KR20200019211A - T 세포 수용체 - Google Patents

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니콜 조이 베드케
루시 부아드
스티픈 하퍼
나타니엘 리디
타라 마혼
로난 패드라익 오드위어
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Abstract

본 발명은 생식선 암 항원 PRAME로부터 유래된 HLA-A*02 제한된 펩타이드 SLLQHLIGL (서열번호 1)에 결합하는 T 세포 수용체 (TCR)에 관한 것이다. 상기 TCR은 본래의 PRAME TCR과 비교하여 알파 및/또는 베타 가변 도메인 내 비-천연 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 TCR은 특히 악성 질환의 치료를 위한 신규 면역치료학적 시약으로서 사용하기에 적합하다.

Description

T 세포 수용체
본 발명은 생식선 암 항원 PRAME로부터 유래된 HLA-A*02 제한된 펩타이드 SLLQHLIGL (서열번호 1)에 결합하는 T 세포 수용체 (TCR)에 관한 것이다. 상기 TCR은 본래의 PRAME TCR과 비교하여 알파 및/또는 베타 가변 도메인 내 비-천연 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 TCR은 특히 악성 질환의 치료를 위한 신규 면역치료학적 시약으로서 사용하기에 적합하다.
T 세포 수용체(TCR)는 천연적으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 발현된다. TCR은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자 (인간에서, MHC 분자는 인간 백혈구 항원 또는 HLA로도 공지되어 있다)와의 복합체에서 항원 제공 세포의 표면 상에 나타나는 짧은 펩타이드 항원을 인지하도록 디자인된다(참조: Davis et al., Annu Rev Immunol. 1998;16:523-44). 세포독성 T 세포로도 호칭되는 CD8+ T 세포는 MHC 부류 I 분자에 결합된 펩타이드를 특이적으로 인지하는 TCR을 갖는다. CD8+ T 세포는 일반적으로 암성 및 바이러스 감염된 세포를 포함하는, 환부 세포의 파괴를 모색하고 매개하는데 관여한다. 상응하는 항원에 대한 천연 레퍼토리에서 암-특이적 TCR의 친화성은 전형적으로 흉선 선택의 결과로서 낮으며, 이는 암성 세포가 흔히 검출 및 파괴를 회피함을 의미한다. T 세포에 의한 암 인지 촉진을 목표로 하는 신규 면역치료학적 접근법은 효과적인 항암 치료의 개발을 위한 고도로 유망한 전략을 제공한다.
흑색종에서 PRAME 또는 우선적으로 발현되는 항원은 최초로 흑색종에서 과발현되는 항원으로서 동정되었고(참조: Ikeda et al Immunity. 1997 Feb;6(2):199-208); 이것은 또한 CT130, MAPE, OIP-4로서 공지되어 있으며 유니프로트 (Uniprot) 승인 번호 P78395를 갖는다. 단백질은 레티노산 수용체 신호전달의 리프레서로서 기능한다(참조: Epping et al., Cell. 2005 Sep 23;122(6):835-47). PRAME는 암 고환 항원으로서 공지된 생식선-암호화된 항원 패밀리에 속한다. 암 고환 항원은 이들이 전형적으로 정상 성인 조직에서 제한되거나 발현되지 않기 때문에 면역치료학적 중재를 위해 매력적인 표적이다. PRAME는 백혈병 및 림프종에서 뿐만 아니라 다수의 고형 종양에서 발현된다(참조: Doolan et al Breast Cancer Res Treat. 2008 May; 109(2):359-65; Epping et al Cancer Res. 2006 Nov 15;66(22):10639-42; Ercolak et al Breast Cancer Res Treat. 2008 May; 109(2):359-65; Matsushita et al Leuk Lymphoma. 2003 Mar;44(3):439-44; Mitsuhashi et al Int. J Hematol. 2014;100(1):88-95; Proto-Sequeire et al Leuk Res. 2006 Nov;30(11):1333-9; Szczepanski et al Oral Oncol. 2013 Feb;49(2):144-51; Van Baren et al Br J Haematol. 1998 Sep;102(5):1376-9). 본 발명의 PRAME 표적화 치료요법은 특히 폐암 (NSCLC 및 SCLC), 유방암 (삼중 음성을 포함하는), 난소암, 자궁내막암, 식도암, 방광암 및 두경부암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 치료를 위해 적합할 수 있다.
펩타이드 SLLQHLIGL (서열번호 1)은 전장 PRAME 단백질의 아미노산 425-433에 상응하고 HLA-A*02와의 복합체에서 세포 표면 상에 제공된다(참조: Kessler et al., J Exp Med. 2001 Jan 1;193(1):73-88). 이 펩타이드-HLA 복합체는 TCR-기반 면역치료학적 중재를 위한 유용한 표적을 제공한다.
고친화성 및 고특이성으로 SLLQHLIGL (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하는 특정 TCR 서열의 동정은 신규 면역치료요법의 개발에 유리하다. 치료학적 TCR은 예를 들어, 세포독성 제제를 종양 부위로 전달하거나 종양 세포에 대한 면역 이펙터 기능을 활성화시킬 목적을 위해 가용성 표적화 제제로서 사용될 수 있거나(참조: Lissin, et al., "High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions" in Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges. 2013. S. R. Schmidt, Wiley; Boulter et al., Protein Eng. 2003 Sep;16(9):707-11; Liddy, et al., Nat Med. 2012 Jun;18(6):980-7), 대안적으로 이들은 입양 치료요법을 위해 T 세포를 조작하는데 사용될 수 있다(참조: Fesnak et al., Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81).
HLA-A*02와의 복합체에서 SLLQHLIGL (서열번호 1)에 결합하는 TCR은 이전에 보고되었다(참조: Amir et al., Clin Cancer Res. 2011 Sep 1;17(17):5615-25; Griffioen et al., Clin Cancer Res. 2006 May 15;12(10):3130-6; WO2016142783). 그러나, 이들 TCR은 이들이 천연 TCR에 상대적으로 증가된 친화성으로 표적 항원에 결합하도록 조작되지 않았다. 하기에서 추가로 설명된 바와 같이, 초-생리학적 항원 친화성은 치료학적 TCR을 위해 요구될 수 있는 특성이고, 상기 TCR의 생성은 특히 특이성과 같은 다른 요구될 수 있는 특성과 균형을 이루는 경우 간단하지 않다.
본원에 정의된 TCR 서열은 TCR 분야에서의 연구자에게 광범위하게 공지되어 있고 가용할 수 있는 IMGT 명명법을 참조로 기재된다. 예를 들어, 문헌(참조: LeFranc and LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10o; and Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266)을 참조한다. 간략하게, αβTCR은 2개의 디설파이드 연결된 쇄로 이루어진다. 각각의 쇄 (알파 및 베타)는 일반적으로 2개의 도메인, 즉, 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로서 간주된다. 짧은 연결 영역은 가변 및 불변 도메인을 연결하고 전형적으로 알파 가변 영역의 일부로서 간주된다. 추가로, 베타 쇄는 일반적으로, 전형적으로 베타 가변 영역의 일부로도 간주되는, 연결 영역에 인접한 짧은 다양성 영역을 함유한다.
각각의 쇄의 가변 도메인은 N-말단에 위치하고 프레임워크 서열 (FR)에 매립된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. CDR은 펩타이드-MHC 결합을 위한 인지 부위를 포함한다. 알파 쇄 가변 (Vα) 영역을 암호화하는 여러 유전자 및 베타 쇄 가변 (Vβ) 영역을 암호화하는 여러 유전자가 있고, 이들은 이들의 프레임워크, CDR1 및 CDR2 서열 및 부분적으로 한정된 CDR3 서열에 의해 구분된다. Vα 및 Vβ 유전자는 각각 접두어 TRAV 및 TRBV에 의한 IMGT 명명법에서 언급된다(참조: Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). 마찬가지로, 각각 알파 및 베타 쇄에 대해 TRAJ 또는 TRBJ로 호칭되는 여러 연결 또는 J 유전자들, 및 베타 쇄에 대해 TRBD로 호칭되는 다양성 또는 D 유전자들이 있다(참조: Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). T 세포 수용체 쇄의 거대한 다양성은 대립형질 변이체 및 접속 다양성을 포함하는, 다양한 V, J 및 D 유전자 간의 조합 재정렬로부터 비롯된다(참조: Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107.). TCR 알파 및 베타 쇄의 불변 또는 C 영역은 각각 TRAC 및 TRBC로서 언급된다(참조: Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10).
본원 발명자들은 놀랍게도 고친화성 및 고특이성으로 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 결합할 수 있는 신규 TCR을 발견하였다. 상기 TCR은 다수의 돌연변이가 도입되는 적합한 스캐폴드 서열로부터 조작된다. 본 발명의 TCR은 치료학적 용도를 위해 특히 적합한 프로파일을 갖는다. 일반적으로, 상기 TCR의 동정은 간단하지 않고 전형적으로 높은 마모율을 갖는다.
제1의 경우에, 당업자는 적합한 출발, 또는 스캐폴드 서열을 동정할 필요가 있다. 전형적으로, 그러한 서열은 천연 공급원으로부터, 예를 들어, 공여자 혈액으로부터 추출된 항원 반응 T 세포로부터 수득된다. 천연 레퍼토리에서 암 특이적 T 세포가 드물다는 것을 고려하여, 반응 T 세포가 발견되기 전에 많은 공여자, 예를 들어 20 개 이상을 스크리닝하는 것이 종종 필요하다. 스크리닝 공정은 수주 또는 수개월 걸릴 수 있고 심지어 반응 T 세포가 발견되더라도 이것은 면역치료학적 용도에 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, 반응은 너무 약하고/하거나 표적 항원에 특이적일 수 없다. 대안적으로, 클론성 T 세포 집단을 생성할 수 없거나, 정확한 TCR 쇄 서열을 동정하기에 충분한 물질을 생성하도록 주어진 T 세포주를 확장 또는 유지하는 것이 불가능할 수 있다. 출발 또는 스캐폴드 서열로서 적합한 TCR 서열은 하기의 성질 중 하나 이상을 가져야만 한다: 표적 펩타이드-HLA 복합체에 대해, 예를 들어, 200 μM 이상 강한 양호한 친화성; 고수준의 표적 특이성, 예를 들어, 대안적 펩타이드-HLA 복합체에 대해 상대적으로 약한 결합 또는 비결합; 파아지 디스플레이와 같은 디스플레이 라이브러리에 사용하기 용이함; 및 재폴딩되고 고수율로 정제될 수 있음. TCR 인지의 퇴행성 성질을 고려하면, 당업자들에게는 특정 스캐폴드 TCR 서열이 치료학적 사용을 위한 조작에 적격일 수 있게 하는 특이성 프로파일을 갖는지의 여부를 결정한다는 것은 매우 어렵다(참조:Wooldridge, et al., J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2):1168-77).
다음 과제는 TCR이 특이성 및 수율과 같은 목적할 수 있는 특징을 보유하면서 표적 항원에 대해 보다 높은 친화성을 갖도록 조작하는 것이다. 이들이 천연적으로 존재하는 바와 같이 TCR은 항체와 비교하여 표적 항원에 대해 약한 친화성 (낮은 마이크로몰 범위)을 갖고, 암 항원에 대한 TCR은 전형적으로 바이러스 특이적 TCR보다 약한 항원 인지를 갖는다(참조: Aleksic, et al. Eur J Immunol. 2012 Dec;42(12):3174-9). 암 세포에 대한 HLA 하향 조절과 커플링된 이러한 약한 친화성은 암 면역치료요법에 대한 치료학적 TCR이 전형적으로 표적 항원에 대해 이들의 친화성을 증가시킴에 따라서 보다 강력한 반응을 생성하기 위해서는 조작될 필요가 있음을 의미한다. 그러한 친화성 증가는 가용성 TCR-기반 시약에 필수적이다. 그러한 경우에, 나노몰 내지 피코몰 범위의 항원-결합 친화성은 수시간의 결합 반감기와 함께 요구될 수 있다. 낮은 에피토프 수에서 고친화성 항원 인지에 의해 생성되는 개선된 효능은 문헌(참조: Liddy et al. (Liddy, et al., Nat Med. 2012 Jun;18(6):980-7))의 도 1e 및 1f에 예시되어 있다. 친화성 성숙화 공정은 전형적으로 당업자가 항원 인지 강도를 증가시키기 위한 출발 TCR 서열에 대해 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 돌연변이 및/또는 돌연변이의 조합을 조작해야만 함을 포함한다. 주어진 TCR에 대한 친화성 증진 돌연변이를 조작하기 위한 방법, 예를 들어, 디스플레이 라이브러리의 사용은 당업계에 공지되어 있다(참조: Li et al., Nat Biotechnol. 2005 Mar;23(3):349-54; Holler et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 May 9;97(10):5387-92). 그러나, 주어진 표적에 대한 주어진 TCR의 친화성에서 상당한 증가를 생성하기 위해서, 당업자는 가능한 대안의 거대 풀로부터 돌연변이의 조합을 조작해야만 할 수 있다. 친화성에서 유의적 증가를 생성하는 특정 돌연변이 및/또는 돌연변이의 조합은 예측 가능하지 않고 높은 마모율이 있다. 많은 경우에, 주어진 TCR 출발 서열과의 친화성에서 유의적 증가를 성취할 수 없다.
친화성 성숙화 공정은 또한 TCR 항원 특이성을 유지할 필요성을 고려해야만 한다. 이의 표적 항원에 대한 TCR 친화성의 증가는 고유한 TCR 항원 인지의 퇴행성의 결과로서 다른 의도되지 않은 표적과의 교차 반응성을 나타낼 상당한 위험을 초래한다(참조: Wooldridge, et al., J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2):1168-77; Wilson, et al., Mol Immunol.2004 Feb;40(14-15):1047-55; Zhao et al., J Immunol. 2007 Nov 1;179(9):5845-54). 천연의 친화성 수준에서, 교차 반응 항원의 인지는 너무 낮아서 반응을 생성할 수 없다. 교차 반응 항원이 정상의 건강한 세포 상에서 디스플레이되는 경우, 생체내 오프-표적 결합 가능성이 강하여 이는 임상적 독성으로 나타날 수 있다. 따라서, 항원 결합 강도를 증가시키는 것 이외에, 당업자는 또한 TCR이 표적 항원에 대해 높은 특이성을 보유하도록 하고 임상전 시험에서 양호한 안전성 프로파일을 입증할 수 있는 돌연변이 및 또는 돌연변이의 조합을 조작해야만 한다. 다시 말해서, 적합한 돌연변이 및/또는 돌연변이의 조합은 예측 가능하지 않다. 이 단계에서 마모율은 심지어 보다 높고 많은 경우 주어진 TCR 출발 서열로부터 전혀 성취할 수 없다.
상기된 어려움에도 불구하고, 본원 발명자들은 특정 고친화성 (피코몰 범위) 및 고도의 항원 특이성을 갖는 돌연변이 TCR을 동정하였다. 상기 TCR은 T 세포 재지시 모이어티에 융합된 가용성 시약으로서 제조되는 경우 PRAME 양성 암 세포의 강력한 사멸을 입증한다.
제1 양상에서, 본 발명은 HLA-A*02와 복합체화된 SLLQHLIGL (서열번호 1)에 결합하는 성질을 갖고 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 (TCR)를 제공하며, 이들 도메인 각각은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, 여기서, FR은 프레임워크 영역이고, CDR은 상보성 결정 영역이며, 여기서,
(a) 알파 쇄 CDR은 하기의 서열을 갖는다:
CDR1 - TISGTDY(서열번호 39)
CDR2 - GLTSN (서열번호 40)
CDR3 - CILILGHSGAGSYQLTF(서열번호 41)
(임의로 하나 이상의 돌연변이를 가짐),
및/또는
(b) 베타 쇄 CDR은 하기의 서열을 갖는다:
CDR1 - LNHDA (서열번호 42)
CDR2 - SQIVNDF (서열번호 43)
CDR3 - CASSPWTSGSREQYF (서열번호 44)
(임의로 하나 이상의 돌연변이를 가짐).
제1 양상의 TCR에서, 알파 쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 하기의 프레임워크 서열을 포함할 수 있다:
FR1 - 서열번호 2의 아미노산 1-25
FR2 - 서열번호 2의 아미노산 33-49
FR3 - 서열번호 2의 아미노산 55-87
FR4 - 서열번호 2의 아미노산 105-114
또는 상기 서열과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 각각의 서열, 및/또는
베타 쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 하기의 서열을 포함할 수 있다:
FR1 - 서열번호 3의 아미노산 1-26
FR2 - 서열번호 3의 아미노산 32-48
FR3 - 서열번호 3의 아미노산 56-90
FR4 - 서열번호 3의 아미노산 106-114
또는 상기 서열과 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 각각의 서열.
용어 '돌연변이'는 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 모계 (또는 야생형 또는 스캐폴드) TCR에 대한 돌연변이는 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 대한 TCR의 결합 친화성 (kD 및/또는 결합 반감기)을 증가시키는 것들을 포함할 수 있다.
통상적으로, 베타 쇄 잔기 F55는 프레임워크 영역 3의 일부인 것으로 고려된다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해, 베타 쇄 잔기 F55는 CDR2의 일부인 것으로 고려된다.
알파 쇄 프레임워크 영역 FR1, FR2, 및 FR3은 TRAV 26-2 쇄에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있고/있거나 베타 쇄 프레임워크 영역 FR1, FR2 및 FR3은 TRBV19 쇄의 것들에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
FR4 영역은 알파 및 베타 가변 쇄 (각각 TRAJ 및 TRBJ)의 연결 영역을 포함할 수 있다.
TCR 알파 쇄 가변 영역에는 적어도 하나의 돌연변이가 있을 수 있다. 알파 쇄 CDR에는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 돌연변이가 있을 수 있다. 알파 쇄 CDR3에는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 돌연변이가 있을 수 있다. 상기 돌연변이 중 하나 이상은 서열번호 2의 넘버링을 참조로 하기의 돌연변이로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00001
따라서, 임의로 다른 돌연변이와 조합된, 상기 표에는 임의의 또는 모든 돌연변이가 있을 수 있다.
알파 쇄 CDR3은 하기 그룹의 돌연변이 중 하나를 포함할 수 있다 (서열번호 2의 넘버링을 참조로):
Figure pct00002
돌연변이의 바람직한 그룹은 그룹 1이다. 돌연변이의 또 다른 바람직한 그룹은 그룹 2이다.
알파 쇄 CDR3은 하기로부터 선택된 서열을 가질 수 있다:
Figure pct00003
바람직한 알파 쇄 CDR3은 CILILGHSRAGNYIATF (서열번호 45)이다. 바람직한 알파 쇄 CDR3은 CILILGHSRLGNYIATF (서열번호 46)이다.
TCR 베타 쇄 가변 영역에는 적어도 하나의 돌연변이가 있을 수 있다. 베타 쇄 CDR에는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 돌연변이가 있을 수 있다. 베타 쇄 CDR3에는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 돌연변이가 있을 수 있다. 상기 돌연변이 중 하나 이상은 서열번호 3의 넘버링을 참조로 하기의 돌연변이로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00004
따라서, 임의로 다른 돌연변이와 조합된, 상기 표에서의 임의의 돌연변이 또는 모든 돌연변이가 있을 수 있다.
베타 쇄 CDR2 및 CDR3은 하기 그룹의 돌연변이 중 하나를 포함할 수 있다 (서열번호 3의 넘버링을 참조로):
Figure pct00005
돌연변이의 바람직한 그룹은 그룹 1이다. 돌연변이의 바람직한 그룹은 그룹 9이다.
베타 쇄 CDR2는 하기로부터 선택된 서열을 가질 수 있다:
Figure pct00006
바람직한 베타 쇄 CDR2는 SQIMGDE (서열번호 48)이다.
베타 쇄 CDR3은 하기로부터 선택된 서열을 가질 수 있다:
Figure pct00007
바람직한 베타 쇄 CDR3은 CASSWWTGGASPISF (서열번호 51)이다. 바람직한 베타 쇄 CDR3은 CASSWWTGGASPIRF (서열번호 58)이다.
베타 쇄 CDR2 및 CDR3의 바람직한 조합은 다음과 같다:
Figure pct00008
바람직한 조합은 조합 1이다. 또 다른 바람직한 조합은 조합 9이다.
바람직한 구현예에서, TCR 알파 및 베타 쇄 CDR 서열은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00009
바람직한 조합은 조합 1이다. 바람직한 조합은 조합 17이다.
CDR 내 돌연변이(들)는 바람직하게 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 대한 TCR의 결합 친화성을 개선시키지만, 추가로 또는 대안적으로 단리된 형태에서 개선된 안정성 및 개선된 특이성과 같은 다른 이점을 제공할 수 있다. 하나 이상의 위치에서 돌연변이는 추가로 또는 대안적으로 예를 들어, 상호작용을 위해 보다 선호될 수 있는 각도를 제공함에 의해 인접한 위치와 동족체 pMHC 복합체의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 돌연변이는 비-특이적 결합의 양을 감소시킬 수 있는, 즉, SLLQHLIGL-HLA-A*02에 상대적으로 대안적 항원으로의 결합을 감소시킬 수 있는 것들을 포함할 수 있다. 돌연변이는 폴딩 및/또는 제조 효능을 증가시키는 것들을 포함할 수 있다. 일부 돌연변이는 이들 특징 각각에 기여할 수 있고; 다른 것들은 예를 들어, 특이성이 아닌 친화성에 또는 친화성이 아닌 특이성 등에 기여할 수 있다.
전형적으로, 총 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개 이상의 CDR 돌연변이는 표적 항원에 대해 pM 친화성을 갖는 TCR을 수득할 필요가 있다. 총 적어도 5개, 적어도 10개 또는 적어도 15개 CDR 돌연변이는 표적 항원에 대해 pM 친화성을 갖는 TCR을 수득할 필요가 있을 수 있다. 표적 항원에 대해 pM 친화성을 갖는 TCR은 특히 가용성 치료제로서 적합하다. 입양 치료요법 적용에 사용하기 위한 TCR은 표적 항원에 대해 보다 낮은 친화성 및 따라서 보다 적은 CDR 돌연변이, 예를 들어, 총 최대 1개, 최대 2개, 최대 5개 이상의 CDR 돌연변이를 가질 수 있다. 입양 치료요법 적용에 사용하기 위한 TCR은 표적 항원에 대해 보다 낮은 친화성 및 따라서 보다 적은 CDR 돌연변이, 예를 들어, 총 최대 1개, 최대 2개, 또는 최대 5개의 CDR 돌연변이를 가질 수 있다.
돌연변이는 추가로 또는 대안적으로 프레임워크 영역 내 CDR의 외부에서 만들어질 수 있고; 그러한 돌연변이는 TCR의 정제된 가용성 형태의 결합, 및/또는 특이성 및/또는 안정성, 및/또는 수율을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 TCR은 추가로 또는 대안적으로 알파 쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 알파 쇄 가변 영역 FR1은 서열번호 2의 넘버링을 사용하여 -1 위치에서, 즉, 위치 1 앞에 삽입된 G 잔기를 갖는다. 위치 -1에서 G는 이. 콜리 (E. coli)에서 생산 동안에 N-말단 메티오닌의 절단 효율을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 비효율적인 절단은 치료제에 해로울 수 있는데, 이것은 이종성 단백질 생성물을 초래할 수 있고/있거나 개시 메티오닌의 존재는 인간에서 면역원성일 수 있기 때문이다.
바람직하게, 본 발명의 TCR의 α 쇄 가변 도메인은 서열번호 2의 프레임워크 아미노산 잔기 1-25, 33-49, 55-87, 105-114에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 각각의 프레임워크 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 TCR의 베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 3의 프레임워크 아미노산 잔기 1-26, 32-48, 56-90, 106-114에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 각각의 프레임워크 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 언급된 백분율 동일성은 전체로서 고려되는 경우 프레임워크 서열에 대한 것일 수 있다.
알파 쇄 가변 도메인은 서열번호 6 내지 8의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있고, 베타 쇄 가변 도메인은 서열번호 9 내지 24의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
예를 들어, TCR은 하기의 알파 및 베타 쇄 쌍을 포함할 수 있다.
Figure pct00010
바람직한 TCR 쇄 쌍 형성은 서열번호 6 및 서열번호 9이다. 바람직한 TCR 쇄 쌍 형성은 서열번호 7 및 서열번호 17이다.
본 발명의 범위 내에는 본원에 개시된 발명의 임의의 TCR의 표현형적으로 사일런트 변이체가 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표현형적으로 사일런트 변이체"는 TCR이 상기 변화(들) 없이 상응하는 TCR과 유사한 표현형을 갖는, 상기 제시된 것들 이외에 치환, 삽입 및 결실을 포함하는, 하나 이상의 추가의 아미노산 변화가 도입된 TCR 가변 도메인을 언급하는 것으로 이해된다. 상기 적용의 목적을 위해, TCR 표현형은 결합 친화성 (KD 및/또는 결합 반감기) 및 특이성을 포함한다. 바람직하게, 면역 이펙터와 연관된 가용성 TCR에 대한 표현형은 결합 친화성 및 특이성 이외에 면역 활성화 및 정제 수율의 효능을 포함한다. 표현형적으로 사일런트 변이체는 동일한 조건 (예를 들어, 25℃에서 및/또는 동일한 SPR 칩 상에서)하에서 측정되는 경우 상기 변화(들)가 없는 상응하는 TCR의 측정되는 KD 및/또는 결합 반감기의 50% 이내에, 또는 보다 바람직하게 30%, 25% 또는 20% 이내에서 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 대해 KD 및/또는 결합 반감기를 가질 수 있다. 적합한 조건은 실시예 3에 추가로 제공된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체와의 상호작용의 친화성 및 또는 다른 기능성 특징을 변화시키지 않은 상기 상세한 것들과 비교하여 이의 가변 도메인 내 변화를 혼입하는 TCR을 생성할 수 있다. 특히, 그러한 사일런트 돌연변이는 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않는 것으로 공지된 서열의 일부 (예를 들어, 프레임워크 영역 및 또는 항원과 접촉하지 않는 CDR의 일부) 내에 혼입될 수 있다. 그러한 변이체는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
표현형적으로 사일런트 변이체는 하나 이상의 보존 치환 및/또는 하나 이상의 관용성 치환을 함유할 수 있다. 관용성 치환이란, 하기에 제공된 보존성 정의 하에 있지 않지만 그럼에도 불구하고 표현형적으로 사일런트한 치환체들을 의미한다. 당업자는 다양한 아미노산이 유사한 성질을 갖고 따라서 '보존성'임을 알고 있다. 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 그러한 하나 이상의 아미노산은 흔히 상기 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 목적하는 활성을 제거하는 것 없이 하나 이상의 다른 그러한 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
따라서, 아미노산 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 흔히 서로 (지방족 측쇄를 갖는 아미노산) 치환될 수 있다. 이들 가능한 치환 중에서, 글라이신 및 알라닌은 서로 치환하기 위해 사용되고 (이들은 비교적 짧은 측쇄를 갖기 때문에) 발린, 류신 및 이소류신은 서로 치환하기 위해 사용되는 것 (이들은 소수성인 보다 큰 지방족 측쇄를 갖기 때문에)이 바람직하다. 흔히 서로에 대해 치환될 수 있는 다른 아미노산은 다음을 포함한다: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파르테이트 및 글루타메이트 (산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민 (아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌 (황 함유 측쇄를 갖는 아미노산). 본 발명의 범위 내 아미노산 치환은 천연적으로 존재하거나 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 사용하여 수행될 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 예를 들어, 본원에서 알라닌 상의 메틸 그룹은 에틸 그룹으로 대체될 수 있고/있거나 최소 변화는 펩타이드 골격에 만들어질 수 있는 것으로 고려된다. 천연 또는 합성 아미노산이 사용되는지에 상관없이, L-아미노산만이 존재하는 것이 바람직하다.
이러한 특성의 치환은 흔히 "보존성" 또는 "반-보존성" 아미노산 치환으로 지칭된다. 따라서, 본 발명은 상기 기술된 임의의 아미노산 서열을 포함하지만 서열 내 하나 이상의 보존성 치환 및 하나 이상의 관용성 치환을 갖는 TCR의 용도로 확장되고, TCR의 아미노산 서열은 서열번호 2, 6 내지 8의 아미노산 1 내지 114 및/또는 서열번호 3, 9 내지 24의 아미노산 1 내지 114를 포함하는 TCR과 적어도 90% 동일성, 예컨대 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.
당업계에 공지된 바와 같은 "동일성"은 서열을 비교함에 의해 결정된 바와 같이 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 관계이다. 당업계에서, 동일성은 또한 그러한 서열의 스트링 사이의 매칭에 의해 결정된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 서열 관련성 정도를 의미한다. 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재하지만, 동일성을 결정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법은 컴퓨터 프로그램에 코드화된다. 2개의 서열 간의 동일성을 결정하기 위해 바람직한 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 팩키지(참조: Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (참조: Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990))를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
당업자는 아미노산 서열을 비교하기 위해 CLUSTAL 프로그램과 같은 프로그램을 사용할 수 있다. 이 프로그램은 아미노산 서열을 비교하고 적당히 어느 하나의 서열에서 공간을 삽입함에 의해 최적의 정렬을 모색한다. 최적의 정렬을 위해 아미노산 동일성 또는 유사성 (아미노산 유형의 동일성 + 보존성)을 계산할 수 있다. BLASTx와 같은 프로그램은 유사 서열의 가장 긴 스트레치를 할당하고 값을 피트에 할당한다. 따라서, 유사성의 여러 영역이 발견되고, 각각이 상이한 스코어를 갖는 경우의 비교를 수득할 수 있다. 동일성 분석의 유형 둘 다가 본 발명에 고려된다.
2개 아미노산 서열 또는 2개 핵산 서열의 백분율 동일성은 최적의 비교 목적을 위해 (예를 들어, 갭이 서열과의 최상의 정렬을 위해 제1 서열에 도입될 수 있다) 서열을 정렬하고 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교함에 의해 결정된다. "최상의 정렬"은 최고의 백분율 동일성을 초래하는 2개 서열의 정렬이다. 백분율 동일성은 비교되는 서열 내 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 수에 의해 결정된다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x 100).
2개의 서열 간의 백분율 동일성의 결정은 당업자에게 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 성취될 수 있다. 2개의 서열을 비교하기 위한 수학적 알고리즘의 하나의 예는 문헌(참조: Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)에서와 같이 변형된, 문헌(참조: Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)의 알고리즘이다. 문헌(참조: Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)의 BLASTn 및 BLASTp 프로그램은 그러한 알고리즘을 혼입하였다. 2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 백분율 동일성의 결정은 BLASTn 프로그램을 수행하여 수행될 수 있다. 2개의 단백질 서열 간의 백분율 동일성의 결정은 BLASTp 프로그램을 수행하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭화된 정렬을 수득하기 위해, 갭화된 BLAST는 문헌(참조: Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 사용하여 분자 간의 원거리 관계를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다 (Id.). BLAST, 갭화된 BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터 (예를 들어, BLASTp 및 BLASTp)가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.를 참조한다. 디폴트 일반 파라미터는 예를 들어, 단어 크기 = 3, 예상 역치 = 10을 포함할 수 있다. 파라미터는 짧은 입력 서열을 자동적으로 조정하기 위해 선택될 수 있다. 서열 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 예는 문헌(참조: Myers and Miller, CABIOS (1989))의 알고리즘이다. CGC 서열 정렬 소프트웨어 팩키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)은 그러한 알고리즘을 도입하였다. 당업계에 공지된 서열 분석을 위한 다른 알고리즘은 문헌(참조:Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5)에 기재된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌(참조: Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8)에 기재된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에, ktup는 검색 민감성 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다. 본원 개시내용 중에 백분율 동일성을 평가하기 위해, 디폴트 파라미터와 함께 BLASTp는 비교 방법으로서 사용된다. 추가로, 언급된 백분율 동일성이 아미노산에 대해 비-전체 수 값을 제공한다 (즉, 90% 서열 동일성을 갖는 25개 아미노산의 서열은 "22.5"의 값을 제공하고, 수득된 값은 다음 전체 수로 내림에 따라서 "22"이다). 따라서, 제공된 예에서, 25개 아미노산 중 22개 매칭을 갖는 서열은 90% 서열 동일성 내에 있다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 이의 C-말단 및/또는 N-말단에서 제공된 서열을 TCR의 기능적 특징에 실질적으로 영향을 미치는 것 없이 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 잔기에 의해 절단하거나 연장하는 것이 가능할 수 있다. 이의 C-말단 및/또는 N-말단에 제공된 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 잔기에 의해 절단되거나 연장될 수 있다. 모든 상기 변이체는 본 발명에 의해 포함된다.
보존성 및 관용성 치환, 삽입 및 결실을 포함하는 돌연변이는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 제한 효소-기반 클로닝 또는 결찰 무관한 클로닝 (LIC) 과정을 기반으로 하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적당한 방법을 사용하여, 제공된 서열로 도입될 수 있다. 이들 방법은 많은 표준 분자 생물학 텍스트에 상세히 기재되어 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 제한 효소-기반 클로닝에 관한 추가의 세부 사항에 대해서, 문헌(Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press)을 참조한다. 결찰 무관한 클로닝 (LIC) 과정들에 대한 추가의 정보는 문헌(참조: Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6)에서 발견될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 TCR 서열은 당업계에 공지된 고체 상태 합성, 또는 임의의 다른 적당한 방법으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 TCR은 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 결합하는 성질을 갖는다. 본 발명의 TCR은 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 대한 고도의 특이성을 입증하고 따라서 특히 치료학적 사용을 위해 적합하다. 본 발명의 TCR과 관련된 특이성은 항원 음성인 HLA-A*02 표적 세포를 인지하는 최소의 능력을 가지면서 항원 양성인 HLA-A*02 표적 세포를 인지하는 이들의 능력에 관한 것이다.
특이성은 예를 들어, 실시예 6, 7 및 8에 기재된 것들과 같은 세포 검정에서 시험관내 측정될 수 있다. 특이성을 시험하기 위해, TCR은 가용성 형태일 수 있고 면역 이펙터와 연관될 수 있고/있거나, T 세포와 같은 세포의 표면 상에 발현될 수 있다. 특이성은 항원 양성 및 항원 음성 표적 세포의 존재하에 T 세포 활성화 수준을 측정함에 의해 결정될 수 있다. 항원 음성 표적 세포의 최소 인지는 동일한 조건하에서 치료학적 관련 TCR 농도에서 측정되는 경우 항원 양성 표적 세포의 존재하에 생성된 수준의 20% 미만, 바람직하게 10% 미만, 바람직하게 5% 미만, 및 보다 바람직하게 1% 미만의 T 세포 활성화 수준으로 정의된다. 면역 이펙터와 연관된 가용성 TCR을 위해, 치료학적 관련 농도는 10-9 M 이하의 TCR 농도, 및/또는 상응하는 EC50 값보다 최대 100배, 바람직하게 최대 1000배 더 큰 농도로 정의될 수 있다. 바람직하게, 면역 이펙터와 연관된 가용성 TCR에 대해, 항원 음성 세포에 상대적으로, 항원 양성 세포에 대한 T 세포 활성화를 위해 요구되는 농도에서 적어도 100배 차이가 있다. 항원 양성 세포는 적합한 펩타이드 농축을 사용한 펩타이드-펄싱으로 암 세포에 상응할 수 있는 항원 제공의 수준(예를 들어, 문헌(참조: Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840)에 기재된 바와 같이 10-9 M 펩타이드)을 수득함에 의해 수득될 수 있거나, 이들은 천연적으로 상기 펩타이드를 제공할 수 있다. 바람직하게, 항원 양성 및 항원 음성 세포 둘 다는 인간 세포이다. 바람직하게, 항원 양성 세포는 인간 암 세포이다. 항원 음성 세포는 바람직하게 건강한 인간 조직으로부터 유래된 것들을 포함한다.
특이성은 추가로 또는 대안적으로 SLLQHLIGL (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하지만 대안적 펩타이드-HLA 복합체의 패널에 결합하지 않는 TCR의 능력에 관한 것이다. 이것은 예를 들어, 실시예 3의 바이오코어 방법에 의해 결정될 수 있다. 상기 패널은 적어도 5개, 및 바람직하게 적어도 10개의 대안적 펩타이드-HLA-A*02 복합체를 함유할 수 있다. 대안적 펩타이드는 서열번호 1과 낮은 수준의 서열 동일성을 공유할 수 있고 천연적으로 제공될 수 있다. 대안적 펩타이드는 바람직하게 건강한 사람 조직에서 발현되는 단백질로부터 유래한다. SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체로의 TCR의 결합은 다른 천연적으로 제공된 펩타이드 HLA 복합체로의 결합 보다 적어도 2배 초과, 보다 바람직하게 적어도 10배 초과, 또는 적어도 50배 초과 또는 적어도 100배 초과, 심지어 보다 바람직하게 적어도 400배 초과일 수 있다.
TCR 특이성을 결정하기 위한 대안적 또는 추가의 접근법은 순차적 돌연변이 유발, 예를 들어, 알라닌 스캐닝을 사용한 TCR의 펩타이드 인지 모티프를 동정하는 것일 수 있다. 결합 모티프의 일부를 형성하는 잔기들은 치환에 허용될 수 없는 것들이다. 허용될 수 없는 치환은 상기 펩타이드 위치로서 정의될 수 있고, 여기서, TCR의 결합 친화성은 비-돌연변이된 펩타이드에 대한 결합 친화성에 상대적으로 적어도 50%, 또는 바람직하게 적어도 80%까지 감소된다. 그러한 접근법은 문헌(참조: Cameron et al., (2013), Sci Transl Med. 2013 Aug 7; 5 (197): 197ra103 및 WO2014096803)에 추가로 기재되어 있다. 이 경우에 TCR 특이성은 인간 프로테옴에서 펩타이드, 특히 대안적 모티프 함유 펩타이드를 동정하고 TCR로의 결합을 위해 이들 펩타이드를 시험함에 의해 결정될 수 있다. TCR의 하나 이상의 대안적 펩타이드로의 결합은 특이성의 부재를 지적할 수 있다. 이 경우에, 세포 검정을 통한 TCR 특이성의 추가의 시험이 요구될 수 있다.
본 발명의 TCR은 치료학적 시약으로서 사용하기 위해 이상적인 안전성 프로파일을 가질 수 있다. 이 경우에, TCR은 가용성 형태일 수 있으며, 바람직하게 면역 이펙터에 융합될 수 있다. 적합한 면역 이펙터는 사이토킨, 예를 들어, IL-2 및 IFN-γ; 슈퍼항원 및 이의 돌연변이체; 케모킨, 예를 들어, IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질; T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포 상의 항원에 결합하는 이의 단편, 유도체 및 변이체를 포함하는 항체 (예를 들어, 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16); 및 상보체 활성화제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이상적인 안전성 프로파일은 양호한 특이성을 입증할 뿐만 아니라, 본 발명의 TCR이 추가의 임상전 안전성 시험을 통과할 수 있음을 의미한다. 그러한 시험의 예는 전혈의 존재하에 최소 사이토킨 방출 및 따라서 생체내 잠재적 사이토킨 방출 증후군을 유발할 낮은 위험성을 확인하기 위한 전혈 검정, 및 대안적 HLA 유형의 인지를 위해 낮은 잠재력을 확인하기 위한 동종반응 시험을 포함한다.
본 발명의 TCR은 고수율의 정제, 특히 가용성 포맷의 TCR에 적합할 수 있다. 수율은 정제 공정 동안에 보유되는 물질의 양 (즉, 재폴딩 전 수득된 가용화된 물질의 양에 상대적으로 정제 공정 말기에 수득된 올바르게 폴딩된 물질의 양)을 기준으로 결정될 수 있고/있거나, 수율은 본래의 배양 용적에 상대적으로 정제 공정 말기에 수득된 올바르게 폴딩된 물질의 양을 기준으로 할 수 있다. 고수율은 1% 초과, 또는 보다 바람직하게 5% 초과 또는 보다 높은 수율을 의미한다. 고수율은 1 mg/ml 초과, 또는 보다 바람직하게 3 mg/ml 초과, 또는 5 mg/ml 초과, 또는 보다 높은 수율을 의미한다.
본 발명의 TCR은 바람직하게 비-돌연변이된 또는 스캐폴드 TCR보다 큰 (즉, 보다 강한) SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 대해, 예를 들어, 1 pM 내지 100 μM의 범위의 KD를 갖는다. 하나의 양상에서, 본 발명의 TCR은 복합체에 대해 약 (즉, +/- 10%) 1 pM 내지 약 400 nM, 약 1 pM 내지 약 1000 pM, 약 1 pM 내지 약 500 pM의 KD를 갖는다. 상기 TCR은 추가로 또는 대안적으로 복합체에 대해 약 1분 내지 약 60시간, 약 20분 내지 약 50시간, 또는 약 2시간 내지 약 35시간 범위의 결합 반감기 (T½)를 갖는다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 TCR은 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 대해 약 1 pM 내지 약 500 pM의 KD 및/또는 약 2시간 내지 약 35시간의 결합 반감기를 갖는다. 그러한 고친화성은 치료학적 제제 및/또는 검출 가능한 표지와 연합된 경우 가용성 포맷의 TCR에 대해 바람직할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 TCR은 복합체에 대해 약 50 nM 내지 약 200 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 1 μM의 KD 및/또는 복합체에 대해 약 3초 내지 약 12분의 결합 반감기를 가질 수 있다. 그러한 TCR은 입양 치료요법 적용을 위해 바람직할 수 있다.
결합 친화성 (평형 상수 KD에 반비례하는) 및 결합 반감기 (T½로서 표현되는)를 결정하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 구현예에서, 결합 친화성 및 결합 반감기는 각각 표면 플라스몬 공명 (SPR) 또는 바이오-층 간섭계 (BLI)를 사용하여, 예를 들어, BIAcore 장비 또는 Octet 장비를 사용하여 결정된다. 바람직한 방법은 실시예 3에 제공된다. TCR의 친화성 배가는 KD가 절반으로 된다는 것이 인지될 것이다. T½은 In2를 오프-레이트 (k오프)로 나누어 계산된다. 따라서, T½의 배가는 k오프 절반을 초래한다. TCR에 대한 KD 및 k오프 값은 일반적으로 TCR의 가용성 형태, 즉 세포질 및 막관통 도메인 잔기를 제거하기 위해 절단되는 형태들에 대해 측정된다. 독립적 측정들 간의 변화 및 특히 20시간 초과 동안 해리 시간과의 상호작용을 설명하기 위해, 주어진 TCR의 결합 친화성 및 또는 결합 반감기는 동일한 검정 프로토콜 및 취해진 결과의 평균 값을 사용하여, 수회, 예를 들어, 3회 이상 측정될 수 있다. 2개의 샘플 간의 결합 데이터를 비교하기 위해 (즉, 2개의 상이한 TCR 및 또는 동일한 TCR의 2개 제제), 실시예 3에 기재된 것들과 같은 동일한 검정 조건 (예를 들어, 온도)을 사용하여 측정되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 특정의 바람직한 TCR은 본래의 TCR의 것보다 실질적으로 보다 높은, SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 대한 결합 친화성 및/또는 결합 반감기를 갖는다. 본래의 TCR의 결합 친화성의 증가는 흔히, 이의 펩타이드-MHC 리간드에 대한 TCR의 특이성을 감소시키고 이것은 문헌(참조: Zhao et al., (2007) J.Immunol, 179:9, 5845-5854)에서 입증된다. 그러나, 본 발명의 그러한 TCR은 본래의 TCR 보다 실질적으로 높은 결합 친화성에도 불구하고, SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 대해 특이적인 것으로 남아있다.
특정의 바람직한 TCR은 항원 양성 세포에 대한, 특히 암 세포에 전형적인 낮은 수준의 항원을 제공 (즉, 세포당 5-100개, 예를 들어, 50개 항원 정도로, (참조: Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840; Purbhoo et al.,(2006). J Immunol 176(12): 7308-7316.))하는 이들 세포들에 대한 시험관내에서 고도로 강력한 T 세포 반응을 생성할 수 있다. 그러한 TCR은 가용성 형태일 수 있으며, 항-CD3 항체와 같은 면역 이펙터에 연결될 수 있다. 측정되는 T 세포 반응은 인터페론 γ 또는 그랜자임 B와 같은 T 세포 활성화 마커의 방출, 또는 표적 세포 사멸, 또는 T 세포 증식과 같은 T 세포 활성화의 다른 측정일 수 있다. 바람직하게, 고도의 강한 반응은 pM 범위, 가장 바람직하게 100 pM 이하의 EC50 값을 갖는 반응이다.
본 발명의 TCR은 αβ 이종이량체일 수 있다. 본 발명의 알파-베타 이종이량체 TCR은 일반적으로 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및/또는 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 포함한다. 불변 도메인은 전장일 수 있고 이는 세포외, 막관통 및 세포질 도메인이 존재하거나 이들이 가용성 포맷 (즉, 막관통 또는 세포질 도메인을 갖지 않는)으로 존재할 수 있음을 의미한다. 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 본래의 TRAC 및/또는 TRBC1/2 서열에 상대적으로 돌연변이, 치환 또는 결실을 함유할 수 있다. 용어 TRAC 및 TRBC1/2는 또한 예를 들어, TRAC의 위치 4에서 N에서 K로 천연 다형태 변이체를 포함한다(참조: Bragado et al International immunology. 1994 Feb;6(2):223-30)).
본 발명의 가용성 TCR에 대해, 알파 및 베타 쇄 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 간의 본래의 디설파이드 결합을 결실시키기 위한 절단 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)은 예를 들어, WO 03/020763에 기재된 바와 같이 각각의 불변 도메인의 잔기들 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 알파 및 베타 불변 도메인은 TRAC의 위치 Thr 48과 TRBC1 또는 TRBC2의 위치 Ser 57에서 시스테인 잔기들의 치환에 의해 변형될 수 있으며, 상기 시스테인은 TCR의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에 디설파이드 결합을 형성한다. TRBC1 또는 TRBC2는 추가로 불변 도메인의 위치 75에서 시스테인의 알라닌으로의 돌연변이 및 불변 도메인의 위치 89에서 아스파라긴의 아스파르트산으로의 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 αβ 이종이량체에 존재하는 세포외 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 C 말단 (terminus) 또는 C 말단 (termini)에서 예를 들어, 최대 15개, 또는 최대 10개 또는 최대 8개 이하의 아미노산까지 절단될 수 있다. 본 발명의 αβ 이종이량체에 존재하는 세포외 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 C 말단 (terminus) 또는 C 말단 (termini)에서 예를 들어, 최대 15개, 또는 최대 10개 또는 최대 8개 아미노산이 절단될 수 있다. 알파 쇄 세포외 불변 도메인의 C 말단은 8개 아미노산까지 절단될 수 있다. 가용성 TCR은 바람직하게 치료학적 제제 및/또는 검출 가능한 표지와 연관된다.
αβ 이종이량체 TCR의 불변 도메인은 전장일 수 있고 막관통 및 세포질 도메인 둘 다를 갖는다. 그러한 TCR은 각각의 알파 및 베타 불변 도메인 사이에서 천연적으로 발견되는 것에 상응하는 디설파이드 결합을 함유할 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 비-본래의 디설파이드 결합은 세포외 불변 도메인 사이에 존재할 수 있다. 비-본래의 디설파이드 결합은 추가로 WO03020763 및 WO06000830에 기재되어 있다. 비-본래의 디설파이드 결합은 TRAC의 위치 Thr 48과 TRBC1 또는 TRBC2의 위치 Ser57 사이에 있을 수 있다. 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 본래의 TRAC 및/또는 TRBC1/2 서열에 상대적으로 하나 이상의 돌연변이 치환 또는 결실을 함유할 수 있다. 전장 불변 도메인을 갖는 TCR은 입양 치료요법에 사용하기에 바람직하다.
본 발명의 TCR은 단일 쇄 포맷으로 존재할 수 있다. 단일 쇄 포맷은 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ 또는 Vα-Cα-L-Vβ-Cβ 유형의 αβ TCR 폴리펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서, Vα 및 Vβ는 각각 TCRα 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ는 각각 TCRα 및 β 불변 영역이고, L은 링커 서열이다(참조: Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. Dec 1;221(1-2):59-76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565-73; WO 2004/033685; WO9918129). 존재하는 경우, 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다는 전장일 수 있거나, 이들은 절단되고/되거나 상기된 바와 같이 돌연변이를 함유할 수 있다. 바람직하게, 단일 쇄 TCR은 가용성이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 단일 쇄 TCR은 WO 2004/033685에 기재된 바와 같이 각각의 불변 도메인의 잔기들 사이에 도입된 디설파이드 결합을 가질 수 있다. 단일 쇄 TCR은 추가로 문헌(WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829)에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 TCR을 나타내는 입자 및 입자 라이브러리 내 상기 입자의 봉입물을 포함한다. 그러한 입자는 파아지, 효모 세포, 리보솜 또는 포유동물 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 입자 및 라이브러리를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(참조: 예를 들어, WO2004/044004; WO01/48145, Chervin et al. (2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175-184).
본 발명의 가용성 TCR은 검출 가능한 표지 또는 치료학적 제제를 항원 제공 세포 및 항원 제공 세포를 함유하는 조직으로 전달하는데 유용하다. 따라서, 이들은 검출 가능한 표지 (TCR이 동족체 항원을 제공하는 세포의 존재를 검출하기 위해 사용되는 진단 목적을 위해); 및/또는 치료학적 제제; 및/또는 PK 변형 모이어티와 연합 (공유적으로 또는 기타 방식으로)될 수 있다.
PK 변형 모이어티의 예는 PEG(참조: Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64 and Jevsevar et al., (2010) Biotechnol J. Jan; 5(1):113-28), 파실화 (PASylation) (참조: Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug; 26(8): 489-501), 알부민 및 알부민 결합 도메인(참조: Dennis et al., (2002) J Biol Chem. Sep 20; 277(38): 35035-43), 및/또는 비구조화된 폴리펩타이드(참조: Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dec; 27(12): 1186-90)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 PK 변형 모이어티는 항체 Fc 단편을 포함한다.
진단 목적을 위해 검출 가능한 표지는 예를 들어, 형광성 표지, 방사능표지, 효소, 핵산 프로브 및 조영 시약을 포함한다.
일부 목적을 위해, 본 발명의 TCR은 여러 TCR을 포함하는 복합체로 응집되어 다가의 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 다가의 TCR 복합체의 생성에 사용될 수 있는 다량체화 도메인을 함유하는 다수의 인간 단백질이 있다. 예를 들어, p53의 사량체화 도메인은 단량체 scFv 단편과 비교하여 증가된 혈청 지속성 및 유의적으로 감소된 오프-레이트를 나타내는 scFv 항체 단편의 사량체를 생성하기 위해 사용되어 왔다(참조: Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). 헤모글로빈은 또한 이러한 종류의 적용을 위해 사용될 수 있는 사량체화 도메인을 갖는다. 본 발명의 다가 TCR 복합체는 본 발명의 비-다량체 야생형 또는 T 세포 수용체 이종이량체와 비교하여 복합체에 대해 증진된 결합 능력을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 TCR의 다가 복합체는 또한 본 발명 내에 포함된다. 본 발명에 따른 그러한 다가 TCR 복합체는 특히 시험관내 또는 생체내 특정 항원을 제공하는 세포를 트랙킹하거나 표적화하는데 유용하며, 또한 그러한 용도를 갖는 추가의 다가 TCR 복합체의 생성을 위한 중간체로서 유용하다.
본 발명의 TCR과 연합될 수 있는 치료학적 제제는 면역-조절제 및 이펙터, 방사능활성 화합물, 효소 (예를 들어, 퍼포린) 또는 화학치료학적 제제 (예를 들어, 시스-플라틴)를 포함한다. 독성 효과가 목적하는 위치에서 실행됨을 확신하기 위해, 독소는 TCR에 연결된 리포좀 내부에 있을 수 있어 상기 화합물은 느리게 방출된다. 이것은 신체 내 수송 동안에 손상 효과를 예방하고 독소가 TCR의 관련 항원 제공 세포로의 결합 후 최대 효과를 갖도록 보장할 것이다.
적합한 치료학적 제제의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
ㆍ 소분자 세포독성 제제, 즉, 700 돌턴 미만의 분자량을 갖는, 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 화합물. 그러한 화합물은 또한 세포독성 효과를 가질 수 있는 독성 금속을 함유할 수 있다. 추가로, 이들 소분자 세포독성 제제는 또한 프로드럭, 즉, 세포독성 제제를 방출하도록 생리학적 조건하에서 쇠퇴하거나 전환되는 화합물을 포함하는 것으로 이해되어야만 한다. 그러한 제제의 예는 시스-플라틴, 메이탄신 유도체, 라켈마이신, 칼리케아미신, 도세탁셀, 에토포시드, 겜시타빈, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 미톡산트론, 소르피머 소듐포토프린 II, 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트레에이트 아르보우레이트, 아우리스타틴 E 빈크리스틴 및 독소루비신;
ㆍ 펩타이드 세포독소, 즉, 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 이의 단백질 또는 단편. 예를 들어, 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 세균성 외독소 A, Dnase 및 Rnase;
ㆍ 방사성 핵종, 즉, α 또는 β 입자, 또는 γ 광선 중 하나 이상의 동시 방출과 함께 쇠퇴하는 요소들의 불안정 동위원소. 예를 들어, 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이트륨 90, 비스무쓰 210 및 213, 액티늄 225 및 아스타틴 213; 킬레이팅제는 이들 방사성 핵종을 고친화성 TCR 또는 이의 다량 체와의 회합을 용이하게하는데 사용될 수 있음;
ㆍ 면역-자극제, 즉, 면역 반응을 자극하는 면역 이펙터 분자. 예를 들어, 사이토킨, 예를 들어 IL-2 및 IFN-γ;
ㆍ 슈퍼항원 및 이의 돌연변이체;
ㆍ TCR-HLA 융합, 예를 들어, 펩타이드-HLA 복합체로의 융합 (여기서, 상기 펩타이드는 통상의 인간 병원체, 예를 들어, 엡슈타인 바르 바이러스 (EBV)로부터 유래된다);
ㆍ 케모킨, 예를 들어, IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등;
ㆍ 항-T 세포 또는 NK 세포 결정인자 항체 (예를 들어, 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16)를 포함하는 항체 또는 이의 단편;
ㆍ 항체 유사 결합 특징을 갖는 대안적 단백질 스캐폴드;
ㆍ 보체 활성화제;
ㆍ 이종발생 단백질 도메인, 동종이계 단백질 도메인, 바이러스/세균 단백질 도메인, 바이러스/세균 펩타이드.
하나의 바람직한 구현예는 면역 이펙터와 연합된 본 발명의 가용성 TCR에 의해 (일반적으로 알파 또는 베타 쇄의 N- 또는 C-말단으로의 융합에 의해) 제공된다. 특히 바람직한 면역 이펙터는 항-CD3 항체, 또는 상기 항-CD3 항체의 기능성 단편 또는 변이체이다 (그러한 TCR-항-CD3 융합은 ImmTACTM 분자로 호칭될 수 있다). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 그러한 단편 및 변이체를 포함한다. 항-CD3 항체의 예는 OKT3, UCHT-1, BMA-031 및 12F6을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 항체 단편 및 변이체/유사체는 몇개 이름을 거론하자면, 미니바디 (minibodies), Fab 단편, F(ab')2 단편, dsFv 및 scFv 단편, NanobodiesTM (이들 작제물로, Ablynx (Belgium)에 의해 시판되며, 낙타과 (예를 들어, 낙타 또는 라마) 항체로부터 유래된 합성 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인을 포함함) 및 도메인 항체 (Domantis (벨기에)로, 친화성 성숙화된 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인 또는 면역글로빈 가변 경쇄 도메인을 포함함) 또는 어피바디와 같은 항체 유사 결합 특징을 나타내는 대안적 단백질 스캐폴드 (Affibody (스웨덴)로, 조작된 단백질 A 스캐폴드를 포함함) 또는 안티칼린스 (Pieris (독일)로, 조작된 안티칼린스를 포함함)를 포함한다.
TCR 및 항-CD3 항체의 연결은 공유 또는 비-공유 부착을 통한 것일 수 있다. 공유 부착은 직접적이거나 링커 서열을 통해 간접적일 수 있다. 링커 서열은 일반적으로 가요성이고, 여기서, 이들은 주로 가요성을 제한할 가능성이 있는 벌크 측쇄를 갖지 않는, 글라이신, 알라닌 및 세린과 같은 아미노산으로 구성된다. 대안적으로, 보다 큰 강성을 갖는 링커가 바람직할 수 있다. 링커 서열의 사용될 수 있거나 최적의 길이는 용이하게 결정될 수 있다. 흔히, 링커 서열은 길이가 약 12개 미만, 예를 들어, 10개 미만 또는 2 내지 10개 아미노산이다. 본 발명의 TCR에 사용될 수 있는 적합한 링커의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: GGGGS (서열번호 31), GGGSG (서열번호 32), GGSGG (서열번호 33), GSGGG (서열번호 34), GSGGGP (서열번호 35), GGEPS (서열번호 36), GGEGGGP (서열번호 37), 및 GGEGGGSEGGGS (서열번호 38) (WO2010/133828에 기재된 바와 같음).
본 발명의 항-CD3-TCR 융합 작제물의 특정 구현예는 알파 및 베타 쇄 쌍 형성을 포함하고, 여기서, 알파 쇄는 서열번호 6-8의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 가변 도메인으로 구성되고/되거나 베타 쇄는 서열번호 9-24의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 가변 도메인으로 구성된다. 상기 알파 및 베타 쇄는 비-본래의 디설파이드 결합을 포함하는 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 알파 쇄의 불변 도메인은 8개 아미노산까지 절단될 수 있다. 알파 및/또는 베타 쇄의 N 또는 C 말단은 서열번호 31-38로부터 선택되는 링커를 통해 항-CD3 scFv 항체 단편에 융합될 수 있다. 그러한 항-CD3-TCR 융합 작제물의 특정의 바람직한 구현예는 하기에 제공된다:
Figure pct00011
또한, 본 발명의 범위내에서 상기 항-CD3-TCR 융합 작제물의 기능성 변이체가 포함된다. 상기 기능성 변이체는 바람직하게 참조 서열과 적어도 90% 동일성, 예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖지만 그럼에도 불구하고 기능적으로 균등하다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 TCR, 또는 TCR 항-CD3 융합을 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 cDNA이다. 일부 구현예에서 핵산은 mRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 α 쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 TCR의 β 쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 핵산은 비-천연적으로 존재하고/하거나 정제되고/되거나 조작될 수 있다. 핵산 서열은 사용된 발현 시스템에 따라 코돈 최적화될 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 발현 시스템은 세균 세포, 예를 들어, 이. 콜리, 또는 효모 세포, 또는 포유동물 세포, 또는 곤충 세포를 포함할 수 있거나, 또는 이들은 세포 부재 발현 시스템일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게, 벡터는 TCR 발현 벡터이다. 적합한 TCR 발현 벡터는 예를 들어, 감마-레트로바이러스 벡터 또는 보다 바람직하게, 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 추가의 세부사항은 문헌(참조: Zhang 2012) 및 본원의 참조자료(Zhang et al,. Adv Drug Deliv Rev. 2012 Jun 1; 64(8): 756-762)에서 발견될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터, 바람직하게 TCR 발현 벡터를 함유하는 세포를 제공한다. 적합한 세포는 포유동물 세포, 바람직하게, 면역 세포, 심지어 보다 바람직하게 T 세포를 포함한다. 벡터는 단일 개방 판독 프레임, 또는 2개의 구분된 개방 판독 프레임에서 각각 알파 쇄 및 베타 쇄를 암호화하는 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 양상은 본 발명의 TCR의 알파 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 본 발명의 TCR의 베타 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 함유하는 세포를 제공한다. 그러한 세포는 특히 입양 치료요법에 유용하다. 본 발명의 세포는 단리되고/되거나 재조합 및/또는 비-천연적으로 존재하고/하거나 조작될 수 있다.
본 발명의 TCR은 입양 치료요법에서의 용도를 갖기 때문에, 본 발명은 비천연적으로 존재하고/하거나 정제되고/되거나 조작된 세포, 특히 본 발명의 TCR을 제공하는 T-세포를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 TCR을 제공하는 T 세포의 확장된 집단을 제공한다. 본 발명의 TCR을 암호화하는 핵산 (예를 들어, DNA, cDNA 또는 RNA)을 사용한 T 세포의 형질감염에 적합한 다수의 방법이 있다(참조: 예를 들어, Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). 본 발명의 TCR을 발현하는 T 세포는 암의 입양 치료요법 기반 치료에 사용하기 위해 적합할 것이다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 입양 치료요법이 수행될 수 있는 다수의 적합한 방법이 있다(참조: 예를 들어, Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).
당업계에 널리 공지된 바와 같이, TCR은 해독 후 변형에 적용될 수 있다. 당화는 하나의 그러한 변형이며, 이는 TCR 쇄에서 한정된 아미노산으로의 올리고사카라이드 모이어티의 공유 부착을 포함한다. 예를 들어, 아스파라긴 잔기, 또는 세린/트레오닌 잔기들은 올리고사카라이드 접착을 위해 널리 공지된 위치이다. 특정 단백질의 당화 상태는 단백질 서열, 단백질 형태 및 특정 효소의 이용 가용성을 포함하는 다수의 인자들에 의존한다. 추가로, 당화 상태 (즉, 올리고사카라이드 유형, 공유 연결 및 부착의 총수)는 단백질 기능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 재조합 단백질을 생성하는 경우, 당화 제어가 흔히 바람직할 수 있다. 제어된 당화는 항체 기반 치료제를 개선시키기 위해 사용되어 왔다. (참조: Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34.). 본 발명의 가용성 TCR에 대해, 당화는 예를 들어 특정 세포주 (포유동물 세포주, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 인간 배아 신장 (HEK) 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는)를 사용함에 의해 또는 화학적 변형에 의해 제어될 수 있다. 그러한 변형은 당화가 약동학을 개선시키고 면역원성을 감소시키고 보다 밀접하게 본래의 인간 단백질을 모방할 수 있기 때문에 요구될 수 있다(참조: Sinclair and Elliott, (2005) Pharm Sci.Aug; 94(8):1626-35).
환자로의 투여를 위해, 본 발명의 TCR (바람직하게는 검출 가능한 표지 또는 치료학적 제제와 연합되거나, 형질감염된 T 세포 상에서 발현되는), TCR-항 CD3 융합 분자, 핵산, 본 발명의 발현 벡터 또는 세포는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 멸균 약제학적 조성물의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 (이를 환자에게 원하는 투여 방법에 따라) 임의의 적합한 형태로 있을 수 있다. 이것은 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 일반적으로 밀봉된 컨테이너로 제공될 것이며, 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 그러한 키트는 정상적으로 (필수는 아니지만) 사용 지침서를 포함한다. 이것은 복수의 상기 단위 투여 형태를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 임의의 적당한 경로, 예를 들어, 비경구 (피하, 근육내, 척추강내 또는 정맥내를 포함하는), 장내 (구강 또는 직장을 포함하는), 흡입 또는 비강내 경로에 의한 투여를 위해 적응될 수 있다. 그러한 조성물은 제약 분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 멸균 조건하에서 활성 성분을 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합함에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 물질의 용량은 치료될 질환 또는 장애, 치료될 개체의 연령 및 병태 등에 따라 광범위 제한 사이에서 다양할 수 있고, TCR-항-CD3 융합 분자에 대해 적합한 용량 범위는 25 ng/kg 내지 50 μg/kg 또는 1 μg 내지 1 g의 범위일 수 있다. 담당의는 궁극적으로 사용될 적당한 용량을 결정할 것이다.
본 발명의 TCR, TCR-항-CD3 융합 분자, 약제학적 조성물, 벡터, 핵산 및 세포는 실질적으로 순수한 형태, 예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 순수한 형태로 제공될 수 있다.
또한 본 발명에 의해 하기가 제공된다:
ㆍ 의약에 사용하기 위한, 바람직하게 암 또는 종양을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 TCR, TCR-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포;
ㆍ 암 또는 종양을 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 TCR, TCR-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포의 용도;
ㆍ 본 발명의 TCR, TCR-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포를 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 암 또는 종양을 치료하는 방법;
ㆍ 본 발명의 TCR, TCR-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포를 포함하여, 인간 대상체에게 투여하기 위한 주사용 제형.
암은 고형 또는 액체 종양일 수 있다. 바람직하게 종양은 PRAME를 발현한다. 암은 유방암 (삼중 음성을 포함하는), 난소암, 자궁내막암, 식도암, 폐암 (NSCLC 및 SCLC), 방광암 또는 두경부암일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 암은 백혈병 또는 림프종일 수 있다. 이들 암 중에서, 유방암 (삼중 음성을 포함하는), 난소암 및 자궁내막암이 바람직하다. 본 발명의 TCR, TCR-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포는 주사에 의해, 예를 들어, 정맥내 또는 직접적인 종양내 주사에 의해 투여될 수 있다. 인간 대상체는 HLA-A*02 서브타입일 수 있다.
치료 방법은 추가의 항-신생물 제제를 별도로, 조합하여, 또는 순차적으로 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 제제의 예는 당업계에 공지되어 있으며 면역 활성화 제제 및/또는 T 세포 조절제를 포함할 수 있다.
본 발명의 각각의 양상의 바람직한 특성은 다른 양상 무타티스 무탄디스 (mutatis mutandis) 각각에 대한 것이다. 본원에서 언급된 선행 기술 문헌은 법에 의해 허용되는 최대 정도로 참조로 포함된다.
도 1 - 스캐폴드 PRAME TCR 알파 및 베타 쇄의 세포외 영역의 아미노산 서열을 제공한다.
도 2 - 스캐폴드 PRAME TCR 알파 및 베타 쇄의 가용성 버젼의 세포외 영역의 아미노산 서열을 제공한다.
도 3 - 돌연변이된 PRAME TCR 알파 쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 예를 제공한다.
도 4 - 돌연변이된 PRAME TCR 베타 쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 예를 제공한다.
도 5 - 도 3 및 4에 제시된 바와 같이 특정 돌연변이된 PRAME TCR 가변 도메인을 포함하는 ImmTAC 분자 (TCR-항-CD3 융합)의 아미노산 서열을 제공한다.
도 6 - 도 3 및 4에 제시된 바와 같이 돌연변이된 PRAME TCR 가변 도메인을 포함하는 도 5의 ImmTAC 분자의 효능 및 특이성을 입증하는 세포 데이터를 제공한다.
도 7 (패널 a 및 b) - 도 3 및 4에 제시된 바와 같은 돌연변이된 PRAME TCR 가변 도메인을 포함하는, 도 5의 ImmTAC 분자의 특이성을 입증하는 세포 데이터를 제공한다.
도 8 - 도 3 및 4에 제시된 바와 같이 돌연변이된 PRAME TCR 가변 도메인을 포함하는, 도 5의 ImmTAC 분자에 의한 PRAME 양성 흑색종 암 세포의 사멸을 입증하는 세포 데이터를 제공한다.
도 9 - 도 3 및 4에 제시된 바와 같이 돌연변이된 PRAME TCR 가변 도메인을 포함하는, 도 5의 ImmTAC 분자에 의한 PRAME 양성 폐 암 세포의 사멸을 입증하는 세포 데이터를 제공한다.
본 발명은 추가로 하기의 비-제한적인 예에서 기재된다.
실시예
실시예 1 - 가용성 TCR의 발현, 재폴딩 및 정제
방법
본 발명의 가용성 TCR의 알파 및 베타 세포외 영역을 암호화하는 DNA 서열을 표준 방법을 사용한 pGMT7-기반 발현 플라스미드에 별도로 클로닝하였다(문헌(Sambrook, et al. Molecular cloning. Vol. 2. (1989) New York: Cold spring harbour laboratory press)에 기재된 바와 같음). 발현 플라스미드를 별도로 이. 콜리 균주 로제타 (Rosetta (BL21pLysS)), 또는 T7 익스프레스에 형질전환시키고, 단일 앰피실린-내성 콜로니를 0.5 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하기 전에 37℃에서 TYP (+ 앰피실린 100 mg/ml) 배지에서 ~0.6-0.8의 OD600까지 성장시켰다. 세포는 원심분리에 의해 유도 후 3시간에 수거하였다. 세포 펠렛을 제조업자의 지침에 따라 버그버스터 (BugBuster) 단백질 추출 시약 (Merck Millipore)으로 용해시켰다. 봉입체 (Inclusion body) 펠렛을 원심분리에 의해 회수하였다. 펠렛은 Triton 완충액 (50 mM Tris-HCI pH 8.1, 0.5% Triton-X100, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA) 중에 2회 세척하고 최종적으로 세제 부재 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM NaEDTA) 중에 재현탁시켰다. 봉입체 단백질 수율은 6 M 구아니딘-HCl로 가용화시키고 OD280를 측정함에 의해 정량하였다. 이어서, 단백질 농도는 흡광 계수를 사용하여 계산하였다. 봉입체 순도는 8 M 우레아로 가용화시키고 ~ 2 μg을 환원 조건하에서 4-20% SDS-PAGE 상으로 로딩함에 의해 측정하였다. 이어서, 순도는 밀도측정 소프트웨어 (Chemidoc, Biorad)를 사용하여 평가하거나 계산하였다. 봉입체는 단기 저장을 위해 +4℃에서 그리고 장기 저장을 위해 -20℃ 또는 -70℃에서 저장하였다.
가용성 TCR 재폴딩을 위해, α 및 β 쇄-함유 주입체를 먼저 혼합하고 10 ml 가용화/변성 완충액 (6 M 구아니딘-하이드로클로라이드, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM DTT)으로 희석함에 이어서 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 이어서, 재폴딩은 1 L의 재폴드 완충액 (100 mM Tris pH 8.1, 800 또는 1000 mM L-아르기닌 HCL, 2 mM EDTA, 4 M 우레아, 10 mM 시스테아민 하이드로클로라이드 및 2.5 mM 시스타민 디하이드로클로라이드)으로 추가로 희석함에 의해 개시하고 용액을 잘 혼합하였다. 재폴딩된 혼합물은 5℃ ± 3℃에서 18 내지 20시간 동안 10 L H2O에 대해 투석하였다. 이 시간 후, 투석 완충액은 10 mM Tris pH 8.1 (10 L)로 2회 대체하고, 투석은 15시간 동안 추가로 계속하였다. 이어서, 재폴딩된 혼합물은 0.45 μm 셀룰로스 필터를 통해 여과하였다.
가용성 TCR의 정제는 투석 재폴딩을 POROS® 50HQ 음이온 교환 컬럼 상에 적용하고 Akta® 퓨어 (Pure) (GE Healthcare)를 사용하는 6개 컬럼 용적에 대해 20 mM Tris pH 8.1 중에서 0 내지 550 mM NaCl의 구배와 함께 결합된 단백질을 용출시킴에 의해 개시하였다. 피크 TCR 분획물은 모아서 농축시키기 전에 SDS PAGE에 의해 동정하였다. 이어서, 농축된 샘플을 둘베코 PBS 완충액 중에서 예비 평형화된 Superdex® 200 인크리즈 (Increase) 10/300 GL 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하였다. 피크 TCR 분획물을 모으고 농축시키고 정제된 물질의 최종 수율을 계산하였다.
실시예 2- ImmTAC 분자 (가용성 TCR-항 CD3 융합 분자)의 발현, 재폴딩 및 정제
방법
ImmTAC 제제는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였고, 단 TCR 베타 쇄는 링커를 통해 항-CD3 단일 쇄 항체에 융합시켰다. 추가로, 양이온 교환 단계는 음이온 교환 후 정제 동안에 수행하였다. 이 경우에, 음이온 교환으로부터의 피크 분획물을 20 mM MES (pH 6.5)에서 20배 희석시키고, POROS® 50HS 양이온 교환 컬럼에 적용하였다. 결합된 단백질은 20 mM MES 중에서 0 내지 500 mM NaCl의 구배로 용출시켰다. 피크 ImmTAC 분획물을 모으고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 농축시키고, 겔 여과 매트릭스에 직접 적용하기 전, 50 mM Tris pH 8.1로 조정하였다.
실시예 3 - 결합 특징 분석
정제된 가용성 TCR 및 ImmTAC 분자의 관련 펩타이드-HLA 복합체로의 결합 분석은 BIAcore 3000 또는 BIAcore T200 장비를 사용한 표면 플라스몬 공명에 의해, 또는 ForteBio Octet 장비를 사용하는 생물층 간섭계에 의해 수행하였다. 비오티닐화된 부류 I HLA-A*02 분자는 관심 대상의 펩타이드와 함께 재폴딩하였고 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 정제하였다(참조: O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433). 모든 측정은 0.005% P20이 보충된, 둘베코 PBS 완충액 중에서 25℃에서 수행하였다.
BIAcore 방법
비오티닐화된 펩타이드-HLA 단량체는 스트렙타비딘-커플링된 CM-5 센서 칩 상에 고정화시켰다. 평형 결합 상수는 펩타이드-HLA-A*02 복합체의 ~200 반응 유닛 (RU)으로 코팅된 유동 세포 상에서 30 ㎕ min-1의 일정 유동 속도로 주사된 가용성 TCR/ImmTAC의 연속 희석액을 사용하여 결정하였다. 평형 반응은 관련없는 펩타이드-HLA를 함유하는 제어 유동 세포에 대한 벌크 완충액 반응을 공제함에 의해 각각의 TCR 농도에 대해 규정화하였다. KD 값은 프리즘 소프트웨어 및 랑뮈르 결합 등온선, 결합된 = C*Max/(C + KD)를 사용한 비-선형 곡선 피팅에 의해 수득하였고, 여기서 "결합된"은 주사된 TCR 농도 C에서 RU에서의 평형 결합이고, Max는 최대 결합이다.
고친화성 상호작용을 위해, 결합 파라미터는 단일 사이클의 동력학 분석에 의해 결정하였다. 5개의 상이한 농도의 가용성 TCR/ImmTAC를 50 내지 60 μl min-1의 유속을 사용한 펩타이드-HLA 복합체의 ~100 - 200 RU로 코팅된 유동 세포 상에 주사하였다. 전형적으로, 60 내지 120 μl의 가용성 TCR/ImmTAC는 50 내지 100 nM의 상위 농도로 주사하였고 연속 2배 희석물을 다른 4개의 주사를 위해 사용하였다. 최저 농도를 먼저 주사하였다. 해리 상 (phase)을 측정하기 위해, 이어서 완충액을 전형적으로 1 내지 3시간 후 ≥ 10% 해리가 일어날 때까지 주사하였다. 동력학적 파라미터는 BIAevaluation® 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 해리 상은 반감기의 단일 대수 쇠퇴 수학식에 피팅하였다. 평형 상수 KD는 k오프/k온으로부터 계산하였다.
Octet 방법
비오티닐화된 펩타이드-HLA 단량체는 스트렙타비딘으로 예비 고정화된 (SA) 스트렙타비딘 바이오센서 (Pall ForteBio) 상에 1 nm로 포획하였다. 센서는 2분 동안 유리된 비오틴 (2 μM)으로 차단시켰다. 평형 결합 상수는 96-웰 또는 384-웰 샘플 플레이트에서 연속으로 희석된 가용성 TCR/ImmTAC에 로딩된 바이오센서를 침지시킴에 의해 결정하였다. 플레이트 진탕은 1000 rpm으로 설정하였다. 낮은 친화성 상호작용 (μM 범위)을 위해, 단기 연합 (~2분) 및 단기 해리 시간 (~2분)을 사용하였다. 결합 곡선은 Octet 데이터 분석 소프트웨어 (Pall ForteBio)를 사용한 관련 없는 pHLA가 로딩된 참조 바이오센서의 이중 참조 공제에 의해 프로세싱하였다. 평형에서 반응 (nm)을 사용하여 수학식 반응 = Rmax*conc/(KD + conc)에 피팅된 안정한 상태 플롯으로부터 KD 값을 평가하였고, 여기서, "반응"은 각각의 TCR 농도 (conc)에서 nm로 평형 결합이고 R최대는 pHLA 포화에서 최대 결합 반응이다.
고친화성 상호작용 (nM - pM 범위)을 위해, 동력학적 파라미터는 ≥ 3 TCR/ImmTAC 농도, 전형적으로 10 nM, 5 nM 및 2.5 nM에서 결합 곡선으로부터 결정하였다. 결합 시간은 30분이었고 해리 시간은 1 내지 2시간이었다. 결합 곡선은 관련 없는 pHLA가 로딩된 참조 바이오센서의 이중 참조 공제에 의해 프로세싱하였고 비오틴으로 차단시켰다. 동력학적 파라미터 k온 및 k오프는 Octet 데이터 분석 소프트웨어 (Pall ForteBio)를 사용한 결합 곡선에 직접적으로 범용 피팅함에 의해 계산하였다. KD는 k오프/k온으로부터 계산하였고 해리 반감기는 t1/2 = 0.693/k오프로부터 계산하였다.
실시예 4 - 본래의 TCR의 결합 특징 분석
가용성 본래의 TCR은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조하고 pHLA로의 결합은 실시예 3에 따라 분석하였다. 알파 및 베타 쇄의 아미노산 서열은 도 2에 나타낸 것들에 상응하였다. 가용성 비오티닐화된 HLA-A*02는 PRAME 펩타이드 SLLQHLIGL (서열번호 1)과 함께 제조하였고 BIAcore 센서 칩 상으로 고정화시켰다.
결과
결합은 다양한 농도에서 결정하였고 상호작용에 대한 KD 값은 141 μM인 것으로 결정되었다. 교차 반응성 (특이성)은 실시예 3의 평형 BIAcore 방법을 사용하여 14개 관련없는 펩타이드 HLA-A*02 복합체의 패널에 대해서 평가하였다. 14개의 관련 없는 pHLA는 3개의 그룹으로 분할하였고 3개의 유동 세포 중 하나 상에 로딩하여 유동 세포당 각각의 pHLA의 대략 1000 RU를 수득하였다. 30 μL의 가용성 야생형 TCR은 20 μL/min의 속도로 모든 유동 세포 상에 130 및 488 μM의 농도에서 주사하였다. 어떠한 유의적 결합도 어느 농도에서도 검출되지 않았고 이는 본래의 TCR이 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체에 대해 특이적임을 지적한다.
이들 데이터는 이러한 본래의 TCR이 고친화성 치료학적 TCR을 조작하기 위한 출발 서열로서 사용하기에 적합한 특징을 가짐을 지적한다.
실시예 5 - 본 발명의 특정 돌연변이된 TCR의 결합 특징 분석
각각 도 3 및 4에 제공된 돌연변이된 TCR 알파 및 베타 가변 도메인 아미노산 서열 (서열번호 6-24)을 사용하여 ImmTAC 분자를 제조하였다. 알파 쇄의 출발 (서열번호 2의 넘버링에 상대적으로 -1 위치)에서 글라이신 잔기의 내포가 이. 콜리에서 생산 동안에 N 말단 메티오닌의 절단 효율을 개선시키는 것으로 밝혀졌음을 주지한다. 비효율적인 절단은 치료제에 해로울 수 있는데, 이것은 이종성 단백질 생성물을 유도할 수 있고/있거나 개시 메티오닌의 존재는 인간에서 면역원성일 수 있기 때문이다. 하기의 알파 및 베타 쇄를 포함하는 ImmTAC 분자의 전체 아미노산 서열은 도 5에 제공된다.
ㆍ a28b50 - ImmTAC1
ㆍ a79b74 - ImmTAC2
ㆍ a79b46 - ImmTAC3
분자는 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였고 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체로의 결합은 실시예 3에 따라 결정하였다.
결과
하기 표에 제공된 데이터는 나타낸 TCR 가변 도메인 서열을 포함하는 ImmTAC 분자가 특히 적합한 친화성 및/또는 반감기를 갖는 SLLQHLIGL-HLA-A*02 복합체를 인지하였음을 보여준다.
Figure pct00012
실시예 6 - 본 발명의 특정 돌연변이된 TCR의 효능 및 특이성 특징 분석
실시예 5에 제시된 바와 같이 동일한 TCR 가변 도메인 서열을 포함하는 ImmTAC 분자는 PRAME 양성 암 세포에 대해 CD3+ T 세포의 강력하고 특이적 재지시를 매개하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 인터페론-γ (IFN-γ) 방출은 T 세포 활성화를 위한 판독으로서 사용하였다. 하기의 알파 및 베타 쇄를 포함하는 ImmTAC 분자의 전체 아미노산 서열은 도 5에 제공된다.
ㆍ a28b50 - ImmTAC1
ㆍ a79b74 - ImmTAC2
ㆍ a79b46 - ImmTAC3
검정은 제조자의 지침에 따라 인간 IFN-γ ELISPOT 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 표적 세포는 검정 배지 (10% 열 불활성화된 FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640)에서 1x106/ml의 밀도로 제조하고, 50 μl의 용적에서 웰당 50,000 세포로 분주하였다. 새로운 공여자 혈액으로부터 단리된, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 이펙터 세포로서 사용하였고 50 μl의 용적에서 웰당 50,000 세포로 분주하였다 (각각의 실험을 위해 사용되는 세포의 정확한 수는 공여자 의존성이고 검정에 대한 범위 내에서 반응을 생성하도록 조정될 수 있다). ImmTAC 분자를 적정하여 예상된 임상적 관련 범위에 걸쳐 있는 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM 및 0.001 nM의 최종 농도를 수득하고, 50 μl의 용적으로 웰에 첨가하였다.
플레이트는 제조자의 지침에 따라 제조하였다. 표적 세포, 이펙터 세포 및 ImmTAC 분자는 관련 웰에 첨가하고 검정 배지와 함께 최대 200 μl의 최종 용적으로 구성된다. 모든 반응은 3중 수행하였다. 대조군 웰은 ImmTAC, 이펙터 세포 또는 표적 세포를 제외시켜 제조하였다. 이어서, 플레이트는 밤새 항온처리하였다 (37℃/5% CO2). 다음 날, 플레이트는 세척 완충액 (0.05% Tween-20을 함유하는 1xPBS 사쉐, 탈이온수에서 구성됨)으로 3회 세척하였다. 이어서, 1차 검출 항체는 50 μl의 용적으로 각각의 웰에 첨가하였다. 다시 3회 세척하기 전에 2시간 동안 실온에서 플레이트를 항온처리하였다. 2차 검출은 50 μl의 희석된 스트렙타비딘-HRP를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리함에 의해 수행하였고, 세척 단계를 반복하였다. 사용 전 15분 이내에, AEC 크로모겐의 하나의 적가물 (20 μl)을 AEC 기질 각각의 1 ml에 첨가하였고 혼합하고 50 μl를 각각의 웰에 첨가하였다. 스팟 전개를 정기적으로 모니터링하고 플레이트를 수돗물에서 세척하여 전개 반응을 종료하였다. 이어서, 플레이트는 면역스팟 소프트웨어 (Cellular Technology Limited)를 사용한 CTL 분석기를 사용하여 스팟을 계수하기 전 적어도 2시간 동안 실온에서 건조되도록 방치하였다.
상기 실시예에서, 하기의 암 세포주를 표적 세포로서 사용하였다:
ㆍ Mel624 (흑색종) PRAME+ve HLA-A*02+ve
ㆍ Granta519 (혈구-림프구성) PRAME-ve HLA-A*02+ve
ㆍ SW620 (결장 암종) PRAME-ve HLA-A*02+ve
ㆍ HT144 (흑색종) PRAME+ve HLA-A*02-ve
결과
하기 표에 나타낸 알파 및 베타 가변 도메인을 포함하는, ImmTAC 분자 각각은 항원 양성 Mel624 세포의 존재하에 재지시된 T 세포의 강한 활성화를 입증하였다. 각각의 경우에, EC50 값은 데이터로부터 계산하였고 하기 표에 나타낸다. 추가로, 각각의 ImmTAC 분자는 최대 1 nM의 농도에서 2개의 항원 음성, HLA-A*02 양성 세포를 최소로 인지하거나 전혀 인지하지 못함을 입증하였다. ImmTAC 분자는 또한 HLA-A*02 음성인 PRAME 양성 세포를 인지하지 못함을 입증하였다 (데이터는 나타내지 않음). 도 6은 하기의 표에서 열거된 ImmTAC 분자 중 4개로부터의 대표적 데이터를 보여준다.
Figure pct00013
이들 데이터는 본 발명의 돌연변이된 TCR 가변 도메인 서열을 포함하는 ImmTAC 분자가 치료학적 사용을 위해 적합한 농도 범위에서 PRAME 양성, HLA-A*02 양성, 암 세포에 대해 강하고 특이적 T 세포 재지시를 매개할 수 있음을 입증한다.
실시예 7 - 본 발명의 특정 돌연변이된 TCR의 추가의 특이성 특징 분석
돌연변이된 TCR 서열을 포함하는 ImmTAC 분자의 특이성을 추가로 입증하기 위해, 추가의 시험은 표적 세포로서 건강한 인간 조직으로부터 유래된 정상 세포의 패널과 함께 실시예 6에 기재된 바와 동일한 ELISPOT 방법을 사용하여 수행하였다.
ㆍ 정상 조직은 심혈관, 신장, 골격근, 폐, 혈관계, 간 및 뇌를 포함한다. 각각의 경우에, 항원 양성 Mel624 암 세포는 양성 대조군으로서 사용하였다.
본 실시예에 제공된 데이터는 하기의 TCR 알파 및 베타 쇄를 포함하는 ImmTAC 분자를 포함한다:
ㆍ a28b50
ㆍ a79b74
ㆍ a79b46
ㆍ a79b77
a28b50, a79b74 및 a79b46을 포함하는 ImmTAC 분자의 전체 아미노산 서열은 도 5에 제공된다 (각각 ImmTAC 1-3)
결과
도 7에 제공된 데이터 (패널 a)는 돌연변이된 알파 및 베타 쇄 a28b50 및 a79b46을 포함하는 ImmTAC 분자가 최대 1 nM의 농도에서 항원 양성 암 세포에 비해 8개 정상 세포의 패널에 대해 최소 반응성을 보여줌을 입증한다. 또한, 도 7의 데이터 (패널 b)는 a28b57 및 a79b46을 포함하는 ImmTAC 분자가 최대 1 nM의 농도에서 항원 양성 암 세포에 비해 4개 정상 세포의 패널에 대해 최소 반응성을 보여줌을 입증한다.
실시예 8 - 본 발명의 특정 돌연변이된 TCR에 의해 매개된 암 세포 사멸
돌연변이된 TCR 서열을 포함하는 ImmTAC 분자가 항원 양성 종양 세포의 강한 재지시된 T 세포 사멸을 매개하는 능력은 IncuCyte 플랫폼 (Essen BioScience)을 사용하여 조사하였다. 이 검정은 아폽토시스에 대한 마커인 카스파제-3/7의 방출의 현미경에 의한 실시간 검출을 가능하게 한다.
방법
검정은 CellPlayer 96-웰 카스파제-3/7 아폽토시스 검정 키트 (Essen BioScience, Cat. No.4440)를 사용하여 수행하였고 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 표적 세포 (Mel624 (PRAME+ve HLA-A*02+ve) 또는 NCI-H1755)는 웰당 10,000 세포로 분주하고 밤새 항온처리하여 이들이 부착되도록 하였다. ImmTAC 분자는 다양한 농도로 제조하였고 각각 25 μl를 관련된 웰에 첨가하여 최종 농도가 1 pM 내지 100 pM이 되도록 하였다. 이펙터 세포는 10:1 (웰당 100,000 세포)의 이펙터 표적 세포 비율로 사용하였다. ImmTAC가 없는 대조군 샘플은 또한 단독의 이펙터 세포 또는 단독의 표적 세포를 함유하는 샘플과 함께 제조하였다. NucView 검정 시약은 모든 웰에 부가된 30 μM 및 25 μl로 구성하였고 최종 용적이 150 μl가 되도록 하였다 (최종 농도가 5 μM이 되도록 한다). 플레이트는 IncuCyte 장비에 위치시키고 이미지는 3일에 걸쳐 2시간 마다 취득 (웰당 1개 이미지)하였다. 각각의 이미지에서 아폽토시스 세포의 수를 결정하고 mm2당 아폽토시스 세포로서 기록하였다. 검정은 3회 수행하였다.
본 실시예에 제공된 데이터는 하기의 TCR 알파 및 베타 쇄를 포함하는 ImmTAC 분자를 포함한다:
ㆍ a28b50
ㆍ a79b74
ㆍ a79b46
a28b50, a79b74 및 a79b46을 포함하는 ImmTAC 분자의 전체 아미노산 서열은 도 5에 제공된다 (각각 ImmTAC 1, 2 및 3).
결과
도 8 및 9에 제공된 데이터는 100 pM 이하의 농도에서 돌연변이된 TCR 서열을 포함하는 ImmTAC 분자의 존재하에 항원 양성 암 세포 (도 8에서 흑색종 세포주 Mel624 및 도 9에서 폐암 세포주 NCI-H1755)의 실시간 사멸을 보여준다. ImmTAC 분자의 부재하에 어떠한 사멸도 관찰되지 않았다.
<110> IMMUNOCORE LIMITED <120> T CELL RECEPTORS <130> P111234WO <150> PCT/WO EP2018/066287 <151> 2018-06-19 <150> GB 1709866.6 <151> 2017-06-20 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Asn Ser Met Glu Ser Asn Glu Glu Glu 1 5 10 15 Pro Val His Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Ser Gln Gly Pro Glu Tyr Val Ile 35 40 45 His Gly Leu Thr Ser Asn Val Asn Asn Arg Met Ala Ser Leu Ala Ile 50 55 60 Ala Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Ile Leu His Arg Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Leu Ile Leu Gly His Ser Gly 85 90 95 Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val 100 105 110 Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp 115 120 125 Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 130 135 140 Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp 145 150 155 160 Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala 165 170 175 Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn 180 185 190 Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr 195 200 <210> 3 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr 35 40 45 Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr 50 55 60 Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser 65 70 75 80 Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Ser Gly Ser Arg Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro 165 170 175 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser 180 185 190 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe 195 200 205 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240 Gly Arg Ala Asp <210> 4 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Asn Ser Met Glu Ser Asn Glu Glu Glu 1 5 10 15 Pro Val His Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Ser Gln Gly Pro Glu Tyr Val Ile 35 40 45 His Gly Leu Thr Ser Asn Val Asn Asn Arg Met Ala Ser Leu Ala Ile 50 55 60 Ala Glu Asp Arg Lys Ser Ser Thr Leu Ile Leu His Arg Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Leu Ile Leu Gly His Ser Gly 85 90 95 Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val 100 105 110 Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp 115 120 125 Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 130 135 140 Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp 145 150 155 160 Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala 165 170 175 Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn 180 185 190 Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr 195 200 <210> 5 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr 35 40 45 Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr 50 55 60 Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser 65 70 75 80 Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Ser Gly Ser Arg Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr 100 105 110 Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe 115 120 125 Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val 130 135 140 Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp 145 150 155 160 Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro 165 170 175 Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser 180 185 190 Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe 195 200 205 Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr 210 215 220 Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp 225 230 235 240 Gly Arg Ala Asp <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Asp Ala Lys Thr Thr Gln Pro Asn Ser Met Glu Ser Asn Glu Glu 1 5 10 15 Glu Pro Val His Leu Pro Cys Asn His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp 20 25 30 Tyr Ile His Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Ser Gln Gly Pro Glu Tyr Val 35 40 45 Ile His Gly Leu Thr Ser Asn Val Asn Asn Arg Met 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Arg Lys 260 265 270 Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp 275 280 285 Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile 290 295 300 Tyr Tyr Ser Gln Ile Met Gly Asp Glu Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu 305 310 315 320 Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val 325 330 335 Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser 340 345 350 Trp Trp Thr Gly Gly Ser Ala Pro Ile Arg Phe Gly Pro Gly Thr Arg 355 360 365 Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 370 375 380 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 385 390 395 400 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 405 410 415 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 420 425 430 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu 435 440 445 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn 450 455 460 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 465 470 475 480 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 485 490 495 Ala Trp Gly Arg Ala 500 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Ser Gly Gly Gly Pro 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gly Gly Glu Pro Ser 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gly Gly Glu Gly Gly Gly Pro 1 5 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gly Gly Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Thr Ile Ser Gly Thr Asp Tyr 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gly Leu Thr Ser Asn 1 5 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Cys Ile Leu Ile Leu Gly His Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr 1 5 10 15 Phe <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Leu Asn His Asp Ala 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe 1 5 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Cys Ala Ser Ser Pro Trp Thr Ser Gly Ser Arg Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Cys Ile Leu Ile Leu Gly His Ser Arg Ala Gly Asn Tyr Ile Ala Thr 1 5 10 15 Phe <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Cys Ile Leu Ile Leu Gly His Ser Arg Leu Gly Asn Tyr Ile Ala Thr 1 5 10 15 Phe <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Cys Ile Leu Ile Leu Gly His Ser Arg Leu Gly Asn Tyr Gln Ala Thr 1 5 10 15 Phe <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ser Gln Ile Met Gly Asp Glu 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ser Gln Ile Met Asn Asp Glu 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Ser Gln Ile Val Gly Asp Glu 1 5 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ala Ser Pro Ile Ser Phe 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Ser Gly Ala Ser Pro Ile Ser Phe 1 5 10 15 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ser Ala Pro Ile Arg Phe 1 5 10 15 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Ser Gly Ser Ala Pro Ile Arg Phe 1 5 10 15 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ser Ala Glu Ile Arg Phe 1 5 10 15 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ser Ala Pro Ile Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ala Ala Pro Ile Ser Phe 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ala Ser Pro Ile Arg Phe 1 5 10 15 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ala Ala Pro Ile Arg Phe 1 5 10 15 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ala Ser Glu Ile Ser Phe 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ser Ala Pro Ile Ser Phe 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ser Ser Pro Ile Ser Phe 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Cys Ala Ser Ser Pro Trp Thr Gly Gly Ser Ala Pro Ile Arg Phe 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Cys Ala Ser Ser Trp Trp Thr Gly Gly Ser Ser Pro Ile Arg Phe 1 5 10 15

Claims (41)

  1. SLLQHLIGL (서열번호 1) HLA-A*02 복합체에 결합하는 성질을 갖고 TCR 알파 쇄 가변 도메인 및/또는 TCR 베타 쇄 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체 (TCR)로서, 이들 도메인 각각은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, 여기서, FR은 프레임워크 영역이고, CDR은 상보성 결정 영역이며, 여기서,
    (a) 상기 알파 쇄 CDR이:
    CDR1 - TISGTDY (서열번호 39)
    CDR2 - GLTSN (서열번호 40)
    CDR3 - CILILGHSGAGSYQLTF (서열번호 41)
    (임의로 하나 이상의 돌연변이를 가짐)
    를 갖고/갖거나
    (b) 상기 베타 쇄 CDR이:
    CDR1 - LNHDA (서열번호 42)
    CDR2 - SQIVNDF (서열번호 43)
    CDR3 - CASSPWTSGSREQYF (서열번호 44)
    (임의로 하나 이상의 돌연변이를 가짐)를 갖는 T 세포 수용체 (TCR).
  2. 제1항에 있어서, 상기 알파 쇄 가변 도메인 프레임워크 영역이:
    FR1 - 서열번호 2의 아미노산 1-25
    FR2 - 서열번호 2의 아미노산 33-49
    FR3 - 서열번호 2의 아미노산 55-87
    FR4 - 서열번호 2의 아미노산 105-114
    또는 상기 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 각각의 서열을 포함하고/하거나
    상기 베타 쇄 가변 도메인 프레임워크 영역이:
    FR1 - 서열번호 3의 아미노산 1-26
    FR2 - 서열번호 3의 아미노산 32-48
    FR3 - 서열번호 3의 아미노산 56-90
    FR4 - 서열번호 3의 아미노산 106-114
    또는 상기 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 각각의 서열을 포함하는, TCR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 알파 쇄 CDR 내 돌연변이 중 하나 이상이 하기 (서열번호 2의 넘버링을 참조로)로부터 선택되는, TCR:
    Figure pct00014
  4. 제3항에 있어서, 상기 알파 쇄 CDR에는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 돌연변이가 있고, 이들 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 돌연변이가 하기 (서열번호 2의 넘버링을 참조로)로부터 선택되는, TCR:
    Figure pct00015
  5. 제4항에 있어서, 상기 알파 쇄 CDR이 하기 그룹의 돌연변이 중 하나 (서열번호 2의 넘버링을 참조로)를 갖는, TCR:
    Figure pct00016
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 알파 쇄 CDR3이 하기로부터 선택되는 서열을 갖는, TCR:
    Figure pct00017
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파 쇄 CDR 내 돌연변이 중 하나 이상이 하기 (서열번호 3의 넘버링을 참조로)로부터 선택되는, TCR:
    Figure pct00018
  8. 제7항에 있어서, 상기 베타 쇄 CDR에는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 돌연변이가 있고, 이들 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 돌연변이가 하기 (서열번호 3의 넘버링을 참조로)로부터 선택되는, TCR:
    Figure pct00019
  9. 제8항에 있어서, 상기 베타 쇄 CDR이 하기 그룹의 돌연변이 중 하나 (서열번호 3의 넘버링을 참조로)를 갖는, TCR:
    Figure pct00020
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 베타 쇄 CDR2가 하기로부터 선택되는 서열을 갖는, TCR:
    Figure pct00021
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베타 쇄 CDR3이 하기로부터 선택되는 서열을 갖는, TCR:
    Figure pct00022
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 각각의 베타 쇄 CDR2 및 CDR3이 하기와 같은, TCR:
    Figure pct00023
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 알파 쇄 및 베타 쇄 CDR의 하기의 조합 중 하나를 갖는, TCR:
    Figure pct00024
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파 쇄 가변 영역 FR1이 서열번호 2의 넘버링을 사용한 위치 -1에서 G 잔기를 갖는, TCR.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파 쇄 가변 도메인이 서열번호 6 내지 8의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하고, 상기 베타 쇄 가변 도메인이 서열번호 9 내지 24의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, TCR.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파 쇄 가변 도메인 및 상기 베타 쇄 가변 도메인이 하기의 아미노산 서열로부터 선택되는, TCR:
    Figure pct00025
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 알파 쇄 TRAC 불변 도메인 서열 및 베타 쇄 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 갖는 알파-베타 이종이량체인, TCR.
  18. 제17항에 있어서, 상기 알파 및 베타 쇄 불변 도메인 서열이 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 간의 본래의 디설파이드 결합을 결실시키기 위한 절단 또는 치환에 의해 변형된, TCR.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 알파 및/또는 베타 쇄 불변 도메인 서열(들)이 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57에 대한 시스테인 잔기들의 치환에 의해 변형되고, 상기 시스테인이 TCR의 상기 알파 및 베타 불변 도메인 사이에 비-본래의 디설파이드 결합을 형성하는, TCR.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ, Vα-L-Vβ-Cβ의 단일 쇄 포맷으로 존재하고, Vα 및 Vβ가 각각 TCRα 및 β 가변 영역이고, Cα 및 Cβ가 각각 TCRα 및 β 불변 영역이고, L이 링커 서열인, TCR.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지, 치료학적 제제 또는 PK 변형 모이어티와 연합된, TCR.
  22. 제21항에 있어서, 항-CD3 항체가 임의로 링커 서열을 통해 상기 TCR의 알파 또는 베타 쇄의 C- 또는 N-말단에 공유적으로 연결된, TCR.
  23. 제21항에 있어서, 상기 링커 서열이 GGGGS (서열번호 31), GGGSG (서열번호 32), GGSGG (서열번호 33), GSGGG (서열번호 34), GSGGGP (서열번호 35), GGEPS (서열번호 36), GGEGGGP (서열번호 37), 및 GGEGGGSEGGGS (서열번호 38)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, TCR.
  24. 알파 쇄 가변 도메인이 서열번호 6 내지 8로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 베타 쇄 가변 도메인이 서열번호 9 내지 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 항-CD3 항체가 서열번호 31 내지 38로부터 선택되는 링커 서열을 통해 TCR 베타 쇄의 N-말단 또는 C-말단에 공유적으로 연결된 TCR-항-CD3 융합 분자.
  25. 제24항에 있어서, 하기를 포함하는 TCR-항-CD3 융합 분자:
    서열번호 25, 27 및 29로부터 선택되는 알파 쇄 아미노산 서열, 또는 서열번호 25, 27 및 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성, 예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 알파 쇄 아미노산 서열,
    서열번호 26, 28 및 30으로부터 선택되는 베타 쇄 아미노산 서열, 또는 서열번호 26, 28 및 29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성, 예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 베타 쇄 아미노산 서열,
  26. 제25항에 있어서, 하기를 포함하는 TCR-항CD3 융합 분자:
    (a) 서열번호 25에 상응하는 알파 쇄 아미노산 서열 및 서열번호 26에 상응하는 베타 쇄 아미노산 서열;
    (b) 서열번호 27에 상응하는 알파 쇄 아미노산 서열 및 서열번호 28에 상응하는 베타 쇄 아미노산 서열; 또는
    (c) 서열번호 29에 상응하는 알파 쇄 아미노산 서열 및 서열번호 30에 상응하는 베타 쇄 아미노산 서열.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 TCR 알파 쇄 및/또는 TCR 베타 쇄를 암호화하는 핵산.
  28. 제27항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  29. 하기를 함유하는 세포:
    (a) 단일 개방 판독 프레임 또는 2개의 구분된 개방 판독 프레임으로 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 TCR 알파 및 베타 쇄를 암호화하는 제28항에 청구된 바와 같은 발현 벡터; 또는
    (b) 제1항 내지 제26항 어느 한 항에 청구된 바와 같은 TCR의 알파 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 TCR의 베타 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터.
  30. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 TCR을 제공하는, 비-천연적으로 존재하고/하거나 정제되고/되거나 조작된 세포, 특히 T-세포.
  31. 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 TCR을 포함하는 약제학적 조성물, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 TCR-항 CD3 융합 분자, 또는 제29항 또는 제30항에 청구된 바와 같은 세포.
  32. 바람직하게는 인간 대상체에서 의약에 사용하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 TCR, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항의 TCR-항-CD3 융합 분자, 또는 제27항의 핵산, 제31항의 약제학적 조성물 또는 제29항 또는 제30항의 세포.
  33. 바람직하게는 인간 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 TCR, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항의 TCR-항-CD3 융합 분자, 또는 제27항의 핵산, 제31항의 약제학적 조성물 또는 제29항 또는 제30항의 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 인간 대상체가 PRAME를 발현하는 종양을 갖는, TCR, TCR 항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 종양이 고형 종양인, TCR, TCR 항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체가 HLA-A*02 서브타입을 갖는, TCR, TCR 항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 또는 직접 종양내 주사와 같은 주사에 의해 투여되는, TCR, TCR-항-CD3 융합 분자, 핵산, 약제학적 조성물 또는 세포.
  38. 제33항에 따른 약제학적 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 암을 갖는 인간 대상체를 치료하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 항-신생물 제제와 별도로, 조합으로 또는 순차적으로 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항의 TCR-항-CD3 융합 분자를 포함하는, 인간 대상체에게 투여하기 위한 주사 가능한 제형.
  41. a) TCR 쇄 산의 발현을 위한 최적의 조건하에서 제29항에 따른 세포를 유지하고, b) 상기 TCR 쇄를 단리함을 포함하는, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 TCR-항-CD3 융합 분자를 제조하기 위한 방법.
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