KR20210121120A

KR20210121120A - 반감기 연장된 immtac 결합 cd3 및 hla-a*02 제한 펩티드

Info

Publication number: KR20210121120A
Application number: KR1020217026912A
Authority: KR
Inventors: 폴 콘로이; 스티픈 하티; 아만딘 조지스; 록 행 맥; 니콜라이 리신; 앤드류 데이빗 존슨; 엠마 호지슨; 우도포요 우예
Original assignee: 이뮤노코어 리미티드
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2020-01-30
Publication date: 2021-10-07
Also published as: US20220119479A1; WO2020157211A1; AU2020213907A1; MX2021009274A; CN113474367A; IL284891A; CA3126628A1; GB201901306D0; EP3917955A1; BR112021014962A2; JP2022523722A

Abstract

본 발명은 항원에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR), 면역글로불린 Fc 도메인 또는 알부민-결합 모이어티; 및 면역 이펙터 도메인을 포함하는 가용성 다중-도메인 결합 분자에 관한 것이다. 이러한 다중-도메인 결합 분자는 기능을 유지하면서 개선된 반감기를 나타내기 때문에 유리하다.

Description

반감기 연장된 IMMTAC 결합 CD3 및 HLA-A*02 제한 펩티드

본 발명은 항원에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체(TCR), 면역글로불린 Fc 도메인 또는 알부민-결합 모이어티(moiety); 및 면역 이펙터 도메인(immune effector domain)을 포함하는 가용성 다중-도메인 결합 분자에 관한 것이다. 이러한 다중-도메인 결합 분자는 기능을 유지하면서 개선된 반감기를 나타내기 때문에 유리하다.

항체 단편 및 융합 단백질을 포함한 많은 단백질-기반 치료제는 투여 후 신체로부터 빠르게 제거된다. 이들의 짧은 순환 반감기는 전형적으로 신장 여과를 통한 효과적인 제거를 허용하는 이들의 작은 크기 및 세포내 분해로부터의 보호 부족에 기인한다. 이러한 경우, 장기간에 걸쳐 약물의 유효 농도를 유지하기 위해서는 빈번한 투여 또는 긴 주입 시간이 필요하다. 투약을 개선하기 위해, 순환 반감기를 연장하기 위한 몇 가지 전략들이 사용되어 왔다. 이들은 탄수화물 또는 PEG(폴리에틸렌 글리콜)와 같은 가요성(flexible) 친수성 분자의 부착을 통해 단백질의 유체역학적 반경을 증가시키고, 항체 Fc 도메인 또는 혈청 알부민의 부착을 통해 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 재순환을 이용하는 것을 포함한다(Konnteman, Curr Opin Biotechnol. 2011 Dec;22(6):868-76).

FcRn 매개된 재순환을 이용하는 전략은 생체내 면역원성을 유도할 위험이 낮고 긴 반감기 연장이 달성될 수 있기 때문에 특히 매력적이다. 예를 들면, BiTE® 형식의 T 세포 관여 이중특이 항체의 반감기는 Fc 도메인의 부착 후 200시간을 초과하는 것으로 보고된다(Lorenczewski, et al., Blood 2017. 130(Suppl 1), 2815). 유사하게, 알부민 결합 도메인을 포함하는 TriTac® 형식의 이중특이 항체는 4일에 걸친 반감기를 갖는 것으로 보고된다(Wesche et al., Cancer Res 2018;78(13 Suppl):Abstract nr 3814).

항-CD3 항체 단편에 융합된 가용성 T 세포 수용체를 포함하는 융합 단백질은 6-8시간 범위의 생체내 반감기를 갖는 T 세포 관여 이중특이 융합 단백질의 새로운 범주이다(Sato et al., 2018 J Clin Onc 2018 36, no. 15_suppl 9521-9521; Middleton et al., J Clin Onc 2016 34, no. 15_suppl 3016-3016). 기존의 항체와는 달리, T 세포 수용체는 세포내 항원으로부터 유래된 짧은 펩티드를 인식하도록 설계되며 인간 백혈구 항원(펩티드-HLA)에 의해 세포 표면에 제시된다. 항원 제시 세포 상의 펩티드-HLA 복합체와 T 세포 사이의 효과적인 면역 시냅스 형성은 고정된 상호작용 기하구조에 의존하며, 이것은 막내 거리(intramembrane distance)의 증가에 의해 교란(perturbed)된다(Choudhuri et al., 2005 Nature Jul 28;436(7050):578-82).

효과적인 면역 시냅스 형성을 매개할 수 있는 증가된 반감기를 갖는 T 세포 관여 이중특이적 단백질이 필요하다. 당업계의 예상과 달리, 본 발명자들은 TCR-항-CD3 융합 단백질을 항체 Fc 영역 또는 알부민 결합 모이어티에 융합하면 놀랍게도 효과적인 면역 시냅스 형성이 초래된다는 것을 발견하였다.

제1 양태에서,

i) T 세포 관여 면역 이펙터에 연결된 펩티드-주요 조직적합성 복합체(pMHC; peptide Major histocompatibility Complex) 결합 모이어티; 및

ii) 면역글로불린 Fc 또는 알부민 결합 도메인을 포함하는 반감기 연장 도메인을 포함하는 다중-도메인 결합 분자가 제공된다.

바람직하게는, pMHC 결합 모이어티는 T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 항체 가변 도메인, 및 적어도 하나의 불변 도메인을 포함하는 TCR 또는 TCR-유사 항체이다. 바람직하게는 pMHC 결합 모이어티는 적어도 하나의 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 바람직하게는 불변 도메인은 TCR 알파 쇄 또는 TCR 베타 쇄(각각 TRAC 또는 TRBC)의 불변 도메인에 상응할 수 있다. 대안으로, pMHC 결합 모이어티의 TCR 불변 도메인은 항체 경쇄 또는 중쇄(CL, CH1, CH2, CH3 또는 CH4)의 불변 도메인으로 대체될 수 있다. 불변 도메인은 전장일 수 있거나 절단될 수 있다. TCR 불변 도메인은 막관통 도메인(transmembrane domain)을 제거하기 위해 절단될 수 있다. 불변 도메인이 절단된 경우, 바람직하게는 막-관련 부분만 제거된다. 천연 불변 도메인에 비해 불변 도메인의 아미노산 서열에 추가 돌연변이가 도입될 수 있다. 불변 영역은 또한, 예를 들면, 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합에 의한 이량체화를 허용하는 자연적으로 발생하거나 도입된 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명자들은 예기치 않게 pMHC 결합 모이어티, 면역 이펙터 도메인 및 면역글로빈 Fc 도메인 또는 알부민-결합 모이어티를 포함하는 다중-도메인 결합 분자가 여전히 기능을 유지하고 있음을 발견하였다. 이것은 TCR-pMHC 상호작용이 고정된 결합 기하구조에 의존하고 TCR 트리거링이 막간 거리(intermembrane distance)의 증가에 민감하다는 당업계의 지식을 고려할 때 특히 놀라운 것이다(Garboczi et al., Nature. 1996 Nov 14;384(6605):134-41; Choudhuri et al., 2005 Nature Jul 28;436(7050):578-82; Rudolph et al., Annu Rev Immunol. 2006;24:419-66). 실제로, 동적 분리 모델은 TCR 트리거링이 CD45와 같은 티로신 포스파타제의 크기 의존적 배제로 인해 티로신 인산화가 선호되는 밀접 접촉 영역 내에서 TCR-CD3 복합체의 테더링의 결과라고 제안한다(Choudhuri et al., 2005 Nature Jul 28;436(7050):578-82; Davis et al., Nat Immunol. 2006 Aug;7(8):803-9). 따라서 TCR-pMHC 복합체의 작은 치수(대략 100Å)와 고정된 결합 기하구조가 면역 시냅스 형성 및 TCR 트리거링에 중요한 것으로 이해된다. 이러한 지식에 기초하여, 숙련가는 본 발명의 항원 결합 폴리펩티드가 불량한 면역 시냅스 형성, TCR-pMHC 결합 기하구조의 교란, 및 궁극적으로 효과적이지 않은 TCR 트리거링을 초래할 것으로 예상된다는 것을 이해할 것이다.

pMHC 결합 모이어티는 TCR-유사 항체일 수 있다. 바람직하게는 pMHC 결합 모이어티는 TCR-유사 항체의 가변 도메인을 포함한다. 항체는 자연적으로 pMHC를 인식하지 않는다; 그러나, pMHC에 대한 특이성을 갖는 항체가 조작될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 항체를 TCR-유사 또는 TCR-모방 항체라고 한다(Chang et al., Expert Opin Biol Ther. 2016 Aug;16(8):979-87 and Dahan et al., Expert Rev Mol Med. 2012 Feb 24;14:e6).

TCR은 이종이량체 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 폴리펩티드 쌍(polypeptide pair)일 수 있다. 대안으로, TCR은 단일 쇄 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 폴리펩티드일 수 있다. TCR 가변 도메인의 아미노산 서열은 자연에서 발견되는 것에 상응할 수 있거나, 천연 TCR에 비해 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 이러한 돌연변이는 주어진 항원에 대한 TCR의 친화도를 증가시키기 위해 이루어질 수 있다. 추가로 또는 대안으로 돌연변이는 안정성 및 제조 가능성을 개선하기 위해 삽입될 수 있다.

TCR은 펩티드 항원과의 복합체로 MHC에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 펩티드 항원은 임의의 질병 관련 항원이다. 바람직하게는, 펩티드 항원은 임의의 종양 관련 항원이다. 펩티드 항원은 제WO2011001152호, 제WO2017109496호, 제WO2017175006호 및 제WO2018234319호에 기술된 바와 같이 GP100, NYESO, MAGEA4, 또는 PRAME로부터 유래된 펩티드일 수 있다.

TCR은 제WO2011001152호, 제WO2017109496호, 제WO2017175006호 및 제WO2018234319호에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다.

T-세포 관여 면역 이펙터 도메인은 CD3 이펙터 도메인일 수 있다. T 세포 관여 면역 이펙터는 CD3 및 또는 TCR/CD3 복합체와의 상호작용을 통해 T 세포를 활성화하는 항체 scFv(또는 유사한 크기의 항체-유사 스캐폴드)일 수 있다. CD3 이펙터는 항-CD3 항체 또는 항체 단편, 특히 항-CD3 scFv 또는 항체-유사 스캐폴드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가 면역 이펙터는 IL-2 및 IFN-γ와 같은 사이토카인; 초항원(superantigen) 및 이의 돌연변이체; IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질과 같은 케모카인; T 세포 또는 NK 세포(예를 들어, 항-CD28 또는 항-CD16 또는 면역 시냅스에 위치하는 임의의 분자), 및 보체 활성화제(complement activators)와 같은 면역 세포 상의 항원에 결합하는 이의 단편, 유도체 및 변이체를 포함하는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

반감기 연장 도메인은 pMHC 결합 모이어티의 C 또는 N 말단에 또는 T 세포 관여 면역 이펙터의 C 또는 N 말단에 연결될 수 있다.

반감기 연장 도메인은 면역글로불린 Fc를 포함할 수 있다. 면역글로불린 Fc 도메인은 임의의 항체 Fc 영역일 수 있다. Fc 영역은 세포 표면 Fc 수용체 및 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용하는 항체의 꼬리 영역이다. Fc 영역은 전형적으로 2개 또는 3개의 중쇄 불변 도메인(CH2, CH3 및 CH4로 지칭됨) 및 힌지 영역을 둘 다 갖는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 두 개의 쇄는 힌지 영역 내에서 이황화 결합에 의해 연결된다. 면역글로불린 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG4로부터의 Fc 도메인은 FcRn 매개된 재순환에 결합하고 이를 거쳐, 긴 순환 반감기(3 내지 4주)를 제공한다. IgG와 FcRn의 상호작용은 CH2 및 CH3 도메인의 일부를 덮는 Fc 영역에 국한되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 면역글로불린 Fc 도메인은 IgG1 또는 IgG4로부터의 Fc 도메인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 Fc 도메인은 인간 서열로부터 유래된다. Fc 영역은 또한 바람직하게는 이량체화를 촉진하는 KiH 돌연변이 뿐만 아니라 활성화 수용체, 일예로, 기능적으로 침묵하는 분자(functionally silent molecule)와의 상호작용을 방지하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 면역글로불린 Fc 도메인은 다른 도메인(즉, TCR 또는 면역 이펙터)의 C 또는 N 말단에 융합될 수 있다. 면역글로불린 Fc는 링커를 통해 다른 도메인(즉, TCR 또는 면역 이펙터)에 융합될 수 있고, 대안으로 링커가 사용되지 않을 수 있다. 링커 서열은 통상적으로, 가요성을 제한할 수 있는 덩치가 큰(bulky) 측쇄를 갖지 않는 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 아미노산으로 주로 구성된다는 점에서 가요성이다. 대안으로, 더 큰 강성을 가진 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 사용 가능한 또는 최적의 길이는 쉽게 결정될 수 있다. 종종 링커 서열은 약 12개 미만, 예를 들어 10개 미만, 또는 2-10개 아미노산 길이일 것이다. 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 다중-도메인 결합 분자에서 사용될 수 있는 적합한 링커의 예는 GGGSGGGG, GGGGS, GGGSG, GGSGG, GSGGG, GSGGGP, GGEPS, GGEGGGP, 및 GGEGGGSEGGGS(제WO2010/133828호에 기술된 바와 같음)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 면역글로불린 Fc가 TCR에 융합되는 경우, 이것은 링커의 존재 또는 부재하에 알파 또는 베타 쇄 중의 어느 하나 또는 알파와 베타 쇄 둘 다에 융합될 수 있다. 또한, Fc의 개별 쇄가 TCR의 개별 쇄에 융합될 수 있다.

바람직하게는 Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4 서브클래스로부터 유래될 수 있다. 2개의 쇄는 CH2 및 CH3 불변 도메인 및 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 힌지 영역은 실질적으로 또는 부분적으로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 힌지 영역에 상응할 수 있다. 힌지는 코어 힌지 도메인의 전부 또는 일부 및 하부 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 힌지 영역은 두 개의 쇄를 연결하는 적어도 하나의 이황화 결합을 함유한다.

Fc 영역은 WT Fc 서열에 비해 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 이러한 돌연변이는 바람직한 치료 특성을 도입할 목적으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 이종이량체화를 용이하게 하기 위해, KiH(knobs into holes) 돌연변이가 CH3 도메인으로 조작될 수 있다. 이 경우, 하나의 쇄는 Y와 같은 덩치가 큰 돌출 잔기(즉, 매듭(knob))를 함유하도록 조작되고, 다른 쇄는 상보적 포켓(즉, 구멍(hole))을 함유하도록 조작된다. KiH 돌연변이에 적합한 위치는 당업계에 공지되어 있다. 추가로 또는 대안으로 Fcy 수용체에 대한 결합을 폐지 또는 감소시키고 또는 FcRn에 대한 결합을 증가시키고/시키거나 Fab 아암(arm) 교환을 방지하거나 프로테아제 부위를 제거하는 돌연변이가 도입될 수 있다. 추가로 또는 대안으로 돌연변이는 제조상의 이유로, 예를 들면, 글리코실화와 같은 번역후 변형에 적용될 수 있는 아미노산을 제거하거나 대체하기 위해 이루어질 수 있다.

예는 다음을 포함한다:

IgG4 (밑줄 친 잔기는 야생형 서열에 대한 돌연변이를 나타낸다)

"매듭(Knob)"

YGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

"구멍(Hole)"

YGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

IgG1 (밑줄 친 잔기는 야생형 서열에 대한 돌연변이를 나타낸다)

"매듭(Knob)"

VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

"구멍(Hole)"

VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

반감기 연장 도메인은 알부민-결합 도메인을 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 알부민은 부분적으로 이의 크기, 신장 역치 이상, 및 FcRn을 통한 이의 특이적 상호작용 및 재순환으로 인해 19일의 긴 순환 반감기를 갖는다. 알부민에 대한 부착은 생체내 치료 분자의 순환 반감기를 개선하기 위한 잘 알려진 전략이다. 알부민은 특정 알부민 결합 도메인의 사용을 통해 비공유적으로 부착되거나 접합 또는 직접적인 유전적 융합에 의해 공유적으로 부착될 수 있다. 개선된 반감기를 위해 알부민에 대한 부착을 이용한 치료 분자의 예는 문헌[Sleep et al., Biochim Biophys Acta. 2013 Dec;1830(12):5526-34]에 제공되어 있다.

알부민-결합 도메인은 임의의 공지된 알부민-결합 모이어티를 포함하여, 알부민에 결합할 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 알부민 결합 도메인은 알부민에 특이적으로 결합하는 내인성 또는 외인성 리간드, 작은 유기 분자, 지방산, 펩티드 및 단백질로부터 선택될 수 있다. 바람직한 알부민 결합 도메인의 예는 문헌[Dennis et al., J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43]에 기술된 바와 같은 짧은 펩티드(예를 들어 펩티드 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF); 항체, 항체 단편 및 항체 유사 스캐폴드와 같은 알부민에 결합하도록 조작된 단백질, 예를 들면 GSK에 의해 상업적으로 제공되는 Albudab® (O'Connor-Semmes et al., Clin Pharmacol Ther. 2014 Dec;96(6):704-12), 및 Ablynx에 의해 상업적으로 제공되는 Nanobody® (Van Roy et al., Arthritis Res Ther. 2015 May 20;17:135); 및 스트렙토코커스 단백질 G 단백질과 같이 자연에서 발견되는 알부민 결합 도메인에 기반한 단백질 (Stork et al., Eng Des Sel. 2007 Nov;20(11):569-76), 예를 들면 Affibody에 의해 상업적으로 제공되는 Albumod®를 포함한다. 바람직하게는, 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 인간 알부민에 대한 알부민 결합 도메인의 친화도는 피코몰 내지 마이크로몰 범위일 수 있다. 인간 혈청에서의 알부민의 극도로 높은 농도(35-50mg/ml, 대략 0.6mM)를 고려할 때, 실질적으로 모든 알부민 결합 도메인이 생체내에서 알부민에 결합될 것으로 계산된다.

알부민-결합 모이어티는 다른 도메인(즉, TCR 또는 면역 이펙터)의 C 또는 N 말단에 연결될 수 있다. 알부민-결합 모이어티는 링커를 통해 다른 도메인(즉, TCR 또는 면역 이펙터)에 연결될 수 있다. 링커 서열은 통상적으로, 가요성을 제한할 수 있는 덩치가 큰 측쇄를 갖지 않는 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 아미노산으로 주로 구성된다는 점에서 가요성이다. 대안으로, 더 큰 강성을 가진 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 사용 가능한 또는 최적의 길이는 쉽게 결정될 수 있다. 종종 링커 서열은 약 12개 미만, 예를 들어 10개 미만, 또는 2-10개 아미노산 길이일 것이다. 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 다중-도메인 결합 분자에서 사용될 수 있는 적합한 링커의 예는 GGGSGGGG, GGGGS, GGGSG, GGSGG, GSGGG, GSGGGP, GGEPS, GGEGGGP, 및 GGEGGGSEGGGS(제WO2010/133828호에 기술된 바와 같음)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 알부민-결합 모이어티가 TCR에 연결되는 경우, 이것은 링커의 존재 또는 부재하에 알파 또는 베타 쇄 또는 알파와 베타 쇄 둘 다에 연결될 수 있다.

제1 양태에 따른 다중-도메인 결합 분자는 약제로서 사용하기 위한 것일 수 있다.

추가의 양태에서, 제1 양태에 따른 다중-도메인 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

추가의 양태에서, 제1 양태에 따른 다중-도메인 결합 분자를 암호화하는 핵산이 제공된다. 이러한 양태의 핵산을 포함하는 발현 벡터가 또한 제공된다. 또한, 이러한 양태의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 여기서 다중-도메인 결합 분자를 암호화하는 핵산은 각각 알파 쇄 및 베타 쇄를 암호화하는 단일 개방 판독 프레임 또는 2개의 별개의 개방 판독 프레임으로서 존재한다.

또한, 추가의 양태에서, 핵산의 발현을 위한 임의의 조건하에 상기 기술된 숙주 세포를 유지하는 단계 및 다중-도메인 항원 결합 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하여, 제1 양태에 따른 다중-도메인 결합 분자를 제조하는 방법이 제공된다.

또 다른 추가의 양태에서 제1 양태에 따른 다중-도메인 결합 분자를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 치료 방법이 제공된다.

본원에 개시된 임의의 분자의 표현형 침묵 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "표현형 침묵 변이체(phenotypically silent variants)"는, 상기 제시된 것에 더하여, 치환, 삽입 및 결실을 포함하는 하나 이상의 추가 아미노산 변화를 포함하는 변이체를 지칭하는 것으로 이해되며, 이 변이체는 상기 변화(들)를 갖지 않는 상응하는 분자와 유사한 표현형을 갖는다. 본 출원의 목적을 위해, 표현형은 결합 친화도(K_D 및/또는 결합 반감기) 및 특이성을 포함한다. 바람직하게는, 가용성 다중-도메인 결합 분자에 대한 표현형은 결합 친화도 및 특이성 외에도 면역 활성화의 효능 및 정제 수율을 포함한다.

표현형 침묵 변이체는 하나 이상의 보존적 치환 및/또는 하나 이상의 허용된 치환(tolerated substitution)을 함유할 수 있다. 허용된 치환이란 아래에 제공된 바와 같은 보존적(conservative)의 정의에 속하지 않지만 그럼에도 불구하고 표현형적으로 침묵하는 치환을 의미한다. 숙련가는 다양한 아미노산이 유사한 특성을 가지며 따라서 '보존적'이라는 것을 알고 있다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 하나 이상의 이러한 아미노산은 종종 그 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 원하는 활성을 제거하지 않고 하나 이상의 다른 이러한 아미노산으로 치환될 수 있다.

따라서 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 종종 서로 치환될 수 있다(지방족 측쇄를 갖는 아미노산). 이러한 가능한 치환 중에서 글리신과 알라닌이 서로를 치환하는데 사용되고(이들이 비교적 짧은 측쇄를 갖기 때문에) 발린, 류신 및 이소류신이 서로를 치환하는데 사용되는 것(이들이 소수성인 더 큰 지방족 측쇄를 갖기 때문에)이 바람직하다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다. 본 발명의 범위 내에서 아미노산 치환은 자연 발생 또는 비-자연 발생 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들면, 알라닌 상의 메틸 그룹이 에틸 그룹으로 대체될 수 있고/있거나 펩티드 골격(peptide backbone)에 사소한 변화가 이루어질 수 있음이 본원에서 고려된다. 천연 또는 합성 아미노산이 사용되는지 여부에 관계없이 L-아미노산만 존재하는 것이 바람직하다.

이러한 성질의 치환을 종종 "보존적" 또는 "반-보존적" 아미노산 치환이라고 한다. 따라서 본 발명은 TCR의 아미노산 서열이 본원에 개시된 TCR 서열과 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖도록 위에 기술된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하지만 서열에 하나 이상의 보존적 치환 및 또는 하나 이상의 허용된 치환을 갖는 분자의 사용으로 확장된다.

당업계에 공지된 바와 같은 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정되는 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 관계이다. 당업계에서, 동일성은 또한 경우에 따라 이러한 서열의 문자열(strings) 사이의 일치에 의해 결정되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 동일성을 측정하는 다수의 방법이 존재하지만, 동일성을 결정하는데 일반적으로 사용되는 방법은 컴퓨터 프로그램으로 성문화되어 있다. 두 서열 간의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

CLUSTAL 프로그램과 같은 프로그램을 사용하여 아미노산 서열을 비교할 수 있다. 이 프로그램은 아미노산 서열을 비교하고 두 서열 중 하나에 적절하게 공백을 삽입함으로써 최적 정렬을 찾는다. 최적 정렬을 위해 아미노산 동일성 또는 유사성(아미노산 유형의 동일성 플러스 보존)을 계산하는 것이 가능하다. BLASTx와 같은 프로그램은 유사한 서열의 가장 긴 스트레치를 정렬하고 적합도에 값을 할당할 것이다. 따라서 각각 상이한 점수를 갖는 여러 유사성 영역이 발견되는 비교를 수득하는 것이 가능하다. 두 가지 유형의 동일성 분석이 본 발명에서 고려된다.

2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트는 최적 비교 목적을 위해 서열을 정렬하고(예를 들어, 서열과의 최상의 정렬을 위해 제1 서열에 갭을 도입할 수 있음) 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교함으로써 결정된다. "최상의 정렬"은 가장 높은 동일성 퍼센트를 초래하는 두 서열의 정렬이다. 동일성 퍼센트는 비교되는 서열에서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 수에 의해 결정된다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100).

2개의 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 당업계의 숙련가들에게 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열을 비교하기 위한 수학적 알고리즘의 예는 문헌(Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)에서와 같이 수정된 칼린 및 알트슐러의 알고리즘(Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)이다. 알트슐러 등의 BLASTn 및 BLASTp 프로그램(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)은 이러한 알고리즘을 포함하였다. 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 BLASTn 프로그램으로 수행될 수 있다. 2개의 단백질 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 BLASTp 프로그램으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭 정렬(gapped alignment)을 수득하기 위해, Gapped BLAST가 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 대안으로, PSI-Blast는 분자(Id.) 간의 먼 관계를 감지하는 반복 검색을 수행하는데 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램(예를 들어, BLASTp 및 BLASTp)의 기본 매개변수가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다. 기본 일반 매개변수는, 예를 들면, 단어 크기 = 3, 예상 임계값 = 10을 포함할 수 있다. 매개변수는 짧은 입력 서열에 대해 자동으로 조정하도록 선택될 수 있다. 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 예는 마이어스와 밀러의 알고리즘(Myers and Miller, CABIOS(1989))이다. CGC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)은 이러한 알고리즘을 포함하였다. 당업계에 공지된 서열 분석을 위한 또 다른 알고리즘은 문헌[Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5]에 기술된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8]에 기술된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup은 검색의 감도와 속도를 설정하는 제어 옵션이다. 본 개시내용에서 동일성 퍼센트를 평가하기 위한 목적으로, 기본 매개변수를 갖는 BLASTp가 비교 방법론으로서 사용된다. 또한, 인용된 동일성 퍼센트가 아미노산에 대해 비정수 값을 제공할 때(즉, 90% 서열 동일성을 갖는 25개 아미노산의 서열이 "22.5"의 값을 제공할 때, 수득된 값은 다음 정수로 내림되므로, "22"). 따라서, 제공된 예에서, 25개 아미노산 중 22개 일치를 갖는 서열은 90% 서열 동일성 이내이다.

당업계의 숙련가들에게 명백한 바와 같이, 분자, 예를 들면 TCR 부분의 기능적 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 C-말단 및/또는 N-말단에 제공된 서열을 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 잔기만큼 절단하거나 연장하는 것이 가능할 수 있다. 이의 C-말단 및/또는 N-말단에 제공된 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 잔기만큼 절단되거나 연장될 수 있다. 이러한 모든 변이체는 본 발명에 의해 포함된다.

보존적(conservative) 및 허용된(tolerated) 치환, 삽입 및 결실을 포함한 돌연변이는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 제한 효소-기반 클로닝, 또는 결찰(ligation) 비의존적 클로닝(LIC) 절차를 기반으로 하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 방법을 사용하여 제공된 서열에 도입될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 표준 분자 생물학 텍스트에 자세히 설명되어 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 제한 효소-기반 클로닝에 관한 추가의 상세한 내용에 대해서는, 문헌[Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3^rd Ed.) CSHL Press]을 참조한다. 결찰 비의존적 클로닝(LIC) 절차에 대한 추가의 정보는 문헌[Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 TCR 서열은 고체상 합성, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 방법으로부터 수득될 수 있다.

본 발명의 분자는 치료 시약으로서 사용하기에 이상적인 안전성 프로파일을 가질 수 있다. 이상적인 안전성 프로파일은 우수한 특이성을 입증하는 것 외에도 본 발명의 분자가 추가의 전임상 안전성 검사를 통과할 수 있음을 의미한다. 이러한 검사의 예는 전혈의 존재하에서의 최소 사이토카인 방출 및 이에 따른 생체 내(in vivo) 잠재적인 사이토카인 방출 증후군을 유발할 낮은 위험을 확인하기 위한 전혈 분석, 및 대체 HLA 유형의 인식에 대한 낮은 가능성을 확인하기 위한 동종이식편반응 검사를 포함한다.

본 발명의 분자는 고수율 정제에 적합할 수 있다. 수율은 정제 과정 동안 보유된 물질의 양(즉, 재접힘 전에 수득된 가용화된 물질의 양에 비해 정제 과정의 말기에 수득된 올바르게 접힌 물질의 양)을 기준으로 하여 결정될 수 있고/있거나 수율은 원래 배양물 용적에 비해 정제 과정의 말기에 수득된 올바르게 접힌(folded) 물질의 양을 기준으로 할 수 있다. 고수율은 1% 이상, 또는 보다 바람직하게는 5% 이상 또는 더 높은 수율을 의미한다. 고수율은 1 mg/ml 이상, 또는 보다 바람직하게는 3 mg/ml 이상, 또는 5 mg/ml 이상, 또는 더 높은 수율을 의미한다.

결합 친화도(평형 상수 K_D에 반비례함) 및 결합 반감기(T½로 표현됨)를 결정하는 방법은 당업계의 숙련가들에게 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 결합 친화도 및 결합 반감기는 표면 플라스몬 공명(SPR) 또는 바이오층 간섭법(BLI)을 사용하여, 예를 들어 각각 BIAcore 기기 또는 Octet 기기를 사용하여 결정된다. 친화도를 배가하면 K_D가 반감된다는 것을 인지할 것이다. T½은 ln2를 오프율(k_off)로 나눈 것으로서 계산된다. 따라서 T½을 배가하면 k_off가 반감된다. TCR에 대한 K_D 및 k_off 값은 통상적으로 TCR의 가용성 형태, 즉 세포질 및 막관통 도메인 잔기를 제거하도록 절단된 형태에 대해 측정된다. 독립적인 측정 간의 변동, 및 특히 20시간을 초과하는 해리 시간과의 상호작용을 고려하여, 주어진 TCR의 결합 친화도 및 또는 결합 반감기는 동일한 분석 프로토콜을 사용하여 수 회, 예를 들면 3회 이상 측정할 수 있으며, 결과의 평균을 취할 수 있다. 두 샘플(즉, 두 개의 상이한 TCR 및 또는 동일한 TCR의 두 개의 제제) 간의 결합 데이터를 비교하기 위해, 동일한 분석 조건(예를 들어, 온도)을 사용하여 측정이 이루어지는 것이 바람직하다. TCR과 관련하여 기술된 측정 방법은 또한 본원에 기술된 다중-도메인 항원-결합 폴리펩티드에 적용될 수 있다.

본 발명의 특정한 바람직한 다중-도메인 결합 분자는 항원 양성 세포, 특히 암세포에 전형적인 낮은 수준의 항원을 제시하는 세포에 대해 시험관 내에서(in vitro) 매우 강력한 T 세포 반응을 생성할 수 있다((즉, 대략 5-100, 예를 들면 50, 세포당 항원 (Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840; Purbhoo et al.,(2006). J Immunol 176(12): 7308-7316.)). 이러한 TCR은 본원에 기술된 다중-도메인 항원-결합 폴리펩티드로의 통합에 적합할 수 있다. 측정되는 T 세포 반응은 인터페론 γ 또는 그랜자임 B와 같은 T 세포 활성화 마커의 방출, 또는 표적 세포 사멸, 또는 T 세포 증식과 같은 T 세포 활성화의 다른 척도일 수 있다. 바람직하게는 매우 강력한 반응은 nM - pM 범위, 바람직하게는 500nM 이하, 가장 바람직하게는 1nM 이하 또는 500pM 이하의 EC₅₀ 값을 갖는 것이다.

본 발명의 분자의 TCR 부분은 αβ 이종이량체일 수 있다. 본 발명의 분자의 알파-베타 이종이량체 TCR 부분은 통상적으로 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 포함한다. 불변 도메인은 가용성 형식일 수 있다(즉, 막관통 도메인 또는 세포질 도메인을 갖지 않음). 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 천연 TRAC 및/또는 TRBC1/2 서열에 비해 돌연변이, 치환 또는 결실을 함유할 수 있다. TRAC 및 TRBC1/2라는 용어는 또한 천연 다형성 변이체, 예를 들면 TRAC의 위치 4에 N에서 K로의 변이체를 포함한다(Bragado et al International immunology. 1994 Feb;6(2):223-30).

알파 및 베타 쇄 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이의 천연 이황화 결합을 결실시키기 위해 절단 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)은, 예를 들면, 제WO 03/020763호 및 제WO06000830호에 기술된 바와 같이 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 이황화 결합을 가질 수 있다. 알파 및 베타 불변 도메인은 TRAC의 위치 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 위치 Ser 57에서 시스테인 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있으며, 상기 시스테인은 TCR의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에 이황화 결합을 형성한다. TRBC1 또는 TRBC2는 불변 도메인의 위치 75에 시스테인에서 알라닌으로의 돌연변이 및 불변 도메인의 위치 89에 아스파라긴에서 아스파르트산으로의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. αβ 이종이량체에 존재하는 세포외 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 C 말단 또는 C 말단들에서, 예를 들면 최대 15개, 또는 최대 10개, 또는 최대 8개 또는 그보다 적은 아미노산에 의해 절단될 수 있다. 알파 쇄 세포외 불변 도메인의 C 말단은 8개의 아미노산에 의해 절단될 수 있다.

본 발명의 분자의 TCR 부분은 단일 쇄 형식일 수 있다. 단일 쇄 형식은 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ, or Vα-Cα-L-Vβ-Cβ 유형의 αβ TCR 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 영역이며, L은 링커 서열이다(Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. Dec 1;221(1-2):59-76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565-73; WO 2004/033685; WO9918129). 단일 쇄 TCR은 제WO 2004/033685호에 기술된 바와 같이 각 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 이황화 결합을 가질 수 있다. 단일 쇄 TCR은 제WO2004/033685호; 제WO98/39482호; 제WO01/62908호; 문헌(Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829))에 추가로 기술되어 있다.

본 발명의 분자와 결합될 수 있는 치료제는 면역 조절제 및 이펙터, 방사성 화합물, 효소(예를 들면 퍼포린) 또는 화학요법제(예를 들면 시스-플라틴)를 포함한다. 독성 효과가 원하는 위치에서 발휘되도록 보장하기 위해, 독소는 화합물이 서서히 방출되도록 본원에 기술된 다중-도메인 항원-결합 폴리펩티드에 연결된 리포솜 내부에 있을 수 있다. 이것은 체내 수송 동안 손상 효과를 방지하고, 관련 항원 제시 세포에 본원에 기술된 다중-도메인 항원-결합 폴리펩티드의 결합 후에 독소가 최대 효과를 갖는 것을 보장할 것이다.

적합한 치료제의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:

· 소분자 세포독성제, 즉 700달톤 미만의 분자량을 갖는 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 화합물. 이러한 화합물은 또한 세포독성 효과를 가질 수 있는 독성 금속을 함유할 수 있다. 또한, 이러한 소분자 세포독성제는 또한 전구약물, 즉 생리학적 조건하에서 붕괴되거나 전환되어 세포독성제를 방출하는 화합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 제제의 예는 시스-플라틴, 메이탄신 유도체, 라켈마이신, 칼리케아미신, 도세탁셀, 에토포시드, 젬시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미톡산트론, 소르피머 나트륨포토프린 II, 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트레에이트 12아버12에이트(trimetreate 12arbour12ate), 오리스타틴 E 빈크리스틴 및 독소루비신을 포함한다;

· 펩티드 세포독소, 즉 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 단백질 또는 이의 단편. 예를 들면, 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 박테리아 외독소 A, Dnase 및 Rnase;

· 방사성 핵종, 즉 하나 이상의 α 또는 β 입자의 동시 방출, 또는 γ 선으로 붕괴하는 원소의 불안정한 동위원소. 예를 들면, 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이트륨 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213; 킬레이트제는 고친화성 TCR 또는 이의 다량체에 대한 이러한 방사성 핵종의 회합을 촉진하기 위해 사용될 수 있다;

· 면역 자극제, 즉 면역 반응을 자극하는 면역 이펙터 분자. 예를 들면, IL-2 및 IFN-γ와 같은 사이토카인,

· 초항원 및 이의 돌연변이체;

· TCR-HLA 융합체, 예를 들어 펩티드-HLA 복합체에 대한 융합체, 여기서 상기 펩티드는 엡스타인 바 바이러스(EBV)와 같은 일반적인 인간 병원체로부터 유래됨;

· IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등과 같은 케모카인;

· 항-T 세포 또는 NK 세포 결정인자 항체(예를 들어, 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16)를 포함한 항체 또는 이의 단편;

· 면역 시냅스에 위치한 분자에 결합하는 항체 또는 이의 단편

· 항체 유사 결합 특성을 갖는 대체 단백질 스캐폴드

· 보체 활성제;

· 이종(xenogeneic) 단백질 도메인, 동종(allogeneic) 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 펩티드.

특히 바람직한 면역 이펙터는 항-CD3 항체, 또는 상기 항-CD3 항체의 기능적 단편 또는 변이체이다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 이러한 단편 및 변이체를 포함한다. 항-CD3 항체의 예는 OKT3, UCHT-1, BMA-031 및 12F6을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 항체 단편 및 변이체/유사체는 몇 가지만 예를 들자면 미니바디, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, dsFv 및 scFv 단편, 나노바디™(Ablynx(벨기에)에 의해 판매되는 이러한 작제물은 낙타과(예를 들어, 낙타 또는 라마) 항체로부터 유래된 합성 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인을 포함함) 및 도메인 항체(Domantis(벨기에), 친화성 성숙된 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인 또는 면역글로불린 가변 경쇄 도메인을 포함함) 또는 애피바디(Affibody(스웨덴), 조작된 단백질 A 스캐폴드를 포함함) 또는 안티칼린(Pieris(독일), 조작된 엔티칼린을 포함함)와 같은 항체 유사 결합 특성을 나타내는 대체 단백질 스캐폴드를 포함하며 면역 이펙터가 다중-도메인 항원 결합 폴리펩티드의 TCR 부분에 연결되고, 여기서 바람직하게는 면역 이펙터는 항-CD3 항체이다.

다중-도메인 결합 분자의 개별 성분의 연결은 공유 또는 비공유 부착을 통해 이루어질 수 있다. 공유 부착은 직접적이거나, 링커 서열을 통해 간접적일 수 있다. 링커 서열은 통상적으로, 가요성을 제한할 수 있는 덩치가 큰 측쇄를 갖지 않는, 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 아미노산으로 주로 구성된다는 점에서 가요성이다. 대안으로, 더 큰 강성을 가진 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 사용 가능한 또는 최적의 길이는 쉽게 결정될 수 있다. 종종 링커 서열은 약 12개 미만, 예를 들어 10개 미만, 또는 2-10개 아미노산 길이일 것이다. 본 발명의 분자에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: GGGSGGGG, GGGGS, GGGSG, GGSGG, GSGGG, GSGGGP, GGEPS, GGEGGGP, 및 GGEGGGSEGGGS (제WO2010/133828호에 기술된 바와 같음).

추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 다중-도메인 결합 분자를 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 cDNA이다. 일부 실시양태에서 핵산은 mRNA일 수 있다. 핵산은 비-자연 발생 및/또는 정제 및/또는 조작될 수 있다. 핵산 서열은 사용되는 발현 시스템에 따라 코돈 최적화될 수 있다. 당업계의 숙련가들에게 공지된 바와 같이, 발현 시스템은 대장균(E. coli)과 같은 박테리아 세포, 또는 효모 세포, 또는 포유동물 세포, 또는 곤충 세포를 포함할 수 있거나, 무세포 발현 시스템일 수 있다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 작제물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기와 같은 하나 이상의 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 언급된 바와 같이, 본 발명의 특이 결합 분자를 암호화하는 핵산은 그에 대한 암호화 핵산으로부터의 발현을 포함하는 특이 결합 분자의 생산 방법이 그러한 바와 같이 본 발명의 한 양태을 형성한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 생산 후에, 특이 결합 분자를 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제한 다음 적절하게 사용할 수 있다.

각종 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 및 배큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종성 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용가능한 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포 및 기타 다수를 포함한다. 일반적이고 바람직한 박테리아 숙주는 대장균이다. 대장균과 같은 원핵 세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들면 문헌[Pluckthun, Bio/Technology 9:545-551 (1991)]을 참조한다. 배양물 중 진핵 세포에서의 발현은 또한 특이 결합 분자의 생산을 위한 옵션으로서 당업계의 숙련가들에게 이용가능하며, 최신 검토를 위해, 예를 들면, 문헌[Reff, Curr. Opinion Biotech. 4:573-576 (1993); Trill et al., Curr. Opinion Biotech. 6:553-560 (1995)]을 참조한다.

프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 예를 들어 적절한 경우 '파지 또는 파지미드일 수 있다. 자세한 내용은 예를 들면 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]을 참조한다. 예를 들면 핵산 작제물의 제조, 돌연변이 유발, 시퀀싱, 세포 내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에서 핵산 조작을 위한 다수의 공지된 기술 및 프로토콜이 문헌[Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Edition, John Wiley & Sons (1992)]에 상세하게 기술되어 있다.

따라서, 본 발명의 추가 양태는 본원에 개시된 바와 같은 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 여전히 추가의 양태는 이러한 핵산을 숙주 세포에 도입함을 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 임의의 이용 가능한 기술을 사용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포솜-매개된 형질감염 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스, 예를 들어 백시니아 또는, 곤충 세포의 경우, 배큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다. 도입 이후에는, 예를 들어, 유전자 발현을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터 발현을 유발하거나 허용할 수 있다.

본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열의 포함에 의해 촉진될 수 있다.

당업계에 잘 알려진 바와 같이, 분자는 번역 후 변형에 적용될 수 있다. 글리코실화가 이러한 변형 중 하나이며, 이것은 TCR 쇄에서 정의된 아미노산에 대한 올리고당 모이어티의 공유 부착을 포함한다. 예를 들면, 아스파라긴 잔기, 또는 세린/트레오닌 잔기는 올리고당 부착을 위한 잘 알려진 위치이다. 특정 단백질의 글리코실화 상태는 단백질 서열, 단백질 형태 및 특정 효소의 이용 가능성을 포함한 다수의 요인에 따라 좌우된다. 또한, 글리코실화 상태(즉, 올리고당 유형, 공유 결합 및 총 부착 수)가 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 재조합 단백질을 생산할 때, 글리코실화를 조절하는 것이 종종 바람직하다. 조절된 글리코실화는 항체 기반 치료제를 개선하는데 사용되었다(Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34.). 본 발명의 분자의 TCR 부분의 경우, 글리코실화는 예를 들면 특정 세포주(중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 인간 배아 신장(HEK) 세포와 같은 포유동물 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 사용함으로써 또는 화학적 변형에 의해 조절될 수 있다. 글리코실화가 약동학을 개선하고 면역원성을 감소시키며 천연 인간 단백질을 보다 가깝게 모방할 수 있기 때문에 이러한 변형이 바람직할 수 있다(Sinclair and Elliott, (2005) Pharm Sci.Aug; 94(8):1626-35).

환자에게 투여하기 위해, 본 발명의 분자(바람직하게는 검출 가능한 표지 또는 치료제와 결합됨), 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 세포는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 멸균 약제학적 조성물의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 (이것을 환자에게 투여하는 원하는 방법에 따라) 임의의 적합한 형태일 수 있다. 이것은 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 일반적으로 밀봉된 용기에 제공될 것이며, 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는 통상적으로 (반드시 그런 것은 아니지만) 사용 지침을 포함한다. 이것은 다수의 상기 단위 투여 형태를 포함할 수 있다.

약제학적 조성물은 비경구(피하, 근육내, 척수강내 또는 정맥내 포함), 장(경구 또는 직장 포함), 흡입 또는 비강내 경로와 같은 임의의 적절한 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 이러한 조성물은 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들면, 활성 성분을 멸균 조건하에 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 분자의 투여량은 치료하고자 하는 질병 또는 장애, 치료하고자 하는 개인의 연령 및 상태 등에 따라 넓은 한계 사이에서 다양할 수 있으며, 본 발명의 분자에 대한 적합한 용량 범위는 25ng/kg 내지 50μg/kg 또는 1μg 내지 1g의 범위일 수 있다. 의사가 궁극적으로 사용하고자 하는 적절한 투여량을 결정할 것이다.

본 발명의 다중-도메인 항원 결합 폴리펩티드, 약제학적 조성물, 벡터, 핵산 및 세포는 실질적으로 순수한 형태, 예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 순수한 형태로 제공될 수 있다.

또한 본 발명에 의해 다음이 제공된다:

· 약제에 사용하기 위한, 바람직하게는 암 또는 종양을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 다중-도메인 항원 결합 폴리펩티드, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포;

· 암 또는 종양을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 다중-도메인 항원 결합 폴리펩티드, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포의 용도;

· 본 발명의 다중-도메인 항원 결합 폴리펩티드, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포를 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 암 또는 종양을 치료하는 방법;

· 본 발명의 다중-도메인 항원 결합 폴리펩티드, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포를 포함하는, 인간 대상체에게 투여하기 위한 주사 가능한 제형.

치료 방법은 추가의 항-신생물제(anti-neoplastic agent)를 별도로, 조합하여, 또는 순차적으로 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 제제의 예는 당업계에 공지되어 있으며 면역 활성화제 및/또는 T 세포 조절제를 포함할 수 있다.

본 발명의 각 양태의 바람직한 특징은 필요한 수정을 가하여 다른 양태 각각에 대한 것과 같다. 본원에 언급된 선행 기술 문서는 법률이 허용하는 최대 범위까지 참고로 포함된다.

도 1a TCR-항CD3-Fc 융합 단백질의 설계; 도 1b 본 발명의 TCR-항CD3-Fc 융합 단백질의 예시적인 서열
도 2는 Fc 도메인을 포함하는 TCR-항CD3 융합체가 항원 양성 표적 세포의 존재하에 T 세포 활성화를 매개할 수 있음을 보여준다. 3개의 IgG1-Fc 융합체에 대한 데이터가 표시된다.
도 3a는 알부민 결합 펩티드를 포함하는 TCR-항CD3 융합체가 항원 양성 표적 세포의 존재하에 T 세포 활성화를 매개할 수 있음을 보여준다. 알부민 결합 펩티드가 C-알파 (F1), N-알파 (F2) 또는 C-베타 (F3)에 부착되어 있는 세 가지 형식이 표시된다. 도 3b는 알부민 결합 나노바디를 포함하는 TCR-항CD3 융합체가 항원 양성 표적 세포의 존재하에 T 세포 활성화를 매개할 수 있음을 보여준다. 알부민 결합 펩티드가 C-알파 (R) 또는 C-베타 (Y)에 부착되어 있는 두 가지 형식이 표시된다. 도 3c는 알부민 결합 도메인 항체(Albudab®)를 포함하는 TCR-항CD3 융합체가 항원 양성 표적 세포의 존재하에 T 세포 활성화를 매개할 수 있음을 보여준다. Albudab®이 TCR-항CD3 융합체의 C-알파에 부착되어 있는 하나의 형식이 도시된다.
도 4a는 마우스 혈청에서 TCR-항CD3-Albudab® 융합체의 PK 특성을 보여주고 도 4b는 마우스에서 TCR-항CD3-Albudab® 융합체 기반 평가에 대한 인간에서의 이론적 PK를 보여준다.

실시예

하기 실시예는 TCR-항CD3-Fc 융합 단백질 또는 TCR-항CD3-알부민-결합 융합 단백질로 지칭될 수 있는 본 발명의 다중-도메인 결합 분자를 기술한다.

실시예 1 (Fc 융합체)

a) TCR - 항CD3 - Fc 융합 단백질의 설계

당해 실시예에서, PRAME로부터의 HLA-A*02 제한 펩티드에 결합하는 고친화성 TCR을 포함하는 TCR-항CD3 융합 단백질을 사용하였다. 이러한 분자의 예는 제WO2018234319호에 제공되어 있다.

인간 IgG1 Fc 도메인을 링커를 통해 TCR-항CD3의 C 말단에 융합하였다(개략도는 도 1A 참조). 당업계에 공지된 인간 IgG1 Fc의 기능적 변이체를 포함하는 추가의 2개의 작제물을 제조하였다. 변이체 1은 Fcγ 수용체(FcγR) 또는 보체 단백질 C1q에 결합하지 않으므로 기능적으로 침묵한다. 변이체 2는 FcRn에 대한 증가된 결합을 보이며, 이것은 연장된 생체내 반감기를 야기할 수 있다. 각각의 경우에 Fc 도메인은 이종이량체화를 촉진하기 위해 공지된 구멍내 매듭 (knobs in holes) 돌연변이 Y86T 및 T22Y를 포함한다.

도 1b는 기능적으로 침묵하는 인간 IgG1 Fc를 포함하는 TCR-항-CD3-Fc 융합체(변이체 1)의 서열을 보여준다.

b) TCR - 항CD3 - Fc 융합 단백질의 발현 및 정제

Fc 융합체의 발현은 현탁-적응된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 기반한 일과성 발현 시스템(ExpiCHO Expression system, Thermo Fisher)을 사용하여 수행하였다. 다양한 Ig Fc 도메인에 융합된 관련 TCR 쇄를 함유하는 포유동물 발현 플라스미드를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포를 형질감염시켰다. 수확 후, 세포 배양물 상청액을 냉장 원심분리기에서 30분 동안 4000 - 5000 xg에서 세포를 원심분리하여 정화하였다. 상청액을 0.22μm 필터를 통해 여과하고 추가 정제를 위해 수집하였다.

정제를 위해, Fc 융합체를 제조업체의 지침에 따라 mAbselect Sure 사전포장된 컬럼(GE Healthcare 또는 등가 수지)을 사용하여 정제하기 전에 먼저 완충액으로 조정하였다. 특정 단백질 함유 분획을 혼주하고 생리학적으로 관련된 완충액에서 적절한 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 특정 단백질 함유 분획을 혼주하고 다운스트림 시험 및 저장을 위해 농축하였다.

c) TCR-항CD3-Fc 융합 단백질에 의한 강력한 T 세포 활성화

TCR-항CD3-Fc 융합 단백질을 항원 제시 T2 세포에 대한 CD3+ T 세포의 강력한 재지시(redirection)를 매개하는 능력에 대해 평가하였다. 인터페론-γ(IFN-γ) 방출을 T 세포 활성화에 대한 판독값으로서 사용하였다.

제조업체의 지침에 따라 인간 IFN-γ ELISPOT 키트(BD Biosciences)를 사용하여 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, T2 세포를 표적 세포로서 사용하고 5nM PRAME 펩티드로 펄싱하였다. 표적 세포를 분석 배지(10% 열 불활성화 FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640)에서 1x10⁶/ml의 밀도로 제조하고 50μl의 용적으로 웰당 50,000개 세포로 플레이팅하였다. 신선한 기증자 혈액으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이펙터 세포로서 사용하고 50μl의 용적으로 웰당 35,000개 세포로 플레이팅하였다. TCR-항CD3-Fc 융합 단백질을 10nM 내지 0.0001nM의 최종 농도로 적정하고, 50μl의 용적으로 웰에 첨가하였다.

제조업체의 지침에 따라 플레이트를 준비하였다. 표적 세포, 이펙터 세포 및 융합 단백질을 함유하는 웰을 분석 배지를 사용하여 200μl의 최종 용적으로 되도록 만들었다. 모든 반응은 3회 반복으로 수행하였다. 대조군 웰을 또한 융합 단백질, 이펙터 세포 또는 표적 세포를 생략하여 준비하였다. 플레이트를 밤새 배양하였다(37^oC/5% CO₂). 다음날 플레이트를 세척 완충액(탈이온수에서 구성된 0.05% Tween-20을 포함하는 1xPBS 샤쉐)으로 3회 세척하였다. 그후 1차 검출 항체를 50μl의 용적으로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 3회 세척하기 전에 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 2차 검출은 50μl의 희석된 스트렙타비딘-HRP를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하고 세척 단계를 반복함으로써 수행하였다. 사용 전 15분 이내에, AEC 크로모젠 1방울(20μl)을 각 1ml의 AEC 기질에 첨가하고 혼합하고 각 웰에 50μl를 첨가하였다. 스팟 전개를 정기적으로 모니터링하고 플레이트를 수돗물로 세척하여 전개 반응을 종료하였다. 그후 플레이트를 Immunospot 소프트웨어(Cellular Technology Limited)를 갖는 CTL 분석기를 사용하여 스팟을 계수하기 전에 적어도 2시간 동안 실온에서 건조되도록 두었다. PRISM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 준비하고 분석하였다.

도 2에 제시된 결과는 TCR-항CD3-Fc 융합 단백질이 항원 양성 표적 세포의 존재하에 효과적인 T 세포 활성화를 매개한다는 것을 입증한다. EC₅₀ 값은 pM 범위였다(각각 IgG1-Fc에 대한 융합체, IgG1-Fc-변이체1 및 IgG1-Fc-변이체2에 대해 각각 238pM, 257pM 및 25pM). 항원 음성 표적 세포를 사용한 대조군 실험은 기능적으로 침묵하는 IgG1-변이체2가 무시할 수 있는 배경 활성을 제공함을 입증하였다. 따라서 기능적으로 침묵하는 Fc 도메인이 치료 용도에 가장 바람직한 것으로 간주되었다.

실시예 2 (알부민 결합)

a) TCR-항CD3-알부민-결합 융합 단백질의 설계

제1 설계에서, TCR-항CD3 융합 단백질은 gp100으로부터의 HLA-A*02 제한 펩티드에 결합하는 고친화성 TCR을 포함하였다. 이러한 분자의 아미노산 서열은 제WO2011001152호에 개시되어 있다. 구체적으로, TCR-항CD3 융합체는 제WO2011001152호의 서열 번호 45의 알파 쇄(여기서, 아미노산 1-109는 제WO2011001152호의 서열 번호 8로 대체되고, 위치 1의 아미노산은 서열 번호 45의 넘버링에 기반하여 A이다); 및 제WO2011001152호의 서열 번호 36의 베타 쇄(여기서, 잔기 259-370은 제WO2011001152호의 서열 번호 27에 상응하고, 위치 1 및 2의 아미노산은 각각 A 및 I이다)를 포함하였다. 아미노산 서열 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF를 갖는 알부민 결합 펩티드(문헌[Dennis et al., J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43]에 기술된 바와 같음)를 링커를 통해 TCR-항CD3 융합체에 부착하였다. 적합한 링커는 GGGGS이다. 알부민 결합 펩티드가 3개의 상이한 부착 부위에서 융합된 3개의 변이체를 제조하였다: C-알파 (F1), N-알파 (F2) 또는 C-베타 (F3).

제2 설계에서, 알부민 결합 나노바디를 제1 디자인에서 사용된 것과 동일한 TCR-항CD3 융합체에 부착하였다. 제WO2006122787호의 서열 번호 52의 서열을 갖는 알부민 결합 나노바디를 링커를 통해 TCR-항CD3 융합체에 부착하였다. 적합한 링커는 GGGGS이다. 알부민 결합 나노바디가 두 개의 상이한 부착 부위에서 융합된 2개의 변이체를 제조하였다: C-알파 (R) 또는 C-베타 (Y).

제3 설계에서, 알부민 결합 도메인 항체를 TCR-항CD3 융합 알파 쇄의 C 말단에 부착하였다. 항체는 Albudab® 플랫폼에 속한다. 도메인 항체의 두 개의 변이체를 사용하였다; 제WO201010893호의 각각 서열 번호 26 및 27에 의해 제공된 DOM 7h-10-14 dAb 및 DOM 7h-11-15 dAb. 항체는 링커를 통해 및 직접(즉, 링커 없이) 부착하였다. 적절한 링커는 GGGGS이다. TCR-항CD3 융합 단백질은 MAGEA3으로부터의 HLA-A*01 제한 펩티드에 결합하는 고친화성 TCR을 포함하였다. 이러한 분자의 아미노산 서열은 제WO2013041865호에 제공되어 있다.

b) TCR-항CD3-알부민-결합 융합 단백질의 발현 및 정제

TCR-항CD3-알부민-결합 융합 단백질을 TCR-항CD3 융합 단백질에 대해 당업계에 공지된 것과 동일한 방법을 사용하여 봉입체로서 대장균에서 발현시키고 후속적으로 리폴딩하고 정제하였다(예를 들면, 제WO2011001152호, 실시예 2 참조).

c) TCR-항CD3-알부민-결합 융합 단백질에 의한 강력한 T 세포 활성화

TCR-항CD3-알부민 결합 융합 단백질을 항원 양성 암 세포에 대한 CD3+ T 세포의 강력한 재지시를 매개하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 인터페론-γ(IFN-γ) 방출을 T 세포 활성화에 대한 판독값으로서 사용하였다.

제조업체의 지침에 따라 인간 IFN-γ ELISPOT 키트(BD Biosciences)를 사용하여 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, 알부민 결합 펩티드를 포함하는 융합체의 경우, 흑색종 Mel526 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 표적 세포를 분석 배지(RPMI 1640, 플러스 150μM 인간 혈청 알부민(HSA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민)에서 1x10⁶/ml의 밀도로 제조하고 50μl의 용적으로 웰당 50,000개 세포로 플레이팅하였다. 신선한 기증자 혈액으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이펙터 세포로서 사용하고 50μl의 용적으로 웰당 30,000개 세포로 플레이팅하였다. TCR-항CD3-Fc 융합 단백질을 10nM 내지 0.0001nM의 최종 농도로 적정하고, 50μl의 용적으로 웰에 첨가하였다.

Albudab®를 포함하는 융합체의 경우, 골수종 EJM 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 표적 세포를 분석 배지(RPMI 1640, 플러스 45μM HSA, 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민)에서 1x10⁶/ml의 밀도로 제조하고 50μl의 용적으로 웰당 50,000개 세포로 플레이팅하였다. 신선한 기증자 혈액으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이펙터 세포로서 사용하고 50μl의 용적으로 웰당 30,000개 세포로 플레이팅하였다. TCR-항CD3-Fc 융합 단백질을 10nM 내지 0.0001nM의 최종 농도로 적정하고, 50μl의 용적으로 웰에 첨가하였다.

실시예 1c에 기술된 바와 같이 플레이트를 제조하고 전개하였다.

도 3a-3c는 TCR-항CD3 융합 단백질에 대한 알부민 결합 모이어티의 융합이 항원 양성 표적 세포의 존재하에 효과적인 T 세포 활성화를 매개한다는 것을 보여준다. Ec50 값은 pM 범위였다(137.4/ 178.0/ 137.1)

실시예 3 (연장된 반감기)

a) TCR-항CD3-알부민-결합 융합 단백질의 PK 평가

TCR-항CD3-AlbudAb 융합체의 PK 특성을 마우스 혈청에서 조사하였다.

마우스에게 0.1mg/kg의 융합 단백질을 정맥내 농축괴 주사에 의해 투여하고 혈청 샘플을 120시간의 기간에 걸쳐 일정한 간격으로 채취하였다. PK 평가는 ELISA 기반 분석을 사용하여 수행하였다. 간단히 말해서, 비오틴화된 pHLA 복합체를 스트렙타비딘-코팅 플레이트에 부착한 다음 혈청 샘플을 첨가하였다. 450nm에서 TMB로 비색 검출을 위해 활성화된 HRP-접합된 항-염소 IgG 및 항-CD3 scFv에 대한 1차 염소 항체를 사용하여 검출 단계를 수행하였다. 생성된 결과는 희석 시리즈 및 표준 곡선에 대한 분석을 사용함으로써 TCR-항CD3-Albudab 융합체의 존재 및 결합 활성을 확인하는데 사용되었다. 결과는 활성 %로서 보고되며 시간 경과에 따른 Cmax의 플롯을 생성하는데 사용된다.

생성된 PK 데이터가 도 4a에 표시되어 있다. 'TCR-Alb(10-14)' 및 'TCR-Alb(11-15)'로 표시된 샘플은 실시예 2a에 기술된 TCR-항CD3 융합체를 지칭함을 주지한다. 'TCR-Alb(D)'는 비-알부민 결합 Albudab에 융합된 대조군 샘플이고, 'TCR'은 Albudab가 없는 TCR-항CD3을 지칭한다.

도 4a로부터의 PK 데이터는 인간에서 TCR-항CD3-AlbudAb 융합체에 대한 이론적 PK 프로필을 계산하는데 사용되었다 (도 4b). Albudab에 대한 융합체는 생체내 반감기를 7시간에서 264시간으로 연장할 것으로 예상된다.

<110> IMMUNOCORE LIMITED <120> MULTI-DOMAIN BINDING MOLECULES <130> P121630WO <150> GB1901306.9 <151> 2019-01-30 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Linker sequence <400> 1 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Linker sequence <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Linker sequence <400> 3 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Linker sequence <400> 4 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Linker sequence <400> 5 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Linker sequence <400> 6 Gly Ser Gly Gly Gly Pro 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Linker sequence <400> 7 Gly Gly Glu Pro Ser 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Linker sequence <400> 8 Gly Gly Glu Gly Gly Gly Pro 1 5 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Linker sequence <400> 9 Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 226 <212> PRT <213> homosapien <400> 10 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly 1 5 10 15 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 20 25 30 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 35 40 45 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 100 105 110 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 130 135 140 Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 145 150 155 160 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 165 170 175 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 180 185 190 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 195 200 205 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 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Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 13 <211> 223 <212> PRT <213> homosapien <400> 13 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> homosapien <400> 14 Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Glu Asp Asp Phe 20 <210> 15 <211> 450 <212> PRT <213> homosapien <400> 15 Gly Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Asn Ser Met Glu Ser Asn Glu Glu 1 5 10 15 Glu Pro Val His Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp 20 25 30 Tyr Ile His Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Ser Gln Gly Pro Glu Tyr Val 35 40 45 Ile His Gly Leu Thr Ser Asn Val Asn Asn Arg Met Ala Ser Leu Ala 50 55 60 Ile Ala Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Ile Leu His Arg Ala Thr 65 70 75 80 Leu Arg Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Leu Ile Leu 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Claims

i) T 세포 관여 면역 이펙터에 연결된 펩티드-주요 조직적합성 복합체(pMHC) 결합 모이어티; 및
ii) 면역글로불린 Fc 또는 알부민 결합 도메인을 포함하는 반감기 연장 도메인을 포함하는, 다중-도메인 결합 분자.
제1항에 있어서,
상기 pMHC 결합 모이어티가 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 항체 가변 도메인, 및 적어도 하나의 불변 도메인을 포함하는 TCR 또는 TCR-유사 항체인, 다중-도메인 결합 분자.
제2항에 있어서,
상기 TCR이 이종이량체성 알파/베타 TCR 폴리펩티드 쌍인, 다중-도메인 결합 분자.
제2항에 있어서,
상기 TCR이 단일 쇄 알파/베타 TCR 폴리펩티드인, 다중-도메인 결합 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T-세포 관여 면역 이펙터 도메인이 CD3 및 또는 TCR/CD3 복합체와의 상호작용을 통해 T 세포를 활성화시키는 CD3 이펙터 도메인인, 다중-도메인 결합 분자.
제5항에 있어서,
상기 CD3 이펙터 도메인이 항체 scFv 또는 항체-유사 스캐폴드를 포함하는, 다중-도메인 결합 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 반감기 연장 도메인이 면역글로불린 Fc 도메인인, 다중-도메인 결합 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 반감기 연장 도메인이 알부민 결합 도메인을 포함하는, 다중-도메인 결합 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 반감기 연장 도메인이 pMHC 결합 모이어티의 C 또는 N 말단에 또는 T 세포 관여 면역 이펙터의 C 또는 N 말단에 연결되는, 다중-도메인 결합 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 반감기 연장 도메인이 링커를 통해 pMHC 결합 모이어티에 또는 T 세포 관여 면역 이펙터에 연결되는, 다중-도메인 결합 분자.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 다중-도메인 결합 분자.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르는 다중-도메인 결합 분자를 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르는 다중-도메인 결합 분자를 암호화하는, 핵산.
제13항의 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
상기 다중-도메인 결합 분자를 암호화하는 핵산이 각각 알파 쇄 및 베타 쇄를 암호화하는 단일 개방 판독 프레임 또는 2개의 별개의 개방 판독 프레임으로서 존재하는, 제13항의 핵산 또는 제14항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
핵산의 발현을 위한 임의의 조건하에 제15항의 숙주 세포를 유지하는 단계 및 다중-도메인 항원 결합 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는, 제1항에 따르는 다중-도메인 결합 분자의 제조 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따르는 다중-도메인 결합 분자 또는 제12항의 약제학적 조성물을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법.