-15Rα의 스시 도메인 다음에 위치하는 14개의 아미노산으로 정의되며, 스시 도메인에 비해 C-말단 위치에 있으며, 즉, 상기 IL-15Rα 힌지 영역은 상기 (C4) 시스테인 잔류물 뒤의 첫 번째 아미노산에서 시작하여 14번째 아미노산에서 끝난다 (표준적인 계산은 “N-말단에서 C-말단으로” 방향임). 스시 + 단편은 IL-15에 대한 완전한 결합 활성을 재구성한다 (WO 2007/046006).

“IL-15Rα 유도체”는 인간 IL-15Rα의 스시 도메인의 아미노산 서열 (서열번호 5) 및, 바람직하게는 인간 IL-15 Rα의 스시 + 도메인 (서열번호 6)의 아미노산 서열과 적어도 92 %, 바람직하게는 적어도 96 %, 더욱 바람직하게는 98 %, 및 가장 바람직하게는 100 % 동일한 동일성 비율을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 바람직하게는, IL-15Rα 유도체는 N- 및 C- 말단이 절단된 폴리펩타이드이며, 반면 신호 펩타이드 (서열번호 4의 아미노산 1 내지 30)가 결실되고, IL-15Rα의 막 통과 도메인 및 세포질 내 부분 (서열번호 210 내지 267)이 결실되는 폴리펩타이드이다. 따라서, 바람직한 IL-15Rα 유도체는 적어도 스시 도메인 (아미노산 33 내지 93)을 포함하지만, 성숙한 IL-15Rα의 세포 외 부분인 서열번호 4의 아미노산 31 내지 209를 넘어 확장되지는 않는다. 특정 바람직한 IL-15Rα 유도체는 IL-15Rα의 스시 도메인 (서열번호 5), IL-15Rα의 스시+ 도메인 (서열번호 6) 및 IL-15Rα의 가용성 형태 (아미노산 31에서 아미노산 172, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 또는 205 중 하나에 이르는 서열번호 4의 아미노산, WO 2014/066527, (Giron-Michel 외 2005) 참조)가 있다. 본 정의에서 제공하는 범위 내에서, IL-15Rα 유도체는 자연적으로 발생하거나 도입된 돌연변이를 포함할 수 있다. 자연적 변이 및 대체 서열은 예를 들어 UniProtKB 항목 Q13261(https://www.uniprot.org/uniprot/Q13261)에 설명되어 있다. 또한, 당업자 (artisan)는 포유류 IL-15Rα 상동체 또는 영장류 IL-15Rα 상동체 사이에서 덜 보존되어 있는 아미노산을 쉽게 식별하여 여전히 기능을 하는 유도체를 생성할 수 있다. 포유류 IL-15Rα 상동체의 각 서열은 WO 2007/046006의 18 및 19 페이지에 설명되어 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 당업자는 보존적인 아미노산 치환 (conservative amino acid substitutions)을 쉽게 할 수 있다.

바람직하게는, IL-15Rα 유도체는 예를 들어, Wei 등 (2001)에서 결정된 바와 같이, 인간 스시 도메인의 인간 IL-15에 대한 결합 활성의 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 25 %, 더욱더 바람직하게는 적어도 50 %, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 80 %를 갖는다.

"IL-2Rγ"는 일반적인 사이토카인 수용체 γ 또는 γ_c 또는 CD132를 말하며, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21이 공유된다.

"RLI-15" 또는 "RLI"는 인간 IL-15Rα 스시+ 단편과 인간 IL-15의 수용체-링커-인터루킨 융합 단백질인 모든 IL-15/IL-15Rα 접합체를 의미한다. 적합한 링커는 WO 2007/046006 및 WO 2012/175222에 설명되어 있다.

"RLI2" 또는 "SO-C101"은 RLI-15의 특정 버전이며, 인간 IL-15Rα 스시 + 단편과 인간 IL-15 (서열번호 8)의 수용체-링커-인터루킨 융합 단백질인 IL-15/IL-15Rα 접합체를 말하며, 링커를 서열번호 7과 결합한다.

본 명세서에서 사용되는 접합체는 인터루킨 15 (IL-15) 또는 이의 유도체의 비공유 또는 공유 복합체와 인터루킨 15-수용체 알파 (IL-15Rα) 또는 이의 유도체의 스시 도메인 중 하나에 관한 것이다. 비공유 복합체는 두 폴리펩타이드의 공동 발현 (co-expression of the two polypeptides) 또는 분리 발현 (separate expression), (부분) 정제 ((partial) purification) 및 후속 조합 (subsequent combination)에 의해 형성될 수 있으며, 이러한 폴리펩타이드의 친화성으로 인해 이러한 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 접합체는 융합 폴리펩타이드 또는 단백질로서, 적어도 두 개의 폴리펩타이드가 유전적으로 융합되고 재조합적으로 발현되어 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성하여 온전한 복합체 (intact complex)를 형성한다.

본 발명에 따르면, 융합 폴리펩타이드 또는 단백질은 다른 폴리펩타이드 사슬에 비공유적으로 또는 바람직하게는 공유적으로 연결된 적어도 하나의 융합 폴리펩타이드와의 접합체이며, 예를 들어, IL-15 또는 이의 변이체와 융합된 항체 (이황화 결합을 통해 공유 결합된 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함)를 포함하는 면역 사이토카인, IL-15/스시 도메인 융합 단백질, 또는 각각 IL-15 변이체와 결합된 스시 도메인에 융합된 2개의 CH2/CH3를 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 각각 갖는 항체의 Fc 도메인, 또는 하나의 CH2/CH3를 포함하는 폴리펩타이드가 스시 도메인에 융합되고 다른 하나는 IL-15에 융합되는 면역 사이토카인을 포함한다.

본 발명에 있어서, 면역 사이토카인 (immunocytokine)은 본 발명에 따른 접합체에 유전적으로 융합된 항체 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 말한다.

“ALT-803”은 알토르 바이오사이언스사 (Altor BioScience Corp.)의 IL-15/IL-15Rα 접합체를 말하며, 접합체는 최적화된 아미노산 치환 (N72D) 인간 IL-15 “초작용제” 2분자, 안정정을 부여하고 IL-15_N72D:IL-15Rα_스시-Fc 접합체의 반감기를 연장하는 이랑체 인간 IgG1 Fc에 융합된 인간 IL-15α 수용체 “스시” 도메인의 2분자를 포함하는 접합체이다 (예를 들어, US 2017/0088597을 참조하라).

'P-22339'는 헝루이 의약 (Hengrui Medicine)의 IL-15/IL-15Rα 접합체를 의미하며, 이는 Fc 단편의 N-말단에 융합된 이황화 결합을 통해 IL-15와 IL-15Rα의 스시 도메인이 2개 융합된 융합 단백질이다.

'XmAb24306'은 센코어 (Xencor)의 IL-15/IL-15Rα 접합체를 의미하며, IL-15Rα의 스시 도메인과 IL-15가 Fc 단편의 N-말단에 융합된 융합단백질이다.

'CUG105'는 IL-15Rα의 스시 도메인과 IL-15가 Fc 단편의 N-말단에 융합된 융합 단백질인 큐진 (Cugene)의 IL-15/IL-15Rα 접합체를 의미한다.

"이종이합체 IL-15:IL-Rα (Heterodimeric IL-15:IL-Rα)", "hetIL-15" 또는 "NIZ985"는 IL-15와 유사한 노바티스의 IL-15/IL-15Rα 접합체를 의미하며, 이는 수용성 IL-15Rα와 안정적인 분자 접합체로 순환하고, 이는 인간 IL-15와 수용성 인간 IL-15Rα(sIL-15Rα), 즉, 신호 펩타이드와 막 통과 및 세포질 도메인이 없는 IL-15Rα의 170개 아미노산 (Thaysen-Andersen et al. 2016, see e.g. table 1)의 재조합적으로 공동 발현된 비공유 접합체이다.

“IL-2/IL-15Rβγ 작용제”는 IL-2Rα 및/또는 IL-15Rα 수용체와 결합하지 않고 주로 중간 친화성 IL-2/IL-15Rβγ 수용체를 표적으로 하는 분자 또는 접합체를 말하며, 따라서 T_regs의 자극이 부족하다. 예를 들어, 적어도 IL-15Rα의 스시 도메인에 결합된 IL-15는 트랜스 프레젠테이션이나 세포 간 상호작용에 의존하지 않고 분자의 크기가 커져 생체 내 반감기가 길다는 장점이 있으며, 시험관 내 및 생체 내에서 네이티브 IL-15보다 훨씬 더 강력한 것으로 나타났다 (Robinson and Schluns 2017). IL-15/IL-15Rα 기반 접합체 외에도, 이는 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 IL-2에 의해 달성될 수 있으며, 이는 IL-2/15Rβ 및 γc 수용체에 대한 결합에는 영향을 미치지 않으면서 IL-2α 수용체에 대한 결합을 현저하게 감소시키거나 시간적으로 지연시킨다.

"NKTR-255"는 IL-15Rα에 대한 결합 친화력을 유지하고 지속적인 약역학적 반응을 제공하기 위해 감소된 클리어런스를 나타내는 PEG-접합된 인간 IL-15를 기반으로 하는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 의미한다 (WO 2018/213341A1).

"THOR-924, -908, -918"은 부위 특이적 페길화에 사용되는 비천연 아미노산으로 IL-15Rα에 대한 결합이 감소된 PEG-접합된 IL-15를 기반으로 하는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제를 의미한다 (WO 2019/165453A1).

"AM0015"는 PEG-접합된 IL-15 뮤테인을 의미한다 (WO 2017/112528).

두 아미노산 서열 간의 “동일성 비율 (Percentage of identity)”은 비교 대상인 두 염기서열 사이에 가장 잘 정렬된 염기서열을 통해 얻은 동일한 아미노산의 비율을 의미하며, 이 비율은 순전히 통계적이며 두 염기서열 간의 차이는 아미노산 서열에 무작위로 분산되어 있다. 본 발명에 있어서, “최상의 정렬 (best alignment)” 또는 “최적의 정렬 (optimal alignment)”은 결정된 동일성 비율 (하기 참조)이 가장 높은 정렬을 의미한다. 두 아미노산 서열 간의 서열 비교는 일반적으로 최상의 정렬에 따라 이전에 정렬된 서열을 비교하는 방식으로 이루어지며, 이 비교는 유사성이 있는 국소 영역을 식별하고 비교하기 위해 비교 세그먼트에 대해 이루어진다. 비교를 수행하기 위해 최상의 서열 정렬을 실행할 수 있으며, 수동 방법 이외에도 Smith와 Waterman (1981)이 개발한 글로벌 상동 알고리즘을 사용하고, Needleman과 Wunsch (1970)가 개발한 국소 상동 알고리즘을 사용하고, Pearson과 Lipman (1988)이 개발한 유사성 방법을 사용하고, 이러한 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA in the Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA)를 사용하고, MUSCLE 다중 정렬 알고리즘 (Edgar 2004)을 사용하거나 CLUSTAL (Goujon et al. 2010)을 사용한다. 최상의 국소 정렬을 얻으려면 BLOSUM 62 매트릭스와 함께 BLAST 소프트웨어를 사용하는 것이 바람직하다. 두 아미노산 서열 간의 동일성 비율은 최적으로 정렬된 두 서열을 비교하여 결정되며, 아미노산 서열은 기준 서열에 대한 추가 또는 결실을 포함할 수 있어 두 서열 간의 최적의 정렬을 얻을 수 있다. 동일성 비율은 두 염기서열 사이의 동일한 위치 수를 결정하고 이 수를 비교한 총 위치 수로 나눈 다음, 얻은 결과에 100을 곱하여 두 염기서열 사이의 동일성 비율을 구하는 방식으로 계산한다.

“보존적인 아미노산 치환 (Conservative amino acid substitutions)”은 지방족 아미노산 (즉, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신)이 다른 지방족 아미노산으로 치환되고, 하이드록실 또는 황/셀레늄 함유 아미노산 (즉, 세린, 시스테인, 셀레노시스테인, 트레오닌, 메티오닌)이 다른 하이드록실 또는 황/셀레늄 함유 아미노산으로 치환되고, 방향족 아미노산 (즉, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판)이 다른 방향족 아미노산으로 치환되고, 염기성 아미노산 (즉, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판)이 다른 염기성 아미노산으로 치환되거나 산성 아미노산 또는 그 아미드 (아스파르트산염, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민)가 다른 산성 아미노산 또는 그 아미드로 대체되는 아미노산의 치환체를 말한다.

면역글로불린 (immunoglobulin, Ig)로도 알려진 “항체”는 인간과 대부분의 포유류에서 이황화 결합으로 연결된 두 개의 중쇄 (heavy chains, HC)와 두 개의 경쇄 (light chains, LC)로 구성된 커다란 Y자형 단백질이다. 경쇄는 하나의 가변 도메인 V_L과 하나의 상수 도메인 C_L로 구성되며, 중쇄는 하나의 가변 도메인 V_H와 3개의 상수 도메인 C_H1, C_H2, C_H3로 구성된다. 구조적으로도 항체는 두 개의 항원 결합 단편 (antigen-binding fragments, Fab)으로 나뉘며, 각각 하나의 V_L, V_H, C_L, C_H1 도메인과 두 개의 중쇄 중 두 개의 C_H2와 C_H3를 포함하는 Fc 단편 또는 도메인을 포함한다.

본 발명에 있어서, “항체 변이체 (antibody variant)” 또는 “항체 기능 변이체 (antibody functional variant)”는 예를 들어, 이펙터 기능 (effector function)을 조절하거나, 항체 Fc 도메인의 이종이합체화를 유도하는 등의 변형을 갖는 항체와 관련된다. 이러한 변이체는 돌연변이 및/또는 번역 후 변형에 의해 달성될 수 있다. 항체 변이체는 또한 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 중쇄에서 N-말단 라이신이 절단된 항체 중쇄를 포함한다. 염료, 방사성 핵종, 독소 또는 기타 결합 모이어티와 같은 다른 모이어티에 화학적 또는 효소적 결합을 위한 중쇄 및/또는 경쇄의 N- 또는 C- 말단 태그가 포함된 변형도 있다. 또한, 항체 변이체는 화학적 변형, 글리코실화의 변형 또는 다른 모이어티에 화학적 결합을 위한 인공 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 항체 변이체는 또한 잠재적으로 두 개 이상의 서로 다른 에피토프를 인식하는 면역글로불린 감마 (IgG) 기반 이중특이성 항체와 관련이 있다. 다양한 형태의 이중 특이항체가 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Godar et al. (2018) 및 Spiess et al. (2015)에서 검토된 바 있다. 본 발명에 따른 이중 특이적 포맷 (Bispecific formats)은 Fc 도메인 (Fc domain)을 포함한다. 본 발명의 면역사이토카인 (Immunocytokines)과 관련하여, 두 개의 RLI 접합체는, 모이어티 (moiety)에 달리 연결되지 않는 경우, 두 경쇄의 C-말단 또는 두 중쇄의 C-말단에 융합될 수 있거나; 대안적으로, 하나의 RLI 접합체는 이종이합체 이중 특이적 포맷의 경우 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되거나, 또는 다른 경쇄를 갖는 이종이합체 이중 특이적 포맷의 중쇄 또는 하나의 경쇄 (the heavy chain or one light chain of heterodimeric bispecific formats)에 융합될 수 있다. 항체 기능 변이체는 해당 비변형 항체와 동일한 에피토프 또는 표적에 결합할 수 있다.

“생체 내 반감기 (In vivo half-life)”, T½ 또는 말기 반감기는 제거 반감기 또는 말기 단계의 반감기를 의미하며, 투여 후 생체 내 반감기는 유사 분포 평형에 도달한 후 혈장/혈중 농도가 50% 감소하는데 필요한 시간이다 (outain and Bousquet-Melou 2004). 혈액/혈장 내 약물 (여기서는 폴리펩타이드인 IL-2/IL-15βγ 작용제)의 측정은 일반적으로 폴리펩타이드 특이적 ELISA를 통해 수행된다.

"면역 관문 억제제 (Immune check point inhibitor)" 또는 줄여서 "체크 포인트 억제제 (check point inhibitors)"는 T세포와 같은 일부 면역계 세포와 일부 암세포가 만드는 특정 단백질 (면역 관문 단백질)을 차단하는 약물의 일종을 의미한다. 이 단백질은 말초 내성을 유지하고 과도한 면역 반응을 예방하는 데 중요한 역할을 한다. 악성 질환에서 이러한 단백질은 종양 세포에 의해 활용되어 T 세포가 암세포를 죽이는 것을 방지한다. 이러한 단백질이 체크 포인트 억제제에 의해 차단되면 면역 체계의 "브레이크"가 풀리고 T 세포가 다시 암세포를 죽일 수 있게 된다. 따라서 체크포인트 억제제는 면역 억제 체크포인트 분자의 작용제이거나 억제 체크포인트 분자의 작용적 리간드의 작용제이다. T세포 또는 암세포에서 발견되는 체크포인트 단백질의 예로는 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2 (미국 국립보건원 국립암연구소의 정의, https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-terms/def/immune-checkpoint-inhibitor 참조)가 있으며, 예를 들어 Darvin 외(2018)에서 검토한 바 있다. 체크 포인트 억제제의 일 예로는 항 PD-L1 항체, 항 PD-1 항체, 항 CTLA-4 항체뿐만 아니라 LAG-3 또는 TIM-3에 대한 항체 또는 현재 클리닉에서 테스트 중인 BTLA 차단제가 있다 (De Sousa Linhares et al. 2018). 또 다른 유망한 체크포인트 억제제는 항-TIGIT 항체이다 (Solomon and Garrido-Laguna 2018).

"항 PD-L1 항체 (anti-PD-L1 antibody)"는 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그 항체 단편을 의미한다. 일 예로는 아벨루맙 (avelumab), 아테졸리주맙 (atezolizumab), 더발루맙 (durvalumab), KN035, MGD013 (PD-1 및 LAG-3에 대한 이중 특이성) 등이 있다.

"항 PD-1 항체 (anti-PD-1 antibody)"는 PD-1에 결합하는 항체 또는 그 항체 단편을 의미한다. 일 예로는 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 세미플리맙 (cemiplimab)(REGN2810), BMS-936558, SHR1210, IBI308, PDR001, BGB-A317, BCD-100 및 JS001 등이 있다.

"항-PD-L2 항체 (anti-PD-L2 antibody)"는 항-PD-L2에 결합하는 항체 또는 그 항체 조각을 의미한다. 일 예로는 sHIgM12가 있다.

"항-CTLA4 항체"는 CTLA-4에 결합하는 항체 또는 그 항체 조각을 의미한다. 일 예로는 이필리무맙 (ipilimumab)과 트레멜리무맙 (tremelimumab)(티실리무맙(ticilimumab))이 있다.

"항-LAG-3" 항체는 LAG-3에 결합하는 항체 또는 그 항체 단편을 의미한다. 항-LAG-3 항체의 일 예로는 릴래틀리맙 (relatlimab)(BMS 986016), Sym022, REGN3767, TSR-033, GSK2831781, MGD013 (PD-1 및 LAG-3에 대한 이중 특이성) 및 LAG525(IMP701) 등이 있다.

"항-TIM-3 항체"는 TIM-3에 결합하는 항체 또는 그 항체 단편을 의미한다. 일 예로는 TSR-022 및 Sym023이 있다.

"항-TIGIT 항체"는 TIGIT에 결합하는 항체 또는 그 항체 단편을 의미한다. 일 예로는 티라골루맙 (MTIG7192A, RG6058) 및 에티길리맙 (WO 2018/102536)이 있다.

"치료용 항체" 또는 "종양 표적 항체"는 치료용 종양 세포의 표면에 발현된 표적에 항체가 결합하여 종양 세포에 직접적인 치료 효과를 갖는 항체 또는 그 항체 단편을 의미한다. 이러한 치료 활성은 세포의 변형된 신호 전달, 직접적인 세포 사멸 유도, 항체 의존성 세포 독성 (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC), 보체 의존성 세포 독성 (Complement-Dependent Cytotoxicity, CDC) 또는 기타 항체 매개 종양 세포 사멸로 이어지는 수용체 결합에 기인할 수 있다.

"항-CD38 항체"는 고리형 ADP 리보스 가수분해효소라고도 알려진 CD38에 결합하는 항체 또는 그 항체 조각을 의미한다. 항-CD38 항체의 예로는 다라투무맙 (daratumumab), 이사툭시맙 (isatuximab)(SAR650984), MOR-202 (MOR03087), TAK-573 또는 TAK-079(Abramson 2018) 또는 GEN1029 (HexaBody®-DR5/DR5)가 있다.

"병용 투여 (administered in combination)"라고 명시된 경우, 이는 일반적으로 두 약제의 공동 조제 및 공동 투여를 의미하는 것이 아니라 한 약제가 다른 약제와 함께 사용하도록 명시된 라벨이 부착되어 있다는 의미이다. 그래서 예를 들면, IL-2/IL-15Rβγ 작용제는 암의 치료 또는 관리에 사용하기 위한 것으로서, 그 사용은 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 추가 치료제를 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여하거나 그 반대로 투여하는 것을 포함한다. 그러나 본 발명의 어떤 내용도 번들 (bundle) 또는 키트 (kit)로 제공되거나 투약 스케줄이 일치하는 경우 함께 조제 및 투여되는 두 가지 복합제를 배제해서는 안 된다. 따라서, "병용 투여"에는 (i) 약물을 공동 주입, 공동 주사 또는 이와 유사한 방식으로 함께 투여하는 경우, (ii) 약물을 개별적으로 투여하되 각 약물의 주어진 투여 방법에 따라 병용으로 투여하는 경우, (iii) 약물을 개별적으로 순차적으로 투여하는 경우가 포함된다. 이러한 맥락에서 병용 투여는 두 치료가 함께 시작되는 것이 바람직하며, 예를 들어 치료 요법 내에서 각 약물의 첫 번째 투여가 같은 날에 투여되는 것을 의미한다. 잠재적으로 다른 치료 일정을 고려할 때 다음 날/주/월에 걸쳐 투여가 항상 같은 날에 이루어지지 않을 수도 있다. 일반적으로 병용 투여는 각 치료 주기가 시작될 때 두 약물이 동시에 체내에 존재하는 것을 목표로 한다.

이러한 맥락에서 순차적 투여 (Sequential administration)는 두 치료가 순자적으로 시작되는 것이 바람직하며, 예를 들면 두 번째 약물이 활성화되기 전에 첫 번째 약물에 대한 신체의 약역학적 반응을 허용하기 위해 첫 번째 약물의 첫 번째 투여는 두 번째 약물의 첫 번째 투여보다 적어도 하루, 바람직하게는 며칠 또는 1주일 전에 시작된다. 그런 다음 치료 일정은 서로 겹치거나 간헐적으로 또는 바로 이어서 진행할 수 있다.

용어 “체크포인트 억제제 치료에 내성이 생긴 환자 (resistant to checkpoint inhibitor treatment)”는 체크포인트 억제제 투여 시 치료반응을 보이지 않는 환자를 의미한다.

용어 “체크포인트 억제제 치료에 불응성 (refractory to checkpoint inhibitor treatment)”은 처음에 체크포인트 억제제 치료에 치료 반응을 보였으나 시간이 지나도 치료 반응이 유지되지 않는 환자를 의미한다.

용어 “약”이라는 용어는 값과 함께 사용될 때 해당 값의 10 %, 가급적 5 %, 특히 1 %를 더하거나 뺀 값을 의미한다.

본 명세서 및 청구범위에서 "포함하는 (comprising)"이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적상, "구성하는 (consisting of)"이라는 용어는 "포함하는"이라는 용어의 바람직한 일 양태로 간주된다. 이하에서 그룹이 적어도 특정 수의 일 양태를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이는 또한 그룹을 개시하는 것으로 이해되어야 하며, 바람직하게는 이러한 일 양태들로만 구성된 그룹을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.

단수 명사를 지칭할 때 부정관사 또는 정관사를 사용하는 경우 (예를 들어” "a", "an" 또는 "the"), 특별히 다른 내용이 명시되지 않는 한 해당 명사의 복수형도 포함된다.

따라서 용어 “적어도 하나의 화학 요법제”와 같은 “적어도 하나”라는 것은 하나 이상의 화학요법제를 의미할 수 있다. 같은 맥락에서 용어 “이들의 조합 (combinations thereof)”은 둘 이상의 화학요법제를 포함하는 조합을 의미한다.

기술 용어는 상식적인 의미로 사용된다. 특정 용어에 특정한 의미가 전달되는 경우 해당 용어가 사용되는 문맥에서 용어의 정의는 다음과 같이 제공된다.

"qxw", 라틴어 쿼크/각각에서 유래, 매 x주마다마다 (예를 들어, 매 2번째 주마다 q2w).

"s.c." 또는 "SC"는 피하 주사.

"i.v." 또는 "IV"는 정맥 주사.

"i.p." 또는 "IP"는 복강 주사.

C_max는 최대 농도

AUC는 곡선 아래 면적

표 1: 분자 목록

본 발명의 설명

일 측면에 있어서, 본 발명은 성숙한 인간 IL-15 (interleukin-15)(서열번호 2)의 G78 위치 및 N79 위치에서 아미노산 치환 (amino acid substitutions)을 포함하는 인터루킨-15 (IL-15) 변이체 (variant)에 관한 것이다. 바람직하게는, 치환되는 아미노산은 자연적으로 발생하는 아미노산이다.

본 발명자들은 특히 G87 및 N79 부위를 치환하여 균질성이 높고 글리코실화가 감소되면서 반면 IL-15 변이체의 효능과 안정성은 영향을 받지 않는 IL-15 변이체를 성공적으로 생산하였다. 글리코실화는 단백질의 미세 이질성 (글리코폼 (glycoforms))의 주요 원인이며, 글리코폼은 분자 및 세포 수준에서 복잡성을 반영하기 때문에 이는 놀라운 결과이다. 단백질 접힘 (protein folding), 운반 (trafficking), 포장 (packing), 안정화 (stabilization), 프로테아제 보호 (protease protection), 4차 구조 또는 물 구조의 조직과 같은 글리코실화의 많은 잠재적 기능이 있다. 예를 들어, 당 모티프의 변화는 암이나 류마티스 관절염과 같은 생리적 변화를 반영하거나 초래할 수 있다. 따라서 특히 의약품으로 응용하는 경우, 당업자는 치료용 단백질의 글리코실화를 수정하는 것을 주저한다.

일 양태에 있어서, IL-15 변이체는 아미노산 치환 G78A, G78V, G78L 또는 G78I 및 N79Q, N79H 또는 N79M, 바람직하게는 G78A 및 N79Q를 포함한다. G78A/N79Q 이중 치환 (double substitution)은 균질성, 안정성 및 생체 내 반감기 측면에서 RLI2 융합 단백질 (여기서는 각 번호는 G175A/N176Q)의 맥락에서 테스트한 결과 우수한 IL-15 변이체로 나타났다.

바람직하게는, IL-15 변이체는 포유류 세포주에서 발현되고, 바람직하게는 포유류 세포주는 CHO 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, SP20 세포, NSO 세포 또는 이들로부터 유래된 임의의 세포 중에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 CHO 세포가 선택된다. 다양한 진핵생물 또는 포유류 발현 시스템을 사용할 수 있지만, CHO 세포에서의 발현이 가장 잘 확립된 발현 시스템이며 좋은 수율을 제공한다.

IL-15 변이체의 아미노산 치환은 바람직하게는 이러한 치환이 없는 성숙한 인간 IL-15에 비해 IL-15 변이체의 N77에서 탈아미드화 및 N79에서 글리코실화를 감소시킨다. 더욱 바람직하게는, 글리코실화된 IL-15 변이가 30% 미만, 특히 RLI2 융합에서 결정된 글리코실화된 IL-15 변이가 25% 미만이다. 비교를 위해, RLI2(AQ 치환이 없는)는 최대 40%의 글리코실화를 갖는다. 일 양태에 있어서, IL-15 변이체의 30% 미만이 글리코실화되어 있다. 다른 일 양태에 있어서, IL-15 변이체의 25 % 미만이 글리코실화된다. 바람직하게는, N71은 이러한 치환이 없는 IL-15 (인간 성숙 IL-15)에 비해 더 많이 글리코실화된다. 따라서 RLI2 AQ의 전체 글리코실화율은 RLI2에 비해 감소하는 반면, 글리코실화 음성 부위인 N71 (IL-15 번호)/N168(RLI 번호)의 글리코실화율은 20%로 증가하는데, 이는 두 글리코실화 부위인 N168과 N176의 근접성으로 인해 N176의 지배/우위적 (domination/preferential) 글리코실화 간섭으로 이어질 수 있는 것으로 추정된다. 이러한 간섭은 N176Q 치환을 통해 해소되어 N168에서 글리코실화가 증가한다.

바람직한 일 양태에 있어서, IL-15 변이체의 아미노산 치환은 Kit225 세포, 32Db 세포, 인간 PBMC의 증식 유도 또는 프로메가 IL-15-생물학적 분석의 증식 유도에 대한 IL-15 변이체의 IL-15 활성을 실질적으로 감소시키지 않는다. 이러한 맥락에서 실질적으로란 이러한 치환물이 없는 IL-15에 비해 활동이 약 20 % 이상, 바람직하게는 10 % 이상 감소하지 않는 것을 의미한다. Kit225 세포 (Hori et al. 1987)는 일반적으로 IL-15 및 IL-15 초작용제에 의한 증식 유도를 결정하는데 사용된다. 바람직하게는, 예를 들어 CTLL-1 세포를 사용하여 Soman et al. 등이 기술한 바와 같이, 비색법 또는 형광과 같은 방법이 IL-2 또는 IL-15 자극에 의한 증식 활성화를 결정하는데 사용된다 (Soman et al. 2009). Kit225 세포와 같은 세포주 대신 32Db 세포 (ThermoFisher), 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 버피코트를 사용할 수 있다. IL-15의 활성을 측정하는 데 선호되는 바이오 분석은 STAT5-RE CTLL-2 세포를 사용하는 IL-2/IL-15 바이오 분석 키트이다 (Promega Catalog number CS2018B03/B07/B05).

다른 일 양태에 있어서, IL-15 변이체는 위치 N71 및/또는 위치 N77에서 치환을 갖지 않는다. 본 출원인은 글리코실화 음성 부위를 치환하면 다른 부위의 발현과 글리코실화가 낮아진다는 사실을 발견하였다. 또한 돌연변이/치환이 추가적으로 도입될 때마다 면역원성의 위험이 증가하므로 피해야 한다.

바람직한 일 양태에 있어서, IL-15 변이체는 IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체 및/또는 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 추가 치환체를 추가로 포함한다. IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체와의 결합과 관련이 있다: IL-15의 수용체에 대한 친화력이 매우 높기 때문에 투여된 IL-15 및 이와 유사한 IL-15/IL-15Rα 접합체는 주로 약물이 표적 면역 세포에 결합하여 소비되고 제거되는 표적 매개 약물 침착 (TMDD)으로 인해 매우 짧은 반감기를 보인다 (Hangasky et al. 2020). 따라서 1회 정맥 주사는 높은 C_max와 매우 짧은 반감기로 즉각적인 가파른 감소로 이어져 AUC가 다소 작아지고 따라서 약동학(PK) 프로파일이 최적화되지 않는다. 그러나 강력한 면역 세포 확장을 위해서는 특정 임계치 이상의 반복 및/또는 장기간의 IL-15 노출, 즉 더 높은 AUC가 필요하다. 보다 선호되는 PK 프로필을 얻기 위해 (i) 지속적으로 정맥 주사, 다만 이는 불편하고, (ii) 예를 들어, 페길화 (예를 들어, NKTR-255, THOR-924, AM0015), IL-15Rα의 일부 (RLI-15, hetIL-15, ALT-803, P-22339, XmAb24306 또는 CUG105)와 복합화, 또는 항체의 Fc 부분 (ALT-803, P-22339, XmAb24306 또는 CUG105)과 복합화/융합의 방법을 통한 분자 크기의 증가, (iii) 피하 저장부에서 일부 지연된 흡수를 유발하는 SC 투여 및/또는 (iv) IL-15의 수용체에 대한 결합 친화력을 감소시켜 TMDD의 감소와 같은 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 이러한 IL-15의 수용체에 대한 결합 감소는 시험관 내에서 표적 면역 세포를 활성화하는 효능 감소와 함께 진행되지만 (예를 들어, kit225 세포에서 측정한 결과, TMDD가 중요한 역할을 하지 않는 경우), 생체 내 반감기 연장 (US 2018/0118805A1)으로 인한 더 나은 PK 프로필로 인해 생체 내에서 보상된다 (Bernett et al. 2018).

IL-2/IL-15Rβ 또는 γ_c 수용체와의 결합을 감소시키는 적절한 아미노산 치환체는 바람직하게는 IL-2Rβ 또는 γ_c 인터페이스에 위치한다. IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γ_c 수용체에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환을 위한 다수의 부위가 선행기술에 기술되어 있다. 아미노산 치환체는 N1, N4, S7, D8, K10, K11, D30, D61, E64, N65, L69, N72, E92, Q101, Q108, I111로 이루어진 목록에서 선택된 하나 이상의 부위일 수 있으며, 바람직하게는 D61, N65 및 Q101 (WO 2005/085282, WO 2006/020849A2, WO 2008/143794A1, WO 2014/207173A1, US 2018/0118805A1 참조)(Ring et al. 2012)에서 선택된 하나 이상의 부위일 수 있으며, 특히 N65로부터 선택된 것일 수 있다. 구체적으로, 하나 이상의 치환체는 N1D, N1A, N1G, N4D, S7Y, S7A, D8A, D8N, K10A, K11A, D30N, D61A, D61N, E64Q, N65D, N65A, N65E, N65R, N65K, L69R, N72R, Q101D, Q101E, Q108D, Q108A, Q108E, Q108R로 이루어진 그룹에서 선택되고, 바람직하게는 D8A, D8N, D61A, D61N, N65A, N65D, N72R, Q101D, Q101E 및 Q108A으로 이루어진 목록에서 선택되며 더욱 바람직하게는 치환체 D61A("DA" 돌연변이), N65A("NA" 돌연변이), Q101D("QD" 돌연변이), 특히 N65A로부터 선택된다. N65K와 L69R은 IL-2/IL-15Rβ의 결합을 무효화하는 것 (WO 2014/207173A1)으로 보고되었으며, 반면 Q101D와 Q108D는 IL-15의 기능을 억제하는 것 (WO 2006/020849A2)으로 보고되어 선호되는 대체 물질이다. Q108D는 특히 CD122에 대한 친화력을 증가시키고 IL-2 및 IL-15 이펙터 기능을 억제하기 위한 CD132의 모집을 손상시키는 것으로 설명된 반면, N65K는 CD122 친화력을 무효화하는 것으로 설명되었다 (WO 2017/046200A1). N1D, N4D, D8N, D30N, D61N, E64Q, N65D 및 Q108E는 NK 세포 및 CD8 T 세포의 활성화와 관련하여 각각의 IL-15/IL-15Rα 접합체의 활성을 점진적으로 감소시키는 것으로 설명되었다 (도 51, WO 2018/071918A1, WO 2018/071919A1 참조). S7Y, S7A, K10A, K11A는 IL-2/IL-15Rβ 결합을 감소시키는 것으로 확인되었다 (Ring et al. 2012).

선호되는 조합은 D8N/N65A, D61A/N65A ("DANA" 돌연변이), N1D/D61N, N1D/E64Q, N4D/D61N, N4D/E64Q, D8N/D61N, D8N/E64Q, D61N/E64Q, E64Q/Q108E, D61A/N65A/Q101D("DANAQD" 돌연변이), N1D/N4D/D8N, D61N/E64Q/N6SD("NQD" 돌연변이), N1D/D61N/E64Q, N1D/D61N/E64Q/Q108E, 또는 N4D/D61N/E64Q/Q108E, 더욱 바람직하게는 D8N/N65A, D61A/N65A 또는 D61A/N65A/Q101D, 특히 D61A/N65A이다.

IL-2/IL-15Rβγ에 대한 결합을 감소시키는 여러 가지 치환이 선행기술에 기술되어 있었다. 하지만 포유류의 약동학에 미치는 영향에 대한 적절한 데이터가 없었고 예측할 수 없는 경우가 많았다. 본 출원인은 추가 단일 치환을 통해 AQ 돌연변이가 있는 적절한 범위의 IL-15 변이체를 확인하였으며, 이 변이체는 IL-15Rα의 스시+ 단편(RLI2)과 융합 단백질에서 테스트한 결과 효능을 현저히 감소시켰다. 표 11에서 볼 수 있듯이, D61A를 대체하면 약 8배, N65D를 대체하면 약 20배, N65A를 대체하면 약 48배의 감소 효과가 있었다.

마찬가지로, 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 양쪽 모두의 C-말단에 융합된 RLI2_AQ가 있는 항 PD-1 항체 펨브롤리주맙 (anti-PD-1 antibody pembrolizumab)을 기반으로 한 면역 사이토카인을 만들었다 (실시예 11 참조). 단일 치환은 다시 Kit225 세포의 EC50을 wt RLI2 (100% 설정)와 비교하여 감소된 효능의 범위를 커버하였다. 반면 항체와의 융합은 이미 효능이 약 50 %(2개의 RLI2 분자가 융합(x2)) 또는 약 15% (1개의 RLI2(x1) 분자가 KIH 기술로 융합)로 감소한 반면, N65A 치환의 경우 약 40%에서 약 0.4% 사이의 범위에서 효능이 관찰되었다. 이 분석에서 NQD 돌연변이는 1x 분자의 경우 검출 한계치 이하, x2 분자의 경우 약 0.04%로 가장 낮은 효능을 보였다. 또한, 항 PD-1 항체 펨브롤리주맙과 IL-2Rβγ에 대한 결합을 감소시키는 돌연변이가 있는 RLI2_AQ가 항체의 경쇄에 융합된 면역 사이토카인을 RLI2_AQ가 항체의 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합된 각각의 면역 사이토카인과 비교하였다 (실시예 12 참조). 동일한 RLI2_AQ 변종에 대해 이종이합체 중쇄 융합과 비교하여 동종이합체 경쇄 융합 (homodimeric light chain fusions)은 유사하거나 약간 향상된 EC50 값을 보였다.

RLI2_AQNA(RLI-15AQA라고도함) 뮤테인과 비교했을 때, QDQA(Q101D/Q108A) 이중 치환은 kit225 세포의 효능을 약 50%, NQD(D30N/E64Q/N65D) 삼중 변이는 약 7%, DANA(D61A/N65A) 이중 치환은 약 1%로 낮췄다.

펨브롤리주맙 유도체 (중쇄에서 L235E 치환이 없는 경우 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24 참조)에 단일 RLI2_AQ NA가 융합된 PEM-RLI NA x1 구조는 마우스 종양 모델에서 대조군 미처리 그룹에 비해 종양 부피를 크게 감소시키는 것으로 나타났으며 (p-값<0.05), 펨브롤리주맙 치료 그룹과 유사하게 나타났다 (실시예 14 참조).

다른 일 양태에 있어서 IL-15 변이체는 IL-15를 활성화하는 적어도 하나의 추가 치환체를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 활성화 돌연변이는 위치 N72, 특히 N72D에 위치한다. 또한 AQ 치환체는 예를 들어, N72D처럼 임상후보 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 ALT-803에 사용된 것과 같이 N72 위치에서 활성화 돌연변이를 갖는 IL-15 변이체를 포함하는 접합체의 이질성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

다른 일 양태에 있어서 IL-15 변이체는 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 추가 치환을 포함하며, 바람직하게는 아미노산 치환이 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 부위는 L44, L45, E46, L47, V49, I50, S51, L52, E64, L66, I67, I68 또는 L69로 이루어진 목록에서 선택된 하나 이상의 부위에 위치할 수 있다. L44, E46, L47, V49, I50, S51, L66 및 I67이 선호된다. 하나 이상의 치환체는 L44D, E46K, E46G, L47D, V49D, V49R, I50D, L66D, L66E, I67D 및 I67E로 이루어진 목록에서 선택된다. L44D, E46K, L47D, V49D, I50D, L66D, L66E, I67D 및 I67E는 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키기 위해 구체적으로 설명되었으며 (WO 2016/142314A1), 반면, L45, S51 및/또는 L52는 D, E, K 또는 R로 치환되고, E64, I68 및 L69는 D, E, R 또는 K로 치환되어 IL-15Rα에 대한 결합을 증가시키는 것으로 설명되었다 (WO 2005/085282A1). 유사하게, 위치 V49 및 I51 또는 V49, I50 및 S51에서 아미노산 치환을 포함하고, 위치 N1, N4, S7, K10, K11, Y26, S29, D30, V31, H32, E53, G55, E64, I68, L69, E89, L91, M109 및/또는 I111에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 IL-15 변이체는 IL-15Rα 및 IL-2/IL-15βγ 수용체에 대한 결합이 감소되거나 없는 것으로 기술되어 있다.

IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 바람직한 치환 조합은 E46G/V49R, N1A/D30N/E46G/V49R, N1G/D30N/E46G/V49R/E64Q, V49R/E46G/N1A/D30N 및 V49R/E46G/N1G/E64Q/D30N(WO 2019/166946A1)이다. 유사하게, 아미노산 위치 L45, S51, L52, E64, I68, L69는 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 것으로 기술되어 있다. 바람직하게는, L45, S51 및/또는 L52는 D, E, K 또는 R로 치환되고, E64, I68, L69는 D, E, R 또는 K로 치환된다 (WO 2005/085282A1).

다른 일 양태에 있어서 탈아미드화를 줄이기 위해 추가로 N71이 S, A 또는 N으로, N72가 S, A 또는 N으로, 그리고 N79가 S, A 또는 G로 대체된다 (WO 2009/135031A1).

WO 2016/060996A2는 IL-15의 특정 영역을 치환에 적합한 것으로 정의하고 (0020, 0035, 00120, 00130항 참조), PEG의 앵커를 제공하거나 기타 변형을 위한 잠재적 치환을 식별하는 방법을 구체적으로 제시한다 (0021항 참조).

또한, 당업자는 보존되어 있는 아미노산을 쉽게 대체할 수 있다.

다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 IL-15 변이체를 포함하는 접합체에 관한 것이다. IL-15 또는 IL-15 변이체는 임상 또는 전임상 단계에서 다양한 비공유 또는 공유 접합체에 사용된다. RLI2/SO-C101/SOT101 (사이튠 파마 (Cytune Pharma))은 IL-15Rα의 스시+ 단편, 링커 및 IL-15의 공유 결합 단백질이다. NIZ985 (노바티스)는 IL-15와 용해성 IL-15Rα의 이종이합체, 비공유 접합체이다. ALT-803 (면역-바이오/구 알토르)은 IL-15Rα 스시 도메인에 비공유 결합된 두 개의 IL-15 N72D 변이체가 각각 IgG1-Fc 사슬에 N-말단으로 융합된 호모디메릭 비공유 접합체이다. P-22339 (헝루이제약)는 시스테인 치환을 갖는 두 개의 IL-15 변이체의 동종이합체 공유 접합체로서, IL-15 변이체를 역시 시스테인 치환을 갖는 두 개의 IL-15Rα 스시 도메인에 연결하는 인공 이황화물 다리를 형성하며, 둘 다 IgG-Fc 사슬에 N-말단으로 융합되어 있다. XmAb24306 (센코어, 제넨텍)은 IL-15 변이체의 이종이합체 공유 접합체로, 하나의 Fc 사슬에 말단 융합된 IL-2/IL-15R βγ 결합 N-말단과 다른 Fc 사슬에 말단 융합된 IL-15Rα 스시 도메인 N-말단을 가지고 있다. CUG105(큐진)는 하나의 Fc 사슬에 말단 융합된 IL-15 N-말단과 다른 Fc 사슬에 말단 융합된 IL-15Rα 스시 도메인의 이합체 공유 접합체이다. 또한, IL-15 또는 IL-15 변이체는 PEG와 접합체, 예를 들어, AM0015 (Armo Bio, 일라이 릴리), THOR-924, 908, 918 (신톡스, 사노피) 또는 NKTR-255 (넥타 테라퓨틱스)로 사용된다. 본 발명자들이 RLI2_AQ 및 RLI2_AQ 기반 면역 사이토카인에 대해 보여준 바와 같이, AQ 돌연변이는 이러한 접합체의 이질성을 유사하게 개선할 것으로 예상한다.

일 양태에 있어서, 접합체는 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 그 유도체를 추가로 포함한다. 폴리펩타이드를 포함하는 IL-15와 스시 도메인의 결합은 IL-15의 IL-15Rα 결합부위를 차지하고 한편으로는 IL-2/IL-15Rαβγ에 대한 결합을 폐지하고, IL-2/IL-15Rβγ에 대한 결합 친화력을 높이며(IL-15 단독에 비해), IL-2/IL-15Rβγ 발현 세포의 트랜스-프리젠테이션 요구 사항을 우회하여 이러한 접합체를 IL-2/IL-15Rβγ 초작용제로 만든다. 상기 설명한 바와 같이, 이 개념은 RLI2/SO-C101/SOT101, NIZ985, ALT-803, P-22339, XmAb24306 및 CUG105를 포함한 다양한 접근 방식에서 사용된다. 일부는 IL-15Rα의 최소 결합 도메인인 스시 도메인만 사용하여 IL-15와 결합하고 (예를 들어, ALT-803), 일부는 스시 도메인을 확장하여 IL-15와 완전히 결합하는 스시+ 단편을 사용하고 (RLI2/SO-C101/SOT101), 다른 일부는 가용성 IL-15Rα, 즉 막 통과 도메인이 없는 훨씬 더 큰 폴리펩타이드 (NIZ985)를 사용하기도 한다. 스시 도메인의 유도체는 IL-15에 대한 결합을 유지하거나 (해당 스시 도메인 결합의 최소 25 %, 바람직하게는 최소 50 %를 유지), IL-2/IL15Rαβγ에 결합하는 접합체 블록 내에 있어야 한다 (즉, IL15Rαβγ에 대한 결합 친화도를 최소 1로그, 바람직하게는 최소 2로그 감소시켜야 한다). 예를 들어, WO 2016/095642는 위치 K34, L42, A37, G38 또는 S40에 시스테인이 치환된 스시 유도체를 개시하고 있으며, 스시 S40C 변이체는 L45, Q48, V49, L52, E53, C88 또는 E89에 시스테인이 치환된 IL-15 변이체와 인공 이황화 결합을 도입하는 것이 바람직하며, 스시 S40C 변이체는 L52C 치환된 IL-15 변이체와 쌍을 이루는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 IL-15 변이체를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 융합 단백질은 바람직하게는 접합체이며, 비공유 접합체와 비교하여, 환자에게 투여 시 접합체를 강하게 희석한 후 접합체가 해리될 위험이 없다. 또한 일반적으로 융합 단백질의 발현은 여러 폴리펩타이드 사슬의 공동 발현 또는 개별 정제 후 폴리펩타이드의 시험관 내 조립보다 더 효과적이며 더 균질한 생성물을 유도한다. 항체의 중쇄 C-말단에 융합된 IL-15 변이체를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 WO 2019/166946A1 (화이자) 또는 WO 2018/184964A1 (로슈)에 공개되어 있으며, 항체의 중쇄 각 C-말단에 융합된 IL-15 변이체를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 WO 2016/142314A1(DKFZ, 튀빙겐 대학교)에 공개되어 있다.

일 양태에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은 IL-15Rα 또는 그 유도체의 스시 도메인, 표적화 모이어티 및/또는 반감기 연장 모이어티, 및 선택적으로 하나 이상의 링커를 추가로 포함한다. 위에서 언급한 바와 같이, IL-15Rα의 스시 도메인 또는 그 유도체와의 융합이 선호되는데, 그 결과 융합 단백질은 IL-15Rαβγ에 결합하지 않고 IL-2/IL-15Rβγ에 최적화된 표적을 가지며 IL-15Rα의 트랜스 프리젠테이션이 필요 없기 때문이다. 또한, IL-15 변이체는 표적 모이어티에 융합될 수 있다. 표적 모이어티는 주로 동일한 표적에 결합하는 항체 또는 기능 단편이며, IL-15 또는 IL-15/IL-15Rα 융합 단백질은 바람직하게는 하나 또는 양쪽 중쇄의 C-말단 (KiH 기술과 같은 Fc 도메인에서 이합체화 변이가 필요한 하나의 중쇄에) 또는 양쪽 경쇄에 융합될 수 있다. 다른 표적 모티프는 RGD 모티프 (예를 들어, WO 2017/000913를 참조하라), 알부민 결합 도메인(ABD) (예를 들어, WO 2018/151868A2를 참조하라), TCR (예를 들어, WO 2008/143794를 참조하라) 또는 안티칼린 (anticalins), 어피바디 (affibodies), 아덱틴 (adectins), 앱타머 (aptamers), 어피머 (affimers), 아피틴 (affitins), 아비머 (avimers), 파이노머 (fynomers), 아르마딜로 반복 단백질 (armadillo repeat proteins), 노트틴 (knottins)과 같은 항체 모방체와 같은 짧은 결합 태그일 수 있다. IL-15 변이체는 Fc 도메인 또는 인간 혈청 알부민과 같은 반감기 연장 모티프에 융합될 수도 있다. 단백질의 크기를 증가시켜 혈류에서 제거되는 속도를 늦춤으로써 반응성 면역 세포 (주로 NK 및 CD8+ T 세포)의 자극을 연장하기 위해 생체 내 반감기를 늘리는 것이 IL-15 개발의 일반적인 전략이다. 예를 들어 개발 후보물질인 P-22339, XmAb24306 및 CUG105에서 Fc 도메인과의 융합이 사용되었다.

바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은, 바람직하게는, 인간 IL-15Rα 스시 도메인, 링커 및 본 발명의 IL-15 변이체를 N- 내지 C- 말단 순서로 포함한다. 수용체-링커-인터루킨 (receptor - linker - interleukin, "RLI")의 순서는 반대 순서인 ILR에 비해 유익한 것으로 나타났다. 바람직하게는, 인간 IL-15Rα 스시 도메인은 서열 번호: 5의 서열을 포함하고, 반면 링커는 18 내지 22 아미노산의 길이를 가지며, 글리신 또는 세린과 글리신, 및 본 발명의 IL-15 변이체로 구성된다. 인간 환자에게는 인간 서열이 선호된다. 18 내지 22개 아미노산 길이의 링커가 유리한 것으로 나타났으며, 글리신 또는 세린과 글리신이 링커 서열에 선호되는 아미노산으로 링커를 유연하고 비면역원성으로 만들기 위한 아미노산이다. RLI2/SO-C101/SOT101은 IL-15Rα의 스시+ 단편을 도입하여 균질성이 우수하도록 개선한 임상단계 융합단백질로, AQ 치환을 도입하여 균질성을 높였다. 따라서, RLI2_AQ (서열번호 9)가 바람직한 일 양태이다. 덜 강력한 IL-15 변이체를 갖는 또 다른 바람직한 RLI 분자는 RLIAQ N65A/RLI-15AQA (서열번호 10)이다. 일반적으로 사용되는 링커는 글리신 또는 세린과 글리신으로 구성되며 10 내지 40개의 아미노산 길이를 가진다.

다른 일 양태에 있어서, 표적 모이어티는 종양 항원, 종양 세포외 기질 항원 또는 종양 신생 혈관 형성 항원에 결합하는 것이 바람직하며, 면역 조절 항체인 항체 또는 이의 기능적 변이체이다.

종양 항원 (Tumor antigens)은 바람직하게는 EGFR, HER2, FGFR2, FOLR1, CLDN18.2, CEA, GD2, O-아세틸-GD-2, GM1, CAIX, EPCAM, MUC1, PSMA, c-Met, CD19, CD20, CD38 중에서 선택된다. 종양 세포외 기질 항원 (Tumor extracellular matrix antigens)은 바람직하게는 FAP, 피브로넥틴의 EDA 도메인 (EDA domain of fibronectin), 피브로넥틴의 EDB 도메인 (EDB domain of fibronectin) 및 LRRC15에서 선택되고, 바람직하게는 FAP 및 피브로넥틴의 EDB 도메인 (EDB domain of fibronectin) 중에서 선택된다.

신생혈관 생성 항원은 바람직하게는 VEGF 또는 엔도글린 (Endoglin; (CD105))중에서 선택된다.

면역 조절 항체 또는 이의 기능적 변이체는 공동 자극 수용체를 자극하는 면역 조절 항체일 수 있으며, 바람직하게는 CD40 작용제, CD137/4-1BB 작용제, CD134/OX40 작용제 및 TNFRSF18/GITR 작용제 중에서 선택될 수 있으며, 또는 면역 조절 항체는 면역 억제 수용체를 억제할 수 있으며, 바람직하게는 PD-1 길항제 (antagonists), CTLA-4 길항제, LAG3 길항제, TIGIT 길항제, 억제성 KIRs 길항제, BTLA/CD272 길항제, HAVCR2/TIM-3/CD366 길항제 및 ADORA2A 길항제 중에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 PH-1 길항제 일 수 있다.

위에 나열된 표적에 대한 항체는 당업자에게 잘 알려져 있거나 표준 면역 또는 파지 디스플레이 프로토콜을 통해 생성할 수 있다. 비인간 항체도 인간화 할 수 있다. 항-EGFR 항체의 예로는 세툭시맙 (cetuximab), 파니투무맙 (panitumumab), 잘루투무맙 (zalutumumab), 니모투주맙 (nimotuzumab), 마투주맙 (matuzumab) 등이 있다. 항 HER2 항체의 예로는 트라스투주맙 (trastuzumab), 퍼투주맙 (permtuzumab) 또는 마게툭시맙 (margetuximab)이 있다. 항-CLDN18.2 항체의 예로는 졸베툭시맙 (zolbetuximab) 및 아래 본 발명의 항체가 있다. 항-CEA 항체의 예로는 아르시투모맙 (arcitumomab)이 있다. 항-GD2의 예로는 hu14.18K322A가 있다. 항 O-아세틸-GD-2 (Acetyl-GD-2)의 예로는 c.8B6이 있다. 항-CD20 항체의 예로는 리툭시맙 (rituximab), 오크레리주맙 (ocrelizumab), 오비누투주맙 (obinutuzumab), 오아투무맙 (ofatumumab), 이브리투모맙 (ibritumomab), 토시투모맙 (tositumomab), 유블리툭시맙 (ublituximab) 등이 있다. 항-CD38 항체의 예로는 다라투무맙 (daratumumab), MOR202 및 이사툭시맙 (isatuximab)이 있다.

항-FAP 항체의 예로는 시브로투주맙 (Sibrotuzumab)과 B12 (US 2020-0246383A1)가 있다. 피브로넥틴의 항-EDA 도메인 항체의 예로는 F8 항체 ((Villa et al. 2008), WO 2010/078945, WO 2014/174105), 피브로넥틴의 항-EDB 도메인 항체의 예로는 L19 항체((Pini et al. 1998), WO 1999/058570), 항-LRC15 항체의 예로는 Samrotamab/huM25(WO 2017/095805)가 있다.

항-VEGF 항체의 예로는 베바시주맙 (bevacizumab)과 라니비주맙 (ranibizumab)이 있다. 항-엔도글린 항체의 예로는 TRC 105 (WO 2010039873A2)가 있다.

항-CD40 작용 항체의 예로는 셀리크루맙 (selicrelumab), APX005M, ChiLob7/4, ADC-1013, SEA-CD40 및 CDX-1140이 있다 (Vonderheide 2020). 항-CD137/4-1BB 작용 항체의 예로는 우렐루맙 (urelumab)과 우토밀루맙 (utomilumab )이 있다 (Chester et al. 2018). 항-CD134/OX40 작용 항체의 예로는 PF-04518600, MEDI6469, MOXR0916, MEDI0562, INCAGN01949가 있다 (Fu et al. 2020). 항-TNFRSF18/GITR 작용 항체의 예로는 DTA-1이 있다.

PD-1 길항제의 예로는 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체 또는 항 PD-L2 항체가 있다. 항 PD-1 길항 항체의 예로는 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 피딜리주맙 (pidilizumab), 토리팔리맙 (toripalimab) 및 티슬렐리주맙 (tislelizumab)이 있다 (Dolgin 2020). 항 PD-L1 길항 항체의 예로는 아테졸리주맙 (atezolizumab)과 아벨루맙 (avelumab)이 있다. 항-CTLA-4 길항 항체의 예로는 이필리무맙 (ipilimumab)이 있다. 항-LAG3 길항 항체의 예로는 릴라티맙 (relatlimab)이 있으며, 항-TIGIT 길항 항체의 예로는 티라골루맙 (Tiragolumab), 비보스톨리맙 (Vibostolimab), 돔바날리맙 (Domvanalimab), 에티길리맙 (Etigilimab), BMS-986207, EOS-448, COM902, ASP8374, SEA-TGT, BGB-A1217, IBI-939 및 M6223 (Dolgin 2020)이 있다.

항-BTLA 길항 항체의 예로는 TAB004가 있다. 항 HAVCR2/TIM-3 길항 항체의 예로는 LY3321367, MBG453 및 TSR-022가 있다.

바람직한 일 양태에 있어서, 융합 단백질은 항체의 적어도 하나의 중쇄의 C-말단 또는 항체의 양쪽 경쇄의 C-말단에 융합된다. 다양한 면역 사이토카인, 즉 사이토카인에 융합된 항체를 실시예 7 내지 14에서 펨브롤리주맙 유래 항체의 하나 (예를 들어, 서열번호 22) 또는 양쪽 중쇄 (예를 들어, 서열번호 25)의 C-말단 또는 양쪽 경쇄 (예를 들어, 서열번호 30)에 링커 없이 RLI2_AQ를 융합하여 제작하고 테스트하였다. 대안적으로, 링커를 사용하여 하나 또는 양쪽 중쇄의 C-말단에 RLI2_AQ를 융합시킬 수 있다. 이러한 링커는 글리신 또는 글리신과 세린으로 구성되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30 내지 50 아미노산 길이의 GGGGS 단위, 특히 서열번호 30의 L40 링커로 구성되는 것이 바람직하다. L40 링커와 양쪽 중쇄에 융합된 RLI2_AQ를 갖는 항-CD20 항체상의 예시적인 면역 사이토카인 염기 (서열번호 32, 서열번호 34)를 제조하였다. 하나의 중쇄에 하나의 RLI 분자가 융합된 이종이합체 면역 사이토카인을 생성하기 위해 한 사슬 (노브)에 T366W 돌연변이를, 다른 사슬 (홀)에 T366S/L368A/Y407V를 가진 KiH 기술을 적용하였다 (Elliott et al. 2014). 다른 이종 이성질체화 기술, 예를 들어, KiHS-S (T366W/S354C -T366S/L368A/Y407V/Y349C, (Merchant et al. 1998, Leaver-Fay et al. 2016)), HA-TF (S364H/F405A - Y349T/T394F, (Moore et al. 2011)), ZW1 (T350V/L351Y/F405A/Y407V - T350V/T366L/K392L/T394W, (Von Kreudenstein et al. 2013)), 7.8.60 (K360D/D399M/Y407A - E345R/Q347R/T366V/K409V, (Leaver-Fay et al. 2016)), DD-KK (K409D/K392D - D399K/E356K, (Gunasekaran et al. 2010)), EW-RVT (K360E/K409W - Q347R/D399V/F405T, (Choi et al. 2013, Choi et al. 2015)), EW-RVTS-S (K360E/K409W/Y349C - Q347R/D399V/F405T/S354C, (Choi et al. 2015)), SEED f(IgG1 CH3의 IgA 유래 45개 잔기 - IgA CH3의 IgG1 유래 57개 잔기, (Davis et al. 2010)), A107 (K370E/K409W - E357N/D399V/F405T, (Choi et al. 2015))은 당업자에게 알려져 있다. 면역 사이토카인의 IgG4 기반 Fc 도메인은 L235E 돌연변이에 의해 변형되어 ADCC 활성을 더욱 감소시키거나 (Alegre et al. 1992), M252Y/S254T/T256E 돌연변이에 의해 생체 내 반감기를 연장하기 위해 FcRn 결합을 증가시켰다 (Dall'Acqua et al. 2002). 다른 일 양태에 있어서, PD-1 또는 CTLA-4와 같은 체크포인트 억제제를 표적으로 하는 항체는 ADCC 및/또는 CDC 활성을 강력하게 감소시키거나 침묵시키도록 조작된 IgG1 형식 (예를 들어, 감소된 FcγR 및 C1q 결합)일 수 있다. 면역 사이토카인에 적합한 Fc 변형은 표 2에 기재하였다.

표 2: 항체 이펙터 기능을 조절하기 위한 변형의 예. 달리 명시되지 않는 한, 돌연변이는 IgG1 서브클래스에 있다. Wang et al.에서부터 발췌함 (Wang et al. 2018).

IL-2Rβγ 결합을 감소시키는 추가 돌연변이가 있는 다양한 IL-15 변이체 (모두 AQ 돌연변이)를 RLI 접합체에 사용하였다.

IL-15의 N65A 치환은 많은 항체에 적합한 수준으로 RLI-15 활성을 낮추는 단일 돌연변이로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 양태는 RLI-15AQA를 포함하는 융합 단백질이다.

바람직한 일 양태에 있어서, PD-1을 표적으로 하는 융합 단백질은 서열 및 펨브롤리주맙 유래 중쇄 노브 서열 서열번호 22 (서열번호 10에 융합됨), 펨브롤리주맙 유래 중쇄 홀 서열 서열번호 23 및 경쇄 서열 서열번호 24를 포함하는 항체를 포함하고, 상기 접합체는 링커 없이 C-말단 중쇄 노브 서열에 융합되어 있다. 더욱 바람직한 일 양태에 있어서, PD-1을 표적으로 하는 융합 단백질은 서열번호 22, 서열번호 38 및 서열번호 24 (SOT201)를 포함하는 항체를 포함한다.

바람직한 일 양태는 서열번호 10과 항-CLDN18.2 이종이합체 IgG1 항체 변이체가 각각 서열번호 46 및 서열번호 47의 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 서열의 접합체이고, IgG1 변이체는 KiH 돌연변이 (한 사슬(노브)의 T366W 돌연변이 및 다른 사슬(홀)의 T366S/L368A/Y407V)를 통한 이종이합체이다. 바람직한 일 양태에 있어서 접합체는 서열번호 66, 서열번호 67 및 서열번호 68 (SOT202)을 포함한다.

추가 실시예는 모두 표 1에 열거된 IL-15 변이체를 포함하는 폴리펩타이드이다.

또한, 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 IL-15 변이체, 본 발명의 접합체 또는 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 일 측면은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 본 발명의 IL-15 변이체에 관한 것으로, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 융합 단백질, 본 발명의 핵산 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 IL-15 및 이에 따른 IL-15 변이체는 종양 질환 (Robinson and Schluns 2017) 및 전염병 치료를 위한 의약품으로 임상 또는 전임상 시험에서 사용 및/또는 시험된 강력한 사이토카인이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 IL-15 변이체, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 융합 단백질, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 약제학적 조성물은 세제, 염 및/또는 동결 보호제와 같은 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 IL-15 변이체, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 융합 단백질, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터에 관한 것으로서, 종양 질환 또는 감염성 질환을 앓고 있거나 발병 위험이 있거나 진단을 받은 대상의 치료에 사용하기 위한 것이다.

일 양태에 있어서, 신생물학적 질환 (neoplastic disease)은 고형 종양 (solid tumor) 또는 혈액 질환 (hematological diseases)으로부터 선택된다. 고형 종양의 예로는 대장암 (colorectal cancer), 위암 (gastric cancer), 흑색종 (melanoma), 안구 흑색종 (ocular melanoma), 메르켈 세포 암 (Merkel-cell carcinoma), 피부 편평 세포 암 (skin squamous-cell carcinoma), 항문암 (anal cancer), 신세포 암 (renal cell carcinoma), 방광암 (bladder cancer), 선암 (adenocarcinoma), 카르시노이드 종양 (carcinoid tumor), 평활근 육종 (leiomyosarcoma), 유방암 (breast cancer), 삼중 음성 유방암 (triple-negative breast cancer), 골육종 (osteosarcoma), 갑상선암 (thyroid cancer), 흉선암 (thymic cancer), 담관암 (cholangiocarcinoma), 침샘암 (salivary gland cancer), 아데노이드 낭성암 (adenoid cystic carcinoma), 위암 (gastric cancer), 두경부 편평상피세포암 (head and neck squamous cell carcinoma), 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer), 소세포폐암 (small-cell lung cancer), 간세포암 (hepatocellular carcinoma), 난소암 (ovarian cancer), 자궁경부암 (cervical cancer), 담도암 (biliary tract cancer), 요로상피암 (urothelial cancer) 및 중피종 (mesothelioma)이 있다. 일 양태에 있어서 미세위성 불안정성 (microsatellite instability)이 높은 고형 종양이 선호된다. 혈액암의 일 예로는 급성 림프모구 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia, ALL), 급성 골수성 백혈병 (acute myelogenous leukemia, AML), 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia, CLL), 만성 골수성 백혈병 (Chronic myelogenous leukemia, CML) 및 급성 단핵구 백혈병 (acute monocytic leukemia, AMoL) 등의 백혈병, 호지킨 림프종 (Hodkin's lymphomas), 비호지킨 림프종 (Non-Hodgkin's lymphomas) 및 골수종 (myelomas) 등의 림프종 등이 있다. 일 양태에 있어서, 감염성 질환은 HIV, A, B 또는 C형 간염 및 헤르페스 바이러스 감염 중에서 선택된다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 IL-15 변이체, 본 발명의 접합체, 또는 본 발명의 융합 단백질, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 벡터를 치료적으로 효과적인 양으로 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일 양태에 있어서, 본 발명은 서열번호 9에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 서열번호 10에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

도 1: (A) 비환원 조건에서 RLI2 (RLI2 wt), G78A가 치환된 RLI2 (RLI2A) 및 G78A/N79Q가 치환된 RLI2 (RLI2 AQ)의 LMW SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 (항-RLI-15) 분석. 쿠마시 염색에는 0.5 ㎍ 또는 2 ㎍ 또는 단백질이 사용되었고 (레인 (lanes) 2, 4, 6, 8, 10, 12), 웨스턴 블로팅에는 25 ㎍의 단백질이 사용되었다 (레인 3, 7, 11).
(B) 환원 (reducing, R) 및 비환원 (non-reducing, NR) 조건에서 RLI2 (RLI2 wt), G78A가 치환된 RLI2 (RLI2A) 및 G78A/N79Q가 치환된 RLI2 (RLI2 AQ)의 모세관 전기영동 변성, 분석. 점선 박스 1은 글리코실화 부위 #2 (주요), 박스 2는 글리코실화 부위 #1 (소수), 점선 박스 3은 RLI2A에 대한 새로운 글리코실화 부위를 나타낸다. 이름이 지정되지 않은 레인은 6, 21, 30, 48 및 68 kDa의 마커이다.
도 2: 쿠마시 블루(왼쪽 패널), 질산은(가운데 패널)으로 염색하고 항-IL15 웨스턴 블롯(오른쪽 패널)으로 검출한 SDS-PAGE(7.5-18%)로 CHO 세포에서 발현된 3개의 탈글리코실화된 RLI 변이체 분석: 1번 레인: 분자량 마커; 2번 레인: RLI2_N176Q, 3번 레인: RLI2_{N168S/N176Q/N209S}, 4번 레인: RLI1_{N168S/N176Q/N209S}.
도 3: 32Db 세포 또는 Kit225 세포의 활성화에 의해 측정된 상청액에서 RLI2 및 RLI2_AQ의 효능. (A) 32Db 세포, 21시간, (B) Kit225 세포, 4시간.
도 4: Kit225 세포의 활성화에 의해 측정된 상층액으로부터의 RLI2_AQ와 비교하였을때 정제된 또는 상층액으로부터의 RLI2의 상대적 효능.
도 5: 고글리코실화된 RLI2 (highly glycosylated RLI2)와 저글리코실화된 RLI2 (low glycosylated RLI2)의 비교 (A) 280 nm에서 측정한 버퍼 B의 농도에 따른 CPI HIC 용출 프로파일. 왼쪽 상자는 고글리코실화된 RLI2 ("RLI-15-HG")에 대해 모은 분획(pooled fraction) 2B1 1-3을 나타내고, 오른쪽 상자는 저글리코실화된 RLI2 ("RLI-15-LG")에 대해 모은 분획 4B1 1-3을 나타낸다. (B) RLI-15-HG의 분획 2B1 1-3, RLI2 참조 표준 및 주어진 kDa의 분자량 래더 (ladders)의 SDS PAGE. (C) RLI-15-LG의 분획 4B1 1-3, RLI2 참조 표준 및 주어진 kDa의 분자량 래더의 SDS PAGE.
도 6: 시험관 내 혼합 림프구 반응 (hPBMC 기증자): 면역 사이토카인 PEM LY-RLI NA x1(AQ 돌연변이가 있는 IL-15 N65A 돌연변이)과 비교하여 PEM (펨브롤리주맙) 및 RLI-15 (RLI2)의 상대적 IFNγ 생산량을 표시한다.
도 7: HuCell MC38-hPD-L1 종양 세포주를 이식한 생체 내 hPD1 단일 KI HuGEMM 마우스를 동물 종양 모델로 사용하였다. 종양 부피는 대조군 (삼각형), 펨브롤리주맙 (회색 원)을 D0, D3, D6, D9에 5mg/kg씩 투여한 경우와 PEM-RLI NA x1(검은색 원)을 D0에 20mg/kg씩 투여한 경우로 표시되어 있다.
도 8: 이펙터 기능이 변형되지 않은 hCl1a 항체를 기반으로 한 면역 사이토카인과 ADCC 활성이 감소된 면역 사이토카인 및 항체 hCl1a 및 졸베툭시맙 (Zolbetuximab)의 ADCC 활성 비교. ADCC 표적 세포는 CLDN18.2를 과발현하는 A549 세포 (A549-CLDN18.2) 또는 CLDN18.2를 내인성적으로 발현하는 PA-TU-8988S 세포 (PATU)였다.
도 9: 이펙터 기능이 변형되지 않은 hCl1a 항체를 기반으로 한 면역 사이토카인과 ADCC 활성이 강화된 면역 사이토카인 및 항체 hCl1a 및 졸베툭시맙의 ADCC 활성을 비교한 결과. ADCC 표적 세포는 CLDN18.2를 과발현하는 A549 세포(A549-CLDN18.2) 또는 CLDN18.2를 내인성적으로 발현하는 PA-TU-8988S 세포(PATU)였다. (A): DLE 돌연변이; (B): DE 돌연변이; (C): AAA 돌연변이; (D): TL 돌연변이; (E): IE 돌연변이; (F): 아푸코실화된 면역 사이토카인.
도 10: (A) 키트루다 (Keytruda) 및 SOT201의 pM 농도 증가에 따른 PD-1/PD-L1 차단 %
(B) IL-2/IL-15Rβγ에 대한 결합이 감소하지 않고 IL-15 모이어티를 갖는 SOT201 또는 SOT201 wt의 양을 증가시킨 건강한 기증자의 인간 PBMC를 시험관 내에서 7일간 자극한 후 유세포 분석법으로 측정한 Ki67⁺ NK 세포 및 CD8⁺ T 세포의 %.
(C) 항-뮤린 PD-1 항체 단독 또는 단일 활성 대조군으로서 항-인간 PD1 마우스 IgG1-RLI-15AQA(hPD1-mSOT201)와 비교하여 뮤린 대리체 분자 mSOT201 (항-뮤린 PD-1 항체 RMP1-14 융합 RLI-15AQA) 5mg/kg의 등가량 화합물을 정맥 주사한 후 건강한 C57BL/6 마우스(n=2/그룹)의 비장에서 유세포 분석법으로 5일간 검출된 CD8⁺ T 세포 또는 NK 세포의 세포 증식(Ki67⁺).
도 11: (A) 1일차 (종양 부피 80-100mm³의 무작위 배정일)에 mSOT201 (5mg/kg)의 등가량에서 대조군 (NaCl, mSOT201, hPD1-mSOT201 또는 mPD1의 1회 정맥 주사로 처리한 MC38 종양 세포 보유 C57BL/6 마우스의 17일 동안의 종양 부피(mm³) (n=10 마우스/그룹).
(B) 처리 후 100일까지 생존한 MC38 종양 보유 마우스의 해당 %
도 12: (A) RNA 시퀀스 데이터의 메타게놈에 의해 결정된 MC38 종양 보유 마우스의 mSOT201 처리 종양 샘플 (N=3) 및 대조군 샘플 (N=4)에서 표시된 적응성 및 선천성 면역 세포 및 섬유아세포 (CAF)와 관련된 암 관련 유전자 세트의 상대적 발현 수준. 박스 플롯: 최소, 중앙값, 최대.
(B) 확립된 종양 (80~100mm³)에 mSOT201 (5mg/kg) 정맥 주사 처리 후 7일째에 MC38 종양 보유 마우스의 비장 또는 림프절에서 표시된 세포의 유세포 분석에 의한 % Ki67⁺ 세포로 측정한 세포 증식도 (n=2).
도 13: (A) 대조군 (NaCl), mSOT201, CD25 결합이 제거된 mPD1-IL-2βγ 작용제 (항뮤린PD-1 항체 RMP1-14에 융합된 IL-2v) 또는 RLI-15AQA와 항뮤린 PD-1 항체 mPD1(RMP1-14)의 조합을 1회 정맥 주사 처리한 MC38 종양을 보유한 C57BL/6 마우스의 21일 동안의 종양 부피 (mm³) (n=10 마우스/그룹).
(B) 건강한 C57/BL6 마우스에 5일째 및 8일째에 정맥 주사 후 유세포 분석법으로 검출한 CD8⁺ T 세포 및 NK 세포의 Ki67⁺ 세포 %로 측정한 세포 증식.
(C) MC38 종양을 가진 C57BL/6 마우스의 mSOT201, mPD1-IL-2v 또는 RLI-15AQA와 mPD-1의 조합으로 정맥 주사 처리하고 7일째 비장 또는 림프절에 있는 CD8⁺ T 세포의 Ki67⁺ 세포의 %. 무작위 배정 1일차, 종양 부피 100 mm³(n=10/그룹).
도 14: (A) 1일째에 0.6 mg/kg의 SOT201을 1회 정맥 주사한 후 유세포 분석 및 혈액학에 의해 지정된 날짜에 측정된 시노몰구스 원숭이의 혈액 내 Ki67⁺의 % 및 NK 및 CD8⁺ T 세포의 절대 세포 수의 및 배율 변화, 각 그래프 곡선은 한 마리의 동물을 나타냄.
(B) 1일차 및 21일차 (화살표로 표시)에 0.3 mg/kg의 SOT201을 정맥 주사한 후 유세포 분석법으로 측정한 시노몰구스 원숭이의 혈액 내 NK 및 CD8⁺ T 세포의 Ki67⁺ %, 각 그래프 곡선은 한 마리의 동물을 나타냄.
도 15: 생체 내에서 마우스 SOT201 대리체를 처리한 후의 NK 및 CD8⁺ T 세포 증식.
(A) 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 hPD1-mSOT201, mPD-1, mSOT201, mSOT201 wt 및 mPD1-IL2v로 처리한 후 5일 및 8일째에 CD8⁺ T 세포 및 NK 세포의 증식. CD8⁺ T 세포와 NK 세포에서 Ki67의 발현을 유세포 분석법으로 검출하였다. 이 분자들은 1일차에 mSOT201 5mg/kg과 등가인 용량: 5.37 mg/kg에서 hPD1-mSOT201, 4.51 mg/kg에서 mPD-1, 및 mSOT201 wt의 0.25 mg/kg과 등가인 용량: 0.26mg/kg에서 mPD1-IL2v을 정맥 주사하였다. 유세포 분석은 5일째와 8일째에 수행하였다. 데이터는 매일 그룹당 2명에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다.
(B) 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 hPD1-mSOT201, mPD-1, mSOT201, mSOT201 wt 및 mPD1-IL2v 처리 후 5일 및 8일째의 CD8⁺ T 세포 및 NK 세포의 증식. CD8⁺ T 세포와 NK 세포에서 Ki67의 발현을 유세포 분석법으로 검출하였다. 분자를 1일째에 mSOT201 10 mg/kg에 등가인 용량: hPD1-mSOT201 10.74 mg/kg, mPD-1 9.02 mg/kg 및 mSOT201 wt 0.1 mg/kg에 등가인 용량: mPD1-IL2v 0.1 mg/kg을 정맥 주사하였다. 유세포 분석은 5일째와 8일째에 수행하였다. 데이터는 매일 그룹당 2명에 대한 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 16: 생체 내 PD-1 민감성 및 PD-1 내성 종양 모델에서 마우스 SOT201 대리체.
(A) 항 PD-1 민감성 종양 모델
MC38/C57BL/6 마우스 모델: 0일째에 4.51 mg/kg mPD-1 (문헌과 비교했을 때 최적 용량 미만, mSOT201과 등가로 선택), 5mg/kg mSOT201 또는 5.37 mg/kg hPD1-mSOT201(mSOT201과 등가로 선택)을 1회 정맥 주사; D0 = 종양 부피 ~ 80-100mm³인 무작위 배정일, 마우스 10마리/그룹
CT26/BALB/c 마우스 모델: 0일, 3일, 6일, 9일에 9.02 mg/kg mPD-1(문헌과 비교한 유효 용량), 10 mg/kg mSOT201, 10.74 mg/kg hPD1-mSOT201(mSOT201과 동등한 용량)을 4회 복강 주사; D0 = 종양 부피가 ~ 100 mm³인 무작위 배정일, 마우스 10마리/그룹.
(B) 항 PD-1 내성 종양 모델
CT26 STK11 ko 마우스 모델: 0일, 3일, 6일, 9일에 9.02 mg/kg mPD-1 (문헌과 비교한 유효 용량), 10 mg/kg mSOT201, 10.74 mg/kg hPD1-mSOT201 (mSOT201과 동등한 용량)을 4회 복강 주사; D0 = 종양 부피 ~ 100 mm³인 무작위 배정일, 마우스 10마리/그룹.
B16F10/C57BL/6 마우스 모델: 0일, 3일, 6일, 9일에 9.02 mg/kg mPD-1 (문헌과 비교한 유효 용량), 10 mg/kg mSOT201, 10.74 mg/kg hPD1-mSOT201(mSOT201과 동등한 용량)을 4회 복강 주사; 0일 (Day 0) = 종양 부피 ~ 100 mm³인 무작위 배정일, 마우스 10마리/그룹.
대조군에 존재하는 모든 마우스의 컷오프일, CR = 완전 반응.
도 17: 생체 내 mSOT201과 RLI-15_AQA 뮤테인 + 항PD-1의 비교.
MC38/C57BL/6 마우스 모델과 다음 그룹:
G1 모의 대조군 (mock control)
G4: 0일째에 0.64 mg/kg RLI-15 _AQA , 피하 주사 (s.c.) 1회 투여
+ 0일째에 4.51 mg/kg mPD-1, 복강 주사 (i.p.) 1회 투여.
G2 0일째에 5mg/kg mSOT201, 정맥 주사 (i.v.) 1회 투여
G3 0일째에 2 mg/kg mSOT201, 정맥 주사 (i.v.) 1회 투여
G6 0일째에 4.51 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 1회 투여 (문헌과 비교한 차선책 용량, mSOT201과 등가물로서 선택됨)
G11 0일째에 5 mg/kg hPD1-mSOT201, 정맥 주사 (i.v.) 1회 투여
+ 0일째에 4.36 mg/kg mPD-1, 복강 주사 (i.p.) 1회 투여.
0일차 = 종양 부피가 ~80-100 mm³인 무작위 배정일, 마우스 10마리/그룹
대조군에 존재하는 모든 마우스에 대한 컷오프일, CR = 완전 반응.
도 18: MC38/C57BL/6 마우스 모델 - D0 = ~80-100 mm³의 무작위 배정일, 마우스 10마리/그룹. CR = 완전 반응
G1 모의 대조군
G2 0일째에 5 mg/kg mSOT201, 정맥 주사 (i.v.) 1회 투여
G3 0일째에 2 mg/kg mSOT201, 정맥 주사 (i.v.) 1회 투여
G7 0일, 1일, 2일 및 3일째에 1 mg/kg RLI2 _AQ , 피하 주사 (s.c.) 4회 투여
G5 0일째에 1 mg/kg RLI2 _AQ , 피하 주사 (s.c.) 1회 투여
+ 0일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 1회 투여
G8 0일, 1일, 2일 및 3일째에 1 mg/kg RLI2 _AQ , 피하 주사 (s.c.) 4회 투여
+ 0일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 1회 투여
G9 0일, 1일, 2일 및 3일째에 1 mg/kg RLI2 _AQ , 피하 주사 (s.c.) 4회 투여
+ 0일, 3일, 6일 및 9일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 4회 투여
G6 0일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 1회 투여
G10 0일, 3일, 6일 및 9일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 4회 투여
대조군에 존재하는 모든 마우스에 대한 컷오프일
도 19: 생체 내 mSOT201과 RLI2_AQ + 항 PD-1 종양 성장 비교. MC38/C57BL/6 마우스 모델
(A) 16일째에 개별 동물에 대해 표시한 시간에 따른 평균 종양 부피(mm³), 수평선은 평균 종양 부피를 나타냄.
G1 모의 대조군
G2 0일째에 2 mg/kg mSOT201, 정맥 주사 (i.v.) 1회 투여
G3 0일 및 1일째에 2 mg/kg RLI2 _AQ , 피하 주사 (s.c.) 2회 투여
+ 0일, 3일, 6일 및 9일째에 5 mg/kg mPD1, 복강 주사 (i.p.) 4회 투여
1회 실험만, D0 = 종양 부피 ~80-100mm³의 무작위 배정일, 마우스 10마리/그룹.
CR = 전체 응답
NK 세포, CD8⁺ T 세포의 상대적 확장 (expansion) 및 αβTCR 및 γδTCR (T 세포)를 발현하는 세포는 SOT201 (위부터 G2) 및 RLI2_AQ + anti-PD-1 (위부터 G3) 처리 후 7일째 비장, 림프절 및 종양에서 유세포 분석기를 사용하여 조사하였다. 3개의 종양 샘플을 풀링하고 3개의 비장 및 림프절 샘플을 개별적으로 분석하였다.
(B) 림프절, 비장 및 종양으로부터의 CD8⁺ T 세포 (위쪽 줄)와 NK 세포 (아래쪽 줄)에 대한 모세포의 빈도 (모세포 집단 대비 상대적 백분율)를 %로 표시하였다.
(C) 림프절, 비장 및 종양으로부터의 αβTCR⁺ CD3⁺ T 세포(위쪽 줄)와 βγTCR⁺ CD3⁺ T 세포 (아래쪽 줄)의 모세포 빈도를 %로 표시하였다.
도 20: (A) DC-T 세포 기반 분석에서의 면역원성. 후보 분자를 가지는 iDC를 로딩 CFSE로 사전 염색된 자가 CD4⁺ T 세포로 배양, 순환 세포의 대리체로서 CFSE^low로 염색된 CD4⁺ T 세포를 검출한 후, PEM-RLI-15 후보 분자에 대한 T 세포 반응을 % CFSE^low 염색된 CD4⁺ T 세포로 표시. 11명의 기증자 ± SEM 평균을 표시하였다. 단백질 없이 배양하여 비특이적 T 세포 증식을 유도한 대조군 DC와 비교하여 유의미한 차이를 나타낸다. * p≤0.05, *** p≤0.001.
(B) 도입된 치환체 N65A 및 G175A/N176Q에 걸쳐 있는 RLI-15 펩타이드의 IFN-γ 및 TNF-α에 대한 플루오로스팟 분석. 40명의 기증자로 구성된 테스트 집단에서 각 야생형 펩타이드 대비 Mut2 또는 Mut3 펩타이드가 평균 dSFU에 미치는 영향을 95% 신뢰 구간(CI)으로 추정한 값이다. SFU = 스팟-형성 단위, dSFU = 재자극 웰의 SFU에서 재자극 되지 않은 웰의 SFU를 뺀 값.
도 21: 이펙터 기능이 변형된 SOT202 분자의 hPBMC 증식 유도 능력 비교. SOT202-DANA, SOT202-afuc-DANA, SOT202-DLE-DANA, SOT202-DE-DANA 및 SOT202-LALAPG-DANA에 대하여 분리된 hPBMC의 증식을 평가하였다. 세포를 7일 동안 시험관 내에서 자극하였다. 6명의 기증자 ± SEM의 평균을 표시하였다. 유세포 분석법으로 Ki67⁺ 세포를 계수하여 NK(위) 및 CD8⁺ T 세포(아래)의 증식을 측정하였다.
도 22: SOT202 분자와 SOT201의 hPBMC 증식 유도 능력 비교. SOT202, SOT202-afuc, SOT201-DANA, SOT202-DANA 및 SOT202-afuc-DANA에 대하여 분리된 hPBMC의 증식을 평가하였다. 유세포 분석법으로 Ki67⁺ 세포를 계수하여 NK(위) 및 CD8⁺ T 세포(아래)의 증식을 측정하였다.
도 23: 이펙터 기능이 변형된 SOT202-DANA 분자와 SOT201-DANA의 hPBMC 증식 유도 능력 비교. SOT201-DANA, SOT202-DANA, SOT202-afuc-DANA, SOT202-LALAPG-DANA 및 hCl1a(SOT202-mab로도 표시)에 대하여 분리된 hPBMC의 증식을 평가하였다. 유세포 분석법으로 Ki67⁺ 세포를 계수하여 NK(위) 및 CD8⁺ T 세포(아래)의 증식을 측정하였다.
도 24: (A) mSOT202로 자극한 후 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 검출된 CD8⁺ T세포 또는 NK세포의 세포 증식 (Ki67⁺). 세포 증식을 Ki67 염색으로 검출하고 5, 10 또는 20 mg/kg의 mSOT202 (hCl1a-mIgG2a-NA 1x) 화합물 또는 hCl1a-mIgG2a를 정맥 주사한 후 5일 후에 유세포 분석법으로 측정하였다.
(B) (A)와 동일한 실험 조건에서 NK 세포 및 CD8⁺ T 세포의 백분율.
도 25: 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 mSOT202, mSOT202-LALAPG 및 hCl1a-mIgG2a로 자극한 후 검출된 NK 세포(A) 또는 CD8⁺ T 세포(B)의 세포 증식. 위: 세포 증식을 Ki67 염색으로 감지하고 유세포 분석법으로 화합물을 5mg/kg으로 정맥 주사한 후 5일 및 10일 후에 측정하였다. 아래쪽: NK 세포 및 CD8⁺ T 세포의 백분율.

서열목록

서열번호 1: 인간 IL-15 (human IL-15)

1 MRISKPHLRS ISIQCYLCLL LNSHFLTEAG IHVFILGCFS AGLPKTEANW VNVISDLKKI

061 EDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKC FLLELQVISL ESGDASIHDT VENLIILANN

121 SLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS 162

신호 펩타이드는 밑줄 침

서열번호 2: 성숙한 인간 IL-15 (mature human IL-15)

1 NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH

061 DTVENLIILA NNSLSSN GN V TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114

G78 및 N79는 굵게/밑줄로 표시됨

서열번호 3: 성숙한 인간 IL-15 _AQ (mature human IL-15 _AQ )

1 NWVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTESD VHPSCKVTAM KCFLLELQVI SLESGDASIH

061 DTVENLIILA NNSLSSN AQ V TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114

A78 및 Q79는 굵게/밑줄로 표시됨

서열번호 4: 인간 IL-15Rα (human IL-15Rα)

1 MAPRRARGCR TLGLPALLLL LLLRPPATRG ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN

61 SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKCIRDPALV HQRPAPPSTV TTAGVTPQPE

121 SLSPSGKEPA ASSPSSNNTA ATTAAIVPGS QLMPSKSPST GTTEISSHES SHGTPSQTTA

181 KNWELTASAS HQPPGVYPQG HSDTTVAIST STVLLCGLSA VSLLACYLKS RQTPPLASVE

241 MEAMEALPVT WGTSSRDEDL ENCSHHL 267

서열번호 5: IL-15Rα의 스시 도메인 (sushi domain of IL-15Rα)

001 CPPPMSVEHA DIWVKSYSLY SRERYICNSG FKRKAGTSSL TECVLNKATN VAHWTTPSLK 60

061 C

서열번호 6: IL-15Rα의 스시 + 단편 (sushi+ fragment of IL-15Rα)

001 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS

061 LKCIRDPALV HQRPAPP 77

서열번호 7: 링커 (linker)

001 SGGSGGGGSG GGSGGGGSGG 20

서열번호 8: RLI2 (또는 SO-C101, SOT101)

001 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS

061 LKCIRDPALV HQRPAPPSGG SGGGGSGGGS GGGGSGGNWV NVISDLKKIE DLIQSMHIDA

121 TLYTESDVHP SCKVTAMKCF LLELQVISLE SGDASIHDTV ENLIILANNS LSSN GN VTES

181 GCKECEELEE KNIKEFLQSF VHIVQMFINT S 211

서열번호 9: RLI2 _AQ

001 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS

061 LKCIRDPALV HQRPAPPSGG SGGGGSGGGS GGGGSGGNWV NVISDLKKIE DLIQSMHIDA

121 TLYTESDVHP SCKVTAMKCF LLELQVISLE SGDASIHDTV ENLIILANNS LSSN AQ VTES

181 GCKECEELEE KNIKEFLQSF VHIVQMFINT S 211

서열번호 10: RLI2 _AQ N162A (N65A) 또는 RLI-15 _AQA

001 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS

061 LKCIRDPALV HQRPAPPSGG SGGGGSGGGS GGGGSGGNWV NVISDLKKIE DLIQSMHIDA

121 TLYTESDVHP SCKVTAMKCF LLELQVISLE SGDASIHDTV E A LIILANNS LSSN AQ VTES

181 GCKECEELEE KNIKEFLQSF VHIVQMFINT S 211

서열번호 11: (IL-15 _N72D ) ₂ :IL-15Rα _sushi -Fc의 리더 펩타이드 (Leader peptide of (IL-15 _N72D ) ₂ :IL-15Rα _sushi -Fc):

001 METDTLLLWV LLLWVPGSTG 20

서열번호 12: IL-15Rα _sushi (65aa)-Fc (IgG1 CH2-CH3):

1 ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS

61 LKCIREPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED

121 PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA

181 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN

241 YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 297

서열번호 13: IL-15 _N72D

NW VNVISDLKKI

061 EDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKC FLLELQVISL ESGDASIHDT VENLIILAN D

121 SLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS 162

서열번호 14: 펨브롤리주맙 중쇄 (pembrolizumab heavy chain, HC) - 인간 IgG4 k 아이소타입 (human IgG4 k isotype)

001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060

061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120

121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180

181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV 240

241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300

301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360

361 NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG 420

421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG

펨브롤리주맙 HC는 S228P 돌연변이가 안정화되어 있으며, 면역 사이토카인의 경우 이질성을 줄이기 위해 말단 K가 삭제되었다.

서열번호 15: 펨브롤리주맙 HC CDR1 (pembrolizumab HC CDR1)

001 NYYMY

서열번호 16: 펨브롤리주맙 HC CDR2 (pembrolizumab HC CDR2)

001 GINPSNGGTNFNEKFKN

SEQ ID NO: 17: 펨브롤리주맙 HC CDR3 (pembrolizumab HC CDR3)

001 RDYRFDMGFDY

서열번호 18: 펨브롤리주맙 경쇄 사슬 (pembrolizumab light chain)

001 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL LIYLASYLES 060

061 GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF 120

121 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 180

181 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC

서열번호 19: 펨브롤리주맙 LC CDR1 (pembrolizumab LC CDR1)

001 RASKGVSTSGYSYLH

서열번호 20: 펨브롤리주맙 LC CDR2 (pembrolizumab LC CDR2)

001 LASYLES

서열번호 21: 펨브롤리주맙 LC CDR3 (pembrolizumab LC CDR3)

001 QHSRDLPLT

서열번호 22: SOT201 HC 노브 (SOT201 HC knob): IgG4 S228P.L235E.T366W.dK-RLI2.N162A.G175A.N176Q

001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060

061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120

121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180

181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCP P CP APEF E GGPSV 240

241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300

301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360

361 NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL Y SRL TVDKSRWQEG 420

421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGITCP PPMSVEHADI WVKSYSLYSR ERYICNSGFK 480

481 RKAGTSSLTE CVLNKATNVA HWTTPSLKCI RDPALVHQRP APPSGGSGGG GSGGGSGGGG 540

541 SGGNWVNVIS DLKKIEDLIQ SMHIDATLYT ESDVHPSCKV TAMKCFLLEL QVISLESGDA 600

601 SIHDTVE A LI ILANNSLSSN AQ VTESGCKE CEELEEKNIK EFLQSFVHIV QMFINTS 657

서열번호 23: 펨브롤리주맙 변이체 HC 홀 (pembrolizumab variant HC hole): S228P.L235E.T366S.L368A.Y407V

001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060

061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120

121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180

181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCP P CP APEF E GGPSV 240

241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300

301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360

361 NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SRL TVDKSRWQEG 420

421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK

서열번호 24: SOT201 LC

001 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL LIYLASYLES 060

061 GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF 120

121 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 180

181 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 218

서열번호 25: 펨브롤리주맙 중쇄 사슬 (pembrolizumab heavy, chain HC) - 인간 IgG4 k-RLI2 AQ (human IgG4 k-RLI2 AQ)

001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060

061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120

121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180

181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV 240

241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300

301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360

361 NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG 420

421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGITCP PPMSVEHADI WVKSYSLYSR ERYICNSGFK 480

481 RKAGTSSLTE CVLNKATNVA HWTTPSLKCI RDPALVHQRP APPSGGSGGG GSGGGSGGGG 540

541 SGGNWVNVIS DLKKIEDLIQ SMHIDATLYT ESDVHPSCKV TAMKCFLLEL QVISLESGDA 600

601 SIHDTVENLI ILANNSLSSN AQ VTESGCKE CEELEEKNIK EFLQSFVHIV QMFINTS 657

서열번호 26: IgG4 Fc KiH - 노브 (knob)

APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호 27: IgG4 Fc KiH - 홀 (HOLE)

APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호 28: IgG4 Fc LE (L235E)

APEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호 29: LC k- RLI2 AQ의 CL 도메인 (CL domain of LC k- RLI2 AQ)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 30: SOT201 LC-RLI2 AQ

001 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL LIYLASYLES 060

061 GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF 120

121 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 180

181 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGECIT CPPPMSVEHA DIWVKSYSLY 240

241 SRERYICNSG FKRKAGTSSL TECVLNKATN VAHWTTPSLK CIRDPALVHQ RPAPPSGGSG 300

301 GGGSGGGSGG GGSGGNWVNV ISDLKKIEDL IQSMHIDATL YTESDVHPSC KVTAMKCFLL 360

361 ELQVISLESG DASIHDTVEN LIILANNSLS SN AQ VTESGC KECEELEEKN IKEFLQSFVH 420

421 IVQMFINTS 429

서열번호 31: L40 링커 (Linker)

001 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS 040

서열번호 32: RTX HC-L40-RLI2 _AQ

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLT

ADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG

TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT

KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL

PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV

FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ITCPPPM

SVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPS

GGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISL

ESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 33: RTX HC-RLI2 _AQ

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLT

ADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG

TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT

KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL

PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV

FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVL

NKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHI

DATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELE

EKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 34: RTX LC

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYS

LTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE

AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 35: hCl1a HC AAA 노브 RLI2 NA (hCl1a HC AAA Knob RLI2 NA)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEE KNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 36: hCl1a HC AAA 홀 (Hole)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 37: hCl1a LC

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 38: SOT201 HC 홀: S228P.L235E.T366S.L368A.Y407V/dK

001 QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG INPSNGGTNF 060

061 NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS 120

121 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180

181 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCP P CP APEF E GGPSV 240

241 FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 300

301 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK 360

361 NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SRL TVDKSRWQEG 420

421 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG

서열번호 39: mPD1.VH-h1.HC.D265A.E356K.N399K.dk-RLI.N162A.G175A.N176Q

뮤린 (murine) 항PD-1 (mIgG1 D265A HC1 - RLI-15 _AQA )

EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMGYINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTTPFTYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVV A ISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPK K QMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIM K TDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVE A LIILANNSLSSN AQ VTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 40: mPD1.VH-h1.HC.D265A.K409E.K439D.dk

뮤린 항PD-1 (mIgG1 D265A HC2)

EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMGYINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTTPFTYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVV A ISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTDGSYFVYS E LNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEDSLSHSP

서열번호 41: mPD1.VL-hk.LC

뮤린 항PD-1 (murine antiPD-1)(mIgG1 Light Chain)

DIVMTQGTLPNPVPSGESVSITCRSSKSLLYSDGKTYLNWYLQRPGQSPQLLIYWMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDVGIYYCQQGLEFPTFGGGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

서열번호 42: 인간 IL-2 (human IL-2)

001 APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE 060

061 EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR 120

121 WITFCQSIIS TLT 133

서열번호 43: IL-2v

1 AP A SSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML T A KF A MPKKA TELKHLQCLE 060

061 EELKPLEEVL N G AQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR 120

121 WITF A QSIIS TLT

서열번호 44: IL-15 M1

001 A WVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTES N VHPSCKVTAM KCFLL G LQ R I SLESGDASIH 060

061 DTVENLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114

서열번호 45: IL-15 M2

001 G WVNVISDLK KIEDLIQSMH IDATLYTES N VHPSCKVTAM KCFLL G LQ R I SLESGDASIH 060

061 DTV Q NLIILA NNSLSSNGNV TESGCKECEE LEEKNIKEFL QSFVHIVQMF INTS 114

서열번호 46: hCl1a VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSS

서열번호 47: hCl1a VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIK

서열번호 48: hCl1a HC 노브 (Knob)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 49: hCl1a HC 홀 (Hole)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 50: hCl1a HC 노브 RLI2 NA

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 51: PD1-IL2v HC1: HC with IL2v (Fc 노브, LALAPG), IL2v.T3A.F42A.Y45A.L72G.C125A

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSAPASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

서열번호 52: PD1-IL2v HC2: HC (Fc 홀 LALAPG)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP

서열번호 53: PD1-IL2v LC

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 54: mPD1-IL2v HC1: mPD-1.VH-h1.HC.D265A.E356K.N399K.dk-IL2v.T3A.F42A.Y45A.L72G.C125A 뮤린 항PD-1 (mIgG1 D265A HC1 - IL-2v)

EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMGYINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTTPFTYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPAPASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

서열번호 55: mPD1-IL2v HC2: mPD-1.VH-h1.HC.D265A.K409E.K439D.dk murine antiPD-1 (mIgG1 D265A HC2)

EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNWIRKFPGNRLEWMGYINSAGISNYNPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTTPFTYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTDGSYFVYSELNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEDSLSHSP

서열번호 56: mPD1-IL2v LC: mPD-1.VL-hk.LC 뮤린 항PD-1 (mIgG1 경쇄)

서열번호 57: hPD-1-IL15 (M1) HC1: xhPD-1.VH-h1.HC.L234A.L235A.G237A.T366S.L368A.Y407V.dk-IL15m1.N1A.D30N.E46G.V49R

항-인간 PD-1 (Fc LALA KiH 홀 - IL-15m1)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSITNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLTTGTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGG A WVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTES N VHPSCKVTAMKCFLL G LQ R ISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 58: hPD-1-IL15 (M1) HC2: xhPD-1.VH-h1.HC.L234A.L235A.G237A.T366W.dk 항-인간 PD-1 (Fc LALA KiH 노브)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSITNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLTTGTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호 59: hPD-1-IL15 (M1) LC: xhPD-1.VL-hk.LC 항-인간 PD-1 (경쇄)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLWDSGNQKNFLTWYQQKPGKAPKLLIYWTSYRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNDYFYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 60: hPD-1-IL15 (M2) HC1: xhPD-1.VH-h1.HC.L234A.L235A.G237A.T366S.L368A.Y407V.dk-IL15m1.N1G.D30N.E46G.V49R.E64Q

항-인간 PD-1 (Fc LALA KiH 홀 - IL-15m2)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWINWVRQAPGQGLEWMGNIYPGSSITNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLTTGTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSGGGGSGGGGSGGGG G WVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTES N VHPSCKVTAMKCFLL G LQ R ISLESGDASIHDTV Q NLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 61: hPD-1-IL15 (M2) HC2: xhPD-1.VH-h1.HC.L234A.L235A.G237A.T366W.dk 항-인간 PD-1 (Fc LALA KiH 노브)

서열번호 62: hPD-1-IL15 (M2) LC: xhPD-1.VL-hk.LC 항-인간 PD-1 (경쇄)

서열번호 63: 캐드몬(Kadmon) HC1: 2-8 S354C/T366W LALAPG 개선 링커

ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPS

LKCIRDPALVHQRPAPPSGGGGSGGGGSGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDA

TLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVESLIILANNSLSSNGNVTES

GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG

SEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY

YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWVDVWGQGTTVTVSSAS

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL

YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPS

VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST

YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT

KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호 64: 캐드몬 HC2: 서열번호 223: 1-4 Y349C/T366S/L368A/Y407V LALAPG

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYY

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPLQWVDVWGQGTTVTVSSAST

KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY

SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY

RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTK

NQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

서열번호 65: 캐드몬 LC: 서열번호: 219 - 38B2:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPS

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSFPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT

LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 66: mSOT202 HC 노브

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 67: mSOT202 HC 홀

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG

서열번호 68: mSOT202 LC

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIFSVKRLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGSNFPLTFGQGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

서열번호 69: mSOT202 LALAPG HC 노브

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNAAGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLGAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 70: mSOT202 LALAPG HC 홀

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINTYTGKPTYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAVFYGYTMDAWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNAAGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLGAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG

서열번호 71: mSOT202 아이소타입 HC 노브

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYAMSWIRQTPENRLEWVASINIGATYAYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMSSLGSEDTAMYYCARPGSPYEYDKAYYSMAYWGPGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEKEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLKSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 72: mSOT202 아이소타입 HC 홀

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYAMSWIRQTPENRLEWVASINIGATYAYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMSSLGSEDTAMYYCARPGSPYEYDKAYYSMAYWGPGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSELRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTDSFSRTPG

서열번호 73: mSOT202 아이소타입 LC

DVQMTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDIKNYLNWYQQKPGGTVKLLIYYSSTLLSGVPSRFSGRGSGTDFSLTITNLEREDIATYFCQQSITLPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

서열번호 74: mSOT202 아이소타입 LALAPG HC 노브

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYAMSWIRQTPENRLEWVASINIGATYAYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMSSLGSEDTAMYYCARPGSPYEYDKAYYSMAYWGPGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNAAGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLGAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEKEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLKSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSGGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

서열번호 75: mSOT202 아이소타입 LALAPG HC 홀

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYAMSWIRQTPENRLEWVASINIGATYAYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMSSLGSEDTAMYYCARPGSPYEYDKAYYSMAYWGPGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNAAGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLGAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSELRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTDSFSRTPG

서열번호 76: RLI-15 _AQ 펩타이드

ELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNAQV

서열번호 77: RLI-15 _AQA 펩타이드

ELQVISLESGDASIHDTVEALIILANNSLSSNAQV

서열번호 78: RLI-15 NA 펩타이드

VEALIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEK

서열번호 79: RLI-15 _AQA 펩타이드

VEALIILANNSLSSNAQVTESGCKECEELEEK

본 발명은 다음의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명된다:

1. 성숙한 인간 IL-15 (interleukin-15)의 G78 위치 및 N79 위치에서 아미노산 치환 (amino acid substitutions)을 포함하는 인터루킨-15 (IL-15) 변이체 (variant).

2. 서열번호 3을 포함하는 IL-15 변이체.

3. 실시예 1 또는 실시예 2의 IL-15 변이체로서, 상기 IL-15 변이체는 글리코실화된다.

4. 실시예 1-3 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체로서, 상기 IL-15 변이체의 글리코실화가 글리코실화된 성숙 인간 IL-15와 비교하여 감소되는 IL-15 변이체.

5. 실시예 1 내지 4 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체로서, 상기 IL-15 변이체의 글리코실화는 성숙 인간 IL-15의 글리코실화와 비교하여 IL-15 변이체의 N71에서 증가된다.

6. 실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체, 상기 IL-15 변이체는 포유류 세포에서 IL-15 변이체를 코딩하는 핵산의 발현에 의해 얻어진다.

7. 실시예 6의 IL-15 변이체로서, 포유류 세포는 CHO 세포이다.

8. 실시예 1 내지 7 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체로서, 상기 IL-15 변이체가 성숙 인간 IL-15에 비해 증가된 동질성을 나타낸다.

9. 실시예 1 내지 8 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체로서, 상기 IL-15 변이체는 본 명세서 상에 기술된 바와 같이 IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γ_c 수용체 및/또는 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 아미노산 치환체를 추가로 포함한다.

10. 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체로서, 상기 IL15 변이체는 G78A 및 N79Q를 포함한다.

11. 실시예 1 내지 10 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에서 IL-15 변이체의 30% 미만, 바람직하게는 25% 미만이 글리코실화되어 있는 조성물.

12. 실시예 1-11 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에서 IL-15 변이체의 15% 이상 및 25% 미만이 N71에서 글리코실화되어 있는 조성물.

13. 실시예 11 또는 12의 조성물로서, 상기 조성물은 성숙한 인간 IL-15를 포함하는 조성물과 비교하여 증가된 균질성을 나타낸다.

14. 실시예 11 내지 12 중 어느 하나의 실시예의 조성물로서, 상기 조성물은 성숙한 인간 IL-15를 포함하는 조성물과 비교하여 보다 균일한 글리코실화 패턴을 나타낸다.

15. 실시예 1-10 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체 및 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 그 유도체를 포함하는 접합체.

16. 실시예 1-10 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체 및 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 그 유도체를 포함하는 융합 단백질.

17. 실시예 1 내지 10 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체, 실시예 15의 접합체 또는 실시예 16의 융합 단백질 및 항체 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 면역 사이토카인.

18. 실시예 17의 면역 사이토카인으로서, 상기 항체는 본 명세서 상에 기재된 항체 또는 이의 기능적 변이체이다.

19. 실시예 17의 면역 사이토카인으로서, 상기 항체는 면역 조절 항체 또는 이의 기능적 변이체이며, 바람직하게는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 대한 지시 항체 또는 이의 기능적 변이체이다.

20. 실시예 1 내지 10 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체, 실시예 15의 접합체, 실시예 16의 융합 단백질 또는 실시예 17 내지 19 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인을 암호화하는 핵산.

21. 실시예 20의 핵산을 포함하는 벡터.

22. 실시예 20의 핵산 또는 실시예 21의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

23. 실시예 1-10 중 어느 하나의 실시예의, 실시예 15의 접합체, 실시예 16의 융합 단백질 또는 실시예 17-19 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인의 IL-15 변이체를 제조하는 방법.

24. 치료에 사용하기 위한 실시예 1-10 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체, 실시예 15의 접합체, 실시예 16의 융합 단백질 또는 실시예 17-19 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인.

25. 종양성 질환 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 실시예 1 내지 10 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체, 실시예 15의 접합체, 실시예 16의 융합 단백질 또는 실시예 17 내지 19 중 어느 하나의 실시예의 면역 사이토카인.

26. 서열번호 9 또는 서열번호10을 포함하는 폴리펩타이드.

본 발명은 다음의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명된다:

2. 실시예 1의 IL-15 변이체, 상기 IL-15 변이체는 아미노산 치환체 G78A, G78V, G78L 또는 G78I, 및 N79Q, N79H 또는 N79M, 바람직하게는 G78A 및 N79Q를 포함한다.

3. 실시예 1 또는 실시예 2의 IL-15 변이체로서, 상기 IL-15 변이체는 포유류 세포주 (mammalian cell line)에서 발현된 것으로서, 바람직하게는 포유류 세포주는 CHO 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, SP20 세포, NSO 세포 또는 이들로부터 유래된 임의의 세포로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 CHO 세포로부터 선택된다.

4. 실시예 1 내지 3 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 상기 아미노산 치환은

(a) 성숙한 인간 IL-15와 비교하여 IL-15 변이체의 N77에서의 탈아미드화 및 N79에서의 글리코실화 (glycosylation)를 감소시키고,

(b) 30 % 미만의 글리코실화된 IL-15 변이체, 바람직하게는 25 % 미만의 글리코실화된 IL-15 변이체를 초래하며, 및/또는,

(c) 성숙한 인간 IL-15와 비교하여 IL-15 변이체의 N71에서 글리코실화를 증가시키는 IL-15 변이체.

5. 실시예 1 내지 4 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 상기 아미노산 치환은 Kit225 세포, 32Db 세포, 인간 PBMC 또는 프로메가 IL-15-생물학적 분석 (Promega IL-15-bioassay)의 증식 유도에 대한 IL-15 변이체의 IL-15 활성을 실질적으로 감소시키지 않는다.

6. 실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 상기 IL-15 변이체는 위치 N71 및/또는 위치 N77에 치환을 가지지 않는다.

7. 실시예 1 내지 6 중 어느 하나의 실시예에 있어서, 상기 IL-15 변이체는 IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γ_c 수용체 및/또는 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 추가 치환을 추가로 포함한다.

8. 실시예 7의 IL-15 변이체에 있어서,

(a) IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γ_c 수용체에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환을 위한 사이트는 N1, N4, S7, D8, K10, K11, D30, D61, E64, N65, L69, N72, E92, Q101, Q108 및 I111로 이루어진 목록에서 선택되며, 바람직하게는 D61, N65 및 Q101, 가장 바람직하게는 N65로 이루어진 목록 중에서 선택되고;

(b) IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환은 N1D, N1A, N1G, N4D, S7Y, S7A, D8A, D8N, K10A, K11A, D30N, D61A, D61N, E64Q, N65D, N65A, N65E, N65R, N65K, L69R, N72R, Q101D, Q101E, Q108D, Q108A, Q108E, 및 Q108R로 이루어진 목록에서 선택되고;

바람직하게는 D8A, D8N, D61A, D61N, N65A, N65D, N72R, Q101D, Q101E 및 Q108A로 이루어진 목록에서 선택되고,

보다 바람직하게는 D61A, N65A 및 Q101로 이루어진 목록에서 선택되고, 가장 바람직하게는 N65A; 또는

(c) IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환은 결합 치환 (combined substitution)이며, D8N/N65A, D61A/N65A 및 D61A/N65A/Q101D로 이루어진 목록에서 선택된다.

9. 실시예 7의 IL-15 변이체에 있어서,

(a) IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환을 위한 사이트는 L44, L45, E46, L47, V49, I50, S51, E64, L66, I67, I68 및 L69로 이루어진 목록에서 선택되고,

(b) 상기 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환은 L44D, E46K, E46G, L47D, V49D, V49R, I50D, L66D, L66E, I67D 및 I67E로 이루어진 목록에서 선택되거나, 또는

(c) IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환은 E46G/V49R, N1A/D30N/E46G/V49R, N1G/D30N/E46G/V49R/E64Q, V49R/E46G/N1A/D30N 및 V49R/E46G/N1G/E64Q/D30N로 이루어진 목록에서 선택된다.

10. 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체를 포함하는 접합체.

11. 실시예 10의 접합체로서, 상기 접합체는 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 이의 유도체를 추가로 포함한다.

12. 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체를 포함하는 융합 단백질.

13. 실시예 12의 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 이의 유도체, 표적화 모이어티 (targeting moiety) 및/또는 반감기 연장 모이어티 (a half-life extending moiety), 및 선택적으로 하나 이상의 링커를 추가로 포함한다.

14. 실시예 13의 융합 단백질에 있어서, 상기 융합 단백질은 바람직하게는 N- 내지 C- 말단 순서로 인간 IL-15Rα 스시 도메인, 링커 및 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체를 포함하며,

바람직하게는, 인간 IL-15Rα 스시 도메인은 서열번호 5의 서열을 포함하고, 링커는 18 내지 22 아미노산 길이를 가지며, 링커는 세린 (serine) 및 글리신 (glycine)으로 구성되고, 및

더욱 바람직하게는 상기 융합 단백질은 서열번호 9 또는 서열번호 10이다.

15. 실시예 12 내지 14 중 어느 하나의 실시예의 융합 단백질에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 바람직하게는 종양 항원 (tumor antigen), 종양 세포외 기질 항원 (tumor extracellular matrix antigen), 또는 종양 혈관신생 항원 (tumor neovascularization antigen), 또는 면역조절 항체 (immunomodulatory antibody)이다.

16. 실시예 15의 융합 단백질에 있어서, 상기 융합 단백질은 항체의 적어도 하나의 중쇄 (heavy chain)의 C-말단 또는 항체의 두 경쇄 (light chains)의 C-말단에 융합된다.

17. 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체, 실시예 10 또는 11 중 어느 하나의 실시예의 접합체, 또는 실시예 12 내지 16 중 어느 하나의 실시예의 융합 단백질을 코딩하는 핵산.

18. 실시예 17의 핵산을 포함하는 벡터.

19. 실시예 17의 핵산 또는 실시예 18의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

20. 치료에 사용하기 위한 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체, 실시예 10 또는 11 중 어느 하나의 실시예의 접합체, 또는 실시예 12 내지 15 중 어느 하나의 실시예의 융합 단백질, 실시예 17의 핵산 또는 실시예 18의 벡터.

21. 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체, 실시예 10 또는 11 중 어느 하나의 실시예의 접합체, 또는 실시예 12 내지 15 중 어느 하나의 실시예의 융합 단백질, 실시예 17의 핵산 또는 실시예 18의 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.

22. 신생물학적 질환 (neoplastic disease) 또는 감염성 질환 (infectious disease)을 앓고 있거나, 발생 위험 및/또는 진단받은 대상의 치료에 사용하기 위한 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 실시예의 IL-15 변이체, 실시예 10 또는 11 중 어느 하나의 실시예의 접합체, 또는 실시예 12 내지 15 중 어느 하나의 실시예의 융합 단백질, 실시예 17의 핵산 또는 실시예 18의 벡터.

실시예

1. 발현 및 정제, 일반 재료 및 방법

RLI2(RLI2 wt), G78A이 치환된 RLI2 (RLI2 A) 및 G78A/N79Q이 치환된 RLI2 (RLI2 AQ)를 CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고 상층액 해동 (supernatant thawing), 농축 (concentration) 및 여과 (diafiltration), 선택적 정화 (optional clarification), Q-세파로스 크로마토그래피 단계 (Q-sepharose chromatography step), 페닐-세파로스 크로마토그래피 단계 (phenyl-sepharose chromatography step), 버퍼 교환(투석)(buffer exchange (dialysis)) 및 농축 (concentration)을 통해 상층액에서 정제하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다:

TFF1에 의한 농축 및 투과 여과

해동 후, 멸균 여과된 CHO 상청액 (RLI2 wt의 경우 875 mL 또는 돌연변이의 경우 약 2800 mL)을 농축하고 버퍼 교환을 위해 한외 여과하였다. CHO 상청액을 2.5배 (RLI wt의 경우) 또는 약 5.5배 (RLI 돌연변이의 경우)로 농축하고 약 7용량 (7 volumes)의 한외 여과 완충액으로 완충액 교환을 위한 한외 여과 (완충액 25mM Tris-HCl pH7.5 사용)를 수행하였다. 필요한 경우 이 물질을 20 ℃에서 30분간 15,000g으로 원심분리하여 정화한 다음 0.45μm PES 멤브레인 필터와 0.22μm PES 멤브레인 필터로 여과하고 즉시 Q-세파로스 레진 (Q-sepharose resin)에 주입하였다.

Q-세파로스 수지(AEX)에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 캡처

각 한외여과된 CHO 상청액을 200cm/h (50.7mL/min, 체류 시간 3분)로 150mL 컬럼의 Q-세파로스 (직경 44mm, 베드 높이 10cm)에 로딩한 후 완충액 B (25mM Tris HCl pH 7.5, 1M NaCl)에서 사전 평형화시킨 다음 완충액 A (25mM Tris HCl pH 7.5)로 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼을 동일한 유속으로 10 CV의 완충액 A로 세척하였다. 단백질은 염 농도가 증가함에 따라 컬럼에서 용출되었다. 먼저 0%에서 25% 버퍼 B (25mM Tris HCl pH 7.5, 1M NaCl)로 15 CV 선형 구배 (linear gradient)를 적용한 다음, 25% 버퍼 B에서 5 CV 단계(1단계)와 100% 버퍼 B에서 10 CV 단계(2단계)를 적용하였다. 마지막으로 버퍼 A로 10 CV 재보정 단계를 적용하고 280nm에서 UV 신호로 정제를 수행하였다.

선형 구배에서 용출물을 분획하여 10개의 첫 번째 CV에 대해 40mL 분획으로 수집한 다음 5개의 CV를 F5 분획으로 수집하였다. 250mM NaCl, 1M NaCl에서 단계 및 재평형은 각각 F6, F7 및 F8 분획에서 수집되었다. 용출 풀을 결정하기 위해 정제 분획을 SDS-PAGE 및 항-RLI 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

페닐-세파로스 수지에서 소수성 크로마토그래피에 의한 정제

각각의 Q-세파로스 용출 풀 (Q-sepharose elution pool)은 62.5% 버퍼 A (25mM 삼염소산 염소산염 pH 7.5)와 37.5% 버퍼 B (25 mM Tris-HCl pH 7.5; 2 M 황산암모늄)를 혼합하여 사전 평형화시킨 후 100 mL 페닐-세파로스 컬럼 (직경 32mm, 베드 높이 12.4cm)에서 750mM 황산암모늄까지 버퍼 B (25mM Tris-HCl pH 7.5; 2M 황산 암모늄)에 1.6배 온라인 희석 (1.6-fold online dilution)하여 149cm/h (20mL/min; 체류 시간 5분)로 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼을 동일한 유속에서 62.5% 버퍼 A/37.5% 버퍼 B 혼합물 5 CV로 세척하였다. 단백질은 염 농도가 감소함에 따라 컬럼에서 용출되었다. 37.5%에서 0% 버퍼 B로 20 CV 선형 그라데이션을 적용한 다음 100% A에서 5 CV 단계를 적용하였다 (2단계). 마지막으로, 스트리핑을 위해 버퍼 C (이소프로판올 30%, 3단계)로 5 CV 스텝을 적용하였다. 이어서 280nm에서 UV 신호로 정제하였다. 선형 구배에서 용출한 것을 분별하여 40mL 분획으로 수집하였다. 용출 풀을 결정하기 위해 정제 분획을 SDS-PAGE 및 항-RLI 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

배합 단계: TFF를 통한 농축 및 한외 여과

페닐-세파로스 용출 풀을 2.6 내지 4.4배율로 농축하고 적어도 7 용량의 한외 여과 완충액을 사용하여 완충액 교환을 위한 한외 여과 (제제 완충액 20mM L-히스티딘, 6% D-소르비톨, pH 6.5 사용)를 수행하였다. 그런 다음 이 물질을 10kDa 컷오프를 사용하여 Vivaspin 장치에 즉시 농축하여 최종 목표 농도에 도달하였다.

농축

한외 여과된 샘플은 10kDa 컷오프가 있는 비바스핀 장치를 사용하여 농축하였다. 농축은 이론적 농도인 1mg/mL에 도달할 때까지 수행하였다.

kit225의 역가 분석

IL-2와 IL-15의 활성은 Hori et al. (1987)이 설명한 대로 kit225 세포의 증식 유도를 통해 확인할 수 있다. kit225 세포 (Hori, Uchiyama et al. 1987)를 kit225 기본 배지에서 통과시키고 4 내지 7번 통과에서 효능 분석에 사용하였다. 효능 분석 전, kit225 세포를 IL-2가 없는 kit225 기본 배지에서 24시간 동안 배양하였다(공복 기간). 1x10⁴ kit225 세포를 96웰 플레이트에 플레이트하고 RLI-15와 각 분자인 PEM-RLI-15의 직렬 희석액을 세포에 첨가하였다. 세포를 37 ℃, 5% CO₂에서 72±3시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰에 10μl (웰 내 부피의 10%)의 알라마르 블루를 첨가하고 6시간 후 Tecan Spark 흡광도 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 620 nm 기준으로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다(15초 동안 검출 전에 혼합을 설정). 일부 경우, 효능이 낮은 RLI2 돌연변이를 테스트할 때 kit225 세포를 사용한 배양 기간을 3일(72시간 ± 3시간)에서 5일로 연장하였다.

바람직하게는, 예를 들어 CTLL-2 세포를 사용하여 소만 등이 설명한 것처럼, 비색법 또는 형광과 같은 방법을 사용하여 IL-2 또는 IL-15 자극에 의한 증식 활성화를 측정하였다 (Soman, Yang et al. 2009). kit225 세포와 같은 세포주의 대안으로 인간 말초혈액 단핵세포 (human peripheral blood mononuclear cells, PBMC) 또는 버피코트 (buffy coats)를 사용할 수 있다. IL-2 또는 IL-15의 활성을 측정하는데 선호되는 바이오 분석법은 STAT5-RE CTLL-2 세포를 사용하는 IL-2/IL-15 바이오 분석 키트이다 (Promega 카탈로그 번호 CS2018B03/B07/B05).

분석된 RLI 변이체의 농도는 다음과 같다:

RLI2 상청액. 0.133 mg/ml (ELISA, 2개 실험 평균)

RLI2_AQ 상청액. 0.0297 mg/ml (ELISA, 2개 실험 평균)

RLI2의 특성

순도(RP-UPLC) 99.8%

제형20mM 히스티딘, 6%(w/v) 소르비톨, pH 6.5

보관 온도 -20℃

Kit225 베이스 미디엄

플라스크 (75cm2)에 RPMI (460mL) + FBS (30mL) + 글루타맥스 (5mL) + 페니실린-스트렙토마이신 (5mL) + 사이토카인, IL-2 (5ng/mL)를 첨가하였다. 사이토카인은 배양 직전에 배지에 첨가하였다.

hPBMC 효능 분석

건강한 기증자로부터 버피 코트를 얻었다. PBMC를 Ficoll Paque 게이지로 분리하고 세 번 세척한 후 96웰 플레이트의 T세포 완전 배지에 다시 현탁하였다. 면역 사이토카인을 표시된 농도로 첨가하고 37℃에서 5% CO₂로 7일간 배양하였다. 면역 세포 집단의 증식을 유세포 분석법으로 검출하였다.

T 세포 완전 배지

RPMI 1640 배지, CTS 글루타맥스 - I 1X, 페니실린-스트렙토마이신 100 U/mL, 피루브산 나트륨 1mM, NEAA 1X (비필수 아미노산 혼합물), 2-메르캡토에탄올 (2-Mercaptoethanol) 0.05mM 및 10% AB 인간 혈청 (열 불활성화).

사용된 항체 목록

인간 NK 세포(hNK) 분리 : 건강한 기증자로부터 채취한 신선한 혈액을 차가운 PBS-EDTA, ph7.4로 1:1 비율로 희석하고 Ficoll-Paque 구배 분리를 통해 PBMC를 분리하였다. 분리된 PBMC를 완전한 배양액에 재부유시켰다. 제조업체 지침에 따라 EasySep 인간 NK 세포 분리 키트 (미국 스템셀 테크놀로지스, 미국)를 사용하여 PBMC에서 hNK 세포를 분리하였다. 각 기증자로부터 분리한 hNK 세포를 10% 혈청을 함유한 NK 배지에 3 x 10⁶ 세포/ml 농도로 재부유시켰다.

PD-1/PD-L1 차단 생물학적 분석법

분석은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다 (Promega PD-1/PD-L1 차단 바이오 분석 J1250). 간단히 말해서, PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포를 96 웰 플레이트에 플레이트하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 16 내지 20시간 배양하였다. 그 후 표시된 농도의 PEM-RLI 면역 사이토카인과 PD-1 이펙터 세포를 세포에 추가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 배양 기간이 끝나면 Bio-Glo™ 시약을 웰에 첨가하고 실온에서 15분간 배양한 후 발광 측정을 수행하였다.

시노몰구스 원숭이 연구

1일차 또는 15일차에 표시된 용량을 투여한 후 시노몰구스 원숭이 (cynomolgus monkeys)(n=2-3)를 대상으로 표시된 PEM-RLI 분자의 약동학을 테스트하였다. 혈청 분리를 위한 혈액은 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간, 120시간 및 168시간에 채취하였다 (일부 시점은 생략되었을 수 있음). 혈청 내 면역 사이토카인의 농도는 표 3의 항체를 사용하여 ELISA로 측정하였다. 선택된 면역 세포 집단(NK 및 CD8⁺ T 세포)의 유세포 분석 평가를 위해 투여 전, 투여 5일, 8일, 12일, 15일, 19일, 22일 및 26일에 혈액을 채취하였다.

표 3: 시노몰구스 원숭이 연구에 사용된 항체 목록

사용된 항체 목록 (Tscm 세포 패널)

마우스 효능 연구

이 연구의 목적은 암컷 hPD1 단일 KI HuGEMM 마우스 (C57BL/6-Pdcd1em1(hPDCD1) /Smoc)의 HuCell MC38-hPD-L1 종양 세포주 치료에서 단일 요법으로서 PEM-RLI2 NA x1 및 펨브롤리주맙의 생체 내 치료 효능을 평가하는 것이다 (그룹당 n=8 마우스). 종양 발생을 위해 각 마우스의 우측 아래 옆구리 부위에 MC38-hPD-L1 종양 세포(1×10⁶)를 0.1 ml의 PBS에 담아 피하 접종하였다. 평균 종양 크기가 108 mm³에 도달하면 무작위 배정이 시작되었다. 40마리의 마우스가 연구에 등록되었다. 모든 동물은 5개의 연구 그룹에 무작위로 배정되었다. 무작위 배정은 "일치 분포" 방법 (StudyDirectorTM 소프트웨어, 버전 3.1.399.19)에 따라 수행되었다. 무작위 배정일은 0일 (D0)로 표시하였다. 종양 세포 접종 후, 동물의 이환율과 사망률을 매일 (또는 연구 책임자의 재량에 따라 필요에 따라 더 자주) 확인하였다. 종양 부피는 캘리퍼 (calliper)를 사용하여 주당 3회 2차원으로 측정했으며, 부피는 다음 공식을 사용하여 mm³로 표현하였다: "V = (L × W × W)/2, 여기서 V는 종양 부피, L은 종양 길이 (가장 긴 종양 치수), W는 종양 너비 (L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다. 0일째에 PEM-RLI2 NA x1을 20 mg/kg으로 정맥 투여하고 0, 3, 6, 9일째에 펨브롤리주맙을 5 mg/kg으로 IP 투여하였다. 18일 동안 종양을 관찰하였다. 이와 동시에, 0일째인 5일, 10일에 PEM-RLI2 NA x1(IL-15, N65A 및 AQ 돌연변이)을 정맥 내로 투여하였다. 6일 동안 종양을 관찰하였다.

혼합 림프구 반응

버피 코트는 건강한 기증자로부터 얻었다. PBMC를 Ficoll Paque 게이지로 분리하고 세 번 세척하였다. PBMC를 Ficoll Paque 게이지로 분리하고 세 번 세척하였다. 한 쌍의 hPBMC 기증자를 등가 농도의 펨브롤리주맙과 PEM L-RLI NA x1을 1 nM에서 6일 동안 배양하였다. 세포 상청액에서 IFNγ 생성을 인간 IFN-γ DuoSet ELISA(R&D systems, No. DY258B)를 사용하여 측정하였다. 데이터는 IFNγ 생산의 상대적 반응[%]으로 표시되며 -12쌍의 hPBMC 건강한 기증자로부터의 평균 ± SEM을 나타내었다.

2. SDS-PAGE 및 anti-RLI 웨스턴 블롯 분석

실시예 1에서 정제된 단백질을 SDS-PAGE 및 항-RLI 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

쿠마시 염색: 변성된 상태의 분자량에 따라 단백질 밴드가 시각화된다.

간단히 말해서, 분석할 시료 3부피에 1부피의 로딩 버퍼 (베타 메르캅토에탄올 포함 또는 미포함)를 첨가하고 (1X 로딩 버퍼로 다소 희석), 균질화하여 95℃에서 5분간 변성시켰다. 변성된 샘플을 Criterion TGX 겔에 로드하고 1X TGS 버퍼에서 겔 유형에 따라 18분 또는 21분 동안 일정한 전압 (300V)과 제한된 전류 (겔당 75mA 또는 135mA)로 흐르는 버퍼에서 실행하였다. 젤을 카세트에서 꺼내 물로 5분간 3회 세척하고, 바이오세이프 염색 용액 (Biorad)으로 20분간 염색하고, 물로 20분간 3회 세척한 후 물로 3시간 동안 최종 염색 제거 세척을 하였다. 그런 다음 염색된 젤을 젤 스캐너로 스캔하였다.

웨스턴 블롯 분석: 젤을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮긴 다음 다른 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 이동이 끝나면 젤은 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 단백질을 옮기는데 사용된다. 참조 예시 (Biorad#170-4155, Trans-BlotR Turbo™ 전사 스타터 시스템)의 경우, 전사 파라미터는 2.5 A, 25 V, 7분 (Criterion 겔의 경우) 또는 2.5 A, 25 V, 3분 (Mini-PROTEAN 겔의 경우)이다. iBind™ Flex 용액에서 멤브레인을 포화시킨 후, 항체 배양 및 세척 단계는 iBind 시스템에서 수행된다. 노출 후 완전히 건조되면 분석을 위해 멤브레인을 스캔한다. 사용된 1차 항체는 항 RLI2-PR01 항체 (사이튠, 희석 1:25000)이고, 사용된 2차 항체는 당나귀 항-토끼 IgG-AP 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀로지, 희석 1:5000)이다.

3. 모세관 전기 영동

모세관 전기영동에 의한 단백질 분석은 일정한 전기장에서 체질 매트릭스를 통해 LDS 표지 단백질 변이체를 분리하는 방식에 의존한다. Labchip GXII 기기는 단일 시퍼 미세유체 칩을 사용하여 96웰 플레이트에 로드된 단백질 샘플을 특성화한다. 미세 유체 칩 기술을 통해 단백질 샘플을 분리하고 분석할 수 있다. 레이저 유도 신호 검출 및 분석 후 제공되는 데이터는 래더 및 마커 보정 표준을 사용한 상대적 단백질 농도, 분자 크기 및 순도 백분율이다.

샘플은 최종 농도 35mM에서 DTT의 존재 여부에 관계없이 5μL 샘플과 35μL의 HT 단백질 샘플 버퍼를 혼합하여 변성시켰다. 필요한 경우, 샘플을 HT 단백질 샘플 버퍼에 1mg/mL로 미리 희석하였다. 혼합물을 100 ℃에서 5분간 가열하여 변성을 수행하였다. 그런 다음 70μL의 물을 추가하고 샘플을 2,000g에서 10분간 원심분리하였다. 그런 다음 샘플 (96웰 플레이트에 담긴)을 랩칩 GXII 기기에 로드하여 칩 전송 및 분석을 진행하였다.

표 4: 특성 요약

4. 글리코실화/탈아미드화 돌연변이체

표 5: 글리코실화 및 탈아미드화에 관련된 아미노산 개요

RLI2 분자의 주요 글리코실화 부위는 N176(RLI 넘버링)이고 부위는 N168에 있다. N209에서는 글리코실화가 보이지 않는다. 글리칸은 복잡하고, 주로 바이안테너리 (biantennary)이며, 푸코실화되어 있고, 시알릴화가 거의 없는 G0 내지 G2이다. 세포 배양에서 단백질의 약 40 내지 50%가 글리코실화되며, N168에서 약 5%가 글리코실화되었다. 위에서 설명한 대로 정제하면 RLI2의 약 14 내지 25%가 글리코실화된다. 상기 글리코실화 수준이 다르다고 해서 효능과 안정성에 영향을 미치지는 않으며, 글리코실화 된 RLI2의 반감기가 짧아 약동학에 미치는 영향은 미미하지만, 활성 약리 성분의 이질성은 규제 관점에서 여전히 문제가 되고 있다.

대장균에서 발현되는 IL-15에서 확인된 탈아미드화의 잠재적 핫스팟은 N77(IL-15 번호)/N174(RLI 번호)이다 (Nellis et al. 2012). N79의 N-글리코실화가 N77 탈아미데이션을 부분적으로 방지한다고 설명되었지만 (Thaysen-Andersen et al. 2016), 본 발명자들은 실제로 질량 분석법을 통해 CHO로 발현된 RLI2에서 N77이 탈아미데이션되는 것을 확인했으며, 탈아미데이션이 RLI2 및 RLI 기반 제품의 잠재적 이질성에 대한 실제 문제이므로 탈아미데이션을 피해야 한다는 것을 확인하였다.

도 1A는 (돌연변이가 없는) RLI2 wt가 실제로 약 20 및 25kDa의 두 개의 주요 밴드와 몇 개의 부밴드가 있는 이종 산물 (heterogenous product)이라는 것을 보여주며, 모두 항 RLI2 항체에 면역 반응하며, 따라서 RLI2 단백질의 서로 다른 변형을 나타낸다.

본 출원인은 글루타민을 보전적으로 치환해도 탈아미드화 위험이 해결되지 않았기 때문에 N77의 탈아미드화를 없애고 극성 아미드를 제거하기 위한 확실한 방법으로 돌연변이를 피하고자 하였다. 대신 RLI2 (RLI2 A)의 단일 치환 G78A (IL-15 번호)/G175A(RLI 번호)를 도입하여 N77 위치에서 탈아미드화 가능성을 없앴다. 탈아미데이션의 손실은 쿠마시 염색이나 웨스턴 블롯에서는 보이지 않지만, 탈아미데이션의 손실이 예상되는 cIEF에서는 탈아미데이션 핫스팟 N174의 주요 산성피크 (pI 6.0)가 크게 감소하여 탈아미데이션이 실제로 제거되었음을 확인하였다 (데이터는 표시되지 않음). 또한 PEM-RLI AQ 구조의 질량 분석 결과 탈산화가 전혀 없는 것으로 나타났다 (데이터는 표시되지 않음).

놀랍게도 G78A 돌연변이는 글리코실화가 약간 증가하여 (도 1A 참조, 도 1B에서 더 잘 보임) RLI2 중량에 비해 더 크고 더 많은 글리코실화된 종으로 이어진다. 추가 밴드는 이러한 새로운 글리코실화 패턴을 나타냈다 (도 1B의 점선 상자 3 참조). 또한 RP-UPLC 피크도 약간 이동하였다 (데이터는 표시되지 않음). 탈아미네이션 돌연변이 G78A가 글리코실화에 미치는 영향을 예측할 수 없었기 때문에 이러한 변화된 글리코실화 패턴은 예상치 못한 것이었다.

IL-15의 주요 글리코실화 부위를 막기 위해 도입한 Q (RLI2 AQ, RLI2_AQ)로 N79 (IL-15 번호)/N176(RLI 번호)을 추가로 치환한 결과, 더 큰 종의 RLI2가 현저히 감소하는 것이 관찰되었다 (도 1B의 점선 박스 1 참조). 잔류하는 더 큰 밴드 (도 1B의 실선 박스 2 참조)는 RLI 분자의 약 20%에 해당하는 N71(IL-15 번호)/N168(RLI 번호)의 글리코실화를 나타내는 것으로 보이며, 이는 RLI2 wt 및 RLI2에 비해 약간 증가된 것으로 보였다. 상자 1의 밴드는 N176에서 글리코실화된 RLI2를 나타낼 수 있는 반면, 상자 3의 밴드는 N176 및 N168에서 글리코실화된 RLI2를 나타낼 수 있다. 하지만 상자 3의 밴드는 N176에서 바람직하지 않은 시알산 글리칸 구조로 글리코실화된 RLI2일 수도 있다. 어떤 이론에 얽매이지 않고, N71에서의 이러한 놀라운 글리코실화의 증가는 주요 부위인 N79에서의 글리코실화가 RLI2 wt에서 N71에서의 글리코실화를 입체적으로 방해하고, N79가 변이되면 이러한 방해가 완화되는 것으로 설명할 수 있다.

함께, AQ 치환이 있는 RLI2_AQ 및 이에 따른 IL-15_AQ는 균질성이 매우 개선되고 탈아미드화 위험이 감소한 RLI2 또는 IL-15 변형을 나타낸다.

글리코실화가 RLI 변이체의 생물학적 활성에 미치는 영향/영향을 비교하기 위해, 본 출원인은 부위지향적 돌연변이 유발법 (Stratagene 부위지향적 돌연변이 유발 XL 키트)을 통하여 IL-15의 3개의 잠재적 당화 부위 N71/N79/N160 (RLI의 경우 N168/N176/N209)을 특이적으로 비활성화시켰다. N71을 S로 치환하고, N79를 Q로 치환하고, N160을 S로 치환하여 RLI2_{N168S/N176Q/N209S}및 RLI1_{N168S/N176Q/N209S}를 생성하였다. N79(=RLI의 N176)에서의 주요 N-글리코실화 점유를 확인하기 위해 RLI2N176Q 돌연변이체를 만들었다. CHO 세포에서 일시적으로 발현하면 고유한 25kDa 밴드가 나타났다 (도 2, 우측 패널 참조).

주요 글리코실화 부위에서만 돌연변이를 일으킨 RLI 단백질 (RLI2_N176Q)도 독특한 25kDa 밴드를 나타냈으며, 따라서 CHO에서 발현된 RLI의 N176 잔기에서 주요 글리코실화 점유를 확인하였다 (일시적 발현). 일시적 CHO 세포에서 발현된 탈글리코실화 돌연변이체의 분비 수율은 글리코실화/원형 돌연변이체와 유사하였다. 따라서 탈글리코실화 가 발현 수준에 미치는 영향은 크지 않았다. 이는 피키아 파스토리스 발현 시스템 (Pichia pastoris expression system)에서도 동일하게 관찰되었다 (데이터는 표시되지 않음).

또한, N-글리코실화 부위의 이러한 돌연변이는 kit225 또는 32Dβ 세포에서 RLI의 시험관 내 증식 활성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 반적으로 그렇듯이, 모든 RLI 버전 (RLI1 또는 RLI2, 글리코실화 또는 비글리코실화, CHO 또는 바쿨로 또는 피치아)은 kit225 세포주의 증식을 유사하게 자극하였다.

5. RLI2 _AQ 변이체의 효능

IL-2와 IL-15의 활성은 Hori et al. (1987)이 설명한 대로 kit225 세포의 증식 유도를 통해 확인할 수 있다. kit225 세포 (Hori et al. 1987)를 kit225 기본 배지에서 통과시키고 4 내지 7번 통과하여 효능 분석에 사용하였다. 효능 분석 전, kit225 세포를 IL-2가 없는 kit225 기본 배지에서 24시간 (굶김 기간) 동안 배양하였다. 1x10⁴ kit225 세포를 96웰 플레이트에 플레이트하고 RLI-15와 각 분자인 PEM-RLI-15의 연속 희석액 (serial dilution)을 세포에 첨가하였다. 세포를 37 ℃, 5% CO₂에서 72 ± 3시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰에 10 μl (웰 내 부피의 10%)의 알라마르 블루 (Alamar Blue)를 첨가하고 6시간 후, Tecan Spark 흡광도 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 620 nm 기준과 함께 560 nm에서 흡광도를 측정하였다 (15초 동안 검출 전에 혼합을 설정). 일부 경우, 효능이 낮은 RLI2 돌연변이를 테스트할 때 kit225 세포를 사용한 배양 기간을 3일 (72시간 ± 3시간)에서 5일로 연장하였다.

바람직하게는, 예를 들어, CTLL-2 세포를 사용하여 소만 등이 설명한 것처럼 (Soman et al. 2009) 비색법 또는 형광과 같은 방법을 사용하여 IL-2 또는 IL-15 자극으로 인한 증식 활성화를 확인한다. kit225 세포와 같은 세포주의 대안으로 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 버피코트를 사용할 수 있다. IL-2 또는 IL-15의 활성을 측정하는 데 선호되는 바이오 분석법은 STAT5-RE CTLL-2 세포를 사용하는 IL-2/IL-15 바이오 분석 키트이다 (Promega 카탈로그 번호 CS2018B03/B07/B05).

분석된 RLI 변이체의 농도는 다음과 같다:

RLI2 상청액. 0.133 mg/ml (ELISA, 2개 실험 평균)

RLI2_AQ상청액. 0.0297 mg/ml (ELISA, 2개 실험 평균)

표 6: 32Db 세포 또는 kit225 세포의 활성화에 의해 결정된 상층액의 RLI2_AQ와 비교한 RLI2의 EC₅₀ 값(nM)

표 7: Kit225 세포 증식의 활성화에 의해 결정된 상층액의 RLI2와 RLI2_AQ의 상대적 효능.

따라서 상청액에서 글리코실화 돌연변이체 RLI2_AQ는 상청액에서 추출한 RLI2와 비교했을 때 kit225 및/또는 32Db 세포를 자극하는 효능이 매우 유사하였다. 많은 당단백질에서 글리코실화가 손실되면 활성이 낮아지기 때문에 이는 놀라운 결과이다.

또한 IL-2/IL-15 βγ 수용체에 대한 SPR (바이오코어)의 결합 실험에서도 RLI2와 RLI AQ 간의 k_on 속도, k_off 속도 및 평형 상수 K_d의 관련성이 관찰되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음).

요약하면, AQ가 치환된 RLI2_AQ 및 그에 따른 IL-15_AQ는 균질성이 매우 개선되고 탈아미드화 위험이 감소하며 면역 세포를 활성화하는 효능이 비슷한 RLI2 또는 IL-15 변이체를 나타낸다.

6. 고글리코실화 및 저글리코실화 RLI2의 사이노몰구스 PK/PD 연구

고글리코실화 및 저글리코실화 RLI2의 PK 및 PD 특성을 비교하기 위해 200리터 규모의 생산 캠페인을 실행하고, S0SP 및 X0SP 깊이 필터로 수확한 후 PPA 컬럼에서 단백질을 포획하였다. 바이러스는 용매 세제 처리를 통해 비활성화하고 Capto Adhere 컬럼과 Hydroxyapatite type II 컬럼 (플로우 스루 모드)을 통해 정제를 계속한 후 나노여과를 통해 두 번째 바이러스 제거 단계를 거쳤다. RLI 제제를 Capto Impres 페닐 컬럼(CPI 페닐 HIC)에서 연마하고 고글리코실화된 RLI2에 대해 선택된 분획을 풀링 (RLI-15-HG)하고 저글리코실화된 RLI2에 대해 선택된 분획을 풀링 (RLI-15-LG)하였다 (도 5A 내지 C 참조). 마지막으로, 최종 제형 완충액 (20mM 히스티딘, 6% 소르비톨 pH6.5)으로 10kDa 컷오프 UF 멤브레인에서 UFDF 여과를 수행하였다. RLI-15-HG는 글리코실화된 RLI 이성질체의 상단 밴드에서 대부분의 RLI를 보여주는 반면, RLI-15-LG는 글리코실화된 RLI 이성질체의 작은 부분만 포함한다 (도 5B 및 C).

총 3마리의 수컷과 3마리의 암컷 시노몰구스 원숭이가 PK/PD 연구에 포함되었다. 동물은 교차 투여 설계에 따라 매일 피하 투여하여 15μg/kg (보통 용량)의 RLI2를 RLI-15-HG와 RL1-15-LG로 투여하는 두 그룹으로 배정되었다. 투여는 10일의 휴약 기간을 두고 4일씩 2회 (2x4)에 걸쳐 실시하였다 (1일차 내지 4일차: 수컷의 경우 RLI-l5-LG, 암컷의 경우 RLI-15-HG). 15일 내지 18일차: 수컷의 경우 RLI-15-HG, 암컷의 경우 RLI-15-LG). 전 처리 기간에 채취한 혈액 샘플에서 약력학적 파라미터 (NK, CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포의 Ki67 발현 포함)를 분석하였다. 5일째. 12일차 및 19일차. 약동학 조사 (pharmacokinetic investigations)를 위한 혈액 샘플은 각 치료 간격의 첫 투여 후 1일째와 15일째에 모든 동물로부터 투여 전과 투여 후 0.5, l, 2, 6, 12, 24시간 시점에 채취하였다. 바이오 분석이 수행되었다. 또한, 백업 혈청 샘플 (D1(프리도스). D15(투여 전) 및 D16(24시간))을 부분적으로 면역원성 평가(ADA 측정)에 사용하였다.

약동학(PK) 분석은 Phoenix™ WinNonlin® 소프트웨어(버전 6.4. Certara L.P.)에서 비구획 분석을 사용하여 수행하였다.

약동학적 프로파일: 모든 처리된 동물은 1일차 및 15일차 투여 후 샘플링 기간의 대부분에 걸쳐 정량화 가능한 양의 RLI2를 측정하면서 시험 항목에 노출되었다. 주요 약동학 파라미터는 표 8에 요약되어 있다.

표 8: 주요 약동학 매개변수

암컷과 수컷 동물의 C_max 및 AUC_0-t노출량은 차이가 있었다. 암컷은 수컷에 비해 C_max와 AUC_0-t가 약 2배 더 높았다. 이러한 성별 차이와는 무관하게 RLI-15-HG와 RLI-15-LG의 약물동력학에서도 차이가 관찰되었다. 놀랍게도 RLI-15-HG에 의한 노출이 RLI-15-LG에 의한 노출보다 낮았다. 동물의 성별에 관계없이 RLI-15-HG와 RLI-15-LG 사이의 비율은 C_max와 AUC_0-t에 대해 각각 0.606과 0.453이었다.

7. RLI2 _AQ 기반 면역 사이토카인 생성

면역 사이토카인은 항 PD-1 항체/IgG4의 중쇄 C-말단에 링커 없이 두 개의 RLI2_AQ 융합 단백질을 융합하거나, HC 노브 돌연변이 T366W 및 HC 구멍 사슬 돌연변이 T366S/L368A/Y407V가 있는 KIH (Know-in-Hole 기술)를 사용하여 하나의 중쇄 (노브 사슬)에 하나의 RLI2_AQ 융합 단백질이 융합된 곳에서 생성되었다. 항 PD-1 항체는 표 9에 표시된 바와 같이 Fc 돌연변이가 있거나 없는 펨브롤리주맙 (PEM)이다.

표 9: AQ 돌연변이(G175A/N176Q)가 있는 PEM-RLI2 면역 사이토카인은 모두 다음과 같다.

Fc 돌연변이: "L" 또는 "LE" = L235E (추가 ADCC 감소), "Y" 또는 "YTE" = M252Y/S254T/T256E (반감기 연장을 위한 FcRn 결합 증가), LY = L과 Y의 조합. 추가 IL-15 돌연변이: KAQD = K10A/Q101D DA = D61A, NA = N65A, ND = N65D, NQD = D127N/E161Q/N162D (각 면역 사이토카인의 반감기를 늘리기 위해 IL-15/RLI와 IL-2Rβγ의 결합을 감소시킴).

표 9의 면역 사이토카인과 대조군은 실시간 PCR 기기를 사용하여 펼쳐진 단백질에 우선적으로 결합하는 염료의 형광 변화를 측정함으로써 열에 의해 유도된 단백질 변성을 모니터링하는 차등 주사 형광법 (DSF)을 사용하여 용융 온도(Tm)를 측정하여 예측된 안정성을 테스트하였다 (예를 들어: 시프로 오렌지, 단백질의 소수성 영역에 결합하고 물이 형광을 강하게 소멸시키는 염료). 이 실험은 안정화 또는 불안정화 결합 파트너 또는 완충 성분을 첨가할 때 겉보기 용융 온도의 변화를 측정할 수 있기 때문에 단백질 열 이동 분석법이라고도 한다. 간단히 설명하자면, 초순수 (UPW)에 미리 희석한 SYPRO 50X, 단백질 샘플 및 물을 혼합하여 SYPRO 5X의 최종 단백질 농도 5 내지 10μM에서 25μL 반응 샘플을 얻는다. 최종 농도 5배로 희석한 SYPRO를 UPW로만 사용한 음성 대조군과 최종 농도 10μM의 리소자임과 동일한 혼합물을 양성 대조군으로 사용한다. 25μL의 각 혼합물은 PCR 플레이트에서 3중으로 만들어지고 특정 열순환 프로그램이 실행된다. 이 프로그램은 열순환기로 가능한 한 최상의 해상도를 얻기 위해 만들어졌다. 용융 곡선은 20.0℃에서 95.0℃까지 20초마다 0.2℃씩 증가하여 그려진다. 네거티브 컨트롤에서는 형광 신호가 측정되지 않아야 하며, 포지티브 컨트롤에서는 70℃ ± 1℃에서 하나의 피크만 검출되어야 한다. 버퍼 호환성을 결정하기 위해 UPW 대신 버퍼를 사용하여 동일한 제어를 수행하며 동일한 결과가 예상된다. 형광 대 온도 곡선의 미분은 단백질 샘플의 50%가 접힌 상태이고 50%가 펼쳐진 상태인 온도로 정의되는 단백질의 Tm을 결정하는데 사용된다.

RFU: 상대 형광 단위

T: 온도

Tm은 그려진 곡선의 음의 피크에 해당한다. 음의 피크가 여러 개 존재한다는 것은 단백질이 여러 수준의 불안정성을 가지고 있다는 신호이다.

KIH 돌연변이가 존재할 때 1.5℃의 용융 온도 감소가 관찰되었다 (60.1℃ 대 61.6℃, PEM WT). 펨브롤리주맙의 Fc 도메인에서 RLI 결합이 없는 KIH 돌연변이는 항체의 안정성 저하를 유도하였다. 모든 구조에서 69 ℃에서 71 ℃ 사이의 두 번째 용융 온도가 관찰되었다. 이 Tm은 RLI가 결합되지 않은 구조에 존재하므로, 이는 매우 안정적인 PEM 항체 도메인의 변성에 해당한다.

예상대로 IL-15 돌연변이는 테스트된 면역 사이토카인의 용해 온도에 영향을 미치지 않았다.

PEM의 Fc에 존재하는 돌연변이의 함수로서 Tm의 현저한 감소가 관찰되었다. L(LE) 돌연변이는 돌연변이가 없는 구조에 비해 Tm이 0.6 ℃ 내지 1.8 ℃ 감소한 반면, Y(YTE) 돌연변이는 5 ℃ 내지 6.5 ℃ 감소한 것으로 나타났다. 이중 돌연변이 LY는 비돌연변이 구조에 비해 최대 7 ℃에서 9 ℃까지 감소할 수 있기 때문에 두 돌연변이의 효과가 결합된 것으로 보인다. Tm은 PEM-RLI N65A x1의 경우 60 ℃에서 PEM LY-RLI N65A x1의 경우 52 ℃로, 비돌연변이 PEM 구조의 경우 61 ℃에서 PEM LY-RLI N65A x2의 경우 53 ℃로 떨어졌다.

L40 링커 (서열번호 31) 및 동일한 경쇄 (서열번호 34)가 있는 (서열번호 32) 또는 없는 (서열번호 33) 두 중쇄에 융합된 RLI2_AQ를 비교하여 리툭시맙을 기반으로 하는 면역사이토카인을 만들었으며, 이는 유의한 생물학적 차이를 나타내지 않았다 (데이터는 표시되지 않음).

8. 펨브롤리주맙에 비해 혼합 림프구 반응에서 IFN-γ 생성을 향상시키는 PEM L-RLI NAx1 분자

PEM L-RLI N65A x1는 혼합 림프구 반응(MLR)을 사용하여 T세포 활성화와 IFNγ 생성을 향상시킬 수 있는 잠재력을 평가받았다. MLR은 같은 종의 유전적으로 다른 두 개체의 백혈구를 배양하여 세포 아세포 변형, DNA 합성 및 증식을 유도하는 시험관 내 분석법이다. MLR의 생성은 세포 집단의 표면에서 발현되고 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex, MHC)에 의해 코딩되는 동종 결정인자의 비호환성의 결과로 발생한다. 반응을 위해 건강한 기증자로부터 버피 코트를 얻었다. PBMC를 피콜 패크 구배로 분리하고 세 번 세척하였다. 한 쌍의 hPBMC 기증자를 등가 농도의 펨브롤리주맙과 PEM L-RLI-NA x1을 1 nM에서 6일 동안 배양하였다. 세포 상청액에서의 IFNγ 생산은 인간 IFN-γ DuoSet ELISA(R&D systems, No. DY258B)를 사용하여 측정하였다. 데이터는 IFNγ 생산의 상대적 반응[%]으로 표시되며 -12쌍의 건강한 hPBMC 기증자로부터의 평균 ± SEM을 나타낸다.

불일치 인간 PBMC 기증자 쌍을 PEM L-RLI NA x1(1 nM)(N65A 및 AQ 돌연변이가 있는 IL-15)과 함께 배양했을 때 같은 양의 펨브롤리주맙과 비교하여 IFNγ 생산이 증가하였다 (도 6 참조). 데이터는 펨브롤리주맙과 PEM L-RLI NAx1에 대한 12개 기증자 쌍의 평균 ± SE를 나타낸다. 이러한 데이터는 T 세포의 IFN-γ 자극에서 펨브롤리주맙보다 PEM L-RLI NAx1의 우수한 역학적 작용을 시사한다.

9. 마우스 종양 모델에서 항종양 효능을 보이는 PEM-RLI NAx1 분자

이 연구의 목적은 암컷 hPD1 단일 KI HuGEMM 마우스 (그룹당 n=8마리)에 이식된 HuCell MC38-hPD-L1 세포주를 치료할 때 단일 요법으로 PEM-RLI NAx1과 펨브롤리주맙을 시험하여 생체 내 치료 효능을 전임상적으로 평가하기 위한 것이다. 치료는 무작위 배정 0일째에 평균 종양 크기가 108mm³에 도달하면 시작되었다. 0일째에 PEM-RLI NA x1 (IL-15, N65A 및 AQ 돌연변이)을 20 mg/kg으로 정맥 투여하고 0, 3, 6, 9일째에 펨브롤리주맙을 5 mg/kg으로 IP 투여하였다. 18일 동안 종양을 관찰하였다 (도 7A). 이와 동시에, 0일째인 5일, 10일에 PEM-RLI NA x1(N65A 및 AQ 돌연변이가 있는 IL-15)을 정맥 내로 투여하였다. 6일 동안 종양을 관찰하였다 (도 7B).

이 모델에서 PEM-RLI NA x1의 단일 용량은 대조군인 무치료 그룹에 비해 종양 부피를 크게 감소시켰으며 (p-값은 <0.05), 펨브롤리주맙의 다중 용량과 유사하게 감소하였다 (도 7A 참조). 펨브롤리주맙을 여러 번 투여한 경우와 비교하여 1회 투여 후 5 mg/kg의 저용량에서도 종양 감소가 관찰되었다 (도 7B 참조).

10. 체외 효능 감소를 위한 IL-15 뮤테인

IL-2Rβ 및/또는 γ 수용체에 대한 RLI 접합체의 결합과 이에 따른 시험관 내 효능을 감소시키고, RLI2 함유 제품의 이질성을 감소시키기 위해 RLI2 접합체(접합체)의 IL-15 부분에 돌연변이를 도입하였다. 표시된 아미노산 치환은 성숙한 인간 IL-15 서열에서 만들어졌다 (표 10 참조).

표 10: IL-15의 아미노산 치환 및 RLI2의 각 위치

표 11: kit225 세포에 대한 IL-15 변이체를 가진 RLI2 IL-2/IL-15Rβγ 뮤틴의 효능

IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γ에 대한 결합에 영향을 미치는 IL-15 치환을 테스트한 결과, kit225 세포에서 RLI 분자의 효능이 현저히 감소하였다. 단일 돌연변이 N65A가 가장 큰 감소를 보였지만, 삼중 돌연변이 NQD보다는 낮았다. (표 11 참조). 다른 치환은 효능에 약간의 영향만 미쳤다.

표 12: kit225 세포에 대한 RLI-15 뮤틴 (항체와 융합되지 않은 상태)의 효능

또한 항체와 결합하지 않은 상태에서 테스트한 RLI-15 뮤틴의 경우, NA 돌연변이는 kit225 세포에서 EC₅₀으로 측정한 결과 약 2배의 활성 감소를 초래하였다.

11. PD-1 표적 면역 사이토카인의 IL-15 N65A 돌연변이는 kit225 세포에서 효능이 감소됨을 보여준다

항 PD-1 항체 펨브롤리주맙을 기반으로 한 면역 사이토카인은 RLI 분자를 포함하는 다양한 형태로 생성되었다. 펨브롤리주맙은 항체의 Fc 부분에 안정화 S228P 돌연변이가 있는 인간화 IgG4-k 항체이다. 면역 사이토카인에 사용하기 위한 구조를 개선하기 위해 펨브롤리주맙("PEM")의 변형을 테스트하였다. IgG4 항체 계열은 ADCC 활성이 상대적으로 낮은 것으로 알려져 있지만, ADCC를 더욱 감소시키기 위해 L235E 돌연변이 (Alegre et al. 1992)("LE" 또는 짧은 "L")가 도입되었다 (서열번호 28). 면역원성/항약물 항체의 가능성을 제한하기 위해 더 복잡한 ADCC 비활성화 돌연변이는 피했다. 하나 또는 두 개의 RLI2 분자가 PEM 항체의 C-말단에 유전적으로 융합되었다. 동종이합체 PEM 변이체 ("x2")의 경우 각 중쇄에 하나의 RLI2 분자가 융합된 반면, 이종이합체 PEM 변이체 ("x1")는 노브인홀 (KiH) 기술을 사용하여 만들어졌으며 (Elliott et al. 2014), 노브 중쇄에는 ADCC 활성을 감소시키기 위해 추가로 L235E 돌연변이가 있는 T336W 치환체 (서열번호 26)에 하나의 RLI2 분자가 융합된 반면, 홀 중쇄 (RLI2 융합이 없는)에는 추가로 L235E 돌연변이가 있는 T366S/L368A/Y407V 치환체 (서열번호 27)를 포함하였다. RLI2가 중쇄에 융합되었을 때, 제품의 이질성을 줄이기 위해 말단 라이신(K)이 삭제되었다 ("dK"). 또한, 항체의 중쇄에 융합하기 위해 다른 RLI2 뮤틴을 사용하였다. 제품의 이질성을 줄이기 위해 모든 RLI2 분자에 AQ(G78A/N79Q) 치환을 적용했으며, IL-2/IL-15Rβγ에 대한 RLI2의 결합을 감소시키는 다음과 같은 치환을 PEM-RLI 면역 사이토카인에서 테스트하였다: KAQD, DA, NA, ND 및 NQD. 생성된 PEM-RLI 면역 사이토카인은 표 13 왼쪽 열에 나열되어 있다. 예시적인 PEM-RLI 이종이합체 면역 사이토카인 SOT201은 서열번호 22 (HC 노브: IgG4 S228P.L235E)를 사용하여 만들어졌다. T366W.dK-RLI2.N162A.G175A.N176Q - RLI2AQ N162A), 서열번호 23 (HC 홀: S228P.L235E.T366S.L368A.Y407V) 및 서열번호 24(LC)의 염기서열을 사용하여 제조되었다.

제공된 IL-15 치환체를 사용한 여러 동종이합체 또는 이합체 PEM-RLI2AQ 면역 사이토카인의 효능은 RLI2를 표준으로 사용하고 상대 효능을 100%로 설정한 kit225 세포에서 체외 EC50을 측정하여 비교하였다 (표 13). 그래프패드 프리즘 8.4.3을 사용하여 EC50을 계산하였다. 목표는 kit225 세포에서 가장 효능이 낮은 RLI-15의 뮤틴을 식별하는 것이었다. 표시된 결과는 2~5회 실험의 평균이다.

표 13. kit225에 대한 PEM-RLI2 돌연변이의 효능

PEM-RLI-NA x1 내의 RLI2_AQNA는 단일 돌연변이로 IL-2/IL-15Rβγ를 낮추는 가장 강력한 RLI 뮤테인으로 확인되었지만, 아미노산 치환이 3개인 NQD 돌연변이보다 약 10배 더 활성이어서 상대적으로 면역원성 위험이 높다.

12. 시험관 내 kit225 세포에서 HC 또는 LC에 부착된 저효능 PEM-RLI 돌연변이체 평가

돌연변이된 Fc 항체 부분이 있거나 없는 PEM-RLI 면역 사이토카인의 여러 저효능 IL-15 뮤틴 (LE-YTE 또는 짧은 "LY"): Fc 도메인의 ADCC 활성을 감소시키는 IgG4 항체의 EU 번호에 따른 Fc 돌연변이 L235E의 LE; 생체 내 반감기를 향상시키기 위해 FcRn 결합을 향상시키는 것으로 보고된 EU 번호에 따른 Fc 돌연변이 M252Y/S254T/T256E의 YTE)를 참조로 PEM LE/YTE-RLI NA x1과 비교하여 효능을 비교하였다. "Lc" 면역 사이토카인에서는 링커 없이 항체 경쇄의 C-말단에 RLI 접합체가 융합된 반면 (서열 번호 30 및 표시된 IL-15 치환체 DA, NA 및 DANA 참조), 다른 모든 구조는 두 중쇄 중 하나의 C-말단에 RLI 접합체가 융합되어 있다. 시험관 내 효능 테스트는 변경된 프로토콜(장기간 세포 배양)을 적용한 kit225 세포주를 사용하여 수행되었다. 분자의 효능은 EC₅₀으로 평가되었으며, PEM LE/YTE-RLI NA x1 분자와 관련된 상대적 효능으로도 계산되었다. 데이터는 2 내지 4개 실험의 평균을 나타냈다.

표 14: kit225에 대한 PEM-RLI2_AQ 분자의 효능; 경쇄 융합을 위한 Lc

치환체 QDQA(Q101D/Q108A), NQD(D30N/E64Q/N65D), DANA(D61A/N65A) 및 DANAQD(D61A/N65A/Q101D)의 조합은 PEM-RLI 면역 사이토카인 구조의 효능을 더욱 감소시켜 DANAQD 구조에서는 측정할 수 없을 때까지 효능을 감소시켰다. 항체의 경쇄에 융합된 RLI 접합체를 가진 면역 사이토카인은 항체의 중쇄에 동일한 IL-15 돌연변이가 있는 하나의 RLI 접합체만 있는 구조와 비교했을 때 유사한 효능을 보였다.

13. 시노몰구스 원숭이에서 PEM-RLI 면역 사이토카인의 항-약물 항체 분석

표 15에 표시된 계획에 따라 시노몰구스 원숭이에게 0.3 mg/kg의 표시된 PEM-RLI 면역 사이토카인을 투여하였다.

표 15: 시노몰구스 원숭이 PK/PD 연구의 투여 계획

C 그룹의 경우: 투여. 1일차에는 PEM L-RLI2 NA x1을, 15일, 22일, 29일차에는 PEM LY-RLI2 NA x1을 투여한다.

15일째에 채취한 혈청에서 ADA 역가를 측정하고 ELISA로 측정하였다. 중화 항체는 kit225 세포에서 테스트된 PEM-RLI 면역 사이토카인의 혈청 샘플에 의한 STAT5 인산화에 대한 FACS 분석을 통해 측정하였다.

표 16: 50일째에 시노몰구스 원숭이에게 표시된 PEM-RLI 면역 사이토카인을 정맥 또는 SC로 투여한 후 항약물 항체(ADA) 및 중화 항체(NAb)를 측정하였다.

펨브롤리주맙은 시노몰구스 원숭이에서 ADA를 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에 모든 원숭이가 테스트한 면역 사이토카인에 대해 ADA를 생성하고 모든 원숭이가 면역 사이토카인의 항체 부분(αPEM 칼럼)에 반응하는 것으로 나타날 수 있는 ADA를 생성하는 것은 놀라운 일이 아니었다. RLI2_AQNA 단일 치환 (정맥 주사 투여)을 한 두 그룹 모두에서 단 한 마리의 원숭이만이 RLI 부위에 대한 ADA가 발생한 반면, RLI2_AQNQD 삼중 치환을 한 원숭이는 모두 RLI에 대한 ADA를 생성하였다. PEM LY-RLI NA x1 면역 사이토카인의 피하 투여도 모든 원숭이에서 ADA를 발생시켰다.

또한 생성된 ADA가 부분적으로 중화되어 면역 사이토카인의 치료 효능을 잠재적으로 제한할 수 있으며, 특히 여러 번 투여할 경우 더욱 그러하다는 것이 입증되었다. 다시 말하지만, NQD 삼중 치환은 NA 단일 치환(IV)에 비해 열등한 반면, SC 투여는 가장 많은 양의 중화 항체를 생성하였다.

면역 사이토카인의 RLI 부분에 대한 ADA 및 nAB 개발은 원숭이의 약력학적 반응과 상관관계가 있었는데, PEM-RLI2 NQD를 투여한 원숭이 (및 SC 투여 원숭이)는 1일 및 15일 후 자극에 비해 29일 후 림프구 재자극이 현저히 감소한 반면, RLI2_AQ NA 뮤테인으로 정맥 투여된 면역 사이토카인은 여전히 강한 림프구 증식을 보였다(데이터 미표시). 재자극 능력의 상실은 중화 항체 때문일 수 있다.

14. 마우스 종양 모델에서 항종양 효능을 보이는 PEM-RLI NA x1 면역 사이토카인

암컷 hPD-1 단일 KI HuGEMM 마우스 (그룹당 n=8마리)에 이식된 HuCell MC38-hPD-L1 종양 세포주 치료에서 PEM-RLI NA x1 면역 사이토카인의 생체 내 치료 효능을 단독 요법으로서 펨브롤리주맙과 비교하였다. 치료는 무작위 배정 0일째에 평균 종양 크기가 108mm³에 도달했을 때 시작되었다. 0일째에 PEM-RLI NA x1을 20 mg/kg으로 정맥 투여하고 0, 3, 6, 9일째에 펨브롤리주맙을 5 mg/kg으로 정맥 투여하였다. 18일 동안 종양을 관찰하였다. 이와 동시에, 0일째인 5일, 10일에 PEM-RLI NA x1(IL-15, N65A 및 AQ 돌연변이)을 정맥 내로 투여하였다. 6일 동안 종양을 관찰하였다.

이 모델에서 PEM-RLI NA x1은 대조군인 무치료 그룹에 비해 종양 부피를 크게 감소시켰으며 (p-값은 <0.05), 펨브롤리주맙 치료 그룹과 유사하게 종양 부피를 감소시켰다 (도 7 참조). 면역 사이토카인의 경우 펨브롤리주맙과 뚜렷한 차이가 나타나지 않았지만, 면역 사이토카인 1회 주사로 펨브롤리주맙 4회 투여와 유사한 결과를 얻었다는 점에 주목할 필요가 있다. 또한 5mg/kg의 저용량도 비슷한 효과를 보였다. 또한, 마우스는 RLI에 대한 민감도가 약 10배 정도 낮은 것으로 알려져 있기 때문에 이 마우스 모델에서는 PEM-RLI NA x1의 전체 기능을 테스트할 수 없으므로 사람에서의 치료 효과는 더 좋을 것으로 예상된다.

15. 이펙터 기능이 수정된 항-Claudin18.2 hCl1a 항체를 기반으로 한 면역 사이토카인의 ADCC 활성

세포주:

클라우딘 18.2를 과발현하는 인간 세포주 PA-TU-8988S (크리에이티브 바이오어레이, 카탈로그 번호 CSC-C0326) 및 A549(ATCC CCL-185)(A549-Cldn18. 2)를 10% 태아 소 혈청, 2mM 글루타민 (글루타맥스, 깁코), 100mg/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신 (인비트로젠) 및 2ug/ml 푸로마이신 (깁코)이 보충된 DMEM 배지(깁코)에서 배양하였다.

A549 세포를 전기천공을 통해 전위효소 발현 구조체 (pcDNA3.1-hy-mPB), 전위 가능한 전장 huCLDN18.2 (pPB-Puro-huCLDN18.2), 푸로마이신 내성 카세트 및 EGFP를 전달하는 구조체 (pEGFP-N3)와 함께 형질전환 대조군으로 공동 감염시켰다 (Waldmeier et al. 2016). 전기천공 후, 5% CO₂ 대기의 습도 조절 인큐베이터에서 37 ℃의 성장 배지에서 세포를 이틀 동안 회복하도록 하였다. EGFP 발현에 대한 FC 분석을 통해 형질전환을 확인하였다. 그런 다음 푸로마이신을 1 ug/ml로 배양하여 CLDN18.2를 발현하는 세포를 선별하고, 10% DMSO가 포함된 FCS에서 동결 스톡을 생성할 수 있도록 배양액을 더 확장하였다. 감염된 세포에서 CLDN18.2의 발현을 FC로 분석하였다.

보다 균질한 PA-TU-8988S 세포 집단을 얻기 위해 세포를 FACS로 분류하여 CLDN18.2 발현이 더 높은 세포만 선택하였다. 간단히 말해, FACS 버퍼(PBS, 2% FCS)에 현탁된 PA-TU-8988S 세포를 2 ug/ml의 졸베툭시맙과 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. FACS 버퍼로 세척한 후, 세포를 PE-표지된 Fcγ 특이 IgG 염소 항-인간 이차 항체(eBioscience)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 세척 후, 염색된 세포를 FACS 버퍼에 재부유시키고, 분석 및 분류하여 FACSAriaTM 기기로 중간 발현 세포와 고 발현 세포를 분리하였다. 수집된 PA-TU-8988S-고발현 세포(PaTu)를 분류한 후 성장 배지에 재부유하고, 팽창 및 동결된 시료를 액체 N2에 보존하였다.

인간 CD16 (NK92-hCD16, 이하 NK92라고 함)을 외인성 발현하는 인간 NK 세포주 NK92(ATCC CRL-2407)는 Clemenceau et al. (2013)의 설명에 따라 생성되었다. 세포는 10% AB 인간 혈청 (원 람다), 2mM 글루타민 (글루타맥스, 깁코) 및 5mg/ml IL-2 (페프로테크)가 보충된 RPMI 1640 배지 (깁코)에서 배양되었다. 모든 세포는 5% CO₂가 포함된 가습된 환경에서 37℃로 유지되었다.

건강한 기증자의 신선한 혈액에서 인간 NK 세포를 분리하고 차가운 PBS-EDTA, ph7.4로 1:1 비율로 희석한 후 Ficoll-Paque 구배 분리를 통해 PBMC를 분리했다. 분리된 PBMC를 완전한 배양액에 다시 현탁시켰다. 제조업체 지침에 따라 EasySep 인간 NK 세포 분리 키트 (미국 Stem Cell Technologies)를 사용하여 PBMC에서 hNK 세포를 분리하였다. 각 기증자로부터 분리한 hNK 세포를 10% 혈청을 함유한 NK 배지에 3 x 10⁶ 세포/ml 농도로 재부유시켰다.

세포 기반 ADCC 분석:

A549-Cldn18.2 또는 PaTu 세포를 96웰 플레이트에 적절한 농도(A549-Cldn18.2 - 20.000세포, PaTu - 30.000세포)로 시드하고 24시간 동안 배양하였다. NK92 세포 또는 분리된 인간 NK 세포를 원심분리하여 수집하고 세척한 후 ADCC 분석 배지 (2mM 글루타민과 10% 열 비활성화(56℃에서 20분간) 풀 보체 인간 혈청을 첨가한 RPMI 1640(페놀 레드 무첨가)(Innovative Research))에 다시 현탁했다. 부착된 세포 (표적 세포 T)가 포함된 96웰 플레이트의 배지를 제거하고 ADCC 분석 배지(이펙터 세포 E)에 현탁 중인 NK92 세포를 A549-Cldn18.2의 경우 10, PA-TU-8988S 세포의 경우 5의 E:T 비율로 부착된 표적 세포에 추가하였다. 테스트할 항체 또는 면역 사이토카인(ICK)을 0.001 내지 100nm 또는 0.0001 내지 10 ug/ml의 농도 범위로 첨가하였다. 인간 IgG1 동형 항체 (Ultra-LEAF™ 정제 인간 IgG1 동형 제어 재조합 항체, 바이오레전드, 제품 번호. 403502)를 비특이적 대조군으로 포함시켰다. 혼합물을 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 24시간 후, 제조업체의 지침에 따라 LDH 세포 독성 분석법(Abcam, ab65393)을 사용하여 죽은 세포에서 방출되는 젖산 탈수소효소 효소의 활성으로 표현되는 세포 독성을 측정했다: 10 ul의 상층액을 새로운 96 웰 플레이트에 옮기고 LDH 기질과 혼합한 후 분광광도계를 사용하여 450 nm의 OD에서 발현된 색 변화를 측정하였다. 세포 독성은 이 공식에 따라 계산되었다: 세포독성 (%) = ((테스트 샘플 - 이펙터 세포 대조군 - 낮은 대조군)/(높은 대조군 - 낮은 대조군)) X 100; "테스트 샘플": 이펙터/표적 혼합; "이펙터 세포 대조군": NK92 세포만 있는 웰 1개(이펙터 세포에서 방출되는 LDH 활성 결정); "낮은 대조군": 이펙터 세포만 있는 웰 1개(처리되지 않은 표적 세포의 자발적 방출 결정): 표적 세포만 있는 웰 1개(처리되지 않은 표적 세포에서 LDH 활성의 자발적 방출 결정); "높은 제어": 용해 완충액으로 투과된 표적 세포가 있는 웰 1개(방출 가능한 최대 LDH 활성 결정).

도 8은 이펙터 기능이 변형된 hCl1a 항체를 기반으로 한 면역 사이토카인의 ADCC 활성을 보여준다. 테스트한 모든 면역 사이토카인은 이종이합체 Fc 도메인을 가지고 있으며, 하나의 RLI2_AQ 접합체가 중쇄 중 하나의 C-말단에 융합되어있다. 클라우딘18.2를 표적으로 하는 대표적인 면역 사이토카인은 서열번호 35 (RLI2AQ NA에 융합된 AAA 돌연변이가 있는 hCl1a 중쇄 노브), 서열번호 36 (hCl1a 중쇄 홀) 및 서열번호 37(hCl1a 경쇄)로 구성된다. ADCC를 감소시키는 이펙터 도메인의 돌연변이가 있는 면역 사이토카인을 테스트했을때, hCl1a 항체 단독의 hCl1a-DANA 면역 사이토카인과 비교했을때 NK92 세포가 있는 A549-CLDN18.2 세포(상단 패널) 또는 PA-TU-8988S(하단 패널)에서 테스트했을 때 hCl1a LALAPG-RLI DANA는 거의 폐지된 ADCC 활성을 보였다. hCl1a-LALA 항체도 hCl1a 항체와 비교했을 때 ADCC 활성이 감소하는 것으로 나타났지만, ADCC 활성이 완전히 없어지지는 않았다. 접합체의 추가는 항체 단독의 ADCC 활성과 비교했을 때 ADCC 활성이 감소된 면역 사이토카인의 ADCC 활성에 영향을 미치지 않았다. 표 17에는 테스트한 각 면역 사이토카인 또는 항체에 대해 측정한 ADCC EC₅₀ 값이 요약되어 있다. EC₅₀ 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어에 내장된 " 로그(AGONIST(작용제)) 대 반응 - 가변 기울기 (4개 파라미터)" EC₅₀ 측정 기능을 사용하여 측정하였다.

ADCC를 강화하는 이펙터 도메인의 돌연변이가 있는 면역 사이토카인을 테스트했을 때, Fc 도메인에 DLE, DE, AAA, TE 또는 IE 돌연변이가 있는 hCl1a 항체를 기반으로 테스트한 모든 면역 사이토카인은 이러한 돌연변이가 없거나 항체만 있는 동일한 면역 사이토카인과 비교했을 때 향상된 ADCC 활성을 보였다 (도 9).

아푸코실화는 또한 ADCC 활성을 향상시키는 것으로 테스트되었다. 도 9F는 A549-Cldn18.2 및 PA-TU-8988S 세포에서 아푸코실화된 면역 사이토카인 hCl1a-DANA afuc가 hCl1a-DANA와 비교했을 때 ADCC 활성이 향상되었으며, 위에서 설명한 DE 및 DLE 변이가 있는 면역 사이토카인과 비슷한 수준의 ADCC 활성을 나타냄을 보여준다. 그러나 아푸코실화를 이펙터 도메인 강화 돌연변이와 결합했을 때, 아푸코실화는 놀랍게도 DE 또는 DLE 돌연변이에 의해 유도된 ADCC 강화에 부정적인 영향을 미쳤다 (도 9B 및 A 참조). 그럼에도 불구하고, 아푸코실화를 AAA 돌연변이와 결합했을 때 강화된 ADCC 활성은 유지되었다 (도 9C).

표 17: 테스트된 면역 사이토카인 및 항체에 대한 ADCC EC₅₀ 값(RLI = RLI2_AQ)

16. 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 통한 ADCC 활성화 수용체 FcγRIIIa V158, FcγRIIIa F158 및 ADCC 억제 수용체 FcγRIIb에 대한 항체 Fc의 결합 평가

인간 FcγRIIIa 수용체 (hFcγRIIIa; CD16a)는 158번 위치에서 두 가지 다형성 변이체, 즉 hFcγRIIIaV158과 hFcγRIIIaF158로 존재한다. FcγRIIIa는 ADCC 활동을 활성화하는 반면, FcγRIIb는 ADCC를 억제한다. 면역 사이토카인의 수용체에 대한 친화도를 SPR로 측정할 때 면역 사이토카인의 ADCC 활성은 FcγRIIIa에 대한 EC₅₀ 결합 친화도와 FcγRIIb에 대한 EC₅₀ 결합 친화도의 비율로 표현할 수 있다.

SPR 실험은 Biacore 8K (미국 일리노이주 시카고, Cytiva)에서 수행되었으며, CM5 센서 칩 (Cytiva)을 사용하여 고정화 및 His 태그 항체 (Genscript)를 사용했다. 1×HBS-EP+ 유동 버퍼에서 10μl/min의 유속으로 30초의 접촉 시간으로 FcγRIIIa V158, FcγRIIIa F158 또는 FcγRIIb 단백질을 포획하는 데 사용되었다. 결합/해리 시간은 300초/300초의 결합 시간/해리 시간으로 적절한 범위에서 농도 연속 희석하여 30μl/min의 유속으로 테스트된 각 면역 사이토카인에 대해 측정했으며, 아푸코실화 유무에 관계없이 120초/1200초의 결합/해리 시간이 적용된 DLE 및 DE 구조물을 제외하고는 결합/해리 속도를 측정했다. 아래 표 18에는 SPR 측정 결과가 요약되어 있다.

표 18: SPR 데이터(RLI = RLI2_AQ)

A/I 비율 = (FcgRIIIa에 대한 친화도)/(FcgRIIb에 대한 친화도)는 친화도 = 1/Kd이다. 아푸코실화된 "AFUC"

A/I 비율을 통해 ADCC 활성화 수용체 ("A"; FcgRIII)에 대한 결합 강도를 ADCC 억제 수용체("B"; FcγRIIb)에 대한 결합 강도와 비교하여 평가할 수 있다. 비율이 높을수록 항체 또는 면역 사이토카인의 활성화 수용체에 대한 결합이 더 강하다는 것을 의미한다.

SPR 데이터는 전반적으로 ADCC를 강화하는 돌연변이가 있는 모든 면역 사이토카인이 TL 돌연변이의 일부인 ADCC를 강화하는 돌연변이가 없는 면역 사이토카인보다 더 높은 A/I 비율을 보인다는 것을 확인시켜 준다. TL 돌연변이에 대한 상대적으로 낮은 A/I 비율은 이러한 돌연변이의 당화 증가로 인한 것일 수 있다 (실시예 17 참조).

17. ADCC 활성이 강화된 hCl1a 기반 면역 사이토카인의 안정성/개발 가능성

ADCC를 강화하는 DLE, DE, AAA, TL 또는 IE 돌연변이가 있거나 아푸코실화된 hCl1a에 기반한 면역 사이토카인으로, C_H2 도메인의 용융 온도, 서열 책임 및 글리코실화(N-글리칸) 프로파일을 평가하여 안정성과 개발 가능성을 평가한다.

C_H2 도메인의 용융 온도는 MicroCal PEAQ-DSC 자동화 시스템 (말번 파날리티컬)을 사용하여 시차 주사 열량계(DSC)로 측정하였다. 간단히 말해, 면역 사이토카인 샘플을 보관 버퍼에서 1mg/ml로 희석하였다. 가열은 20 ℃에서 100 ℃까지 1℃/min의 속도로 수행되었다. 그런 다음 단백질 용액을 현장에서 냉각하고 동일한 열 스캔을 실행하여 첫 번째 스캔에서 빼기 위한 기준선을 얻었다.

N-글리칸 분석을 위해 먼저 단백질을 DTT로 환원시킨 다음 유리 삽입 바이알이 있는 HPLC 컬럼으로 옮겨 주입하였다. 단백질은 역상 크로마토그래피로 분리한 후, UV 검출기와 결합된 Waters/XEVOG2XS-QTOF 온라인 LC-MS로 검출하였다. 검출된 글리칸 사슬의 분자량을 알려진 N-글리칸 유형과 일치시키고, N-글리칸 상대적 풍부도를 계산하여 검출된 피크의 강도로 표시하였다.

표 19에 설명된 대로 ADCC 강화 돌연변이가 있는 면역 사이토카인 구조체의 아미노산 서열을 분석하여 다음과 같은 추가 서열 라이어빌리티 (liabilities)가 있는지 (ADCC 강화 돌연변이가 없는 구조체에는 존재하지 않음) 분석하였다.

표 19: 알려진 시퀀스 라이어빌리티 (liabilities).

TL 돌연변이는 N-글리코실화 서열 라이어빌리티 (liability) (IgG1 서열의 N390에 근접한 돌연변이 K392T)을 도입하였다. 다른 돌연변이에서는 서열 라이어빌리티가 나타나지 않았다 (표 20 참조).

표 20: 안정성 및 개발 가능성 요약.

점수 4: 매개변수가 mAb 기반 의약품에 대해 예상되는 범위 내에 있다;

점수 3: 개발 중 품질 속성에 대한 신중한 모니터링/평가가 필요하다;

점수 2: 일정 및/또는 비용에 상당한 영향을 미칠 가능성이 있다;

점수 1: 적절히 통제할 수 없는 높은 위험도이다.

전반적으로, 아푸코실화는 안정성과 개발 가능성에 영향을 미치지 않았으며, 따라서 면역 사이토카인의 ADCC 활성을 향상시키는데 사용될 수 있다. DLE 및 DE 돌연변이는 Tm1 (CH2 도메인의 용융 온도)을 상당히 감소시켜 (표 21 참조) 잠재적으로 면역 사이토카인의 용액 내 안정성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났다. 하지만 이러한 돌연변이는 면역 사이토카인의 글리코실화에 영향을 미치지 않았다. TL 돌연변이에 의해 도입된 서열 라이어빌리티로 인해 원치 않는 시알릴화 (sialylated) 및 고만노스 글리칸 종 (high mannose glycan species)의 도입이 발생하였다 (표 22 참조). 이러한 종은 면역 사이토카인의 pK에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 마찬가지로, IE 돌연변이가 있는 면역 사이토카인은 만노스 종의 비율이 높아서 잠재적으로 특성에 영향을 미칠 수 있다. AAA 돌연변이를 가진 면역 사이토카인은 만노스 종의 증가를 초래하였다 (표 22 참조). 그러나 아푸코실화된 면역 사이토카인을 생산하면 부분적으로 글리코실화가 발달 가능성과 관련하여 허용 가능한 수준으로 되돌아갔다. 따라서 hCl1a에 기반한 면역 사이토카인의 강화가 필요한 경우, 선택적으로 아푸코실화와 결합된 AAA 돌연변이가 안정성과 발달성에 가장 적은 영향을 미치는 권장 돌연변이가 될 수 있다. 아푸코실화는 평가된 특성에 영향을 미치지 않았다. DLE 및 DE 돌연변이는 Tm을 상당히 감소시켜 잠재적으로 분자를 불안정하게 하였다. TL 돌연변이는 Fc에 추가적인 글리코실화 부위를 도입하였다. IE 돌연변이가 있는 FC. 컨스트럭트는 만노스 종의 비율이 높았다.

표 21: 용융 온도('afuc'는 아푸코실화됨).

표 22: N-글리칸 분석

18. 클라우딘18.2 면역 사이토카인 마우스 생체 내 효능 연구

이 연구의 목적은 마우스 모델에서 hCl1a-RLI 면역 사이토카인의 생체 내 치료 효능을 테스트하는 것이다. 암컷 NMRI 누드 마우스에 Claudin18.2(BXPC3-CLDN18.2)를 외인성으로 발현하는 인간 췌장 세포주 유래 이종이식편 BXPC3(ATCC CRL-1687™)을 5~7주령에 이식하였다. 종양은 일방적인 피하 주사를 통해 이식된다. 동물은 약 100 mm³의 종양 부피를 기준으로 무작위로 배정된다. 마우스를 각기 다른 그룹 (그룹당 n=7)에 배정하고 1일차에 표 23에 따라 치료하였다. 동물의 체중 감소와 종양 부피를 매주 2회 확인하였다. 종양 부피는 캘리퍼로 측정하며 다음 공식을 사용하여 mm³로 표시한다: "V = (L × W × W)/2, 여기서 V는 종양 부피, L은 종양 길이 (가장 긴 종양 치수), W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)입니다. 마우스는 종양 부피가 2000mm³에 도달하거나 체중이 현저히 감소(전체적으로 30% 이상 또는 이틀 연속 20% 이상)하면 안락사 시켰다.

표 23: 마우스 치료 요법("afuc"는 아푸코실화)

19. 항-PD-1 항체와 SOT201은 CD8+ T 세포의 활성화에 시너지 효과를 발휘한다

SOT201은 인간화 IgG 4 펨브롤리주맙에서 추출한 항체 (T366W-노브/T366S, L368A, Y407V-구멍 치환, L235E 치환 및 중쇄의 말단 K가 삭제되고, 노브 중쇄의 C-말단에서 RLI-15AQA에 융합된)가 포함된 이종이중체 면역 사이토카인 (서열번호 22, 서열번호 38, 서열번호 24 참조)이다. 실시예 1에 따라 PD-1/PD-L1 차단 분석에서 SOT201과 키트루다®(펨브롤리주맙)를 비교하였다. 도 10A는 SOT201이 항 PD-1 항체 키트루다와 유사하게 PD-1/PD-L1 상호작용을 효과적으로 차단한다는 것을 보여준다. SOT201과 펨브롤리주맙의 결정된 KD 값은 표 24에 나타내었다.

표 24: 4°C 및 37°C에서의 SOT201 및 펨브롤리주맙의 KD 값

11명의 건강한 기증자로부터 채취한 인간 PBMC는 RLI2_AQ N65A(RLI-15_AQA) 변이체를 가진 SOT201 또는 SOT201과 동일한 항체 중쇄 및 경쇄를 가지고 있지만 IL-15 변이체의 IL-2/IL-15Rβγ에 대한 결합이 감소되지 않은 RLI2_AQ 변이체를 가진 대조 분자("SOT201 wt")로 7일간 시험관 내에서 자극되었다. 세포 증식은 유세포 분석법으로 Ki-67+ NK 세포와 CD8⁺ T 세포를 측정하여 측정하였다. SOT201은 수용체 결합이 감소된 RLI-15 분자를 사용한 유사한 면역 사이토카인 분자에 비해 더 높은 EC₅₀ 농도에서 NK 및 CD8⁺ T 세포의 증식을 활성화한다 (SOT201 wt)(도 10B).

이종이합체화 (E356K, N399K/K409E, K439D), ADCC 침묵 (D265A) 및 안정화(dK)를 위한 유사 치환을 가지고 RLI-15AQA에 융합된 항-뮤린 PD-1 항체 RMP1-14 (BioXCell, Lebanon, NH, USA)를 포함하는 항-뮤린 PD-1 항체 SOT201(mSOT201, 서열번호 39, 서열번호 40 및 서열번호 41를 참조하라)를 (mPD1)과 같은 단일 클론 항-뮤린 PD-1 항체 RMP1-14 및 항-인간 PD1 마우스 IgG1-RLI-15AQA(hPD1-mSOT201)로 대표되고, mSOT201과 유사한 생체 내 반감기를 갖는 RLI-15AQA 대조군으로서, C57BL/6 마우스에서 PD-1 차단 활성을 나타내지 않는 단일 활성 대조군과 비교하였다. 건강한 C57BL/6 마우스(n=2/그룹)에 mSOT201 5mg/kg의 등가량 화합물을 정맥 주사한 후 5일 후 유세포 분석법으로 비장에서 세포 증식 (Ki67)이 검출되었다. 항-PD-1 항체와 마우스 대리체 mSOT201의 RLI-15AQA 뮤테인 모이어티는 CD8+ T 세포 증식에 시너지 효과를 나타냈다 (도 10C).

20. MC38 마우스 모델에서의 종양 퇴행

C57BL/6 마우스 (hPD1 형질전환 마우스)에 동종 MC38 세포주를 이식했다. 1일차 (무작위 배정일, 종양 부피 80-100 mm³)(n=10/그룹)에 시험 약제인 mSOT201, hPD1-mSOT201 및 mPD1을 5mg/kg mSOT201의 등가량으로 정맥 주사하고 대조군(NaCl)과 비교했다. mSOT201은 1회 정맥 투여 후 10마리 중 9마리에서 종양 퇴행을 유도한 반면, 마우스에서 항 PD-1 효과가 없는 단일 클론 항 뮤린 PD-1 항체(mPD1)와 항 인간 PD-1 마우스 IgG1-RLI-15 뮤테인 면역 사이토카인(hPD1-mSOT201)은 대조군에 비해 종양 성장에 약간의 영향만 나타냈다 (도 11A). 마찬가지로, RLI-15AQA 뮤테인 단독에 비해 항-마우스PD-1 항체와 융합 단백질 (mSOT201)의 시너지 활성은 항-마우스PD-1 항체 단독 (mPD1) 또는 항-인간PD1 마우스 IgG1-RLI-15 뮤테인 면역 사이토카인 (hPD1-mSOT201)을 대조군으로 하였을 때 치료 후 100일까지의 시간 경과에서 생존한 마우스에서 나타났다 (도 11B).

21. MC38 종양에서 항종양 면역과 관련된 경로 및 유전자 유도 및 비장 및 림프절의 면역 세포 활성화 유도

RNA 분리: mSOT201(5mg/kg)을 일회 정맥 주사한 후 7일 후, C57BL/6 마우스를 보유한 동종 MC38 종양 마우스의 종양에서 RNA 샘플을 분리하였다. 3마리의 마우스는 1일차 (무작위 배정일, 종양 부피 80-100 mm³)에 mSOT201(5mg/kg)을 정맥 주사하고, 4마리의 대조군 마우스는 치료하지 않고 방치하였다. 종양 조직에서 RNA를 RNeasy MicroKit을 사용하여 분리하였다. RNA 샘플의 품질은 애질런트 바이오애널라이저 RNA 나노 칩과 큐비트 HS RNA 분석기를 사용하여 확인하였다.

RNA 시퀀싱 분석: 시퀀싱 라이브러리는 SMARTer® Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico 입력 포유류 키트(Takara Bio USA, Inc.)를 사용하여 RNA 샘플로부터 준비하였고, 라이브러리 품질 관리는 모세관 젤 전기영동 시스템(HS DNA 칩이 장착된 Agilent Bioanalyzer)과 Qubit HS DNA Assay를 사용하여 수행되었으며, 시퀀싱은 NovaSeq 6000에서 NovaSeq 6000 300 사이클 시약 키트를 사용하여 2x151 bp 실행으로 수행되었다.

데이터 분석: 원시 데이터는 다음과 같은 단계를 포함하는 표준 RNA-seq 파이프라인에 따라 처리되었다: 품질 관리 (FastQC 및 FastqScreen을 통한), 어댑터 트리밍 (seqtk를 사용하여 Read2에서 8bp 트리밍), 참조 게놈 GRCm39에 매핑(HISAT2 사용) 및 전사체 계수 (ht-seq 사용). 얻은 결과물인 각 샘플의 전사체 수가 포함된 정량화 파일은 R 패키지와 ggplot2, tydiverse, dplyr을 통해 추가로 처리되었다. 원시 개수는 DESeq2 배율 정규화 중앙값을 통해 정규화되었다. 차등 유전자 발현 분석은 R의 DESeq2(버전 1.24.0)를 사용하여 수행하였다 (abs(log2FC)=1, FDR<0.05). 히트맵은 R의 ComplexHeatmap 패키지를 사용하여 만들었으며, DEG의 기능 및 농축 분석은 ClusterProfiler와 웹 기반 도구인 GO(Gene ontology)를 사용하여 수행하였다. 세포 집단 분석을 위한 TPM 값을 계산하기 위해, 연어 도구는 트리밍된 fastq 파일에 사용되었다. 세포 집단 분석은 타이머 2.0과 xCell 툴로 수행하였다.

결과: 차등 발현 분석(abs(log2FC)=1, FDR<0.05) 결과, 대조군 샘플과 비교하여 mSOT201 처리 종양에서 800개의 마우스 유전자가 상향 조절되고 1910개의 마우스 유전자가 하향 조절된 것으로 나타났다. 유전자 온톨로지(GO) 용어의 농축 분석은 주로 αβ T 세포, γδT 세포, B 세포, NK 세포, 세포 독성, 세포 사멸, 사이토카인 생성, 세포 화학 주성 및 세포 부착의 활성화와 관련된 상향 조절된 DEG를 확인했으며, 하향 조절된 유전자는 종양 발생 및 종양 신호와 관련이 있는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 mSOT201이 종양 미세환경에서 선천성 면역과 후천성 면역을 모두 활성화한다는 것을 나타낸다. 다음으로, 종양 미세환경에서 다양한 면역 세포 집단의 상대적 풍부도를 추정하기 위해 "메타유전자" 마커를 사용하였다. 전체 전사체 결과와 일치하게, mSOT201 처리된 샘플은 CD8⁺T 세포 (p<0.001), CD8⁺ 순진한 T 세포 (p<0.0005), CD8⁺ 이펙터 기억 T 세포 (p=0. 001), CD8⁺ T 세포 중심 기억 (p<0.001), γd T 세포 (p=0.0002), NK 세포 (p<0.001), CD4⁺ T 세포 (p=0.0157), CD4⁺ 순진한 T 세포 (p=0.1176), CD4⁺ 이펙터 기억 T 세포 (p=0.003), B 세포 (p=0.0602), 골수성 수지상 세포 (p=0.0120). 반면에 암 관련 섬유아세포와 관련된 유전자 세트는 현저하게 감소하였다 (p=0.0254)(도 12A).

mSOT201은 MC38 종양 보유 마우스의 비장과 림프절에서 선택된 면역 세포 집단의 증식을 유도하였다 (도 12B). 세포 증식 (Ki67)은 확립된 종양 (80-100 mm3)에 mSOT201을 처리한 후 7일째에 유세포 분석법으로 검출되었다 (n=2).

22. kit225 세포에 대한 다양한 IL2/IL-15Rβγ 작용제의 EC50 값

실시예 1에 기술된 바와 같이 RLI-15(SOT101), SOT201(PEM-RLI-15AQA), hPD-1-IL-2v 및 αhPD1-IL-15m M1의 EC50 값을 측정하였다. hPD-1-IL-2v에서 하나의 IL-2 뮤테인 IL-2v (서열번호 43)는 WO 2018/184964A1(서열번호 22, 23, 25)에 기술된 바와 같이 항-인간PD-1 항체의 중쇄의 C-말단에 융합되어 있다. αhPD1-IL-15m M1에서는 돌연변이 N1A-D30N-E46G-V49R (서열번호 44)을 갖는 하나의 IL-15 뮤틴이 WO 2019/166946a1에 기술된 바와 같이 항-인간PD-1 항체의 중쇄의 C-말단에 융합되어 있다 (도 1D 참조, 서열번호 89, 74 및 65). EC₅₀ 값은 표 25에 나타내었다.

표 25: kit225 세포에 대한 선택된 IL-2/IL-15Rβγ 작용제의 EC50

테스트할 또 다른 흥미로운 후보물질은 WO 2019/166946a1에 기술된 바와 같이 돌연변이 N1G-D30N-E46G-V49R-E64Q (서열번호 45)가 항-인간PD-1 항체 중쇄의 C-말단에 융합된 IL-15 뮤틴을 가진 αhPD1-IL-15m M2이다 (도 1C 참조, 서열번호 90, 74 및 65 참조).

따라서 SOT201은 PD1-IL-2v 및 αhPD1-IL-15m M1에 비해 kit225 세포에서 EC50이 현저히 낮아, 더 많은 양을 투여하고 생체 내 반감기를 연장하여 항 PD-1/PD-L1 상호작용을 방해하는 활성을 더 강력하고 오래 지속시키는 효과를 발휘할 수 있을 것으로 기대된다.

23. MC38 종양 모델에서 mSOT201과 mPD1-IL-2Rβγ 작용제의 비교

실시예 20에 설명된 대로 MC38 종양 모델에서 mSOT201 (마우스 SOT201 대리체)을 대조군(NaCl), IL-2v IL-2 뮤테인 (mPD1-IL-2Rβγ 작용제)에 융합된 항뮤린 PD-1 항체 RMP1-14 및 RLI-15_AQA와 mPD1 항체의 조합을 1회 정맥 주사하여 비교하였다. 건강한 C57/BL6 마우스에 5mg/kg의 mSOT201을 정맥 주사한 후 5일째의 NK 및 CD8⁺ T 세포 증식과 일치하도록 mPD1-IL-2Rβγ의 용량을 선택했으며, 그 결과 0.25 mg/kg의 mPD1-IL-2Rβγ가 동등한 용량이 되었다. 세포 증식(Ki67+)은 유세포 분석법으로 검출되었다. mSOT201은 CD8⁺ T 세포와 NK 세포의 활성화를 유도했으며, 이는 mPD1-IL-2Rβγ 작용제와는 대조적으로 8일까지 지속되었다 (도 13B).

mPD1-IL-2Rβγ는 IL-2/IL-15Rβγ 작용제로서, IL-2 뮤테인 IL-2v (서열번호 43)는 IL-2 서열에 대한 치환체 F42A, Y45A 및 L72G를 포함하여 IL-2Rα에 대한 친화성을 감소시킨다 (WO 2018/184964A1 참조, 예를 들어, 27, 28쪽 연결항) 및 3번 위치에서 O-글리코실화를 제거하기 위한 추가 치환 T3A(28, 29쪽 연결 항) 및 발현 또는 안정성을 증가시키기 위한 추가 치환 C125A (30쪽, 3항)를 포함한다.

SOT201의 마우스 대리체 (mSOT201)는 1회 정맥 주사 후 MC38 종양을 보유한 마우스 10마리 중 9마리에서 종양 퇴행을 유도한 반면, mPD1-IL-2Rβγ 작용제의 경우 10마리 중 5마리에서 종양 성장을 지연시킨 반면, RLI-15AQA와 mPD1 항체의 조합은 대조 마우스에 비해 종양 성장을 지연시키는데 그쳤다 (도 13A).

mSOT201은 MC38 종양 보유 마우스에서 NK 및 CD8⁺ T 세포의 증식을 유도했으며, 이는 mPD1-IL-2Rβγ 작용제 및 mPD1과 같은 양의 RLI-15AQA를 병용 투여한 것과 대조적으로 투여 후 7일간 지속되었다. MC38 종양 치료는 무작위 배정 1일차, 종양 부피 100mm³(n=10/그룹)에 이루어졌다.

또한, mSOT201은 8일째에 증식하는 세포의 현저한 감소를 보인 mPD1-IL-2Rβγ 작용제와는 대조적으로 8일째에도 CD8⁺ T 세포와 NK 세포의 활성화가 현저하게 더 오래 지속되도록 유도했다 (도 13B).

또한 SOT201은 MC38 종양 보유 마우스의 비장과 림프절에서 NK 및 CD8+ T 세포의 증식을 유도했으며, 이는 mPD1-IL-2v 및 RLI-15_AQA와 mPD1 항체의 등극량 조합과 대조적으로 투여 후 7일 동안 지속되었다 (도 13C).

24. 시노몰구스 원숭이에서 SOT201의 PK 프로파일

사이노몰구스 원숭이에게 1일째 0.6 mg/kg의 SOT201을 정맥 주사하고 유세포 분석 및 혈액학을 통해 NK 및 CD8⁺ T 세포의 증식 (Ki67+) 및 절대 세포 수를 시간 경과에 따라 측정했다. SOT201은 정맥 주사한 후 시노몰구스 원숭이의 혈액에서 NK (5일째 약 90%) 및 CD8⁺ T 세포(5일째 약 80%)의 높은 증식 및 확장을 유도했다 (도 14A). 약동학 매개변수는 표 26에 나타내었다.

표 26: 시노몰구스 원숭이에서 SOT201의 약동학 매개변수

SOT201은 시노몰구스 원숭이에게 반복적인 정맥 주사한 후 NK 및 CD8⁺T 세포의 활성화를 유도했다 (도 14B).

25. 마우스 SOT201 대리체의 PD 활동

이 연구의 첫 번째 목표는 마우스 대리체 분자 mSOT201 (실시예 19 참조)을 사용한 치료가 C57BL/6 마우스에서 hPD1-mSOT201 또는 mPD-1을 사용한 치료와 비교했을 때 CD8⁺ T 세포 증식에 부가적/시너지 효과가 있는지 평가하는 것이었다. 이 연구의 두 번째 목표는 C57BL/6 마우스에서 mSOT201 wt 마우스 대리체 분자의 약역학적 활성을 마우스 대리체 분자인 mPD1-IL2v와 비교하는 것이었다. 테스트한 마우스 대리체 분자에 대한 설명은 표 27에 설명되어 있다. PD 활성은 5일째와 8일째에 평가하였다. FACS 분석은 위에서 설명한 대로 수행하였다.

표 27: 마우스 대리체 분자에 대한 설명

표 28: kit225 분석에서 인간 분자에 대한 마우스 대리체의 효능 비교

펨브롤리주맙은 뮤린 PD-1을 인식하지 못하므로, hPD-1-mSOT201은 유사한 PK 프로파일을 가진 비결합 항체에 결합된 RLI-15_AQA에 대한 대조군을 나타내고, 따라서 이러한 PK 프로파일을 가진 RLI-15_AQA 분자의 PD 활성을 반영한다. mPD-1 분자는 항PD-1 항체 단독의 PD 활성을 반영한다. CD8⁺ T 세포의 활성화와 관련하여, mSOT201은 단일 성분 대리체인 hPD1-mSOT201 및 mPD-1에 비해 투여 5일째에 추가 효과 (즉, 시너지 효과) 이상을 보였으며, 같은 양으로 투여한 8일째에는 그 이상의 효과를 나타냈다. 이에 비해, 5일째에 높은 활성이 예상되어 더 낮은 용량을 투여한 mPD1-IL2v와 mSOT201 wt (둘 다 더 활성적인 IL-2/IL-15Rβγ 작용제)는 5일째에 CD8⁺ T 세포의 활성화가 약간 더 높게 나타났지만, 8일째에 mSOT201의 CD8⁺ T 세포 활성화가 훨씬 더 강하기 때문에 이러한 효과는 단기간만 지속된다. 활성화된 NK 세포를 보면 그 차이가 그렇게 뚜렷하지 않다. 예상대로 mPD-1은 NK 세포를 활성화시키지 않는 반면, hPD1-mSOT201, mPD1-IL2v, mSOT201 및 mSOT201 wt는 5일째에 강하게 활성화되고 mSOT201은 다른 세포에 비해 다소 약하게 활성화된다. 8일째에 다시 mSOT201은 mPD1-IL2v 및 mSOT201 wt에 비해 NK 세포가 더 강하게 활성화되는 것으로 나타났다 (도 15 A).

비슷한 도가 관찰되었는데, mSOT201, hPD1-mSOT201 및 mPD-1은 A의 두 배로 투여된 반면, mSOT201 wt 및 mPD1-IL2v는 더 적은 양으로 투여되었다 (도 15 B 참조). 예상대로 mSOT201 wt 및 mPD1-IL2v는 CD8⁺ T 세포와 NK 세포의 활성화가 모두 감소했으며, CD8⁺ T 세포의 경우 8일째에 다시 대조 수준까지 감소하였다.

이 데이터에 따르면, 항 PD-1 모이어티와 함께 IL-2/IL-15Rβγ와의 결합이 현저히 감소된 SOT201은 NK 및 CD8⁺ T 세포를 강력하고 오래 활성화시키는 반면, IL-2/IL-15Rβγ 작용제 활성이 높은 분자는 특히 CD8⁺ T 세포의 활성화가 훨씬 짧아지는 것으로 나타났다. 시스 (즉, 동일한 CD8⁺ T 세포) 또는 트랜스 (즉, 근접한 다른 CD8⁺ T 세포 간)에서 PD-1과 PD-1 발현 CD8⁺ T 세포의 IL-2/IL-15Rβγ가 동시에 결합하는 선호도 효과가 CD8⁺ T 세포의 이러한 우선적 활성화로 이어진다는 가설이 제기되고 있다.

26. PD-1 민감성 및 PD-1 치료 저항성 마우스 모델에서 mSOT201의 항종양 효능 활성

이 연구의 목적은 항 PD-1 치료에 민감한 (CT26, MC38) 마우스 모델과 항 PD-1 치료에 내성이 있는 (B16F10, CT26 STK11 ko) 마우스 모델에서 mSOT201의 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 테스트한 마우스 대리체 분자에 대한 설명은 표 29에 설명되어 있다.

표 29: 마우스 대리체 분자에 대한 설명

SOT201의 마우스 대리체 분자인 mSOT201은 단일 성분 대리 분자인 mPD-1 및 hPD1-mSOT201과 비교하여 테스트된 PD-1 민감성 종양 모델인 CT26 및 MC38에서 10회 중 5회, 10회 중 9회가 완전 반응을 보이는 시너지 효과를 보였다 (도 16 A).

항 PD-1 치료에 내성이 있는 것으로 알려진 종양 모델에서도 mSOT201은 단일 성분에 비해 시너지 효과를 보였지만, 치료 효과는 민감성 모델에 비해 강하지 않아서 B16F10 모델의 경우 10마리 중 1마리만이 완전 반응을 보였다 (도 16 B).

27. mSOT201의 항종양 효능 활성과 RLI-15AQA 뮤테인 + 항 PD-1 항체 비교

이 연구의 목적은 MC38 마우스 모델에서 mSOT201의 항종양 활성과 RLI-15 AQA 뮤테인 + 항 PD-1 치료의 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 테스트한 마우스 대리 분자에 대한 설명은 표 30에 나타내었다.

표 30: 마우스 대리 분자에 대한 설명

항 PD-1 모이어티와 IL-2/IL-15βγ 작용제 RLI-15AQA (두 가지 용량, G2 및 G3)의 융합은 개별 등극 성분의 조합 (G4: RLI-15AQA + mPD1 또는 G11: hPD1-mSOT201 + mPD1)에 비해 강력한 시너지 효과를 보였다 (도 17 참조). PD-1 양성 면역세포 활성화의 시간적, 공간적 연결이 개별 구성 요소에 의한 면역세포 활성화보다 기계적으로 더 강력하다는 가설이 있다.

28. mSOT201의 항종양 효능 활성과 SOT101 + 항 PD-1 항체의 항종양 효능 활성 비교

이 연구의 목적은 MC38 마우스 모델에서 mSOT201과 SOT101 + 항 PD-1 치료의 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 평가한 마우스 대리체 분자에 대한 설명은 표 31에 나타내었다.

표 31. 마우스 대리체 분자에 대한 설명

2mg/kg의 mSOT201 단일 용량(G3)은 1mg/kg RLI2_AQ 4회 투여 + 5mg/kg mPD1 단일 용량(G8) 또는 1mg/kg RLI2AQ 4회 투여 + 5mg/kg mPD1 4회 투여(G9)의 병용 요법과 거의 동일한 치료 효과를 보였다. 그러나 5mg/kg의 mSOT201 1회 접종(G2)은 개별 성분을 여러 번 접종하는 것(G8 및 G9)보다 효과가 더 뛰어나다 (도 18 참조)

29. mSOT201과 SOT101 + 항 PD-1 항체 치료 시 면역 세포 활성화의 차이에 대한 메커니즘 연구

이 연구의 목적은 MC38 마우스 모델에서 유사한 효능 용량의 mSOT201과 SOT101 + 항 PD-1 치료의 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 테스트한 마우스 대리체 분자에 대한 설명은 표 31에 나타내었다. 종양, 비장 및 림프절에서 두 치료법 모두에서 다양한 면역 세포 집단의 상대적 수에 차이가 발견되었다. 비장과 림프절에서 CD8⁺ T 세포와 CD3⁺ 세포를 보유한 αβTCR의 상대적 확장은 두 치료법 사이에 변화가 없었다. 하지만, 종양에서 mSOT201은 CD8⁺ T 세포의 상대적 증가를 더 많이 유도한 반면, RLI2_AQ + 항 PD-1 병용 치료는 더 많은 NK 세포를 증가시켰다. 흥미롭게도 mSOT201은 비장과 림프절에서 CD3+ 세포를 보유한 γδTCR의 비율을 더 많이 유도한 반면, RLI2_AQ + 항 PD-1 병용 치료는 주로 종양에서 CD3+ 세포를 보유한 γδTCR의 비율을 더 많이 유도하였다. (도 19 참조).

30. 면역원성 측정을 위한 DC-T 세포 기반 분석 및 형광 스폿 분석

면역원성 측정을 위한 DC-T 세포 기반 분석법

건강한 기증자로부터 버피 코트를 얻었다. 혈액을 PBS-EDTA로 희석하고 (희석된 혈액 175mL를 얻기 위해) Ficoll 농도계 (Ficoll 15mL + 희석된 혈액 35 mL)를 사용하여 PBMC를 분리하였다. 제조업체의 지침에 따라 EasySep™ Human CD14 양성 선별 키트 II(17858, StemCell)를 사용하여 CD14⁺ 단핵구를 분리하였다. CD14^- 분획을 새 팔콘 튜브에 피펫팅하고 나머지는 1200 rpm에서 10분간 원심분리한 다음 CryoStore 배지에 다시 현탁하여 냉동하고 -80℃에서 임시 보관하였다. 분리된 CD14⁺ 단핵구를 DC 배지 (IL-4 및 GM-CSF가 보충된 CellGro)에 다시 현탁시켰다. 세포를 37 ℃에서 5% CO₂로 5일간 배양하고 수확하여 48웰 플레이트에 시드하였다. iDC에 단백질을 4시간 동안 로드하고 사이토카인 칵테일 (TNF-α, IL-1β + IL-4 및 GM-CSF)로 하룻밤 숙성시켰다. 이후 PBS와 T 세포 배지로 4회 세척하였다. 세포를 1:10 비율 (음성 자기 분리)로 자가, CFSE 염색된 CD4⁺ T 세포와 공배양하고 7일간 배양하였다. CFSE 희석은 유세포 분석법으로 검출하였다.

유세포 분석을 통한 CD4⁺ T 세포 증식 평가에 사용되는 항체와 생존성 염료 (viability dye)의 혼합물 (CFSE(FITC)로 염색된 T 세포):

이 연구의 목적은 시험관 내에서 하나의 RLI-15 뮤테인 (PEM-RLI-15 후보 분자)을 함유한 펨브롤리주맙 기반 면역 사이토카인의 면역원성 위험성을 평가하는 것이었다. 이를 위해 DC-T 세포 분석법이 사용되었는데, 시험 제품을 먼저 미성숙 수지상 세포(iDC)와 함께 배양한 후 성숙된 DC (mDC)의 MHC 분자에 탑재된 후보 분자의 가공된 펩타이드로서 자가 T 세포에 제시하는 방식이다. 7일간의 공동 배양 기간 후, 항약물 항체 형성을 위한 대리 마커로서 T세포 증식을 측정하였다. DC에 의해 유도된 T 세포 증식의 검출은 면역원성에 기인하지 않는 결과에 강한 영향을 미칠 수 있는 테스트 시스템에서 RLI-15 성분의 자극 활성을 완화하기 위해 사용되었다. KLH는 강력한 면역 반응 유도를 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 양성 대조군으로 사용하였다. 펨브롤리주맙은 음성 대조군으로 사용되었다. 비특이적 T 세포 증식을 평가하기 위해 단백질이 없는 대조군 DC를 대조군으로 사용하였다.

표 32: DC-T 세포 기반 분석을 위한 PEM-RLI-15 후보 분자

표 32에 따른 PEM-RLI-15 후보 분자를 각각 두 가지 농도로 iDC를 자극하는 데 사용하였다. DC의 성숙은 염증성 사이토카인에 의해 유도되었다. 24시간 후, mDC를 세척하고 CFSE로 사전 염색한 자가 CD4⁺ T 세포와 함께 배양하였다. 7일 후 유세포 분석기에 의한 CFSE 검출을 기반으로 T 세포의 증식을 평가하였다.

이 분석은 SOT201(PEM L-RLI N65A x1)으로는 수행할 수 없었는데, 이는 RLI N65A 뮤틴의 활성이 여전히 너무 높아 직접적인 T 세포 활성화로 이어져 RLI-15 활성에 영향을 미쳤기 때문이다.

인간 CD14⁺ 단핵구 (3개의 개별 실험에서 11명의 건강한 기증자)로부터 생성된 DC를 성숙 신호(염증성 사이토카인 TNFα 및 IL-1β)가 있는 상태에서 10μg/ml(표시되지 않음) 또는 50μg/ml의 PEM-RLI-15 후보 분자, 펨브롤리주맙 또는 KLH를 24시간 동안 배양하였다. 이후 단백질이 적재된 세척된 mDC를 자가, CFSE 염색된 CD4⁺ T 세포와 함께 배양하였다. 7일 후 유세포 분석법으로 T 세포 증식을 측정하였다. 증식하는 CD4⁺ T 세포의 비율은 CFSE 신호에 따라 평가되었으며, CFSElow 세포는 순환하는 세포로 간주되었다. KLH는 양성 대조군으로, 펨브롤리주맙은 음성 대조군으로 사용되었다 (도 20A 참조). PEM-RLI-15 후보 분자 PEM L-RLI DANA x1/PEM LY-RLI DANA x1은 낮은 면역원성 위험을 반영하는 음성 대조군에 비해 T 세포의 유의미한 증식을 유도하지 못하였다 (11명의 기증자 중 1명에서 양성 반응이 검출됨). 후보 분자 PEM LY-RLI DANAQD x1은 음성 대조군에 비해 T 세포의 유의미한 증식을 유도했으며 (p=0.0208, paired t test), 이는 IL-2/IL-15Rβγ에 대한 결합을 감소시키는 3개의 변이를 가진 이 RLI-15 뮤틴의 잠재적 면역원성 위험 (11명의 기증자 중 4명에서 양성 반응이 검출됨)을 시사한다.

면역원성 측정을 위한 플루오로스팟 분석법

너무 활성화된 RLI-15 뮤틴은 면역 반응을 자극하기 때문에 DC-T 세포 분석법은 RLI-15(야생형 서열)와 비교하여 RLI-15AQA의 면역원성을 테스트하는 데 적합하지 않다. 따라서 치환이 도입된 펩타이드 쌍을 치환 부위에 걸쳐 생성하여 형광 스폿 분석법으로 테스트하였다.

표 33: 검증된 펩타이드

40명의 건강한 기증자로부터 각각 분리한 PBMC를 극저온 저장고에서 회수하여 배양 배지에서 해동하였다. 네거티브 비드 선택을 사용하여 PBMC에서 CD8⁺ 세포를 고갈시켰다. CD8이 고갈된 PBMC를 RPMI + 10% huAB 혈청의 세포 배양 플레이트에 시드한 후 풀링된 테스트 펩타이드로 펄싱하고 사이토카인이 보충된 배지에서 추가로 배양하였다. 하룻밤 배양 후 배양 4일째에 사이토카인 IL-7 및 IL-2를 보충하는 배지를 새로 교체하였다. 7일간의 배양 후, 농축된 CD8이 고갈된 PBMC를 채취하여 하룻밤 동안 놔두었다. 8일째 되는 날, 펩타이드 풀과 대조 분자의 유무에 관계없이 IFN-γ/TNF-α 플루오로스팟 플레이트에 PBMC를 시드하고 재자극하였다. 하룻밤 배양 후, Mabtech IRIS FluoroSpot Reader로 IFN-γ 및 TNF-α를 측정하여 T 세포 활성화를 평가하였다.

도 20 B는 모든 테스트 조건에서 신뢰 구간이 0과 겹치는 것을 보여 주며, 이는 돌연변이 펩타이드와 짝을 이루는 야생형 서열을 비교한 평균 dSFU에 변화의 증거가 없음을 의미한다. 따라서 N65A 치환과 G175A/N176Q 치환 쌍 모두에서 면역원성의 관련 증가가 나타나지 않는다.

31. 다양한 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 효능

다음과 같은 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인 (표 34)을 만들어 그 활성을 비교하였다.

표 34: 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인

항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 효능을 kit225 세포 (표 35 참조)와 hPBMC (표 36 참조)에서 측정하였다.

표 35: kit225 분석에서 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 효능

표 36: 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 hPBMC에 대한 효능

32. 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 PD-1/PD-L1 차단 활성

PD-1/PD-L1 축의 차단 활성을 평가하기 위해 위에서 설명한 대로 PD-1/PD-L1 차단 생물학적 분석법 (Promega, 번호 J1250)을 사용하여 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인의 차단 활성을 테스트하였다. 결과는 표 37에 나타내었다.

표 37: 프로메가 차단 분석에서 PD-1/PD-L1 차단 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인 차단

SOT201은 테스트된 세 가지 항 PD-1 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 면역 사이토카인 중 가장 높은 PD-1/PD-L1 차단 활성을 보였다.

33. kit225 세포에 대한 이펙터 기능이 변형된 인간 및 마우스 대리체 SOT202 분자의 효능

SOT202는 T366W-노브/T366S, L368A, Y407V-홀 치환 및 중쇄의 말단 K가 삭제된 인간화 IgG 1 hCl1a에서 추출한 항체가 노브 중쇄의 C-말단에서 RLI-15_AQA에 융합된 이종이합체 면역 사이토카인이다 (서열번호 50, 서열번호 49 및 서열번호 37 참조). 다음 예에서 SOT202-XXX라는 용어는 표 11에 표시된 것처럼 RLI2의 DANA 돌연변이와 같이 SOT202에 추가 돌연변이가 발생한 분자를 나타낸다. 명확히 하자면, SOT202-DANA는 SOT202에 이미 NA(N65A) 돌연변이가 포함되어 있기 때문에 추가 DA(D61A) 돌연변이만 SOT202와 다르다 (숫자는 IL-15 번호 참조). 표 2에 표시된 바와 같이 항체의 ADCC 특성을 변경하는 IgG1 분자의 이펙터 도메인 돌연변이 (예: AAA, DE, DLE 돌연변이)는 표 2에 나타내었다.

표 2. "afuc"라는 용어는 아푸코실화 IgG1 분자를 나타낸다. 아푸코실화 항체는 ADCC 특성도 수정되었다.

kit225 세포의 증식 유도에 대한 인간 및 마우스 대리체 SOT202 ADCC 변형 분자의 활성은 실시예 1에 설명한 것과 같이 평가되었으며, SOT101과 비교한 EC50 및 상대적 효능은 표 38 및 표 39에 나타내었다.

마우스 SOT202는 SOT202의 인간 hIgG1 상수 도메인을 마우스에 해당하는 mIgG2a (mSOT202: 서열번호 51, 서열번호 67 및 서열번호 68; mSOT2020 LALAPG: 서열번호 69, 서열번호 70 및 서열번호 68; mSOT202 아이소타입: mSOT202 아이소타입 HC 노브, 서열번호 72 및 서열번호 73; mSOT202 LALAPG 아이소타입: 서열번호 74, 서열번호 75. 서열번호 73)로 대체하여 생성되었다.

표 38: kit225 세포에 대한 인간 SOT202 ADCC 변형 분자의 효능

이 효능 분석은 SOT202가 kit225 세포에서 SOT201과 동일한 효능을 나타내며 (표 28 참조), ADCC 변형이 면역 사이토카인의 효능에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 따라서 이 툴박스를 사용하면 kit225 세포의 활성화와 관련하여 면역 사이토카인의 효능에 영향을 주지 않으면서 항체의 ADCC 활성을 조정할 수 있다.

표 39: kit225 세포에 대한 인간 SOT202 분자 및 마우스 SOT202 대리체의 효능

인간 SOT202의 경우, ADCC 변형 (LALAPG 돌연변이)은 kit225 세포의 활성화와 관련하여 마우스 SOT202 대리체의 효능에 영향을 미치지 않았다. 그러나 마우스 SOT202 대리체는 인간 대리체보다 효능이 떨어졌는데, 이는 kit225 세포가 인간 NK 세포 및 마우스 NK 세포에서 IL-15Rβγ와 공동 신호 전달에 필요한 CD16을 발현하지 않기 때문일 가능성이 높다.

34. 인간 NK 및 CD8 ⁺ T 세포에 대한 인간 SOT202 ADCC 변형 분자의 효능

인간 NK 및 CD8⁺ T 세포의 증식 유도에 대한 인간 SOT202 ADCC 변형 분자의 활성은 실시예 1에 설명된 대로 평가되었으며 (hPBMC 효능 분석), SOT202와 비교한 EC50 및 상대 효능은 그림 21 및 표 40에 나타내었다.

표 40: 인간 NK 및 CD8⁺ T 세포에 대한 인간 SOT202 ADCC 변형 분자의 효능

ADCC를 강화하는 DLE 및 DE 돌연변이가 있는 SOT202-DANA는 ADCC를 변형하지 않은 SOT202-DANA와 비교했을 때 인간 NK 세포 활성을 크게 증가시켰다. 아푸코실화된 SOT202도 ADCC 활성을 증가시켰지만 DE 및 DLE 돌연변이보다는 그 정도가 적었다. 반면에 LALAPG 돌연변이와 같이 ADCC를 감소시키는 돌연변이는 NK 세포의 활성화를 거의 없앴다. 이러한 돌연변이는 CD8 ⁺ T 세포 활성화에 약간의 영향만 미쳤다. 이론에 얽매이지 않고, 돌연변이 강화를 통해 CD16 수용체에 대한 결합력이 높아지면 IL-15Rβγ 신호와 시너지 효과를 내는 것으로 추정된다.

35. 인간 NK 및 CD8 ⁺ T 세포에 대한 인간 SOT202 분자의 효능을 SOT201 분자와 비교한 결과

인간 NK 및 CD8⁺ T 세포의 증식 유도에 대한 인간 SOT202 분자의 활성을 SOT201의 활성과 비교하였다. 도 22와 표 41에는 SOT202와 SOT201에 대한 EC50 및 상대적 효능이 나와 있다.

표 41: 인간 NK 및 CD8⁺ T 세포에 대한 인간 SOT202 분자의 효능, SOT201 비교

인간 NK 및 CD8⁺ T 세포의 증식 유도에 대한 인간 SOT202 분자의 활성을 SOT201-DANA의 활성과 비교하였다. 도 23과 표 41에는 SOT202 및 SOT201과 비교한 EC50 및 상대적 효능이 나와 있다. NA 돌연변이만 있는 분자에 비해 DANA 돌연변이가 있는 분자의 자극 활성이 감소한 것은 이전 예에서 이미 설명한 바와 같이 이 돌연변이의 낮은 자극 활성을 확인시켜 준다. 아푸코실화를 통해 ADCC 활성이 강화된 SOT202 분자(NA 돌연변이가 있는 SOT202)는 NK 세포 활성은 증가하지만 CD8⁺ T 세포 활성은 증가하지 않으며, 실시예 34에 나타난 결과를 확인했다. SOT201은 IgG4 항체를 기반으로 하며, 따라서 IgG4 항체는 본질적으로 낮은 ADCC 활성을 가지고 있다. 다시 말하지만, 이론에 얽매이지 않고 아푸코실화된 분자의 CD16 수용체에 대한 높은 결합이 IL-15Rβγ 신호와 시너지 효과를 낸다고 가정한다.

표 42: 인간 NK 및 CD8⁺ T 세포에 대한 인간 SOT202 분자의 효능(SOT201-DANA와 비교)

SOT202와 SOT201 분자는 인간 CD8⁺ T 세포에는 동일한 효능을 보이지만 NK 세포에는 효능이 없다. 아푸코실화는 인간 NK 세포의 활성을 증가시켰다.

36. mSOT202가 건강한 C57BL/6 마우스의 비장에서 면역 세포를 활성화한다

SOT202의 인간 hIgG1 상수 도메인을 마우스에 상응하는 mIgG2a로 대체하여 마우스 SOT202를 생성했다 (서열번호 66, 서열번호 67 및 서열번호 68). 건강한 C57BL/6 마우스에 5, 10 또는 20 mg/kg의 mSOT202 화합물을 정맥 주사한 후 5일 후 유세포 분석법으로 비장에서 세포 증식(Ki67)이 감지되었다. mSOT202는 NK 및 CD8⁺ T 세포의 용량 의존적 자극을 보였다 (도 24 (A) 및 (B)).

37. mSOT202는 ADCC 활성과 NK 세포 증식에 대한 RLI2 자극 사이의 시너지를 유도한다

건강한 C57BL/6 마우스에 5mg/kg의 mSOT202 분자를 정맥 주사한 후 5일 및 10일 후 유세포 분석법으로 비장에서 세포 증식(Ki67)이 검출되었다. mSOT202의 NK세포에 대한 증식 활성은 mSOT202-LALAPG(hCl1a-mIgG2a-NA 1x)의 효과에 hCl1a-mIgG2a(RLI2가 없는 분자)를 더한 효과보다 높았다 (도 25(A)), ADCC 활성이 없음)의 효과는 mSOT202에서 항체의 ADCC 활성과 RLI2의 증식 활성 사이의 시너지 효과를 보여주며 (도 25(A)), 이는 CD16 신호에 의한 것으로 추정된다. 따라서 ADCC는 NK 세포의 활성 증가에 기여할 수 있다.

이 실험 모델에서는 CD8⁺ T 세포 자극에 대한 시너지를 측정할 수 없었다(도 25 (B)).

SEQUENCE LISTING <110> CYTUNE PHARMA SOTIO Biotech a.s. <120> Interleukin 15 variants <130> C10962WO <150> EP21181261.5 <151> 2021-06-23 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 3 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mature human IL-15-AQ <400> 3 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Ala Gln Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 4 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr 20 25 30 Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser 35 40 45 Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 65 70 75 80 Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp 85 90 95 Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr 100 105 110 Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu 115 120 125 Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala 130 135 140 Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr 145 150 155 160 Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser 165 170 175 Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln 180 185 190 Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile 195 200 205 Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu 210 215 220 Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu 225 230 235 240 Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg 245 250 255 Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu 260 265 <210> 5 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys 20 25 30 Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala 35 40 45 Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys 50 55 60 <210> 6 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu 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175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser 180 185 190 Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn 195 200 205 Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro 210 215 220 Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Asn Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys 245 250 255 Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn 275 280 285 Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu 325 330 335 Gly Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg 340 345 350 Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp 370 375 380 Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser 405 410 415 Glu Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser 420 425 430 Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Asp Ser 435 440 445 Phe Ser Arg Thr Pro Gly 450 <210> 76 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI-15AQ peptide <400> 76 Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp 1 5 10 15 Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Gln Val 35 <210> 77 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI-15AQA peptide <400> 77 Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp 1 5 10 15 Thr Val Glu Ala Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn 20 25 30 Ala Gln Val 35 <210> 78 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI-15 NA peptide <400> 78 Val Glu Ala Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly 1 5 10 15 Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys 20 25 30 <210> 79 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLI-15AQA peptide <400> 79 Val Glu Ala Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Ala 1 5 10 15 Gln Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys 20 25 30

Claims

성숙한 인간 IL-15 (interleukin-15)의 G78 위치 및 N79 위치에서 아미노산 치환 (amino acid substitutions)을 포함하는 인터루킨-15 (IL-15) 변이체 (variant).
제1항에 있어서, 상기 IL-15 변이체는 아미노산 치환 G78A, G78V, G78L 또는 G78I 및 N79Q, N79H 또는 N79M, 바람직하게는 G78A 및 N79Q를 포함하는 것인 IL-15 변이체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IL-15 변이체는 포유류 세포주 (mammalian cell line)에서 발현된 것으로서, 바람직하게는 상기 포유류 세포주는 CHO 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, SP20 세포, NSO 세포 또는 이들로부터 유래된 임의의 세포로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 CHO 세포로부터 선택되는 IL-15 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환은
(a) 성숙한 인간 IL-15와 비교하여 IL-15 변이체의 N77에서의 탈아미드화 및 N79에서의 글리코실화 (glycosylation)를 감소시키고
(b) 30 % 미만의 글리코실화된 IL-15 변이체, 바람직하게는 25 % 미만의 글리코실화된 IL-15 변이체를 초래하며, 및/또는,
(c) 성숙한 인간 IL-15와 비교하여 IL-15 변이체의 N71에서 글리코실화를 증가시키는 IL-15 변이체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 Kit225 세포, 32Db 세포, 인간 PBMC 또는 프로메가 IL-15-생물학적 분석 (Promega IL-15-bioassay)의 증식 유도에 대한 IL-15 변이체의 IL-15 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 IL-15 변이체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-15 변이체는 위치 N71 및/또는 위치 N77에 치환을 가지지 않는 IL-15 변이체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-15 변이체는 IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γ_c 수용체 및/또는 IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 적어도 하나의 추가 치환을 추가로 포함하고,
선택적으로
(a) IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γ_c 수용체에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환을 위한 사이트는 N1, N4, S7, D8, K10, K11, D30, D61, E64, N65, L69, N72, E92, Q101, Q108 및 I111로 이루어진 목록에서 선택되며, 바람직하게는 D61, N65 및 Q101, 가장 바람직하게는 N65로 이루어진 목록 중에서 선택되고;
(b) IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환은 N1D, N1A, N1G, N4D, S7Y, S7A, D8A, D8N, K10A, K11A, D30N, D61A, D61N, E64Q, N65D, N65A, N65E, N65R, N65K, L69R, N72R, Q101D, Q101E, Q108D, Q108A, Q108E, 및 Q108R로 이루어진 목록에서 선택되고;
바람직하게는 D8A, D8N, D61A, D61N, N65A, N65D, N72R, Q101D, Q101E 및 Q108A로 이루어진 목록에서 선택되고,
보다 바람직하게는 D61A, N65A 및 Q101로 이루어진 목록에서 선택되고, 가장 바람직하게는 N65A; 또는
(c) IL-2/IL-15Rβ 및/또는 γc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환은 결합 치환 (combined substitution)이며, D8N/N65A, D61A/N65A 및 D61A/N65A/Q101D로 이루어진 목록에서 선택되고, 및/또는
선택적으로
(a) IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환을 위한 사이트는 L44, L45, E46, L47, V49, I50, S51, E64, L66, I67, I68 및 L69로 이루어진 목록에서 선택되고,
(b) IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환은 L44D, E46K, E46G, L47D, V49D, V49R, I50D, L66D, L66E, I67D 및 I67E로 이루어진 목록에서 선택되거나, 또는
(c) IL-15Rα에 대한 결합을 감소시키는 추가 치환은 E46G/V49R, N1A/D30N/E46G/V49R, N1G/D30N/E46G/V49R/E64Q, V49R/E46G/N1A/D30N 및 V49R/E46G/N1G/E64Q/D30N로 이루어진 목록에서 선택된 조합된 치환인 IL-15 변이체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 IL-15 변이체를 포함하는 접합체 (conjugate)로서, 선택적으로 상기 접합체는 IL-15Rα의 스시 도메인 (sushi domain) 또는 그 유도체를 추가로 포함하는 접합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 IL-15 변이체를 포함하는 융합 단백질 (fusion protein)로서, 선택적으로 상기 융합 단백질은 IL-15Rα의 스시 도메인 또는 이의 유도체, 표적화 모이어티 (targeting moiety) 및/또는 반감기 연장 모이어티 (a half-life extending moiety), 및 선택적으로 하나 이상의 링커를 추가로 포함하는 것인 융합 단백질.
제9항에 있어서, 상기 융합 단백질은 바람직하게는 N- 내지 C- 말단 순서로 인간 IL-15Rα 스시 도메인, 링커 및 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 IL-15 변이를 포함하며,
바람직하게는, 인간 IL-15Rα 스시 도메인은 서열번호 5의 서열을 포함하고, 링커는 18 내지 22 아미노산 길이를 가지며, 링커는 세린 (serine) 및 글리신 (glycine)으로 구성되고, 및
더욱 바람직하게는 상기 융합 단백질은 서열번호 9 또는 서열번호 10인 것인 융합 단백질.
제9항 또는 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 바람직하게는 종양 항원 (tumor antigen), 종양 세포외 기질 항원 (tumor extracellular matrix antigen), 또는 종양 혈관신생 항원 (tumor neovascularization antigen), 또는 면역조절 항체 (immunomodulatory antibody)이고,
선택적으로 융합 단백질은 항체의 적어도 하나의 중쇄 (heavy chain)의 C-말단 또는 항체의 두 경쇄 (light chains)의 C-말단에 융합되는 것인 융합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 IL-15 변이체, 제8항의 접합체 또는 제9항 내지 11항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 (nucleic acid).
제12항의 핵산을 포함하는 벡터 (vector).
제12항의 핵산 또는 제13항의 벡터를 포함하는 숙주 세포 (host cell).
치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 IL-15 변이체, 제8항의 접합체, 또는 제9항 내지 제11항의 융합 단백질, 제12항의 핵산 또는 제13항의 벡터.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항의 IL-15 변이체, 제8항의 접합체 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제12항의 핵산 또는 제13항의 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 약제학적 조성물.
신생물학적 질환 (neoplastic disease) 또는 감염성 질환 (infectious disease)을 앓고 있거나, 발생 위험 및/또는 진단받은 대상의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 IL-15 변이체, 제8항의 접합체, 또는 제9항 내지 제11항의 융합 단백질, 제12항의 핵산 또는 제13항의 벡터.