KR20180090374A - Ny-eso-1 종양 항원-hla-a*02 복합체에 특이적인 t 세포 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 항원 NY-ESO-1로부터 유래된 HLA-A*02 제한 펩타이드 SLLMWITQC에 결합하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 상기 TCR은 네이티브 NY-ESO-1 TCR에 대한 알파 및/또는 베타 가변 도메인 내에 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 TCR은 악성 질환의 치료를 위한 신규한 면역요법 시약으로서 사용하기에 특히 적합하다.

Description

NY-ESO-1 종양 항원-HLA-A*02 복합체에 특이적인 T 세포 수용체
본 발명은 암 항원 NY-ESO-1로부터 유래된 HLA-A*02 제한 펩타이드 SLLMWITQC에 결합하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 상기 TCR은 네이티브 NY-ESO-1 TCR에 대한 알파 및/또는 베타 가변 도메인 내에 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 TCR은 악성 질환의 치료를 위한 신규한 면역요법 시약으로서 사용하기에 특히 적합하다.
T 세포 수용체(TCR)는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 자연적으로 발현된다. TCR은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와의 복합체로 항원 제시 세포의 표면 상에 발현되는 짧은 펩타이드 항원을 인식하도록 설계된다(인간에서, MHC 분자는 인간 백혈구 항원, 또는 HLA로도 알려져 있음)(Davis, et al., (1998), Annu Rev Immunol 16: 523-544.). 세포독성 T 세포라고도 하는 CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I에 결합된 펩타이드를 특이적으로 인식하며 일반적으로 감염된 또는 암성 세포를 찾아내고 이의 파괴를 중재하는 역할을 한다.
NY-ESO-1은 생식계열 암호화된 암 항원의 패밀리에 속하며(Chen, et al., (1997), Cytogenet Cell Genet 79(3-4): 237-240: WO9814464) Uniprot 수탁 번호 P78358을 갖는다. 이러한 생식계열 항원은 각종 암에서는 흔히 발현되는 것으로 발견된 반면, 정상 조직에서의 이들의 발현은 성인 고환 및 다른 면역 특혜 부위(immune privileged site)에 제한된다. 이러한 항원의 암 특이 성질은 이들을 항암 치료법에 이상적인 표적으로 만든다. NY-ESO-1의 정확한 기능은 여전히 알려져 있지 않지만 이의 발현은 태아 및 성인 고환(Satie, et al., (2002), Lab Invest 82(6): 775-780), 난소 및 자궁 자궁근층에서, 뿐만 아니라 골수종(Andrade, et al., (2008), Cancer Immun 8: 2), 난소암(Odunsi, et al., (2003), Cancer Res 63(18): 6076-6083), 소세포 폐암(Konishi, et al., (2004), Oncol Rep 11(5): 1063-1067) 및 흑색종(Barrow, et al., (2006), Clin Cancer Res 12(3 Pt 1): 764-771)을 포함한 광범위한 암에서 보고되었다. 9-mer 펩타이드 SLLMWITQC (서열번호 1)는 전장 NY-ESO-1 단백질의 아미노산 157-165에 상응한다. 동일한 펩타이드는 LAGE-1A(Acc. No. O75638-2), 대안적인 암 항원(Lethe, et al., (1998), Int J Cancer 76(6): 903-908)에서도 발견된다. 이 펩타이드는 HLA-A*02에 결합하며 펩타이드-HLA 복합체는 세포독성 T 세포를 자극하여 NY-ESO-1+, HLA-A*02+, 종양 세포의 용균을 야기할 수 있다(Duffour, et al., (1999), Eur J Immunol 29(10): 3329-3337 and WO2000020445). 따라서, SLLMWITQC HLA-A*02 복합체는 면역요법적 개입을 위한 유용한 표적 항원을 제공한다.
SLLMWITQC HLA-A*02 복합체에 결합하는 특정 TCR 서열의 동정은 신규한 면역요법의 개발을 위해 유리하다. 이러한 치료적 TCR은, 예를 들어, 세포독성제 또는 면역 효과기 제제를 종양에 전달하기 위한 목적으로 가용성 표적화제로서 사용될 수 있거나(Lissin, et al., (2013). "High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions. Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges". S. R. Schmidt, Wiley; Boulter, et al., (2003), Protein Eng 16(9): 707-711; Liddy, et al., (2012), Nat Med 8: 980-987), 또는 대안적으로 이들은 입양 치료(adoptive therapy)를 위해 T 세포를 조작하는데 사용될 수 있다(June, et al., (2014), Cancer Immunol Immunother 63(9): 969-975). TCR은 면역요법적 사용을 위해 표적 항원을 강하게 인식할 수 있는 것이 바람직한데, 이것은 TCR이 강력한 반응을 발휘하기 위해 표적 항원에 대해 높은 친화도 및/또는 긴 결합 반감기를 가져야 함을 의미한다. TCR은 자연에 존재하기 때문에 전형적으로 표적 항원에 대해 낮은 친화도(낮은 마이크로몰 범위)를 가지며, 따라서 항원 결합을 개선하기 위해 소정의 TCR 서열에 대해 이루어질 수 있는 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하지만 이에 제한되지 않는 돌연변이를 동정하는 것이 종종 필요하다. 가용성 표적화제로서 사용하기 위해서는 항원 결합 친화도가 나노몰 내지 피코몰 범위이고 수 시간의 결합 반감기를 갖는 TCR이 바람직할 수 있다. 또한, 치료적 TCR이 오프-타겟 결합으로부터 야기되는 임상 응용에서의 독성의 위험을 완화시키기 위해 표적 항원에 대해 높은 수준의 특이성을 입증하는 것이 바람직하다. 이러한 높은 특이성을 수득한다는 것은 TCR 항원 인식의 자연적인 퇴화를 고려해 볼 때 특별히 중요한 의미를 갖는다(Wooldridge, et al., (2012), J Biol Chem 287(2): 1168-1177; Wilson, et al., (2004), Mol Immunol 40(14-15): 1047-1055). 마지막으로, 치료적 TCR이 매우 안정한 형태로 발현되고 정제될 수 있는 것이 바람직하다.
본원에서 정의된 TCR 서열은 TCR 분야에서 일하는 분들에게 널리 공지되어 있고 접근이 쉬운 IMGT 명명법을 참고로 하여 기술된다. 예를 들어, 다음을 참고한다: LeFranc and LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 1O; and Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266. αβ TCR은 두 개의 디설파이드 연결된 쇄로 이루어진다. 각 쇄(알파 및 베타)는 일반적으로 두 개의 도메인, 즉 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로 간주된다. 짧은 결합 영역은 가변 및 불변 도메인을 연결하며 전형적으로 가변 영역의 일부로 간주된다. 게다가, 베타 쇄는 통상적으로 가변 및 결합 영역 사이에 짧은 다양성 영역을 함유한다.
각 쇄의 가변 도메인은 N-말단에 위치하며 골격 서열에 매봉된 세 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. CDR은 펩타이드-MHC 결합을 위한 인식 부위를 포함한다. 알파 쇄 가변(Vα) 영역을 암호화하는 수 개의 유전자와 베타 쇄 가변(Vβ) 영역을 암호화하는 수 개의 유전자가 있다. 이들 유전자는 이들의 골격, CDR1 및 CDR2 서열에 의해, 및 부분적으로 정의된 CDR3 서열에 의해 구별된다. Vα 및 Vβ 유전자는 IMGT 명명법에서 각각 접두사 'TRAV' 및 'TRBV'를 가리킨다(Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). 마찬가지로 알파 및 베타 쇄에 대해 각각 'TRAJ' 또는 'TRBJ'로 불리는 수 개의 결합(joining) 또는 J 유전자가 있으며, 베타 쇄의 경우, 'TRBD'로 불리는 다양성(diversity) 또는 D 유전자가 있다(Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). 알파 및 베타 가변 영역 서열의 거대한 다양성은 대립유전자 변이체를 포함한 다양한 V, J 및 D 유전자 간의 조합적 재배열, 및 추가의 연접 다양성으로부터 야기된다(Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107). TCR 알파 및 베타 쇄의 불변, 또는 C, 영역을 각각 'TRAC' 및 'TRBC'라고 한다(Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 1O).
본 명세서 및 청구항에서, 용어 "TCR 알파(또는 α) 가변 도메인"은 TRAV 및 TRAJ 영역의 연결; TRAV 영역 단독; 또는 TRAV 및 부분 TRAJ 영역을 가리키고, 용어 TCR 알파(또는 α) 불변 도메인은 세포외 TRAC 영역, 또는 C-말단 절단된 또는 전장 TRAC 서열을 가리킨다. 마찬가지로 용어 "TCR 베타(또는 β) 가변 도메인"은 TRBV 및 TRBD/TRBJ 영역의 연결; TRBV 및 TRBD 영역 단독; TRBV 및 TRBJ 영역 단독; 또는 TRBV 및 부분 TRBD 및/또는 TRBJ 영역을 가리킬 수 있고, 용어 TCR 베타(또는 β) 불변 도메인은 세포외 TRBC 영역, 또는 C-말단 절단된 또는 전장 TRBC 서열을 가리킨다.
NY-ESO-1을 표적화하는 TCR이 이전에 보고된 바 있다(WO05113595; WO08039818; McCormack, et al., (2013), Cancer Immunol Immunother 62(4): 773-785).
본 발명자들은 NY-ESO-1 HLA-A*02 복합체에 결합하는 또 다른 TCR 알파 및 베타 가변 도메인 서열을 확인하였다. 이러한 서열은 SLLMWITQC HLA-A*02 복합체를 나타내는 암의 표적화된 면역요법을 위한 치료적 TCR로서 사용하기에 특히 적합하다.
본 발명자들은 다음의 쇄 사용을 포함한 네이티브 TCR을 확인하였다:
알파 쇄: TRAV3*01/TRAJ28*01
베타 쇄: TRBV29-1*01/TRBD2*01/TRBJ2-3*01
(주석, 용어 '*01'은 IMGT 명명법에 의해 지정된 바와 같이 이러한 서열에 대한 대립유전자 변이체를 나타낸다)
이러한 네이티브 TCR은 본 발명의 돌연변이된 서열을 유도하는 주형으로서 사용되었다.
본 발명은 제1 측면으로서 SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하는 특성을 가지며 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 제공하며, 여기서
알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 아미노산 1-117과 적어도 90% 동일성, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나,
베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 아미노산 1-115와 적어도 90% 동일성, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
제2 측면으로서, 본 발명은 50μM 초과의 친화도로 SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하는 TCR을 제공하며, 여기서: 알파 쇄 CDR 1, 2 및 3은 각각 서열번호 41, 42 및 43을 포함하고/하거나, 베타 쇄 CDR 1, 2 및 3은 각각 서열번호 44, 45 및 46을 포함하고/하거나; CDR 중의 적어도 하나는 서열번호 41 내지 46에 대해 하나 이상의 보존적 치환을 함유하고/하거나; CDR 중의 적어도 하나는 서열번호 41 내지 46에 대해 세 개 이하의 관용 치환(tolerated substitution)을 함유한다.
제1 또는 제2 측면의 알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 가질 수 있고/있거나:
Figure pct00001
제1 또는 제2 측면의 베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 가질 수 있다:
Figure pct00002
알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 가질 수 있고/있거나:
Figure pct00003
베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 가질 수 있다.
Figure pct00004
알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 2 내지 6개를 가질 수 있고/있거나:
Figure pct00005
베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 3을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 3 내지 9개를 가질 수 있다.
Figure pct00006
알파 쇄 가변 도메인은 다음의 돌연변이 그룹 중의 적어도 하나를 가질 수 있고/있거나
그룹 1: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A
그룹 2: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97D
그룹 3: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97R
그룹 4: I96S, N97D, S98Q, G99H
그룹 5: D95S, I96S, N97R, S98Q, G99H
그룹 6: I51L, G53D
베타 쇄 가변 도메인은 다음의 돌연변이 그룹 중의 적어도 하나를 가질 수 있다
그룹 1: N50W, Q51T, S53G
그룹 2: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G
그룹 3: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G, G100A
그룹 4: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T
그룹 5: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G
그룹 6: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G, G100A
그룹 7: S27K, Q28R, V29L, T30A, M3IL, N50W, Q51T
그룹 8: T30A, N50W, G100A
알파 쇄 가변 도메인 및 베타 쇄 가변 도메인은 각각 다음의 돌연변이 그룹을 가질 수 있다:
Figure pct00007
본 발명의 TCR은 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이를 갖는 알파 쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고/있거나:
Figure pct00008
베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 포함할 수 있다:
Figure pct00009
알파 쇄 가변 도메인에서 아미노산 잔기 27 - 32, 50 - 57 및 91 - 107의 서열은 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00010
TCR 알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 12와 적어도 90% 동일성, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
베타 쇄 가변 도메인에서 아미노산 잔기 27 - 31, 49 - 55 및 93 - 106의 서열은 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00011
TCR 베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 15와 적어도 90% 동일성, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
알파 쇄 가변 도메인은 아미노산 잔기 27-32, 50-57 및 91-107의 서열을 가질 수 있고 베타 쇄 가변 도메인은 다음으로부터 선택된 아미노산 잔기 27-31, 49-55 및 93-106의 서열을 가질 수 있다:
Figure pct00012
알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 12와 적어도 90% 동일성, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고 베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 15와 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 6-12, 또는 51의 아미노산 서열로부터 선택될 수 있고 베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 13-23, 또는 52의 아미노산 서열로부터 선택될 수 있다.
알파 쇄 가변 도메인 및 베타 쇄 가변 도메인은 다음의 아미노산 서열로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00013
본 발명의 TCR은 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열과 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 갖는 알파-베타 이형이량체일 수 있다.
알파 및 베타 쇄 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 간의 네이티브 디설파이드 결합을 결실시키는 절단 또는 치환에 의해 변형될 수 있고/있거나 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)은 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57을 시스테인 잔기로 치환함으로써 변형될 수 있으며, 상기 시스테인은 TCR의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에 비-네이티브 디설파이드 결합을 형성한다.
본 발명의 TCR은 타입 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ의 단일 쇄 포맷일 수 있으며, 여기서 Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 영역이며, L은 링커 서열이다.
본 발명의 TCR은 검출 가능한 표지, 치료제 또는 PK 변형 모이어티와 결합될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 TCR 및 TCR의 알파 또는 베타 쇄의 C- 또는 N-말단에 공유 결합된 항-CD3 항체를 포함하는 TCR 항-CD3 융합체를 제공하며 이러한 TCR 항-CD3 융합체는 서열번호 6-12, 또는 51 중 어느 하나로부터 선택된 알파 쇄 가변 도메인 및 서열번호 13-23, 또는 52 중 어느 하나로부터 선택된 베타 쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 베타 쇄는 링커 서열을 통해 항-CD3 항체 서열에 결합될 수 있다; 링커 서열은 GGGGS (서열번호 24), GGGSG (서열번호 25), GGSGG (서열번호 26), GSGGG (서열번호 27), GSGGGP (서열번호 28), GGEPS (서열번호 29), GGEGGGP (서열번호 30), 및 GGEGGGSEGGGS (서열번호 31)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 TCR 항-CD3 융합체는 아래 표에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 쌍과 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 알파 쇄 아미노산 서열 및 베타 쇄 아미노산 서열 쌍을 포함할 수 있다.
Figure pct00014
본 발명은 또한 본 발명의 TCR 또는 TCR 항-CD3 융합체를 암호화하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명의 TCR 또는 TCR 항-CD3 융합체를 제시하는 비-자연 발생적 및/또는 정제된 및/또는 조작된 세포가 제공되며, 당해 세포는 (a) 단일 개방형 해독틀(open reading frame; ORF), 또는 두 개의 별개의 개방형 해독틀에서 각각 알파 쇄 및 베타 쇄를 암호화하는 본 발명의 핵산을 포함하는 TCR 발현 벡터; 또는 (b) 본 발명의 TCR 또는 TCR 항-CD3 융합체의 알파 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 본 발명의 TCR 또는 TCR 항-CD3 융합체의 베타 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함한다.
TCR 또는 TCR 항-CD3 융합체를 제시하는 세포 또는 발현 벡터(들)를 포함하는 세포는 T-세포일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 TCR 또는 TCR 항-CD3 융합체 또는 본 발명의 세포를, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제에서 사용하기 위한 본 발명의 TCR, TCR 항-CD3 융합체 또는 핵산 또는 세포가 또한 제공된다. TCR, TCR 항-CD3 융합체, 세포 또는 핵산은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것일 수 있다.
인간 대상체는 NY-ESO-1 및/또는 LAGE-1A를 발현하는 종양을 가질 수 있으며 종양은 고형 종양일 수 있고 활막 육종, 비 소세포 폐 암종(NSCLC), 방광 종양, 위 종양, 전립선 종양, 결장 종양, 유방 종양, 난소 종양, 식도 종양, 흑색종, 다발성 골수종, 간세포 암종 및 두경부 종양으로부터 선택될 수 있다. 인간 대상체는 HLA-A*02 아형의 대상체일 수 있다.
발명의 상세한 설명
제1 측면에서 본 발명은 SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하는 특성을 가지며 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 제공하며, 여기서 알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 아미노산 1-117과 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 아미노산 1-115와 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. TCR은 단리되거나, 세포를 함유하지 않고/않거나 가용성일 수 있으며, 즉, 이것은 인체내 T-세포 내에서 이의 자연 상태로 발생하는 TCR이 아닐 수 있다.
본 발명은 또한 50μM 초과의 친화도로 SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하는 TCR을 제공하며, 여기서: 알파 쇄 CDR 1, 2 및 3은 각각 서열번호 41, 42 및 43을 포함하고/하거나, 베타 쇄 CDR 1, 2 및 3은 각각 서열번호 44, 45 및 46을 포함하고/하거나; CDR 중의 적어도 하나는 서열번호 41 내지 46에 대해 하나 이상의 보존적 치환을 함유하고/하거나; CDR 중의 적어도 하나는 서열번호 41 내지 46에 대해 세 개 이하의 관용 치환을 함유한다. SLLMWITQC HLA-A*02 복합체에 대한 TCR의 친화도는 50uM 내지 100nM의 범위일 수 있다. 바람직하게는 상기 치환은 비-치환된 TCR에 비해 +/- 50% 이상까지, 또는 보다 바람직하게는 최대 +/- 20%까지 결합 친화도를 변화시키지 않는다.
본 발명의 안정한 가용성 TCR의 생산을 위해, 네이티브 TCR의 가용성 버전이 도 2에 나타낸 서열을 갖는 출발 서열로서 사용되었다. 이러한 목적을 위해 비-네이티브 쇄간 디설파이드 결합이 형성될 수 있도록 시스테인 치환이 TRAC 및 TRBC 영역에 도입된다. 상기 시스테인 치환의 위치에 적합한 자리가 제WO03020763호에 기재되어 있다. 도 2는 가용성 포맷으로 각각 야생형 TCR 알파 및 베타 쇄의 세포외 서열을 보여준다. 서열번호 4는 TRAC의 Thr48이 Cys로 대체된 것을 제외하고는 네이티브 알파 쇄 세포외 서열인 서열번호 2와 동일하다. 마찬가지로 서열번호 5는 TRBC의 Ser57이 Cys로 대체되고, Cys75가 Ala로 대체되고 Asn201이 Asp로 대체된 것을 제외하고는 네이티브 베타 쇄 세포외 서열인 서열번호 3과 동일하다. 상기 기술된 가용성 야생형 TCR은 본 발명의 돌연변이된 TCR의 결합 프로파일을 비교할 수 있는 기준을 제공하는데 사용될 수 있다. 제1 측면의 TCR은 또한 제2 측면의 TCR일 수 있다.
본 발명의 양태 중 어느 하나 또는 둘 다의 TCR은 비-자연적으로 발생하고/하거나 정제되고/되거나 조작될 수 있다. 본 발명의 TCR은 네이티브 NY-ESO-1 TCR에 비해 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 베타 쇄 가변 도메인에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
"조작된 TCR" 및 "돌연변이체 TCR"은 본원에서 동의어로 사용되며 일반적으로 야생형 NY-ESO-1 TCR에 비해 특히 이의 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 베타 쇄 가변 도메인에서 도입된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 TCR을 의미한다. 돌연변이는 바람직하게는 CDR 영역 내에서 만들어진다. 이러한 돌연변이(들)는 전형적으로 SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 대한 TCR의 결합 친화도를 개선시킨다. 알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 가질 수 있고/있거나:
Figure pct00015
베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개를 가질 수 있다:
Figure pct00016
알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 가질 수 있고/있거나:
Figure pct00017
베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 가질 수 있다:
Figure pct00018
알파 쇄 가변 도메인은 다음의 돌연변이 그룹 중의 적어도 하나를 갖고/갖거나
그룹 1: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A
그룹 2: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97D
그룹 3: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97R
그룹 4: I96S, N97D, S98Q, G99H
그룹 5: D95S, I96S, N97R, S98Q, G99H
그룹 6: I51L, G53D
베타 쇄 가변 도메인은 다음의 돌연변이 그룹 중의 적어도 하나를 갖는다
그룹 1: N50W, Q51T, S53G
그룹 2: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G
그룹 3: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G, G100A
그룹 4: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T
그룹 5: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G
그룹 6: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G, G100A
그룹 7: S27K, Q28R, V29L, T30A, M3IL, N50W, Q51T
그룹 8: T30A, N50W, G100A
돌연변이 그룹의 특정 조합은 아래 표에 제시된 바와 같을 수 있다:
Figure pct00019
돌연변이의 특정 조합이 아래 표에 제시된 바와 같이 본 발명의 TCR에 존재할 수 있다:
Figure pct00020
Figure pct00021
특히, 알파 및 베타 쇄 가변 도메인은 아미노산 서열의 하기 조합을 포함할 수 있다:
Figure pct00022
특정 양태에서, 알파 쇄 CDR에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 돌연변이, 예를 들어 2 내지 6개의 돌연변이, 및/또는 베타 쇄 CDR에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 돌연변이, 예를 들어 3 내지 9개 돌연변이가 있다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 TCR의 α 쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 아미노산 잔기 1-117의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 단 α 쇄 가변 도메인은 상기한 돌연변이 중의 적어도 하나를 갖는다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 TCR의 β 쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 아미노산 잔기 1-115의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 단 β 쇄 가변 도메인은 상기한 돌연변이 중의 적어도 하나를 갖는다. 알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 6-12 또는 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 13-23 또는 52 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
돌연변이는 또한 CDR의 외부에서 만들어질 수 있으며, 이러한 돌연변이는 결합을 개선시킬 수 있지만, 바람직하게는 정제 수율 및 안정성을 개선시킨다. 이러한 돌연변이의 예는 알파 쇄 가변 도메인에서는 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음과 같을 수 있고/있거나:
Figure pct00023
베타 쇄 가변 도메인에서는 서열번호 3의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나일 수 있다:
Figure pct00024
모(parental) TCR에 대한 돌연변이는 SLLMWITQC에의 TCR의 결합 친화도(kD 및/또는 결합 반감기)를 증가시킬 수 있는 것들을 포함할 수 있다. 돌연변이는 비특이 결합의 양을 감소, 즉, SLLMWITQC에의 결합 이외에 항원에의 결합을 감소시킬 수 있거나, SLLMWITQC에 대한 TCR 결합의 특이성을 증가시킬 수 있는 것들을 포함할 수 있다. 돌연변이는 접힘 및/또는 제조의 효율을 증가시키는 것들을 포함할 수 있다. 어떤 돌연변이들은 이러한 특징들 각각에 기여할 수 있으며, 다른 돌연변이들은, 예를 들어, 친화성에는 기여하지만 특이성에는 기여하지 않거나, 특이성에는 기여하지만 친화성 등에는 기여하지 않을 수 있다.
본원에 개시된 본 발명의 임의의 TCR의 표현형적으로 잠재성인 변이체는 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "표현형적으로 잠재성인 변이체(phenotypically silent variant)"는 TCR이 하기 변화(들) 없는 상응하는 TCR과 유사한 표현형을 갖는 상기 제시된 것들 이외의 하나 이상의 추가의 아미노산 변화를 포함하는 TCR을 가리키는 것으로 이해된다. 본 출원의 목적을 위해, TCR 표현형은 항원 결합 친화도(KD 및/또는 결합 반감기) 및 항원 특이성을 포함한다. 표현형적으로 잠재성인 변이체는 동일한 조건(예를 들어 25℃에서 동일 SPR 칩 상에서) 하에 측정되는 경우 상기 변화(들) 없는 상응하는 TCR의 측정된 KD 및/또는 결합 반감기의 20% 이내의 SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 대한 KD 및/또는 결합 반감기를 가질 수 있다. 적합한 조건은 실시예 3에 추가로 정의된다. 항원 특이성은 아래에 추가로 정의된다. 당업계의 숙련가들에게 공지된 바와 같이, SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체와의 상호작용의 친화도를 변화시키지 않으면서 상기 설명된 것들과 비교하여 이의 가변 도메인에 변화를 포함하는 TCR을 제조하는 것이 가능할 수 있다. 특히, 이러한 잠재 돌연변이는 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않는 것으로 알려진 서열의 일부 내에 포함될 수 있다(예를 들어, 펩타이드 항원과 접촉하지 않는 CDR 또는 CDR의 일부의 바깥쪽). 이러한 사소한 변이체도 본 발명의 범위에 포함된다. 하나 이상의 보존적 및/또는 관용적 치환이 이루어진 TCR이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 관용 치환은 또한 아래에 정의된 바와 같이 표현형적으로 잠재성이지만 보존적이지 않을 수 있다. 관용 치환은 관용 치환을 갖지 않는 TCR에 비해 SLLMWITQC HLA-A*02 복합체에 대한 친화도에 있어서 감소를 야기할 수 있다. 친화도의 감소는 관용 치환을 갖지 않는 TCR의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% 또는 50%일 수 있다. 친화도의 감소는 50㎛ 미만(즉, 이보다 약한)의 친화도를 야기하지 않는다.
본 발명의 TCR은 또한 유사한 아미노산 서열을 갖고/갖거나 동일한 기능을 보유하는 하나 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다.　 숙련가는 다양한 아미노산이 유사한 특성을 가지며 따라서 '보존적'이라는 것을 알고 있다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 하나 이상의 이러한 아미노산은 당해 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 목적하는 활성을 없애지 않으면서 하나 이상의 다른 이러한 아미노산에 의해 종종 치환될 수 있다.
따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 종종 서로(지방족 측쇄를 갖는 아미노산) 치환될 수 있다.　 이러한 가능한 치환 중에서 글리신 및 알라닌이 (이들이 비교적 짧은 측쇄를 갖기 때문에) 서로를 치환하는데 사용되고 발린, 류신 및 이소류신이 (이들이 소수성인 보다 큰 지방족 측쇄를 갖기 때문에) 서로를 치환하는데 사용되는 것이 바람직하다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산들은 다음을 포함한다: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산).
이러한 성질의 치환을 종종 "보존적" 또는 "반-보존적" 아미노산 치환이라고 한다. 따라서, 본 발명은 TCR의 아미노산 서열이 서열번호 2, 6-12 또는 51의 아미노산 1-117 및/또는 서열번호 3, 13-23 또는 52의 아미노산 1-115를 포함하는 TCR과 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖도록, 상기한 아미노산 서열을 포함하되 서열에 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 TCR의 사용에까지 확대된다.
알파 쇄 가변 도메인 및 베타 쇄 가변 도메인의 특정 조합은 다음과 같을 수 있다:
Figure pct00025
위에 제공된 서열에 대한 아미노산 변화는 임의의 적합한 기술을 사용하여, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 또는 고체 상 합성을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 범위 내의 아미노산 치환은 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있음을 인지해야 한다. 예를 들어, 알라닌 상의 메틸 그룹은 에틸 그룹으로 대체될 수 있고/있거나, 펩타이드 주쇄에 사소한 변화가 이루어질 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 천연 또는 합성 아미노산이 사용되든 그렇지 않든 간에, 오직 L- 아미노산 만이 존재하는 것이 바람직하다.
당업계에 공지된 바와 같은 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같이 둘 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 관계이다. 당업계에서, 동일성은 또한 이러한 서열의 스트링 간의 매치에 의해 결정되는 바와 같이, 경우에 따라, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 두 개의 폴리펩타이드 또는 두 개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법들이 존재하지만, 동일성을 결정하는데 흔히 사용되는 방법은 컴퓨터 프로그램으로 성문화되어 있다. 두 서열 간의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
아미노산 서열을 비교하기 위해 CLUSTAL 프로그램과 같은 프로그램을 사용할 수 있다.　 이 프로그램은 아미노산 서열을 비교하고, 적당하다면 서열에 스페이스를 삽입함으로써 최적 정렬을 찾아낸다. 최적 정렬을 위해 아미노산 동일성 또는 유사성(아미노산 유형의 동일성 플러스 보존)을 계산하는 것이 가능하다. BLASTx 같은 프로그램은 최장 구간의 유사 서열을 정렬하고 걸맞은 값을 할당할 것이다. 따라서, 각각 다른 스코어를 갖는 몇몇 유사성 영역이 발견되는 비교치를 수득하는 것이 가능하다. 동일성 분석의 두 가지 타입 모두가 본 발명에서 고려된다.
두 개의 아미노산 서열 또는 두 개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트는 최적 비교 목적을 위해 서열을 정렬하고(예를 들어, 서열과의 최상의 정렬을 위해 제1 서열에 갭이 도입될 수 있다) 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교함으로써 결정된다. "최상의 정렬"은 최고의 동일성 퍼센트를 초래하는 두 개 서열의 정렬이다.　 동일성 퍼센트는 비교되는 서열들 중의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 수에 의해 결정된다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/총 위치의 수 x 100).
두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 당업계의 숙련가들에게 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 서열을 비교하기 위한 수학적 알고리즘의 예는 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 수정된 카를린 및 앨트슐의 알고리즘[참조; Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]이다. 앨트슐 등[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램이 이러한 알고리즘을 포함하였다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12로 하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명에서 사용하기 위한 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3으로 하여 수행할 수 있다. 비교 목적을 위해 갭 정렬(gapped alignment)을 수득하기 위해서는, Gapped BLAST가 문헌[참조; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이 활용될 수 있다.　 대안적으로, PSI-Blast가 분자들 간의 원연 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하기 위해 사용될 수 있다(Id.).　 BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 활용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조.　 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 예는 마이어스 및 밀러의 알고리즘[Myers and Miller, CABIOS (1989)]이다.　 CGC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)이 이러한 알고리즘을 포함하였다. 당업계에 공지된 서열 분석을 위한 또 다른 알고리즘은 문헌[Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5]에 기술된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8]에 기재된 FASTA를 포함한다.　 FASTA 내에서, ktup이 검색의 민감도 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다.
돌연변이는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 제한 효소-기반 클로닝, 또는 결찰 비의존적 클로닝(LIC) 절차를 기본으로 하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 이러한 방법들은 여러 표준 분자 생물학 교재에 상세하게 설명되어 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 제한 효소-기반 클로닝에 관한 추가의 상세한 설명을 위해서는, 문헌[Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press]을 참고한다. 결찰 비의존적 클로닝(LIC) 절차에 대한 추가의 정보는 문헌[Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6]에서 찾아볼 수 있다.
제2 측면의 TCR은 알파 쇄 골격 2(FM2) 영역 및 알파 쇄 골격 3(FM3) 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 FM2 및 FM3 영역은 각각 서열번호 47 및 48을 포함하고/하거나, 하나 이상의 보존적 치환 및/또는 세 개 이하의 관용 치환을 함유한다.
제2 측면의 TCR은 베타 쇄 FM2 영역 및 베타 쇄 FM3 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 FM2 및 FM3 영역은 각각 서열번호 49 및 50을 포함하고/하거나, 하나 이상의 보존적 치환 및/또는 세 개 이하의 관용 치환을 함유한다.
제2 측면의 TCR은 서열번호 2의 아미노산 1-117 및/또는 서열번호 3의 아미노산 1-115를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 하나 이상의 보존적 치환 및/또는 세 개 이하의 관용 돌연변이 및/또는 표 1 또는 표 2에 정의된 돌연변이 중의 하나 이상을 함유할 수 있다.
본 발명의 TCR은 SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하는 특성을 갖는다. 본 발명의 TCR은 다른, 무관련 에피토프에 비해 이 에피토프에 대해 매우 특이적인 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이러한 에피토프를 나타내는 세포 및 조직으로의 치료제 또는 검출 가능한 표지의 전달을 위한 표적화 벡터로서 특히 적합하다. 본 발명의 TCR의 맥락에서 특이성은 펩타이드에 대해 음성인 HLA-A*02 표적 세포를 인식하는 최소의 능력을 가지면서 펩타이드 SLLMWITQC에 대해 양성인 HLA-A*02 표적 세포를 인식할 수 있는 능력과 관련된다. 특이성을 시험하기 위해 TCR은 가용성 형태일 수 있고/있거나 T 세포의 표면 상에 발현될 수 있다. 인식은 TCR 및 표적 세포의 존재하에서 T 세포 활성화의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이 경우에, 펩타이드 음성 표적 세포의 최소 인식은 동일한 조건하에서 측정되는 경우 펩타이드 양성 표적 세포의 존재하에서 생산된 수준의 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만의 T 세포 활성화 수준으로서 정의된다. 본 발명의 가용성 TCR의 경우, 특이성은 치료학적으로 관련된 TCR 농도에서 결정될 수 있다. 치료학적으로 관련된 농도(therapeutically relevant concentration)는 10-9M 이하의 TCR 농도, 및/또는 상응하는 EC50 값보다 100배까지, 또는 1000배까지 더 높은 농도로서 정의될 수 있다. 펩타이드 양성 세포는 펩타이드-펄싱(peptide-pulsing)에 의해 수득될 수 있거나, 보다 바람직하게는, 이들은 상기 펩타이드를 자연적으로 제시할 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드 양성 및 펩타이드 음성 세포 둘 다는 인간 세포이다. 특이성은, 예를 들어, 실시예 6-8에 기재된 것들과 같은 세포 검정에서 측정될 수 있다. 특이성은 추가로, 예를 들어, Biacore에 의해 결정되는 바와 같이 NY-ESO-1-HLA-A*02 복합체에는 결합하지만, 다수의 자연적으로-존재하는 펩타이드 HLA 복합체에는 결합하지 않는 능력과 관련될 수 있다. 바람직하게는, NY-ESO-1-HLA-A*02 복합체에의 결합은 다른 자연적으로-존재하는 펩타이드 HLA 복합체보다 적어도 400배 더 크다.
본 발명의 TCR은 50μM보다 큰(즉, 보다 강한), 예를 들어 50μM 내지 1pM의 NY-ESO-1-HLA-A*02 복합체에 대한 KD를 가질 수 있다. 본 발명의 특정 TCR은 약 1pM 내지 약 50nM, 약 1pM 내지 약 400pM, 약 20pM 내지 약 200pM의 복합체에 대한 KD를 가질 수 있다. 본 발명의 TCR은 약 1초 내지 약 60시간 또는 그 이상, 약 30분 내지 약 60시간 또는 그 이상, 또는 약 6시간 내지 약 60시간 또는 그 이상의 범위의 복합체에 대한 결합 반감기(T½)를 가질 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 치료제에 결합되는 경우 가용성 치료제 및/또는 진단제로서 사용하기 위한 TCR은 바람직하게는 실시예 3의 BIAcore 방법을 사용하여 결정되는 바와 같이 약 1pM 내지 약 200pM, 또는 약 20pM 내지 약 100pM의 복합체에 대한 KD, 및/또는 실시예 3의 BIAcore 방법을 사용하여 결정되는 바와 같이 약 2시간 내지 60시간 또는 그 이상, 또는 약 20시간 내지 약 60시간 또는 그 이상의 복합체에 대한 결합 반감기를 갖는다. 본 발명의 특정 TCR은 입양 치료 용도에 적합할 수 있다; 이러한 TCR은 약 50nM 내지 약 50μM, 또는 약 100nM 내지 약 1μM의 복합체에 대한 KD 및/또는 약 3초 내지 약 12분의 복합체에 대한 결합 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 특정 TCR은 네이티브 TCR보다 실질적으로 더 높은 SLLMWITQC -HLA-A*02 복합체에 대한 결합 친화도 및/또는 결합 반감기를 갖는다. 네이티브 TCR의 결합 친화도를 증가시키는 것은 종종 이의 펩타이드-MHC 리간드에 대한 TCR의 특이성을 감소시키며, 이것은 문헌[Zhao Yangbing et al., The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, US, vol. 179, No.9, 1 November 2007, 5845-5854]에 입증되어 있다. 그러나, 본 발명의 TCR은 네이티브 TCR보다 실질적으로 더 높은 결합 친화도를 가짐에도 불구하고 SLLMWITQC-HLA-A*02 복합체에 대해 여전히 특이적일 수 있다.
결합 친화도(평형 상수 KD에 반비례함) 및 결합 반감기(T½로서 표현됨)는 본원의 실시예 3의 표면 플라스몬 공명(BIAcore) 및/또는 Octet 방법을 사용하여 결정될 수 있다. TCR의 친화도를 배가시키는 것은 KD를 이등분함을 초래하는 것으로 인지될 것이다. T½은 ln2를 오프-속도(koff)로 나눈 것으로서 계산된다. 따라서, T½의 배가는 koff의 이등분을 초래한다. TCR에 대한 KD 및 koff 값은 통상적으로 TCR의 가용성 형태, 즉, 세포질 및 막관통 도메인 잔기를 제거하도록 절단된 형태에 대해 측정된다. 바람직하게는 소정의 TCR의 결합 친화도 또는 결합 반감기는 동일한 검정 프로토콜을 사용하여 수 회, 예를 들어 3회 이상 측정되며, 결과의 평균을 취한다.
치료제를 항원 제시 세포에 전달하기 위한 표적화제로서의 사용을 위해 TCR은 가용성 형태(즉, 막관통 또는 세포질 도메인을 갖지 않음)일 수 있다. 안정성을 위해, 본 발명의 TCR, 및 바람직하게는 가용성 αβ 이형이량체성 TCR은, 예를 들어, 제WO 03/020763호에 기술된 바와 같이, 각각의 불변 도메인의 잔기들 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 본 발명의 αβ 이형이량체에 존재하는 불변 도메인 중의 하나 또는 둘 다는 C 말단 또는 C 말단들에서, 예를 들어 15개 이하, 또는 10개 이하 또는 8개 이하 또는 더 적은 아미노산으로 절단될 수 있다. 알파 쇄 세포외 불변 영역의 C 말단은 8개 아미노산으로 절단될 수 있다. 입양 치료에서 사용하기 위해, αβ 이형이량체성 TCR은, 예를 들어, 세포질 및 막관통 도메인 둘 다를 갖는 전장 쇄로서 형질감염될 수 있다. 입양 치료에서 사용하기 위한 TCR은 각각의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에 자연에서 발견되는 것에 상응하는 디설파이드 결합을 함유할 수 있으며, 추가로 또는 대안적으로 비-네이티브 디설파이드 결합이 존재할 수 있다.
본 발명의 TCR은 αβ 이형이량체일 수 있거나 단일 쇄 포맷일 수 있다. 단일 쇄 포맷은 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ 또는 Vα-L-Vβ-Cβ 타입의 αβ TCR 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 영역이며, L은 링커 서열이다. 특정 양태에서 본 발명의 단일 쇄 TCR은 제WO 2004/033685호에 기술된 바와 같이 각각의 불변 도메인의 잔기들 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 단일 쇄 TCR은 문헌[WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829)]에 추가로 기술되어 있다.
당업계의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, TCR의 결합 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 잔기로 C-말단 및/또는 N-말단에 제공된 서열을 절단하는 것이 가능할 수 있다. 이러한 모든 사소한 변이체들도 본 발명에 의해 포함된다.
본 발명의 알파-베타 이형이량체성 TCR은 통상적으로 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 포함한다. 알파 및 베타 쇄 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 간의 네이티브 디설파이드 결합을 결실시키는 절단 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)은 또한 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57을 시스테인 잔기로 치환함으로써 변형될 수 있으며, 상기 시스테인은 TCR의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에 디설파이드 결합을 형성한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 및/또는 제2 측면의 TCR을 암호화하는 핵산을 제공한다. 몇몇 양태에서, 핵산은 cDNA이다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 α 쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 β 쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 핵산은 비-자연 발생적이고/이거나 정제되고/되거나 조작될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는 벡터는 TCR 발현 벡터이다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터, 바람직하게는 TCR 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 벡터는 단일 개방형 해독틀, 또는 두 개의 별개의 개방형 해독틀에서 각각 알파 쇄 및 베타 쇄를 암호화하는 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 측면은 본 발명의 TCR의 알파 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 본 발명의 TCR의 베타 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함한 세포를 제공한다. 이러한 세포는 입양 치료에서 특히 유용하다. 본 발명의 세포는 단리 및/또는 재조합 및/또는 비-자연적 발생 및/또는 조작될 수 있다.
본 발명의 TCR은 입양 치료에 있어서 효용을 갖기 때문에, 본 발명은 본 발명의 TCR을 제시하는 비-자연 발생적이고/이거나 정제되고/되거나 조작된 세포, 특히 T-세포를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 TCR을 제시하는 확장된 T 세포군을 제공한다. T 세포를 본 발명의 TCR을 암호화하는 핵산(예를 들어, DNA, cDNA 또는 RNA)으로 형질감염시키는데 적합한 수많은 방법들이 있다(참조; 예를 들어 Robbins et al., (2008) J Immunol . 180: 6116-6131). 본 발명의 TCR을 발현하는 T 세포는 암의 입양 요법-기반 치료에서 사용하기에 적합할 것이다. 당업계의 숙련가들에게 공지된 바와 같이, 입양 치료를 실시할 수 있는 수많은 적합한 방법들이 있다(참조; 예를 들어 Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).
본 발명의 가용성 TCR은 검출 가능한 표지 또는 치료제를 항원 제시 세포 및 항원 제시 세포를 함유하는 조직에 전달하는데 유용하다. 따라서, 이들은 검출 가능한 표지(TCR이 SLLMWITQC-HLA-A*02 복합체를 제시하는 세포의 존재를 검출하는데 사용되는 진단 목적을 위해); 치료제; 또는 PK 변형 모이어티(예를 들어 페길화에 의해)와 (공유적으로 또는 달리) 결합될 수 있다.
진단 목적을 위한 검출 가능한 표지는, 예를 들어, 형광 표지, 방사선표지, 효소, 핵산 프로브 및 콘트라스트 시약을 포함한다.
본 발명의 TCR과 결합될 수 있는 치료제는 면역조절제, 방사성 화합물, 효소(예를 들어 퍼포린) 또는 화학요법제(예를 들어 시스-플라핀)를 포함한다. 독성 효과가 목적하는 위치에서 발휘되는 것을 보장하기 위해 화합물이 서서히 방출되도록 독소가 TCR에 연결된 리포솜 내부에 있을 수 있다. 이것은 체내 수송 동안 손상 효과를 방지하고, 독소가 관련 항원 제시 세포에의 TCR의 결합 후 최대 효과를 갖도록 보장할 것이다.
다른 적합한 치료제는 다음을 포함한다:
· 소분자 세포독성제, 즉, 700달톤(Dalton) 미만의 분자량을 갖는 포유류 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 화합물. 이러한 화합물은 또한 세포독성 효과를 가질 수 있는 독성 금속을 함유할 수 있다. 게다가, 이러한 소분자 세포독성제는 또한 프로-드럭, 즉, 생리학적 조건하에서 붕괴되거나 전환되어 세포독성제를 방출하는 화합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 제제의 예는 시스-플라틴, 메이탄신 유도체, 라셀마이신, 칼리키아미신, 도세탁셀, 에토포시드, 겜시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미토크산트론, 소르피머 소디움포토프린 II, 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트레에이트 글루쿠로네이트, 오리스타틴 E 빈크리스틴 및 독소루비신을 포함한다;
· 펩타이드 세포독소, 즉, 포유류 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 단백질 또는 이의 단편. 예를 들어, 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 박테리아 외독소 A, DNase 및 RNase;
· 방사성-핵종, 즉, α 또는 β 입자, 또는 γ선 중의 하나 이상의 동시 방출과 함께 붕괴되는 원소의 불안정한 동위원소. 예를 들어, 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이트륨 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213; 킬레이트화제가 고친화도 TCR, 또는 이의 다량체에의 이들 방사성-핵종의 결합을 촉진시키는데 사용될 수 있다;
· 면역자극제, 즉, 면역 반응을 자극하는 면역 효과기 분자. 예를 들어, IL-2 및 IFN-γ와 같은 사이토킨;
· 초항원 및 이의 돌연변이체;
· TCR-HLA 융합체, 예를 들어, 펩타이드-HLA 복합체에의 융합체, 여기서 상기 펩타이드는 엡스타인-바 바이러스(EBV)와 같은 공통 인간 병원체로부터 유도된다;
· 케모카인, 예를 들어, IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등;
· 항-T 세포 또는 NK 세포 결정 항체(예를 들어, 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16)를 포함한 항체 또는 이의 단편;
· 항체 유사 결합 특성을 갖는 대안적인 단백질 스캐폴드;
· 보체 활성제;
· 이종성 단백질 도메인, 동종성 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 펩타이드.
한 가지 바람직한 양태는 항-CD3 항체, 또는 상기 항-CD3 항체의 기능적 단편 또는 변이체와 (통상적으로 알파 또는 베타 쇄의 N- 또는 C-말단에의 융합에 의해) 결합된 본 발명의 TCR을 포함하는 TCR 항-CD3 융합체에 의해 제공된다. (이러한 TCR-항-CD3 융합체를 ImmTACTM 분자라고 부를 수 있다) 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 TCR은 TCR 항-CD3 융합체와 같은 TCR-융합체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 이러한 단편 및 변이체를 포함한다. 항-CD3 항체의 예는 OKT3, UCHT-1, BMA-031 및 12F6을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기술된 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 항체 단편 및 변이체/유사체는, 몇 가지 예를 들자면, 미니바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, dsFv 및 scFv 단편, 나노바디(Nanobodies)™(Ablynx(Belgium)에 의해 판매되는 이러한 작제물은 낙타과(예를 들어, 낙타 또는 라마) 항체로부터 유도되는 합성 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인을 포함한다) 및 도메인 항체(Domain Antibodies)(친화도 성숙된 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인 또는 면역글로불린 가변 경쇄 도메인을 포함하는 Domantis(Belgium)) 또는 항체 유사 결합 특성을 나타내는 대안적인 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 애피바디((조작된 단백질 A 스캐폴드를 포함하는 Affibody(Sweden)) 또는 안티칼린(Anticalin)(조작된 안티칼린을 포함한 Pieris(Germany))을 포함한다.
TCR 및 항-CD3 항체의 결합은 직접적일 수 있거나, 링커 서열을 통해 간접적일 수 있다. 링커 서열은 이들이 가요성(flexibility)을 제한할 것 같은 벌키한 측쇄를 갖지 않는 글리신, 알라닌 및 세린과 같은 아미노산으로 주로 이루어진다는 점에서 통상적으로 가요성이다. 링커 서열의 사용 가능한 또는 최적의 길이는 용이하게 결정된다. 종종 링커 서열은 약 12개 미만, 예를 들어, 10개 미만, 또는 5-10개 아미노산 길이일 것이다. 본 발명의 TCR 항-CD3 융합체에서 사용될 수 있는 적합한 링커는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: GGGGS (서열번호 24), GGGSG (서열번호 25), GGSGG (서열번호 26), GSGGG (서열번호 27), GSGGGP (서열번호 28), GGEPS (서열번호 29), GGEGGGP (서열번호 30), 및 GGEGGGSEGGGS (서열번호 31) (제WO2010/133828호에 기재된 바와 같음).
본 발명의 항-CD3-TCR 융합체 작제물의 특정한 양태는 아래 표에 나타낸 알파 및 베타 쇄 쌍을 포함한다.
[표 7]
Figure pct00026
특히 바람직한 항-CD3-TCR 융합체는 알파 쇄 서열번호 37 및 베타 쇄 서열번호 38을 포함한다.
일부 목적을 위해, 본 발명의 TCR은 수 개의 TCR을 포함하는 복합체로 응집되어 다가 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 다가 TCR 복합체의 생산에 사용될 수 있는 다량체화 도메인을 함유하는 수많은 인간 단백질이 있다. 예를 들어 단량체성 scFv 단편에 비해 증가된 혈청 지속성 및 상당히 감소된 오프-속도를 나타내고 scFv 항체 단편의 사량체를 생산하는데 사용되는 p53의 사량체화 도메인(Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). 헤모글로빈이 또한 이러한 종류의 용도를 위해 사용될 수 있는 사량체화 도메인을 갖는다. 본 발명의 다가 TCR 복합체는 본 발명의 비-다량체성 야생형 또는 T 세포 수용체 이형이량체에 비해 SLLMWITQC-HLA-A*02 복합체에 대해 증진된 결합 성능을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 TCR의 다가 복합체가 또한 본 발명 내에 포함된다. 본 발명에 따르는 이러한 다가 TCR 복합체는 시험관내 (in vitro) 또는 생체내에서 ( in vivo) 특정 항원을 제시하는 세포를 추적하거나 표적화하는데 특히 유용하며, 이러한 용도를 갖는 추가의 다가 TCR 복합체의 생산을 위한 중간체로서 또한 유용하다.
당업계에 널리 공지된 바와 같이, TCR은 번역 후 변형에 적용될 수 있다. 글리코실화가 이러한 변형 중의 하나이며, 이것은 TCR 쇄에서 정의된 아미노산에의 올리고당 모이어티의 공유적 부착을 포함한다. 예를 들어, 아스파라긴 잔기, 또는 세린/트레오닌 잔기가 올리고당 부착을 위한 널리 알려진 위치이다. 특정 단백질의 글리코실화 상태는 단백질 서열, 단백질 배좌 및 특정 효소의 이용가능성을 포함한 다수의 인자들에 따라 좌우된다. 게다가, 글리코실화 상태(즉, 올리고당 타입, 공유 결합, 및 부착의 총 수)는 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 재조합 단백질을 생산하는 경우, 글리코실화를 조절하는 것이 종종 바람직하다. 조절된 글리코실화가 항체 기반 치료법을 개선시키는데 사용된 바 있다(Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar;8(3):226-34.). 본 발명의 가용성 TCR의 경우 글리코실화는 예를 들어 특정 세포주를 사용함으로써 생체내에서, 또는 화학적 변형에 의해 시험관내에서 조절될 수 있다. 이러한 변형이 바람직할 수 있는데, 그 이유는 글리코실화가 약동학을 개선시키고, 면역원성을 감소시키며 네이티브 인간 단백질을 더욱 가깝게 모방할 수 있기 때문이다(Sinclair AM and Elliott S., Pharm Sci. 2005 Aug; 94(8):1626-35).
환자에의 투여를 위해, (바람직하게는 검출 가능한 표지 또는 치료제와 결합되거나, 형질감염된 T 세포 상에 발현된) 본 발명의 TCR 또는 TCR 항-CD3 융합체 또는 본 발명의 세포는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명에 따르는 치료적 또는 이미징 TCR, TCR 융합체 또는 세포는 통상적으로, 보통 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 멸균 약제학적 조성물의 일부로서 공급될 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 (이것을 환자에게 투여하는 목적하는 방법에 따라) 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다. 이것은 단위 투여형으로 제공될 수 있고, 일반적으로 밀봉된 용기에 제공될 것이며 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는 보통 (반드시 그런 것은 아니지만) 사용을 위한 지침서를 포함한다. 이것은 다수의 상기 단위 투여형을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 비경구(피하, 근육내, 또는 정맥내 포함), 장관(경구 또는 직장 포함), 흡입 또는 비강내 경로와 같은 임의의 적합한 경로에 의한 투여용으로 맞출 수 있다. 이러한 조성물은 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 활성 성분을 멸균 조건하에서 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 물질의 투여량은 치료하고자 하는 질환 또는 장애, 치료하고자 하는 개인의 연령 및 상태 등에 따라 광범위한 한계 내에서 변할 수 있으며, 항-CD3 항체와 결합된 본 발명의 가용성 TCR에 대한 적합한 용량 범위는 25ng/kg 내지 50μg/kg일 수 있다. 담당의가 궁극적으로 사용하고자 하는 적합한 투여량을 결정할 것이다.
본 발명의 TCR, 약제학적 조성물, 벡터, 핵산 및 세포는 실질적으로 순수한 형태, 예를 들어 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 순도로 제공될 수 있다.
또한, 다음이 본 발명에 의해 제공된다:
· 약제에서 사용하기 위한, 바람직하게는 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 TCR, TCR 항-CD3 융합체, 핵산 또는 세포;
· 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 TCR, TCR 항-CD3 융합체, 핵산 또는 세포의 용도;
· 본 발명의 TCR, TCR 항-CD3 융합체, 핵산, 또는 세포를 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 암을 치료하는 방법.
치료하고자 하는 암은 활막 육종, 비 소세포 폐 암종(NSCLC), 방광 종양, 위 종양, 전립선 종양, 결장 종양, 유방 종양, 난소 종양, 식도 종양, 흑색종, 다발성 골수종, 간세포 암종 및 두경부 종양일 수 있다.
본 발명의 각 측면의 바람직한 특징은 필요한 부분만 약간 수정하여 또 다른 측면들의 각각에 대한 것과 같다. 본원에 명시된 선행 기술 문헌들은 법률이 허용하는 최대 범위까지 포함된다.
본 발명은 하기 비제한적인 도면 및 실시예를 참고로 하여 아래에 설명된다:
도 1은 본 발명의 네이티브 알파 및 베타 쇄 가변 도메인의 세포외 영역의 아미노산 서열을 제공하고;
도 2는 본 발명의 네이티브 알파 및 베타 쇄의 가용성 세포외 영역의 아미노산 서열을 제공하고;
도 3은 본 발명의 돌연변이된 TCR 알파 쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제공하고;
도 4는 본 발명의 돌연변이된 TCR 베타 쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제공하고;
도 5는 본 발명의 TCR 서열을 포함하는 ImmTAC 분자의 아미노산 서열을 제공하고;
도 6은 본 발명의 TCR 서열을 포함하는 ImmTAC 분자의 아미노산 서열을 제공하고;
도 7은 본 발명의 TCR 서열을 포함하는 ImmTAC 분자의 아미노산 서열을 제공하고;
도 8은 본 발명의 TCR 서열을 포함하는 ImmTAC 분자의 아미노산 서열을 제공하고;
도 9는 본 발명의 ImmTAC 분자의 강력하고 특이적인 결합을 보여주고;
도 10은 본 발명의 2개의 ImmTAC 분자에 대한 추가의 역가 시험(potency testing)을 보여주고;
도 11은 본 발명의 3개의 ImmTAC 분자에 대한 추가의 특이성 시험을 보여주고;
도 12는 ImmTAC 재지시된 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 보여준다.
실시예
실시예 1 - 가용성 TCR의 발현, 리폴딩 및 정제
본 발명의 가용성 TCR의 알파 및 베타 세포외 영역을 암호화하는 DNA 서열을 표준 방법을 사용하여 pGMT7-기반 발현 플라스미드로 별도로 클로닝하였다(문헌[Sambrook, et al. Molecular cloning. Vol. 2. (1989) New York: Cold spring harbor laboratory press]에 기재된 바와 같음). 발현 플라스미드를 대장균(E. coli) 균주 Rosetta(BL21pLysS)로 별도로 형질전환시키고, 단일 암피실린-내성 콜로니를, 0.5mM IPTG로 단백질 발현을 유도하기 전에, 37℃에서 TYP (+ 암피실린 100mg/ml) 배지 중에서 ~0.6-0.8의 OD600으로 되도록 성장시켰다. 세포를 유도 후 세 시간 후에 원심분리에 의해 수거하였다. 세포 펠렛을 제조자의 지침에 따라 BugBuster 단백질 추출 시약(Merck Millipore)으로 용해시켰다. 봉입체 펠렛을 원심분리에 의해 회수하였다. 펠렛을 Triton 완충액(50mM Tris-HCI pH 8.1, 0.5% Triton-X100, 100mM NaCl, 10mM NaEDTA)에서 두 번 세척하고 마지막으로 세제 비함유 완충액(50mM Tris-HCl pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM NaEDTA)에 재현탁시켰다. 봉입체 단백질 수율은, 6M 구아니딘-HCl로 가용화시켜 OD280을 측정함으로써 정량하였다. 그 후, 단백질 농도를 소광 계수(extinction coefficient)를 사용하여 계산하였다. 봉입체 순도는, 8M 우레아로 가용화시키고 ~2μg을 환원 조건하에서 4-20% SDS-PAGE에 부하함으로써 측정하였다. 그 후, 순도를 밀도측정 소프트웨어(Chemidoc, Biorad)를 사용하여 추정 또는 계산하였다. 봉입체는 단기 저장을 위해서는 +4℃에서 및 장기 저장을 위해서는 -20℃ 또는 -70℃에서 저장하였다.
가용성 TCR 리폴딩을 위해, α 및 β 쇄-함유 봉입체를 먼저 혼합하고 10ml 가용화/변성 완충액(6M 구아니딘-염산염, 50mM Tris HCl pH 8.1, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 20mM DTT)에 희석시킨 다음, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 1 L의 리폴드 완충액(100mM Tris pH 8.1, 400mM L-아르기닌 HCL, 2mM EDTA, 4 M 우레아, 10mM 시스테아민 염산염 및 2.5mM 시스타민 중염산염)에 추가로 희석시킴으로써 리폴딩을 개시하고 용액을 잘 혼합하였다. 리폴딩된 혼합물을 10L H2O에 대해 5℃ ± 3℃에서 18-20시간 동안 투석하였다. 이 시간 후, 투석 완충액을 10mM Tris pH 8.1(10L)로 두 번 교체하고 또 다른 15시간 동안 투석을 계속하였다. 그 후, 리폴드 혼합물을 0.45μm 셀룰로스 필터를 통해 여과하였다.
가용성 TCR의 정제는, 투석된 리폴드를 POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼 상에 적용하고 결합된 단백질을 Akta® 정제기(GE Healthcare)를 사용하여 50 컬럼 부피에 걸쳐 20mM Tris pH 8.1에서 0-500mM NaCl의 구배로 용출시킴으로써 개시하였다. 피크 TCR 분획을 혼주 및 농축 전에 SDS PAGE에 의해 확인하였다. 그 후, 농축된 샘플을 둘베코 PBS 완충액에서 예비-평형화된 Superdex® 75HR 겔 여과 컬럼(GE Healthcare)에 적용하였다. 피크 TCR 분획을 혼주하고 농축시키며 정제된 물질의 최종 수율을 계산하였다.
실시예 2 - ImmTAC 분자(가용성 TCR -항 CD3 융합 단백질)의 발현, 리폴딩 및 정제
ImmTAC 제조는 TCR 베타 쇄를 링커를 통해 항-CD3 단일 쇄 항체에 융합시키는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 또한 양이온 교환 단계를 음이온 교환 후 정제 동안 실시하였다. 이 경우에 음이온 교환으로부터의 피크 분획을 20mM MES(pH 6.5) 중에서 20배 희석시키고, POROS® 50HS 양이온 교환 컬럼에 적용하였다. 결합된 단백질을 20mM MES 중의 0-500mM NaCl의 구배로 용출시켰다. 피크 ImmTAC 분획을 실시예 1에 기술된 바와 같이 농축시키고 겔 여과 매트릭스에 직접 적용하기 전에 혼주하고 50mM Tris pH 8.1로 되도록 조절하였다.
실시예 3 - 결합 특성화
관련 펩타이드-HLA 복합체에 대한 정제된 가용성 TCR 및 ImmTAC 분자의 결합 분석은 BIAcore 3000 또는 BIAcore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해, 또는 ForteBio Octet 기기를 사용하여 바이오층 간섭법(biolayer interferometry)에 의해 수행하였다. 비오티닐화 클래스 I HLA-A*02 분자를 관심 펩타이드로 리폴딩하고 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 정제하였다(O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433). 모든 측정은 0.005% P20로 보충된 둘베코 PBS 완충액에서 25℃에서 수행하였다.
BIAcore
비오티닐화 펩타이드-HLA 단량체를 스트렙타비딘-결합된 CM-5 센서 칩 상에 고정화시켰다. 평형 결합 상수를 ~200 반응 단위(RU)의 펩타이드-HLA-A*02 복합체로 코팅된 유량 세포 상에 30㎕ 분-1의 일정 유속으로 주사된 가용성 TCR/ImmTAC의 연속 희석물을 사용하여 구하였다. 평형 반응은 무관련 펩타이드-HLA를 함유하는 조절 유량 세포에 대한 벌크 완충액 반응을 공제함으로써 각각의 TCR 농도에 대해 표준화하였다. KD 값은 Prism 소프트웨어 및 Langmuir 결합 등온선을 사용한 비선형 곡선 맞춤에 의해 수득되었으며, 결합도(bound) = C*Max/(C + KD), 여기서 "결합도"는 주사된 TCR 농도 C에서의 RU 단위의 평형 결합이고 Max는 최대 결합이다.
고 친화성 상호작용을 위해, 결합 파라미터를 단일 주기 동력학 분석에 의해 구하였다. 다섯 가지 상이한 농도의 가용성 TCR/ImmTAC를 50-60μl 분-1의 유속을 사용하여 ~100 - 200 RU의 펩타이드-HLA 복합체로 코팅된 유량 세포 상에 주사하였다. 전형적으로, 60-120μl의 가용성 TCR/ImmTAC를 100-200nM의 최고 농도로 주사하였으며, 연속 2배 희석물이 다른 네 번의 주사를 위해 사용되었다. 최저 농도를 먼저 주사하였다. 그 후, 해리 상(dissociation phase)을 측정하기 위해 완충액을 ≥ 10% 해리가 발생할 때까지, 전형적으로 1 - 3시간 후 주사하였다. 동력학적 파라미터를 BIAevaluation® 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 해리 상을 반감기의 계산을 가능케 하는 단일 지수 붕괴 방정식에 맞추었다. 평형 상수 KD를 koff/kon로부터 계산하였다.
Octet
비오티닐화 펩타이드-HLA 단량체를 스트렙타비딘으로 예비-고정화된 (SA) 스트렙타비딘 바이오센서(Pall ForteBio) 상에 1nm로 캡처하였다. 센서를 2분 동안 유리 비오틴(2μM)으로 차단하였다. 평형 결합 상수는 부하된 바이오센서를 96-웰 또는 384-웰 샘플 플레이트에서 연속 희석된 가용성 TCR/ImmTAC에 침지시킴으로써 결정하였다. 플레이트 진탕을 1000rpm으로 설정하였다. 저 친화성 상호작용(μM 범위)의 경우 짧은 결합(~2분) 및 짧은 해리 시간(~2분)이 사용되었다. 결합 곡선은 Octet 데이터 분석 소프트웨어(Pall ForteBio)를 사용하여 무관련 pHLA로 부하된 기준 바이오센서의 이중 기준 공제(double reference subtraction)에 의해 프로세싱하였다. 평형에서의 반응(nm)을 사용하여, 방정식 반응 = Rmax*conc/(KD + conc)에 맞춘 정상 상태 플롯으로부터 KD 값을 추정하였으며, 여기서 "반응"은 각 TCR 농도(conc)에서의 nm 단위의 평형 결합이며 Rmax는 pHLA 포화시 최대 결합 반응이다.
고 친화성 상호작용(nM - pM 범위)의 경우, 동력학적 파라미터는 ≥ 3 TCR/ImmTAC 농도, 전형적으로 10nM, 5nM 및 2.5nM에서 결합 곡선으로부터 결정하였다. 결합 시간은 30분이었고 해리 시간은 1 - 2시간이었다. 결합 곡선은 무관련 pHLA로 부하되고 비오틴으로 차단된 기준 바이오센서의 이중 기준 공제에 의해 프로세싱하였다. 동력학적 파라미터 kon 및 koff는 Octet 데이터 분석 소프트웨어(Pall ForteBio)를 사용하여 결합 곡선에 직접적으로 전역 맞춤(global fitting)함으로써 계산하였다. KD는 koff/kon으로부터 계산하였고 해리 반감기는 t1/2 = 0.693/koff로부터 계산하였다.
실시예 4 - 본 발명의 가용성 비- 돌연변이된 TCR의 결합 특성
가용성 야생형 TCR을 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조하고 pHLA에 대한 결합을 실시예 3에 따라 분석하였다. 알파 및 베타 쇄의 아미노산 서열은 도 2에 나타낸 것에 상응하였다. 가용성 비오티닐화 HLA-A*02를 야생형(SLLMWITQC) 또는 불규칙변화성 NY-ESO-1 펩타이드(SLLMWITQV 서열번호 34) 중 어느 하나로 제조하였으며, BIAcore 센서 칩 상에 고정하였다. KD 값은 각각 5.2μM 및 4.3μM인 것으로 밝혀졌다. 15개의 무관련 펩타이드 HLA-A*02 복합체에 대해 유의적인 결합은 검출되지 않았다.
이러한 데이터는 TCR이 적절한 친화성 및 특이성으로 표적에 결합함을 나타낸다. 따라서, 이러한 TCR 쇄는 본 발명의 추가의 TCR의 확인을 위한 유용한 스캐폴드를 제공한다.
실시예 5 - 본 발명의 가용성 고 친화성 TCR 및 ImmTAC 분자의 결합 특성화
가용성 돌연변이된 TCR 및 ImmTAC 분자는 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 제조하였으며, 결합 특성은 실시예 3에 따라 결정하였다. TCR 알파 및 또는 베타 쇄는 도 2에 나타낸 CDR 서열 (서열번호 41 내지 46)에 비해 적어도 하나의 CDR 영역에 돌연변이를 함유하였다. 본 발명의 특정 돌연변이된 TCR 알파 및 베타 쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 도 4 및 5에 제공되어 있다. 아래 표는 나타낸 알파 및 베타 가변 영역을 포함하는 가용성 TCR 및/또는 ImmTAC 분자에 대한 결합 특성을 제공한다. 결합은 불규칙변화성 NY-ESO-1 펩타이드(SLLMWITQV)를 사용하여 측정하였다.
Figure pct00027
nd = 측정 불가
1 실시예 6으로부터의 ImmTAC1에 상응함, 전체 알파 및 베타 쇄 서열은 도 5에 제공되어 있음
2 실시예 6으로부터의 ImmTAC2에 상응함, 전체 알파 및 베타 쇄 서열은 도 6에 제공되어 있음
3 실시예 6으로부터의 ImmTAC3에 상응함, 전체 알파 및 베타 쇄 서열은 도 7에 제공되어 있음
4 실시예 6으로부터의 ImmTAC4에 상응함, 전체 알파 및 베타 쇄 서열은 도 8에 제공되어 있음
이들 데이터는 본 발명의 TCR 알파 및 베타 쇄 서열이 면역치료 시약의 개발에 적합한 결합 특성을 갖는 가용성 TCR 및 ImmTAC 분자를 생산함을 입증한다.
실시예 6 - 본 발명의 ImmTAC 분자에 의한 강력하고 특이적인 T 세포 재지시
본 발명의 알파 및 베타 가변 쇄 서열을 함유하는 ImmTAC 분자를 T 세포 활성화에 대한 판독치로서 인터페론-γ(IFN-γ) 분비를 사용하여 ELISPOT 검정에 의해 CD3+ T 세포의 강력하고 특이적인 재지시를 매개하는 능력에 대해 시험하였다.
시험된 네 개의 ImmTAC 분자의 알파 및 베타 쇄의 서열이 도 5-8에 제공되어 있다.
검정은 인간 IFN-γ ELISPOT 키트(BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다. 표적 세포를 검정 배지(10% 열 불활성화된 FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640)에서 1x106/ml의 밀도로 제조하고 50μl의 용적으로 웰당 50,000개 세포를 플레이팅하였다. 다음의 표적 세포주가 당해 실시예에서 사용되었다:
· NCI-H1755 (NY-ESO-1+ ve; HLA-A*02+ ve) 인간 폐암 세포주(ATCC에 의해 공급됨, cat. no: CRL-5892)
· HAo5 (NY-ESO-1- ve; HLA-A*02+ ve) 인간 심장 세포(Promocell에 의해 공급됨, cat. no: C-12271)
신선한 기증자 혈액으로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 효과기 세포로서 사용하고 50μl의 용적으로 웰당 40,000개 세포의 농도로 플레이팅하였다. 예상되는 임상적으로 관련된 범위에 걸쳐 다양한 농도의 ImmTAC를 사용하였으며, 50μl의 용적으로 웰에 첨가하였다.
플레이트를 제조자의 지침에 따라 제조하였다. 표적 세포, 효과기 세포 및 ImmTAC 분자를 관련 웰에 첨가하고 검정 배지로 200μl의 최종 용적으로 되게 하였다. 모든 반응은 삼중으로 수행하였다. ImmTAC, 효과기 세포, 또는 표적 세포 중 어느 것을 생략한 대조 웰을 또한 제조하였다. 그 후, 플레이트를 밤새 배양하였다(37℃/5% CO2). 다음날 플레이트를 세척 완충액(1xPBS sachet, 0.05% P20 함유, 탈이온수로 구성됨)으로 3회 세척하였다. 그 후, 일차 검출 항체를 50μl의 용적으로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 다시 3회 세척하기 전에 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이차 검출은 50μl의 희석된 스트렙타비딘-HRP를 각 웰에 가하여 실온에서 1시간 동안 배양함으로써 수행하였으며 세척 단계를 반복하였다. 그 후, 플레이트를 200μl PBS(pH 7.4)로 2회 세척하였다. 사용하기 최대 15분 전에, 한 방울(20μl)의 AEC 색원체를 각 1ml의 AEC 기질에 첨가하여 혼합하고 50μl를 각 웰에 첨가하였다. 반점 전개(spot development)를 정기적으로 모니터링하였으며 플레이트를 수돗물에서 세척하여 전개 반응을 종료하였다. 그 후, 플레이트를 Immunospot 소프트웨어를 갖는 CTL 분석기(Cellular Technology Limited)를 사용하여 반점을 계수하기 전에 적어도 2시간 동안 실온에서 건조되도록 하였다.
도 9에 나타낸 데이터는 본 발명의 알파 및 베타 가변 쇄 서열을 함유하는 ImmTAC 분자가 표적 항원을 발현하는 HLA-A*02+ ve 암세포에 대해 강력한 T 세포 재지시를 매개할 수 있음을 보여준다. HLA-A*02+ ve 항원 음성 세포에 대해서는 활성이 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 ImmTAC 분자가 임상적으로 관련된 농도 범위(≤ 1nM) 내에서 표적 세포 특이적임을 나타낸다.
효능의 추가의 평가를 ImmTAC 분자 3 및 4에 대해 실시하여 EC50 값을 구하였다. ELISpot 검정은 10-13M 내지 10-8M 범위의 ImmTAC 농도로 위에 기술된 바와 같이 수행하였다. 데이터를 Prism 5.0 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 분석하여 EC50 값을 계산하였다. 값은 ImmTAC 분자 3 및 4에 대해 각각 95pM 및 121pM로 밝혀졌다(도 10). 이러한 데이터는 이들 ImmTAC 분자가 강력한 재지시된 T 세포 반응을 매개하는 능력을 확인시켜 준다.
실시예 7 - 본 발명의 ImmTAC 분자의 추가의 특이성 시험
ImmTAC 분자의 추가의 특이성 시험을 정상 세포의 패널에 대해 실시하였다. ImmTAC 분자 2-4(도 6-8)가 당해 실시예에서 사용된다. 인터페론-γ(IFN-γ) 분비가 T 세포 활성화에 대한 판독치로서 사용되었다.
검정은 IFN-γ DuoSet ELISA 키트(R&D Systems, Cat No: DY285)를 사용하여 수행하였으며 제조자에 의해 지시된 바와 같이 수행하였다. 간략히, IFN-γ를 10,000pg/ml로 되도록 희석시키고 2배 희석물을 만들어 표준 곡선을 생성하였다. 표적 세포를 계수하고 검정 배지에서 10ul에 웰당 10,000개 세포로 플레이팅하였다. ImmTAC 분자를 희석시켜 웰 당 10ul에 2nM 및 1nM의 최종 농도를 제공하였다. ImmTAC가 없는 대조 샘플을 또한 제조하였다. 효과기 PBMC를 해동시키고 10ul에 10,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 플레이트를 전개 및 판독하기 전에 48시간 동안 배양하였다.
당해 실시예에서, NCI-H1755 세포가 항원 양성 대조군으로서 사용되었고 HTC-116 세포가 항원 음성 대조군으로서 사용되었다. 세포 패널은 심근세포(CM12, CM5 및 CM10), 대동맥 내피 세포(HAo5), 기도 상피 세포(HCAEC2 및 HCAEC5) 골격근 근모세포(HSkMM3) 및 HPF9 세포를 포함하였다. 모든 세포주는 HLA-A*02+ ve이었다. 검정은 삼중으로 수행하였다.
도 11에 나타낸 데이터는 치료학적으로 관련된 ImmTAC 농도 범위 내에서, 항원 양성 암 세포주에 비해 정상 조직으로부터 유도된 세포주의 존재하에서의 최소 IFN-γ 생산을 입증한다. 이러한 데이터는 본 발명의 ImmTAC 분자가 높은 수준의 특이성을 가지며 따라서 치료 용도에 특히 적합함을 나타낸다.
실시예 8 - ImmTAC 재지시된 T 세포에 의한 종양 세포의 강력한 사멸
본 발명의 ImmTAC 분자가 항원 양성 종양 세포의 강력한 재지시된 T 세포 사멸을 매개하는 능력을 IncuCyte 플랫폼(Essen BioScience)을 사용하여 조사하였다. 이 검정은 아폽토시스의 마커인 카스파제-3/7의 방출의 현미경 검사에 의해 실시간 검출을 가능하게 한다.
검정은 CellPlayer 96-웰 카스파제-3/7 아폽토시스 검정 키트(Essen BioScience, Cat. No.4440)를 사용하여 수행하였으며 제조자 프로토콜에 따라 실시하였다. 간략하게, 표적 세포(NCI-H1755 - NYESO+ ve HLA A*02+ ve 또는 HCT-116 - NYESO-ve HLA A*02+ ve)를 웰당 5000개 세포로 플레이팅하고 밤새 배양하여 이들이 부착되게 하였다. ImmTAC 용액을 2.16nM 내지 8.8pM의 농도로 제조하였다. 각 농도의 25ul를 관련 웰에 가하였다. PBMC를 효과기 세포로서 사용하여 50ul에 웰당 50,000개로 플레이팅하였다. ImmTAC가 없는 대조 샘플을 또한 제조하였다. NucView 검정 시약을 30uM로 구성하고 25ul를 모든 웰에 첨가하였다(5uM 최종 농도를 제공함). 플레이트를 IncuCyte 기기에 배치하고 영상을 3일에 걸쳐 매 2시간마다(웰당 1개의 영상) 촬영하였다. 각 영상에서의 아폽토시스성 세포의 수를 구하고 mm2 당 대상(object)의 수로서 기록하였다. 검정은 삼중으로 수행하였다.
도 12에 나타낸 데이터는 ImmTAC 재지시된 T 세포에 의한 종양 세포의 실시간 사멸을 보여준다. 결과는 ImmTAC3 및 ImmTAC4에 대해 나타내어져 있다. ImmTAC 분자 둘 다는 26pM 정도로 낮은 농도에서 항원 양성 종양 세포의 T 세포 재지시된 사멸을 보여준다. ImmTAC3은 10pM 미만의 T 세포 재지시된 사멸을 보여준다. 항원 음성 세포의 낮은 수준 사멸은 단지 최고 농도(2.16nM)에서 관찰된다.
이러한 데이터는 ImmTAC3 및 immTAC4가 치료학적으로 관련된 농도 범위 내에서 항원 양성 종양 세포의 강력한 재지시된 T 세포 사멸을 매개함을 확인시켜 준다.
SEQUENCE LISTING <110> Immunocore Limited <120> T cell receptors <130> P100579WO <150> 1522592.3 <151> 2015-12-22 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys 1 5 <210> 2 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly 1 5 10 15 Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu 35 40 45 Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu 50 55 60 Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser 65 70 75 80 Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile 85 90 95 Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys 100 105 110 Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 115 120 125 Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 130 135 140 Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser 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Leu 130 135 140 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 145 150 155 160 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln 165 170 175 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser 180 185 190 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His 195 200 205 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 210 215 220 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 225 230 235 240 Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 4 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly 1 5 10 15 Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu 35 40 45 Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu 50 55 60 Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser 65 70 75 80 Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile 85 90 95 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Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 100 105 110 Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 115 120 125 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 130 135 140 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 145 150 155 160 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln 165 170 175 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser 180 185 190 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His 195 200 205 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 210 215 220 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 225 230 235 240 Trp Gly Arg Ala Asp 245 <210> 6 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant alpha chain (a12) <400> 6 Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly 1 5 10 15 Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro 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comprising SEQ ID NO: 18(b65) and the constant domain of SEQ ID NO: 5) <400> 40 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn 180 185 190 Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe 225 230 235 240 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln 260 265 270 Arg Gly Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Lys Arg Leu Ala 275 280 285 Leu Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile 290 295 300 Ala Thr Ala Trp Thr Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val 305 310 315 320 Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu 325 330 335 Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser 340 345 350 Val Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr 355 360 365 Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val 370 375 380 Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala 385 390 395 400 Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu 405 410 415 Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp 420 425 430 Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala 435 440 445 Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg 450 455 460 Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp 465 470 475 480 Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala 485 490 495 Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp 500 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Val Ser Gly Asn Pro Tyr 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val 1 5 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Cys Ala Val Arg Asp Ile Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr 1 5 10 15 Phe <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ser Gln Val Thr Met 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ala Asn Gln Gly Ser Glu Ala 1 5 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Cys Ser Val Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Thr Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu 1 5 10 15 Lys <210> 48 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser 1 5 10 15 Phe His Leu Lys Lys Pro Ser Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr 20 25 30 Phe <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Ile Ala 1 5 10 15 Thr <210> 50 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro 1 5 10 15 Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp 20 25 30 Ser Ser Ile Tyr Leu 35 <210> 51 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant alpha chain (a86) <400> 51 Ala Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala Glu Gly 1 5 10 15 Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn Pro Tyr 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu 35 40 45 Lys Tyr Leu Thr Asp Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly Phe Glu 50 55 60 Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys Pro Ser 65 70 75 80 Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg Asp Ile 85 90 95 Asn Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys 100 105 110 Leu Ser Val Ile Pro 115 <210> 52 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant beta chain (b71) <400> 52 Ser Ala Val Ile Ser Gln Lys Pro Ser Arg Asp Ile Lys Gln Arg Gly 1 5 10 15 Thr Ser Leu Thr Ile Gln Cys Gln Val Asp Ser Gln Val Ala Met Met 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Ile Ala Thr 35 40 45 Ala Trp Gln Gly Ser Glu Ala Thr Tyr Glu Ser Gly Phe Val Ile Asp 50 55 60 Lys Phe Pro Ile Ser Arg Pro Asn Leu Thr Phe Ser Thr Leu Thr Val 65 70 75 80 Ser Asn Met Ser Pro Glu Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Cys Ser Val Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 100 105 110 Thr Val Leu 115

Claims (46)

  1. SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하는 특성을 가지며 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하고,
    알파 쇄 가변 도메인이 서열번호 2의 아미노산 1-117과 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나,
    베타 쇄 가변 도메인이 서열번호 3의 아미노산 1-115와 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 T 세포 수용체(TCR).
  2. 50μM 초과의 친화도로 SLLMWITQC (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하며, 여기서: 알파 쇄 CDR 1, 2 및 3은 각각 서열번호 41, 42 및 43을 포함하고/하거나, 베타 쇄 CDR 1, 2 및 3은 각각 서열번호 44, 45 및 46을 포함하고/하거나; CDR 중의 적어도 하나는 서열번호 41 내지 46에 대해 하나 이상의 보존적 치환을 함유하고/하거나; CDR 중의 적어도 하나는 서열번호 41 내지 46에 대해 세 개 이하의 관용 치환을 함유하는, TCR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 갖고/갖거나:
    Figure pct00028

    상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열번호 3의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 갖는, TCR:
    Figure pct00029
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 2 내지 6개를 갖고/갖거나:
    Figure pct00030

    상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열번호 3을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 3 내지 9개를 갖는, TCR:
    Figure pct00031
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 다음의 돌연변이 그룹 중의 적어도 하나를 갖고/갖거나
    그룹 1: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A
    그룹 2: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97D
    그룹 3: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97R
    그룹 4: I96S, N97D, S98Q, G99H
    그룹 5: D95S, I96S, N97R, S98Q, G99H
    그룹 6: I51L, G53D
    상기 베타 쇄 가변 도메인이 다음의 돌연변이 그룹 중의 적어도 하나를 갖는, TCR:
    그룹 1: N50W, Q51T, S53G
    그룹 2: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G
    그룹 3: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G, G100A
    그룹 4: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T
    그룹 5: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G
    그룹 6: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G, G100A.
    그룹 7: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T
    그룹 8: T30A, N50W, G100A
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인 및 베타 쇄 가변 도메인이 각각 다음의 돌연변이 그룹을 갖는, TCR:
    Figure pct00032
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열번호 2의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 갖고/갖거나:
    Figure pct00033

    상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열번호 3의 넘버링을 참고로 하여 다음의 돌연변이 중의 적어도 하나를 갖는, TCR:
    Figure pct00034
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인에서 아미노산 잔기 27 - 32, 50 - 57 및 91 - 107의 서열이 다음으로부터 선택되는, TCR:
    Figure pct00035
  9. 제8항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열번호 12와 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, TCR.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 베타 쇄 가변 도메인에서 아미노산 잔기 27 - 31, 49 - 55 및 93 - 106의 서열이 다음으로부터 선택되는, TCR:
    Figure pct00036
  11. 제10항에 있어서,
    상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열번호 15와 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, TCR.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 잔기 27-32, 50-57 및 91-107의 알파 쇄 가변 도메인 서열 및 상기 아미노산 잔기 27-31, 49-55 및 93-106의 베타 쇄 가변 도메인 서열이 다음으로부터 선택되는, TCR:
    Figure pct00037
  13. 제12항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열번호 12와 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열번호 15와 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, TCR.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열번호 6-12 또는 51의 아미노산 서열로부터 선택되고 상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열번호 13-23 또는 52의 아미노산 서열로부터 선택되는, TCR.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파 쇄 가변 도메인 및 베타 쇄 가변 도메인이 다음의 아미노산 서열로부터 선택되는, TCR:
    Figure pct00038
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR은 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 갖는 알파-베타 이형이량체인, TCR.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 알파 쇄 및 베타 쇄 불변 도메인 서열이 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 간의 네이티브 디설파이드 결합을 결실시키는 절단 또는 치환에 의해 변형되는, TCR.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)이 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57을 시스테인 잔기로 치환함으로써 변형되고, 상기 시스테인이 TCR의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에 비-네이티브 디설파이드 결합을 형성하는, TCR.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR은 타입 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ의 단일 쇄 포맷(여기서, Vα 및 Vβ는 각각 TCR α 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCR α 및 β 불변 영역이며, L은 링커 서열이다)인, TCR.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR은 검출 가능한 표지, 치료제 또는 PK 변형 모이어티와 결합되는, TCR.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR 및 TCR의 알파 또는 베타 쇄의 C- 또는 N-말단에 공유 결합된 항-CD3 항체를 포함하는, TCR 항-CD3 융합체.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 TCR 항-CD3 융합체는 서열번호 6-12 또는 51로부터 선택되는 알파 쇄 가변 도메인을 포함하고 서열번호 13-23 또는 52로부터 선택되는 베타 쇄 가변 도메인을 포함하는, TCR 항-CD3 융합체.
  23. 제22항에 있어서,
    베타 쇄가 링커 서열을 통해 항-CD3 항체 서열에 결합되는, TCR 항-CD3 융합체.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 링커 서열이 GGGGS (서열번호 24), GGGSG (서열번호 25), GGSGG (서열번호 26), GSGGG (서열번호 27), GSGGGP (서열번호 28), GGEPS (서열번호 29), GGEGGGP (서열번호 30), 및 GGEGGGSEGGGS (서열번호 31)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, TCR 항-CD3 융합체.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 TCR 항-CD3 융합체는 아래 표에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성, 예를 들어 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 알파 및 베타 쇄를 포함하는, TCR 항-CD3 융합체:
    Figure pct00039
  26. 제25항에 있어서,
    상기 TCR 항-CD3 융합체는 서열번호 37로 이루어진 알파 쇄 및 서열번호 38로 이루어진 베타 쇄를 포함하는, TCR 항-CD3 융합체.
  27. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR 항-CD3 융합체는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 알파 쇄 가변 도메인 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 베타 쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 베타 쇄가 상기 링커 서열을 통해 항-CD3 항체에 결합되는, TCR 항-CD3 융합체.
  28. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR 항-CD3 융합체는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 알파 쇄 가변 도메인 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 베타 쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 알파 쇄가 상기 링커 서열을 통해 항-CD3 항체에 결합되는, TCR 항-CD3 융합체.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고 상기 베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지며, 여기서 상기 베타 쇄가 서열번호 24의 링커 서열을 통해 항-CD3 항체에 결합되는, TCR 항-CD3 융합체.
  30. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR 또는 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체를 암호화하는 핵산.
  31. 제30항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  32. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR 또는 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체를 제시하는 비-자연 발생적 및/또는 정제된 및/또는 조작된 세포.
  33. (a) 단일 개방형 해독틀, 또는 두 개의 별개의 개방형 해독틀에서 각각 알파 쇄 및 베타 쇄를 암호화하는 제31항의 TCR 발현 벡터; 또는
    (b) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR 또는 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체의 알파 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR 또는 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체의 베타 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터;
    를 포함하는 세포.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    상기 세포는 T-세포인, 세포.
  35. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR 또는 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체, 제30항의 핵산 또는 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포를, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 인간 대상체에서 약제에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR 또는 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체, 제30항의 핵산 또는 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포.
  37. 제35항에 따르는 약제학적 조성물의 약제학적 유효량을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함하여, 이를 필요로 하는 인간 대상체를 치료하는 방법.
  38. 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR, 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체, 제30항의 핵산, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제35항의 약제학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 인간 대상체가 NY-ESO-1 및/또는 LAGE-1A를 발현하는 종양을 갖는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR, 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체, 제30항의 핵산, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제35항의 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 종양이 고형 종양인, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR, 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체, 제30항의 핵산, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제35항의 약제학적 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서,
    상기 종양이 활막 육종, 비 소세포 폐 암종(NSCLC), 방광 종양, 위 종양, 전립선 종양, 결장 종양, 유방 종양, 난소 종양, 식도 종양, 흑색종, 다발성 골수종, 간세포 암종 및 두경부 종양으로부터 선택되는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR, 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체, 제30항의 핵산, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제35항의 약제학적 조성물.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 대상체가 HLA-A*02 아형의 대상체인, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR, 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체, 제30항의 핵산, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제35항의 약제학적 조성물.
  43. 제37항에 있어서,
    상기 방법은 항-신생물제를 별도로, 조합하여 또는 연속적으로 투여함을 추가로 포함하여 인간 대상체를 치료하는, 방법.
  44. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR, 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체, 제30항의 핵산, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제35항의 약제학적 조성물을 포함하는 인간 대상체에 투여하기 위한 주사 가능한 제형.
  45. 제36항 및 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR, TCR 항-CD3 융합체, 핵산, 세포 또는 약제학적 조성물이 정맥내 또는 직접 종양내 주사와 같은 주사에 의해 투여되는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR, 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체, 제30항의 핵산, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 세포, 또는 제35항의 약제학적 조성물.
  46. a) 숙주인 제33항의 세포를 핵산의 발현을 위해 최적인 조건하에서 유지시키는 단계; 및
    b) 핵산에 의해 암호화된 TCR 또는 TCR 항-CD3 융합체를 단리하는 단계;
    를 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 TCR 또는 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항의 TCR 항-CD3 융합체를 제조하는 방법.
KR1020187020682A 2015-12-22 2016-12-22 Ny-eso-1 종양 항원-hla-a*02 복합체에 특이적인 t 세포 수용체 KR20180090374A (ko)

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