ES2942765T3 - Receptores de células T - Google Patents

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ES2942765T3 ES18738201T ES18738201T ES2942765T3 ES 2942765 T3 ES2942765 T3 ES 2942765T3 ES 18738201 T ES18738201 T ES 18738201T ES 18738201 T ES18738201 T ES 18738201T ES 2942765 T3 ES2942765 T3 ES 2942765T3
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Nicole Joy Bedke
Lucie Bouard
Stephen Harper
Nathaniel Liddy
Tara Mahon
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Abstract

La presente invención se refiere a receptores de células T (TCR) que se unen al péptido SLLQHLIGL restringido por HLA-A*02 (SEQ ID NO: 1) derivado del antígeno de cáncer de línea germinal PRAME. Dichos TCR pueden comprender mutaciones no naturales dentro de los dominios variables alfa y/o beta en relación con un PRAME TCR nativo. Los TCR de la invención son particularmente adecuados para su uso como nuevos reactivos inmunoterapéuticos para el tratamiento de enfermedades malignas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de células T
La presente invención se refiere a receptores de células T (TCR) que se unen al péptido restringido HLA-A*02 SLLQHLIGL (SEC ID NO: 1) derivado del antígeno cancerígeno de la línea germinal PRAME. Dichos TCR comprenden mutaciones no naturales dentro de los dominios variables alfa y/o beta en relación con un TCR PRAMEnativo. Los TCR de la invención son particularmente adecuados para su uso como novedosos reactivos inmunoterapéuticos para el tratamiento de enfermedades malignas.
Antecedentes de la invención
Los receptores de células T (TCR) son expresados naturalmente por las células T CD4+ y CD8+. Los TCR están diseñados para reconocer antígenos peptídicos cortos que se muestran en la superficie de las células presentadoras de antígenos en complejo con las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad ("Major Histocompatibility Complex", MHC) (en los seres humanos, las moléculas del MHC también se conocen como antígenos leucocitarios humanos, "Human Leukocyte Antigens", o HLA) (Davis, et al. (1998), Annu. Rev. Immunol., 16: 1998;16:523-44). Los linfocitos TCD8+, que también se denominan linfocitos T citotóxicos, tienen TCR que reconocen específicamente péptidos unidos a moléculas MHC de clase I. Los linfocitos TCD8+ son generalmente responsables de encontrar y mediar en la destrucción de las células enfermas, incluidas las cancerosas y las infectadas por virus. La afinidad de los TCR específicos del cáncer en el repertorio natural por el antígeno correspondiente suele ser baja como resultado de la selección tímica, lo que significa que las células cancerosas escapan con frecuencia a la detección y destrucción. Los nuevos enfoques inmunoterapéuticos destinados a facilitar el reconocimiento del cáncer por parte de las células T ofrecen una estrategia muy prometedora para el desarrollo de tratamientos eficaces contra el cáncer.
PRAME o Preferentially Expressed Antigen In Melanoma (antígeno expresado preferentemente en melanoma) se identificó por primera vez como un antígeno que se expresa en exceso en el melanoma (Ikeda et al Immunity. 1997 Feb;6(2):199-208); también se conoce como CT130, MAPE, OIP-4 y tiene el número de acceso Uniprot P78395. La proteína funciona como represor de la señalización del receptor de ácido retinoico (Epping et al., Cell. 2005 Sep 23;122(6):835-47). El PRAME pertenece a la familia de antígenos codificados por la línea germinal conocidos como antígenos testiculares del cáncer. Los antígenos testiculares del cáncer son dianas atractivas para la intervención inmunoterapéutica, dado que suelen tener una expresión limitada o nula en los tejidos adultos normales. El PRAME se expresa en varios tumores sólidos, así como en leucemias y linfomas (Doolan et al Breast Cancer Res Treat.
2008 May;109(2):359-65; Epping et al Cancer Res. 2006 Nov 15;66(22):10639-42 Ercolak et al Breast Cancer Res Treat. 2008 mayo;109(2):359-65; Matsushita et al Leuk Lymphoma. 2003 Mar;44(3):439-44 Mitsuhashi et al Int. J Hematol. 2014; 100(1):88-95y Proto-Sequeire et al Leuk Res. 2006 Nov;30(11):1333-9 Szczepanski et al Oral Oncol.
2013 Feb;49(2):144-51 Van Baren et al Br J Haematol. 1998 Sep 24;102(5):1376-9). Las terapias dirigidas a PRAME de las invenciones pueden ser particularmente adecuadas para el tratamiento de cánceres, incluidos, entre otros, los cánceres de pulmón (NSCLC y SCLC), mama (incluido el triple negativo), ovario, endometrio, esófago, vejiga y cabeza y cuello.
Los péptidos SLLQHLIGL de (SEC ID NO: 1) corresponde a los aminoácidos 425-433 de la proteína PRAME de longitud completa y se presenta en la superficie celular en complejo con HLA-A*02 (Kessler et al., J Exp Med. 2001 Ene 1;193(1):73-88). Este complejo péptido-HLA constituye una diana útil para la intervención inmunoterapéutica basada en el TCR.
La identificación de secuencias TCR particulares que se unen al SLLQHLIGL (SEC ID NO: 1) El complejo HLA-A*02 con alta afinidad y especificidad es ventajoso para el desarrollo de nuevas inmunoterapias. Los TCR terapéuticos se pueden utilizar, por ejemplo, como agentes solubles dirigidos a la administración de agentes citotóxicos en el tumor o a la activación de funciones inmunitarias efectoras contra las células tumorales (Lissin, et al., "High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions" en Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges", 2013. S. R. Schmidt, Wiley; Boulter et al., Protein Eng. 2003 Sep;16(9):707-11; Liddy, et al., Nat Med. 2012 Jun;18(6):980-7), o bien se pueden utilizar para modificar células T para la terapia adoptiva (Fesnak et al., Nat Rev Cancer. 2016 Ago; 23; 16(9):566-81).
Los TCR que se unen a SLLQHLIGL (SEC ID NO: 1) en complejo con HLA-A*02 (Amir et al., Clin Cancer Res. 2011 Sep 1;17(17):5615-25 y Griffioen et al., Clin Cancer Res. 2006 Mayo 15;12(10):3130-6, WO2016142783). Sin embargo, estos TCR no han sido modificados para que se unan al antígeno diana con mayor afinidad que el TCR natural. Como se explica más adelante, la afinidad antigénica suprafisiológica es una característica deseable para un TCR terapéutico, cuya producción no es sencilla, especialmente cuando se equilibra con otras características deseables, tales como la especificidad.
Las secuencias del TCR definidas en el presente documento se describen con referencia a la nomenclatura IMGT, que es ampliamente conocida y accesible para quienes trabajan en el campo del TCR. Por ejemplo, véase: LeFranc y LeFranc (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc (2011), Cold Spring Harb Protoc., 2011(6): 595-603 Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Apéndice 10O; y Lefranc (2003), Leukemia, 17(1): 260266). Brevemente, las ap de TCR están formadas por dos cadenas unidas por disulfuro. Por lo general, se considera que cada cadena (alfa y beta) tiene dos dominios, a saber, uno variable y otro constante. Una región corta de unión conecta los dominios variable y constante y se considera normalmente parte de la región variable alfa. Además, la cadena beta suele contener una región corta de diversidad junto a la región de unión, que también suele considerarse parte de la región variable beta.
El dominio variable de cada cadena está situado N-terminalmente y comprende tres Regiones Determinantes de la Complementariedad (las CDR) embebidas en una secuencia marco (FR). Las CDR comprenden el sitio de reconocimiento para la unión del péptido-MHC. Existen varios genes que codifican las regiones variables de la cadena alfa (Va) y varios genes que codifican las regiones variables de la cadena beta (Vp), que se distinguen por su marco, las secuencias CDR1 y CDR2, y por una secuencia CDR3 parcialmente definida. Los genes Va y Vp se denominan en la nomenclatura del IMGT con el prefijo TRAV y TRBV, respectivamente (Folch y Lefranc (2000), Exp. Clin. Immunogenet., 17(1): 42-54; Scaviner y Lefranc (2000), Exp. Clin. Immunogenet., 17(2): 83-96; LeFranc y LeFranc (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Asimismo, existen varios genes de unión o J, denominados TRAJ o TRBJ, para la cadena alfa y beta, respectivamente, y para la cadena beta existe un gen de diversidad o D denominado Tr BD (Folch y Lefranc (2000), Exp. Clin. Immunogenet., 17(2): 107-114; Scaviner y Lefranc (2000), Exp. Clin. Immunogenet., 17(2): 97-106 LeFranc y LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). La enorme diversidad de cadenas de receptores de células T es el resultado de redisposiciones combinatorias entre los diversos genes V, J y D, que incluyen variantes alélicas, y de la diversidad de uniones (Arstila, et al. (1999), Science, 286(5441): 958-961; Robins et al. (2009), Blood, 114(19): 4099-4107). Las regiones constantes, o C, de las cadenas TCR alfa y beta se denominan TRAC y TRBC, respectivamente (Lefranc (2001), Curr. Protoc. Immunol., apéndice 1: Anexo 10).
Los inventores de la presente solicitud han encontrado sorprendentemente nuevos TCR que son capaces de unirse al complejo SLLQHLlGL-HLA-A*02 con alta afinidad y especificidad. Dichos TCR se diseñan a partir de una secuencia de andamiaje adecuada en la que se introducen una serie de mutaciones. Los TCR de la invención tienen un perfil particularmente adecuado para uso terapéutico. En general, la identificación de estos TCR no es sencilla y suele presentar una elevada tasa de desgaste.
En primer lugar, los expertos deben identificar una secuencia de partida o de andamiaje adecuada. Normalmente, estas secuencias se obtienen de fuentes naturales, por ejemplo, de células T que responden al antígeno extraídas de la sangre de un donante. Dada la rareza de las células T específicas para el cáncer en el repertorio natural, a menudo es necesario examinar a muchos donantes, por ejemplo 20 o más, antes de encontrar una célula T que responda. El proceso de selección puede durar varias semanas o meses, e incluso cuando se encuentra una célula T que responde, puede ser inadecuada para su uso inmunoterapéutico. Por ejemplo, la respuesta puede ser demasiado débil y/o puede no ser específica para el antígeno diana. Alternativamente, puede no ser posible generar una población clonal de células T, ni expandir o mantener una determinada línea de células T para producir suficiente material para identificar las secuencias de cadena TCR correctas. Las secuencias de TCR que son adecuadas como secuencias de partida o de andamiaje deben tener una buena afinidad por el complejo diana de péptido-HLA, por ejemplo 200 pM o más, demostrar un alto nivel de especificidad por la diana, por ejemplo, una unión relativamente débil o nula a complejos de péptido-HLA alternativos, ser modificables para su uso en bibliotecas de presentación, tal como la presentación por fagos, y poder ser replegadas y purificadas con un alto rendimiento. Dada la naturaleza degenerativa del reconocimiento del TCR, es excepcionalmente difícil, incluso para los profesionales expertos, poder determinar si un TCR particular tiene un perfil de especificidad que lo haría elegible para la modificación para un uso terapéutico (Wooldridge, et al., J Biol Chem. 2012 Ene 6;287(2):1168-77).
El siguiente desafío es diseñar el TCR para que tenga una mayor afinidad hacia el antígeno diana, conservando al mismo tiempo características deseables como la especificidad y el rendimiento. Los TCR, tal y como existen en la naturaleza, tienen una afinidad débil por el antígeno diana (intervalo micromolar bajo) en comparación con los anticuerpos, y los TCR contra antígenos cancerígenos suelen tener un reconocimiento del antígeno más débil que los TCR específicos virales (Aleksic, et al. Eur J Immunol. 2012 Dic;42(12):3174-9). Esta débil afinidad, unida a la regulación negativa del HLA en las células cancerosas, significa que los TCR terapéuticos para la inmunoterapia del cáncer requieren una modificación para aumentar su afinidad por el antígeno diana y para de este modo generar una respuesta más potente. Estos aumentos de afinidad son esenciales para los reactivos solubles basados en el TCR. En dichos casos, las afinidades de unión al antígeno del TCR en el intervalo nanomolar a picomolar y con semividas de unión de varias horas, son deseables. La mejora de la potencia generada por el reconocimiento de antígenos de alta afinidad con un número bajo de epítopos se ejemplifica en las figuras 1e y 1f de Liddy et al. (Liddy, et al., Nat Med. 2012 Jun;18(6):980-7). La maduración por afinidad típicamente implica que los expertos en la técnica tengan que identificar mutaciones específicas y/o combinaciones de mutaciones, incluyendo pero no limitándose a sustituciones, inserciones y/o deleciones, que se pueden hacer a la secuencia del t Cr de partida para aumentar la fuerza de reconocimiento del antígeno. Los procedimientos para identificar las mutaciones de un determinado TCR que confieren una mejora de la afinidad son conocidos en la técnica, por ejemplo, el uso de bibliotecas de presentación (Li et al. (2005), Nat. Biotechnol., 2005 Mar;23(3):349-54; Holler et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Mayo 9;97(10):5387-92). Sin embargo, para producir aumentos significativos en la afinidad de un TCR dado contra una diana determinada, se requiere que los expertos en la técnica seleccionen mutaciones específicas y/o combinaciones de mutaciones de un gran conjunto de alternativas posibles. Las mutaciones específicas y/o las combinaciones de mutaciones que producen aumentos significativos en la afinidad no son predecibles y existe una alta tasa de erosión. En muchos casos puede que no sea posible conseguir un aumento significativo de la afinidad con una secuencia inicial de TCR determinada.
El proceso de maduración por afinidad también debe tener en cuenta la necesidad de mantener la especificidad de antígeno del TCR. El aumento de la afinidad de un TCR por su antígeno diana conlleva un riesgo sustancial de revelar una reactividad cruzada con otras dianas no previstas como resultado de la degeneración inherente al reconocimiento de antígenos por parte del TCR (Wooldridge, et al. (2012), J. Biol. Chem., 287(2): 2012 Ene 6;287(2):1168-77; Wilson, et al., Mol Immunol.2004 Feb;40(14-15):1047-55; Zhao et al., J Immunol. 2007 Nov 1;179(9):5845-54). En un nivel natural de afinidad, el reconocimiento del antígeno de reacción cruzada puede ser demasiado bajo para producir una respuesta. Si un antígeno de reacción cruzada se muestra en células sanas normales, existe una gran posibilidad de que se produzca una unión que no sea a la diana in vivo , lo que se puede manifestar en una toxicidad clínica. De este modo, además de aumentar la fuerza de unión al antígeno, los expertos también deben seleccionar las mutaciones y/o combinaciones de mutaciones que permiten que el TCR mantenga una alta especificidad por el antígeno diana y demuestre un buen perfil de seguridad en las pruebas preclínicas. De nuevo, estas mutaciones y/o combinaciones de mutaciones adecuadas no son predecibles. La tasa de erosión en esta etapa es aún mayor y en muchos casos puede no ser alcanzable en absoluto a partir de una determinada secuencia de partida de TCR.
A pesar de las dificultades descritas anteriormente, los inventores han identificado TCR mutados con una afinidad particularmente alta (intervalo picomolar), y un alto grado de especificidad de antígeno. Dichos TCR demuestran una potente eliminación de células cancerosas PRAME positivas cuando se preparan como reactivos solubles fusionados a una fracción redireccionadora de células T.
Descripción de la invención
La invención se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a SLLQHLIGL (SEC ID NO: 1) Complejo HLA-A*02 y que comprende un dominio variable de la cadena alfa del TCR y un dominio variable de la cadena beta del TCR, cada uno de los cuales comprende FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, donde FR es una región marco y CDR es una región determinante de la complementariedad, en la que
a) las CDR de la cadena alfa tienen las siguientes secuencias:
CDR1 - TISGTDY (SEC ID NO: 39).
CDR2 - GLTSN (SEC ID NO: 40).
CDR3 - CILILGHSGAGSYQLTF (SEC ID NO: 41).
con una o más mutaciones en el mismo, en el que la una o más mutaciones se selecciona de (con referencia a la numeración de SEC ID NO: 2):
Figure imgf000004_0001
y
(b) las CDR de la cadena beta tienen las siguientes secuencias:
CDR1 - LNHDA (SEC ID NO: 42).
CDR2 - SQIVNDF (SEC ID NO: 43).
CDR3 - CASSPWTSGSREQYF (SEC ID NO: 44).
con una o más mutaciones en el mismo, en el que la una o más mutaciones se selecciona de (con referencia a la numeración de SEC ID NO: 2):
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000005_0001
También se desvela pero se abarca en las reivindicaciones un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a SLLQHLIGL (SEC ID NO: 1) en complejo con HLA-A*02 y que comprende un dominio variable de cadena alfa del TCR y/o un dominio variable de cadena beta del TCR, cada uno de los cuales comprende FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 donde FR es una región marco y CDR es una región determinante de la complementariedad, en la que
(a) las CDR de la cadena alfa tienen las siguientes secuencias:
CDR1 -TISGTDY(SEC ID NO: 39).
CDR2 - GLTSN (SEC ID NO: 40).
CDR3 - CILILGHSGAGSYQLTF(SEC ID NO: 41).
opcionalmente con una o más mutaciones en el mismo,
y/o
(b) las CDR de la cadena beta tienen las siguientes secuencias:
CDR1 - LNHDA (SEC ID NO: 42).
CDR2 - SQIVNDF (SEC ID NO: 43).
CDR3 - CASSPWTSGSREQYF (SEC ID NO: 44).
opcionalmente con una o más mutaciones en la misma.
En el TCR del primer aspecto, las regiones marco del dominio variable de cadena alfa pueden comprender las siguientes secuencias marco:
FR1 - los aminoácidos 1-25 de la SEC ID NO: 2
FR2 - los aminoácidos 33-49 de la SEC ID NO: 2
FR3 - los aminoácidos 55-87 de la SEC ID NO: 2
FR4 - los aminoácidos 105-114 de la SEC ID NO: 2
o secuencias respectivas que tengan al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dichas secuencias, y/o
las regiones marco del dominio variable de la cadena beta pueden comprender las siguientes secuencias:
FR1 - los aminoácidos 1-26 de la SEC ID NO: 3
FR2 - los aminoácidos 32-48 de la SEC ID NO: 3
FR3 - los aminoácidos 56-90 de la SEC ID NO: 3
FR4 - los aminoácidos 106-114 de la SEC ID NO: 3
o secuencias respectivas que tengan al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con dichas secuencias.
El término "mutaciones" abarca sustituciones, inserciones y deleciones. Las mutaciones de un TCR parental (o de tipo natural) pueden incluir aquellas que son capaces de aumentar la afinidad de unión (ko y/o semivida de unión) del TCR al complejo SLLQHLIGL-HLA-A*02.
Convencionalmente, se considera que el residuo F55 de la cadena beta forma parte de la región marco 3. Sin embargo, a efectos de la presente invención, el residuo F55 de la cadena beta se considera parte de la CDR2. Las regiones marco de cadena alfa FR1, FR2 y FR3 pueden comprender secuencias de aminoácidos correspondientes a una cadena TRAV 26-2 y/o las regiones marco de cadena beta FR1, FR2 y FR3, pueden comprender secuencias de aminoácidos correspondientes a las de una cadena TRBV19.
La región FR4 puede comprender la región de unión de las cadenas variables alfa y beta (TRAJ y TRBJ, respectivamente).
En la región variable de la cadena alfa del TCR, puede haber una, dos, tres, cuatro o cinco mutaciones en la CDR3 de la cadena alfa seleccionadas entre las siguientes mutaciones, con referencia a la numeración de SEC ID NO: 2:
Figure imgf000006_0003
De este modo, puede haber alguna o todas las mutaciones de la tabla anterior, opcionalmente en combinación con otras mutaciones.
La cadena alfa CDR3 puede comprender al menos una de las siguientes mutaciones (con referencia a la numeración de la SEC ID NO: 2):
Figure imgf000006_0001
Un grupo preferente de mutaciones es el grupo 1. Otro grupo preferente de mutaciones es el grupo 2.
La CDR3 de la cadena alfa puede tener una secuencia seleccionada entre:
Figure imgf000006_0002
Una CDR3 cadena alfa preferente es CILILGHSRAGNYIATF (SEC ID NO: 45). Una CDR3 de cadena alfa preferente es CILILGHSRLGNYIATF (SEC ID NO: 46).
En la región variable de la cadena beta del TCR, puede haber una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez mutaciones en la CDR3 de la cadena beta seleccionadas entre las siguientes mutaciones con referencia a la numeración de SEC ID NO: 3:
Figure imgf000006_0004
Figure imgf000007_0004
De este modo, puede haber alguna o todas las mutaciones de la tabla anterior, opcionalmente en combinación con otras mutaciones.
Las cadenas CDR2 y CDR3 pueden comprender una de las siguientes mutaciones con referencia a la numeración de la SEC ID NO: 3):
Figure imgf000007_0001
Un grupo preferente de mutaciones es el grupo 1. Un grupo preferente de mutaciones es el grupo 9.
La CDR2 de la cadena beta puede tener una secuencia seleccionada entre:
Figure imgf000007_0003
Una CDR2 de cadena beta preferente es SQIMGDE (SEC ID NO: 48).
La CDR3 de la cadena beta puede tener una secuencia seleccionada entre:
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000008_0003
Una CDR3 de cadena beta preferente es CASSWWTGGASPISF (SEC ID NO: 51). Una CDR3 de cadena beta preferente es CASSWWTGGASPIRF (SEC ID NO: 58).
Las combinaciones preferentes de CDR2 y CDR3 de la cadena beta son las siguientes:
Figure imgf000008_0002
Una combinación preferente es la combinación 1. Otra combinación preferente es la combinación 9.
En una realización preferente, las secuencias CDR de las cadenas alfa y beta del TCR se seleccionan entre:
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Una combinación preferente es la combinación 1. Una combinación preferente es la combinación 17.
La(s) mutación(es) dentro de las CDR mejora(n) preferentemente la afinidad de unión del TCR al complejo SLLQHLIGL-HLA-A*02, pero puede(n) conferir adicional o alternativamente otras ventajas tales como estabilidad mejorada en una forma aislada y especificidad mejorada. Las mutaciones en una o más posiciones pueden afectar además, o como alternativa, a la interacción de una posición adyacente con el complejo pMHC cognado, por ejemplo al permitir un ángulo más favorable para la interacción. Las mutaciones pueden incluir aquellas que son capaces de reducir la cantidad de unión no específica, es decir, reducir la unión a antígenos además de la unión a SLLQHLIGL-HLA-A*02. Las mutaciones pueden incluir las que aumentan la eficacia del plegado y/o fabricación. Algunas mutaciones pueden contribuir a cada una de estas características, otras pueden contribuir a la afinidad, pero no a la especificidad, por ejemplo, o a la especificidad, pero no a la afinidad, etc.
Típicamente, se necesitan al menos 5, al menos 10, al menos 15, o más mutaciones CDR en total para obtener TCRs con afinidad pM por el antígeno diana. Pueden ser necesarias al menos 5, al menos 10 o al menos 15 mutaciones CDR en total para obtener TCR con afinidad pM por el antígeno diana. Los TCR con afinidad pM por el antígeno diana son especialmente adecuados como terapéutica soluble. Los TCR para su uso en aplicaciones de terapia adoptiva pueden tener menor afinidad por el antígeno diana y, por tanto, menos mutaciones CDR, por ejemplo, hasta 1, hasta 2, hasta 5 o más mutaciones CDR en total. Los TCR para su uso en aplicaciones de terapia adoptiva pueden tener menor afinidad por el antígeno diana y, por tanto, menos mutaciones CDR, por ejemplo, hasta 1, hasta 2 o hasta 5 mutaciones CDR en total.
Las mutaciones se pueden llevar a cabo además, o como alternativa, fuera de las CDR; dichas mutaciones pueden mejorar la unión y/o la especificidad y/o la estabilidad y/o el rendimiento de una forma soluble purificada del TCR. Por ejemplo, el t Cr de la invención puede, adicional o alternativamente, comprender un dominio variable de cadena alfa, en el que la región variable de cadena alfa FR1 tiene un residuo G en la posición -1 mediante el uso de la numeración de SEC ID NO: 2, es decir, insertado antes de la posición 1. Se descubrió que una G en la posición -1 mejora la eficacia de la escisión de la metionina N-terminal durante la producción en E. coli. Una escisión ineficaz puede ser perjudicial para una terapéutica, dado que puede dar lugar a un producto proteico heterogéneo, y o la presencia de la metionina de iniciación puede ser inmunogénica en humanos.
Preferentemente, el dominio variable de la cadena a del TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98 % o al menos un 99% de identidad con la secuencia de residuos de aminoácidos 1-25, 33-49, 55-87, 105-114 of SEC ID NO: 2. El dominio variable de la cadena p del TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de restos aminoácidos 1-26, 32-48, 56-90, 106-114 of SEC ID NO: 3. Alternativamente, el porcentaje de identidad indicado puede ser sobre las secuencias marco consideradas en su conjunto.
El dominio variable de la cadena alfa puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 6-8 y el dominio variable de la cadena beta puede comprender las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 9-24).
Por ejemplo, el TCR puede comprender los siguientes pares de cadenas alfa y beta.
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Figure imgf000011_0001
Un emparejamiento de cadenas TCR preferente es SEC ID NO: 6 y la SEC ID NO: 9. Un emparejamiento de cadenas TCR preferente es SEC ID NO: 7 y la SEC ID NO: 17.
Dentro del ámbito de la invención están las variantes fenotípicamente silenciosas de cualquier TCR de la invención divulgada en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "variantes fenotípicamente silenciosas" se entiende que se refiere a un TCR que incorpora uno o más cambios de aminoácidos, incluyendo sustituciones, inserciones y deleciones, además de los expuestos anteriormente, cuyo TCR tiene un fenotipo similar al correspondiente TCR sin dichos cambios. A los efectos de esta solicitud, el fenotipo del TCR comprende la afinidad de unión al antígeno (Kd y/o semivida de unión) y la especificidad por el antígeno. Preferentemente, el fenotipo para un TCR soluble asociado con un efector inmunitario incluye la potencia de activación inmunitaria y el rendimiento de purificación, además de la afinidad y especificidad de unión. Una variante fenotípicamente silenciosa puede tener una vida media de Kd y/o unión para el complejo SLLQHLIGL-HLA-A*02 dentro del 50 %, o más preferentemente dentro del 30 %, 25 % o 20 %, de la Kd medida y/o la vida media de unión. vida media del TCR correspondiente sin dicho(s) cambio(s), cuando se mide en condiciones idénticas (por ejemplo, a 25°C y/o en el mismo chip SPR). En el ejemplo 3 se proporcionan además las condiciones adecuadas. Como es sabido por los expertos en la técnica, puede ser posible producir TCR que incorporen cambios en los dominios variables de los mismos en comparación con los detallados anteriormente sin alterar la afinidad de la interacción con el complejo de SLLQHLIGL-HLA-A*02, y/o otras características funcionales. En particular, estas mutaciones silenciosas se pueden incorporar en partes de la secuencia que se sabe que no participan directamente en la unión al antígeno (por ejemplo, las CDR, o partes de las CDR que no entran en contacto con el antígeno peptídico). Dichas variantes están incluidas en el alcance de esta invención.
Las variantes fenotípicamente silenciosas pueden contener una o más sustituciones conservadoras y/o una o más sustituciones toleradas. Por sustituciones toleradas se entienden aquellas sustituciones que no entran en la definición de conservadoras, tal y como se indica a continuación, pero que, sin embargo, son fenotípicamente silenciosas. Los expertos en la técnica saben que diversos aminoácidos tienen propiedades similares y, por tanto, son "conservadores". Uno o más de estos aminoácidos de una proteína, polipéptido o péptido pueden ser sustituidos a menudo por uno o más de estos aminoácidos sin eliminar una actividad deseada de dicha proteína, polipéptido o péptido.
Así, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina pueden sustituirse a menudo entre sí (aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas). De estas posibles sustituciones, se prefiere que la glicina y la alanina se utilicen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y que la valina, la leucina y la isoleucina se utilicen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales alifáticas más grandes que son hidrófobas). Otros aminoácidos que pueden sustituirse a menudo son: la fenilalanina, la tirosina y el triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas); la lisina, la arginina y la histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas); el aspartato y el glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas); la asparagina y la glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales amidas); y la cisteína y la metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales azufradas). Se debe apreciar que las sustituciones de aminoácidos dentro del ámbito de la presente invención se pueden llevar a cabo mediante el uso de aminoácidos de origen natural o no natural. Por ejemplo, en el presente documento se contempla que el grupo metilo de una alanina pueda ser sustituido por un grupo etilo y/o que se lleven a cabo cambios menores en el esqueleto del péptido. Tanto si se utilizan aminoácidos naturales como sintéticos, se prefiere que solo estén presentes los aminoácidos L.
Las sustituciones de esta naturaleza suelen denominarse sustituciones de aminoácidos "conservadoras" o "semiconservadoras". Se desvela en el presente documento un TCR que comprende una secuencia de aminoácidos descrita anteriormente, pero con una o más sustituciones conservadoras y/o una o más sustituciones toleradas en la secuencia, de forma que la secuencia de aminoácidos del TCR tiene al menos un 90 % de identidad, tal como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con el TCR que comprende los aminoácidos 1-114 de SEC ID NO: 2, 6-8, y/o los aminoácidos 1-114 de las SEC ID NOs: 3, 9-24.
La "identidad", tal y como se conoce en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, la identidad también significa el grado de parentesco de la secuencia entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, como se determina por la coincidencia entre las cadenas de dichas secuencias. Aunque existen varios procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias polipeptídicas o dos polinucleotídicas, los procedimientos comúnmente empleados para determinar la identidad están codificados en programas informáticos. Los programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)).
Se puede utilizar un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar las secuencias de aminoácidos. Este programa compara las secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima insertando espacios en cualquiera de las secuencias según corresponda. Es posible calcular la identidad o la similitud de aminoácidos (la identidad más la conservación del tipo de aminoácido) para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. Así, es posible obtener una comparación en la que se encuentran varias regiones de similitud, cada una con una puntuación diferente. Ambos tipos de análisis de identidad se contemplan en la presente invención.
El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos se determina alineando las secuencias para una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir brechas en la primera secuencia para una mejor alineación con la secuencia) y comparando los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes. El "mejor alineamiento" es un alineamiento de dos secuencias que da como resultado el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina por el número de restos aminoácidos o nucleótidos idénticos en las secuencias comparadas (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones * 100).
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse mediante un algoritmo matemático conocido por los expertos en la materia. Un ejemplo de algoritmo matemático para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. 1977: 66: 1-19". Us a , 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. 1977: 66: 1-19". USA, 90:5873-5877. Los programas nBLAST y pBLAST de Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 han incorporado dicho algoritmo. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede llevar a cabo con el programa BLASTn. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias de proteínas se puede llevar a cabo con el programa BLASTp. A fin de obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Como alternativa, se puede utilizar PSI-Blast para llevar a cabo una búsqueda iterada que detecte relaciones lejanas entre las moléculas (id.). Al utilizar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTp y BLASTp). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Los parámetros generales por defecto pueden incluir, por ejemplo, Tamaño de palabra = 3, Umbral de expectativa = 10. Se pueden seleccionar parámetros para ajustar automáticamente secuencias de entrada cortas. Otro ejemplo de algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). El programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias del CGC, ha incorporado un algoritmo de este tipo. Otros algoritmos para el análisis de secuencias conocidos en la técnica son ADvAnCE y ADAM, descritos en Torellis y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5y FASTA descritos en Pearson y Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 1977: 66: 1-19". 85:2444-2448. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y la velocidad de la búsqueda. A fin de evaluar el porcentaje de identidad en la presente divulgación, se utiliza BLASTp con los parámetros predeterminados como metodología de comparación. Además, cuando el porcentaje de identidad recitado proporciona un valor no entero para los aminoácidos (es decir, una secuencia de 25 aminoácidos con un 90% de identidad de secuencia proporciona un valor de "22,5", el valor obtenido se redondea hacia abajo al siguiente número entero, es decir, "22"). Por consiguiente, en el ejemplo proporcionado, una secuencia que tiene 22 coincidencias de 25 aminoácidos está dentro del 90% de identidad de secuencia.
Como será obvio para los expertos en la técnica, puede ser posible truncar las secuencias proporcionadas en el C-terminal y/o N-terminal de las mismas, en 1, 2, 3, 4, 5 o más residuos, sin afectar sustancialmente a las características de unión del TCR. Las secuencias proporcionadas en el C-terminal y/o N-terminal de las mismas pueden estar truncadas o extendidas en 1, 2, 3, 4 o 5 residuos. La presente invención abarca todas estas variantes.
Las mutaciones, incluidas las sustituciones conservadoras y toleradas, las inserciones y las deleciones, se pueden introducir en las secuencias proporcionadas mediante el uso de cualquier procedimiento apropiado, incluidos, pero sin limitarse a ellos, los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la clonación basada en enzimas de restricción o los procedimientos de clonación independiente del acoplamiento (LIC). Estos procedimientos se detallan en muchos de los textos convencionales de biología molecular. Para más detalles sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la clonación basada en enzimas de restricción, véase Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press.. Se puede encontrar más información sobre los procedimientos de clonación independiente de la ligadura (LIC) en Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30­ 6. Las secuencias de TCR proporcionadas por la invención pueden obtenerse a partir de la síntesis en estado sólido, o cualquier otro procedimiento apropiado conocido en la técnica.
Los TCR de la invención tienen la propiedad de unir el complejo SLLQHLIGL-HLA-A*02 complex. Los TCR de la invención demuestran un alto grado de especificidad para el complejo SLLQHLIGL-HLA-A*02 y, por lo tanto, son particularmente adecuados para uso terapéutico. La especificidad en el contexto de los TCR de la invención se refiere a su capacidad para reconocer las células diana HLA-A*02 que son positivas al antígeno, mientras que tienen una capacidad mínima para reconocer las células diana HLA-A*02 que son negativas al antígeno.
La especificidad se puede medir in vitro, por ejemplo, en ensayos celulares tales como los descritos en los Ejemplos 6, 7 y 8. A fin de analizar la especificidad, los t Cr pueden estar en forma soluble y/o se pueden fusionar con un efector inmunológico y/o se pueden expresar en la superficie de las células, tales como las células T La especificidad se puede determinar por medio de la medición del nivel de activación de las células T en presencia de un TCR y de células diana. El reconocimiento mínimo de células diana negativas al antígeno se define como un nivel de activación de células T inferior al 20 %, preferiblemente inferior al 10 %, preferiblemente inferior al 5 %, y lo más preferiblemente inferior al 1 % del nivel producido en presencia de células diana positivas al antígeno, cuando se mide en las mismas condiciones y a una concentración de TCR terapéuticamente pertinente. Para los TCR solubles de la invención asociados con un efector inmunitario, una concentración terapéuticamente pertinente se puede definir como una concentración de TCR de 10'9 M o inferior y/o una concentración de hasta 100, preferentemente hasta 1000 veces mayor que el valor de CE50 correspondiente. Preferentemente, para los TCR solubles asociados a un efector inmunitario existe al menos una diferencia de 100 veces en la concentración requerida para la activación de células T contra células positivas al antígeno en relación con células negativas al antígeno. Las células positivas al antígeno se pueden obtener por pulsión de péptidos mediante el uso de una concentración de péptidos adecuada para obtener un nivel de presentación de antígenos comparable al de las células cancerosas (por ejemplo, 10-9 M de péptido, tal como se describe en Bossi et al. (2013), Oncoimmunol. 1, 2(11):e26840) o, pueden presentar naturalmente dicho péptido. Preferiblemente, tanto las células positivas al antígeno como las negativas al antígeno son células humanas. Preferiblemente, las células positivas al antígeno son células cancerosas humanas. Las células negativas al antígeno incluyen preferiblemente las derivadas de tejidos humanos sanos.
La especificidad se puede referir además, o como alternativa, a la capacidad de un TCR para unirse a un SLLQHLIGL (SEC ID NO: 1) y HLA-A*02 y no a un panel de complejos de péptido-HLA alternativos. Esto puede determinarse, por ejemplo, mediante el procedimiento Biacore del ejemplo 3. Dicho panel puede contener al menos 5, y preferiblemente al menos 10 complejos de péptido-HLA -A*02 alternativos. Los péptidos alternativos pueden compartir un bajo nivel de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1 y puede presentarse de forma natural. Los péptidos alternativos se pueden derivar preferentemente de proteínas expresadas en tejidos humanos sanos. La unión del TCR al complejo de SLLQHLIGL-HLA-A*02 puede ser al menos 2 veces mayor que a otros complejos de HLA y péptidos presentados de forma natural, más preferentemente al menos 10 veces, o al menos 50 veces o al menos 100 veces mayor, incluso más preferentemente al menos 400 veces mayor.
Un enfoque alternativo o adicional para determinar la especificidad del TCR puede ser la identificación del motivo de reconocimiento del péptido del TCR mediante el uso de mutagénesis secuencial, por ejemplo, la exploración de alanina. Los restos que forman parte del motivo de unión son los que no se pueden sustituir. Las sustituciones no permitidas se pueden definir como aquellas posiciones del péptido en las que la afinidad de unión del TCR se reduce al menos en un 50 %, o preferentemente al menos en un 80 % en relación con la afinidad de unión del péptido no mutado. Este enfoque se describe con más detalle en Cameron et al. (2013), Sci. Transl. Med., 7 de agosto de 2013, 5(197): 197ra103; y el documento WO2014096803. En este caso, la especificidad del TCR puede determinarse identificando péptidos con motivos alternativos, en particular péptidos con motivos alternativos en el proteoma humano, y analizando la unión de estos péptidos al TCR. La unión del TCR a uno o más péptidos alternativos puede indicar una falta de especificidad. En este caso, puede ser necesario realizar más pruebas de especificidad del TCR mediante ensayos celulares.
Los TCR de la invención pueden tener un perfil de seguridad ideal para su uso como reactivos terapéuticos. En este caso, los TCR pueden estar en forma soluble y pueden estar preferiblemente fusionados a un efector inmunológico. Los efectores inmunitarios adecuados incluyen, entre otros, citocinas tales como IL-2 e IFN-y; superantígenos y mutantes de los mismos; quimiocinas tales como IL-8, factor plaquetario 4, proteína estimulante del crecimiento del melanoma; anticuerpos, incluidos fragmentos, derivados y variantes de los mismos, que se unen a antígenos de células inmunitarias tales como células T o células NK (por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28 o anti-CD16); y activadores del complemento. Un perfil de seguridad ideal significa que, además de demostrar una buena especificidad, los TCR de la invención pueden haber superado otras pruebas preclínicas de seguridad. Los ejemplos de estas pruebas incluyen ensayos de sangre total para confirmar la liberación mínima de citoquinas en presencia de sangre total y, por tanto, el bajo riesgo de causar un síndrome de liberación de citoquinas potencial in vivo, y las pruebas de alorreactividad para confirmar el bajo potencial de reconocimiento de tipos alternativos de HLA.
Los TCR de la invención pueden ser susceptibles de una purificación de alto rendimiento, particularmente los TCR de formato soluble. El rendimiento se puede determinar en base a la cantidad de material retenido durante el proceso de purificación (es decir, la cantidad de material correctamente plegado obtenida al final del proceso de purificación en relación con la cantidad de material solubilizado obtenido antes del nuevo plegado), y o el rendimiento se puede basar en la cantidad de material correctamente plegado obtenida al final del proceso de purificación, en relación con el volumen de cultivo original. Un alto rendimiento significa más del 1 %, o más preferiblemente más del 5 % o un rendimiento superior. Un alto rendimiento significa más de 1 mg/ml, o más preferentemente más de 3 mg/ml, o más de 5 mg/ml, o un rendimiento superior.
Los TCR de la invención preferentemente tienen una Kd para el complejo SLLQHLIGL -HLA-A*02 mayor que (es decir, más fuerte que) el TCR no mutado, por ejemplo en el intervalo de 1 pM a 100 pM. En un aspecto, los TCR de la invención tienen una Kd para el complejo de aproximadamente (es decir, /- 10 %) de 1 pM a aproximadamente 400 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1000 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 pM. Dichos TCR pueden además, o alternativamente, tener una semivida de unión (T1^ ) para el complejo en el intervalo de aproximadamente 1 min a aproximadamente 60 h, de aproximadamente 20 min a aproximadamente 50 h, o de aproximadamente 2 h a aproximadamente 35 h. En una realización particularmente preferente, los TCR de la invención tienen una Kd para el complejo SLLQHLIGL -HLA-A*02 de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 pM y/o una semivida de unión de aproximadamente 2 h a aproximadamente 35 h. Esta alta afinidad es preferente para los TCR en formato soluble cuando se asocian con agentes terapéuticos y/o etiquetas detectables. En otro aspecto, los TCR de la invención pueden tener una KD para el complejo de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 200 pM), o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 pM y/o una vida media de unión para el complejo de aproximadamente 3 seg a unos 12 min. Dichos TCR pueden ser preferibles para aplicaciones de terapia adoptiva.
Los procedimientos para determinar la afinidad de unión (inversamente proporcional a la constante de equilibrio Kd) y la vida media de unión (expresada como T1^ ) son conocidos por los expertos en la técnica. En una realización preferente, la afinidad de unión y la semivida de unión se determinan mediante el uso de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) o Interferometría de Biocapa (BLI), por ejemplo mediante el uso de un instrumento BIAcore o un instrumento Octet, respectivamente. En el Ejemplo 3 del presente documento se proporciona un procedimiento preferente. Se apreciará que al duplicar la afinidad de un TCR se reduce a la mitad la Kd. La T1^ se calcula como In2 dividido por la constante de disociación (koff). Por lo tanto, la duplicación de T ^ resulta en una reducción a la mitad de la koff. Los valores de KD y koff para los TCR se miden normalmente para las formas solubles del TCR, es decir, aquellas formas que están truncadas para eliminar los restos del dominio citoplasmático y transmembrana. Para tener en cuenta la variación entre mediciones independientes, y en particular para interacciones con tiempos de disociación superiores a 20 horas, la afinidad de unión y/o la semivida de unión de un TCR dado se pueden medir varias veces, por ejemplo 3 o más veces, mediante el uso del mismo protocolo de ensayo, y se toma una media de los resultados. Para comparar los datos de unión entre dos muestras (es decir, dos TCR diferentes y/o dos preparaciones del mismo TCR) es preferente que las mediciones se lleven a cabo mediante el uso de las mismas condiciones de ensayo (por ejemplo, temperatura), tales como las descritas en el Ejemplo 3.
Ciertos TCR preferentes de la invención tienen una afinidad de unión y/o una semivida de unión para el complejo de SLLQHLIGL-HLA-A*02 sustancialmente mayor que la del TCR nativo. El aumento de la afinidad de unión de un TCR nativo suele reducir la especificidad del TCR por su ligando de péptido-MHC, y esto se demuestra en Zhao et al. (2007), J. Immunol., 179:9, 5845-5854. Sin embargo, dichos TCR de la invención siguen siendo específicos para el complejo de SLLQHLIGL-HLA-A*02, a pesar de tener una afinidad de unión sustancialmente mayor que el TCR nativo.
Ciertos TCR preferentes son capaces de generar una respuesta de células T muy potente in vitro contra las células positivas al antígeno, en particular aquellas células que presentan niveles bajos de antígeno típicos de las células cancerosas (es decir, del orden de 5 a 100, por ejemplo, 50 antígenos por célula).(Bossi et al. (2013), Oncoimmunol., 1, 2(11):e26840; Purbhoo et al. (2006). J. Immunol., 176(12): 7308-7316). Dichos TCR pueden estar en forma soluble y unidos a un efector inmunológico, tal como un anticuerpo anti-CD3. La respuesta de las células T que se mide puede ser la liberación de marcadores de activación de las células T, tales como el interferón y o la granzima B, o la eliminación de células diana, u otra medida de activación de las células T, tal como la proliferación de células T. Preferentemente, una respuesta altamente potente es aquella con un valor de CE50 en el intervalo de pM, más preferentemente, 100 pM o inferior.
Los TCR de la invención pueden ser heterodímeros ap. Los TCR heterodiméricos alfa-beta de la invención suelen comprender una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y/o una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta. Los dominios constantes pueden ser de longitud completa, lo que significa que los dominios extracelulares, transmembrana y citoplasmáticos están presentes, o pueden estar en formato soluble (es decir, sin dominios transmembrana o citoplasmáticos). Uno o ambos de los dominios constantes pueden contener además otras mutaciones, sustituciones o deleciones en relación con las secuencias nativas TRAC y/o TRBC1/2. El término TRAC y TRBC1/2 engloba las variantes polimorfas naturales, por ejemplo N a K en la posición 4 de TRAC (Bragado et al., Int. Immunol., febrero de 1994, 6(2):223-230).
Para los TCR solubles de la invención, las secuencias de dominio constante de las cadenas alfa y beta se pueden modificar por medio de truncamiento o sustitución para eliminar el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2. Las secuencias del dominio constante de la cadena alfa y/o beta pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los residuos de los respectivos dominios constantes, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 03/020763. En una realización preferente las secuencias del dominio constante de la cadena alfa y/o beta pueden ser modificadas por medio de la sustitución de restos cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del TCR. TRBC1 o TRBC2 pueden incluir además una mutación de cisteína a alanina en la posición 75 del dominio constante y una mutación de asparagina a ácido aspártico en la posición 89 del dominio constante. Uno o ambos dominios constantes extracelulares presentes en un heterodímero ap de la invención pueden estar truncados en el terminal C o en los terminales C, por ejemplo hasta 15, o hasta 10 o hasta 8 o menos aminoácidos. Uno o ambos dominios constantes extracelulares presentes en un heterodímero ap de la invención pueden estar truncados en el terminal C o en los terminales C, por ejemplo hasta 15, o hasta 10 o hasta 8 o menos aminoácidos. El extremo C terminal del dominio constante extracelular de la cadena alfa puede estar truncado en 8 aminoácidos. Los TCR solubles se asocian preferentemente con agentes terapéuticos y/o etiquetas detectables Los dominios constantes de un TCR ap heterodimérico pueden ser de longitud completa, teniendo dominios transmembrana y citoplasmáticos. Dichos TCR pueden contener un enlace disulfuro correspondiente al que se encuentra en la naturaleza entre los respectivos dominios constantes alfa y beta. Además, o alternativamente, puede haber un enlace disulfuro no nativo entre los dominios constantes extracelulares. Dichos enlaces disulfuro no nativos se describen además en los documentos WO03020763 y W006000830. El enlace disulfuro no nativo puede estar entre la posición Thr 48 de TRAC y la posición Ser 57 de TRBC1 o TRBC2. Uno o ambos dominios constantes pueden contener una o más mutaciones sustituciones o deleciones relativas a las secuencias nativas TRAC y/o TRBC1/2. Los TCR con dominios constantes de longitud completa son preferentes para su uso en terapia adoptiva. Los TCR de la invención pueden estar en formato monocatenario. Los formatos monocatenarios única incluyen, entre otros, los polipéptidos de TCR ap de los tipos Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp o Va-Va-L-Vp-Cp, en los que Va y Vp son regiones variables de a y p del TCR, respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes de a y p del TCR, respectivamente, y L es una secuencia conectora (Weidanz et al. (1998), J. Immunol. Methods., 1 de diciembre, 221(1-2):59-76; Epel et al. (2002), Cancer Immunol. Immunother., noviembre, 51(10):565-573; documento WO 2004/033685; documento WO9918129). Cuando estén presentes, uno o ambos dominios constantes pueden ser de longitud completa, o pueden estar truncados y/o contener mutaciones como se describe anteriormente. Preferentemente, los TCR de cadena simple son solubles. En ciertas realizaciones, los TCR monocatenarios de la invención pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los restos de los respectivos dominios constantes, como se describe en el documento WO 2004/033685. Los TCR monocatenarios se describen además en el documento WO2004/033685; documento WO98/39482; documento WO01/62908; Weidanz et al. (1998), J. Immunol. Methods, 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(10): 4759­ 4763; Schodin (1996), Mol. Immunol., 33(9): 819-829).
La invención también incluye partículas que muestran los TCR de la invención y la inclusión de dichas partículas dentro de una biblioteca de partículas. Dichas partículas incluyen, pero no se limitan a fagos, ribosomas de levadura o células de mamíferos. Los procedimientos de producción de tales partículas y bibliotecas son conocidos en la técnica (por ejemplo, véase el documento W02004/044004; documento WO01/48145; Chervin et al. (2008), J. Immuno. Methods, 339.2: 175-184).
Los TCRs solubles de la invención son útiles para suministrar etiquetas detectables o agentes terapéuticos a las células presentadoras de antígenos y a los tejidos que contienen células presentadoras de antígenos. Por lo tanto, se pueden asociar (covalentemente o de otro modo) con un marcador detectable (con fines de diagnóstico en los que el TCR se usa para detectar la presencia de células que presentan el antígeno afín); y/o un agente terapéutico; y/o un resto modificador de PK.
Entre los ejemplos de restos modificadores de PK se encuentran, pero no se limitan, entre otros, el PEG (Dozier et al. (2015), Int. J. Mol. Sci., 28 de octubre, 16(10):25831-25864; y Jevsevar et al. (2010), Biotechnol J., enero, 5(1):113-128), la PASilación (Schlapschy et al. (2013), Protein Eng. Des. Sel., agosto, 26(8):489-501), la albúmina, y los dominios de unión de albúmina (Dennis et al. (2002), J. Biol. Chem., 20 de septiembre, 277(38):35035-35043) y/o polipéptidos no estructurados (Schellenberger et al. (2009), Nat. Biotechnol., diciembre, 27(12):1186-1190). Otras moléculas modificadoras de la PK incluyen fragmentos Fc de anticuerpos.
Las etiquetas detectables con fines de diagnóstico incluyen, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácido nucleico y reactivos de contraste.
Para algunos propósitos, los TCRs de la invención pueden ser agregados en un complejo que comprende varios TCRs para formar un complejo TCR multivalente. Hay una serie de proteínas humanas que contienen un dominio de multimerización que puede utilizarse en la producción de complejos TCR multivalentes. Por ejemplo, el dominio de tetramerización de p53, que se ha utilizado para producir tetrámeros de fragmentos de anticuerpos scFv que mostraron una mayor persistencia en el suero y una tasa de desactivación significativamente menor en comparación con el fragmento scFv monomérico (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). La hemoglobina también tiene un dominio de tetramerización que podría utilizarse para este tipo de aplicaciones. Un complejo de TCR multivalente de la invención puede tener una capacidad de unión mejorada para el complejo en comparación con un heterodímero de receptor de células T o de tipo salvaje no multimérico de la invención. Así, los complejos multivalentes de TCRs de la invención también se incluyen dentro de la invención. Dichos complejos TCR multivalentes de acuerdo con la invención son particularmente útiles para rastrear o direccionar células que presentan antígenos particulares in vitro o in vivo, y también son útiles como intermedios para la producción de otros complejos TCR multivalentes que tienen tales usos.
Los agentes terapéuticos que se pueden asociar a los TCR de la invención incluyen inmunomoduladores y efectores, compuestos radiactivos, enzimas (perforina por ejemplo) o agentes quimioterapéuticos (cis-platino por ejemplo). Para asegurar que los efectos tóxicos se ejercen en el lugar deseado, la toxina podría estar dentro de un liposoma unido al TCR para que el compuesto se libere lentamente. Esto evitará los efectos perjudiciales durante el transporte en el cuerpo y garantizará que la toxina tenga el máximo efecto después de la unión del TCR a las células presentadoras de antígenos pertinentes.
Los ejemplos de agentes terapéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a:
• agentes citotóxicos de molécula pequeña, es decir, compuestos con capacidad para matar células de mamíferos que tienen un peso molecular inferior a 700 daltons. Estos compuestos también podrían contener metales tóxicos capaces de tener un efecto citotóxico. Además, se debe entender que estos agentes citotóxicos de molécula pequeña también incluyen profármacos, es decir, compuestos que se descomponen o se convierten en condiciones fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Los ejemplos de estos agentes son cisplatino, derivados de la maytansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecán, melfalán, mitoxantrona, sorfimer sódico-fotofrina II, temozolomida, topotecán, trimetreato 27arbur27ato, auristatina E, vincristina y doxorubicina;
• citotoxinas peptídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con capacidad para matar células de mamíferos. Por ejemplo, la ricina, la toxina diftérica, la exotoxina bacteriana A de pseudomonas, la Dnasa y la Rnasa;
• radionúclidos, es decir, los isótopos inestables de los elementos que se descomponen con la emisión simultánea de una o varias partículas a o p, o de rayos y. Por ejemplo, yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astatina 213; se pueden utilizar agentes quelantes para facilitar la asociación de estos radionúclidos a los TCR de alta afinidad, o a sus multímeros;
• inmunoestimulantes, es decir, moléculas efectoras inmunitarias que estimulan la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, citoquinas, tales como IL-2 y IFN-y,
• superantígenos y sus mutantes;
• Fusiones TCR-HLA, por ejemplo, fusión a un complejo péptido-HLA, en el que dicho péptido se deriva de un patógeno humano común, como el virus de Epstein Barr (EBV);
• quimioquinas como la IL-8, el factor 4 de las plaquetas, la proteína estimuladora del crecimiento del melanoma, etc;
• anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluyendo anticuerpos determinantes de células T o células NK (por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28 o anti-CD16);
• andamios proteicos alternativos con características de unión similares a las de los anticuerpos
• activadores del complemento;
• dominios de proteína xenogénicos, dominios de proteína alogénicos, dominios de proteína virales/bacterianos, péptidos virales/bacterianos.
Una realización preferente la proporciona un TCR soluble de la invención asociado (normalmente por medio de la fusión al extremo N o C de la cadena alfa o beta) con un efector inmunitario. Un efector inmunitario particularmente preferente es un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento funcional o variante de dicho anticuerpo anti-CD3 (tales fusiones TCR-anti-CD3 se pueden denominar moléculasImmTAC™). Tal y como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" engloba dichos fragmentos y variantes. Los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 incluyen, pero no se limitan a OKT3, UCHT-1, BMA-031 y 12F6. Los fragmentos y variantes/análogos de anticuerpos que son adecuados para su uso en las composiciones y procedimientos aquí descritos incluyen minicuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 , fragmentos dsFv y scFv, Nanobodies™ (estos constructos, comercializados por Ablynx (Bélgica), comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina sintética derivado de un camélido (por ejemplo camélido (por ejemplo, camello o llama) y Domain Antibodies (Domantis (Bélgica), que comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina o un dominio ligero variable de inmunoglobulina madurado por afinidad) o andamios proteicos alternativos que presentan características de unión similares a las de los anticuerpos, como Affibodies (Affibody (Suecia), que comprende un andamio de proteína A diseñado) o Anticalins (Pieris (Alemania)), que comprende anticalinas diseñadas), por nombrar sólo algunos.
La unión del TCR y el anticuerpo anti-CD3 puede ser por medio de una unión covalente o no covalente. La unión covalente puede ser directa o indirecta a través de una secuencia conectora. Las secuencias conectoras suelen ser flexibles, dado que están formadas principalmente por aminoácidos tales como la glicina, la alanina y la serina, que no tienen cadenas laterales voluminosas que puedan restringir la flexibilidad. Alternativamente, pueden ser deseables enlazadores con mayor rigidez. Las longitudes utilizables u óptimas de las secuencias enlazadoras se pueden determinar fácilmente. A menudo, la secuencia conectora será inferior a aproximadamente 12, por ejemplo menos de 10, o de 2 a 10 aminoácidos de longitud. Los conectores adecuados que pueden utilizarse en los TCR de la invención incluyen, pero no se limitan a: GGGGS (SEC ID NO: 31), GGGSG (SEC ID NO: 32), GGSGG (SEC ID NO: 33), GSGGG (SEC ID NO: 34), GSGGGP (SEC ID NO: 35), GGEPS (SEC ID NO: 36), GGEGGGP (SEC ID NO: 37), y GGEGGGSEGGGS (SEC ID NO: 38) (como se describe en el documento WO2010/133828).
Las realizaciones específicas de construcciones de fusión anti-CD3-TCR de la invención incluyen aquellos emparejamientos de cadenas alfa y beta en los que la cadena alfa se compone de un dominio variable TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NOs: 6-8 y/o la cadena beta está compuesta por un dominio variable TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NOs: 9-24). Dichas cadenas alfa y beta pueden comprender además una región constante que comprenda un enlace disulfuro no nativo. El dominio constante de la cadena alfa puede estar truncado por ocho aminoácidos. El extremo N o C de la cadena alfa y/o beta se puede fusionar a un fragmento de anticuerpo scFv anti-CD3 por medio de un enlazador seleccionado de SEC ID NOs: 31-38). Ciertas realizaciones preferentes de dichas construcciones de fusión anti-CD3-TCR se proporcionan a continuación:
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También se incluyen dentro del alcance de la invención las variantes funcionales de dichas construcciones de fusión anti-CD3-TCR. Dichas variantes funcionales tienen preferentemente al menos un 90% de identidad, tales como un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de referencia, pero son sin embargo funcionalmente equivalentes.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona ácido nucleico que codifica un TCR, o una fusión TCR anti CD3 de la invención. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADNc. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede ser un mRNA. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena a de un TCR de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena p de un TCR de la invención. El ácido nucleico puede ser de origen no natural y/o purificado y/o de ingeniería. La secuencia del ácido nucleico puede estar optimizada en cuanto a codones, según el sistema de expresión utilizado. Como es sabido por los expertos en la técnica, los sistemas de expresión pueden incluir células bacterianas tales como E. coli, o células de levadura, o células de mamífero, o células de insecto, o pueden ser sistemas de expresión libres de células.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende ácido nucleico de la invención. Preferentemente, el vector es un vector de expresión de TCR. Los vectores de expresión de TCR adecuados incluyen, por ejemplo, vectores gamma-retrovirales o, más preferentemente, vectores lentivirales. Para más detalles, consúltese Zhang 2012 y sus referencias (Zhang et al,. Adv Drug Deliv Rev. 2012 Jun 1; 64(8): 756-762).
La invención también proporciona una célula que alberga un vector de la invención, preferentemente un vector de expresión de TCR. Las células adecuadas incluyen células de mamíferos, preferentemente células inmunitarias, incluso más preferentemente células T. El vector puede comprender ácido nucleico de la invención que codifica en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos, la cadena alfa y la cadena beta respectivamente. Otro aspecto proporciona una célula que alberga un primer vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de la invención, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de la invención. Estas células son especialmente útiles en la terapia adoptiva. Las células de la invención pueden ser aisladas y/o recombinantes y/o de origen no natural y/o estar modificadas.
Dado que los TCR de la invención tienen utilidad en la terapia adoptiva, la invención incluye una célula de origen no natural y/o purificada y/o de ingeniería, especialmente una célula T, que presenta un TCR de la invención. La invención también proporciona una población expandida de células T que presentan un TCR de la invención. Existen varios procedimientos adecuados para la transfección de células T con ácido nucleico (como ADN, ADNc o ARN) que codifica los TCR de la invención (véase, por ejemplo Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). Las células T que expresan los TCR de la invención serán adecuadas para su uso en el tratamiento del cáncer basado en la terapia adoptiva. Como sabrán los expertos en la materia, hay una serie de procedimientos adecuados por los que se puede llevar a cabo la terapia adoptiva (véase, por ejemplo Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).
Como es bien conocido en el arte, los TCRs pueden estar sujetos a modificaciones postraduccionales. La glicosilación es una de estas modificaciones, que comprende la unión covalente de rfracciones de oligosacáridos a aminoácidos definidos en la cadena del TCR. Por ejemplo, los residuos de asparagina o de serina/treonina son lugares bien conocidos para la fijación de oligosacáridos. El estado de glicosilación de una proteína concreta depende de varios factores, como la secuencia de la proteína, su conformación y la disponibilidad de determinadas enzimas. Además, el estado de glicosilación (es decir, el tipo de oligosacárido, la unión covalente y el número total de uniones) puede influir en la función de las proteínas. Por lo tanto, cuando se producen proteínas recombinantes, a menudo es conveniente controlar la glicosilación. La glicosilación controlada se ha utilizado para mejorar las terapias basadas en anticuerpos (Jefferis et al. (2009), Nat. Rev. Drug Discov., marzo 8(3):226-234). En el caso de los TCR solubles de la invención, la glicosilación se puede controlar, por ejemplo, mediante el uso de determinadas líneas celulares (incluidas, entre otras, líneas celulares de mamíferos como las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células de riñón embrionario humano (HEK)), o por medio de modificación química. Dichas modificaciones son deseables, dado que la glicosilación puede mejorar la farmacocinética, reducir la inmunogenicidad y asemejarse más a una proteína humana nativa (Sinclair y Elliott (2005), Pharm. Sci., agosto, 94(8):1626-1635).
Para su administración a los pacientes, los TCR de la invención (preferentemente asociados a un marcador detectable o a un agente terapéutico o expresados en una célula T transfectada), las moléculas de fusión de TCR-anti CD3, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión o las células de la invención se pueden proporcionar en una composición farmacéutica junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada, (dependiendo del procedimiento de administración que se desee llevar a cabo a un paciente). Se puede suministrar en una forma de dosificación unitaria, generalmente se suministrará en un recipiente sellado y puede ser suministrada como parte de un kit. Normalmente (aunque no necesariamente) un kit de este tipo incluye instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas de dosificación unitarias.
La composición farmacéutica se puede adaptar para su administración por cualquier vía apropiada, tal como la parenteral (incluida la subcutánea, la intramuscular o la intravenosa), la enteral (incluida la oral o la rectal), la inhalatoria o la intranasal. Dichas composiciones se pueden preparar por medio de cualquier procedimiento conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo, mezclando el principio activo con el vehículo (o vehículos) o excipiente (o excipientes) en condiciones estériles.
Las dosis de las sustancias de la presente invención pueden variar entre amplios límites, dependiendo de la enfermedad o trastorno a tratar, la edad y condición del individuo a tratar, etc. un intervalo de dosis adecuado para moléculas de fusión TCR-anti-CD3 puede estar en el intervalo de 25 ng/kg a 50 jg/kg o 1 |jg a 1 g. Un médico determinará en última instancia las dosis apropiadas que se utilizarán.
Los TCR, las moléculas de fusión TCR-anti-CD3, las composiciones farmacéuticas, los vectores, los ácidos nucleicos y las células de la invención se pueden proporcionar en forma sustancialmente pura, por ejemplo, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% puro.
La invención también proporciona:
• Un TCR, una molécula de fusión TCR-anti-CD3, ácido nucleico, composición farmacéutica o célula de la invención para uso en medicina, preferentemente para uso en un procedimiento para tratar el cáncer o un tumor;
• el uso de un TCR, molécula de fusión TCR-anti-CD3, ácido nucleico, composición farmacéutica o célula de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer o un tumor;
• un procedimiento de tratamiento del cáncer o de un tumor en un paciente, que comprende administrar al paciente un TCR, una molécula de fusión TCR-anti-CD3, un ácido nucleico, una composición farmacéutica o una célula de la invención;
• una formulación inyectable para administrar a un individuo humano que comprende un TCR, una molécula de fusión TCR-anti-CD3, un ácido nucleico, una composición farmacéutica o una célula de la invención.
El cáncer puede ser un tumor líquido o sólido. Preferentemente, el tumor expresa PRAME. El cáncer puede ser de mama (incluido el triple negativo), ovario, endometrio, esófago, pulmón (CPNm y CPCP), vejiga o cabeza y cuello. Alternativa o adicionalmente el cáncer puede ser una leucemia o un linfoma . De estos cánceres, son preferentes los de mama (incluido el triple negativo), ovario y endometrio. El TCR, la molécula de fusión de TCR-anti-CD3, el ácido nucleico, la composición farmacéutica o la célula de la invención pueden administrarse por inyección, tal como una inyección intravenosa o una inyección intratumoral directa. El individuo humano puede ser del subtipo HLA-A*02.
El procedimiento de tratamiento puede incluir además la administración por separado, en combinación o secuencialmente, de un agente antineoplásico adicional. Ejemplos de tales agentes son conocidos en la técnica y pueden incluir agentes activadores del sistema inmunitario y/o agentes moduladores de células T
Las características preferentes de cada aspecto de la invención son como para cada uno de los otros aspectos con los cambios debidos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1 - proporciona la secuencia de aminoácidos de las regiones extracelulares de una cadena alfa y beta del TCR PRAME.
Figura 2 - proporciona la secuencia de aminoácidos de las regiones extracelulares de una versión soluble de una cadena alfa y beta del TCR PRAME.
Figura 3 - proporciona ejemplos de secuencias de aminoácidos de regiones variables de la cadena alfa del TCR PRAME mutadas.
Figura 4 - proporciona ejemplos de secuencias de aminoácidos de regiones variables de la cadena beta del TCR PRAME mutado.
Figura 5 - proporciona secuencias de aminoácidos de moléculas ImmTAC (fusiones TCR-anti-CD3) que comprenden ciertos dominios variables TCR PRAME mutados, tal como se expone en las Figuras 3 y 4.
Figura 6 - Proporciona datos celulares que demuestran la potencia y especificidad de las moléculas ImmTAC de la Figura 5 que comprenden los dominios variables del TCR PRAME mutados como se establece en las Figuras 3 y 4.
Figura 7 (paneles a y b) - proporcionan datos celulares que demuestran la especificidad de las moléculas ImmTAC de la Figura 5, que comprenden los dominios variables PRAME TCR mutados según se establece en las Figuras 3 y 4.
Figura 8 - proporciona datos celulares que demuestran la destrucción de células cancerosas de melanoma PRAME positivas por las moléculas ImmTAC de la Figura 5, que comprenden los dominios variables del TCR PRAME mutados según se expone en las Figuras 3 y 4.
Figura 9 - proporciona datos celulares que demuestran la destrucción de células de cáncer de pulmón PRAME positivas por moléculas ImmTAC de la Figura 5, que comprenden los dominios variables TCR PRAME mutados según se establece en las Figuras 3 y 4.
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Expresión, replegado y purificación de TCRs solubles
Procedimiento
Las secuencias de ADN que codifican las regiones extracelulares alfa y beta de los TCRs solubles de la invención se clonaron por separado en plásmidos de expresión basados en pGMT7 utilizando procedimientos estándar (como se describe en Sambrook, et al. Molecular cloning. Vol. 2. (1989) Nueva York: Cold Spring Harbour Laboratory Press). Los plásmidos de expresión se transformaron por separado en la cepa de E. coli Rosetta (BL21pLysS), o T7 Express, y se cultivaron colonias individuales resistentes a la ampicilina a 37 °C en medio TYP (+ ampicilina 100 |jg/ml) hasta alcanzar una DO600 de aproximadamente 0,6-0,8 antes de inducir la expresión de la proteína con 0,5 mM de IPTG. Las células se recolectaron tres horas después de la inducción por medio de centrifugación. Los sedimentos celulares se lisaron con el reactivo de extracción de proteínas BugBuster (Merck Millipore) según las instrucciones del fabricante. Los sedimentos de los cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación. Los sedimentos se lavaron dos veces en tampón Tritón (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, Triton-X100 al 0,5 %, NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM) y finalmente se resuspendieron en tampón sin detergente (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM). El rendimiento de la proteína de los cuerpos de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y midiendo la DO280. A continuación se calculó la concentración de proteínas mediante el coeficiente de extinción. La pureza del cuerpo de inclusión se midió solubilizándolo con Urea 8M y cargando ~2jg en SDS-PAGE al 4-20% en condiciones reductoras. A continuación se estimó o calculó la pureza mediante un programa informático de densitometría (Chemidoc, Biorad). Los cuerpos de inclusión se almacenaron a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo y a -20 °C o -70 °C para el almacenamiento a largo plazo.
Para el replegado del TCR soluble, los cuerpos de inclusión que contenían cadenas a y p se mezclaron primero y se diluyeron en 10 ml de tampón de solubilización/desnaturalización (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCI 50 mM pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 20 mM), seguido de una incubación durante 30 minutos a 37°C. A continuación, se inició el repliegue por medio de una nueva dilución en 1 L de tampón de repliegue (100 mM Tris pH 8,1, 800 mM L-Arginina hCl , 2 mM EDTA, 4 M Urea, 10 mM clorhidrato de cisteamina y 2,5 mM dihidrocloruro de cistamina) y se mezcló bien la solución. La mezcla replegada se dializó contra 10 L de H2O durante 18-20 horas a 5 °C ± 3 °C. Transcurrido este tiempo, el tampón de diálisis se sustituyó dos veces por Tris 10 mM de pH 8,1 (10 L) y la diálisis continuó durante otras 15 horas. A continuación, la mezcla replegada se filtró a través de filtros de celulosa de 0,45 |jm.
La purificación de los TCRs solubles se inició aplicando el repliegue dializado en una columna de intercambio aniónico POROS® 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de 0-500mM NaCl en 20 mM Tris pH 8.1 a lo largo de 6 volúmenes de columna mediante el uso de un purificador Akta® (GE Healthcare). Los picos de las fracciones de TCR se identificaron mediante SDS PAGE antes de ser agrupados y concentrados. La muestra concentrada se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex® 75HR (GE Healthcare) preequilibrada en tampón PBS de Dulbecco. Las fracciones del pico TCR se agruparon y concentraron y se calculó el rendimiento final del material purificado.
Ejemplo 2: Expresión, replegamiento y purificación de moléculas ImmTAC (moléculas de fusión de TCR-anti CD3 solubles)
Procedimiento
La preparación de ImmTAC se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1, excepto que la cadena beta del TCR se fusionó mediante un enlazador con un anticuerpo de cadena simple anti-CD3. Además, se realizó una etapa de intercambio de cationes durante la purificación tras el intercambio de aniones. En este caso, las fracciones de los picos de intercambio aniónico se diluyeron 20 veces en 20mM MES (pH6,5), y se aplicaron a una columna de intercambio catiónico POROS® 50HS. La proteína ligada se eluyó con un gradiente de 0-500 mM de NaCl en 20mM de MES. Las fracciones de ImmTAC de los picos se agruparon y se ajustaron a 50mM de Tris pH 8.1, antes de ser concentradas y aplicadas directamente a la matriz de filtración de gel como se describe en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3 - Caracterización de la unión
El análisis de la unión de los TCRs solubles purificados y de las moléculas ImmTAC al complejo péptido-HLA correspondiente se llevó a cabo mediante resonancia de plasmón superficial, utilizando un instrumento BIAcore 3000 o BIAcore T200, o mediante interferometría de biocapa, utilizando un instrumento ForteBio Octet). Las moléculas de clase I HLA-A*02 biotiniladas se volvieron a plegar con el péptido de interés y se purificaron utilizando procedimientos conocidos por los expertos (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89(8): 3429-3433). Todas las mediciones se realizaron a 25 °C en tampón PBS de Dulbecco, complementado con P20 al 0,005 %.
Procedimiento BIAcore
Los monómeros de péptidos-HLA biotinilados se inmovilizaron en chips sensores CM-5 acoplados a estreptavidina. Las constantes de unión en el equilibrio se determinaron mediante el uso de diluciones seriadas de TCR soluble/ImmTAC inyectadas a un caudal constante de 30 j l min'1 sobre una celda de flujo recubierta con aproximadamente 200 unidades de respuesta (RU) del complejo de péptido-HLA-A*02. Las respuestas en el equilibrio se normalizaron para cada concentración de TCR restando la respuesta del tampón en masa en una celda de flujo de control que contenía un péptido-HLA pertinente. El valor de Kd se obtuvo por medio de un ajuste de la curva no lineal mediante el uso del software Prism y la isoterma de unión de Langmuir, unido = C*Max/(C KD), en la que "unido" es la unión en el equilibrio en RU a la concentración de TCR inyectada C, y Max es la unión máxima. Para las interacciones de alta afinidad, los parámetros de unión se determinaron mediante un análisis cinético de ciclo único. Se inyectaron cinco concentraciones diferentes de TCR/ImmTAC soluble sobre una celda de flujo recubierta con aproximadamente 100 - -200 RU de complejo de péptido-HLA mediante el uso de un caudal de 50-60 j l min_1. Normalmente, se inyectaron 60-120 j l de TCR/ImmTAC soluble a una concentración máxima de 50-100 nM, y se utilizaron diluciones sucesivas en 2 veces para las otras cuatro inyecciones. Se inyectó primero la concentración más baja. Para medir la fase de disociación se inyectó entonces tampón hasta que se produjo una disociación del >10 %, normalmente después de 1 a 3 horas. Los parámetros cinéticos se calcularon con el software BIAevaluation®. La fase de disociación se ajustó a una ecuación de descomposición exponencial única que permite calcular la semivida. La constante de equilibrio Kd se calculó a partir de koff/kon.
Procedimiento Octet
Los monómeros de péptido-HLA biotinilados se capturaron a 1 nm en biosensores de estreptavidina (SA) (Pall ForteBio) preinmovilizados con estreptavidina. Los sensores se bloquearon con biotina libre (2 jM ) durante 2 minutos. Las constantes de unión en el equilibrio se determinaron sumergiendo los biosensores cargados en TCR/ImmTAC soluble diluido en serie en una placa de muestras de 96 o 384 pocillos. La agitación de la placa se ajustó a 1000 rpm. Para las interacciones de baja afinidad (intervalo de jM ) se utilizó una asociación corta (aproximadamente 2 minutos) y un tiempo de disociación corto (aproximadamente 2 minutos). Las curvas de unión se procesaron mediante la sustracción de doble referencia de los biosensores de referencia cargados con pHLA no pertinente utilizando el software de análisis de datos Octet (Pall ForteBio). Se usaron las respuestas (nm) en equilibrio para calcular el valor de Kd a partir de gráficos de estado estacionario ajustados a la ecuación Respuesta = Rmax*conc/(KD conc), en la que "respuesta" es la unión en equilibrio en nm a cada concentración de TCR (conc) y Rmax es la respuesta de unión máxima a la saturación de pHLA.
Para las interacciones de alta afinidad (intervalo nM - pM), los parámetros cinéticos se determinaron a partir de curvas de unión a concentraciones > 3 TCR / ImmTAC típicamente 10 nM, 5 nM y 2,5 nM. El tiempo de asociación fue de 30 minutos y el tiempo de disociación de 1 a 2 horas. Las curvas de unión se procesaron mediante la sustracción de doble referencia de biosensores de referencia cargados con pHLA pertinente y bloqueados con biotina. Los parámetros cinéticos kon y koff se calcularon mediante un ajuste global directo a las curvas de unión utilizando el software de análisis de datos Octet (Pall ForteBio). La Kd se calculó a partir de koff/kon y la semivida de disociación se calculó a partir de t i /2 = 0,693/koff.
Ejemplo 4: Caracterización de la unión del TCR nativo
Se preparó un TCR nativo soluble de acuerdo con los procedimientos descritos en el ejemplo 1 y se analizó la unión a pHLA de acuerdo con el ejemplo 3. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas alfa y beta correspondían a las mostradas en la figura 2. El h La -A*02 biotinilado soluble se preparó con el péptido PrAm E SLLQh LiGL (SEC ID NO: 1), e inmovilizado en un chip sensor BIAcore.
Resultados
Se determinó la unión a varias concentraciones y se determinó que el valor Kd para la interacción era de 141 pM. La reactividad cruzada (especificidad) se evaluó frente a un panel de 14 complejos de péptidos HLA-A*02 no pertinentes utilizando el procedimiento de equilibrio BIAcore del ejemplo 3. Los 14 pHLA no pertinentes se agruparon en tres grupos y se cargaron en una de las tres celdas de flujo, para obtener aproximadamente 1000 RU de cada pHLA por celda de flujo. Se inyectaron 30 pl de TCR soluble de tipo salvaje a concentraciones de 130 pM y 488 pM en todas las celdas de flujo a una velocidad de 20 pl/min. No se detectó ninguna unión significativa en ninguna de las dos concentraciones, lo que indica que el TCR nativo es específico para el complejo de SLLQHLIGL-HLA-A*02. Estos datos indican que este TCR nativo tiene características que son adecuadas para su uso como secuencia de partida para la ingeniería de TCR terapéuticos de alta afinidad.
Ejemplo 5 - Caracterización de la unión de un TCR soluble no mutado de la invención
Las secuencias de aminoácidos del dominio variable del TCR alfa y beta mutadas, proporcionadas en las Figuras 3 y 4 respectivamente (SEC ID NOs: 6-24), se utilizaron para preparar moléculas ImmTAC. Obsérvese que la inclusión de un residuo de glicina al inicio de la cadena alfa (posición -1 respecto a la numeración de SEC ID NO: 2) mejora la eficacia de la escisión de la metionina N terminal durante la producción en E. coli. Una escisión ineficaz puede ser perjudicial para una terapéutica, dado que puede dar lugar a un producto proteico heterogéneo y o la presencia de la metionina de iniciación puede ser inmunogénica en humanos. En la Figura 5 se muestran las secuencias completas de aminoácidos de las moléculas ImmTAC que comprenden las siguientes cadenas alfa y beta
• a28b50 - ImmTAC1
• a28b50 - ImmTAC1
• a28b50 - ImmTAC1
Las moléculas se prepararon como se describe en el Ejemplo 2 y la unión al complejo SLLQHLIGL-HLA-A*02 se determinó de acuerdo con el Ejemplo 3.
Resultados
Los datos presentados en la tabla siguiente muestran que las moléculas ImmTAC que comprenden las secuencias de dominio variable TCR indicadas reconocieron el complejo SLLQHLIGL-HLA-A*02 con una afinidad y/o vida media particularmente adecuadas.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 6 - Caracterización de la potencia y especificidad de ciertos TCR mutados de la invención
Las moléculas ImmTAC que comprenden las mismas secuencias de dominio variable TCR como se establece en el Ejemplo 5 se evaluaron para su capacidad de mediar la redirección potente y específica de células T CD3+ contra células cancerosas PRa Me positivas. La secreción de interferón-y (IFN-y) se utilizó como lectura de la activación de las células T En la Figura 5 se muestran las secuencias completas de aminoácidos de las moléculas ImmTAC que comprenden las siguientes cadenas alfa y beta
• a28b50 - ImmTACI
• a28b50 - ImmTACI
• a28b50 - ImmTACI
Los ensayos se llevaron a cabo mediante el uso de un kit ELISPOT de IFN-y humano (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células diana se prepararon a una densidad de 1*106/ml en un medio de ensayo (RPMI 1640 que contenía FBS inactivado por calor al 10 % y penicilina-estreptomicina-L-glutamina al 1 %) y se cultivaron a 50.000 células por pocillo en un volumen de 50 pl. Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica ("peripheral blood mononuclear cells", PBMC), aisladas de sangre fresca de donantes, como células efectoras y se cultivaron entre 10.000 y 50.000 células por pocillo en un volumen de 50 pl (el número exacto de células utilizadas para cada experimento depende del donante y se puede ajustar para producir una respuesta dentro de un intervalo adecuado para el ensayo). Las moléculas ImmTAC se valoraron para obtener concentraciones finales de 10 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM y 0,001 nM, que abarcaban el intervalo clínicamente relevante previsto, y se añadieron al pocillo en un volumen de 50 pl.
Las placas se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células diana, las células efectoras y las moléculas ImmTAC se añadieron a los pocillos correspondientes y se completaron hasta un volumen final de 200 pl con medio de ensayo. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. También se prepararon pocillos de control con la omisión de ImmTAC, células efectoras o células diana. A continuación, las placas se incubaron durante la noche (37 °C/5% de CO2). Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (sobre de 1xPBS, que contiene 0,05% de P20, preparado en agua desionizada). A continuación, se añadió el anticuerpo primario de detección a cada pocillo en un volumen de 50 pl. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas antes de ser lavadas de nuevo tres veces. La detección secundaria se realizó añadiendo 50 pl de estreptavidina-HRP diluida a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y se repitió la etapa de lavado. No más de 15 minutos antes de su uso, se añadió una gota (20 pl) de cromógeno a Ec a cada 1 ml de sustrato AEC, se mezcló y se añadieron 50 |jl a cada pocilio. El desarrollo de las manchas se controló regularmente y las placas se lavaron con agua del grifo para terminar la reacción de desarrollo. A continuación, se dejaron secar las placas a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de realizar el recuento de las manchas mediante un analizador CTL con el software Immunospot (Cellular Technology Limited).
En este ejemplo, se utilizaron las siguientes líneas de células cancerosas como células diana:
- Mel624 (melanoma) PRAME+ve HLA-A*02+ve - Granta519 (hemo-linfocítica) PRAME-ve HLA-A*02+ve - SW620 (carcinoma de colon) PRAME-ve HLA-A*02+ve - HT144 (melanoma) PRAME+ve HLA-A*02-ve
Resultados
Cada una de las moléculas ImmTAC, que comprende los dominios variables alfa y beta indicados en la tabla siguiente, demostró una potente activación de células T redirigidas en presencia de células Mel624 positivas al antígeno. En cada caso, los valores EC50 se calcularon a partir de los datos y se muestran en la tabla siguiente. Además, cada molécula ImmTAC demostró un reconocimiento mínimo o nulo de dos células antígeno negativas, HLA-A*02 positivas, a una concentración de hasta 1 nM. Las moléculas ImmTAC tampoco demostraron reconocer células p Ra ME positivas que son HLA-A*02 negativas (datos no mostrados). La Fgura 6 muestra datos representativos de cuatro de las moléculas ImmTAC enumeradas en la tabla siguiente.
Figure imgf000023_0001
Estos datos demuestran que las moléculas ImmTAC que comprenden secuencias de dominio variable TCR mutadas de la invención pueden mediar la redirección potente y específica de células T contra células cancerosas PRAME positivas, HLA-A*02 positivas, en un intervalo de concentración adecuado para uso terapéutico.
Ejemplo 7 - Caracterización adicional de especificidad de ciertos TCR de la invención
A fin de demostrar aún más la especificidad de las moléculas ImmTAC que comprenden las secuencias TCR mutadas, se llevaron a cabo pruebas adicionales mediante el uso de la misma metodología ELISPOT descrita en el Ejemplo 6, con un panel de células normales derivadas de tejidos humanos sanos como células diana.
• Los tejidos normales incluyeron cardiovascular, renal, músculo esquelético, pulmonar, vasculatura, hepático y cerebral. En cada caso se utilizaron células cancerosas Mel624 con antígeno positivo como control positivo. Los datos presentados en este ejemplo incluyen moléculas ImmTAC que comprenden las siguientes cadenas TCR alfa y beta
• a28b50
• a79b74
• a79b46
• a79b77
Las secuencias completas de aminoácidos de las moléculas ImmTAC que comprenden a28b50, a79b74 y a79b46 se muestran en la Figura 5 (ImmTAC 1-3 respectivamente)
Resultados
Los datos presentados en la Figura 7 (panel a) demuestran que las moléculas ImmTAC que comprenden las cadenas alfa y beta mutadas a28b50 y a79b46 muestran una reactividad mínima contra un panel de 8 células normales en relación con las células cancerosas antígeno positivas a una concentración de hasta 1 nM. Asimismo, los datos de la Figura 7 (panel b) demuestran que las moléculas ImmTAC que comprenden a28b57 y a79b46 muestran una reactividad mínima frente a un panel de 4 células normales en relación con las células cancerosas antígeno positivas a una concentración de hasta 1 nM.
Ejemplo 8 - Eliminación de células cancerosas mediada por determinados TCR mutados de la invención La capacidad de las moléculas ImmTAC que comprenden las secuencias TCR mutadas para mediar en la eliminación potente de células T redirigidas de células tumorales positivas para antígeno se investigó mediante el uso de la plataforma IncuCyte (Essen BioScience). Este ensayo permite detectar en tiempo real por microscopía la liberación de caspasa-3/7, un marcador de la apoptosis.
Procedimiento
Los ensayos se realizaron utilizando el kit de ensayo de apoptosis Caspase-3/7 de 96 pocillos CellPlayer (Essen BioScience, Cat. No.4440) y se llevó a cabo según el protocolo del fabricante. En resumen, las células diana (Mel624 (PRAME+ve HLA-A*02+ve) o NCI-H1755) se colocaron en placa a razón de 10000 células por pocillo y se incubaron durante la noche para permitir que se adhirieran. Se prepararon moléculas ImmTAC a distintas concentraciones y se añadieron 25 pl de cada una al pocillo correspondiente, de forma que las concentraciones finales se situaran entre 1 pM y 100 pM . Las células efectoras se utilizaron en una proporción de células efectoras a células diana de 10:1 (50000 células por pocillo). También se preparó una muestra de control sin ImmTAC junto con muestras que contenían células efectoras solas o células diana solas. El reactivo de ensayo NucView se preparó a 30 pM y se añadieron 25 pl a cada pocillo y el volumen final se llevó a 150 pl (dando una concentración final de 5 pM). La placa se colocó en el instrumento IncuCyte y se tomaron imágenes cada 2 horas (1 imagen por pocillo) durante 3 días. Se determinó el número de células apoptóticas en cada imagen y se registró como células apoptóticas por mm2. Los ensayos se realizaron por triplicado.
Los datos presentados en este ejemplo incluyen moléculas ImmTAC que comprenden las siguientes cadenas TCR alfa y beta
• a28b50
• a79b74
• a79b46
Las secuencias completas de aminoácidos de las moléculas ImmTAC que comprenden a28b50, a79b74 y a79b46 se proporcionan en la Figura 5 (ImmTAC 1, 2 y 3 respectivamente).
Resultados
Los datos presentados en las Figuras 8 y 9 muestran la destrucción en tiempo real de células cancerosas antígeno positivas (líneas celulares de melanoma Mel624 en la Figura 8 y línea celular de cáncer de pulmón NCI-H1755 en la Figura 9) en presencia de moléculas ImmTAC que comprenden las secuencias TCR mutadas, a una concentración de 100 pM o inferior. No se observaron muertes en ausencia de moléculas ImmTAC.

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a SLLQHLIGL (SEC ID NO: 1) Complejo HLA-A*02 y que comprende un dominio variable de cadena alfa del TCR y un dominio variable de cadena beta del TCR, cada uno de los cuales comprende FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, donde FR es una región marco y CDR es una región determinante de la complementariedad, en la que
(a) las CDR de la cadena alfa tienen las siguientes secuencias:
CDR1 - TISGTDY (SEC ID NO: 39).
CDR2 - GLTSN (SEC ID NO: 40).
CDR3 - CILILGHSGAGSYQLTF (SEC ID NO: 41)
con una o más mutaciones en el mismo, en el que la una o más mutaciones se selecciona de (con referencia a la numeración de SEC ID NO: 2):
Figure imgf000026_0001
y
(b) las CDR de la cadena beta tienen las siguientes secuencias:
CDR1 - LNHDA (SEC ID NO: 42).
CDR2 - SQIVNDF (SEC ID NO: 43).
CDR3 - CASSPWTSGSREQYF (SEC ID NO: 44)
con una o más mutaciones en el mismo, en el que la una o más mutaciones se selecciona de (con referencia a la numeración de SEC ID NO: 2):
Figure imgf000026_0002
2. El TCR de la reivindicación 1, en el que las regiones marco de dominio variable de cadena alfa comprenden las siguientes secuencias:
FR1 - los aminoácidos 1-25 de la SEC ID NO: 2
FR2 - los aminoácidos 33-49 de la SEC ID NO: 2
FR3 - los aminoácidos 55-87 de la SEC ID NO: 2
FR4 - los aminoácidos 105-114 de la SEC ID NO: 2
o secuencias respectivas que tengan al menos un 90% de identidad con dichas secuencias, y/o las regiones marco del dominio variable de la cadena beta comprenden las siguientes secuencias:
FR1 - los aminoácidos 1-26 de la SEC ID NO: 3
FR2 - los aminoácidos 32-48 de la SEC ID NO: 3
FR3 - los aminoácidos 56-90 de la SEC ID NO: 3
FR4 - los aminoácidos 106-114 de la SEC ID NO: 3
o secuencias respectivas que tengan al menos un 90% de identidad con dichas secuencias.
3. El TCR de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que hay una, dos, tres, cuatro o cinco mutaciones en las CDR de la cadena alfa y esas una, dos, tres, cuatro o cinco mutaciones se seleccionan de (con referencia a la numeración de SEC ID No : 2):
Figure imgf000027_0003
opcionalmente, en el que las CDR de la cadena alfa presentan uno de los siguientes grupos de mutaciones (con referencia a la numeración de SEC ID NO: 2):
Figure imgf000027_0001
opcionalmente, en el que la CDR3 de la cadena alfa tiene una secuencia seleccionada entre:
Figure imgf000027_0002
4. El TCR de cualquier reivindicación precedente, en el que hay una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez mutaciones en las CDR de la cadena beta y esas son una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez mutaciones se seleccionan de (con referencia a la numeración de SEC ID NO: 3):
Figure imgf000027_0004
Figure imgf000028_0004
opcionalmente, en el que las CDR de la cadena beta presentan uno de los siguientes grupos de mutaciones (con referencia a la numeración de SEC ID NO: 3):
Figure imgf000028_0001
opcionalmente, en el que la CDR2 de la cadena beta tiene una secuencia seleccionada entre:
Figure imgf000028_0003
opcionalmente, en el que la CDR3 de la cadena beta tiene una secuencia seleccionada entre:
Figure imgf000028_0002
Figure imgf000029_0003
opcionalmente, donde las respectivas CDR2 y CDR3 de la cadena beta son las siguientes:
Figure imgf000029_0002
5. El TCR de cualquier reivindicación precedente, que tiene una de las siguientes combinaciones de CDR de cadena alfa y cadena beta:
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
6. El TCR de cualquier reivindicación precedente, en el que la región variable de cadena alfa FR1 tiene un residuo G en la posición -1 mediante el uso de la numeración de SEC ID NO: 2.
7. Un TCR como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que el dominio variable de cadena alfa comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 6-8 y el dominio variable de la cadena beta puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9-24).
8. El TCR como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio variable de la cadena alfa y el dominio variable de la cadena beta se seleccionan entre las secuencias de aminoácidos de:
Figure imgf000031_0001
9. Un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un heterodímero alfa-beta, que tiene una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta, opcionalmente en el que las secuencias de dominio constante de cadena alfa y beta se modifican por truncamiento. o sustitución para eliminar un enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2, además opcionalmente donde las secuencias de dominio constante de cadena alfa y/o beta se modifican por medio de la sustitución de residuos de cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro no nativo entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.
10. El TCR como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, que está en formato de cadena simple del tipo Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp, en el que Va, y Vp son regiones variables del TCR a y p respectivamente, Ca, y Cp son regiones constantes del TCR a y p respectivamente, y L es una secuencia enlazadora.
11. Un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores asociado con un marcador detectable, un agente terapéutico o un resto modificador de PK, opcionalmente en el que un anticuerpo anti-CD3 está unido covalentemente al extremo C o N de la cadena alfa o beta del TCR, opcionalmente a través de una secuencia enlazadora que se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en GGGGS (SEC ID NO: 31), GGGSG (SEC ID NO: 32), GGSGG (SEC ID NO: 33), GSGGG (SEC ID NO: 34), GSGGGP (SEC ID NO: 35), GGEPS (SEC ID NO: 36), GGEGGGP (SEC ID NO: 37), y GGEGGGSEGGGS (SEC ID NO: 38).
12. Una molécula de fusión TCR-anti-CD3 en la que el dominio variable de cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID NOs: 6-8 y el dominio variable de la cadena beta puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9-24, y en el que el anticuerpo anti-CD3 está unido covalentemente al N-terminal o al C-terminal de la cadena beta del TCR a través de una secuencia conectora seleccionada de las SEC ID NO: 31-38).
13. Una molécula de fusión TCR-anti-CD3 de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la molécula de fusión TCR-anti-CD3 comprende
una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa correspondiente a SEC ID NO: 25, 27 o 29 o el dominio variable de la cadena beta comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad, tal como un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad, con la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 25, 27 y 29,
y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a s Ec ID NO: 26, 28 y 30 o la secuencia de aminoácidos de cadena beta que tiene al menos un 90% de identidad, tal como un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad, con la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID NO: 26, 28 y 29.
14. La molécula de fusión TCR-anti-CD3 de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la molécula de fusión TCR-anti CD3 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena alfa correspondiente a SEC ID NO: 25 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEC ID NO: 26.
15. La molécula de fusión TCR-anti-CD3 de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la molécula de fusión TCR-anti CD3 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena alfa correspondiente a SEC ID NO: 27 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEC ID NO: 28.
16. La molécula de fusión TCR-anti-CD3 de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la molécula de fusión TCR-anti CD3 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena alfa correspondiente a SEC ID NO: 29 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEC ID NO: 30.
17. Un ácido nucleico que codifica una cadena alfa de TCR y una cadena beta de TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
18. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 17.
19. Una célula que porta:
(a) un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 12 o 18 que codifica las cadenas alfa y beta de TCR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos; o
(b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
20. Una célula de origen no natural y/o purificada y/o modificada por ingeniería genética, especialmente un linfocito T, que presenta un RLC de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
21. Una composición farmacéutica que comprende un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o una molécula de fusión TCR-anti CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, o una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, junto con una o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
22. El TCR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o molécula de fusión TCR-anti-CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, o ácido nucleico de la reivindicación 17, o composición farmacéutica de la reivindicación 21 o célula de la reivindicación 19 o 20, para uso en medicina, preferentemente en un individuo humano.
23. El TCR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o molécula de fusión TCR-anti-CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, o ácido nucleico de la reivindicación 17, o composición farmacéutica de la reivindicación 21 o célula de la reivindicación 19 o 20, para uso en un procedimiento para tratar el cáncer o un tumor, preferentemente en un individuo humano, opcionalmente en el que
el individuo humano tiene un tumor que expresa PRAME,
el tumor es un tumor sólido,
el individuo humano es del subtipo HLA-A*02, y/o
el TCR, la molécula de fusión TCR-anti-CD3, el ácido nucleico, la composición farmacéutica o la célula se administra por medio de inyección, tal como una inyección intravenosa o intratumoral directa.
24. Una formulación inyectable para administrar a un individuo humano que comprende un TCR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una molécula de fusión TCR-anti-CD3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16.
25. Un procedimiento para producir un TCR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una molécula de fusión de TCR-anti-CD3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16, que comprende a) mantener una célula de acuerdo con la reivindicación 19 en condiciones óptimas para la expresión de las cadenas de TCR y b) aislar las cadenas de TCR.
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