JP2022549994A - Ssx2抗原の短いペプチドを識別するt細胞受容体 - Google Patents
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Abstract
Description
別の好ましい例において、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインのCDR3のアミノ酸配列は、AEPNQAGTALI(SEQ ID NO:12)であり、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインのCDR3のアミノ酸配列は、ASSSLEDPYEQY(SEQ ID NO:15)である。
α CDR1―DSSSTY(SEQ ID NO:10)、
α CDR2―IFSNMDM(SEQ ID NO:11)、
α CDR3―AEPNQAGTALI(SEQ ID NO:12)であり、および/または
前記TCRβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β CDR1―MNHEY(SEQ ID NO:13)、
β CDR2―SVGEGT(SEQ ID NO:14)、
β CDR3―ASSSLEDPYEQY(SEQ ID NO:15)である。
別の好ましい例において、前記TCRは、β鎖可変ドメインのアミノ酸配列SEQ ID NO:5を含む。
別の好ましい例において、前記TCRは、TCRα鎖定常領域TRAC*01およびTCRβ鎖定常領域TRBC1*01またはTRBC2*01を含む、αβヘテロダイマーである。
別の好ましい例において、前記TCRは、可溶性である。
別の好ましい例において、前記TCRは、一本鎖である。
別の好ましい例において、前記TCRは、ペプチドリンカー配列を介してα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとを結合することによって形成される。
別の好ましい例において、前記TCRのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:30である。
別の好ましい例において、前記TCRは、(a)膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部または一部、および(b)膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部または一部を含み、
別の好ましい例において、システイン残基は、前記TCRのα鎖定常ドメインとβ鎖定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成する。
別の好ましい例において、前記TCRにおいて人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer77、
TRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer17、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAsp59、
TRAC*01エクソン1のSer15およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu15、
TRAC*01エクソン1のArg53およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer54、
TRAC*01エクソン1のPro89およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAla19、および
TRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu20から選択される1つの群または複数の群の部位を置換する。
別の好ましい例において、前記TCRのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、または
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸から選択される1つの群または複数の群の部位を置換することを特徴とする。
別の好ましい例において、前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC―末端またはN―末端にコンジュゲートが結合される。
別の好ましい例において、前記T細胞受容体に結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせであり、好ましくは、前記治療剤は、抗―CD3抗体である。
別の好ましい例において、前記核酸分子は、TCRα鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:33を含む。
別の好ましい例において、前記核酸分子は、TCRα鎖をコードするヌクレオチド配列SEQ ID NO:4を含み、および/またはTCRβ鎖をコードするヌクレオチド配列SEQ ID NO:8を含む。
好ましくは、前記疾患は、腫瘍であり、好ましくは、前記腫瘍は、肝細胞がんである。
MHC分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であり、クラスIまたはクラスIIのMHC分子であり得る。従って、抗原の提示に対して特異性を有し、異なる個体は、異なるMHCを有し、タンパク質抗原の異なる短いペプチドをそれぞれのAPC細胞表面に提示することができる。ヒトMHCは、通常HLA遺伝子またはHLA複合体と呼ばれる。
天然のTCRの膜近位領域のCα鎖とCβ鎖との間には、一つのグループのジスルフィド結合が存在し、本発明では、「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。本発明において、天然の鎖間ジスルフィド結合とは位置が異なる人工的に導入された鎖間共有ジスルフィド結合は、「人工鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。
TCR分子
抗原プロセシングの過程において、抗原は、細胞内で分解され、次にMHC分子によって細胞表面に運ばれる。T細胞受容体は、抗原提示細胞表面のペプチド―MHC複合体を識別することができる。従って、本発明の第1の態様は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合することができるTCR分子を提供する。好ましくは、前記TCR分子は、単離または精製される。当該TCRのα鎖およびβ鎖は、それぞれ三つの相補性決定領域(CDR)を有する。
α CDR1―DSSSTY(SEQ ID NO:10)、
α CDR2―IFSNMDM(SEQ ID NO:11)、
α CDR3―AEPNQAGTALI(SEQ ID NO:12)のアミノ酸配列を有するCDRを含み、および/または
前記TCRβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β CDR1―MNHEY(SEQ ID NO:13)、
β CDR2―SVGEGT(SEQ ID NO:14)、
β CDR3―ASSSLEDPYEQY(SEQ ID NO:15)である。
本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様のTCR分子またはその一部コードする核酸分子を提供し、前記一部は、一つまたは複数のCDR、α鎖および/またはβ鎖の可変ドメイン、およびα鎖および/またはβ鎖であり得る。
α CDR1―gacagctcctccacctac(SEQ ID NO:16)、
α CDR2―attttttcaaatatggacatg(SEQ ID NO:17)、
α CDR3―gcagaacctaaccaggcaggaactgctctgatc(SEQ ID NO:18)であり、
本発明の第1の態様のTCR分子のβ鎖CDR領域をコードするヌクレオチド配列は、
β CDR1―atgaaccatgaatac(SEQ ID NO:19)、
β CDR2―tcagttggtgagggtaca(SEQ ID NO:20)、
β CDR3―gccagcagttccctggaggacccctacgagcagtac(SEQ ID NO:21)である。
本発明は、発現ベクター、即ち、インビボまたはインビトロで発現することができる構築物を含む、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。一般に使用されるベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージおよび動植物ウイルスを含む。
好ましくは、ベクターは、本発明のヌクレオチドをT細胞等の細胞に移して、当該細胞がSSX2抗原に特異的なTCRを発現させることができる。理想的には、当該ベクターは、T細胞で高レベルで持続的に発現されることができる。
本発明は、本発明のベクターまたはコード配列を使用して遺伝子工学によって作成された宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、本発明のベクターを含むか、または染色体には本発明の核酸分子が組み込まれた。宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、CHO細胞等の原核細胞および真核細胞から選択される。
本発明は、SSX2特異的T細胞を被験者に養子移入する段階を含む、被験者におけるSSX2関連疾患を治療および/または予防する方法に関する。当該SSX2特異的T細胞は、KASEKIFYV―HLA A0201複合体を識別することができる。
本発明のSSX2特異的T細胞は、SSX2抗原の短いペプチドKASEKIFYV―HLA A0201複合体を提示する任意のSSX2関連疾患を治療するために使用されることができる。例えば、黒色腫、頭頸部がん、リンパ腫、様々な骨髄腫、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、肝細胞がんおよび結腸がん等の腫瘍を含むが、これらに限定されない。
治療は、SSX2抗原関連疾患に罹患している患者またはボランティアからT細胞を単離し、本発明のTCRを上記T細胞に導入し、次にこれらの遺伝子操作された細胞を治療のために患者の体内に注入することによって実施されることができる。従って、本発明は、本発明のTCRを発現する単離されたT細胞を含む、SSX2関連疾患を治療する方法を提供し、好ましくは、当該T細胞は、患者自身に裕頼氏、患者の体内に移される。一般に、(1)患者のT細胞の単離、(2)本発明の核酸分子または本発明のTCR分子をコードすることができる核酸分子によるT細胞のインビトロ形質導入、(3)患者の体内に注入された遺伝子操作されたT細胞を含む。単離、トランスフェクションおよび再注入される細胞の数は、医師によって決定されることができる。
(1)本発明のTCRは、SSX2抗原の短いペプチド複合体KASEKIFYV―HLA A0201に結合することができ、同時に、本発明のTCRで形質導入された細胞は、特異的に活性化され、かつ標的細胞に対して強い殺傷効果を有することができる。
合成短いペプチドKASEKIFYV(SEQ ID NO.:9、北京サイバーソン遺伝子技術株式会社)を使用して、遺伝子型がHLA―A0201である健康なボランティアの末梢血リンパ球(PBL)を刺激する。KASEKIFYV短いペプチドを、ビオチンマーカーを有するHLA―A0201で再生し、pHLA半数体を調製する。これらの半数体は、PEマーカーのストレプトアビジン(BD会社)と組み合わせてPEマーカーのテトラマーを形成し、当該テトラマーおよび抗―CD8―APC二重陽性細胞が選択される。選択された細胞を増幅し、上記方法に従って二次選択を行い、次に限界希釈法を使用してものクローニングを行う。モノクローナル細胞は、テトラマーで染色され、スクリーニングされた二重陽性クローンは、図3に示されたとおりである。
用Quick―RNA(商標)miniPrep(ZYMO research)を使用して、実施例1でスクリーニングされた抗原の短いペプチドKASEKIFYV特異性、HLA―A0201限制性T細胞クローンのトータルRNAを抽出する。cDNAの合成は、clontechのSMART RACE cDNA増幅キットを使用し、使用されるプライマーは、ヒトTCR遺伝子のC末端保存領域で設計される。配列をTベクター(TAKARA)にクローンしてシーケンシングする。当該配列は、イントロンを含まない相補的配列であることに注意されたい。シーケンシング後、当該二重陽性クローンによって発現されたTCRのα鎖およびβ鎖の配列構造は、それぞれ図1および図2示されたとおりであり、図1a、図1b、図1c、図1d、図1eおよび図1fは、それぞれTCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列、TCRα鎖可変ドメインのヌクレオチド配列、TCRα鎖アミノ酸配列、TCRα鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有するTCRα鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するTCRα鎖ヌクレオチド配列であり、図2a、図2b、図2c、図2d、図2eおよび図2fは、それぞれTCRβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列、TCRβ鎖可変ドメインのヌクレオチド配列、TCRβ鎖アミノ酸配列、TCRβ鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有するTCRβ鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するTCRβ鎖ヌクレオチド配列である。
α CDR1―DSSSTY(SEQ ID NO:10)、
α CDR2―IFSNMDM(SEQ ID NO:11)、
α CDR3―AEPNQAGTALI(SEQ ID NO:12)のアミノ酸配列を有するCDRを含み、
β鎖は、
β CDR1―MNHEY(SEQ ID NO:13)、
β CDR2―SVGEGT(SEQ ID NO:14)、
β CDR3―ASSSLEDPYEQY(SEQ ID NO:15)のアミノ酸配列を有するCDRを含む。
可溶性TCR分子を得るために、本発明のTCR分子のα鎖およびβ鎖は、それぞれその可変ドメインおよび定常ドメインの一部のみを含むことができ、またα鎖およびβ鎖の定常ドメインにそれぞれ一つのシステイン残基を導入して、人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成し、システイン残基を導入した位置は、それぞれTRAC*01エクソン1のThr48およびTRBC2*01エクソン1のSer57であり、そのα鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図4aおよび図4bに示されたとおりであり、そのβ鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図5aおよび図5bに示されたとおりである。「分子クローニング:実験マニュアル」(Molecular Cloning aLaboratory Manual)(第3版、SambrookおよびRussell)に記載の標準的な方法を通じて、上記TCRのα鎖およびβ鎖の標的遺伝子配列を合成した後、それぞれ発現ベクターpET28a+(Novagene)に插入し、上流と下流とのクローニング部位は、それぞれNcoIおよびNotIである。插入されたフラグメントは、シーケンシングによって確認される。
特許文書WO2014/206304の記載によると、部位特異的突然変異の方法を使用して、実施例2のTCRのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを、一つの柔軟な短いペプチド(リンカー(linker))によって結合された安定的で可溶性の一本鎖TCR分子に構築した。当該一本鎖TCR分子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図7aおよび図7bに示されたとおりである。そのα鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図8aおよび図8bに示されたとおりであり、そのβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図9aおよび図9bに示されたとおりであり、そのリンカー配列のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図10aおよび図10bに示されたとおりである。
実施例4で調製された組換えプラスミドpET28a―テンプレート鎖を含むすべてのBL21(DE 3)コロニーを、カナマイシンを含むLB培地に接種し、37℃でOD600が0.6~0.8になるまで培養し、最終濃度が0.5mMになるようにIPTGを加え、37℃で4時間インキュベートし続ける。5000rpmで15分間遠心分離して細胞ペレットを溶解し、Bugbuster Master Mix(Merck)で細胞ペレットを溶解し、6000rpmで15分間遠心分離して封入体を回収し、再びBugbuster(Merck)で洗浄して細胞破片および膜成分を除去し、6000rpmで15分間遠心分離して、封入体を収集する。封入体を緩衝液(20mMのトリス―HCl、pH8.0、8Mの尿素)に溶解し、高速で遠心分離して不溶性物質を除去し、上清液をBCA法で定量した後、分注して―80℃で保存する。
本発明で得られた可溶性一本鎖TCRのSDS―PAGEゲル図は、図11に示されたとおりである。
BIAcore分析
本実施例は、本発明の可溶性TCR分子がKASEKIFYV―HLA A0201複合体に特異的に結合されることができることを証明する。
a.精製
重鎖または軽鎖の発現を誘導するE.coli菌溶液を100mL収集し、4℃、8000gで10分間遠心分離した後、10mLのPBSで細菌を1回洗浄し、その後5mLのBugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)で激しく振とうして細菌を再懸濁し、室温下で回転させながら20分間インキュベートし、その後4℃、6000gで15分間遠心分離し、上清を捨て、封入体を収集する。
合成された短いペプチドKASEKIFYV(北京サイバーソン遺伝子技術株式会社)を20mg/mlの濃度になるまでDMSOに溶解する。軽鎖および重鎖の封入体を、8M尿素、20mMのトリス、pH8.0、10mMDTTで溶解し、再生前に、3M塩酸グアニジン、10mM酢酸ナトリウム、10mMEDTAを加えてさらに変性する。KASEKIFYVペプチドを25mg/L(最終濃度)で再生緩衝液(0.4ML―アルギニン、100mMトリス、pH8.3、2mMEDTA、0.5mM酸化型グルタチオンペプチド、5mM還元型グルタチオンペプチド、0.2mMPMSF、4℃に冷却する)に加え、次に順次に20mg/Lの軽鎖および90mg/Lの重鎖を加え(最終濃度、重鎖は、8時間/回で3回分けて加える)、再生は、4℃で少なくとも3日で完了し、SDS―PAGEで再生が成功したかどうかを検出する。
透析用として10倍量の20mMトリス、pH8.0を使用して、再生緩衝液を交換し、緩衝液を少なくとも2回交換して、溶液のイオン強度を十分に低下させる。透析後、タンパク質溶液を0.45μmの酢酸セルロースフィルターメンプレンでろ過し、次にHiTrap Q HP(GEゼネラルエレクトリックカンパニー(GE General Electric Company))陰イオン交換カラム(5mLのベッドボリューム)にロードする。Akta精製器(GEゼネラルエレクトリックカンパニー)を使用して、20mMトリスpH8.0で配制した0~400mMNaCl線形勾配溶液でタンパク質を溶出し、pMHCは、約250mMNaClで溶出され、各ピーク成分を収集し、SDS―PAGEで純度を検出する。
精製したpMHC分子をMillipore限外ろ過チューブで濃縮し、同時に緩衝液を20mMトリスpH8.0に変換し、次にビオチン化試薬0.05MBicine、pH8.3、10mMATP、10mMMgOAc、50μmのD―ビオチン、100μg/mlのBirA酵素(GST―BirA)を加え、室温下で混合物を一晩インキュベートし、SDS―PAGEでビオチン化が完了したかどうかを検出する。
Millipore限外ろ過チューブでマーカー後のビオチン化pMHC分子を1mLに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用してビオチン化pMHCを精製し、Akta精製器(GEゼネラルエレクトリックカンパニー)を使用して、ろ過したPBSを使用して、HiPrepTM 16/60 S200 HRカラム(GEゼネラルエレクトリックカンパニー)を事前に平衡化し、1mLの濃縮後のビオチン化pMHC分子をロードし、次にPBSで1mL/minの流速で溶出する。ビオチン化pMHC分子は、約55mLで単一のピークとして溶出される。タンパク質を含む成分を合併し、Millipore限外ろ過チューブで濃縮し、BCA法(Thermo)でタンパク質濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤cocktail(Roche)を加えて、ビオチン化pMHC分子を分注して、―80℃で保存する。
本発明のTCR標的遺伝子を含むレンチウイルスベクターを構築し、T細胞を形質導入し、ELISPOT機能検証試験を実施する。
ELISPOTスキーム
以下の試験を実施して、標的細胞特異性に対する本発明のTCRで形質導入されたT細胞の活性化反応を証明する。ELISPOT試験で検出されたIFN―γ生成量をT細胞活性化の読み出し値として使用する。
試験培地:10%FBS(ギブコ会社(Gibco)、カタログ番号16000―044)、RPMI 1640(ギブコ会社(Gibco)、カタログ番号C11875500bt)
洗浄緩衝液(PBST):0.01MPBS/0.05%トゥイーン(Tween)20
PBS(ギブコ会社(Gibco)、カタログ番号C10010500BT)
PVDF ELISPOT 96ウェルプレート(メルクミリポア(Merck Millipore)、カタログ番号MSIPS4510)
ヒトIFN―γ ELISPOT PVDF―酵素キット(BDは、必要とする他のすべての試薬(捕捉および検出抗体、ストレプトアビジン―アルカリホスファターゼおよびBCIP/NBT溶液)を含む
標的細胞の調製
本実験で使用される標的細胞は、特異的短いペプチドをロードするT2細胞である。実験培地で標的細胞を調製する。標的細胞の濃度を2.0×105細胞/mLに調整し、ウェルあたり100μLを摂取することにより、2.0×104細胞/ウェルを得る。
本実験におけるエフェクター細胞(T細胞)は、本発明のSSX2抗原の短いペプチドの特異的なTCRを発現するCD8+ T細胞であり、同じボランティアからの本発明のTCRでトランスフェクトされたCD8+ T細胞を対照グループとして使用する。抗CD3/CD28コーティングビーズ(T細胞増幅産物、ライフテクノロジー(life technologies))でT細胞を刺激し、SSX2抗原の短いペプチド特異的なTCR遺伝子を保有するレンチウイルスで形質導入し、形質導入後9~12日まで50IU/mlのIL―2および10ng/mlのIL―7を含む10%FBSを含む1640培地で増幅し、次にこれらの細胞を試験培地に入れ、室温下で300gで10分間遠心分離して洗浄する。次に細胞を、所望の最終濃度の2倍で試験培地に再懸濁する。陰性対照エフェクター細胞も同様に処理する。
ELISPOTウェルプレートにおける短いペプチドの最終濃度が1μg/mlにするために、対応する短いペプチドを対応する標的細胞(T2)実験グループに加える。
製造業者の説明書に従って、ウェルプレートを次のように準備する。抗ヒトIFN―γ捕捉抗体をプレートあたり10mLの滅菌PBSで1:200に希釈し、次に、100μLの希釈捕捉抗体を各ウェルに均等に加える。4℃下でウェルプレートを一晩インキュベートする。インキュベートした後、ウェルプレートを洗浄して、過剰な捕捉抗体を除去する。10%FBSを含む100μL/ウェルのRPMI 1640培地を加え、ウェルプレートを密閉するために、室温下でウェルプレートを2時間インキュベートする。次にウェルプレートから培地を洗い流し、ELISPOTウェルプレートを紙上でフリックして軽くたたくことにより、残りの洗浄緩衝液をすべて除去する。
100μLの標的細胞2*105細胞/mL(合計で約2*104標的細胞/ウェルを得る)。
100μLのエフェクター細胞(1*104対照エフェクター細胞/ウェルおよびSSX2 TCR陽性T細胞/ウェル)。
すべてのウェルは、2回重複して調製され追加される。
ELISPOT実験(上記のように)を使用して、SSX2抗原の短いペプチドKASEKIFYVをロードする標的細胞に反応する、本発明のTCRで形質導入されたT細胞のIFN―γ放出を試験する。graphpad prism6を使用して、各ウェルで観察されたELSPOTスポットの数を製図する。
本実施例は、本発明のTCRでトランスフェクトされたエフェクター細胞が、標的細胞に対して良好な特異的活性化効果を有することを検証する。細胞における本発明のTCRの機能および特異性をELISPOT実験によって検出される。
Claims (33)
- T細胞受容体(TCR)であって、
前記TCRは、KASEKIFYV―HLA A0201複合体に結合することができ、好ましくは、前記TCRは、TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインのCDR3のアミノ酸配列は、AEPNQAGTALI(SEQ ID NO:12)であり、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインのCDR3のアミノ酸配列は、ASSSLEDPYEQY(SEQ ID NO:15)であることを特徴とする、前記TCR。 - 前記TCRα鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域(CDR)は、
α CDR1―DSSSTY(SEQ ID NO:10)、
α CDR2―IFSNMDM(SEQ ID NO:11)、
α CDR3―AEPNQAGTALI(SEQ ID NO:12)であり、および/または
前記TCRβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β CDR1―MNHEY(SEQ ID NO:13)、
β CDR2―SVGEGT(SEQ ID NO:14)、
β CDR3―ASSSLEDPYEQY(SEQ ID NO:15)であることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - TCRα鎖可変ドメインおよびTCRβ鎖可変ドメインを含み、前記TCRα鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:1と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインは、SEQ ID NO:5と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRは、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列SEQ ID NO:1を含むことを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRは、β鎖可変ドメインのアミノ酸配列SEQ ID NO:5を含むことを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRは、TCRα鎖定常領域TRAC*01およびTCRβ鎖定常領域TRBC1*01またはTRBC2*01を含む、αβヘテロダイマーであることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記TCRのα鎖アミノ酸配列は、SEQ ID NO:3であり、および/または前記TCRのβ鎖アミノ酸配列は、SEQ ID NO:7であることを特徴とする
請求項6に記載のTCR。 - 前記TCRは、可溶性であることを特徴とする
請求項1~5のいずれか1項に記載のTCR。 - 前記TCRは、一本鎖であることを特徴とする
請求項8に記載のTCR。 - 前記TCRは、ペプチドリンカー配列を介してα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとを結合することによって形成されることを特徴とする
請求項9に記載のTCR。 - 前記TCRは、α鎖可変領域の11、13、19、21、53、76、89、91、または94番目のアミノ酸位置、および/またはα鎖J遺伝子の短いペプチドの最後から3番目、最後から5番目または最後から7番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異を有し、および/または前記TCRは、β鎖可変領域の11、13、19、21、53、76、89、91、または94番目のアミノ酸位置、および/またはβ鎖J遺伝子の短いペプチドの最後から2番目、最後から4番目または最後から6番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異を有し、ここで、アミノ酸の位置番号は、IMGT(国際免疫遺伝学情報システム)に記載された位置番号によることを特徴とする
請求項10に記載のTCR。 - 前記TCRα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:32を含み、および/または前記TCRβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:34を含むことを特徴とする
請求項11に記載のTCR。 - 前記TCRのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:30であることを特徴とする
請求項12に記載のTCR。 - 前記TCRは、(a)膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部または一部、および(b)膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部または一部を含み、
また(a)および(b)は、それぞれ機能的可変ドメインを含むか、または機能的可変ドメインを含み、前記TCR鎖定常ドメインの少なくとも一部をさらに含むことを特徴とする
請求項8に記載のTCR。 - システイン残基は、前記TCRのα鎖定常ドメインとβ鎖定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成することを特徴とする
請求項14に記載のTCR。 - 前記TCRにおいて人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAC*01エクソン1のThr48およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer57、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer77、
TRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer17、
TRAC*01エクソン1のThr45およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAsp59、
TRAC*01エクソン1のSer15およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu15、
TRAC*01エクソン1のArg53およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のSer54、
TRAC*01エクソン1のPro89およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のAla19、および
TRAC*01エクソン1のTyr10およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1のGlu20から選択される一つまたは複数の部位を置換することを特徴とする
請求項15に記載のTCR。 - 前記TCRα鎖アミノ酸配列は、SEQ ID NO:26であり、および/または前記TCRβ鎖アミノ酸配列は、SEQ ID NO:28であることを特徴とする
請求項16に記載のTCR。 - 前記TCRのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれることを特徴とする
請求項14に記載のTCR。 - 前記TCRにおいて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸、
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、
TRAVの46番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の61番目のアミノ酸、または
TRAVの47番目のアミノ酸およびTRBC1*01またはTRBC2*01エクソン1の60番目のアミノ酸から選択される1つの群または複数の群の部位を置換することを特徴とする
請求項18に記載のTCR。 - 前記TCRは、α鎖可変ドメイン、β鎖可変ドメインおよび膜貫通ドメインを除くβ鎖定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖定常ドメインを含まず、前記TCRα鎖可変ドメインとβ鎖とは、ヘテロダイマーを形成することを特徴とする
請求項18または19に記載のTCR。 - 前記TCRのα鎖および/またはβ鎖のC―末端またはN―末端にコンジュゲートが結合されることを特徴とする
請求項1に記載のTCR。 - 前記T細胞受容体に結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、PK修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせであり、好ましくは、前記治療剤は、抗―CD3抗体であることを特徴とする
請求項21に記載のTCR。 - 多価TCR複合体であって、
少なくとも二つのTCR分子を含み、またそのうちの少なくとも一つのTCR分子は、前記請求項のいずれか1項に記載のTCRであることを特徴とする、前記多価TCR複合体。 - 核酸分子であって、
前記核酸分子は、前記請求項のいずれか1項に記載のTCR分子をコードする核酸配列またはその相補的配列を含むことを特徴とする、前記核酸分子。 - TCRα鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:33を含むことを特徴とする
請求項24に記載の核酸分子。 - TCRβ鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:35を含むことを特徴とする
請求項24または25に記載の核酸分子。 - TCRα鎖をコードするヌクレオチド配列SEQ ID NO:4を含み、および/またはTCRβ鎖をコードするヌクレオチド配列SEQ ID NO:8を含むことを特徴とする
請求項24に記載の核酸分子。 - ベクターであって、
前記ベクターは、請求項24~27のいずれか1項に記載の核酸分子を含み、好ましくは、前記ベクターは、ウイルスベクターであり、より好ましくは、前記ベクターは、レンチウイルスベクターであることを特徴とする、前記ベクター。 - 単離された宿主細胞であって、
前記宿主細胞は、請求項25に記載のベクターを含むか、または染色体には外因性の請求項24~27のいずれか1項に記載の核酸分子が組み込まれたことを特徴とする、前記単離された宿主細胞。 - 細胞であって、
前記細胞は、請求項24~27のいずれか1項に記載の核酸分子または請求項28に記載のベクターで形質導入され、好ましくは、前記細胞は、T細胞または幹細胞であることを特徴とする、前記細胞。 - 医薬組成物であって、
前記組成物は、薬学的に許容される担体および請求項1~22のいずれか1項に記載のTCR、請求項23に記載のTCR複合体、または請求項30に記載の細胞を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。 - 請求項1~22のいずれか1項に記載のT細胞受容体、または請求項23に記載のTCR複合体または請求項30に記載の細胞の用途であって、
腫瘍または自己免疫疾患を治療する薬物の調製に使用され、好ましくは、前記腫瘍は、SSX2抗原陽性腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、黒色腫、頭頸部がん、リンパ腫、様々な骨髄腫、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、肝細胞がんおよび結腸がんを含むことを特徴とする、前記用途。 - 疾患を治療する方法であって、
治療を必要とする対象に適切な量の請求項1~22のいずれか1項に記載のTCR、請求項23に記載のTCR複合体、請求項30に記載の細胞または請求項31に記載の医薬組成物を投与する段階を含み、
好ましくは、前記腫瘍は、SSX2抗原陽性腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、黒色腫、頭頸部がん、リンパ腫、様々な骨髄腫、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、肝細胞がんおよび結腸がんを含むことを特徴とする、前記疾患を治療する方法。
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