ES2923026T3 - Receptores de células T específicos para el complejo antígeno tumoral NY-ESO-1-HLA-A*02 - Google Patents

Receptores de células T específicos para el complejo antígeno tumoral NY-ESO-1-HLA-A*02 Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a receptores de células T (TCR) que se unen al péptido SLLMWITQC restringido por HLA-A*02 derivado del antígeno canceroso NY-ESO-1. Dichos TCR pueden comprender mutaciones dentro de los dominios variables alfa y/o beta en relación con un TCR NY-ESO-1 nativo. Los TCR de la invención son particularmente adecuados para su uso como nuevos reactivos inmunoterapéuticos para el tratamiento de enfermedades malignas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de células T específicos para el complejo antígeno tumoral NY-ESO-1-HLA-A*02
La presente invención se refiere a los receptores de células T (TCR) que se unen al péptido restringido HLA-A*02 SLLMWITQC derivado del antígeno del cáncer NY-ESO-1. Dichos TCRs pueden comprender mutaciones dentro de los dominios variables alfa y/o beta en relación con un TCR nativo de NY-ESO-1. Los TCR de la invención son particularmente adecuados para su uso como novedosos reactivos inmunoterapéuticos para el tratamiento de enfermedades malignas.
Antecedentes de la invención
Los receptores de células T (TCR) son expresados naturalmente por las células T CD4+ y CD8+. Los TCR están diseñados para reconocer antígenos peptídicos cortos que se muestran en la superficie de las células presentadoras de antígenos en complejo con las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) (en los seres humanos, las moléculas MHC también se conocen como antígenos leucocitarios humanos o HLA) (Davis, et al., (1998), Annu Rev Immunol 16: 523-544.). Las células T CD8+, que también se denominan células T citotóxicas, reconocen específicamente los péptidos unidos al CMH de clase I y, por lo general, son responsables por encontrar y mediar en la destrucción de las células infectadas o cancerosas.
NY-ESO-1 pertenece a la familia de antígenos cancerígenos codificados en la línea germinal (Chen, et al., (1997), Cytogenet Cell Genet 79(3-4): 237-240: WO9814464) y tiene el número de acceso Uniprot P78358. Se ha encontrado que estos antígenos de la línea germinal se expresan con frecuencia en diversos tipos de cáncer, mientras que su expresión en los tejidos normales se limita a los testículos de los adultos y a otros lugares inmunológicamente privilegiados. La naturaleza específica del cáncer de estos antígenos los convierte en objetivos ideales para las terapias anticancerígenas. La función precisa de NY-ESO-1 sigue siendo desconocida, pero se ha informado de su expresión en testículos fetales y adultos (Satie, et al., (2002), Lab Invest 82(6): 775-780), el ovario y el miometrio uterino, así como en una amplia variedad de cánceres, incluido el mieloma (Andrade, et al., (2008), Cancer Immun 8: 2), cáncer de ovario (Odunsi, et al., (2003), Cancer Res 63(18): 6076-6083), cáncer de pulmón de células no pequeñas (Konishi, et al., (2004), Oncol Rep 11(5): 1063-1067) y el melanoma (Barrow, et al., (2006), Clin Cancer Res 12(3 Pt 1): 764-771). El péptido 9-mer s Ll m W iTQC (SEQ iD NO 1) corresponde a los aminoácidos 157- 165 de la proteína NY-ESO-1 de longitud completa. El mismo péptido se encuentra también en el LAGE-1A (Acc. No. O75638-2), un antígeno alternativo del cáncer (Lethe, et al., (1998), Int J Cancer 76(6): 903-908). Este péptido se une al HLA-A*02 y el complejo péptido-HLA es capaz de estimular las células T citotóxicas que conducen a la lisis de las células tumorales NY-ESO-1+, HLA-A*02+ (Duffour, et al., (1999), Eur J Immunol 29(10): 3329-3337 y WO2000020445). Por lo tanto, el complejo HLA-A*02 SLLMWITQC constituye un antígeno diana útil para la intervención inmunoterapéutica.
La identificación de secuencias particulares de TCR que se unen al complejo HLA-A*02 SLLMWITQC es ventajosa para el desarrollo de novedosas inmunoterapias. Dichos TCR terapéuticos pueden utilizarse, por ejemplo, como agentes de orientación solubles con el fin de suministrar agentes citotóxicos o efectores inmunitarios al tumor (Lissin, et al., (2013). "High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions. Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges". S. R. Schmidt, Wiley Boulter, et al., (2003), Protein Eng 16(9): 707­ 711 Liddy, et al., (2012), Nat Med 8: 980-987), o bien pueden utilizarse para diseñar células T para la terapia adoptiva (June, et al., (2014), Cancer Immunol Immunother 63(9): 969-975). Es deseable que los TCRs para uso inmunoterapéutico sean capaces de reconocer fuertemente el antígeno diana, lo que significa que el TCR debe poseer una alta afinidad y/o una larga semivida de unión al antígeno diana para ejercer una respuesta potente. Los TCRs, tal y como existen en la naturaleza, suelen tener una baja afinidad por el antígeno diana (intervalo micromolar bajo), por lo que a menudo es necesario identificar mutaciones, incluyendo pero no limitándose a sustituciones, inserciones y/o supresiones, que pueden realizarse en una secuencia de TCR dada para mejorar la unión al antígeno. Para su uso como agentes de focalización solubles son preferibles las afinidades de unión al antígeno del TCR en el intervalo nanomolar a picomolar y con semividas de unión de varias horas. También es deseable que los TCR terapéuticos demuestren un alto nivel de especificidad para el antígeno diana para mitigar el riesgo de toxicidad en las aplicaciones clínicas resultante de la unión fuera del objetivo. Esta alta especificidad puede ser especialmente difícil de obtener dada la degeneración natural del reconocimiento del antígeno del TCR (Wooldridge, et al., (2012), J Biol Chem 287(2): 1168-1177 Wilson, et al., (2004), Mol Immunol 40(14-15): 1047-1055). Por último, es deseable que los TCR terapéuticos puedan expresarse y purificarse en una forma altamente estable.
Las secuencias del TCR definidas en el presente documento se describen con referencia a la nomenclatura IMGT, que es ampliamente conocida y accesible para quienes trabajan en el campo del TCR. Por ejemplo, véase: LeFranc y LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603 Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Apéndice 1O; y Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266. Los TCRs ap consisten en dos cadenas unidas por disulfuro. Por lo general, se considera que cada cadena (alfa y beta) tiene dos dominios, a saber, uno variable y otro constante. Una corta región de unión conecta los dominios variable y constante y se considera normalmente parte de la región variable. Además, la cadena beta suele contener una corta región de diversidad entre las regiones variable y de unión.
El dominio variable de cada cadena está situado N-terminalmente y comprende tres Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDRs) embebidas en una secuencia marco. Las CDR constituyen el sitio de reconocimiento para la unión del péptido al CMH. Hay varios genes que codifican las regiones variables de la cadena alfa (Va) y varios genes que codifican las regiones variables de la cadena beta (Vp). Estos genes se distinguen por su marco, las secuencias CDR1 y CDR2, y por una secuencia CDR3 parcialmente definida. Los genes Va y Vp se denominan en la nomenclatura del IMGT con los prefijos "TRAV" y 'TRBV" respectivamente (Folch y Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54 Scaviner y Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc y LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Asimismo, existen varios genes de unión o J, denominados "TRAJ" o "TRBJ", para la cadena alfa y beta respectivamente, y para la cadena beta, un gen de diversidad o D denominado "TRBD" (Folch y Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114 Scaviner y Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106 LeFranc y LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). La enorme diversidad de las secuencias de las regiones variables alfa y beta es el resultado de los reordenamientos combinatorios entre los distintos genes V, J y D, que incluyen variantes alélicas, y de la diversidad adicional de las uniones (Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961 Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107.) Las regiones constantes, o C, de las cadenas TCR alfa y beta se denominan "TRAC" y "TRBC" respectivamente (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Apéndice 1O).
En la presente especificación y reivindicaciones, el término "dominio variable del TCR alfa (o a)" se refiere a la concatenación de las regiones TRAV y TRAJ; una región TRAV solamente; o TRAV y una región TRAJ parcial, y el término dominio constante del TCR alfa (o a) se refiere a la región TRAC extracelular, o a una secuencia TRAC truncada o de longitud completa C-terminal. Asimismo, el término "dominio variable del TCR beta (o p)" puede referirse a la concatenación de las regiones TRBV y TRBD/TRBJ; a las regiones TRBV y TRBD solamente; a las regiones TRBV y TRBJ solamente; o a las regiones TRBV y TRBD y/o TRBJ parciales, y el término dominio constante del TCR beta (o p) se refiere a la región TRBC extracelular, o a una secuencia TRBC C-terminal truncada o de longitud completa.
Los TCRs que se dirigen a NY-ESO-1 han sido reportados previamente (WO05113595 WO08039818 McCormack, et al., (2013), Cancer Immunol Immunother 62(4): 773-785).
Los inventores han identificado secuencias alternativas del dominio variable del TCR alfa y beta que se unen al complejo NY-ESO-1 HLA-A*02. Dichas secuencias son particularmente adecuadas para su uso como TCRs terapéuticos para la inmunoterapia dirigida de cánceres que presentan el complejo HLA-A*02 SLLMWITQC.
Los inventores han identificado un TCR nativo que comprende el siguiente uso de cadena:
Cadena alfa: TRAV3*01/TRAJ28*01
Cadena beta: TRBV29-1*01/TRBD2*01/TRBJ2-3*01
(Nota, el término "*01" indica la variante alélica para esta secuencia, tal como se designa en la nomenclatura IMGT)
Este TCR nativo se utilizó como plantilla a partir de la cual se derivaron las secuencias mutadas de la invención.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona como primer aspecto un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse específicamente al complejo HLA-A*02 SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) y que comprende un dominio variable de la cadena alfa del TCR y un dominio variable de la cadena beta del TCR, en el que el dominio variable de la cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad, como por ejemplo un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 12, el dominio variable de la cadena beta comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad, como por ejemplo un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 15, y la secuencia del dominio variable de la cadena alfa de los residuos de aminoácidos 27-32 (CDR1), 50-57 (CDR2) y 91-107 (CDR3) y la secuencia del dominio variable de la cadena beta de los residuos de aminoácidos 27­ 31 (CDR1), 49-55 (CDR2) y 93-106 (CDR3) se seleccionan de entre las siguientes:
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El TCR puede unirse a un complejo HLA-A*02 SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) con una afinidad superior a 50 j M, tal como 50uM a 1 pM.
El dominio variable de la cadena alfa y el dominio variable de la cadena beta pueden seleccionarse entre las secuencias de aminoácidos de:
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El TCR de la invención puede ser un heterodímero alfa-beta, que tiene una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta.
Las secuencias de dominio constante de cadena alfa y beta pueden modificarse por truncamiento o sustitución para eliminar el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2 y/o la(s) secuencia(s) de dominio constante de cadena alfa y/o beta puede(n) modificarse por sustitución de residuos de cisteína para Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro no nativo entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.
El TCR de la invención puede estar en formato de cadena simple del tipo Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp, en el que Va y Vp son regiones variables del TCR a y p respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes del TCR a y p respectivamente, y L es una secuencia enlazadora.
El TCR de la invención puede asociarse con una etiqueta detectable, un agente terapéutico o una fracción modificadora de la PK.
La invención también proporciona una fusión TCR anti-CD3 que comprende el TCR de la invención y un anticuerpo anti-CD3 unido covalentemente al C- o N-terminal de la cadena alfa o beta del TCR y dicha fusión TCR anti-CD3 puede comprender un dominio variable de la cadena alfa seleccionado de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-12, o 51 y un dominio variable de cadena beta seleccionado entre cualquiera de las SEQ ID NO: 13-23, o 52. La cadena beta puede estar unida a la secuencia del anticuerpo anti-CD3 a través de una secuencia enlazadora; la secuencia enlazadora puede seleccionarse del grupo que consiste en GGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGSG (SEQ ID NO: 25), GGSGG (SEQ ID NO: 26), GSGGG (SEQ ID NO: 27), GSGGGP (SEQ ID NO: 28), GGEPS (SEQ ID NO: 29), GGEGGGP (SEQ ID NO: 30), y GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 31).
La fusión TCR anti-CD3 de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos de cadena alfa y un emparejamiento de secuencias de aminoácidos de cadena beta que tengan al menos un 90 % de identidad, tal como 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, con los emparejamientos de secuencias de aminoácidos que se indican en la tabla siguiente.
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La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica un TCR o la fusión TCR anti-CD3 de la invención.
También se proporciona una célula no natural y/o purificada y/o de ingeniería que presenta un TCR o una fusión TCR anti-CD3 de la invención, una célula que alberga (a) un vector de expresión de TCR que comprende ácido nucleico de la invención en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos que codifican la cadena alfa y la cadena beta respectivamente; o (b) un primer vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR o fusión TCR anti-CD3 de la invención, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR o fusión TCR anti-CD3 de la invención.
La célula que presenta el TCR o la fusión TCR anti-CD3 o la célula que alberga el/los vector/es de expresión puede ser una célula T.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una fusión TCR o TCR anti-CD3 de la invención o una célula de la invención, junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
También se proporciona el TCR, la fusión TCR anti-CD3 o un ácido nucleico o una célula de la invención para su uso en medicina. El TCR, la fusión TCR anti-CD3, la célula o el ácido nucleico pueden ser para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer en un sujeto humano.
El sujeto humano puede tener un tumor que exprese NY-ESO-1 y/o LAGE-1A y el tumor puede ser un tumor sólido y seleccionarse entre un sarcoma sinovial, un carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), un tumor de vejiga, un tumor gástrico, un tumor de próstata, un tumor colorrectal, un tumor de mama, un tumor de ovario, un tumor de esófago, un melanoma, un mieloma múltiple, un carcinoma hepatocelular y un tumor de cabeza y cuello. El sujeto humano puede ser un sujeto del subtipo HLA-A*02. La invención también proporciona una formulación inyectable adecuada para administrar a un sujeto humano que comprende el TCR, la fusión TCR anti-CD3, el ácido nucleico, la célula o la composición farmacéutica de la invención y dicha formulación inyectable para su uso en medicina, y puede administrarse por inyección, como la inyección intravenosa o intratumoral directa.
Se proporciona además un procedimiento para producir el TCR o la fusión TCR anti-CD3 de la invención, que comprende a) mantener una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20 en condiciones óptimas para la expresión del ácido nucleico y b) aislar el TCR o la fusión TCR anti-CD3 codificada por el ácido nucleico.
Finalmente, se proporciona el TCR, la fusión TCR anti-CD3, el ácido nucleico o la célula de la invención para su uso de acuerdo con la invención en combinación con un agente antineoplásico.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto la invención proporciona
Un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse específicamente un complejo HLA-A*02 SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) y que comprende un dominio variable de la cadena alfa del TCR y un dominio variable de la cadena beta del TCR, en el que el dominio variable de la cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad, como por ejemplo un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 12, el dominio variable de la cadena beta comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad, tal como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, con la SEQ ID NO: 15, y la secuencia del dominio variable de la cadena alfa de los residuos de aminoácidos 27-32 (CDR1), 50-57 (CDR2) y 91-107 (CDR3) y la secuencia del dominio variable de la cadena beta de los residuos de aminoácidos 27-31 (CDR1), 49-55 (CDR2) y 93-106 (CDR3) se seleccionan de entre las siguientes:
Figure imgf000005_0001
La afinidad de los TCR por el complejo HLA-A*02 SLLMWITQC puede estar en el intervalo de 50 uM a 100 nM, o de 5uM a 1pM.
Para la producción de TCRs estables y solubles de la invención, se utilizó una versión soluble del TCR nativo como secuencia de partida que tenía la secuencia mostrada en la Figura 2. Para ello, se introducen sustituciones de cisteína en las regiones TRAC y TRBC de forma que se pueda formar un enlace disulfuro no nativo entre cadenas. Las posiciones adecuadas para la ubicación de dichas sustituciones de cisteína se describen en WO03020763. La figura 2 muestra las secuencias extracelulares de las cadenas alfa y beta del TCR de tipo salvaje, respectivamente, en formato soluble. La SEQ ID NO: 4 es idéntica a la secuencia extracelular nativa de la cadena alfa SEQ ID NO: 2 excepto que la Thr48 de TRAC ha sido sustituida por Cys. Asimismo, la SEQ ID NO: 5 es idéntica a la secuencia extracelular nativa de la cadena beta SEQ ID NO: 3 excepto que la Ser57 de TRBC ha sido sustituida por Cys, Cys75 ha sido sustituida por Ala y Asn201 ha sido sustituida por Asp. El TCR soluble de tipo salvaje descrito anteriormente puede utilizarse para proporcionar una referencia con la que se puede comparar el perfil de unión de los TCR mutados de la invención. Un TCR del primer aspecto puede ser también un TCR del segundo aspecto.
Los TCR de la invención pueden ser de origen no natural y/o purificados y/o de ingenoería. Los TCR de la invención pueden tener más de una mutación presente en el dominio variable de la cadena alfa y/o en el dominio variable de la cadena beta en relación con el TCR nativo NY-ESO-1.
"TCR de ingeniería" y "TCR mutante" se utilizan como sinónimos en el presente documento y generalmente significan un TCR que tiene una o más mutaciones introducidas en relación con el TCR NY-ESO-1 de tipo salvaje, en particular en el dominio variable de la cadena alfa y/o el dominio variable de la cadena beta del mismo. Las mutaciones se realizan preferentemente dentro de las regiones CDR. Estas mutaciones suelen mejorar la afinidad de unión del TCR al complejjo HLA-A*02 SLLMWITQC(SEQ ID NO: 1). El dominio variable de la cadena alfa puede tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes mutaciones con referencia a la numeración de la SEQ ID NO: 2:
tabla 1
Figure imgf000006_0001
y/o el dominio variable de la cadena beta puede tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve de las siguientes mutaciones con referencia a la numeración de la SEQ ID NO: 3:
l 2
Figure imgf000006_0002
El dominio variable de la cadena alfa puede tener al menos una de las siguientes mutaciones con referencia a la numeración de la SEQ ID NO: 2:
tabla 3
Figure imgf000006_0003
Y/o el dominio variable de la cadena beta puede tener al menos una de las siguientes mutaciones con referencia a la numeración de la SEQ ID NO: 3:
tabla 4
Figure imgf000006_0004
El dominio variable de la cadena alfa tiene al menos uno de los siguientes grupos de mutaciones
Grupo 1: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A
Grupo 2: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97D
Grupo 3: I51L, T52G, G53D, D54S, N55A, N97R
Grupo 4: I96S, N97D, S98Q, G99H
Grupo 5: D95S, I96S, N97R, S98Q, G99H
Grupo 6: I51L, G53D
y/o el dominio variable de la cadena beta tiene al menos uno de los siguientes grupos de mutaciones Grupo 1: N50W, Q51T, S53G
Grupo 2: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G
Grupo 3: S27K, Q28R, V29L, T30A, M31L, N50W, Q51T, S53G, G100A
Grupo 4: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T
Grupo 5: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G
Grupo 6: S27K, Q28R, V29L, T30A, N50W, Q51T S53G, G100A
Grupo 7: S27K, Q28R, V29L, T30A, M3IL, N50W, Q51T
Grupo 8: T30A, N50W, G100A
Se divulgan combinaciones particulares de los grupos de mutaciones que pueden ser como se establece en la tabla siguiente:
(tabla 5)
Figure imgf000007_0001
Se divulgan combinaciones particulares de mutaciones que pueden estar presentes en el TCR de la invención, como se establece en las tablas siguientes:
Cadena Alfa
(tabla 6)
Figure imgf000007_0002
Cadena Beta
(tabla 7)
Figure imgf000008_0002
En particular, los dominios variables de las cadenas alfa y beta comprenden las siguientes combinaciones de secuencias de aminoácidos:
tabla 8
Figure imgf000008_0001
De acuerdo con la divulgación, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 mutaciones en las CDR de la cadena alfa, por ejemplo de 2 a 6 mutaciones, y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mutaciones en las CDR de la cadena beta, por ejemplo de 3 a 9 mutaciones. En la divulgación, el dominio variable de la cadena a del TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de residuos de aminoácidos 1-117 de la SEQ ID NO: 2, siempre que el dominio variable de la cadena a tenga al menos una de las mutaciones señaladas anteriormente. En la divulgación, el dominio variable de la cadena p del TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de residuos de aminoácidos 1­ 115 de la SEQ ID NO: 3, siempre que el dominio variable de la cadena p tenga al menos una de las mutaciones señaladas anteriormente. El dominio variable de la cadena alfa puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 6-12 o 51. El dominio variable de la cadena beta puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13-23 o 52.
También se pueden realizar mutaciones fuera de las CDR, dichas mutaciones pueden mejorar la unión, pero preferentemente mejoran el rendimiento de purificación y la estabilidad. Ejemplos de tales mutaciones en el dominio variable de la cadena alfa, con referencia a la numeración de la SEQ ID NO: 2 puede ser:
tabla 9
Figure imgf000008_0003
y/o en el dominio variable de la cadena beta puede ser al menos una de las siguientes mutaciones con referencia a la numeración de la SEQ ID NO: 3:
tabla 10
Figure imgf000008_0004
Las mutaciones de un TCR parental pueden incluir aquellas que son capaces de aumentar la afinidad de unión (kD y/o semivida de unión) del TCR a SLLMWITQC. Las mutaciones pueden incluir aquellas que son capaces de reducir la cantidad de unión no específica, es decir, reducir la unión a antígenos además de la unión a SLLMWITQC, o aumentar la especificidad de la unión del TCR a SLLMWITQC. Las mutaciones pueden incluir las que aumentan la eficiencia del plegado y/o la fabricación. Algunas mutaciones pueden contribuir a cada una de estas características, otras pueden contribuir a la afinidad pero no a la especificidad, por ejemplo, o a la especificidad pero no a la afinidad, etc.
Dentro del ámbito de la invención están las variantes fenotípicamente silenciosas de cualquier TCR de la invención divulgada en el presente documento. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "variantes fenotípicamente silenciosas" se entiende que se refiere a un TCR que incorpora uno o más cambios de aminoácidos además de los expuestos anteriormente y que tiene un fenotipo similar al del TCR correspondiente sin dicho(s) cambio(s). A los efectos de esta solicitud, el fenotipo del TCR comprende la afinidad de unión al antígeno (Kd y/o semivida de unión) y la especificidad del antígeno. Una variante fenotípicamente silenciosa puede tener una Kd y/o semivida de unión para el complejo HLA-A*02 SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) dentro del 20 % de la Kd medida y/o de la semivida de unión del TCR correspondiente sin dicho(s) cambio(s), cuando se mide en condiciones idénticas (por ejemplo a 25°C y en el mismo chip SPR). Las condiciones adecuadas se definen con más detalle en el ejemplo 3. La especificidad del antígeno se define más adelante. Como es sabido por los expertos en la materia, puede ser posible producir TCRs que incorporen cambios en los dominios variables de los mismos en comparación con los detallados anteriormente sin alterar la afinidad de la interacción con el complejo HLA-A*02 SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) . En particular, estas mutaciones silenciosas pueden incorporarse en partes de la secuencia que se sabe que no están directamente implicadas en la unión al antígeno (por ejemplo, fuera de las CDR o en partes de las CDR que no entran en contacto con el antígeno peptídico). Tales variantes triviales se incluyen en el ámbito de esta invención. Aquellos TCRs en los que se han realizado una o más sustituciones conservadoras y/o toleradas también forman parte de esta invención. Las sustituciones toleradas también son fenotípicamente silenciosas pero pueden no ser conservadoras, como se define a continuación. Las sustituciones toleradas pueden dar lugar a una disminución de la afinidad por el complejo HLA-A*02 SLLMWITQC en comparación con un t Cr que no tenga una sustitución tolerada. La disminución de la afinidad puede ser del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 % o 50 % del TCR sin la sustitución tolerada. La disminución de la afinidad no da lugar a que la afinidad sea inferior (es decir, más débil) a 50|jm.
Los TCR de la presente invención también pueden incluir una o más sustituciones conservadoras que tengan una secuencia de aminoácidos similar y/o que conserven la misma función. La pewrsona con experiencia sabe que varios aminoácidos tienen propiedades similares y, por tanto, son "conservadores". Uno o más de estos aminoácidos de una proteína, polipéptido o péptido pueden ser sustituidos a menudo por uno o más de estos aminoácidos sin eliminar una actividad deseada de dicha proteína, polipéptido o péptido.
Así, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina pueden sustituirse a menudo entre sí (aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas). De estas posibles sustituciones, se prefiere que la glicina y la alanina se utilicen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y que la valina, la leucina y la isoleucina se utilicen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales alifáticas más grandes que son hidrófobas). Otros aminoácidos que pueden sustituirse a menudo son: la fenilalanina, la tirosina y el triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas); la lisina, la arginina y la histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas); el aspartato y el glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas); la asparagina y la glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales amidas); y la cisteína y la metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales azufradas).
Las sustituciones de esta naturaleza suelen denominarse sustituciones de aminoácidos "conservadoras" o "semiconservadoras". La presente divulgación incluye un TCR que comprende una secuencia de aminoácidos descrita anteriormente pero con una o más sustituciones conservadoras en la secuencia, de tal manera que la secuencia de aminoácidos del TCR tiene al menos un 90 % de identidad, tal como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, con el TCR que comprende los aminoácidos 1-117 de las SEQ ID NOs: 2, 6­ 12 o 51 y/o los aminoácidos 1-115 de las SEQ ID NOs: 3, 13-23 o 52.
Las combinaciones particulares del dominio variable de la cadena alfa y del dominio variable de la cadena beta pueden ser:
tabla 11
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Los cambios de aminoácidos en relación con las secuencias indicadas anteriormente pueden realizarse mediante cualquier técnica adecuada, por ejemplo, utilizando la mutagénesis dirigida al sitio o la síntesis en estado sólido.
Debe apreciarse que las sustituciones de aminoácidos dentro del ámbito de la presente invención pueden realizarse utilizando aminoácidos de origen natural o no natural. Por ejemplo, se contempla en el presente documento que el grupo metilo de una alanina puede ser sustituido por un grupo etilo, y/o que se pueden realizar cambios menores en la columna vertebral del péptido. Tanto si se utilizan aminoácidos naturales como sintéticos, se prefiere que sólo estén presentes los aminoácidos L.
La "identidad", tal y como se conoce en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, la identidad también significa el grado de parentesco de la secuencia entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, como se determina por la coincidencia entre las cadenas de dichas secuencias. Aunque existen varios procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias polipeptídicas o dos polinucleotídicas, los procedimientos comúnmente empleados para determinar la identidad están codificados en programas informáticos. Los programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLAs Tp , BLASTN y FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)).
Se puede utilizar un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar las secuencias de aminoácidos. Este programa compara las secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima insertando espacios en cualquiera de las secuencias según corresponda. Es posible calcular la identidad o la similitud de aminoácidos (identidad más conservación del tipo de aminoácido) para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. Así, es posible obtener una comparación en la que se encuentran varias regiones de similitud, cada una con una puntuación diferente. Ambos tipos de análisis de identidad se contemplan en la presente invención.
El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos se determina alineando las secuencias para una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir brechas en la primera secuencia para una mejor alineación con la secuencia) y comparando los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes. El "mejor alineamiento" es un alineamiento de dos secuencias que da como resultado el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina por el número de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos en las secuencias comparadas (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100).
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse mediante un algoritmo matemático conocido por los expertos en la materia. Un ejemplo de algoritmo matemático para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 han incorporado dicho algoritmo. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas para su uso en la invención. Para obtener alineaciones separadas con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.
25:3389-3402. Alternativamente, PSI-Blast puede utilizarse para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre las moléculas (Id.). Al utilizar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo de algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). El programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias del CGC, ha incorporado un algoritmo de este tipo. Otros algoritmos para el análisis de secuencias conocidos en la técnica son ADVANCE y ADAM, descritos en Torellis y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci, 10 :3-5y FASTA descritos en Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y la velocidad de la búsqueda.
Las mutaciones pueden llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento apropiado, incluyendo, pero sin limitarse a, los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la clonación basada en enzimas de restricción o los procedimientos de clonación independiente de la ligadura (LIC). Estos procedimientos se detallan en muchos de los textos estándar de biología molecular. Para más detalles sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la clonación basada en enzimas de restricción, véase Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press.. Se puede encontrar más información sobre los procedimientos de clonación independiente de la ligadura (LIC) en Rashtchian, (1995) CurrOpin Biotechnol 6(1): 30-6.
El TCR de la invención puede comprender una región del marco de la cadena alfa 2 (FM2) y una región del marco de la cadena alfa 3 (FM3), donde las regiones FM2 y FM3 comprenden las SEQ ID NO: 47 y 48 respectivamente, y/o contienen una o más sustituciones conservadoras y/o hasta tres sustituciones toleradas.
El TCR del segundo aspecto puede comprender una región FM2 de cadena beta y una región FM3 de cadena beta, donde las regiones FM2 y FM3 comprenden las SEQ ID NOs:49 y 50 respectivamente, y/o contienen una o más sustituciones conservadoras y/o hasta tres sustituciones toleradas.
El TCR de la divulgación puede comprender los aminoácidos 1-117 de la SEQ ID NO: 2 y/o los aminoácidos 1-115 de la SEQ ID NO: 3, cada una de las cuales puede contener una o más sustituciones conservadoras y/o hasta tres mutaciones toleradas y/o una o más de las mutaciones definidas en la tabla 1 o la tabla 2.
Los TCR de la invención tienen la propiedad de unir el complejo HLA-A*02 SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) . Se ha encontrado que los TCRs de la invención son altamente específicos para este epítopo en relación con otros epítopos irrelevantes, y por lo tanto son particularmente adecuados como vectores de direccionamiento para el suministro de agentes terapéuticos o etiquetas detectables a las células y tejidos que muestran esos epítopos. La especificidad en el contexto de los TCR de la invención se refiere a su capacidad de reconocer las células diana HLA-A*02 que son positivas para el péptido SLLMWITQC, mientras que tienen una capacidad mínima de reconocer las células diana HLA-A*02 que son negativas para el péptido. Para comprobar la especificidad, los TCRs pueden estar en forma soluble y/o pueden expresarse en la superficie de las células T. El reconocimiento puede determinarse midiendo el nivel de activación de las células T en presencia de un TCR y de células diana. En este caso, el reconocimiento mínimo de las células diana negativas al péptido se define como un nivel de activación de células T inferior al 20 %, preferentemente inferior al 10 %, y más preferentemente inferior al 5 %, del nivel producido en presencia de células diana positivas al péptido, cuando se mide en las mismas condiciones. Para los TCRs solubles de la invención, la especificidad puede determinarse a una concentración de TCR terapéuticamente relevante. Una concentración terapéuticamente relevante puede definirse como una concentración de TCR de 10'9 M o inferior, y/o una concentración de hasta 100, o hasta 1000, veces mayor que el valor EC50 correspondiente. Las células positivas al péptido pueden obtenerse por impulsión del péptido o, más preferentemente, pueden presentar dicho péptido de forma natural. Preferentemente, tanto las células positivas al péptido como las negativas al péptido son células humanas. La especificidad puede medirse, por ejemplo, en ensayos celulares como los descritos en los Ejemplos 6-8. La especificidad puede referirse, además, a la capacidad de unirse al complejo NY-ESO-1-HLA-A*02 y no a múltiples complejos de péptidos HLA presentados de forma natural, según lo determinado por Biacore, por ejemplo. Preferentemente, la unión al complejo NY-ESO-1-HLA-A*02 es al menos 400 veces mayor que a otros complejos HLA peptídicos presentados de forma natural.
Los TCR de la invención pueden tener una Kd para el complejo NY-ESO-1-HLA-A*02 de más de (es decir, más fuerte que) 50 |j M, por ejemplo entre 50 j M y 1 pM. Algunos TCR de la invención pueden tener una Kd para el complejo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 400 pM, de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 200 pM. Los TCRs de la invención pueden tener una semivida de unión (T / ) para el complejo en el intervalo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 60 h o más, de aproximadamente 30 min a aproximadamente 60 h o más, o de aproximadamente 6 h a aproximadamente 60 h o más. Los TCRs que se van a utilizar como terapéuticos y/o diagnósticos solubles cuando están acoplados a una etiqueta detectable o agente terapéutico tienen preferentemente una Kd para el complejo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 200 pM, o de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 100 pM, según se determina utilizando el procedimiento BIAcore del Ejemplo 3, y/o una semivida de unión para el complejo de aproximadamente 2 h a 60 h o mayor, o de aproximadamente 20 h a aproximadamente 60 h o mayor, según se determina utilizando el procedimiento BIAcore del Ejemplo 3. Ciertos TCRs de la invención pueden ser adecuados para aplicaciones de terapia adoptiva; dichos TCRs pueden tener una Kd para el complejo de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 50 j M, o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 j M y/o una semivida de unión para el complejo de aproximadamente 3 seg a aproximadamente 12 min.
Algunos TCR de la invención tienen una afinidad de unión y/o una semivida de unión para el complejo SLLMWITQC -HLA-A*02 sustancialmente mayor que la del TCR nativo. El aumento de la afinidad de unión de un TCR nativo suele reducir la especificidad del TCR para su ligando péptido-MHC, y esto se demuestra en Zhao Yangbing et al., The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, US, vol. 179, No.9, 1 de noviembre de 2007, 5845-5854. Sin embargo, los TCR de la invención pueden seguir siendo específicos para el complejo SLLMWITQC -HLA-A*02, a pesar de tener una afinidad de unión sustancialmente mayor que el TCR nativo.
La afinidad de unión (inversamente proporcional a la constante de equilibrio Kd) y la semivida de unión (expresada como T / ) pueden determinarse utilizando el procedimiento de Resonancia de Plasmón de Superficie (BIAcore) y/o Octet del Ejemplo 3 del presente documento. Se apreciará que al duplicar la afinidad de un TCR se reduce a la mitad la Kd. T / se calcula como In2 dividido por la tasa de desactivación (kkinactivo). Por lo tanto, la duplicación de T / resulta en una reducción a la mitad de kmactivo. Los valores de Kd y kkinactivo para los TCR se miden normalmente para las formas solubles del TCR, es decir, aquellas formas que están truncadas para eliminar los residuos del dominio citoplasmático y transmembrana. Preferentemente, la afinidad de unión o la semivida de unión de un TCR dado se mide varias veces, por ejemplo 3 o más veces, utilizando el mismo protocolo de ensayo y se toma una media de los resultados.
Para su uso como agente de direccionamiento para el suministro de agentes terapéuticos a la célula presentadora de antígeno, el TCR puede estar en forma soluble (es decir, sin dominios transmembrana o citoplasmáticos). Para la estabilidad, los TCR de la invención, y preferentemente los TCR ap heterodiméricos solubles, pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los residuos de los respectivos dominios constantes, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 03/020763. Uno o ambos de los dominios constantes presentes en un heterodímero ap de la invención pueden estar truncados en la terminal C o en las terminales C, por ejemplo hasta 15, o hasta 10 o hasta 8 o menos aminoácidos. El terminal C de la región constante extracelular de la cadena alfa puede estar truncado en 8 aminoácidos. Para su uso en la terapia adoptiva, un TCR heterodimérico ap puede, por ejemplo, transfectarse como cadenas de longitud completa que tienen dominios citoplasmáticos y transmembrana. Los TCRs para su uso en la terapia adoptiva pueden contener un enlace disulfuro correspondiente al que se encuentra en la naturaleza entre los respectivos dominios constantes alfa y beta, adicionalmente o alternativamente puede estar presente un enlace disulfuro no nativo.
Los TCR de la invención pueden ser ap heterodímeros o pueden estar en formato de cadena única. Los formatos de cadena simple incluyen polipéptidos de TCR ap de los tipos Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp o Va-L-Vp-Cp, en los que Va y Vp son regiones variables de TCR a y p respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes de TCR a y p respectivamente, y L es una secuencia enlazadora. En ciertas realizaciones los TCR de cadena única de la invención pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los residuos de los respectivos dominios constantes, como se describe en el documento WO 2004/033685. Los TCR de cadena única se describen además en los documentos WO2004/033685, WO98/39482, WO01/62908, Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76 Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763 Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829).
Como será obvio para los expertos en la materia, puede ser posible truncar las secuencias proporcionadas en el C-terminal y/o N-terminal de las mismas, en 1, 2, 3, 4, 5 o más residuos, sin afectar sustancialmente a las características de unión del TCR. Todas estas variantes triviales están incluidas en la presente invención.
Los TCR heterodiméricos alfa-beta de la invención suelen comprender una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y/o una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta. Las secuencias del dominio constante de las cadenas alfa y beta pueden modificarse por truncamiento o sustitución para eliminar el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2. La(s) secuencia(s) del dominio constante de la cadena alfa y/o beta también puede(n) ser modificada(s) mediante la sustitución de residuos de cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona ácido nucleico que codifica un TCR de la invención. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADNc. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena a de un TCR de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena p de un TCR de la invención. El ácido nucleico puede ser de origen no natural y/o purificado y/o de ingeniería.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende ácido nucleico de la invención. Preferentemente, el vector es un vector de expresión de TCR.
La invención también proporciona una célula que alberga un vector de la invención, preferentemente un vector de expresión de TCR. El vector puede comprender ácido nucleico de la invención que codifica en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos, la cadena alfa y la cadena beta respectivamente. Otro aspecto proporciona una célula que alberga un primer vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de la invención, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de la invención. Estas células son especialmente útiles en la terapia adoptiva. Las células de la invención pueden ser aisladas y/o recombinantes y/o de origen no natural y/o de ingeniería.
Dado que los TCR de la invención tienen utilidad en la terapia adoptiva, la invención incluye una célula de origen no natural y/o purificada y/o de ingeniería, especialmente una célula T, que presenta un TCR de la invención. La invención también proporciona una población expandida de células T que presentan un TCR de la invención. Existen varios procedimientos adecuados para la transfección de células T con ácido nucleico (como ADN, ADNc o ARN) que codifica los TCR de la invención (véase, por ejemplo Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). Las células T que expresan los TCR de la invención serán adecuadas para su uso en el tratamiento del cáncer basado en la terapia adoptiva. Como sabrán los expertos en la materia, hay una serie de procedimientos adecuados por los que se puede llevar a cabo la terapia adoptiva (véase, por ejemplo Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).
Los TCRs solubles de la invención son útiles para suministrar etiquetas detectables o agentes terapéuticos a las células presentadoras de antígenos y a los tejidos que contienen células presentadoras de antígenos. Por lo tanto, pueden asociarse (de forma covalente o de otro modo) con una etiqueta detectable (para fines de diagnóstico en los que el TCR se utiliza para detectar la presencia de células que presentan el complejo SLLMWITQC-HLA-A*02); un agente terapéutico; o una fracción modificadora del PK (por ejemplo, por PEGilación).
Las etiquetas detectables con fines de diagnóstico incluyen, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácido nucleico y reactivos de contraste.
Los agentes terapéuticos que pueden asociarse a los TCR de la invención incluyen inmunomoduladores, compuestos radiactivos, enzimas (perforina por ejemplo) o agentes quimioterapéuticos (cis-platino por ejemplo). Para asegurar que los efectos tóxicos se ejercen en el lugar deseado, la toxina podría estar dentro de un liposoma unido a un TCR para que el compuesto se libere lentamente. Esto evitará los efectos perjudiciales durante el transporte en el cuerpo y garantizará que la toxina tenga el máximo efecto tras la unión del TCR a las células presentadoras de antígenos pertinentes.
Otros agentes terapéuticos adecuados incluyen:
• agentes citotóxicos de moléculas pequeñas, es decir, compuestos con capacidad para matar células de mamíferos que tienen un peso molecular inferior a 700 Daltons. Estos compuestos también podrían contener metales tóxicos capaces de tener un efecto citotóxico. Además, debe entenderse que estos agentes citotóxicos de moléculas pequeñas también incluyen profármacos, es decir, compuestos que se descomponen o se convierten en condiciones fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Ejemplos de estos agentes son el cis-platino, los derivados de la maytansina, la raquelmicina, la calicheamicina, el docetaxel, el etopósido, la gemcitabina, la ifosfamida, el irinotecán, el melfalán, la mitoxantrona, el sorfímero sódicofotofrina II, la temozolomida, el topotecán, el glucuronato de trimetreato, la auristatina E la vincristina y la doxorrubicina;
• citotoxinas peptídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con capacidad para matar células de mamíferos. Por ejemplo, la ricina, la toxina diftérica, la exotoxina bacteriana A de las pseudomonas, la DNasa y la RNasa;
• los radionúclidos, es decir, los isótopos inestables de los elementos que decaen con la emisión simultánea de una o varias partículas a o p, o de rayos y. Por ejemplo, el yodo 131, el renio 186, el indio 111, el itrio 90, el bismuto 210 y 213, el actinio 225 y la astatina 213; pueden utilizarse agentes quelantes para facilitar la asociación de estos radionúclidos a los TCR de alta afinidad, o a sus multímeros;
• inmunoestimulantes, es decir, moléculas efectoras inmunitarias que estimulan la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, citoquinas como la IL-2 y el IFN-y,
• Superantígenos y sus mutantes;
• Fusiones TCR-HLA, por ejemplo, fusión a un complejo péptido-HLA, en el que dicho péptido se deriva de un patógeno humano común, como el virus de Epstein Barr (EBV);
• quimioquinas como la IL-8, el factor 4 de las plaquetas, la proteína estimuladora del crecimiento del melanoma, etc;
• anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluyendo anticuerpos determinantes de células T o células NK (por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28 o anti-CD16);
• andamios proteicos alternativos con características de unión similares a las de los anticuerpos
• activadores del complemento;
• dominios proteicos xenogénicos, dominios proteicos alogénicos, dominios proteicos virales/bacterianos, péptidos virales/bacterianos.
Una realización preferida es proporcionada por una fusión TCR anti-CD3 que comprende un TCR de la invención asociado (generalmente por fusión al N-o C-terminal de la cadena alfa o beta) con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento funcional o variante de dicho anticuerpo anti-CD3. (Dichas fusiones TCR-anti-CD3 pueden denominarse moléculas ImmTAC™) Tal como se utiliza en el presente documento, el término TCR abarca las fusiones TCR, como una fusión TCR anti-CD3. Tal y como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" engloba dichos fragmentos y variantes. Los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 incluyen, pero no se limitan a OKT3, UCHT-1, BMA-031 y 12F6. Los fragmentos y variantes/análogos de anticuerpos que son adecuados para su uso en las composiciones y procedimientos aquí descritos incluyen minicuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 , fragmentos dsFv y scFv, Nanobodies™ (estos constructos, comercializados por Ablynx (Bélgica), comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina sintética derivado de un camélido (por ejemplo camélido (por ejemplo, camello o llama) y Domain Antibodies (Domantis (Bélgica), que comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina o un dominio ligero variable de inmunoglobulina madurado por afinidad) o andamios proteicos alternativos que presentan características de unión similares a las de los anticuerpos, como Affibodies (Affibody (Suecia), que comprende un andamio de proteína A diseñado) o Anticalins (Pieris (Alemania)), que comprende anticalinas diseñadas), por nombrar sólo algunos.
La unión del TCR y el anticuerpo anti-CD3 puede ser directa, o indirecta a través de una secuencia enlazadora. Las secuencias enlazadoras suelen ser flexibles, ya que están formadas principalmente por aminoácidos como la glicina, la alanina y la serina, que no tienen cadenas laterales voluminosas que puedan restringir la flexibilidad. Las longitudes utilizables u óptimas de las secuencias de enlace se determinan fácilmente. A menudo, la secuencia enlazadora será inferior a aproximadamente 12, por ejemplo menos de 10, o de 5 a 10 aminoácidos de longitud. Los enlazadores adecuados que pueden utilizarse en las fusiones TCR anti-CD3 de la invención incluyen, pero no se limitan a: GGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGSG (SEQ ID NO: 25), GGSGG (SEQ ID NO: 26), GSGGG (SEQ ID NO: 27), GSGGGP (SEQ ID NO: 28), GGEPS (SEQ ID NO: 29), GGEGGGP (SEQ ID NO: 30), y GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 31) (como se describe en WO2010/133828).
Las realizaciones específicas de constructos de fusión anti-CD3-TCR de la invención incluyen los emparejamientos de cadenas alfa y beta que se muestran en la tabla siguiente.
(tabla 7)
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Una fusión anti-CD3-TCR particularmente preferida comprende la cadena alfa SEQ ID NO: 37 y la cadena beta SEQ ID NO: 38.
Para algunos propósitos, los TCRs de la invención pueden ser agregados en un complejo que comprende varios TCRs para formar un complejo TCR multivalente. Hay una serie de proteínas humanas que contienen un dominio de multimerización que puede utilizarse en la producción de complejos TCR multivalentes. Por ejemplo, el dominio de tetramerización de p53, que se ha utilizado para producir tetrámeros de fragmentos de anticuerpos scFvque mostraron una mayor persistencia en el suero y una tasa de desactivación significativamente menor en comparación con el fragmento scFv monomérico (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). La hemoglobina también tiene un dominio de tetramerización que podría utilizarse para este tipo de aplicaciones. Un complejo TCR multivalente de la invención puede tener una capacidad de unión mejorada para el complejo SLLMWITQC-HLA-A*02 en comparación con un heterodímero no multimérico de tipo salvaje o de receptor de células T de la invención. Así, los complejos multivalentes de TCRs de la invención también se incluyen dentro de la invención. Dichos complejos TCR multivalentes de acuerdo con la invención son particularmente útiles para rastrear o direccionar células que presentan antígenos particulares in vitro o in vivo, y también son útiles como intermedios para la producción de otros complejos TCR multivalentes que tienen tales usos.
Como es bien conocido en el arte, los TCRs pueden estar sujetos a modificaciones postraduccionales. La glicosilación es una de estas modificaciones, que comprende la unión covalente de rfracciones de oligosacáridos a aminoácidos definidos en la cadena del TCR. Por ejemplo, los residuos de asparagina o de serina/treonina son lugares bien conocidos para la fijación de oligosacáridos. El estado de glicosilación de una proteína concreta depende de varios factores, como la secuencia de la proteína, su conformación y la disponibilidad de determinadas enzimas. Además, el estado de glicosilación (es decir, el tipo de oligosacárido, la unión covalente y el número total de uniones) puede influir en la función de las proteínas. Por lo tanto, cuando se producen proteínas recombinantes, a menudo es conveniente controlar la glicosilación. La glicosilación controlada se ha utilizado para mejorar las terapias basadas en anticuerpos. (Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar;8(3):226-34.). Para los TCRs solubles de la invención la glicosilación puede ser controlada in vivo, utilizando líneas celulares particulares por ejemplo, o in vitro, por modificación química. Tales modificaciones son deseables, ya que la glicosilación puede mejorar la farmacocinética, reducir la inmunogenicidad e imitar más de cerca una proteína humana nativa (Sinclair AM y Elliott S., Pharm Sci. 2005 Ago; 94(8):1626-35).
Para su administración a los pacientes, los TCR o las fusiones de TCR anti-CD3 de la invención (preferentemente asociados a una etiqueta o agente terapéutico detectable o expresados en una célula T transfectada) o las células de la invención pueden proporcionarse en una composición farmacéutica junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los TCR terapéuticos o de imagen, las fusiones de TCR o las células, de acuerdo con la invención, se suministrarán normalmente como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada, (dependiendo del procedimiento deseado para administrarla a un paciente). Puede suministrarse en forma de dosis unitaria, generalmente se suministrará en un envase sellado y puede ser suministrado como parte de un kit. Normalmente (aunque no necesariamente) un kit de este tipo incluye instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas farmacéuticas unitarias.
La composición farmacéutica puede adaptarse para su administración por cualquier vía apropiada, como la parenteral (incluida la subcutánea, la intramuscular o la intravenosa), la enteral (incluida la oral o la rectal), la inhalatoria o la intranasal. Dichas composiciones pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido en el arte de la farmacia, por ejemplo, mezclando el ingrediente activo con el o los portadores o excipientes en condiciones estériles.
Las dosificaciones de las sustancias de la presente invención pueden variar entre amplios límites, dependiendo de la enfermedad o trastorno a tratar, la edad y condición del individuo a tratar, etc. un intervalo de dosis adecuado para un TCR soluble de la invención asociado a un anticuerpo anti-CD3 puede estar entre 25 ng/kg y 50 pg/kg. Un médico determinará en última instancia las dosificaciones adecuadas que se deben utilizar.
Los TCR, las composiciones farmacéuticas, los vectores, los ácidos nucleicos y las células de la invención pueden proporcionarse en forma sustancialmente pura, por ejemplo, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de pureza.
La invención también proporciona:
• Un TCR, una fusión TCR anti-CD3, un ácido nucleico o una célula de la invención para su uso en medicina, preferentemente para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer; y
• el uso de un TCR, una fusión TCR anti-CD3, un ácido nucleico o una célula de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.
El cáncer a tratar puede ser un sarcoma sinovial, un carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), un tumor de vejiga, un tumor gástrico, un tumor de próstata, un tumor colorrectal, un tumor de mama, un tumor de ovario, un tumor de esófago, un melanoma, un mieloma múltiple, un carcinoma hepatocelular y un tumor de cabeza y cuello. La invención se describe a continuación con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos, en los que:
La figura 1 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones extracelulares de los dominios variables nativos de las cadenas alfa y beta de la invención;
La figura 2 proporciona las secuencias de aminoácidos de las regiones extracelulares solubles de las cadenas alfa y beta nativas de la invención;
La figura 3 proporciona las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena alfa del TCR mutado de la invención;
La figura 4 proporciona las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena beta del TCR mutado de la invención;
La figura 5 proporciona secuencias de aminoácidos de moléculas ImmTAC que comprenden secuencias TCR de la invención;
La figura 6 proporciona secuencias de aminoácidos de moléculas ImmTAC que comprenden secuencias TCR de la invención;
La figura 7 proporciona secuencias de aminoácidos de moléculas ImmTAC que comprenden secuencias TCR de la invención;
La figura 8 proporciona secuencias de aminoácidos de moléculas ImmTAC que comprenden secuencias TCR de la invención;
La figura 9 muestra la unión potente y específica de las moléculas ImmTAC de la invención;
La figura 10 muestra otras pruebas de potencia para 2 moléculas ImmTAC de la invención;
La figura 11 muestra otras pruebas de especificidad para 3 moléculas ImmTAC de la invención; y
La figura 12 muestra la eliminación de células tumorales por parte de las células T redirigidas por ImmTAC.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Expresión, replegado y purificación de TCRs solubles
Las secuencias de ADN que codifican las regiones extracelulares alfa y beta de los TCRs solubles de la invención se clonaron por separado en plásmidos de expresión basados en pGMT7 utilizando procedimientos estándar (como se describe en Sambrook, et al. Molecular cloning. Vol. 2. (1989) Nueva York: Cold spring harbor laboratory press). Los plásmidos de expresión se transformaron por separado en la cepa de E. coli Rosetta (BL21pLysS), y se cultivaron colonias individuales resistentes a la ampicilina a 37°C en medio TYP (+ ampicilina 100 pg/ml) hasta alcanzar una OD600 de ~0,6-0,8 antes de inducir la expresión de la proteína con 0,5 mM de IPTG. Las células se cosecharon tres horas después de la inducción mediante centrifugación. Los pellets de células se lisaron con el reactivo de extracción de proteínas BugBuster (Merck Millipore) según las instrucciones del fabricante. Los gránulos de cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación. Los gránulos se lavaron dos veces en tampón Tritón (50 mM Tris-HCl pH 8,1, 0,5 % Triton-X100, 100 mM NaCI, 10 mM NaEDTA) y finalmente se resuspendieron en tampón sin detergente (50 mM Tris-HCI pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA). El rendimiento de la proteína del cuerpo de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y midiendo la OD280. A continuación se calculó la concentración de proteínas mediante el coeficiente de extinción. La pureza del cuerpo de inclusión se midió solubilizándolo con Urea 8M y cargando ~2|jg en SDS-PAGE al 4-20 % en condiciones reductoras. A continuación se estimó o calculó la pureza mediante un programa informático de densitometría (Chemidoc, Biorad). Los cuerpos de inclusión se almacenaron a 4°C para el almacenamiento a corto plazo y a -20°C o-70°C para el almacenamiento a largo plazo.
Para el replegado del TCR soluble, los cuerpos de inclusión que contenían cadenas a y p se mezclaron primero y se diluyeron en 10 ml de tampón de solubilización/desnaturalización (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCI 50 mM pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA10 mM, DTT 20 mM), seguido de una incubación durante 30 minutos a 37°C. A continuación, se inició el repliegue mediante una nueva dilución en 1 L de tampón de repliegue (100 mM Tris pH 8,1, 400 mM L-Arginina HCL, 2 mM EDTA, 4 M Urea, 10 mM clorhidrato de cisteamina y 2,5 mM dihidrocloruro de cistamina) y se mezcló bien la solución. La mezcla replegada se dializó con 10 L de H2O durante 18-20 horas a 5 °C ± 3 °C. Transcurrido este tiempo, el tampón de diálisis se sustituyó dos veces por 10 mM de Tris de pH 8,1 (10 L) y la diálisis continuó durante otras 15 horas. A continuación, la mezcla replegada se filtró a través de filtros de celulosa de 0,45 jm.
La purificación de los TCRs solubles se inició aplicando el repliegue dializado en una columna de intercambio aniónico POROS® 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de 0-500mM NaCl en 20 mM Tris pH 8.1 a lo largo de 50 volúmenes de columna utilizando un purificador Akta® (GE Healthcare). Los picos de las fracciones de TCR se identificaron mediante SDS PAGE antes de ser agrupados y concentrados. A continuación, la muestra concentrada se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex® 75HR (GE Healthcare) preequilibrada en tampón PBS de Dulbecco. Las fracciones del pico TCR se agruparon y concentraron y se calculó el rendimiento final del material purificado.
Ejemplo 2 - Expresión, replegado y purificación de moléculas ImmTAC (proteínas de fusión TCR-anti CD3 solubles)
La preparación de ImmTAC se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1, excepto que la cadena beta del TCR se fusionó mediante un enlazador con un anticuerpo de cadena simple anti-CD3. Además, se realizó una etapa de intercambio de cationes durante la purificación tras el intercambio de aniones. En este caso, las fracciones de los picos de intercambio aniónico se diluyeron 20 veces en 20mM MES (pH6,5), y se aplicaron a una columna de intercambio catiónico POROS® 50HS. La proteína ligada se eluyó con un gradiente de 0-500 mM de NaCl en 20mM de MES. Las fracciones de ImmTAC de los picos se agruparon y se ajustaron a 50mM de Tris pH 8.1, antes de ser concentradas y aplicadas directamente a la matriz de filtración de gel como se describe en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3 - Caracterización de la unión
El análisis de la unión de los TCRs solubles purificados y de las moléculas ImmTAC al complejo péptido-HLA correspondiente se llevó a cabo mediante resonancia de plasmón superficial, utilizando un instrumento BIAcore 3000 o BIAcore T200, o mediante interferometría de biocapa, utilizando un instrumento ForteBio Octet). Las moléculas de clase I HLA-A*02 biotiniladas se volvieron a plegar con el péptido de interés y se purificaron utilizando procedimientos conocidos por los expertos (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15 Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433). Todas las mediciones se realizaron a 25°C en tampón PBS de Dulbecco, complementado con 0,005 % de P20.
BIAcore
Los monómeros de péptidos-HLA biotinilados se inmovilizaron en chips sensores CM-5 acoplados a estreptavidina. Las constantes de unión de equilibrio se determinaron utilizando diluciones seriadas de TCR soluble / ImmTAC inyectadas a un caudal constante de 30 j l min'1 sobre una celda de flujo recubierta con ~200 unidades de respuesta (RU) del complejo péptido-HLA-A*02. Las respuestas de equilibrio se normalizaron para cada concentración de TCR restando la respuesta del tampón en una celda de flujo de control que contenía un péptido-HLA irrelevante. El valor de Kd se obtuvo mediante un ajuste de curva no lineal utilizando el software Prism y la isoterma de unión de Langmuir, unión = C*Máx/(C Kd), donde "unión" es la unión de equilibrio en RU a la concentración C de TCR inyectado y Máx es la unión máxima.
Para las interacciones de alta afinidad, los parámetros de unión se determinaron mediante un análisis cinético de ciclo único. Se inyectaron cinco concentraciones diferentes de TCR soluble / ImmTAC sobre una celda de flujo recubierta con ~100 - 200 RU de complejo péptido-HLA utilizando un flujo de 50-60 j l min-1. Normalmente, se inyectaron 60-120 j l de TCR soluble / ImmTAC a una concentración máxima de 100-200 nM, y se utilizaron diluciones sucesivas de 2 veces para las otras cuatro inyecciones. Se inyectó primero la concentración más baja. Para medir la fase de disociación se inyectó entonces tampón hasta que se produjo una disociación de > 10 %, normalmente después de 1 a 3 horas. Los parámetros cinéticos se calcularon con el software BIAevaluation®. La fase de disociación se ajustó a una ecuación de decaimiento exponencial única que permite calcular la semivida. La constante de equilibrio Kd se calculó a partir de kinactivo/kactivo.
Octeto
Los monómeros de péptido-HLA biotinilados se capturaron a 1 nm en biosensores de estreptavidina (SA) (Pall ForteBio) preinmovilizados con estreptavidina. Los sensores se bloquearon con biotina libre (2 j M) durante 2 minutos. Las constantes de unión de equilibrio se determinaron sumergiendo los biosensores cargados en TCR solubles / ImmTAC diluidos en serie en una placa de muestras de 96 o 384 pocillos. La agitación de la placa se ajustó a 1000 rpm. Para las interacciones de baja afinidad (intervalo j M) se utilizó una asociación corta (~2 minutos) y un tiempo de disociación corto (~2 minutos). Las curvas de unión se procesaron mediante la sustracción de doble referencia de los biosensores de referencia cargados con pHLA irrelevante utilizando el software de análisis de datos Octet (Pall ForteBio). Las respuestas (nm) en equilibrio se utilizaron para estimar el valor de Kd a partir de gráficos de estado estacionario ajustados a la ecuación Respuesta = Rmáx*conc/(KD + conc), donde "respuesta" es la unión en equilibrio en nm a cada concentración de TCR (conc) y Rmáx es la respuesta de unión máxima a la saturación de pHLA.
Para las interacciones de alta afinidad (intervalo nM - pM), los parámetros cinéticos se determinaron a partir de curvas de unión a concentraciones > 3 TCR / ImmTAC típicamente l0 nM, 5 nM y 2,5 nM. El tiempo de asociación fue de 30 minutos y el de disociación de 1 a 2 horas. Las curvas de unión se procesaron mediante la sustracción de doble referencia de biosensores de referencia cargados con pHLA irrelevante y bloqueados con biotina. Los parámetros cinéticos kactivo y kinactivo se calcularon mediante un ajuste global directo a las curvas de unión utilizando el software de análisis de datos Octet (Pall ForteBio). La Kd se calculó a partir de kinactivo/kactivo y la semivida de disociación se calculó a partir de t i/2 = 0,693/kijnactivo.
Ejemplo 4 - Caracterización de la unión de un TCR soluble no mutado de la invención
Se preparó un TCR soluble de tipo salvaje según los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 y se analizó la unión a pHLA según el Ejemplo 3. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas alfa y beta correspondían a las mostradas en la figura 2. El HLA-A*02 biotinilado soluble se preparó con el péptido de tipo salvaje (SLLMWITQC) o con el péptido heteroclítico NY-ESO-1 (SLLMWITQV SEQ ID NO: 34), e inmovilizado en un chip sensor BIAcore. Los valores de Kd se determinaron en 5,2 j M y 4,3 j M respectivamente. No se detectó ninguna unión significativa contra 15 complejos de péptidos HLA-A*02 irrelevantes.
Estos datos indican que el TCR se une a la diana con una afinidad y especificidad adecuadas. Por lo tanto, estas cadenas de TCR proporcionan un andamiaje útil para la identificación de otros TCR de la invención.
Ejemplo 5 - Caracterización de la unión de TCRs solubles de alta afinidad y moléculas ImmTAC de la invención
Se prepararon TCRs mutados solubles y moléculas ImmTAC como se describe en los Ejemplos 1 y 2, y se determinaron las características de unión según el Ejemplo 3. Las cadenas TCR alfa y/o beta contenían mutaciones en al menos una región CDR en relación con las secuencias CDR mostradas en la Figura 2 (SEQ ID NOs:41 a 46). Las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables mutadas de la cadena TCR alfa y beta de la invención se proporcionan en las figuras 4 y 5 respectivamente. La siguiente tabla proporciona las características de unión de los TCRs solubles y/o moléculas ImmTAC que comprenden las regiones variables alfa y beta indicadas. La unión se midió utilizando el péptido heteroclítico NY-Es O-1 (Sl LMWITQV).
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Estos datos demuestran que las secuencias de cadenas alfa y beta del TCR de la invención producen TCRs solubles y moléculas ImmTAC con características de unión adecuadas para el desarrollo de reactivos inmunoterapéuticos.
Ejemplo 6 - Redirección potente y específica de células T mediante las moléculas ImmTAC de la invención
Las moléculas ImmTAC que contienen secuencias de cadena variable alfa y beta de la invención se probaron para comprobar su capacidad de mediar en la redirección potente y específica de las células T CD3+ mediante un ensayo ELISPOT, utilizando la secreción de interferón-Y (IFN-y) como lectura de la activación de las células T.
Las secuencias de las cadenas alfa y beta de las cuatro moléculas ImmTAC probadas se proporcionan en las Figuras 5-8.
Los ensayos se realizaron utilizando un kit ELISPOT de IFN-y humano (BD Biosciences). Las células diana se prepararon a una densidad de 1*10® / ml en un medio de ensayo (RPM11640 que contenía un 10 % de FBS inactivado por calor y un 1 % de penicilina-estreptomicina-L-glutamina) y se colocaron a 50.000 células por pocillo en un volumen de 50 |jl. En este ejemplo se utilizaron las siguientes líneas celulares diana:
• Línea celular de cáncer de pulmón humano NCI-H1755 (NY-ESO-1+ve; HLA-A*02+ve) (suministrada por ATCC, n° de cat: CRL-5892)
• Células cardíacas humanas HAo5 (NY-ESO-1've; HLA-A*02+ve) (suministradas por Promocell, n° de cat: C-12271)
Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC), aisladas de la sangre fresca de un donante, se utilizaron como células efectoras y se sembraron a una concentración de 40.000 células por pocillo en un volumen de 50 jl. Se utilizaron distintas concentraciones de ImmTAC, que abarcaban el intervalo clínicamente relevante previsto, y se añadieron al pocillo en un volumen de 50 jl.
Las placas se prepararon según las instrucciones del fabricante. Las células diana, las células efectoras y las moléculas ImmTAC se añadieron a los pocillos correspondientes y se completaron hasta un volumen final de 200 j l con medio de ensayo. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. También se prepararon pocillos de control omitiendo la ImmTAC, las células efectoras o las células diana. Las placas se incubaron durante la noche (37°C / 5 % de CO2). Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (sobre de 1xPBS, que contiene 0,05 % de P20, preparado en agua desionizada). A continuación, se añadió el anticuerpo primario de detección a cada pocillo en un volumen de 50 jl. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas antes de ser lavadas de nuevo tres veces. La detección secundaria se realizó añadiendo 50 j l de estreptavidina-HRP diluida a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y se repitió el paso de lavado. A continuación, las placas se lavaron dos veces con 200 j l de PBS (pH 7,4). No más de 15 minutos antes de su uso, se añadió una gota (20 j l ) de cromógeno AEC a cada 1 ml de sustrato AEC, se mezcló y se añadieron 50 j l a cada pocillo. El desarrollo de las manchas se controló regularmente y las placas se lavaron con agua del grifo para terminar la reacción de desarrollo. A continuación, se dejaron secar las placas a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de realizar el recuento de las manchas mediante un analizador CTL con el software Immunospot (Cellular Technology Limited).
Los datos presentados en la Figura 9 muestran que las moléculas ImmTAC que contienen secuencias de cadena variable alfa y beta de la invención son capaces de mediar una potente redirección de células T contra las células cancerosas HLA-A*02+ve que expresan el antígeno diana. No se observó ninguna actividad contra las células negativas al antígeno HLA-A*02+ve. Estos datos indican que las moléculas ImmTAC son específicas de las células diana dentro del intervalo de concentración clínicamente relevante (< 1 nM).
Se realizó una evaluación adicional de la potencia de las moléculas ImmTAC 3 y 4 para determinar los valores EC50. Los ensayos ELISpot se realizaron como se ha descrito anteriormente con concentraciones de ImmTAC que oscilaban entre 10' 13 M y 10' 8 M. Los datos se analizaron con el software Prism 5.0 (GraphPad) para calcular los valores EC50. Los valores se determinaron como 95 pM y 121 pM para las moléculas ImmTAC 3 y 4 respectivamente (Figura 10). Estos datos confirman la capacidad de estas moléculas ImmTAC para mediar una potente respuesta de células T redirigidas.
Ejemplo 7 - Pruebas adicionales de especificidad de las moléculas ImmTAC de la invención
Se realizaron más pruebas de especificidad de las moléculas ImmTAC contra un panel de células normales. En este ejemplo se utilizan las moléculas ImmTAC 2-4 (Figuras 6-8). La secreción de interferón-y (IFN-y) se utilizó como lectura de la activación de las células T.
Los ensayos se llevaron a cabo utilizando un kit IFN-y DuoSet ELISA (R&D Systems, Cat No: DY285) y realizado según las instrucciones del fabricante. En resumen, el IFN-y se diluyó a 10.000 pg/ml y se hicieron diluciones de 2 veces para producir una curva estándar. Se contaron las células diana y se sembraron 10.000 células por pocillo en 10 ul en medio de ensayo. Las moléculas ImmTAC se diluyeron para obtener concentraciones finales de 2 nM y 1 nM en 10 ul por pocillo. También se preparó una muestra de control sin ImmTAC. Las PBMC efectoras se descongelaron y se sembraron a 10.000 células/pocillo en 10 ul. Las placas se incubaron durante 48 h antes de ser reveladas y leídas.

Claims (26)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse específicamente al complejo HLA-A*02 SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) y que comprende un dominio variable de la cadena alfa del TCR y un dominio variable de la cadena beta del TCR, en el que
el dominio variable de la cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad, tal como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 12,
el dominio variable de la cadena beta comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad, tal como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 15, y
la secuencia del dominio variable de la cadena alfa de los residuos de aminoácidos 27-32 (CDR1), 50-57 (CDR2) y 91-107 (CDR3) y la secuencia del dominio variable de la cadena beta de los residuos de aminoácidos 27-31 (CDR1), 49-55 (CDr2) y 93-106 (CDR3) se seleccionan entre las siguientes
Figure imgf000056_0001
2. El TCR de la reivindicación 1 que se une al complejo HLA-A*02 SLLMWITQC (SEQ ID NO: 1) Complejo con una afinidad superior a 50 pM, opcionalmente con una afinidad de 1 pM a 50 nM.
3. El TCR como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable de la cadena alfa y el dominio variable de la cadena beta se seleccionan entre las secuencias de aminoácidos de:
Figure imgf000056_0002
4. El TCR como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, que es un heterodímero alfa-beta, que tiene una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta.
5. El TCR como se reivindica en la reivindicación 4, en el que las secuencias de dominio constante de las cadenas alfa y beta se modifican por truncamiento o sustitución para eliminar el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2.
6. El TCR como se reivindica en la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que la(s) secuencia(s) del dominio constante de la cadena alfa y/o beta se modifican mediante la sustitución de residuos de cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro no nativo entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.
7. El TCR como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, que está en formato de cadena simple del tipo Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp, en el que Va, y Vp son regiones variables del TCR a y p respectivamente, Ca, y Cp son regiones constantes del t Cr a y p respectivamente, y L es una secuencia enlazadora.
8. El TCR como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, asociado con una etiqueta detectable, un agente terapéutico o una fracción modificadora de la PK.
9. Una fusión TCR anti-CD3 que comprende el TCR de cualquier reivindicación anterior y un anticuerpo anti-CD3 enlazado covalentemente al terminal C o N de la cadena alfa o beta del TCR.
10. La fusión TCR anti-CD3 de la reivindicación 9, que comprende un dominio variable de cadena alfa seleccionado de la SEQ ID NO: 7 y 12 y que comprende un dominio variable de la cadena beta seleccionado de la SEQ ID NO: 15 y 18.
11. La fusión TCR anti-CD3 de la reivindicación 10, en la que la cadena beta está enlazada a la secuencia del anticuerpo anti-CD3 mediante una secuencia enlazadora, opcionalmente en la que la secuencia enlazadora se selecciona del grupo que consiste en GGGGS (SEQ ID NO: 24), GGGSG (SEQ ID NO: 25), GGSGG (SEQ ID NO: 26), GSGGG (SEQ ID NO: 27), GSGGGP (SEQ ID NO: 28), GGEPS (SEQ ID NO: 29), GGEGGGP (SEQ ID NO: 30), y GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 31).
12. La fusión TCR anti-CD3 de la reivindicación 11, que comprende una cadena alfa y beta que tiene al menos un 90 % de identidad, tal como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, con las secuencias de aminoácidos como se establece en la tabla siguiente:
Figure imgf000057_0001
13. La fusión TCR anti-CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende un dominio variable de cadena alfa que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 y un dominio variable de la cadena beta que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y en el que la cadena beta está enlazada a un anticuerpo anti-CD3 a través de una secuencia enlazadora, opcionalmente en el que la cadena beta está enlazada a un anticuerpo anti-CD3 a través de la secuencia enlazadora de la SEQ ID NO: 24 o en el que la cadena alfa está unida a un anticuerpo anti-CD3 mediante una secuencia enlazadora.
14. La fusión TCR anti-CD3 de la reivindicación 13, que tiene la cadena alfa de la SEQ ID NO: 32 y la cadena beta de la SEQ ID NO: 33, o la cadena alfa de la SEQ ID NO: 37 y la cadena beta de la SEQ ID NO: 38.
15. Un ácido nucleico que codifica un TCR como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.
16. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 15.
17. Una célula de origen no natural y/o purificada y/o de ingeniería, tal como una célula T, que presenta un TCR como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.
18. Una célula, tal como una célula T, que alberga
(a) un vector de expresión del TCR como se reivindica en la reivindicación 16 en un marco de lectura abierto único, o dos marcos de lectura abiertos distintos que codifican la cadena alfa y la cadena beta respectivamente; o (b) un primer vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.
19. Una composición farmacéutica que comprende un TCR como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, el ácido nucleico de la reivindicación 15 o una célula como se reivindica en la reivindicación 17 o 18, junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
20. El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, el ácido nucleico de la reivindicación 15 o la célula de la reivindicación 17 o 18 para su uso en medicina, en un sujeto humano.
21. El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, el ácido nucleico de la reivindicación 15 o la célula de la reivindicación 17 o 18 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto humano.
22. El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, el ácido nucleico de la reivindicación 15 o la célula de la reivindicación 17 o 18 para su uso en el tratamiento de un tumor sólido que exprese NYESO-1 o LAGE-1A en un sujeto humano, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en un sujeto humano, tumor de vejiga en un sujeto humano, melanoma en un sujeto humano o sarcoma sinovial en un sujeto humano.
23. El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, el ácido nucleico de la reivindicación 15 o la célula de la reivindicación 17 o 18 para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el sujeto humano es un sujeto del subtipo HLA-A*02.
24. Una formulación inyectable adecuada para administrar a un sujeto humano que comprende el TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la fusión TCR anti-CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, el ácido nucleico de la reivindicación 15, la célula de la reivindicación 17 o 18 o la composición farmacéutica de la reivindicación 19.
25. La formulación inyectable de la reivindicación 24, para su uso en medicina.
26. La formulación inyectable para su uso de acuerdo con la reivindicación 25, que se administra por inyección, tal como vía intravenosa o por inyección intratumoral directa.
27. Un procedimiento para producir el TCR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la fusión TCR anti-CD3 de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 que comprende a) mantener una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 18 en condiciones óptimas para la expresión del ácido nucleico y b) aislar el t Cr o la fusión TCR anti-CD3 codificada por el ácido nucleico.
28. El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la fusión TCR anti-CD3 como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, el ácido nucleico de la reivindicación 15 o la célula de la reivindicación 17 o 18 para su uso de acuerdo con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en combinación con un agente antineoplásico.
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