BR112019027291A2

BR112019027291A2 - receptores de células t, molécula de fusão anti-cd3 de tcr, ácido nucleico, vetor de expressão, célula, composição farmacêutica, método de tratar um sujeito humano que tem câncer, formulação injetável para administrar a um sujeito humano e método de produzir um tcr

Info

Publication number: BR112019027291A2
Application number: BR112019027291-7A
Authority: BR
Inventors: Philip William Addis; Nicole Joy Bedke; Lucie Bouard; Stephen Harper; Nathaniel LIDDY; Tara MAHON; Ronan Pádraic O?Dwyer
Original assignee: Immunocore Limited
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2020-07-14
Also published as: US20220177541A1; EP4219541A2; EP3642224A1; CN111148756A; IL271435A; EP3642224B1; RU2019142600A3; EP4219542B1; DK3642224T3; LT3642224T; US11718657B2; KR20200019211A; US20230416335A1; CA3067163A1; US20210355188A1; WO2018234319A1; JP2023145483A; US11427624B2; EP4219541A3; RU2762255C2

Abstract

A presente invenção refere-se a receptores de células T (TCRs) que se ligam ao peptídeo restringido HLA-A*02 de SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) derivado do antígeno de câncer de linhagem germinativa PRAME. Os ditos TCRs podem compreender mutações não naturais dentro dos domínios variáveis alfa e/ou beta em relação a um TCR PRAME nativo. Os TCRs da invenção são particularmente adequados para o uso como novos reagentes imunoterapêuticos para o tratamento de doença maligna.

Description

RECEPTORES DE CÉLULAS T, MOLÉCULA DE FUSÃO ANTI-CD3 DE TCR, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAR UM SUJEITO HUMANO QUE TEM CÂNCER, FORMULAÇÃO INJETÁVEL PARA ADMINISTRAR A UM SUJEITO

HUMANO E MÉTODO DE PRODUZIR UM TCR

[001] A presente invenção refere-se a receptores de células T (TCRs) que se ligam a peptídeo restringido HLA- A*02 de SLLOHLIGL (SEQ ID NO: 1) derivado do antígeno de câncer de linhagem germinativa PRAME. Os ditos TCRs podem compreender mutações não naturais dentro dos domínios variáveis alfa e/ou beta em relação a um TCR PRAME nativo. Os TCRs da invenção são particularmente adequados para o uso como novos reagentes imunoterapêuticos para o tratamento de doença maligna.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os receptores de células T (TCRs) são naturalmente expressados por células T CD4+ e CD8+. Os TCRs são projetados para reconhecer antígenos peptídicos curto que são exibidos na superfície de células apresentadoras de antígeno em complexos com moléculas do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) (em humanos, as moléculas do MHC também são conhecidas como Antígenos de Leucócitos Humanos, ou HLA) (Davis et al., Annu Rev Immunol. 1998; 16: 523 - 44). As células T CD8+, que também são denominadas células T citotóxicas, têm TCRs que reconhecem especificamente peptídeos ligados a moléculas do MHC de classe I. As células T CD8+ são geralmente responsáveis por encontrar e mediar a destruição de células doentes, incluindo células cancerosas e infectadas por vírus. A afinidade de TCRs específicos de câncer no repertório natural para o antígeno correspondente é tipicamente baixo como um resultado da seleção tímica, o que significa que as células cancerosas frequentemente escapam à detecção e destruição. Novas abordagens imunoterapêuticas destinadas a promover o reconhecimento de câncer por células T oferecem uma estratégia altamente promissora para o desenvolvimento de tratamentos anticâncer eficazes.

[003] PRAME ou Antígeno Expressado Preferencialmente No Melanoma foi primeiramente identificado como um antígeno que é superexpressado no melanoma (Ikeda et al. Immunity. Fevereiro de 1997; 6 (2): 199 - 208); também é conhecido como CT130, MAPE, OIP-4 e tem número de acesso Uniprot P78395. A proteína funciona como um repressor da sinalização do receptor de ácido retinoico (Epping et al., Cell. 23 de setembro de 2005; 122 (6): 835 - 47). O PRAME pertence à família de antígenos codificados por linhagem germinativa conhecidos como antígenos câncer-testículos. Os antígenos câncer-testículos são alvos atraentes para a intervenção imunoterapêutica visto que eles tipicamente têm expressão limitada ou inexistente em tecidos adultos normais. O PRAME é expressado em vários tumores sólidos bem como em leucemias e linfomas (Doolan et al. Breast Cancer Res Treat. Maio de 2008; 109 (2): 359 - 65; Epping et al. Cancer Res. 15 de novembro de 2006; 66 (22): 10639 - 42; Ercolak et al. Breast Cancer Res Treat. Maio de 2008; 109 (2): 359 - 65; Matsushita et al. Leuk Lynphoma. Março de 2003; 44 (3): 439 - 44; Mitsuhashi et al. Int. J Hematol. 2014; 100 (1): 88 - 95; Proto-Sequeire et al. Leuk Res. Novembro de 2006; 30 (11): 1333 - 9; Szczepanski et al. Oral Oncol. Fevereiro de 2013; 49 (2): 144 - 51; Van Baren et al. Br J Haematol. Setembro de 1998; 102 (5): 1376 - 9). As terapias de alvejamento de PRAME das invenções podem ser particularmente adequadas para o tratamento de cânceres incluindo, mas não limitados a câncer de pulmão (NSCLC e SCLC), mama (incluindo triplo negativo) ovário, endometrial, esofágico, bexiga e cabeça e pescoço.

[004] O peptídeo SLLQOHLIGL (SEQ ID NO: 1) corresponde aos aminoácidos 425 a 433 da proteína do PRAME de comprimento total e é apresentado na superfície da célula no complexo com HLA-A*02 (Kessler et al., J Exp Med. 1 de janeiro de 2001; 193 (1): 73 - 88). Este complexo peptídeos-HLA fornece um alvo útil para intervenção imunoterapêutica com base em TCR.

[005] A identificação de sequências de TCR particulares que se ligam ao complexo de HLA-A*02 de SLLOHLIGL (SEQ ID NO: 1) com alta afinidade e alta especificidade é vantajoso para o desenvolvimento de novas imunoterapias. Os TCRs terapêuticos podem ser usados, por exemplo, como agentes de alvejamento solúveis para o propósito de liberar agentes citotóxicos no local do tumor ou ativar funções efetoras imunológicas contra as células tumorais (Lissin, et al., “High- Affinity Monocloncal T-cell receptor (mMTCR) Fusions” in Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges. 2013. S. R. Schmidt, Wiley; Boulter et al., Protein Eng. Setembro de 2003; 16 (9): 707 - 11; Liddy, et al., Nat Med. Junho de 2012;18 (6): 980 - 7), ou alternativamente podem ser usados para projetar células T para terapia adotiva (Fesnak et al., Nat Rev Cancer. 23 de agosto de 2016;16 (9): 566 - 81).

[006] Os TCRs que se ligam a SLLOHLIGL (SEQ ID NO: 1) em complexo com HLA-A*02 foram relatados previamente (Amir et al., Clin Cancer Res. 1 de setembro de 2011; 17 (17): 5615 - 25; Griffioen et al., Clin Cancer Res. 15 de maio de

2006; 12 (10): 3130 - 6; WO2016142783). Entretanto, esses TCRs não foram projetados para se ligarem ao antígeno alvo com afinidade aumentada em relação ao TCR natural. Como explicado mais abaixo, a afinidade suprafisiológica do antígeno é uma característica desejável para um TCR terapêutico, cuja produção não é direta, particularmente quando balanceada com outras características desejáveis, tais como especificidade.

[007] As sequências de TCR aqui definidas são descritas com referência à nomenclatura IMGT que é amplamente conhecida e acessível para aqueles que trabalham no campo do TCR. Por exemplo, ver: LeFranc e LeFranc, (2001). “T cell Receptor Factsbook”, Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011 (6): 595 - 603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 100; e Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260 - 266. Brevemente, os TCRs ab consistem em duas cadeias ligadas de dissulfeto. Cada cadeia (alfa e beta) é geralmente considerada como tendo dois domínios, isto é, um domínio variável e um constante. Uma região de união curta conecta os domínios variável e constante e é tipicamente considerada parte da região variável alfa. Adicionalmente, a cadeia beta usualmente contém uma região de diversidade curta próxima à região de união, que também é tipicamente considerada parte da região variável beta.

[008] O domínio variável de cada cadeia está localizado terminalmente em N e compreende três Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs) integradas em uma sequência de estrutura (FR). As CDRs compreendem o sítio de reconhecimento para ligação peptídeo-MHC. Existem vários genes que codificam para regiões de cadeia variável alfa (Va) e vários genes que codificam para regiões de cadeia variável beta (VB), que se destinguem pela sua estrutura, sequências de CDR1 e CDR2, e por uma sequência de CDR3 parcialmente definida. Os genes Va e VB são referidos na nomenclatura IMGT pelo prefixo TRAV e TRBV respectivamente (Folch e Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17 (1): 42 - 54; Scaviner e Lefranc (2000), Exp Clin Immunogenet 17 (2): 83 - 96; LeFranc e LeFranc, (2001), “T cell Receptor Factsbook”, Academic Press). Do mesmo modo, existem vários genes de união ou J, denominados TRAJ ou TRBJ, para as cadeias alfa e beta respectivamente, e para a cadeia beta, um gene de diversidade ou D denominado TRBD (Folch e Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17 (2): 107 - 114; Scaviner e Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17 (2): 97 - 106; LeFranc e LeFranc, (2001), “T cell Receptor Factsbook”, Academic Press). A enorme diversidade de cadeias de receptores de células T resulta de rearranjos combinatórios entre os vários genes V, Je D, que incluem variantes alélicas e diversidade juncional (Arstila, et al., (1999), Science 286 (5441): 958 - 961; Robins et al., (2009), Blood 114 (19): 4099 - 4107.) As regiões constantes ou C de cadeias alfa e beta de TCR são referidas como TRAC e TRBC respectivamente (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10).

[009] os inventores do presente pedido descobriram surpreendentemente novos TCRs que são capazes de se ligarem ao complexo HLA-A*02 de SLLQHLIGL com alta afinidade e especificidade. Os ditos TCRs são projetados a partir de uma sequência de scaffold adequada em que várias mutações são introduzidas. Os TCRs da invenção têm um perfil particularmente adequado para uso terapêutico. Em geral, a identificação desses TCRs não é direta e tipicamente tem uma alta taxa de atrito.

[0010] No primeiro exemplo, a pessoa habilitada precisa identificar uma sequência de partida, ou scaffold, adequada.

Tipicamente, essas sequências são obtidas de fontes naturais por exemplo, de células T responsivas ao antígeno extraídas do sangue do doador.

Dada a raridade de células T específicas de câncer no repertório natural, é frequentemente necessário rastrear muitos doadores, por exemplo, 20 ou mais, antes que uma célula T responsiva possa ser encontrada.

O processo de rastreamento pode levar várias semanas ou meses, e mesmo quando uma célula T responsiva é encontrada, pode ser inadequada para uso imunoterapêutico.

Por exemplo, a resposta pode ser muito fraca e/ou pode não ser específica para o antígeno alvo.

Alternativamente, pode não ser possível gerar uma população de células T clonais, nem expandir ou manter uma dada linhagem de células T para produzir material suficiente para identificar as sequências de cadeias de TCR corretas.

As sequências de TCR que são adequadas como sequências de partida, ou scaffold, devem ter uma ou mais das seguintes propriedades: uma boa afinidade para o complexo peptídeos-HLA alvo, por exemplo, 200 uM ou mais forte; um alto nível de especificidade de alvo, por exemplo, ligação relativamente fraca ou inexistente aos complexos peptídeos-HLA alternativos; serem acessíveis para uso em bibliotecas de exibição, tais como exibição de fagos; e serem capazes de serem redobradas e purificadas em alto rendimento.

Dada a natureza degenerada do reconhecimento de TCR, é excepcionalmente difícil, mesmo para profissionais habilitados, serem capazes de determinar se uma sequência de TCR de scaffold particular tem um perfil de especificidade que a tornaria elegível para manipulação para uso terapêutico (Wooldridge, et al., J Biol Chem. 6 de janeiro de 2012;287 (2): 1168 - 77).

[0011] O próximo desafio é projetar o TCR para ter uma maior afinidade para o antígeno alvo, enquanto mantém as características desejáveis tais como especificidade e rendimento.

Os TCRs, como existem na natureza, têm fraca afinidade pelo antígeno alvo (baixa faixa micromolar) em comparação com anticorpos, e os TCRs contra antígenos de câncer tipicamente têm um reconhecimento de antígeno mais fraco que TCRs específicos de vírus (Aleksic, et al.

Eur J Immunol.

Dezembro de 2012; 42 (12): 3174 - 9). Essa fraca afinidade acoplada à desregulação de HLA em células cancerosas significa que os TCRs terapêuticos para imunoterapia contra câncer tipicamente requerem manipulação para aumentar sua afinidade pelo antígeno alvo e assim gerar uma resposta mais potente.

Esses aumentos de afinidade são essenciais para reagentes solúveis com base em TCR.

Nesses casos, afinidades de antígeno na faixa nanomolar a picomolar, com meia-vida de ligação de várias horas, são desejáveis.

A potência melhorada gerada pelo reconhecimento de antígeno de alta afinidade a baixos números de epítopos é exemplificada nas Figuras le e 1f de Liddy et al. (Liddy, et al., Nat Med.

Junho de 2012;18 (6): 980 - 7). O processo de maturação de afinidade, tipicamente envolve que a pessoa habilitada tenha que projetar mutações específicas e/ou combinações de mutações, incluindo, mas não limitadas a substituições, inserções e/ou deleções, na sequência de TCR de partida de modo a aumentar a força de reconhecimento de antígeno.

Os métodos para projetar mutações de intensificação de afinidade em um determinado TCR são conhecidos na técnica, por exemplo, o uso de bibliotecas de exibição (Li et al., Nat Biotechnol.

Março de 2005; 23 (3): 349 - 54; Holler et al., Proc Natl Acad Sci EUA. 9 de maio de 2000; 97 (10): 5387 -

92). Entretanto, para produzir aumento significativo na afinidade de um determinado TCR contra um determinado alvo, a pessoa habilitada pode ter que projetar combinações de mutações de um grande pool de alternativas possíveis. As mutações específicas e/ou combinações de mutações que produzem aumento significativo na afinidade não são prognosticáveis e existe uma alta taxa de atrito. Em muitos casos, pode não ser possível obter aumento significativo na afinidade com uma determinada sequência de TCR de partida.

[0012] O processo de maturação de afinidade também deve levar em consideração a necessidade de manter especificidade ao antígeno de TCR. Aumentar a afinidade de um TCR para seu antígeno alvo traz um risco substancial de revelar reatividade cruzada com outros alvos não intencionais como um resultado da degeneração inerente do reconhecimento de antígeno de TCR (Wooldridge, et al., J Biol Chem. 6 de janeiro de 2012; 287 (2): 1168 - 77; Wilson, et al., Mol Immunol. Fevereiro de 2004; 40 (14 - 15): 1047 - 55; Zhao et al., 9 Immunol. 1 de novembro de 2007; 179 (9): 5845 - 54). Em um nível natural de afinidade, o reconhecimento do antígeno reativo cruzado pode ser muito baixo para produzir uma resposta. Se um antígeno reativo cruzado é exibido em células saudáveis normais, existe uma forte possibilidade de ligação fora do alvo in vivo que pode se manifestar em toxicidade clínica. Deste modo, além de aumentar a força de ligação ao antígeno, a pessoa habilitada também deve projetar mutações e/ou combinações de mutações que permitem que o TCR mantenha uma alta especificidade para o antígeno alvo e demonstrar um bom perfil de segurança em pré-clínico. Novamente, mutações e/ou combinações de mutações adequadas não são prognosticáveis. A taxa de atrito neste estágio é ainda maior e, em muitos casos, pode não ser alcançável a todos a partir de uma determinada sequência de TCR de partida.

[0013] Apesar das dificuldades acima descritas, os inventores identificaram TCRs mutados com uma afinidade particularmente alta (faixa picomolar), e um alto grau de especificidade de antígeno. Os ditos TCRs demonstraram potente matança de células cancerosas positivas para PRAME quando preparados como reagentes solúveis fundidos a uma porção de redirecionamento de células T.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0014] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um receptor de células T (TCR) tendo a propriedade de ligação a SLLOHLIGL (SEQ ID NO: 1) em complexo com HLA-A*02 e compreendendo um domínio variável de cadeia alfa de TCR e/ou um domínio variável de cadeia beta de TCR, cada um dos quais compreende FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 onde FR é uma região de estrutura e CDR é uma região determinante de complementaridade, em que

[0015] (a) as CDRs de cadeia alfa têm as seguintes sequências:

[0016] CDR1 - TISGTDY (SEQ ID NO: 39)

[0017] CDR2 - GLTSN (SEQ ID NO: 40)

[0018] CDR3 - CILILGHSGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 41)

[0019] opcionalmente, com uma ou mais mutações nelas,

[0020] e/ou

[0021] (b) as CDRs de cadeia beta têm as seguintes sequências:

[0022] CDR1 - LNHDA (SEQ ID NO: 42)

[0023] CDR2 - SQIVNDF (SEQ ID NO: 43)

[0024] CDR3 - CASSPWISGSREQYF (SEQ ID NO: 44)

[0025] opcionalmente, com uma ou mais mutações nelas.

[0026] Na TCR do primeiro aspecto, as regiões de estrutura de domínio variável de cadeia alfa podem compreender as seguintes sequências de estrutura:

[0027] FR1 - aminoácidos 1 a 25 da SEQ ID NO: 2

[0028] FR2 - aminoácidos 33 a 49 da SEQ ID NO: 2

[0029] FR3 - aminoácidos 55 a 87 da SEQ ID NO: 2

[0030] FR4 - aminoácidos 105 a 114 da SEQ ID NO: 2

[0031] ou sequências respectivas tendo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as ditas sequências, e/ou

[0032] a regiões de estrutura de domínio variável de cadeia beta podem compreender as seguintes sequências:

[0033] FR1 - aminoácidos 1 a 26 da SEQ ID NO: 3

[0034] FR2 - aminoácidos 32 a 48 da SEQ ID NO: 3

[0035] FR3 - aminoácidos 56 a 90 da SEQ ID NO: 3

[0036] FR4 - aminoácidos 106 a 114 da SEQ ID NO: 3

[0037] ou sequências respectivas tendo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as ditas sequências.

[0038] O termo 'mutações' abrange substituições, inserções e deleções. As mutações em um TCR parental (ou tipo selvagem, ou scaffold) podem incluir aquelas que aumentam a afinidade de ligação (kp e/ou meia-vida de ligação) do TCR ao complexo HLA-A*02 de SLLQOHLIGL.

[0039] Convencionalmente, o resíduo F55 da cadeia beta é considerado como sendo parte da região de estrutura 3. Entretanto, para os propósitos da presente invenção, o resíduo F55 da cadeia beta é considerado parte de CDR2.

[0040] As regiões de estrutura da cadeia alfa FR1, FR2 e FR3 podem compreender sequências de aminoácidos correspondentes a uma cadeia TRAV 26-2 e/ou aa regiões de estrutura da cadeia beta FRlI, FR2 e FR3, podem compreender sequências de aminoácidos correspondentes àquelas de uma cadeia TRBV19.

[0041] A região FR4 pode compreender a região de união das cadeias variáveis alfa e beta (TRAJ e TRBJ, respectivamente).

[0042] Na região variável da cadeia alfa de TCR, pode haver pelo menos uma mutação. Pode haver uma, duas, três, quatro ou cinco, ou mais, mutações nas CDRs de cadeia alfa. Pode haver uma, duas, três, quatro ou cinco mutações na CDR3 de cadeia alfa. Uma ou mais das ditas mutações podem ser selecionadas das seguintes mutações, com referência à numeração da SEQ ID NO: 2:

[0043] Deste modo, pode ser qualquer ou todas as mutações na tabela acima, opcionalmente em combinação com outras mutações.

[0044] A CDR3 de cadeia alfa pode compreender um dos seguintes grupos de mutações (com referência à numeração da SEQ ID NO: 2):

EI IS EEE EE Esso ma

[0045] Um grupo de mutações preferido é o grupo

1. Outro grupo de mutações preferido é o grupo 2.

[0046] A CDR3 de cadeia alfa pode ter uma sequência selecionada de:

[0047] Uma CDR3 de cadeia alfa preferida é CILILGHSRAGNYIATF (SEQ ID NO: 45). Uma CDR3 de cadeia alfa preferida é CILILGHSRLGNYIATF (SEQ ID NO: 46).

[0048] Na região variável de cadeia beta de TCR, pode haver pelo menos uma mutação. Pode haver uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez, ou mais, mutações nas CDRs de cadeia beta. Pode haver uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez mutações na CDR3 de cadeia beta. Uma ou mais das ditas mutações podem ser selecionadas das seguintes mutações com referência à numeração da SEQ ID NO: 3:

ER

[0049] Deste modo, pode ser qualquer ou todas as mutações na tabela acima, opcionalmente em combinação com outras mutações.

[0050] As CDR2 e CDR3 de cadeia beta podem compreender um dos seguintes grupos de mutações (com referência à numeração da SEQ ID NO: 3): E ps Ts pm TA) sp FE se o TA) se EP Es EE E TA) FE es pe TA)

SFF FE EE TA [5 ssa se] r55e] s55m 5506 sro soma stoze oras re [Es EE FE EE] TT) [E Es EFE FE TE TA) E Ps FF Fer TA) E ss PE A sm 7) e sm asse rsse] som so] -— mos eis foros [n75]

[0051] Um grupo de mutações preferido é o grupo

1. Um grupo de mutações preferido é o grupo 9.

[0052] A CDR2 de cadeia beta pode ter uma sequência selecionada de:

[0053] Uma CDR2 de cadeia beta preferida é SOIMGDE (SEQ ID NO: 48).

[0054] A CDR3 de cadeia beta pode ter uma sequência selecionada de:

[0055] Uma CDR3 de cadeia beta preferida é CASSWWTIGGASPISF (SEQ ID NO: 51). Uma CDR3 de cadeia beta preferida é CASSWWIGGASPIRF (SEQ ID NO: 58).

[0056] As combinações preferidas de CDR2 e CDR3 de cadeia beta são como a seguir: 1 SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWIGGASPISF (SEQ ID NO: 51) AS PA ATE]

E 3 SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWIGGSAPIRF (SEQ ID NO: 53)

PA A 4 SQIMNDE (SEQ ID NO: | CASSWWIGGSAPIRF (SEQ ID NO: 53)

PA A SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWTSGSAPIRF (SEQ ID NO: 54) a o e 6 SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWIGGSAEIRF (SEQ ID NO: 55) o o ea 7 SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWTIGGSAPIYF (SEQ ID NO: 56) o o Ce SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWTIGGAAPISF (SEQ ID NO: 57) a o ea SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWTIGGASPIRF (SEQ ID NO: 58)

PA SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWTIGGAAPIRF (SEQ ID NO: 59) o o Ce 11 SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWIGGASEISF (SEQ ID NO: 60) A o o ces 12 SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWIGGSAPISF (SEQ ID NO: 61) a o o Cos 13 SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWIGGSSPISF (SEQ ID NO: 62) o o Cos 14 SQIVGDE (SEQ ID NO: | CASSWWIGGSAPIRF (SEQ ID NO: 53)

PA A SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSPWIGGSAPIRF (SEQ ID NO: 63) o o Cosa 16 SQIMGDE (SEQ ID NO: | CASSWWIGGSSPIRF (SEQ ID NO: 64) [O fue SS OS CSS SS SO

[0057] Uma combinação preferida é a combinação 1.

Outra combinação preferida é a combinação 9.

[0058] Em uma modalidade preferida, as sequências de CDR de cadeias alfa e beta de TCR são selecionadas de:

39) ID ID 48)

NO: NO:

NO: NO:

40) 42)

39) ID ID 48)

NO: NO:

NO: NO:

NO: NO: 50)

40) 42)

[0059] Uma combinação preferida é a combinação 1. Uma combinação preferida é a combinação 17.

[0060] A(s) mutação (ões) dentro das CDRs preferivelmente melhoram a afinidade de ligação do TCR ao complexo HLA-A*02 de SLLQHLIGL, mas podem adicionalmente ou alternativamente conferir outras vantagens tais como estabilidade melhorada em uma forma isolada e especificidade melhorada. As mutações em uma ou mais posições podem adicionalmente ou alternativamente afetar a interação de uma posição adjacente com o complexo pMHC cognato, por exemplo, fornecendo-se um ângulo mais favorável para interação. As mutações podem incluir aquelas que são capazes de reduzir a quantidade de ligações não específicas, isto é, reduzir a ligação a antígenos alternativos em relação a HLA-A*02 de SLLQOHLIGL. As mutações podem incluir aquelas que aumentam a eficácia de dobragem e/ou fabricação. Algumas mutações podem contribuir para cada uma dessas características; outras podem contribuir para afinidade, mas não para especificidade, por exemplo, ou para especificidade, mas não para afinidade etc.

[0061] Tipicamente, são necessárias pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15 ou mais mutações de CDR no total para obter TCRs com afinidade de pM pelo antígeno alvo. Pelo menos 5, pelo menos 10 ou pelo menos 15 mutações de CDR no total podem ser necessárias para obter TCRs com afinidade de

PM pelo antígeno alvo. Os TCRs com afinidade de pM pelo antígeno alvo são especialmente adequados como terapêuticos solúveis. Os TCRs para o uso em aplicações de terapia adotiva podem ter menor afinidade pelo antígeno alvo e, portanto, menos mutações de CDR, por exemplo, até 1, até 2, até 5 ou mais mutações de CDR no total. Os TCRs para o uso em aplicações de terapia adotiva podem ter menor afinidade pelo antígeno alvo e, portanto, menos mutações de CDR, por exemplo, até 1, até 2 ou até 5 mutações de CDR no total.

[0062] As mutações podem, adicionalmente ou alternativamente, serem feitas fora das CDRs, dentro das regiões de estrutura; essas mutações podem melhorar a ligação e/ou especificidade e/ou estabilidade e/ou o rendimento de uma forma solúvel purificada do TCR. Por exemplo, o TCR da invenção pode, adicionalmente ou alternativamente, compreender “um domínio variável de cadeia alfa, em que a região variável FR1l de cadeia alfa tem um resíduo G na posição -1 usando a numeração da SEQ ID NO: 2, isto é, inserido antes de posição 1. Foi descoberto que um G na posição -l melhora a eficiência de clivagem da metionina N-terminal durante a produção em E. coli. A clivagem ineficiente pode ser prejudicial para um terapêutico, visto que pode resultar em um produto de proteína heterogêneo e/ou a presença da metionina de iniciação pode ser imunogênica em humanos.

[0063] Preferivelmente, o domínio variável de cadeia a do TCR da invenção pode compreender as respectivas sequências de aminoácidos estruturais que têm pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com os resíduos de aminoácidos estruturais 1 a 25, 33 a 49, 55 a 87, 105 a 114 da SEQ ID NO: 2. O domínio variável de cadeia beta do TCR da invenção pode compreender as respectivas sequências de aminoácidos estruturais que têm pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com os resíduos de aminoácidos estruturais 1 a 26, 32 a 48, 56 a 90, 106 a 114 da SEQ ID NO:

3. Alternativamente, a porcentagem de identidade estabelecida pode exceder as sequências de estrutura quando considerada como um todo.

[0064] O domínio variável de cadeia alfa pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6 a 8 e o domínio variável de cadeia beta pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 9 a 24.

[0065] Por exemplo, o TCR pode compreender os seguintes pares de cadeias alfa e beta.

Domínio variável de cadeia|Domínio variável de cadeia

[0066] Um emparelhamento cadeia de TCR preferido é SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 9. Um emparelhamento cadeia de TCR preferido é SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 17.

[0067] Dentro do escopo da invenção, existem variantes fenotipicamente silenciosas de qualquer TCR da invenção aqui divulgado. Como aqui usado, o termo “variantes fenotipicamente silenciosas” é entendido como referindo-se a um domínio variável de TCR que incorpora uma ou mais alterações de aminoácidos adicionais, incluindo substituições, inserções e deleções, além daquelas apresentadas acima, cujo TCR tem um fenótipo similar ao TCR correspondente sem a(s) dita(s) mudança(s). Para os propósitos deste pedido, o fenótipo de TCR compreende afinidade de ligação (Kpr e/ou meia-vida de ligação) e especificidade. Preferivelmente, o fenótipo para um TCR solúvel associado com um efetor imune inclui a potência de ativação imune e rendimento de purificação, além de afinidade de ligação e especificidade. Uma variante fenotipicamente silenciosa pode ter um Kp” e/ou meia-vida de ligação para o complexo HLA-A*02 de SLLOHLIGL dentro de 50% ou, mais preferivelmente, dentro de 30%, 25% ou 20%, da Kp e/ou meia- vida de ligação medidas do TCR correspondente sem a(s) dita(s) mudança(s), quando medidas sob condições idênticas (por exemplo, a 25 ºC e/ou no mesmo chip de SPR). As condições adequadas são ainda fornecidas no Exemplo 3. Como é conhecido por aqueles habilitados na técnica, pode ser possível produzir TCRs que incorporem alterações nos domínios variáveis destes em comparação com aqueles detalhados acima sem alterar a afinidade da interação com o complexo HLA-A*02 de SLLOHLIGL e/ou outras características funcionais. Em particular, essas mutações silenciosas podem ser incorporadas dentro de partes da sequência que são conhecidas por não estarem diretamente envolvidas na ligação ao antígeno (por exemplo, as regiões de estrutura e/ou partes das CDRs que não contatam o antígeno). Essas variantes estão incluídas no escopo desta invenção.

[0068] As variantes fenotipicamente silenciosas podem conter uma ou mais substituições conservadoras e/ou uma ou mais substituições toleradas. Por substituições toleradas entende-se aquelas substituições que não se enquadram na definição de conservadoras como fornecida abaixo, mas que são, entretanto, fenotipicamente silenciosas. A pessoa habilitada está ciente que vários aminoácidos têm propriedades similares e, portanto, são *'conservadores'!. Um ou mais desses aminoácidos de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo podem frequentemente serem substituídos por um ou mais outros desses aminoácidos sem eliminar uma atividade desejada daquela proteína, polipeptídeo ou peptídeo.

[0069] Deste modo, os aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina podem frequentemente ser substituídos no lugar de um outro (aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas). Dessas possíveis substituições, é preferido que glicina e alanina sejam usadas para substituir uma à outra (visto que elas têm cadeias laterais relativamente curtas) e que valina, leucina e isoleucina sejam usadas para substituir uma à outra (visto que elas têm cadeias laterais alifáticas grandes que são hidrofóbicas). Outros aminoácidos que podem frequentemente ser substituídos no lugar de um outro incluem: fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos tendo cadeias laterais básicas); aspartato e glutamato (aminoácidos tendo cadeias laterais ácidas); asparagina e glutamina (aminoácidos tendo cadeias laterais de amida); e cisteína e metionina (aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre). Deve ser avaliado que as substituições de aminoácido, dentro do escopo da presente invenção, podem ser fabricadas usando aminoácidos que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente. Por exemplo, é considerado aqui que o grupo metila em uma alanina pode ser substituído por um grupo etila e/ou que alterações menores podem ser feitas na estrutura principal do peptídeo. Quer sejam ou não utilizados aminoácidos naturais ou sintéticos, é preferido que apenas L-aminoácidos estejam presentes.

[0070] As substituições desta natureza são frequentemente referidas como substituições de aminoácido “conservadoras” ou “semiconservadoras”. A presente invenção, portanto, se estende ao uso de um TCR compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido descritas acima, mais com uma ou mais substituições conservadoras e/ou uma ou mais substituições toleradas na sequência, de tal modo que a sequência de aminoácido do TCR tenha pelo menos 90% de identidade, tal como 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou 100% de identidade com o TCR compreendendo os aminoácidos 1 a 114 das SEQ ID NOs: 2, 6 a 8 e/ou os aminoácidos 1 a 114 das SEQ ID NOs: 3, 9 a 24.

[0071] “Identidade”, como conhecido na técnica, é a relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado comparando-se as sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de parentesco de sequências entre sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme o caso pode ser, conforme determinado pela correspondência entre as cadeias dessas sequências. Embora existam vários métodos para medir a identidade entre duas sequências de polipeptídeo ou duas sequências de polinucleotídeos, os métodos comumente “utilizados para determinar a identidade são codificados em programas de computador. Os programas de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados ao pacote de programa GCG (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN e FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)).

[0072] Pode-se usar um programa tal como o programa CLUSTAL para comparar as sequências de aminoácidos. Este programa compara as sequências de aminoácidos e encontra o alinhamento ótimo inserindo-se espaços em cada sequência, conforme apropriado. É possível calcular a identidade ou similaridade de aminoácidos (identidade mais conservação de tipo de aminoácido) para um alinhamento ótimo. Um programa como BLASTXx alinhará o estiramento mais longo de sequências similares e atribuirá um valor ao ajuste. Assim, é possível obter uma comparação onde várias regiões de similaridade são encontradas, cada uma tendo um escore diferente. Ambos os tipos de análise de identidade são considerados na presente invenção.

[0073] A porcentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácido nucleico é determinada alinhando-se as sequências para propósitos de comparação ótima (por exemplo, intervalos podem ser introduzidos na primeira sequência para melhor alinhamento com a sequência) e comparando-se os resíduos ou nucleotídeos de aminoácidos nas posições correspondentes. O “melhor alinhamento” é um alinhamento de duas sequências que resulta na mais alta porcentagem de identidade. A porcentagem de identidade é determinada pelo número de resíduos ou nucleotídeos de aminoácidos idênticos nas sequências sendo comparadas (isto é, % de identidade = número de posições idênticas/número total de posições x 100).

[0074] A determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático conhecido por aqueles com habilidade na técnica. Um exemplo de um algoritmo matemático para comparar duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264 - 2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 - 5877. Os programas BLASTN e BLASTp de Altschul, et al. (1990) JU. Mol. Biol. 215: 403 - 410 incorporam esse algoritmo. A determinação de porcentagem de identidade entre duas sequências de nucleotídeos pode ser realizada com o programa BLASTn. A determinação de porcentagem de identidade entre duas sequências de proteínas pode ser realizada com o programa BLASTp. Para obter alinhamentos intervalados para propósitos de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 - 3402. Alternativamente, o PSI-Blast pode ser usado para realizar uma pesquisa iterada que detecta parentescos distantes entre moléculas (Id.). Ao utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTp e BLASTp) podem ser usados.

Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Os parâmetros gerais padrão podem incluir por exemplo, Tamanho de Palavra = 3, Limiar Esperado = 10. Os parâmetros podem ser selecionados para ajustar automaticamente para sequências curtas de entrada.

Outro exemplo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). O programa ALIGN (versão 2,0) que é parte do pacote de software de alinhamento de sequências CGC tem incorporado esse algoritmo.

Outros algoritmos para a análise de sequências conhecidos na técnica incluem ADVANCE e ADAM como descrito em Torellis e Robotti (1994) Comput.

Appl.

Biosci., 10: 3 - 5; e FASTA descrito em Pearson e Lipman (1988) Proc.

Natl.

Acad.

Sci. 85: 2444 - 8. Dentro do FASTA, o ktup é uma opção de controle que define a sensibilidade e velocidade da pesquisa.

Para os propósitos de avaliar a porcentagem de identidade na presente divulgação, o BLASTp com os parâmetros padrão é usado como a metodologia de comparação.

Além disso, quando a porcentagem de identidade recitada fornece um valor de número não inteiro para aminoácidos (isto é, uma sequência de 25 aminoácidos tendo 90% de identidade de sequência fornece um valor de “22,5”, o valor obtido é arredondado para o próximo número inteiro, portanto “22”). Consequentemente, no exemplo fornecido, uma sequência tendo 22 correspondências em 25 aminoácidos está dentro de 90% de identidade de sequência.

[0075] Como será óbvio para aquele habilitado na técnica, pode ser possível truncar ou estender, as sequências fornecidas no C-terminal e/ou N-terminal dessas por 1, 2, 3, 4, 5 ou mais resíduos, sem afetar substancialmente as características funcionais do TCR. As sequências fornecidas no C-terminal e/ou N-terminal dessas podem ser truncadas ou estendidas por 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos. Todas essas variantes são abrangidas pela presente invenção.

[0076] As mutações, incluindo inserções, deleções e substituições conservadoras e toleradas, podem ser introduzidas nas sequências fornecidas usando qualquer método apropriado incluindo, mas não limitado àqueles procedimentos com base em reação em cadeia de polimerase (PCR), clonagem com base em enzimas de restrição ou clonagem independente de ligação (LIC). Esses métodos são detalhados em qualquer um dos textos padrão de biologia molecular. Para mais detalhes com respeito à reação em cadeia de polimerase (PCR) e clonagem com base em enzimas de restrição, ver Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (32º Ed.) CSHL Press. Outras informações sobre procedimentos de clonagem independente de ligação (LIC) podem ser encontradas em Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6 (1): 30 - 6. As sequências de TCR fornecidas pela invenção podem ser obtidas de síntese em estado sólido, ou qualquer outro método apropriado conhecido na técnica.

[0077] Os TCRs da invenção têm a propriedade de ligação ao complexo HLA-A*02 de SLLQOHLIGL. Os TCRs da invenção demonstraram um alto grau de especificidade para o complexo HLA-A*02 de SLLQOHLIGL e são, portanto, particularmente adequados para uso terapêutico. A especificidade no contexto de TCRs da invenção refere-se à sua capacidade de reconhecer células alvo HLA-A*02 que são positivas ao antígeno, embora tendo capacidade mínima para reconhecer células alvo HLA-A*02 que são negativas ao antígeno.

[0078] A especificidade pode ser medida in vitro por exemplo, em ensaios celulares tais como aqueles descritos nos Exemplos 6, 7 e 8. Para testar a especificidade, os TCRs podem estar na forma solúvel e associados com um efetor imune e/ou podem ser expressados na superfície de células, tais como células T. A especificidade pode ser determinada medindo-se o nível de ativação de células T na presença de células alvo positivas ao antígeno e negativas ao antígeno. O reconhecimento mínimo de células alvo negativas ao antígeno é definido como um nível de ativação de células T inferior a 20%, preferivelmente, inferior a 10%, preferivelmente, inferior a 5% e, mais preferivelmente, inferior a 1%, do nível produzido na presença de células alvo positivas ao antígeno, quando medido sob as mesmas condições e em uma concentração de TCR terapeuticamente relevante. Para TCR solúveis associados com um efetor imune, uma concentração terapeuticamente relevante pode ser definida como uma concentração de TCR de 10º M ou menor e/ou uma concentração de até 100, preferivelmente até 1000 vezes maior que o valor de ECso correspondente. Preferivelmente, para TCR solúveis associados com um efetor imune existe pelo menos uma diferença de 100 vezes na concentração necessária para a ativação de células T contra células positivas ao antígeno em relação a células negativas ao antígeno. As células positivas ao antígeno podem ser obtidas por pulsação de peptídeo usando uma concentração de peptídeo adequada para obter um nível de apresentação de antígeno comparável às células cancerosas (por exemplo, 10º M de peptídeo, como descrito em Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1; 2 (11): e26840) ou podem apresentar naturalmente o dito peptídeo. Preferivelmente, as células positivas ao antígeno e negativas ao antígeno são células humanas. Preferivelmente, as células positivas ao antígeno são células humanas cancerosas. As células negativas ao antígeno, preferivelmente, incluem aquelas derivadas de tecidos humanos saudáveis.

[0079] A especificidade pode adicionalmente ou alternativamente, referir-se à capacidade de um TCR se ligar ao complexo HLA-A*02 de SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 1) e não à um painel de complexos peptídeos-HLA alternativos. Isso pode, por exemplo, ser determinado pelo método Biacore do Exemplo 3. O dito painel pode conter pelo menos 5 e, preferivelmente, pelo menos 10, complexos peptídeo-HLA-A*02 alternativos. Os peptídeos alternativos podem compartilhar um baixo nível de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 e podem ser apresentados naturalmente. Os peptídeos alternativos são preferivelmente derivados de proteínas expressadas em tecidos humanos saudáveis. A ligação do TCR ao complexo HLA-A*02 de SLLQOHLIGL pode ser pelo menos 2 vezes maior que a outros complexos peptídeo-HLA apresentados naturalmente, mais preferivelmente pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes maior, ainda mais preferivelmente pelo menos 400 vezes maior.

[0080] Um método alternativa ou adicional para determinar especificidade de TCR pode ser para identificar o reconhecimento de peptídeo motivo do TCR usando mutagênese sequencial, por exemplo, varredura de alanina. Os resíduos que fazem parte da ligação motivo são aqueles que não são permissíveis para substituição. Substituições não permissíveis podem ser definidas como aquelas posições de peptídeo em que a afinidade de ligação do TCR é reduzida em pelo menos 50%, ou preferivelmente pelo menos 80% em relação à afinidade de ligação para um peptídeo não mutado. Esse método é ainda descrito em Cameron et al., (2013), Sci Transl Med. 7 de agosto de 2013; 5 (197): 197ral03 e WOZ2014096803. A especificidade de TCR neste caso pode ser determinada identificando-se peptídeos contendo motivo alternativo, particularmente peptídeos contendo motivo alternativo no proteoma humano, e testando esses peptídeos para ligação ao TCR. A ligação do TCR a um ou mais peptídeos alternativos pode indicar uma falta de especificidade. Neste caso, testes adicionais de especificidade de TCR por meio de ensaios celulares podem ser necessários.

[0081] Os TCRs da invenção podem ter um perfil de segurança ideal para o uso como reagentes terapêuticos. Neste caso, os TCRs podem estar na forma solúvel e pode, preferivelmente, estar fundidos a um efetor imune. Os efetores imunes adequados incluem, mas não estão limitados a citocinas, tais como IL-2 e IFN-y; superantígenos e mutantes destes; quimiocinas tais como IL-8, fator plaquetário 4, proteína estimuladora do crescimento de melanoma; anticorpos, incluindo fragmentos, derivados e variantes destes, que se ligam aos antígenos em células imunes tais como células T ou células NK (por exemplo, anti-CD3, anti-CD28 ou anti-CDl6); e ativadores de complemento. Um perfil de segurança ideal significa que além de demonstrar boa especificidade, os TCRs da invenção podem ter passado em testes de segurança Ppré-clínicos adicionais. Exemplos desses testes incluem ensaios de sangue total para confirmar a mínima liberação de citocina na presença de sangue total e, assim, o baixo risco de causar uma potencial síndrome de liberação de citocina in vivo, e testes de alorreatividade para confirmar o baixo potencial para reconhecimento de tipos de HLA alternativos.

[0082] Os TCRs da invenção podem ser passíveis de purificação de alto rendimento, particularmente os TCRs na forma solúvel. O rendimento pode ser determinado com base na quantidade de material retido durante o processo de purificação (isto é, a quantidade de material dobrado corretamente obtido ao final do processo de purificação em relação à quantidade de material solubilizado obtido antes da redobra) e/ou o rendimento pode ser com base na quantidade de material dobrado corretamente obtido ao final do processo de purificação, em relação ao volume de cultura original. Alto rendimento significa maior que 1% ou, mais preferivelmente, maior que 5%, ou maior rendimento. Alto rendimento significa maior que 1 mg/ml ou, mais preferivelmente, maior que 3 mg/ml, ou maior que 5 mg/ml, ou maior rendimento.

[0083] Os TCRs da invenção preferivelmente têm uma Kp para o complexo HLA-A*02 de SLLQOHLIGL superior a (isto é, mais forte que) o TCR não mutado ou scaffold, por exemplo, na faixa de 1 pM a 100 uM. Em um aspecto, os TCRs da invenção têm uma Kp para o complexo de cerca de (isto é, +/- 10%) 1 pM a cerca de 400 nM, de cerca de 1 pM a cerca de 1000 pM, de cerca de 1 pM a cerca de 500 pM. Os ditos TCRs podem adicionalmente ou alternativamente, terem uma meia-vida de ligação (Tx) para o complexo na faixa de cerca de 1 min a cerca de 60 h, de cerca de 20 min a cerca de 50 h ou de cerca de 2 h a cerca de 35 h. Em uma modalidade particularmente preferida, os TCRs da invenção têm uma Kp para o complexo HLA-A*02 de SLLQHLIGL de cerca de 1 pM a cerca de 500 pM e/ou um meia-vida de ligação de cerca de 2 h a cerca de 35 h. Essa alta afinidade é preferível para TCRs na forma solúvel quando associados com agentes terapêuticos e/ou marcadores detectáveis.

[0084] Em outro aspecto, os TCRs da invenção podem ter uma K” para o complexo de cerca de 50 nM a cerca de 200 UM, ou de cerca de 100 nM a cerca de 1 uM e/ou uma meia-vida de ligação para o complexo de cerca de 3 s a cerca de 12 min. Esses TCRs podem ser preferíveis para aplicações de terapia adotiva.

[0085] Os métodos para determinar a afinidade de ligação (inversamente proporcional à constante de equilíbrio Kp”) e meia-vida de ligação (expressada como Tx) são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em uma modalidade preferida, a afinidade de ligação e meia-vida de ligação são determinadas usando Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) ou Interferometria de Bio-Camada (BLI), por exemplo, usando um instrumento BIAcore ou instrumento Octet, respectivamente. Um método preferido é fornecido no Exemplo 3. Será avaliado que a duplicação da afinidade de um TCR resulta na metade da Kb». Tr, é calculado como ln2 dividido pela taxa de dissociação (Korr). Portanto, a duplicação da Tx resulta na metade da korfr. Os valores de Kp e Kkorrf para TCRs são usualmente medidos para as formas solúveis do TCR, isto é, aquelas formas que são truncadas para remover resíduos de domínio citoplasmático e transmembranar. Para explicar a variação entre as medições independentes e, particularmente, para interações com tempos de dissociação que excedem a 20 horas, a afinidade de ligação e/ou meia-vida de ligação de um determinado TCR podem ser medidas várias vezes, por exemplo, 3 ou mais vezes, usando o mesmo protocolo de ensaio, e uma média dos resultados obtidos. Para comparar os dados de ligação entre duas amostras (isto é, dois TCRs diferentes e/ou duas preparações do mesmo TCR) é preferível que as medições sejam feitas usando as mesmas condições de ensaio (por exemplo, temperatura), tais como aquelas descritas no Exemplo 3.

[0086] Certos TCRs preferidos da invenção têm uma afinidade de ligação e/ou uma meia-vida de ligação para o complexo HLA-A*02 de SLLQOHLIGL que é substancialmente maior que do TCR nativo. O aumento da afinidade de ligação de um TCR nativo frequentemente reduz a especificidade do TCR para seu ligante de peptídeo-MHC, e isso é demonstrado em Zhao et al., (2007) J. Immunol, 179: 9, 5845 - 5854. Entretanto, esses TCRs da invenção permanecem específicos para o complexo HLA-A*02 de SLLQHLIGL, apesar de terem afinidade de ligação substancialmente maior que o TCR nativo.

[0087] Certos TCRs preferidos são capazes de gerar uma resposta de células T altamente potente in vitro contra células positivas ao antígeno, em particular aquelas células que apresentam baixos níveis de antígeno típico de células cancerosas (isto é, na ordem de 5 a 100, por exemplo, 50, antígenos por célula (Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1; 2 (11): e26840; Purbhoo et al., (2006). JIJ Immunol 176 (12): 7308 - 7316.)). Esses TCRs podem estar na forma solúvel e ligados a um efetor imune tal como um anticorpo anti-CD3. A resposta de células T que é medida pode ser a liberação de marcadores de ativação de células T tais como Interferon y ou Granzyme B, ou morte da célula alvo, ou outra medida de ativação de células T, tal como Proliferação de células T. Preferivelmente, uma resposta altamente potente é uma com valor de ECso na faixa de pM, o mais preferivelmente, 100 pM ou menos.

[0088] os TCRsS da invenção podem ser heterodímeros ab. Os TCRs heterodiméricos alfa-beta da invenção usualmente compreendem uma sequência de domínio constante TRAC de cadeia alfa e/ou uma sequência de domínio constante TRBC1 ou TRBC2 de cadeia beta. Os domínios constantes podem ser de comprimento total, o que significa que os domínios extracelular, transmembranar e citoplasmático estão presentes, ou podem estar na forma solúvel (isto é, não tendo nenhum domínio transmembranar ou citoplasmático). Um ou ambos os domínios constantes podem conter mutações, substituições ou deleções em relação às sequências nativas TRAC e/ou TRBC1/2. O termo TRAC e TRBC1/2 também abrangem variantes polimórficas naturais, por exemplo, N a K na posição 4 de TRAC (Bragado et al. International immunology. Fevereiro de 1994; 6 (2): 223 - 30).

[0089] Para o TCR solúvel da invenção, as sequências de domínio constante de cadeias alfa e beta podem ser modificadas por truncação ou substituição para deletar a ligação dissulfeto nativa entre Cys4 de éxon 2 de TRAC e Cys2 de éxon 2 de TRBCl ou TRBC2. A(s) sequência(s) de domínio constante de cadeia alfa e/ou beta podem ter uma ligação dissulfeto introduzida entre os resíduos dos respectivos domínios constantes, como descrito, por exemplo, em WO 03/020763. Em uma modalidade preferida os domínios constantes de alfa e beta podem ser modificados pela substituição de resíduos de cisteína na posição Thr 48 de TRAC e posição Ser 57 de TRBC1l ou TRBC2, as ditas cisteínas formando uma ligação dissulfeto entre os domínios constantes de alfa e beta do TCR. TRBCl ou TRBC2 podem adicionalmente incluir uma mutação de cisteína para alanina na posição 75 do domínio constante e uma mutação de asparagina para ácido aspártico na posição 89 do domínio constante. Um ou ambos os domínios constantes extracelulares presentes em um heterodímero ap da invenção podem ser truncados no C terminal ou C terminais, por exemplo, por até 15, ou até 10, ou até 8 ou menos aminoácidos. Um ou ambos os domínios constantes extracelulares presentes em um heterodímero ab da invenção podem ser truncados no C terminal ou C terminais por, por exemplo, até 15, ou até 10 ou até 8 aminoácidos. O C terminal do domínio constante de cadeia alfa extracelular pode ser truncado por 8 aminoácidos. Os TCR solúveis estão preferivelmente associados com agentes terapêuticos e/ou marcadores detectáveis.

[0090] os domínios constantes de um TCR heterodimérico ab podem ser de comprimento total, tendo domínios transmembranares e citoplasmáticos. Esses TCRs podem conter uma ligação dissulfeto correspondente àquela encontrada na natureza entre os respectivos domínios constantes de alfa e beta. Adicionalmente ou alternativamente, uma ligação dissulfeto não nativa pode estar presente nos domínios constantes extracelulares. As ditas ligações dissulfeto não nativas são ainda descritas em WO03020763 e WOO6000830. A ligação dissulfeto não nativa pode estar entre a posição Thr 48 de TRAC e a posição Ser 57 de TRBCl1l ou TRBC2. Um ou ambos os domínios constantes podem conter uma ou mais mutações, substituições ou deleções em relação às sequências nativas TRAC e/ou TRBClI/2. Os TCRs com domínios constantes de comprimento total são preferíveis para o uso em terapia adotiva.

[0091] Os TCRs da invenção podem ser em formato de cadeia única. Os formatos de cadeia única incluem, mas não estão limitados aos polipeptídeos de TCR ab dos tipos Va-L-VB, VB-L-Va, Va-Ca-L-VB, Va-L-VB-CB ou Va-Ca-L-VB-CE, em que Va e VÊ são regiões variáveis de TCR aq e B respectivamente, Ca e CB são regiões constantes de TCR a e B respectivamente e L é uma sequência conectora (Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. 1 de dezembro; 221(1 - 2): 59 - 76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Novembro; 51 (10): 565 - 73; WO 2004/033685; WO9918129). Onde presente, um ou ambos os domínios constantes podem ser de comprimento total ou podem ser truncados e/ou conter mutações como descrito acima. Preferivelmente, TCRs de cadeia única são solúveis. Em certas modalidades, os TCRs de cadeia única da invenção podem ter uma ligação dissulfeto introduzida entre os resíduos dos respectivos domínios constantes, como descrito em WO 2004/033685. Os TCRs de cadeia única são ainda descritos em WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221 (1 - 2): 59 - 76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89 (10): 4759 - 4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819 - 829).

[0092] A invenção também inclui partículas exibindo TCRs da invenção e a inclusão das referidas partículas dentro de uma biblioteca de partículas. Tais partículas incluem, mas não estão limitadas a fagos, células de leveduras, ribossomos ou células de mamíferos. Os métodos de produção de tais partículas e bibliotecas são conhecidos na técnica (por exemplo, ver WO2004/044004; WOO01/48145, Chervin et al. (2008) J. Immuno. Methods 339; 2: 175 - 184).

[0093] Os TCRs solúveis da invenção são úteis para fornecer marcadores detectáveis ou agentes terapêuticos às células apresentadoras de antígeno e tecidos contendo células apresentadoras de antígeno. Eles podem, portanto, estar associados (covalentemente ou não) a um marcador detectável (para fins de diagnóstico em que o TCR é usado para detectar a presença de células que apresentam o antígeno cognato); e ou um agente terapêutico; e ou uma porção modificadora de PK.

[0094] Exemplos de porções modificadoras de PK incluem, mas não estão limitados a PEG (Dozier et al., (2015 Int J Mol Sci. 28 de outubro; 16 (10): 25831 - 64 e Jevsevar et al., (2010 Biotechnol J. Jan; 5 (1): 113 - 28), PASylation (Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug; 26 (8): 489 - 501), albumina e domínios de ligação à albumina, (Dennis et al., (2002) J Biol Chem. 20 de setembro; 277 (38): 35035 - 43) e/ou polipeptídeos não estruturados (Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dec; 27 (12): 1186 - 90). Porções modificadoras de PK adicionais incluem fragmentos de anticorpo Fc.

[0095] Os marcadores detectáveis para fins de diagnóstico incluem, por exemplo, marcadores fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácido nucleico e reagentes de contraste.

[0096] Para alguns propósitos, os TCRs da invenção podem ser agregados em um complexo compreendendo vários TCRs para formar um complexo multivalente de TCR. Existem várias proteínas humanas que contêm um domínio de multimerização que pode ser usado na produção de complexos de TCR multivalentes. Por exemplo, o domínio de tetramerização de p53 que foi usado para produzir tetrâmeros de fragmentos de anticorpo scFv que exibiram aumento da persistência sérica e reduziram significativamente a taxa de transferência em comparação com o fragmento monomérico de scFv (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385 - 14392). A hemoglobina também possui um domínio de tetramerização que pode ser usado para esse tipo de aplicação. Um complexo TCR multivalente da invenção pode ter capacidade de ligação aprimorada para o complexo em comparação com um heterodímero não multimérico de tipo selvagem ou receptor de células T da invenção. Assim, complexos multivalentes de TCRs da invenção também estão incluídos na invenção. Tais complexos de TCR multivalentes de acordo com a invenção são particularmente úteis para rastrear ou direcionar células que apresentam antígenos particulares in vitro ou in vivo, e também são úteis como intermediários para a produção de complexos de TCR multivalentes adicionais com tais usos.

[0097] Os agentes terapêuticos que podem estar associados aos TCRs da invenção incluem imunomoduladores e efetores, compostos radioativos, enzimas (perforina, por exemplo) ou agentes quimioterapêuticos (cisplatina, por exemplo). Para garantir que os efeitos tóxicos sejam exercidos no local desejado, a toxina pode estar dentro de um lipossomo ligado ao TCR, de modo que o composto seja liberado lentamente. Isso evitará efeitos prejudiciais durante o transporte no organismo e garantirá que a toxina tenha efeito máximo após a ligação do TCR às células apresentadoras de antígeno relevantes.

[0098] Exemplos de agentes terapêuticos adequados incluem, mas não estão limitados a:

[0099] . agentes citotóxicos de moléculas pequenas, isto é, compostos com a capacidade de matar células de mamíferos com um peso molecular inferior a 700 Daltons. Tais compostos também podem conter metais tóxicos capazes de ter um efeito citotóxico. Além disso, deve ser entendido que esses agentes citotóxicos de moléculas pequenas também incluem pró-fármacos, isto é, compostos que se deterioram ou são convertidos em condições fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Exemplos de tais agentes incluem cis-platina, derivados da maitansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etoposídeo, gencitabina, ifosfamida, irinotecano, melfalano, mitoxantrona, soroferofotofrina II, temozolomida, topotecana, topotecina e trimetrear Exarbor, aurotina;

[00100] . citotoxinas peptídicas, isto é, proteínas ou fragmentos das mesmas com a capacidade de matar células de mamíferos. Por exemplo, ricina, toxina da difteria, exotoxina bacteriana pseudomonas A, Dnase e Rnase;

[00101] . radionuclídeos, ou seja, isótopos instáveis de elementos que se deterioram com a emissão simultânea de uma ou mais partículas a ou B ou raios y. Por exemplo, iodo 131, rênio 186, índio 111, ítrio 90, bismuto 210 e 213, actínio 225 e astato 213; agentes quelantes podem ser utilizados para facilitar a associação desses radionuclídeos aos TCRs de alta afinidade ou seus multímeros;

[00102] * Imunoestimulantes, isto é, moléculas efetoras imunes que estimulam a resposta imune. Por exemplo, citocinas como IL-2 e IFN-y,

[00103] * Superantígenos e seus mutantes;

[00104] * Fusões de TCR-HLA, por exemplo, fusão a um complexo peptídeo-HLA, em que o referido peptídeo é derivado de um patógeno humano comum, como o vírus Epstein Barr (EBV);

[00105] * quimiocinas como IL-8, fator plaquetário 4, proteína estimuladora do crescimento de melanoma, etc.;

[00106] * anticorpos ou seus fragmentos, incluindo anticorpos determinantes de células anti-T ou NK (por exemplo, anti-CD3, anti-CD28 ou anti-CDl6);

[00107] * estruturas de proteínas alternativas com características de ligação semelhantes a anticorpos

[00108] * ativadores de complemento;

[00109] . domínios de proteína xenogênicos, domínios de proteína alogênicos, domínios de proteína virais/bacterianos, peptídeos virais/bacterianos.

[00110] Uma modalidade preferida é fornecida por um TCR solúvel da invenção associado (usualmente por fusão ao N- ou C-terminal da cadeia alfa ou beta) com um efetor imune. Um efetor imune particularmente preferido é um anticorpo anti- CD3, ou um fragmento ou variante funcional do dito anticorpo anti-CD3 (tais fusões anti-CD3 de TCR podem ser denominadas moléculas ImmTACTM). Como aqui usado, o termo “anticorpo” abrange tais fragmentos e variantes. Exemplos de anticorpos anti-CD3 incluem, mas não são limitados a OKT3, UCHT-1, BMA- 031 e 12F6. Fragmentos e variantes/análogos de anticorpo que são adequados para o uso nas composições e métodos descritos aqui incluem minicorpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos dsEv e scEv, Nanobodies*" (estes “construtos, comercializados por Ablynx (Bélgica), compreendem anticorpo de domínio pesado variável imunoglobulina único sintético derivado de um camelídeo (por exemplo, camelo ou lhama)) e Anticorpos de Domínio (Domantis (Bélgica), compreendendo um domínio pesado variável de imunoglobulina único maturado de afinidade ou domínio leve variável de imunoglobulina) ou scaffolds de proteína alternativa que exibem características de ligação semelhantes a anticorpo tal como Affibodies (Affibody (Suécia), compreendendo scaffold de proteína A projetada) ou Anticalinas (Pieris (Alemanha)), compreendendo anticalinas projetadas) para citar apenas alguns exemplos.

[00111] Ligação do TCR e o anticorpo anti-CD3 podem ser através de ligação covalente ou não covalente. Ligação covalente pode ser direta ou indireta através de uma sequência conectora. Sequências conectoras são usualmente flexíveis e são feitas principalmente de aminoácidos, tais como glicina, alanina e serina, que não têm cadeias laterais volumosas que possam restringir a flexibilidade. Alternativamente, os conectores com maior rigidez podem ser desejáveis. Comprimentos usáveis ou ideais de sequências conectoras podem ser facilmente determinados. Frequentemente, a sequência conectora será inferior a cerca de 12, tal como inferior a 10, ou de 2 a 10 aminoácidos em comprimento. Exemplos de conectores adequados que podem ser usados em TCRs da invenção incluem, mas não são limitados a: GGGGS (SEQ ID NO: 31), GGGSG (SEQ ID NO: 32), GGSGG (SEQ ID NO: 33), GSGGG (SEQ ID NO: 34), GSGGGP (SEQ ID NO: 35), GGEPS (SEQ ID NO: 36), GGEGGGP (SEQ ID NO: 37), e GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 38) (como descrito no documento WO2010/133828).

[00112] Modalidades específicas de construtos de fusão de TCR anti-CD3 da invenção incluem aqueles emparelhamentos de cadeias alfa e beta em que a cadeia alfa é composta de um domínio variável de TCR compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 6 a 8 e/ou a cadeia beta é composta de um domínio variável de TCR compreendendo a sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 9 a 24. As ditas cadeias alfa e beta podem ainda compreender uma região constante compreendendo uma ligação de dissulfeto não nativo. O domínio constante da cadeia alfa pode ser truncado por oito aminoácidos. O N ou C terminal da cadeia alfa e/ou beta pode ser fundido a um fragmento anticorpo scFv anti-CD3 através de um conector selecionado das SEQ ID NOs: 31 a 38. Certas modalidades preferidas de tais construtos de fusão de TCR anti- CD3 são fornecidas abaixo:

[00113] Também são incluídos dentro do escopo da invenção variantes funcionais dos ditos construtos de fusão de TCR anti-CD3. As ditas variantes funcionais preferivelmente têm pelo menos 90% de identidade, tal como 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade para a sequência de referência, mas ainda assim são funcionalmente equivalentes.

[00114] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece ácido nucleico que codifica um TCR, ou fusão anti-CD3 de TCR da invenção. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é CcDNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico pode ser mRNA. Em algumas modalidades, a invenção fornece ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica um domínio variável de cadeia a de um TCR da invenção. Em algumas modalidades, a invenção fornece ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica um domínio variável de cadeia B de um TCR da invenção. O ácido nucleico pode ser de ocorrência natural e/ou purificado e/ou projetado. A sequência de ácido nucleicos pode ser códon otimizado, de acordo com o sistema de expressão usado. Como é conhecido por aqueles habilitados na técnica, os sistemas de expressão podem incluir células bacterianas tais como E. coli, ou células de levedura, ou células mamíferas, ou células de inseto, ou podem ser sistemas de expressão livres de células.

[00115] Em um outro aspecto, a invenção fornece um vetor que compreende ácido nucleico da invenção. Preferivelmente, o vetor é um vetor de expressão de TCR. Adequado vetores de expressão de TCR incluem, por exemplo, vetores gama-retrovirais ou, mais preferivelmente, vetores lentivirais. Outros detalhes podem ser encontrados em Zhang 2012 e referências nele (Zhang et al,. Adv Drug Deliv Rev. 1 de junho de 2012; 64 (8): 756 - 762).

[00116] A invenção também fornece uma célula abrigando um vetor da invenção, preferivelmente um vetor de expressão de TCR. Células adequadas incluem, células mamíferas, preferivelmente células imunes, ainda mais preferivelmente células T. O vetor pode compreender ácido nucleico da invenção que codifica em um único quadro aberto de leitura, ou dois quadros abertos de leitura distintos, que codifica a cadeia alfa e a cadeia beta respectivamente. Um outro aspecto fornece uma célula abrigando um primeiro vetor de expressão que compreende ácido nucleico que codifica a cadeia alfa de um TCR da invenção, e um segundo vetor de expressão que compreende ácido nucleico que codifica a cadeia beta de um TCR da invenção. Tais células são particularmente úteis em terapia adotiva. As células da invenção podem ser isoladas e/ou recombinantes e/ou de ocorrência não natural e/ou projetadas.

[00117] Visto que os TCRs da invenção têm utilidade em terapia adotiva, a invenção inclui uma célula que não ocorre naturalmente e/ou purificada e/ou projetada, especialmente uma célula T, apresentando um TCR da invenção. A invenção também fornece uma população expandida de células T apresentando um TCR da invenção. Existem vários métodos adequados para a transfecção de células T com ácido nucleico (tal como DNA, CDNA ou RNA) que codifica os TCRs da invenção (ver, por exemplo, Robbins et al., (2008) J Imunol. 180: 6116 - 6131) Células T expressando os TCRs da invenção serão adequadas para o uso em tratamento de câncer com base em terapia adotiva. Como será conhecido por aqueles habilitados na técnica, existem vários métodos adequados pelos quais a terapia adotiva pode ser realizada (ver, por exemplo, Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8 (4): 299 - 308).

[00118] Como é bem conhecido na técnica, os TCRs podem estar sujeitos a modificações pós-translacional. Glicosilação é uma tal modificação, que compreende a ligação covalente de porções de oligossacarídeo para aminoácidos definidos na cadeia de TCR. Por exemplo, resíduos de asparagina, ou resíduos de serina/treonina são localizações bem conhecidas para ligação de oligossacarídeo. O estado de glicosilação de uma proteína particular depende de vários fatores, incluindo sequência de proteína, conformação de proteína e a disponibilidade de certas enzimas. Além disso, o estado de glicosilação (isto é, tipo de oligossacarídeo, ligação covalente e número total de ligações) pode influenciar a função de proteína. Portanto, ao produzir proteínas recombinantes, controlar a glicosilação é frequentemente desejável. A glicosilação controlada foi usada para melhorar os terapêuticos à base de anticorpo. (Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar; 8 (3): 226 - 34.). Para TCRs solúveis da invenção, a glicosilação pode ser controlada, usando-se linhagens celulares particulares, por exemplo, (incluindo, mas não limitadas a linhagens de células mamíferas, tais como células do ovário de hamster chinês (CHO) ou células do rim embrionário humano (HEK)), ou pela modificação química. Tais modificações podem ser desejáveis, visto que a glicosilação pode melhorar a farmacocinética, reduzir a imunogenicidade e imitar mais intimamente uma proteína humana nativa (Sinclair e Elliott, (2005) Pharm Sci. Aug; 94 (8): 1626 - 35).

[00119] Para administração a pacientes, os TCRs da invenção (preferivelmente associados com um marcador detectável ou agente terapêutico ou expressado em células T transfectadas), moléculas de fusão anti CD3 de TCR, ácidos nucleicos, vetores de expressão ou células da invenção podem ser fornecidos como parte de uma composição farmacêutica estéril juntamente com um ou mais portadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Esta composição farmacêutica pode ser de qualquer forma adequada, (dependendo do método desejado de administração a um paciente). Pode ser fornecida na forma de dosagem unitária, será geralmente fornecida em um recipiente vedado e pode ser fornecida como parte de um kit. Tal kit normalmente (embora não necessariamente) incluiria instruções para o uso. Pode incluir uma pluralidade das ditas formas de dosagem unitárias.

[00120] A composição farmacêutica pode ser adaptada para administração por qualquer via apropriada, tal como via parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intratecal ou intravenosa), enteral (incluindo oral ou retal)

inalação ou intranasal. Tais composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica de farmácia, por exemplo, misturando-se o ingrediente ativo com o(s portador (es) ou excipiente(s) sob condições estéreis.

[00121] As dosagens das substâncias da presente invenção podem variar entre amplos limites, dependendo da doença ou transtorno a ser tratado, a idade e condição do indivíduo a ser tratado, etc. Uma faixa de dose adequada para uma molécula de fusão anti-CD3 de TCR pode ser na faixa de 25 ng/kg a 50 ug/kg ou 1 ug a 1 g. Um médico determinará as dosagens apropriadas a serem usadas.

[00122] TCRs, moléculas de fusão anti-CD3 de TCR, composições farmacêuticas, vetores, ácidos nucleicos e células da invenção podem ser fornecidos na forma substancialmente pura, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% pura.

[00123] Também são fornecidos pela invenção:

[00124] * Um TCR, molécula de fusão anti-CD3 de TCR, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula da invenção para o uso em medicina, preferivelmente para o uso em um método de tratar câncer ou um tumor;

[00125] * o uso de um TCR, molécula de fusão anti- CD3 de TCR, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula da invenção na fabricação de um medicamento para tratar câncer ou um tumor;

[00126] * um método de tratar câncer ou um tumor em um paciente, compreendendo administrar ao paciente um TCR, molécula de fusão anti-CD3 de TCR, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula da invenção;

[00127] . uma formulação injetável para administrar a um sujeito humano compreendendo um TCR, molécula de fusão anti-CD3 de TCR, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula da invenção.

[00128] O câncer pode ser um tumor sólido ou líquido. Preferivelmente, o tumor expressa PRAME. O câncer pode ser de mama (incluindo triplo negativo), ovário endométrio, esôfago, pulmão (NSCLC e SCLC), bexiga ou cabeça e pescoço. Alternativamente ou adicionalmente, o câncer pode ser uma leucemia ou linfoma. Destes cânceres, mama (incluindo triplo negativo), ovário e endométrio são preferidos. O TCR, molécula de fusão anti-CD3 de TCR, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula da invenção podem ser administrados por injeção, tal como intravenosa ou injeção intratumoral direta. O sujeito humano pode ser do subtipo HLA-A*02.

[00129] O método de tratamento pode ainda incluir administrar separadamente, em combinação, ou sequencialmente, um agente antineoplásico adicional. Exemplos de tais agentes são conhecidos na técnica e podem incluir agentes ativadores imune e/ou agentes moduladores de células T.

[00130] Características preferidas de cada aspecto da invenção são como para cada um dos outros aspectos por analogia. Os documentos da técnica anterior mencionados aqui são incorporados por referência na extensão máxima permitida por lei.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00131] Figura 1 - fornece a sequência de aminoácido das regiões extracelulares das cadeias alfa e beta de TCR PRAME scaffold.

[00132] Figura 2 - fornece a sequência de aminoácido das regiões extracelulares de uma versão solúvel das cadeias alfa e beta de TCR PRAME scaffold.

[00133] Figura 3 - fornece sequências de aminoácidos exemplares de regiões de cadeia alfa variável de TCR PRAME mutadas.

[00134] Figura 4 - fornece sequências de aminoácidos exemplares de regiões variáveis de cadeia beta de TCR PRAME mutadas.

[00135] Figura 5 - fornece sequências de aminoácidos de moléculas ImmTAC (fusões anti-CD3 de TCR) compreendendo certos domínios variáveis de TCR PRAME mutados como apresentado nas Figuras 3 e 4.

[00136] Figura 6 - fornece dados celulares que demonstram a potência e especificidade de moléculas de ImmTAC de Figura 5 compreendendo os domínios variáveis de TCR PRAME mutados como apresentado nas Figuras 3 e 4.

[00137] Figura 7 (painéis a e b) - fornece dados celulares que demonstram especificidade de moléculas ImmTAC da Figura 5, compreendendo os domínios variáveis de TCR PRAME mutados como apresentado nas Figuras 3 e 4.

[00138] Figura 8 - fornece dados celulares que demonstram a morte de células cancerosas de melanoma positivas para PRAME por moléculas de ImmTAC da Figura 5, compreendendo os domínios variáveis de TCR PRAME mutados como apresentado nas Figuras 3 e 4.

[00139] Figura 9 - fornece dados celulares que demonstram a morte de células cancerosas de pulmão positivas para PRAME por moléculas ImmTAC da Figura 5, compreendendo os domínios variáveis de TCR PRAME mutados como apresentado nas

Figuras 3 e 4.

[00140] A invenção é ainda descrita nos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 - EXPRESSÃO, REDOBRA E PURIFICAÇÃO DE TCRS

SOLÚVEIS MÉTODO

[00141] As sequências de DNA que codificam as regiões extracelulares alfa e beta de TCRs solúveis da invenção foram clonadas separadamente em plasmídeos de expressão à base de pGMT7 usando métodos padrão (como descrito em Sambrook, et al. Molecular Cloning. Vol. 2. (1989) New York: Cold spring harbour laboratory press). Os plasmídeos de expressão foram transformados separadamente em cepa de E. coli Rosetta (BL21pLysS) ou T7 Express, e colônias únicas resistentes à ampicilina foram cultivadas a 37 *C em meio TYP (+ ampicilina 100 ug/ml) a uma ODe«oo de -0,6 a 0,8 antes de induzir expressão de proteína com IPTG 0,5 mM. As células foram colhidas três horas após a indução por centrifugação. Sedimentos celulares foram lisados com reagente de extração de proteína BugBuster (Merck Millipore) de acordo com as instruções do fabricante. Sedimentos corporais de inclusão foram recuperados por centrifugação. Sedimentos foram lavados duas vezes em tampão Triton (Tris-HCI 50 mM, pH 8,1, Triton-X100 a 0,5%, NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM) e finalmente recolocados em suspensão em tampão livre de detergente (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM). O rendimento da proteína corporal de inclusão foi quantificado solubilizando-se com guanidina-HCl 6 M e medindo-se a OD280. Concentração de proteína depois foi calculada usando o coeficiente de extinção. Pureza corporal de inclusão foi medida solubilizando-se com Ureia 8 M e carregando -2 ug em SDS-PAGE 4 a 20% sob condições de redução. Pureza depois foi estimada ou calculada usando um software de densitometria (Chemidoc, Biorad). Corpos de inclusão foram armazenados a +4 ºC para armazenamento a curto prazo e a -20 ºC ou -70 ºC para armazenamento a longo prazo.

[00142] Para a redobra de TCR solúvel, corpos de inclusão contendo cadeia a e B foram primeiro misturados e diluídos em tampão de solubilização/desnaturação de 10 ml (Guanidina-cloridreto 6 M, Tris HCl 50 mM, pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 20 mM) seguido por incubação por 30 min a 37 ºC. Redobra depois foi iniciada por diluição adicional em 1 L de tampão de redobra (Tris 100 mM, pH 8,1, L-Arginina HCL 800 ou 1000 mM, EDTA 2 mM, Ureia 4 M, cloridreto de cisteamina mM e dicloridreto de cistamina 2,5 mM) e a solução misturada. A mistura de redobra foi dialisada contra 10 L de H2O por 18 a 20 horas a 5 “C + 3 ºC. Depois deste tempo, o tampão de diálise foi substituído duas vezes com Tris 10 mM, pH 8,1 (10 L) e a diálise continuada por outras 15 horas. A mistura de redobra depois foi filtrada através de filtros de celulose de 0,45 um.

[00143] Purificação de TCRs solúveis foi iniciada aplicando-se a redobra dialisada em uma coluna de troca aniônica POROS” 50HQ e eluindo a proteína ligada com um gradiente de 0 a 500 mM de NaCl em Tris 20 mM, pH 8,1 em 6 volumes de coluna usando um Aktaº Pure (GE Healthcare). Frações de pico de TCR foram identificadas por SDS PAGE antes de serem agrupadas e concentradas. A amostra concentrada depois foi aplicada a uma coluna de filtração de gel Superdexº 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare) pré-equilibrada em tampão

PBS de Dulbecco. As frações de pico de TCR foram agrupadas e concentradas e o rendimento final de material purificado foi calculado.

EXEMPLO 2 - EXPRESSÃO, REDOBRA E PURIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS IMMTAC (MOLÉCULAS DE FUSÃO ANTI CD3 DE TCR SOLÚVEIS)

MÉTODO

[00144] A preparação de ImmTAC foi realizada como descrito no Exemplo 1, exceto que a cadeia beta de TCR foi fundida através um conector a um anticorpo de cadeia única anti-CD3. Adicionalmente, uma etapa de troca catiônica foi realizada durante a purificação após a troca aniônica. Neste caso, as frações de pico da troca aniônica foram diluídas 20 vezes em MES 20 mM (pH 6,5), e aplicadas a um POROS*º 50HS coluna de troca catiônica. Proteína ligada foi eluída com um gradiente de O a 500 mM de NaCl em MES 20 mM. Frações de pico de ImMMTAC foram agrupadas e ajustadas a Tris 50 mM, pH 8,1 antes de serem concentradas e aplicadas diretamente à matriz de filtração de gel como descrito no Exemplo 1.

EXEMPLO 3 - CARACTERIZAÇÃO DE LIGAÇÃO

[00145] Análise de ligação de TCRs solúveis purificados e moléculas ImmMTAC ao complexo peptídeo-HLA relevante foi realizada por ressonância plasmônica de superfície, usando um instrumento BIAcore 3000 ou BIAcore T200, ou por interferometria de biocamada, usando um instrumento ForteBio Octet). As moléculas HLA-A*02 de classe I biotiniladas foram redobradas com o peptídeo de interesse e purificadas usando métodos conhecidos àqueles na técnica (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266 (1): 9 - 15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89 (8): 3429 - 3433). Todas as medições foram realizadas a 25 “C em tampão PBS de Dulbecco,

suplementado com P20 a 0,005%.

MÉTODO BIAcore

[00146] Monômeros de peptídeo-HLA biotinilados foram imobilizados em chips sensores CM-5 acoplados estreptavidina. Constantes de ligação de equilíbrio foram determinadas usando diluições em série de TCR/ImMmTAC solúvel injetado a uma taxa de fluxo constante de 30 ul min! sobre uma célula de fluxo revestida com -200 unidades de resposta (RU) de complexo peptídeo-HLA-A*02. Respostas de equilíbrio foram normalizadas para cada concentração de TCR subtraindo-se a resposta do tampão em massa em uma célula de fluxo de controle contendo um peptídeo-HLA irrelevante. O valor de Kp foi obtido por ajuste de curva não linear usando o software Prisma e o isoterma de ligação de Langmuir, ligado = C*Max/(C + Kp), onde “ligado” é a ligação de equilíbrio em RU, a concentração de TCR injetada C e Max é a ligação máxima.

[00147] Para interações de alta afinidade, os parâmetros de ligação foram determinados por análise de cinética de ciclo único. Cinco concentrações diferentes de TCR/ImmMTAC solúvel foram injetadas sobre uma célula de fluxo revestida com -100 a 200 RU de complexo peptídeo-HLA usando uma taxa de fluxo de 50 a 60 ul min. Tipicamente, 60 a 120 ul de TCR/ImmTAC solúvel foram injetados a uma concentração máxima entre 50 a 100 nM, com diluições sucessivas de 2 vezes usadas para as outras quatro injeções. A concentração mais baixa foi injetada primeiro. Para medir a fase de dissociação, o tampão depois foi injetado até que > 10% de dissociação ocorreu, tipicamente, depois de 1 a 3 horas. Os parâmetros cinéticos foram calculados usando o software BIAevaluationº. A fase de dissociação foi ajustada a uma equação de decaimento exponencial simples permitindo o cálculo de meia-vida. A constante de equilíbrio Kp foi calculada a partir de Korr/Kon.

MÉTODO DE OCTETO

[00148] Os monômeros de peptídeo-HLA biotinilados foram capturados a 1 nm em biossensores de estreptavidina (SA) (Pall ForteBio) pré- imobilizados com estreptavidina. Os sensores foram bloqueados com biotina livre (2 p1uM) por 2 minutos. As constantes de ligação de equilíbrio foram determinadas imergindo-se os biossensores carregados em TCR/ImMTAC solúvel diluído em série em uma placa de amostra de 96 poços ou 384 poços. A agitação de placa foi ajustada a 1.000 rpm. Para interações de baixa afinidade (faixa pM) um tempo de associação curta (-2 minutos) e dissociação curta (-2 minutos foi usado. Curvas de ligação foram processadas por subtração de referência dupla de biossensores de referência carregados com pHLA irrelevante usando Software de Análise Dados Octet (Pall ForteBio). As respostas (nm) em equilíbrio foram usadas para estimar o valor de Kp a partir dos gráficos de estado estável ajustados à Resposta de equação = Rmax*conc/(Kp + conc), onde “resposta” é a ligação de equilíbrio em nm em cada concentração de TCR (conc) e Rmax é a resposta de ligação máxima na saturação de pHLA.

[00149] Para interações de alta afinidade (faixa nM-pM), os parâmetros cinéticos foram determinados a partir das curvas de ligação em concentrações de TCR/ImMTAC 2 3, tipicamente, 10 nM, 5 nM e 2,5 nM. O tempo de associação foi de 30 minutos e o tempo de dissociação foi de 1 a 2 horas. As curvas de ligação foram processadas por subtração de referência dupla de biossensores de referência carregados com PpHLA irrelevante e bloqueados com biotina. Os parâmetros cinéticos

Kon E Korr foram calculados pelo ajuste geral diretamente às curvas de ligação usando Software de Análise de Dados Octet (Pall ForteBio). Kp foi calculada a partir de korr/Kkon e a meia- vida de dissociação foi calculada a partir de t1/2 = 0,693/Kkorfre.

EXEMPLO 4 - CARACTERIZAÇÃO DE LIGAÇÃO DO TCR NATIVO

[00150] Um TCR nativo solúvel foi preparado de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1 e a ligação de PHLA foi analisada de acordo com Exemplo 3. As sequências de aminoácidos das cadeias alfa e beta corresponderam àquelas mostrados na Figura 2. HLA-A*O02 biotinilado solúvel foi preparado com o peptídeo PRAME SLLQOHLIGL (SEQ ID NO: 1) e imobilizado em um chip sensor BIAcore.

RESULTADOS

[00151] A ligação foi determinada em várias concentrações e o valor Kpy para a interação foi determinada para ser 141 UM. Reatividade cruzada (especificidade) foi avaliada contra um painel de 14 complexos peptídeo HLA-A*02 irrelevantes usando o método de equilíbrio BIAcore do Exemplo

3. Os 14 pHLAs irrelevantes foram divididos em três grupos e carregados em uma de três células de fluxo, para fornecer aproximadamente 1000 RU de cada pHLA por célula de fluxo. 30 ul de TCR tipo selvagem solúvel foram injetados em concentrações de 130 e 488 1uM em todas as células de fluxo a uma taxa de 20 pL/min. Nenhuma ligação significativa foi detectada na concentração indicando que o TCR nativo é específico para o complexo HLA-A*02 de SLLQOHLIGL.

[00152] Estes dados indicam que este TCR nativo tem características que são adequadas para o uso como uma sequência de partida para projetar TCRs terapêuticos de alta afinidade.

EXEMPLO 5 - CARACTERIZAÇÃO DE LIGAÇÃO DE CERTOS TCRS

MUTADOS DA INVENÇÃO

[00153] As sequências de aminoácidos de domínio variável alfa e beta de TCR mutadas, fornecidas nas Figuras 3 e 4 respectivamente (SEQ ID NOs: 6 - 24), foram usadas para preparar as moléculas ImmTAC. Note que a inclusão de um resíduo de glicina no início da cadeia alfa (posição -1 em relação à numeração da SEQ ID NO: 2) melhorou a eficiência de clivagem da metionina N-terminal durante a produção em E. coli. A clivagem ineficiente pode ser detrimental para um terapêutico visto que pode resultar em um produto heterogêneo de proteína e ou a presença da metionina de iniciação pode ser imunogênica em seres humanos. As sequências de aminoácidos totais de moléculas ImmMTAC compreendendo as seguintes cadeias alfa e beta são fornecidas na Figura 5

[00154] * a28b50 - ImmTAC1

[00155] * a79b74 - ImmTAC2

[00156] * a79b46 - ImmTAC3

[00157] As moléculas foram preparadas como descrito no Exemplo 2 e a ligação ao complexo HLA-A*02 de SLLQOHLIGL foi determinada de acordo com o Exemplo 3.

RESULTADOS

[00158] Os dados apresentados na tabela abaixo mostram que as moléculas ImmTAC compreendendo as sequências de domínio variável de TCR indicadas reconheceram complexo HLA- A*02 de SLLQOHLIGL com uma afinidade e/ou meia-vida particularmente adequada.

alo9 (SEQ ID NO: | b46 (SEQ ID NO: 11) |170 pM 7,31 h 17 ese aceeeas ea um | EXEMPLO 6 - CARACTERISAÇÃO DE POTÊNCIA E

ESPECIFICIDADE DE CERTOS TCRS MUTADOS DA INVENÇÃO

[00159] As moléculas ImmTAC compreendendo as mesmas sequências de domínio variável de TCR como apresentadas no Exemplo 5 foram avaliadas quanto a sua capacidade de mediar a redireção potente e específica de células T CD3+t contra células cancerosas positivas para PRAME. A liberação de interferon-y (IFN-y) foi usada como uma leitura para ativação de células T. As sequências de aminoácidos totais de moléculas ImmTAC compreendendo as seguintes cadeias alfa e beta são fornecidas na Figura 5.

[00160] * a28b50 - ImmTAC1

[00161] * a79b74 - ImmTAC2

[00162] * a79b46 - ImmTAC3

[00163] Os ensaios foram realizados usando um kit IFN-y ELISPOT humano (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, as células alvo foram preparadas a uma densidade de 1 x 106/ml em meio de ensaio (RPMI 1640 contendo 10% de FBS inativado por calor e 1% de penicilina-estreptomicina-L-glutamina) e colocadas em placa a

50.000 células por poço em um volume de 50 ul. células mononucleares do sangue periférico (PBMC), isoladas de sangue fresco de doador, foram usadas como células efetoras e colocadas em placa a 50.000 células por poço em um volume de 50 ul (o número exato de células usadas para cada experimento é doador dependente e pode ser ajustado para produzir uma resposta dentro de uma faixa adequada para o ensaio). As moléculas ImmTAC foram tituladas para fornecer concentrações finais de 10 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM e 0,001 nM, abrangendo a faixa relevante clinicamente antecipada, e adicionadas ao poço em um volume de 50 ul.

[00164] As placas foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante. As células alvo, células efetoras e moléculas ImmTAC foram adicionadas aos poços relevantes e feitas a um volume final de 200 ul com meio de ensaio. Todas as reações foram realizadas em triplicata. Poços de controle também foram preparados com a omissão de ImmTAC, células efetoras ou células alvo. As placas foram então incubadas durante a noite (37 ºC/CO; a 5%). No dia seguinte, as placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (sachê 1xPBS, contendo Tween-20 a 0,05%, feito em água deionizada). Anticorpo de detecção primário depois foi adicionado a cada poço em um volume de 50 nl. As placas foram incubadas na temperatura ambiente por 2 horas antes de serem lavadas novamente três vezes. A detecção secundária foi realizada adicionando-se 50 ul de estreptavidina-HRP diluído a cada poço e incubando-se na temperatura ambiente por 1 hora e a etapa de lavagem repetida. Não mais do que 15 min antes do uso, uma gota (20 u1ul) de cromogênio AEC foi adicionado a cada 1 ml de substrato de AEC e misturada e 50 ul adicionados a cada poço. O desenvolvimento das manchas foi monitorado regularmente e as placas foram lavadas em água de torneira para finalizar a reação de desenvolvimento. As placas foram então deixadas secar na temperatura ambiente por pelo menos 2 horas antes de contar as manchas usando um analisador CTL com o software Immunospot (Cellular Technology Limited).

[00165] Neste exemplo, as seguintes linhagens de células cancerosas foram usadas como células alvo:

[00166] * Mel624 (melanoma) PRAME+ve HLA-A*02+ve

[00167] * Granta519 (hemolinfocítico) PRAME-ve HLA-A*02+ve

[00168] * SW620 (carcinoma de cólon) PRAME-ve HLA- A*02+ve

[00169] * HT144 (melanoma) PRAME+ve HLA-A*02-ve

RESULTADOS

[00170] Cada uma das moléculas ImmTAC, compreendendo os domínios variáveis alfa e beta indicados na tabela abaixo, demonstrou uma ativação potente de células T redirecionadas na presença de células Mel624 positivas para antígeno. Em cada caso, os valores de ECso foram calculados a partir dos dados e são mostrados na tabela abaixo. Além disso,

cada molécula ImmTAC demonstrou reconhecimento mínimo ou nenhum de duas células negativas para antígeno e positivas para HLA-A*02, a uma concentração de até 1 nM. As moléculas ImMTAC também não demonstraram reconhecimento de células positivas para PRAME que são negativas para HLA-A*02 (dados não mostrados). A Figura 6 mostrou dados representativos de quatro das moléculas ImmTAC listadas na tabela abaixo.

[00171] Estes dados demonstraram que as moléculas

ImMMTAC compreendendo sequências de domínio variável de TCR mutadas da invenção podem mediar redireção de células T potente e específica contra células cancerosas positivas para PRAME, positivas para HLA-A*02, em uma faixa de concentração adequada para uso terapêutico.

EXEMPLO 7 = CARACTERISAÇÃO DE ESPECIFICIDADE

ADICIONAL DE CERTOS TCRS MUTADOS DA INVENÇÃO

[00172] Para demonstrar ainda a especificidade de moléculas ImmTAC compreendendo as sequências de TCR mutadas, outro teste foi realizado usando a mesma metodologia de ELISPOT como descrito no Exemplo 6, com um painel de células normais derivadas de tecidos humanos saudáveis como células alvo.

[00173] . Tecidos normais incluíram cardiovasculares, renais, músculo-esqueléticos, pulmonares, vasculares, hepáticos e cerebrais. Em cada caso, as células cancerosas Mel624 positivas para antígeno foram usadas como um controle positivo.

[00174] os dados apresentados “neste exemplo incluem moléculas ImmTAC compreendendo as seguintes cadeias alfa e beta de TCR

[00175] * az8b50

[00176] * a79b74

[00177] * a79b46

[00178] * a79b77

[00179] As sequências de aminoácidos totais de moléculas ImmTAC compreendendo a28b50, a79b74 e a79b46 são fornecidas na Figura 5 (ImmTAC 1 a 3 respectivamente)

RESULTADOS

[00180] Os dados apresentados na Figura 7 (painel a) demonstram que as moléculas ImmTAC compreendendo a28b50 e a79b46 mutadas de cadeia alfa e beta mostram reatividade mínima contra um painel de 8 células normais em relação a células cancerosas positivas para antígeno a uma concentração de até 1 nM. Do mesmo modo, os dados na Figura 7 (painel b) demonstram que as moléculas ImmTAC compreendendo a28b57 e a79b46 mostram reatividade mínima contra um painel de 4 células normais em relação às células cancerosas positivas para antígeno a uma concentração de até 1 nM.

EXEMPLO 8 - MATANÇA DE CÉLULA CANCEROSA MEDIADA POR

CERTOS TCRS MUTADOS DA INVENÇÃO

[00181] A capacidade de moléculas ImmTAC compreendendo as sequências de TCR mutadas para mediar a matança de células T redirecionadas potentes de células tumorais positivas para antígeno foi investigada usando a plataforma IncuCyte (Essen BioScience). Este ensaio permite a detecção em tempo real por microscopia da liberação de Caspase- 3/7, um marcador para apoptose.

MÉTODO

[00182] Os ensaios foram realizados usando o kit de ensaio de apoptose de Caspase-3/7 de 96 poços CellPlayer (Essen BioScience, Cat. Nº 4440) e realizados de acordo com o protocolo do fabricante. Brevemente, as células alvo (Mel624 (PRAME+ve HLA-A*02+ve) ou NCI-H1755) foram colocadas em placa a 10.000 células por poço e incubadas durante a noite para permitir a adesão. As moléculas ImmTAC foram preparadas em várias concentrações e 25 ul de cada foram adicionados ao poço relevante tal que as concentrações finais foram entre 1 pM e 100 pM. As células efetoras foram usadas a uma razão de célula alvo efetora de 10:1 (100.000 células por poço). Uma amostra de controle sem ImmTAC também foi preparada junto com amostras contendo células efetoras isoladas ou células alvo isoladas. O reagente de ensaio NucView foi feito a 30 uM e 25 ul adicionados a cada poço e o volume final foi aumentado para 150 ul (fornecendo 5 uM de conc. final). A placa foi colocada no instrumento IncuCyte e as imagens tomadas a cada 2 horas (1 imagem por poço) durante 3 dias. O número de células apoptóticas em cada imagem foi determinado e registrado como células apoptóticas por mmº. Os ensaios foram realizados em triplicata.

[00183] Os dados apresentados “neste exemplo incluem moléculas ImmTAC compreendendo as seguintes cadeias alfa e beta de TCR

[00184] * a28b50

[00185] * a79b74

[00186] * a79b46

[00187] As sequências de aminoácidos totais de moléculas ImmTAC compreendendo a28b50, a79b74 e a79b46 são fornecidas na Figura 5 (ImmTAC 1, 2 e 3 respectivamente).

RESULTADOS

[00188] Os dados apresentados nas Figuras 8 e 9 mostraram matança em tempo real de células cancerosas positivas para antígeno (Linhagens de células de melanoma Mel624 na Figura 8 e Linhagem de células de câncer de pulmão NCI-H1755 na Figura 9) na presença de moléculas ImmTAC compreendendo as sequências de TCR mutadas, a uma concentração de 100 pM ou mais baixa. Nenhuma morte foi observada na ausência de moléculas ImmTAC.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. RECEPTOR DE CÉLULAS T (TCR), caracterizado por ter a propriedade de ligação ao complexo HLA-A*02 de SLLQOHLIGL (SEQ ID NO: 1) e compreendendo um domínio variável de cadeia alfa de TCR e/ou um domínio variável de cadeia beta de TCR, cada um dos quais compreende FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 onde FR é uma região de estrutura e CDR é uma região determinante de complementaridade, em que (a) CDRs de cadeia alfa terem as seguintes sequências: CDR1l - TISGTDY (SEQ ID NO: 39) CDR2 - GLTSN (SEQ ID NO: 40) CDR3 - CILILGHSGAGSYQLTF (SEQ ID NO: 41) opcionalmente com uma ou mais mutações nelas, e/ou (b) CDRs de cadeia beta terem as seguintes sequências: CDR1l - LNHDA (SEQ ID NO: 42) CDR2 - SQIVNDF (SEQ ID NO: 43) CDR3 - CASSPWISGSREQYF (SEQ ID NO: 44) opcionalmente com uma ou mais mutações nelas.

2. TCR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas regiões de estrutura de domínio variável de cadeia alfa compreenderem as seguintes sequências: FR1 - aminoácidos 1 a 25 da SEQ ID NO: 2 FR2 - aminoácidos 33 a 49 da SEQ ID NO: 2 FR3 - aminoácidos 55 a 87 da SEQ ID NO: 2 FR4 - aminoácidos 105 a 114 da SEQ ID NO: 2 ou sequências respectivas tendo pelo menos 90% de identidade com as ditas sequências, e/ou regiões de estrutura de domínio variável de cadeia beta compreenderem as seguintes sequências: FR1 - aminoácidos 1 a 26 da SEQ ID NO: 3 FR2 - aminoácidos 32 a 48 da SEQ ID NO: 3 FR3 - aminoácidos 56 a 90 da SEQ ID NO: 3 FR4 - aminoácidos 106 a 114 da SEQ ID NO: 3 ou sequências respectivas tendo pelo menos 90% de identidade com as ditas sequências.

3. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por uma ou mais das mutações nas CDRs de cadeia alfa serem selecionadas de (com referência à numeração da SEQ ID NO: 2): 4, TCR, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por existir uma, duas, três, quatro ou cinco mutações nas CDRs de cadeia alfa e aquelas uma, duas, três, quatro ou cinco mutações serem selecionadas de (com referência à numeração da SEQ ID NO: 2):

5. TCR, de acordo com a reivindicação 4,

caracterizado pelas CDRs de cadeia alfa terem um dos seguintes grupos de mutações (com referência à numeração da SEQ ID NO: 2):

FOI SEE EE Eles e e TT mm

6. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pela CDR3 de cadeia alfa ter uma sequência selecionada de:

7. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por uma ou mais das mutações nas CDRs de cadeia beta serem selecionadas de (com referência à numeração da SEQ ID NO: 3):

EE

8. TCR, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez mutações nas CDRs de cadeia beta e aquelas uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez mutações serem selecionadas de (com referência à numeração da SEQ ID NO: 3):

9. TCR, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelas CDRs de cadeia beta terem um dos seguintes grupos de mutações (com referência à numeração da SEQ ID NO: 3): pp FEF Ee E FF EFE Faça ss Tee pm e TA) FF EA ee ss TE ee ee [E FE ps] cm a pe mm Tm) [a FE ps E sm ns pe mm rm) Es Fr EE] TA) [E FAFE] a e er)

ETF EEEF FEET EA] ET sp] e e e TA) E sr E ea nm a rm)

10. TCR, de dos qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pela CDR2 de cadeia beta ter uma sequência selecionada de

11. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pela CDR3 de cadeia beta ter uma sequência selecionada de:

12. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelos respectivos CDR2 e CDR3s de cadeia beta serem como a seguir:

[Es nm 5: 5 [ass TE 159 | [E sa nm 5: 5 [assa 15 1 5 | [E mm 1 or [ossaasAS TE mo 59

13. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por ter uma das seguintes combinações de CDRs de cadeia alfa e cadeia beta: FEEL «IEEE es pe a as Tag Te 1 |TISGTD |GLTS |CILILGESRAGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWTGGASPISF Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 45) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 51) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 2 |TISGTD |GLTS |CILILGESRAGNYIAT | LNED | SOIMGD | CASSWWIGGASEISF Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 45) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 60) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO:

NO: NO: O rolam 3 |TISGTD |GLTS |CILILGHESRAGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWTIGGASPIRF Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 45) |A E (SEQ| (SEQ IDNO: 58) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 4 |TISGTD |GLTS |CILILGESRAGNYIAT | LNED | SOIMGD | CASSWWIGGSAPISF Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 45) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 61) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) |TISGTD |GLTS | CILILGESRAGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWTSGASPISF Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 45) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 52) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) TISGTD |GLTS |CILILGESRAGNYIAT | LNED | SOIMGD | CASSWWTGGSSPISF Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 45) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 62) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 7 |TISGTD |GLTS | CILILGHESRLGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWTGGSAPIRF Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ IDNO: 53) ID NO: | (SEQ (SEQ ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) TISGTD |GLTS |CILILGHSRLGNYOAT | LNHD | SQIMGD | CASSWWIGGSAPIRF Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 47) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 53) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO:

39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) TISGTD |GLTS |CILILGESRLGNYIAT | LNED | SOIVGD | CASSWWTGGSAPIRF Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 53) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 50) NO: NO: 40) 42) 1 |TISGTD |GLTS |CILILGESRLGNYIAT | LNED | SQIMND | CASSWWTGGSAPIRF oO |Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 53) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 49) NO: NO: 40) 42) 1 |TISGTD |GLTS |CILILGESRLGNYIAT | LNED | SOIMGD | CASSPWIGGSAPIRF 1 |Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 63) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 1 |TISGTD |GLTS |CILILGESRLGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWTSGSAPIRF 2 |Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 54) ID NO: | (SEQ (SEQ ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 1 |TISGTD |GLTS |CILILGHESRLGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWIGGSAEIRF 3 |Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 55) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 1 |TISGTD |GLTS |CILILGESRLGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWIGGSAPIYF

ID NO: |(SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 1 [TISGTD [GLTS |CILILGHESRLGNYIAT | LNED | SOIMGD | CASSWWTGGSSPISF |Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 62) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 1 |TISGTD |GLTS |CILILGESRLGNYIAT | LNED | SOIMGD | CASSWWIGGAAPISF (SE 6 |Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| OQ ID NO: 57) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 1 |TISGTD |GLTS |CILILGESRLGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWTGGASPIRF 7 |Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 58) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 1 |TISGTD |GLTS |CILILGHESRLGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWIGGSAPISF 8 |Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 61) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42) 1 |TISGTD |GLTS |CILILGESRLGNYIAT | LNED | SQIMGD | CASSWWTGGSSPIRF 9 |Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 64) ID NO: | (SEQ (SEQ |ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: 40) 42)

Y (SEQ|N F (SEQ ID NO: 46) |A E (SEQ| (SEQ ID NO: 59 ID NO: | (SEQ (SEQ | ID NO: 39) ID ID 48) NO: NO: BEL ER |

14. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pela região variável FR1l de cadeia alfa ter um resíduo G na posição -l usando a numeração da SEQ ID NO: 2.

15. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo domínio variável de cadeia alfa compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6 a 8 e o domínio variável de cadeia beta compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 9 a 24.

16. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo domínio variável de cadeia alfa e pelo domínio variável de cadeia beta serem selecionados das sequências de aminoácidos de: Domínio variável de cadeia|Domínio variável de cadeia

17. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por ser um heterodímero alfa-beta, tendo uma sequência de domínio constante TRAC de cadeia alfa e uma sequência de domínio constante TRBCl1l ou TRBC2 de cadeia beta.

18. TCR, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelas sequências de domínio constante de cadeias alfa e beta serem modificadas por truncação ou substituição para excluir uma ligação dissulfeto nativa entre Cys4 de éxon 2 de TRAC e Cys2 de éxon 2 de TRBC1 ou TRBC2.

19. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizado pela(s) sequência(s) de domínio constante de cadeia alfa e/ou beta ser (em) modificada(s) pela substituição de resíduos de cisteína por Thr 48 de TRAC e Ser 57 de TRBCl ou TRBC2, as ditas cisteínas formando uma ligação dissulfeto não nativa entre os domínios constantes alfa e beta do TCR.

20. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por ser em formato de cadeia única do tipo Va-L-VB, VB-L-Va, Va-Ca-L-VB, Va-L-VB- cê, em que Va e VB são regiões variáveis a e B de TCR respectivamente, Ca e Cê são regiões constantes a e B de TCR respectivamente, e L é uma sequência conectora.

21. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por estar associado com um marcador detectável, um agente terapêutico ou uma porção modificadora de PK.

22. TCR, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por um anticorpo anti-CD3 ser covalentemente ligado ao C- ou N-terminal da cadeia alfa ou beta do TCR, opcionalmente, através de uma sequência conectora.

23. TCR, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pela sequência conectora ser selecionada do grupo consistindo em GGGGS (SEQ ID NO: 31), GGGSG (SEQ ID NO: 32), GGSGG (SEQ ID NO: 33), GSGGG (SEQ ID NO: 34), GSGGGP (SEQ ID NO: 35), GGEPS (SEQ ID NO: 36), GGEGGGP (SEQ ID NO: 37) e GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 38).

24. MOLÉCULA DE FUSÃO ANTI-CD3 DE TCR, caracterizada pelo domínio variável de cadeia alfa compreender uma sequência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: 6 a 8 e pelo domínio variável de cadeia beta compreender uma sequência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: 9 a 24, e em que o anticorpo anti-CD3 é covalentemente ligado ao N-terminal ou C- terminal da cadeia beta de TCR através de uma sequência conectora selecionada das SEQ ID NOs: 31 a 38.

25. MOLÉCULA DE FUSÃO ANTI-CD3 DE TCR, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa selecionada das SEQ ID NOs: 25, 27 ou 29 ou uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa que tem pelo menos 90% de identidade, tal como 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou 100% de identidade, para as sequências de aminoácidos como apresentadas na SEQ ID NOs: 25, 27 e 29, e uma sequência de aminoácidos de cadeia beta selecionada das SEQ ID NOs: 26, 28 e 30 ou uma sequência de aminoácidos de cadeia beta que tem pelo menos 90% de identidade, tal como 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ou 100% de identidade, para as sequências de aminoácidos como apresentadas na SEQ ID NO: 26, 28 e 29.

26. MOLÉCULA DE FUSÃO ANTI CD3 DE TCR, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por compreender (a) uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa correspondente à SEQ ID NO: 25 e sequência de aminoácidos de cadeia beta correspondente à SEQ ID NO: 26; (b) uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa correspondente à SEQ ID NO: 27 e sequência de aminoácidos de cadeia beta correspondente à SEQ ID NO: 28; ou (c) uma sequência de aminoácidos de cadeia alfa correspondente à SEQ ID NO: 29 e sequência de aminoácidos de cadeia beta correspondente à SEQ ID NO: 30.

27. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por codificar uma cadeia alfa de TCR e/ou uma cadeia beta de TCR, conforme definida em qualquer uma das reivindicações precedentes.

28. VETOR DE EXPRESSÃO, caracterizado por compreender o ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 27.

29. CÉLULA, caracterizada por abrigar (a) um vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 28, que codifica as cadeias alfa e beta de TCR,

conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, em um único quadro aberto de leitura ou dois quadros abertos de leitura distintos; ou (b) um primeiro vetor de expressão que compreende ácido nucleico que codifica a cadeia alfa de um TCR, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, e um segundo vetor de expressão que compreende ácido nucleico que codifica a cadeia beta de um TCR, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.

30. CÉLULA, que não ocorre naturalmente e/ou purificada e/ou engendrada, especialmente uma célula T, caracterizada por apresentar um TCR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

31. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um TCR, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou uma molécula de fusão anti-CD3 de TCR, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 26, ou uma célula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 29 ou 30, juntamente com um ou mais portadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

32. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou molécula de fusão anti-CD3 de TCR, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 26, ou ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 27, composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 31, ou célula, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 ou 30, caracterizado por ser para o uso em medicina, preferivelmente em um sujeito humano.

33. TCR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou molécula de fusão anti-CD3 de TCR,

conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 26, ou ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 27, composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 31, ou célula, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 ou 30, caracterizado por ser para o uso em um método de tratar câncer ou um tumor, preferivelmente em um sujeito humano.

34. TCR, molécula de fusão anti-CD3 de TCR, ácido nucleico, composição farmacêutica ou todos para o uso, de acordo com a reivindicação 33, caracterizados pelo sujeito humano ter um tumor que expressa PRAME.

35. TCR, molécula de fusão anti-CD3 de TCR, ácido nucleico, composição farmacêutica ou todos para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 ou 34, caracterizados pelo tumor ser um tumor sólido.

36. TCR, molécula de fusão anti-CD3 de TCR, ácido nucleico, composição farmacêutica ou todos para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, caracterizados pelo sujeito humano ser do subtipo HLA-A*02.

37. TCR, molécula de fusão anti-CD3 de TCR, ácido nucleico, composição farmacêutica ou célula para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 36, caracterizados por serem administrados por injeção, tal como injeção intravenosa ou intratumoral direta.

38. MÉTODO DE TRATAR UM SUJEITO HUMANO QUE TEM CÂNCER, caracterizado por compreender administrar ao dito sujeito com necessidade do mesmo, uma dose farmaceuticamente eficaz de uma composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 33.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38,

caracterizado por compreender ainda administrar separadamente, em combinação ou sequencialmente um agente antineoplásico.

40. FORMULAÇÃO INJETÁVEL PARA ADMINISTRAR A UM SUJEITO HUMANO, caracterizada por compreender um TCR, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou uma molécula de fusão anti-CD3 de TCR, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 26.

41. MÉTODO DE PRODUZIR UM TCR, conforme definida qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou uma molécula de fusão anti-CD3 TCR, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado por compreender a) manter uma célula, conforme definida na reivindicação 29, sob ótimas condições para a expressão do ácido de cadeias de TCR e Db) isolar as cadeias de TCR.