JP7483865B2 - T細胞受容体の定常ドメインを含むタンパク質 - Google Patents
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Description
、ならびに標準のストークジスルフィドおよび安定化α166/β173ジスルフィドの両方を有するCα/Cβ断片(●)を用いるDSF変性曲線を示す。
または7(■)の安定化変異を伴うCα/CβのDSF曲線を示す。
での異なる可変ドメイン変異を伴う1G4_122 TCRの正規化された発現レベル(図5D)および最低Tm(図5E)。
Cα/Cβ TCRサブユニットの安定化
最初に、α/β TCRの熱力学的特性を、可溶型のα/β TCR、1G4_122、ならびにそのVα/VβおよびCα/Cβサブユニットを生成することによって調べ、1G4_122はNY-ESO-1抗原に結合する(Li、Y.,et al.,Nat Biotechnol,2005.23(3):349-54)。哺乳動物の発現系を使用して、VαをVβに、またはCαをCβに連結するフレキシブル(Gly4Ser)4リンカー(配列番号43)の存在下または非存在下で、Vα/VβおよびCα/Cβサブユニットの両方を生成した。サブユニットの発現およびアセンブリは、ドメイン間ジスルフィドの安定化のある場合とない場合とで試験された。単鎖バリアントを含め、ほとんどのVα/VβおよびCα/Cβ構築物は発現に失敗したか、組み立てに失敗した。最良のVα/Vβサブユニット発現は、抗体可変ドメイン断片またはFvを安定化するために使用されるVH44/VL100ジスルフィドに相同なVα44/Vβ110ジスルフィドを加えることによって得られ(Brinkmann,et al.,Proc Natl Acad Sci USA,1993.90(16):7538-42)、一方、ドメインのC末端のネイティブCα/Cβジスルフィド(Cα213/Cβ247)の上に既知の安定化ジスルフィド(Cα166/Cβ173)を使用すると、最良のCα/Cβ発現が得られた(Boulter,et al.,Protein Eng,2003.16(9):707-11)。示差走査熱量測定(DSC)実験は、(Cα166/Cβ173)ジスルフィドが全長TCR(両方のサブユニット)の熱アンフォールディングの中点(Tm)を8℃増加させることを示した。Vα/VβおよびCα/Cβサブユニットのアンフォールディングを無傷の細胞外TCRドメインのアンフォールディングと比較すると、個々のサブユニットは互いに存在しない場合に明らかに両方とも不安定化され(図1A)、以前に観察された熱力学的協同性と一致する(Feige,et al.,J Biol Chem,2015.290(44):26821-31)。
次に、Cα/Cβサブユニットの野生型および安定化型の両方を結晶化する試みが実行された。タンパク質は、結晶化の前に酵素的に脱グリコシル化された。タンパク質を用いたSDS-PAGEゲルの結果(図1D)と一致して、安定化バージョンのみがタンパク質結晶を生成した。安定化Cα/Cβサブユニットの1.76Åの結晶構造が観察された。7つの変異体すべての側鎖が構造内で分解され、変異がタンパク質をどのように安定化させているかを示す(図3Aおよび図3B)。
無関係の全長の可溶性TCRの発現および安定性に対するCα/Cβ変異の影響を評価するために、1G4_122抗NY-ESO-1 TCRを新規Cα/Cβ変異がある場合とない場合とで生成した。ジスルフィドがない場合、1G4_122 TCRは哺乳動物細胞で非常に不十分に発現したが、Cα/Cβ変異があると、発現は10倍を超えて増加し、DSCで測定したTmは8℃高くなった(表2、図4A)。安定化Cα/Cβ変異はまた、MAGE_A3(pdb 5BRZ、NCBI:α=ABY74337.1/β=ACZ48691.1、HIV(pdb 3VXT、NCBI:α=ABB89050.1/β=ACY74607.1)、およびWT-1抗原を標的とする追加のTCRを含む4つの無関係な(および配列が多様な)α/β TCRにおけるCαT166C/CβS173Cジスルフィドの存在下でも評価された(Raman,et al.,Sci Rep,2016.6:18851、Shimizu,et al.,Sci Rep,2013.3:3097、Richman,S.A.,et al.,Mol Immunol,2009.46(5):902-16)。CαT166C/CβS173Cジスルフィドの存在下でさえ、安定化Cα/Cβサブユニットの存在下で、各TCRは力価の約3倍の増加およびDSCによる熱安定性の増加が見られた(表2、図4B)。興味深いことに、SDS-PAGE分析および分析サイズ排除クロマトグラフィー(SEC、図4C~4D)によって評価されるように、4つのTCRすべてがよりコンパクトであった。
α/β TCRを安定化することの主な利点は、可能にすることができる新しい形態の二重特異性である。第一世代のTCR二重特異性は、可溶性α/β TCRの特異性をImmTacフォーマットの抗CD3 scFvと組み合わせる(Liddy,et al.,Nat Med,2012。18(6):980-7)。このフォーマットは、絶妙な再方向付けされた溶解効力を可能にするが、しかしながら、低収量の細菌発現および再フォールディング、ならびにこのフォーマットの迅速な血清クリアランスは、インビボ投与を困難にする。Cα/Cβ変異によってもたらされる哺乳動物細胞におけるα/β TCRの発現の有意な増加および適切なフォールディングによって、薬物動態(PK)が強化された部分、ならびに腫瘍細胞への結合力を含む新しい二重特異性フォーマットがアクセス可能であるはずである。
分子生物学
NY-ESO-1 1G4_122可溶性TCR、および個々のNY-ESO-1Vα/VβおよびCα/Cβサブユニットは、もともとgBlocks(Integrated DNA Technologies,IDT)を使用して生成され、リコンビナーゼクローニングを使用して(In-Fusion,Clontech)、哺乳動物発現ベクター(Lonza)にサブクローニングした。1G4_122、107、および113の配列は、2F53結晶構造を使用して導出した(Dunn,et al.,Protein Sci,2006.15(4):710-21)および他の場所で説明されているCDR(Li,et al.,Nat Biotechnol,2005.23(3):349-54)。マウスカッパ軽鎖リーダー配列を使用して各タンパク質の分泌を促進し、8xHisタグをα鎖のN末端に組換え的に添加した。DNA配列は、IDTに最適化されたコドンアルゴリズムを使用して導出した。
以前に記載されているように、24ウェルプレート(1mLスケール)または個々のフラスコ(100~200mLスケール)のいずれかで一過性発現のためにα/β構築物をコトランスフェクトした(Rajendra,et al.,Biotechnol Prog,2017.33(2):469-477)。以前に記載されたように、精製のために上清を回収した(Lewis,et al.,Nat Biotechnol,2014.32(2):191-8、Froning、et al.,Protein Sci,2017.26(10):2021-2038)。TCRおよびTCR断片の小規模発現は、Octet RED384システム上でのNi2+-NTAチップ(Pall Forte Bio)の読み取りを使用して定量化された。TCR/TCR断片Hisタグタンパク質は、Ni2+固定化レジン(cOmplete(商標)His-Tag,Millipore Sigma)およびAKTA Pureシステム(GE Healthcare)を使用して精製した。カラムは、少なくとも5カラム容量の結合バッファー(20mM Tris-HCl pH8.0、0.5M NaCl)を用いて、1mLカラムの場合は1mL/分、5mLカラムの場合は5mL/分の流速でそれぞれ平衡化した。CHO発現上清をカラムに通してHisタグ化TCRまたはTCR断片を捕捉した後、TCRタンパク質を10カラム容量の溶出バッファー(20mM Tris-HCl pH8.0、0.5M NaCl、250mMイミダゾール)を用いて溶出した。イミダゾールは、タンパク質を分取サイズ排除カラム(SRT-10C SEC300)に通すか、10,000MWカットオフのVIVASPIN6濃縮器を使用してpH7.2~7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に対して透析することにより除去された。IgG-Fc含有タンパク質は、mAbSureレジン(GE Healthcare)および分取サイズ排除を使用して精製した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)は、製造元(Life Technologies)に従って4~12%のBis Trisゲルを使用して実施した。還元およびアルキル化は、1mM ジチオスレイトール(DTT)および1mM N-エチルマレイミド(NEM)を使用して実行した。
タンパク質のアンフォールディングは、SYPRO Orange色素(Invitrogen,S6651)を使用してLightcycler 480II RT PCRマシン(Roche)上でモニターした。励起フィルターおよび発光フィルターは、それぞれ465nmおよび580nmに設定した。温度は1℃/sの速度で25℃から95℃まで上昇した。タンパク質のストック溶液をランニングバッファー中(1×PBS pH7.4)に保存した。
PDBコード2F53のTCR結晶構造を使用して、A-C鎖を除去して、アルファ鎖およびベータ鎖のみを残した。残りの構造は、ロゼッタのFastRelaxプロトコルを使用して、すべての残基のCA原子に座標制約(バックボーン原子が開始位置から外れると成長するエネルギーペナルティ)を使用して緩和された(Conway et al.,Protein Sci,2014.23(1):47-55)。FastRelaxプロトコルを使用して、考えられるすべての変異(システインへの変異を除く)もシミュレートした。FastRelaxは、2つのサブプロトコルで構成されている。(1)固定バックボーン回転異性体置換(すなわち、側鎖コンフォメーションサンプリング)および(2)バックボーンおよび側鎖ねじれ角の全原子最小化である。最初のサブプロトコルは、残基位置ごとに回転異性体ライブラリーを生成し、ユーザーが許可した位置で回転異性体を確率的にサンプリングする。このサンプリングが何度も繰り返された後(数十万)、回転子の最低エネルギーの組み合わせがタンパク質に割り当てられる。第2のサブプロトコルは、勾配ベースのねじれ角の最小化を使用して、構造をロゼッタエネルギー地形の極小値に緩和する。この研究では、エネルギー関数REF2015を使用した(Park,J Chem Theory Comput,2016、12(12):6201-6212、O’Meara、et al.,J Chem Theory Comput,2015.11(2):609-22)。ロゼッタエネルギー予測でノイズを防ぐために、特定の考慮事項が作成された。FastRelaxの最初のサブプロトコルでは、変異から10Å以内の残基のみを使用して、代替の側鎖コンフォメーションをサンプリングした。バックボーンが開始構造から大きく変化するのを防ぐために、第2のサブプロトコルのすべての残基位置に座標制約が追加された。FastRelaxが完了した後、座標制約なしで全原子最小化の最後の実行が1回実行され、タンパク質がその局所的な、制約のないエネルギー最小値にリラックスできるようにする。可能性があるすべての変異に対して10個の独立した軌道が実行され、その変異の代表的なスコアとして、スコアが最も低い3つの軌道の平均スコアが使用された。ロゼッタバージョンのバージョン識別子(git sha1)は、2017年6月4日にリリースされた360d0b3a2bc3d9e08489bb9c292d85681bbc0cbdであった。
39のCA配列および53のCB配列のリストは、様々な生物からのTCR配列のマルチプル配列アラインメント(MSA)を手動で監督することによって評価された。非冗長タンパク質配列のNCBIデータベース(データベース内の169,859,411配列)を使用して、2F53構造のCA鎖およびCB鎖の配列をBLASTに渡すことにより、TCR類似配列の2つのリストを作成した。両方のリストは、TCRであるとは思われない配列を手動で削除した。ロゼッタによって安定化すると見なされた変異のリストは、2つのリストに分割された:(1)MSAに存在する変異と(2)MSAに存在しない変異である。実験的試験のために、リスト1から30の変異が選択され、リスト2から25の変異が選択された。選考の決定は主にロゼッタスコアによって行われたが、多様性を高めるために一部の候補者は削除された。変異を2つのリストに分割することにより、ロゼッタによって下位層と見なされた変異は、T細胞受容体構造と互換性があることが示されている場合に促進できる。
最高のパフォーマンスの点変異が実験的に決定された後、ロゼッタシミュレーションを実行して、各変異が他のすべての変異と互換性があることを確認した。各変異は、事前に緩和された2F53構造に別々に適用され、固定バックボーン側鎖の再充填を実行した。同じシミュレーションが変異のすべての対で実施され、ペアのロゼッタエネルギーが個々の変異のエネルギーの合計と異ならないことを確認した。
精製されたタンパク質は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して8℃で結晶化された。結晶は、15mg/mLの1部のタンパク質溶液(10mM Tris-HCl pH7.5、および150mM 塩化ナトリウム)を、23%PEG 4K、300mM 硫酸マグネシウム、および10%グリセロールを含む1部のリザーバー溶液と混合することによって得られた。液滴に、15% PEG3350および100mM ギ酸マグネシウムから成長した粉砕結晶を播種した。1週間以内に単一の板状結晶が観察された。これらを15%グリセロールを含む一滴のリザーバー溶液に収集し、液体窒素で瞬間冷凍した。
シンクロトロンX線回折データは、Advanced Photon Source on beamline 31-ID-D(LRL-CAT)の単結晶で収集された。得られたデータは、autoPROCを使用して統合され(Vonrhein,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2011.67(Pt 4):293-302)、SCALAとマージおよびスケーリングされた(Evans,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2011.67(Pt 4):282-92)。この構造は、Phaserによる分子置換によって分解され(McCoy,et al.,J Appl Crystallogr,2007.40(Pt 4):658-674)、以前に分解されたTCR-pMHC複合体(Protein Databankアクセッションコード2F53)のTCR定常ドメインを検索モデルとして使用する(Dunn,et al.,Protein Sci,2006.15(4):710-21)。COOT(Emsley,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2010. 66(Pt 4):486-501)およびREFMAC5(Murshudov,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2011.67(Pt 4):p.355-67)を使用して、CCP4ソフトウェアパッケージに実装されているように(Winn,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2011.67(Pt 4):235-42)、モデルの構築および改良を数回実施した。最終モデルはMolProbityを用いて検証された(Williams,et al.,Protein Sci,2018.27(1):293-315)。追加のデータ収集および改良の詳細は、表4および表5に記載されている。
野生型および安定化CE10 TCRは、分析のために変性、還元、システインアルキル化、および消化された。簡単に説明すると、100μgのTCRバリアントを6Mグアニジンで変性させた後、10mM ジチオスレイトールで37℃にて30分間還元した。次に、15mM ヨードアセトアミドを添加し、暗所で45分間反応を進行させた。次に、スピンフィルターを使用して、各サンプルを10mM TRIS、pH7.5にバッファー交換した。5μgのトリプシンを還元/アルキル化サンプルに添加し、37℃にて4時間インキュベートした。トリプシン処理したサンプルを2つの等量部に分けた。最初のサンプルは、1μLのPNGaseF(ProZyme)および5uLの10x消化バッファーを加えること、および室温で一晩インキュベートすることにより脱グリコシル化され、一方第2のサンプルは未処理のままにされた。
HDX-MS実験は、HDXテクノロジーを用いるWaters nanoACQUITYシステム上で実行され(Wales,et al.,Anal Chem,2008.80(17):6815-20)、これはLEAP HDXロボット液体処理システムを含む。重水素交換実験は、0.1×PBSを含む55μLのD2Oバッファーを5μlの各タンパク質(濃度は25μM)に15℃で様々な時間(0秒、10秒、1分、10分、60分、および240分)加えることによって開始した。等量の0.32M TCEP、0.1Mリン酸塩pH2.5を使用して、1℃で2分間反応を停止させた。移動相として水中0.2%のギ酸を使用して、100μL/分の流速で4分間、14℃で50μLのクエンチした反応物をオンラインペプシンカラム(Waters BEH Enzymate)に注入した。次いで、得られた消化性ペプチドを、50μL/分の流速で10分間にわたって、3~85%のアセトニトリル(0.2%のギ酸を含有する)勾配を使用して、Vanguardトラップカラムを備えるC18カラム(Waters,Acquity UPLC BEH C18,1.7μm,1.0mm×50mm)で分離する。分離されたペプチドは、Waters Xevo G2飛行時間型(qTOF)質量分析計に送られる。質量分析計は、m/z 255.00~1950.00の質量取得範囲において、スキャン時間0.5秒で、MSE、ESI+モードでデータを収集するように設定されている。Xevo G2は、使用前にGlu-フィブリノペプチドで較正されている。すべての取得データは、50% ACN、50% H2O、および0.1% FA中のLeuEnkの2μg/ml溶液を使用して、30秒ごとに5μl/分の流量で質量補正される(m/zは556.2771)。ペプチドは最初に、Waters Protein Lynx Global Server 3.02によって同定される。処理パラメータは、100.0カウントの低エネルギー閾値、50.0カウントの高エネルギー閾値、および1500.0カウントの強度閾値に設定されている。得られたペプチドのリストは、Waters DynamX 3.0ソフトウェアにインポートされ、閾値は5ppmの質量誤差であり、ペプチド長に基づくペプチドあたりの断片イオンは20%であった。各ペプチドの相対的な重水素取り込みは、DynamX3.0(Waters Corporation)の非重水素化対照とともに重水素化サンプルのMSデータを処理することによって決定される。
TCR/CD3 IgG様BsAbsの薬物動態測定は、以前に記載されたように実行された(Lewis,et al.,Nat Biotechnol,2014.32(2):191-8)。BsAbに対する抗薬物抗体がマウスにおいて生成されているかどうかを評価するために、50mM 炭酸ナトリウム、pH9.3中の2μg/mL BsAbで4℃にて一晩、High Bind Uウェル96ウェルプレート(Greiner Microlon)をコーティングすることによりELISAを実施した。プレートをPBS+0.1% Tween20(PBST)で洗浄し、室温(RT)でPBS(Thermo Scientific)中のBlocker(商標)カゼインで1時間ブロックし、PBSTで洗浄した。PBS中のBlocker(商標)カゼインの1:3段階希釈で1:50から開始するマウス血漿希釈液を、室温で1時間プレートに添加した。プレートをPBSTで洗浄し、1:1000ヤギ抗マウスカッパ-APポリクローナル(Southern Biotech Cat#1050-04):Blocker(商標)カゼイン一次抗体を添加し、1時間インキュベートした。検出試薬を洗い流した後、PNPP基質(Thermo Scientific)を添加した。比色読み取りは、SpectraMax190プレートリーダーで450nmの吸光度を読み取ることによって実行した。
Saos-2細胞はATCCからのものであり、624.38細胞はNCI/NIH DTP、DCTD腫瘍リポジトリからのものであり、両方ともComplete Media(RPMI 1640、Corning)中で培養された。初代ナイーブT細胞は、ALLCELLSからのものであった。アッセイでは、Accutaseを使用して腫瘍細胞を培養フラスコから取り出し、1200RPMで10分間スピンダウンした。腫瘍細胞をComplete Mediaに再懸濁し、96ウェルの黒色の透明なボトムプレート(Perkin Elmer)に5000細胞/ウェルで播種し、5%CO2インキュベーター中で16~24時間インキュベートした。次に、細胞に6μg/mLのSLLMWITQC(NY-ESO-1)ペプチド(CPC Scientificによって合成)、総量50μLを3時間パルスした。次に、TCR/CD3二官能性物質を、100nMで開始し、0.001nMで終了する10倍希釈液を3回(50μL/サンプル)で30分間使用して、細胞に滴定した。この期間中、初代T細胞を解凍し、完全培地およびゲンタマイシンで2回洗浄した。次に、T細胞(100μL)を50K細胞/ウェル(総量200mL)で添加した。細胞を5% CO2および37℃で48時間インキュベートした。48時間後、プレートを無血清RPMI 1640で穏やかに(2回)洗浄した。次に、100μLのRPMI 1640および100μLのCell Titer Glo試薬(Promega)を添加し、シェーカーで2分間混合し(ゆっくりと)、暗所で10分間インキュベートした。最後に、発光をEnVision2130マルチラベルリーダーで読み取った。
上記のように細胞培養を行った。フローサイトメトリーを実行する前日に、T25フラスコにJurkat、Saos-2、または624.38細胞を増殖バッファー(RPMI/10%ウシ胎児血清(FBS)/ゲンタマイシン-Gibco)に播種した。腫瘍細胞については、翌朝、細胞を増殖バッファーで1回洗浄した。ペプチドを腫瘍細胞に(すなわち陰性対照としてではなく)6μg/mLで37℃、5% CO2で3時間添加した。次に、過剰なペプチドを吸引除去し、細胞をPBSバッファーで3回洗浄した。その後のすべてのステップは氷上で実行した。Accutase(Innovative Technologies)を使用して、腫瘍細胞をT25フラスコから持ち上げた。ジャーカット細胞は浮遊状態で増殖する。細胞を遠心分離管に移し、1200RPMで7分間の遠心分離によりペレット化した。以降、「洗浄バッファー」はPBS/2%FBS/0.05%NaN3であった。「ブロッキングバッファー」は、10%正常ヤギ血清/10%FBS/ヒトBD Fcブロック(BD)を添加した洗浄バッファーであった。細胞をブロックバッファーに15分間再懸濁し、ペレット化し、3回洗浄し、ブロックバッファーに再懸濁してから、50μLの細胞(0.2×106)を96ウェルプレート(Corning 3799)に添加した。TCR/CD3二官能性および対照mAbを30、3、0.3、および0.03μg/mLでウェルに添加し、45分間インキュベートした。細胞をペレット化し、洗浄し、上清を再度吸引した後、100μLの希釈R-フィコエリトリン結合AffiniPureヤギ抗ヒトIgG-Fc(ジャクソン)または抗ヒトラムダLC(ジャクソン)をブロックバッファー中で45分間添加した。細胞をペレット化し、再度洗浄した。最後に、細胞を1:1000 PI(Molecular Probes)を含むブロックバッファーに再懸濁し、ホイルで覆った。次に、Divaソフトウェア(BD)で取得したFortessa H647780000006フローサイトメーターで細胞を選別し、FloJoバージョン10.0.08を使用してデータを分析した。
TCR定常ドメイン構造の座標、および対応する構造因子は、アクセッションコード6U07でProtein Data Bank(http://www.rcsb.org)に寄託されている。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
1.タンパク質であって、
以下の残基:139位のフェニルアラニン、150位のイソロイシン、190位のスレオニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)のうちの少なくとも1つを含むT細胞受容体(TCR)アルファ定常ドメイン(Cα)を含む第1のポリペプチド、および/または
以下の残基:134位のリジン、139位のアルギニン、155位のプロリン、170位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)のうちの少なくとも1つを含むTCRベータ定常ドメイン(Cβ)を含む第2のポリペプチドを含む、タンパク質。
2.前記第1のポリペプチドが、以下の残基:139位のフェニルアラニン、150位のイソロイシン、190位のスレオニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)のうちの少なくとも1つを含むCαを含み、
前記第2のポリペプチドが、以下の残基:134位のリジン、139位のアルギニン、155位のプロリン、170位のアスパラギン酸またはグルタミン酸(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)のうちの少なくとも1つを含むCβを含む、上記1に記載のタンパク質。
3.前記第1のポリペプチドが、以下の残基:139位のフェニルアラニン、150位のイソロイシン、190位のスレオニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCαドメインを含み、
前記第2のポリペプチドが、以下の残基:134位のリジン、139位のアルギニン、155位のプロリン、170位のアスパラギン酸(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCβドメインを含む、上記1または2に記載のタンパク質。
4.前記第1のポリペプチドが、以下の残基:139位のフェニルアラニンおよび190位のスレオニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCαドメインを含み、
前記第2のポリペプチドが、以下の残基:134位のリジン、139位のアルギニン、155位のプロリン、170位のアスパラギン酸(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCβドメインを含む、上記1または2に記載のタンパク質。
5.前記第1のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第2のポリペプチドに連結されている、上記1~4のいずれかに記載のタンパク質。
6.前記Cαドメインが、166位のシステイン残基(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)をさらに含み、
前記Cβドメインが、173位のシステイン残基(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)をさらに含み、
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドが、Cαの前記166位のシステイン残基とCβの前記173位のシステイン残基との間の鎖間ジスルフィド結合によって連結されている、上記1~5のいずれかに記載のタンパク質。
7.前記Cαドメインが、配列番号5を含み、
前記Cβドメインが、配列番号7を含む、上記1~5のいずれかに記載のタンパク質。
8.前記Cαドメインが、配列番号5からなり、
前記Cβドメインが、配列番号7からなる、上記1~5のいずれかに記載のタンパク質。
9.前記Cαドメインが、配列番号6を含み、
前記Cβドメインが、配列番号8を含む、上記1~6のいずれかに記載のタンパク質。
10.前記Cαドメインが、配列番号6からなり、
前記Cβドメインが、配列番号8からなる、上記1~6のいずれかに記載のタンパク質。
11.前記第1のポリペプチドが、TCRアルファ可変ドメイン(Vα)をさらに含み、
前記第2のポリペプチドが、TCRベータ可変ドメイン(Vβ)をさらに含み、
前記VαおよびVβが、抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、上記1~10のいずれかに記載のタンパク質。
12.前記Vαが、CαのN末端に融合しており、
前記Vβが、CβのN末端に融合している、上記11に記載のタンパク質。
13.前記抗原が、腫瘍抗原またはウイルス抗原である、上記11に記載のタンパク質。
14.前記タンパク質が、第2の抗原結合ドメインをさらに含む、上記1~13のいずれかに記載のタンパク質。
15.前記第2の抗原結合ドメインが、T細胞表面上の抗原に結合する、上記14に記載のタンパク質。
16.前記第2の抗原結合ドメインが、CD3に結合する、上記14に記載のタンパク質。
17.前記第2の抗原結合ドメインが、scFv、Fab、Fab’、(Fab’) 2 、単一ドメイン抗体、またはラクダVHHドメインである、上記14~16のいずれかに記載のタンパク質。
18.前記第2の抗原結合ドメインが、Fabである、上記14~17のいずれかに記載のタンパク質。
19.前記Fabが、重鎖可変ドメイン(VH)およびヒトIgG CH1ドメインを含むFab重鎖、ならびに軽鎖可変ドメイン(VL)およびヒト軽鎖定常ドメイン(CL)を含むFab軽鎖を含み、前記VHおよびVLが、CD3に結合する前記第2の抗原結合ドメインを形成する、上記18に記載のタンパク質。
20.前記タンパク質が、以下の3つのポリペプチド:
Vα-Cα-リンカー-VH-CH1を含む第1のポリペプチド、
Vβ-Cβを含む第2のポリペプチド、および
VL-CLを含む第3のポリペプチドを含み、
前記第2および第3のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第1のポリペプチドに連結されている、上記18または19に記載のタンパク質。
21.前記タンパク質が、ヒトIgG Fc領域(Fc)をさらに含む、上記1~20のいずれかに記載のタンパク質。
22.前記ヒトIgG Fc領域が、対応する野生型ヒトIgG Fc領域と比較してエフェクター機能が低下した改変ヒトIgG Fc領域である、上記21に記載のタンパク質。
23.前記タンパク質が、以下の4つのポリペプチド:
Vα-Cα-ヒンジ-第1のFc領域を含む第1のポリペプチド、
Vβ-Cβを含む第2のポリペプチド、
VL-CLを含む第3のポリペプチド、および
VH-CH1-ヒンジ-第2のFc領域を含む第4のポリペプチドを含み、
前記第2および第4のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第1のポリペプチドに連結されており、前記第3のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第4のポリペプチドに連結されている、上記1~19、21または22のいずれかに記載のタンパク質。
24.前記タンパク質が、以下の4つのポリペプチド:
Vα-Cα-リンカー-VH-CH1-ヒンジ-第1のFc領域を含む第1のポリペプチド、
Vβ-Cβを含む第2のポリペプチド、
VL-CLを含む第3のポリペプチド、
第2のFc領域を含む第4のポリペプチドを含み、
前記第2、第3、および第4のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第1のポリペプチドに連結されている、上記21または22に記載のタンパク質。
25.前記リンカーが、配列番号41~46のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、上記20または24に記載のタンパク質。
26.前記ヒンジ領域が配列番号47を含み、前記第1および第2のFc領域が配列番号48を含む、上記23または24に記載のタンパク質。
27.前記ヒンジ領域が配列番号49を含み、前記第1および第2のFc領域が配列番号50を含む、上記23または24に記載のタンパク質。
28.前記第1および第2のFc領域が、CH3ヘテロ二量体化変異のセットを含む、上記23または24に記載のタンパク質。
29.前記第1または第2のFc領域のうちの一方が、残基407のアラニン、残基399のメチオニン、および残基360のアスパラギン酸を含むCH3ドメインを含み、前記第1または第2のFc領域の他方が、残基366のバリン、残基409のバリン、ならびに残基345および347のアルギニン(EUインデックス番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCH3ドメインを含む、上記28に記載のタンパク質。
30.前記タンパク質が、可溶性タンパク質である、上記1~29のいずれかに記載のタンパク質。
31.前記タンパク質が、
前記Cαドメインが139位のセリン、150位のスレオニン、および190位のアラニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと、ならびに
前記Cβドメインが134位のグルタミン酸、139位のヒスチジン、155位のアスパラギン酸、および170位のセリン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、より高いアンフォールディング温度(Tm)を有する、上記1~30のいずれかに記載のタンパク質。
32.前記タンパク質が、
前記Cαドメインが139位のセリン、150位のスレオニン、および190位のアラニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと、ならびに
前記Cβドメインが134位のグルタミン酸、139位のヒスチジン、155位のアスパラギン酸、および170位のセリン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、増加した安定性を有する、上記1~30のいずれかに記載のタンパク質。
33.前記タンパク質が、同じ条件下で発現される場合、
前記Cαドメインが139位のセリン、150位のスレオニン、および190位のアラニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと、ならびに
前記Cβドメインが134位のグルタミン酸、139位のヒスチジン、155位のアスパラギン酸、および170位のセリン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、増加した発現レベルを有する、上記1~30のいずれかに記載のタンパク質。
34.前記タンパク質が、
前記Cαドメインが139位のセリン、150位のスレオニン、および190位のアラニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと、ならびに
前記Cβドメインが134位のグルタミン酸、139位のヒスチジン、155位のアスパラギン酸、および170位のセリン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、低下したグリコシル化レベルを有する、上記1~30のいずれかに記載のタンパク質。
35.(a)前記第1のポリペプチドが、TCRアルファ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをさらに含み、
(b)前記第2のポリペプチドが、TCRベータ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをさらに含む、上記1~13のいずれかに記載のタンパク質。
36.前記タンパク質が、検出可能な標識に連結されている、上記1~35のいずれかに記載のタンパク質。
37.前記タンパク質が、治療剤に連結されている、上記1~36のいずれかに記載のタンパク質。
38.前記治療剤が、細胞毒性剤、抗炎症剤、または免疫刺激剤である、上記37に記載のタンパク質。
39.上記1~38のいずれかに記載のタンパク質のポリペプチドをコードする核酸。
40.上記39に記載の核酸を含む、ベクター。
41.上記39に記載の核酸または上記40に記載のベクターを含む、細胞。
42.上記1~38のいずれかに記載のタンパク質、上記39に記載の核酸、上記40に記載のベクター、または上記41に記載の細胞を含む、医薬組成物。
43.がんまたは感染症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、上記1~38のいずれかに記載のタンパク質、上記39に記載の核酸、上記40に記載のベクター、上記41に記載の細胞、または上記42に記載の医薬組成物の治療有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
44.がんまたは感染症の治療に使用するための、上記1~38のいずれかに記載のタンパク質、上記39に記載の核酸、上記40に記載のベクター、上記41に記載の細胞、または上記42に記載の医薬組成物。
配列番号1 WT TCRα定常ドメイン(Cα)
[配列表1]
配列番号2 WT TCRβ定常ドメイン(Cβ)
[配列表2]
配列番号3 ジスルフィド変異を伴うWT TCRα定常ドメイン(Cα)
[配列表3]
配列番号4 ジスルフィド変異を伴うWT TCRβ定常ドメイン(Cβ)
[配列表4]
配列番号5 ジスルフィドを差し引いた3つの安定化変異を伴うTCRのCα
ジスルフィド_S139F_T150I_A190Tを差し引いたアルファ定常ドメイン
[配列表5]
配列番号6 ジスルフィド変異を伴う3つの安定化変異を伴うTCRのCα
ジスルフィド_S139F_T150I_A190Tを伴うアルファ定常ドメイン
[配列表6]
配列番号7 ジスルフィドを差し引いた4つの安定化変異を伴うTCRのCβ
ベータ定常E134K_H139R_D155P_S170D
[配列表7]
配列番号8 ジスルフィド変異を伴う4つの安定化変異を伴うTCRのCβ
ベータ定常E134K_H139R_D155P_S170D
[配列表8]
配列番号9 ジスルフィドを伴わないNY-ESO-1 Cα WT
[配列表9]
配列番号10 ジスルフィドを伴うNY-ESO-1 Cα WT
[配列表10]
配列番号11 ジスルフィド_S139F_T150I_A190Tを伴うNY-ESO-1 Cα
[配列表11]
配列番号12 ジスルフィド_S139F_T150I_A190Tを伴わないNY-ESO-1 Cα
[配列表12]
配列番号13 ジスルフィドを伴わないNY-ESO-1 Cβ WT
[配列表13]
配列番号14 ジスルフィドを伴うNY-ESO-1 Cβ WT
[配列表14]
配列番号15 ジスルフィド_E134K_H139R_D155P_S170Dを伴うNY-ESO-1 Cβ
[配列表15]
配列番号16 ジスルフィド_E134K_H139R_D155P_S170Dを伴わないNY-ESO-1 Cβ
[配列表16]
配列番号17 ジスルフィドを伴うCE10 Cα WT
[配列表17]
配列番号18 ジスルフィド_S139F_T150I_A190Tを伴うCE10 Cα
[配列表18]
配列番号19 ジスルフィドを伴うCE10 Cβ WT
[配列表19]
配列番号20 ジスルフィド_E134K_H139R_D155P_S170Dを伴うCE10 Cβ
[配列表20]
配列番号21 ジスルフィドを伴う抗NEF134-10 HIV TCR Cα WT
[配列表21]
配列番号22 ジスルフィド_S139F_T150I_A190Tを伴う抗NEF134-10 HIV TCR Cα
[配列表22]
配列番号23 ジスルフィドを伴う抗NEF134-10 HIV TCR Cβ WT
[配列表23]
配列番号24 ジスルフィド_E134K_H139R_D155P_S170Dを伴う抗NEF134-10 HIV TCR Cβ
[配列表24]
配列番号25 ジスルフィドを伴うMAGE-A3 Cα WT
[配列表25]
配列番号26 ジスルフィド_S139F_T150I_A190Tを伴うMAGE-A3 Cα
[配列表26]
配列番号27 ジスルフィドを伴うMAGE-A3 Cβ WT
[配列表27]
配列番号28 ジスルフィド_E134K_H139R_D155P_S170Dを伴うMAGE-A3 Cβ
[配列表28]
配列番号29 ジスルフィドFc7.8.60Aを伴うIgG1AA_N297Q NY-ESO-1WT Cα
[配列表29]
配列番号30 ジスルフィドおよびCH3 7.8.60Aヘテロダイマー変異を伴うIgG1AA_N297Q NY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T
[配列表30]
配列番号31 7.8.60Bヘテロダイマー変異を伴うIgG1AA_N297Q SP34 mVH
[配列表31]
配列番号32 Ch SP34 mVLラムダ
[配列表32]
配列番号33 ジスルフィド_(G4S)4リンカー_Ch SP34mVHタンデムFAbを伴うNY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T
[配列表33]
配列番号34 ジスルフィド7.8.60Aで脱グリコシル化されたIgG1AA_N297Q NY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T
[配列表34]
配列番号35 ジスルフィド7.8.60Aを伴うIgG1AA_N297Q NY-ESO-1#107 Cα_S139F_T150I_A190T
[配列表35]
配列番号36 ジスルフィド_E134K_H139R_D155P_S170Dを伴うNY-ESO-1#107 Cβ
[配列表36]
配列番号37 ジスルフィド7.8.60Aを伴うIgG1AA_N297Q NY-ESO-1#113 Cα_S139F_T150I_A190T
[配列表37]
配列番号38 とジスルフィド_E134K_H139R_D155P_S170Dを伴うNY-ESO-1#113 Cβ
[配列表38]
配列番号39 ジスルフィド_3XG4S_SP34mVH 7.8.60Bを伴うIgG1AA_N297Q NY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T
[配列表39]
配列番号40 ジスルフィド_5XG4S_Ch SP34 mVHタンデムFAbを伴うNY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T
[配列表40]
配列番号41 (G4S)3リンカー
[配列表41]
配列番号42 (G4Q)3リンカー
[配列表42]
配列番号43 (G4S)4リンカー
[配列表43]
配列番号44 (G4S)5リンカー
[配列表44]
配列番号45 (G4Q)4リンカー
[配列表45]
配列番号46 (G4Q)5リンカー
[配列表46]
配列番号47 IgG1ヒンジ領域
[配列表47]
配列番号48 L234A_L235A_N297Qを含むIgG1Fc領域
[配列表48]
配列番号49 IgG4(StoP)ヒンジ領域
[配列表49]
配列番号50 IgG4AA Fc領域
[配列表50]
配列番号51 ヒトHPB-MLT Cβ
[配列表51]
配列番号52 ヒトHPB-MLT Cα
[配列表52]
Claims (29)
- タンパク質であって、
以下の残基:139位のフェニルアラニン、150位のイソロイシン、190位のスレオニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)のうちの少なくとも1つを含むT細胞受容体(TCR)アルファ定常ドメイン(Cα)を含む第1のポリペプチド、および/または
以下の残基:139位のアルギニン、155位のプロリン、170位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)のうちの少なくとも1つを含むTCRベータ定常ドメイン(Cβ)を含む第2のポリペプチドを含み、
前記タンパク質は、参照ペプチドと比較して、より高いアンフォールディング温度(Tm)を有し、前記参照ペプチドは、
前記Cαドメインが139位のセリン、150位のスレオニン、および190位のアラニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと、および/または
前記Cβドメインが134位のグルタミン酸、139位のヒスチジン、155位のアスパラギン酸、および170位のセリン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むこと
以外は前記タンパク質と同じアミノ酸配列を含む、タンパク質。 - 前記第1のポリペプチドが、以下の残基:139位のフェニルアラニン、150位のイソロイシン、190位のスレオニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)のうちの少なくとも1つを含むCαを含み、
前記第2のポリペプチドが、以下の残基:134位のリジン、139位のアルギニン、155位のプロリン、170位のアスパラギン酸またはグルタミン酸(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)のうちの少なくとも1つを含むCβを含む、請求項1に記載のタンパク質。 - 前記第1のポリペプチドが、以下の残基:139位のフェニルアラニン、150位のイソロイシン、190位のスレオニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCαドメインを含み、
前記第2のポリペプチドが、以下の残基:134位のリジン、139位のアルギニン、155位のプロリン、170位のアスパラギン酸(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCβドメインを含む、請求項2に記載のタンパク質。 - 前記第1のポリペプチドが、以下の残基:139位のフェニルアラニンおよび190位のスレオニン(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCαドメインを含み、
前記第2のポリペプチドが、以下の残基:134位のリジン、139位のアルギニン、155位のプロリン、170位のアスパラギン酸(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCβドメインを含む、請求項2に記載のタンパク質。 - 前記第1のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第2のポリペプチドに連結されている、請求項1~4のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記Cαドメインが、166位のシステイン残基(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)をさらに含み、
前記Cβドメインが、173位のシステイン残基(Kabat番号付けに従って番号付けされた残基)をさらに含み、
前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドが、Cαの前記166位のシステイン残基とCβの前記173位のシステイン残基との間の鎖間ジスルフィド結合によって連結されている、請求項1~5のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記Cαドメインが、配列番号5を含み、
前記Cβドメインが、配列番号7を含む、請求項2~5のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記Cαドメインが、配列番号5からなり、
前記Cβドメインが、配列番号7からなる、請求項2~5のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記Cαドメインが、配列番号6を含み、
前記Cβドメインが、配列番号8を含む、請求項2~6のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記Cαドメインが、配列番号6からなり、
前記Cβドメインが、配列番号8からなる、請求項2~6のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記第1のポリペプチドが、TCRアルファ可変ドメイン(Vα)をさらに含み、
前記第2のポリペプチドが、TCRベータ可変ドメイン(Vβ)をさらに含み、
前記VαおよびVβが、抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、請求項1~10のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記Vαが、CαのN末端に融合しており、
前記Vβが、CβのN末端に融合している、請求項11に記載のタンパク質。 - 前記抗原が、腫瘍抗原またはウイルス抗原である、請求項11に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、第2の抗原結合ドメインをさらに含む、請求項1~13のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記第2の抗原結合ドメインが、T細胞表面上の抗原に結合する、請求項14に記載のタンパク質。
- 前記第2の抗原結合ドメインが、CD3に結合する、請求項14に記載のタンパク質。
- 前記第2の抗原結合ドメインが、scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、単一ドメイン抗体、またはラクダVHHドメインである、請求項14~16のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記第2の抗原結合ドメインが、Fabである、請求項14~17のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記Fabが、重鎖可変ドメイン(VH)およびヒトIgG CH1ドメインを含むFab重鎖、ならびに軽鎖可変ドメイン(VL)およびヒト軽鎖定常ドメイン(CL)を含むFab軽鎖を含み、前記VHおよびVLが、CD3に結合する前記第2の抗原結合ドメインを形成する、請求項18に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、以下の3つのポリペプチド:
Vα-Cα-リンカー-VH-CH1を含む第1のポリペプチド、
Vβ-Cβを含む第2のポリペプチド、および
VL-CLを含む第3のポリペプチドを含み、
前記第2および第3のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第1のポリペプチドに連結されている、請求項18または19に記載のタンパク質。 - 前記タンパク質が、ヒトIgG Fc領域(Fc)をさらに含む、請求項1~20のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 前記ヒトIgG Fc領域が、対応する野生型ヒトIgG Fc領域と比較してエフェクター機能が低下した改変ヒトIgG Fc領域である、請求項21に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、以下の4つのポリペプチド:
Vα-Cα-ヒンジ-第1のFc領域を含む第1のポリペプチド、
Vβ-Cβを含む第2のポリペプチド、
VL-CLを含む第3のポリペプチド、および
VH-CH1-ヒンジ-第2のFc領域を含む第4のポリペプチドを含み、
前記第2および第4のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第1のポリペプチドに連結されており、前記第3のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第4のポリペプチドに連結されている、請求項1~19、21または22のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記タンパク質が、以下の4つのポリペプチド:
Vα-Cα-リンカー-VH-CH1-ヒンジ-第1のFc領域を含む第1のポリペプチド、
Vβ-Cβを含む第2のポリペプチド、
VL-CLを含む第3のポリペプチド、
第2のFc領域を含む第4のポリペプチドを含み、
前記第2、第3、および第4のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第1のポリペプチドに連結されている、請求項21または22に記載のタンパク質。 - 前記リンカーが、配列番号41~46のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項20または24に記載のタンパク質。
- 前記ヒンジ領域が配列番号47を含み、前記第1および第2のFc領域が配列番号48を含む、請求項23または24に記載のタンパク質。
- 前記ヒンジ領域が配列番号49を含み、前記第1および第2のFc領域が配列番号50を含む、請求項23または24に記載のタンパク質。
- 前記第1および第2のFc領域が、CH3ヘテロ二量体化変異のセットを含む、請求項23または24に記載のタンパク質。
- 前記第1または第2のFc領域のうちの一方が、残基407のアラニン、残基399のメチオニン、および残基360のアスパラギン酸を含むCH3ドメインを含み、前記第1または第2のFc領域の他方が、残基366のバリン、残基409のバリン、ならびに残基345および347のアルギニン(EUインデックス番号付けに従って番号付けされた残基)を含むCH3ドメインを含む、請求項28に記載のタンパク質。
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