CN114502578A

CN114502578A - 包含t-细胞受体恒定结构域的蛋白

Info

Publication number: CN114502578A
Application number: CN202080063229.3A
Authority: CN
Inventors: S·J·德马雷斯特; K·J·弗罗宁; B·A·库尔曼; J·B·马圭尔
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Eli Lilly and Co
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; Eli Lilly and Co
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2022-05-13
Also published as: JP7483865B2; US20220306720A1; CA3149939A1; JP2022547494A; WO2021046072A1; EP4025598A1

Abstract

本文提供了包含具有一个或多个稳定突变的T‑细胞受体(TCR)恒定结构域的蛋白、编码此类蛋白的核酸以及制备和使用此类蛋白的方法。

Description

包含T-细胞受体恒定结构域的蛋白

本公开涉及包含具有一个或多个稳定突变的T-细胞受体(TCR)恒定结构域的蛋白、编码此类蛋白的核酸以及制备和使用此类蛋白的方法。

T细胞受体(TCR)是适应性免疫系统用于识别和消除“非自身”细胞内抗原的工具。这些非自身抗原可以来自病毒感染或来自基因改变。基因改变是异常细胞功能的关键，并可能导致疾病、诸如癌症。TCR以α/β和γ/δ形式存在，它们在结构上相似但在不同的T细胞上表达。α/β TCR在CD8+效应细胞和CD4+辅助T细胞上均表达，并且当与HLA/MHC复合时识别在感染/癌细胞表面上展示的蛋白酶体降解的外来抗原(Davis等人, Nature, 1988. 334(6181): 395-402; Heemels, 等人, Annu Rev Biochem, 1995. 64: 463-91)。当在CD8+T效应细胞上表达时，α/β TCR与I型MHC/肽复合物特异性相互作用，并且这种相互作用诱导T细胞活化和展示可识别的非自身抗原的细胞的消除。

在结构上，天然α/β TCR的细胞外部分由两条多肽组成：α链和β链，其各自具有膜近端的恒定结构域(Cα或Cβ结构域)和膜远端的可变结构域(Vα或Vβ结构域)。所述恒定和可变结构域各自包括链内二硫键。所述可变结构域含有类似于抗体的互补决定区(CDR)的高度可变环。TCR的CDR3与由MHC(主要组织相容性复合物)呈递的肽相互作用，并且CDR1和CDR2与肽和MHC相互作用。TCR序列的多样性经由连接的可变(V)、多样性(D)、连接(J)和恒定(C)基因的体细胞重排生成；并且这种重排生成令人难以置信的多样性，其使得TCR能够识别由MHC展示的不同肽抗原。

已经开发了许多方法来利用α/β TCR的精细非自我识别特性用于治疗用途。重组α/β TCR已被转导/转染至大量幼稚T细胞中，作为重定向这些T细胞以靶向肿瘤相关抗原的手段(Riley等人, Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(3):175-196; Parkhurst, 等人,Clin Cancer Res, 2017. 23(10): 2491-2505)。或者，使用与结合活化T细胞受体(通常是CD3ε)的scFv融合的TCR的可溶性细胞外区域，已被用于重定向内源性T细胞以靶向肿瘤细胞(Liddy等人, Nat Med, 2012. 18(6): 980-7)。与依赖于直接识别在细胞表面上的过表达抗原的典型BiTE-样双特异性抗体(Baeuerle, 等人, Cancer Res, 2009. 69(12):4941-4)不同，TCR或TCR-模拟双特异性体可以识别细胞内和异常肿瘤或病毒抗原的更大子集，且因此具有更广泛的潜在适用性(Liddy等人, Nat Med, 2012. 18(6): 980-7)。

然而，TCR组装和表达是有挑战性的(Wilson等人, Curr Opin Struct Biol,1997. 7(6): 839-48)。出于研究和治疗目的，生产可溶性α/β TCR的常用方法是通过在大肠杆菌(E. coli)中表达为包涵体，随后再溶解、重折叠/组装/氧化，且最后以相对低的产率纯化(vanBoxel, 等人, J Immunol Methods, 2009. 350(1-2): 14-21)。为了简化组装件，一些研究人员已经尝试仅使用单链形式或scTv的TCR的可变结构域区域，如抗体单链Fv(scFv)，用于靶向特定的HLA/肽复合物(Stone等人, Methods Enzymol, 2012. 503: 189-222)。尽管scFv已经显示不稳定性、聚集和低溶解度的倾向，但scTCR可变结构域通常显示更差的表达和稳定性问题。已做出巨大努力来稳定scVα/Vβ蛋白以用于治疗和诊断用途(Stone等人, Methods Enzymol, 2012. 503: 189-222)。不幸的是，Vα/Vβ种系的高度多样性(远高于抗体的V_H/V_L种系)，使得scVα/Vβ内的每组稳定突变对于单个Vα/Vβ亚基是独特的，并且不太可能找到在多个TCR之间的通用用途。

鉴于大多数细胞外蛋白本质上是糖基化且具有复杂的二硫键配对，哺乳动物表达用于产生可溶性TCR。工业抗体生产主要转移至哺乳动物表达系统(Shukla等人, BioengTransl Med, 2017. 2(1): 58-69)。然而，当在通常利用的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系统中表达时，与抗体相比时，α/β TCR表达较差，组装可靠性更低。许多新型双特异性抗体形式，包括与可溶性α/β TCR双特异性体相关的形式的那些，可能需要TCR以抗体样水平表达以进行适当的分子组装，这是其生产的障碍。将可溶性TCR与抗体scFv重组融合的双特异性ImmTac部分通常在细菌中表达为不溶性包涵体，以低产率溶解、重折叠和组装(Liddy等人,Nat Med, 2012. 18(6): 980-7)。此外，这些部分本质上具有快速的血清清除率，因为它们缺乏循环机制。

需要适合于跨不同TCR通用并具有良好表达和/或组装水平的TCR稳定工程改造。

本文提供了在TCR恒定结构域(Cα/Cβ结构域)中包含一个或多个稳定突变的蛋白，其增加TCR恒定结构域的解折叠温度并改善TCR的表达和/或组装。本文提供了蛋白，其包含：第一多肽，其包含T细胞受体(TCR)α恒定结构域(Cα)，其包含以下残基中的至少一个：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；或第二多肽，其包含TCRβ恒定结构域(Cβ)，其包含以下残基中的至少一个：位置134处的赖氨酸、位置139处的精氨酸、位置155处的脯氨酸、位置170处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)。

本文使用的TCR Cα和Cβ结构域中氨基酸残基的编号遵循Kabat编号系统(Kabat,等人 Sequences of Immunological Interest Vol. 1 第五版 1991 US Department ofHealth and Human Services, Public Health Service, NIH)，如图2中所举例说明。上述基于Kabat编号的TCR Cα残基对应于SEQ ID NO:5或6(Cα)中的以下残基：Kabat编号的位置139对应于SEQ ID NO:5或6的位置22；Kabat编号的位置150对应于SEQ ID NO:5或6的位置33；Kabat编号的位置190对应于SEQ ID NO:5或6的位置73。上述基于Kabat编号的TCR Cβ残基对应于SEQ ID NO:7或8(Cβ)中的以下残基：Kabat编号的位置134对应于SEQ ID NO:7或8的位置18；Kabat编号的位置139对应于SEQ ID NO:7或8的位置23；Kabat编号的位置155对应于SEQ ID NO:7或8的位置39；Kabat编号的位置170对应于SEQ ID NO:7或8的位置54。

在一个方面，本文提供了蛋白，其包含：第一多肽，其包含含有以下残基中的至少一个的TCR Cα：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；和/或第二多肽，其包含含有以下残基中的至少一个的TCR Cβ：位置134处的赖氨酸、位置139处的精氨酸、位置155处的脯氨酸、位置170处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)。

在另一个方面，本文提供了包含第一多肽和第二多肽的蛋白，其中所述第一多肽包含含有以下残基中的至少一个(例如，一个、两个或三个)的TCR Cα：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；和/或所述第二多肽包含含有以下残基中的至少一个(例如，一个、两个或三个)的TCR Cβ：位置134 处的赖氨酸、位置139处的精氨酸、位置155处的脯氨酸、位置170处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)。在一些实施方案中，所述蛋白包含以上列出的七个残基中的任何一个。在一些实施方案中，所述蛋白包含以上列出的七个残基中的任何两个。在一些实施方案中，所述蛋白包含以上列出的七个残基中的任何三个。在一些实施方案中，所述蛋白包含以上列出的七个残基中的任何四个。在一些实施方案中，所述蛋白包含以上列出的七个残基中的任何五个。在一些实施方案中，所述蛋白包含以上列出的七个残基中的任何六个。在一些实施方案中，所述蛋白包含以上列出的所有七个残基。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白是可溶性蛋白。在一些实施方案中，当与除了以下之外包含相同氨基酸序列的蛋白相比时，本文所述的蛋白具有一种或多种优异特性，例如更高的解折叠温度(Tm)、增加的稳定性、在相同条件下表达时增加的表达水平或降低的糖基化水平：包含位置139处的丝氨酸、位置150处的苏氨酸和位置190处的丙氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)的Cα结构域；和包含位置134处的谷氨酸、位置139处的组氨酸、位置155处的天冬氨酸和位置170处的丝氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)的Cβ结构域。

在一些实施方案中，所述第一多肽包含在位置139 (Kabat编号)处包含苯丙氨酸的Cα结构域。在一些实施方案中，所述第一多肽包含在位置190 (Kabat编号)处包含苏氨酸的Cα结构域。在一些实施方案中，所述第一多肽包含在位置150 (Kabat编号)处包含异亮氨酸的Cα结构域。在一些实施方案中，所述第二多肽包含在位置155 (Kabat编号)处包含脯氨酸的Cβ结构域。在一些实施方案中，所述第二多肽包含在位置170 (Kabat编号)处包含天冬氨酸或谷氨酸的Cβ结构域。在一些实施方案中，所述第二多肽包含在位置134 (Kabat编号)处包含赖氨酸的Cβ结构域。在一些实施方案中，所述第二多肽包含在位置139 (Kabat编号)处包含精氨酸的Cβ结构域。

在一些实施方案中，本文提供了包含第一多肽和第二多肽的蛋白，其中所述第一多肽包含含有以下残基的TCR Cα结构域：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；且所述第二多肽包含含有以下残基的TCR Cβ结构域：位置134处的赖氨酸、位置139处的精氨酸、位置155处的脯氨酸、位置170处的天冬氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)。

在一些实施方案中，本文提供了包含第一多肽和第二多肽的蛋白，其中所述第一多肽包含含有以下残基的TCR Cα结构域：位置139处的苯丙氨酸和位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；且所述第二多肽包含含有以下残基的TCR Cβ结构域：位置134处的赖氨酸、位置139处的精氨酸、位置155处的脯氨酸、位置170处的天冬氨酸(残基根据Kabat 编号进行编号)。

在一些实施方案中，所述TCR Cα结构域包含SEQ ID NO:5；且所述TCR Cβ结构域包含SEQ ID NO:7。因此，本文提供了蛋白，其包含：第一多肽，其包含含有SEQ ID NO:5的Cα结构域，和第二多肽，其包含含有SEQ ID NO:7的Cβ结构域。在一些实施方案中，所述Cα结构域由SEQ ID NO:5组成；且所述Cβ结构域由SEQ ID NO:7组成。因此，本文提供了蛋白，其包含：第一多肽，其包含由SEQ ID NO:5组成的Cα结构域，和第二多肽，其包含由SEQ ID NO:7组成的Cβ结构域。

在一些实施方案中，所述第一多肽通过一个或多个链间二硫键与所述第二多肽连接。二硫键可以由TCR α和β链中的工程改造的半胱氨酸残基对形成，并且此类二硫键将TCRα和β链连接在一起(参见WO03/020763、WO2004/033685、WO2004/074322，Li等人, Nat.Biotechnol. 2005, 23(3): 349-354；Boulter等人, Protein Eng. 2003, 16(9): 707-11)。例如，TCR α和β链中指定残基处的以下对的工程改造的半胱氨酸之间可以形成二硫键：Thr48Cys (α链)和Ser57Cys (β链)、Thr45Cys (α链)和Ser77Cys (β链)、Tyr10Cys (α链)和Ser17Cys (β链)、Thr45Cys (α链)和Asp59Cys (β链)以及Ser15Cys (α链)和Glu15Cys (β链)(参见WO03/020763)。

在一些实施方案中，所述Cα结构域进一步包含在位置166处的半胱氨酸残基(残基根据Kabat编号进行编号)，且所述Cβ结构域进一步包含在位置173处的半胱氨酸残基(残基根据Kabat编号进行编号)，其中所述第一多肽和所述第二多肽通过Cα的位置166处的半胱氨酸残基和Cβ的位置173处的半胱氨酸残基之间的链间二硫键连接。

在一些实施方案中，所述TCR Cα结构域包含SEQ ID NO:6；且所述TCR Cβ结构域包含SEQ ID NO:8。因此，本文提供了蛋白，其包含：第一多肽，其包含含有SEQ ID NO:6的Cα结构域，和第二多肽，其包含含有SEQ ID NO:8的Cβ结构域。在一些实施方案中，所述Cα结构域由SEQ ID NO:6组成；且所述Cβ结构域由SEQ ID NO:8组成。因此，本文提供了蛋白，其包含：第一多肽，其包含由SEQ ID NO:6组成的Cα结构域，和第二多肽，其包含由SEQ ID NO:8组成的Cβ结构域。

在一些实施方案中，所述第一多肽进一步包含TCRα链可变结构域(Vα)；且所述第二多肽进一步包含TCRβ链可变结构域(Vβ)，其中Vα和Vβ形成结合抗原(例如肿瘤抗原或病毒抗原)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，Vα融合至Cα的N-末端，形成Vα-Cα结构域；且Vβ融合至Cβ的N-末端，形成Vβ-Cβ结构域。

TCR可变区(Vα/Vβ)可以结合任何肿瘤或病毒抗原，包括但不限于病毒抗原、新抗原(仅在癌细胞中表达但在正常细胞中不表达的抗原)、肿瘤相关抗原(在正常细胞中低水平表达但在癌细胞中过表达的蛋白的加工片段)或癌症/睾丸(CT)抗原(源自通常仅由生殖组织(例如睾丸、胎儿卵巢和胎盘)表达并且在所有其他成人组织中表达有限/没有表达的蛋白)(参见Pritchard等人, BioDrugs, 2018, 32:99–109)。

在一些实施方案中，所述TCR可变区(Vα/Vβ)结合选自以下中的任一种的抗原：ERBB2、CD19、NY-ESO-1、MAGE (例如，MAGE-A1、A2、A3、A4、A6、A10、A12)、gp100、MART-1/Melan-A、gp75/TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、BAGE、CAMEL、SSX-2、β-连环蛋白、胱天蛋白酶-8、CDK4、MUM-2 (TRAPPC1)、MUM-3、MART-2、OS-9、p14ARF (CDKN2A)、GAS7、GAPDH、SIRT2、GPNMB、SNRP116、RBAF600、SNRPD1、PRDX5、CLPP、PPP1R3B、EF2 (参见Pritchard, 等人,BioDrugs, 2018, 32:99–109; 和Wang, 等人, Cell Research, 2017, 27:11-37)。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白进一步包含第二抗原结合结构域。这种第二抗原结合结构域可以结合T细胞表面上的抗原，例如CD3、CD4、CD8。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域结合CD3。

在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域是抗体或抗体片段，例如，scFv、Fab、Fab'、(Fab')₂、单结构域抗体或骆驼科VHH结构域。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域是Fab。在一些实施方案中，所述Fab包含Fab重链和Fab轻链，所述Fab重链包含重链可变结构域(VH)和人IgG CH1结构域，所述Fab轻链包含轻链可变结构域(VL)和人轻链恒定结构域(CL)，其中所述VH和VL结构域形成第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域结合T细胞表面上的抗原，例如CD3、CD4、CD8。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含三个多肽：包含Vα-Cα-接头-VH-CH1的第一多肽；包含Vβ-Cβ的第二多肽；和包含VL-CL的第三多肽；其中所述第二和第三多肽通过链间二硫键与所述第一多肽连接。在一些实施方案中，本文所述的蛋白具有TCR-CD3 Fab形式。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含四个多肽：包含Vα-Cα-铰链-第一Fc区的第一多肽；包含Vβ-Cβ的第二多肽；包含VL-CL的第三多肽；和包含VH-CH1-铰链-第二Fc区的第四多肽；其中所述第二和第四多肽通过链间二硫键与所述第一多肽连接；且所述第三多肽通过链间二硫键与所述第四多肽连接。在一些实施方案中，本文所述的蛋白具有IgG样形式或TCR-CD3 Fab-Fc IgG形式。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含四个多肽：包含Vα-Cα-接头-VH-CH1-铰链-第一Fc区的第一多肽；包含Vβ-Cβ的第二多肽；包含VL-CL的第三多肽；包含第二Fc区的第四多肽；且其中所述第二、第三和第四多肽通过链间二硫键与所述第一多肽连接。在一些实施方案中，本文所述的蛋白具有TCR-CD3 Fab-Fc串联形式。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含结合人血清白蛋白(HSA)的VHH结构域。在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含三个多肽：包含Vα-Cα-接头- VH - CH1-VHH的第一多肽；包含Vβ-Cβ的第二多肽；和包含VL-CL的第三多肽；其中所述第二和第三多肽通过链间二硫键与所述第一多肽连接。在一些实施方案中，本文所述的蛋白具有TCR-CD3 Fab-VHH形式。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含两个TCR Vα-Cα结构域和两个TCR Vβ-Cβ结构域。在一些实施方案中，本文所述的蛋白具有2xTCR-CD3 Fab-Fc形式。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含接头，所述接头包含选自SEQ ID NO:41-46中任一个的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含Fc区，例如，人IgG Fc区，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是修饰的人IgG Fc区，其具有与对应的野生型人IgG Fc区相比降低的效应子功能。

在一些实施方案中，所述Fc区是修饰的人IgG1 Fc区。众所周知，IgG1结合Fc-γ受体家族(FcγR)的蛋白以及C1q。与这些受体的相互作用可以诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，将某些氨基酸取代引入人IgG1 Fc区以消除免疫效应子功能。在一些实施方案中，所述Fc区是修饰的人IgG1 Fc区，其包含以下突变中的一个或多个：N297A、N297Q、D265A、L234A、L235A、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、P238A、A327Q、A327G、P329A、K322A、L234F、L235E、P331S、T394D、A330L、M252Y、S254T、T256E (残基根据EU索引编号进行编号)。在一些实施方案中，所述Fc区是修饰的人IgG1 Fc区，其包含以下突变：L234A、L235A和N297Q (残基根据EU索引编号进行编号)。在一些实施方案中，所述Fc区是修饰的人IgG1 Fc区，其包含SEQ ID NO:48。在一些实施方案中，本文所述的蛋白进一步在修饰的人IgG1 Fc区的N-末端处包含人IgG1铰链区(例如，SEQ ID NO:47)。

在一些实施方案中，所述Fc区是修饰的人IgG4 Fc区，其包含以下突变中的一个或多个：E233P、F234V、F234A、L235A、G237A、E318A、S228P、L236E、S241P、L248E、T394D、M252Y、S254T、T256E、N297A、N297Q (残基根据EU索引编号进行编号)。在一些实施方案中，所述Fc区是修饰的人IgG4 Fc区，其包含以下突变：F234A和L235A (残基根据EU索引编号进行编号)。在一些实施方案中，所述Fc区是修饰的人IgG4 Fc区，其包含SEQ ID NO:50。在一些实施方案中，本文所述的蛋白进一步在修饰的人IgG4 Fc区的N-末端处包含含有S228P突变(根据EU索引编号，例如，SEQ ID NO:49)的修饰的人IgG4铰链区。此类修饰的人IgG4铰链区减少体内IgG4 Fab-臂交换(参见Labrijn等人, Nat Biotechnol 2009, 27(8):767)。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含含有SEQ ID NO:47或49的铰链区。在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含含有SEQ ID NO:48或50的Fc区。在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含含有SEQ ID NO:47的铰链区和含有SEQ ID NO:48的第一和第二Fc区。在一些实施方案中，本文所述的蛋白包含含有SEQ ID NO:49的铰链区和含有SEQ ID NO:50的第一和第二Fc区。

在一些实施方案中，所述第一和第二Fc区包含一组异二聚化突变，例如，一组CH2和/或CH3异二聚化突变。在一些实施方案中，所述第一和第二Fc区包含一组CH3异二聚化突变，例如，洞中结(knots-in-holes) (Ridgway, 等人, Protein Eng. 1996, 9:617-621)、静电突变和Verdino等人，Current Opinion in Chemical Engineering 2018, 19:107-123；WO2016118742；美国专利号9605084、9701759、10106624；美国专利申请公开号20180362668中描述的其他CH3二聚化突变。

在一些实施方案中，所述第一或第二Fc区之一包含CH3结构域，所述CH3结构域包含残基407处的丙氨酸；且所述第一或第二Fc区中的另一个包含CH3结构域，所述CH3结构域包含残基366处的缬氨酸或甲硫氨酸和残基409处的缬氨酸(残基根据EU索引编号进行编号)。在一些实施方案中，所述第一或第二Fc区之一包含CH3结构域，所述CH3结构域包含残基407处的丙氨酸、残基399处的甲硫氨酸和残基360处的天冬氨酸；且所述第一或第二Fc区中的另一个包含CH3结构域，所述CH3结构域包含残基366处的缬氨酸、残基409处的缬氨酸和残基345和347处的精氨酸(残基根据EU索引编号进行编号)。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白与可检测标记物连接。在一些实施方案中，这种可检测标记物可以是荧光标记物、放射性标记物、化学发光标记物、生物发光标记物、顺磁标记物、MRI造影剂、有机染料或量子点。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白与治疗剂(例如细胞毒性剂、抗炎剂或免疫刺激剂)连接。

在一些实施方案中，本文所述的蛋白是可溶性蛋白。在一些实施方案中，本文所述的蛋白是跨膜蛋白。

在一些实施方案中，所述蛋白的第一多肽进一步包含TCRα链的跨膜和细胞内结构域；且所述第二多肽进一步包含TCRβ链的跨膜结构域和胞内结构域。

本文还提供了包含TCR的T细胞，所述TCR包含：包含以下残基中的至少一个(例如，一个、两个或三个)的Cα结构域：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；和/或包含以下残基中的至少一个(例如，一个、两个、三个或四个)的Cβ结构域：位置134处的赖氨酸、位置139处的精氨酸、位置155处的脯氨酸、位置170处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)。这种TCR还可以包括抗原结合结构域，例如抗体片段或TCR Vα/Vβ结构域。

在另一个方面，本文提供了编码本文所述的蛋白的多肽的核酸。这种核酸可以编码包含TCR Cα结构域的多肽，所述TCR Cα结构域包含以下残基中的至少一个(例如，一个、两个或三个)：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)。这种核酸可以编码包含TCR Cβ结构域的多肽，所述TCR Cβ结构域包含以下残基中的至少一个(例如，一个、两个、三个或四个)：位置134处的赖氨酸、位置139处的精氨酸、位置155处的脯氨酸、位置170处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据 Kabat 编号进行编号)。在一些实施方案中，本文提供了编码包含SEQ ID NO:5或7的多肽的核酸。在一些实施方案中，本文提供了编码包含SEQ ID NO:6或8的多肽的核酸。

在另一个方面，本文提供了载体，其包含编码本文所述的蛋白的多肽的核酸。此类载体可以进一步包括与编码本文所述蛋白的多肽的核酸可操作连接的表达控制序列。能够直接表达与其可操作连接的基因的表达载体是本领域众所周知的。表达载体可以编码促进多肽从宿主细胞分泌的信号肽。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。所述表达载体通常作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物体中可复制。表达载体可以含有选择标记，例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶，以允许检测用期望DNA序列转化的那些细胞。含有目标多核苷酸序列的载体可以通过众所周知的方法(例如，稳定或瞬时转染、转化、转导或感染)转移至宿主细胞中，所述方法取决于细胞宿主的类型而变化。在一些实施方案中，本文提供了载体，其包含编码包含SEQ ID NO:5的多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:6的多肽的核酸。在一些实施方案中，本文提供了载体，其包含编码包含SEQID NO:7的多肽的核酸和编码包含SEQ ID NO:8的多肽的核酸。

本文还提供了宿主细胞，例如哺乳动物细胞，其包含本文所述的核酸或载体；此类宿主细胞可以表达本文所述的蛋白。已知能够表达功能蛋白的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞、HEK293细胞、COS细胞和NSO细胞。本公开进一步提供了通过在使得所述蛋白表达的条件下培养上述宿主细胞和回收表达的蛋白来产生本文所述的蛋白的方法。

在另一个方面，本文提供了药物组合物，其包含本文所述的蛋白、核酸、载体或细胞。此类药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一个方面，本文提供了通过向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的蛋白、核酸、载体、细胞或药物组合物来治疗所述受试者中的癌症或感染的方法。

还提供了本文所述的蛋白、核酸、载体、细胞和药物组合物，其用于疗法中。此外，本公开还提供了本文所述的蛋白、核酸、载体、细胞或药物组合物，其用于癌症或感染的治疗中。此外，本公开提供了本文所述的蛋白、核酸、载体、细胞或药物组合物在制备用于治疗癌症或感染的药物中的用途。

如本文所用，在本发明的上下文中(特别是权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”和“该/所述(the)”和类似术语应被解释为包括单数和复数两者，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。

如本文所用的术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的单克隆免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。所述重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VH中的CDR区被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。VL中的CDR区域被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。将残基分配给各种CDR可以通过算法诸如Kabat、Chothia或North完成。Kabat CDR定义(Kabat等人，“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))基于抗体序列变异性。Chothia CDR定义(Chothia等人，“Canonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology, 196, 901-917(1987)；Al Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structuresof immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑结构。North CDR定义(North等人，“A New Clustering ofAntibody CDR Loop Conformations”，Journal of Molecular Biology, 406, 228-256(2011))基于使用大量晶体结构的亲和传播聚类。

术语“抗原结合结构域”或“抗体片段”是指保留与抗原表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力的抗体部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫化物连接的Fv (sdFv)、由VH和CHl结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体诸如sdAb (VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体，诸如包含在铰链区通过二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段，以及分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。

如本文所用的术语“结合”意指蛋白或分子与另一个蛋白或分子形成一类化学键或有吸引力的相互作用的能力，这导致两个蛋白或分子紧密接近，如通过本领域已知的常用方法所确定。

如本文所用的术语“Fc区”是指包含免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的恒定区的CH2和CH3结构域的多肽。任选地，所述Fc区可以包括免疫球蛋白(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的铰链区的一部分或整个铰链区。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG Fc区，例如人IgG1 Fc区、IgG2 Fc区、IgG3 Fc区或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是修饰的IgG Fc区，其与相应的野生型IgG Fc区相比具有降低的效应子功能。所述Fc区中的残基编号基于如Kabat中的EU索引。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and HumanServices, Public Health Service, National Institutes of Health (1991)。免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，并且人IgG重链Fc区通常定义为从位置231处的氨基酸残基(根据EU索引)至免疫球蛋白的羧基末端的延伸段。

如本文所用的术语“多肽”是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于包含天然存在的氨基酸的聚合物和包含一个或多个非天然存在的氨基酸的聚合物。

如本文所用的术语“治疗有效量”是指本发明的蛋白或核酸或载体或细胞或组合物的量，其将引发受试者的生物学或医学应答，例如，降低或抑制酶或蛋白活性，或改善症状、减轻病况、减缓或延迟疾病进展或预防疾病等。在一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”是指本发明的蛋白或核酸或载体或细胞或组合物的量，当施用于受试者时，所述量有效地至少部分地减轻、抑制、预防和/或改善病况、或病症或疾病。

如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指所有过程，其中可能减缓、控制、延迟或停止本文公开的病症的进展，或改善疾病症状，但不一定表示所有病症症状的完全消除。治疗包括施用本发明的蛋白或核酸或载体或细胞或组合物以用于治疗患者、特别是人的疾病或病况。

附图的简要说明：

图1A-1D显示TCR片段和稳定突变的表征。图1A显示重组TCR(1G4_122，▲)、来自同一TCR的具有α42/β110工程改造的二硫化物(与dsFv中的VH44/VL100二硫化物同源)的Vα/Vβ片段(♦)和具有标准茎二硫化物和稳定α166/β173二硫化物的Cα/Cβ片段(●)的DSF变性曲线。图1B是条形图，其显示‘野生型’(WT) Cα/Cβ亚基和具有指示的单个稳定突变的Cα/Cβ亚基的热解折叠的中点(T_m)。图1C显示野生型Cα/Cβ(●)和具有4个(♦)或7个(■)稳定突变的Cα/Cβ的DSF曲线。图1D显示野生型Cα/Cβ(左泳道)和具有4个(中泳道)或7个(左泳道)稳定突变的Cα/Cβ的SDS-PAGE表征。

图2显示基于两个不同TCR的TCR Cβ和Cα结构域的Kabat编号系统。上面的Cβ和Cα序列源自Kabat, 等人, (Sequences of Immunological Interest Vol. 1 第五版 1991US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH, 第1004和1005页)中的第一种人T-淋巴细胞受体人HPB-MLT序列(人HPB-MLT Cβ，SEQ ID NO:51；人HPB-MLT Cα，SEQ ID NO:52)；并且底部的1G4_122_NYESO1 Cβ和Cα序列(1G4_122_NYESO1 Cβ，SEQ ID NO:4；1G4_122_NYESO1 Cα，SEQ ID NO:3)源自2F53 pdb晶体结构(Dunn等人, Protein Sci 2006. 15: 710-21)。方框指示2F53和HPB-MLT天然序列的恒定结构域之间的差异。2F53序列中的Cβ_S173C和Cα_T166S是形成稳定二硫键的半胱氨酸(Boulter等人, Protein Eng. 2003. 16: 707-11)。比对下方的阴影残基是此处描述的显著稳定Cα/Cβ亚基的稳定突变和携带稳定Cα/Cβ亚基的不同全长TCR。

图3A显示涉及极性氨基酸的突变的结构表征。每行的特征在于单个突变。第一(左)列的特征在于Cα/Cβ骨架结构的放大示意性带状图，以及被突变的原始残基的棒状描绘，其与携带稳定突变的模型的结构图叠加。第二(中间)列显示Cα/Cβ模型图内的稳定突变的叠加，其叠加在相同突变的晶体结构图上。第三列(右)突出使其稳定的该突变的特征。

图3B显示涉及疏水性氨基酸的突变的结构表征。每行的特征在于单个突变。第一(左)列的特征在于Cα/Cβ骨架结构的放大示意性带状图，以及被突变的原始残基的棒状描绘，其与携带稳定突变的模型的结构图叠加。第二(中间)列显示Cα/Cβ模型图内的稳定突变的叠加，其叠加在相同突变的晶体结构图上。第三列(右)突出使其稳定的该突变的特征。第一行的第三列显示脯氨酸的拉马钱德兰图，其覆盖在天冬氨酸的拉马钱德兰图上，其中Cβ155由黑框表示。该图显示Cβ D155天然采用脯氨酸偏好的骨架phi/psi二面角。以下两行的第三列显示突变与周围残基如何好地堆积，其中C⍺ T150I稍暗以使其更明显。

图3C显示7-突变体TCR的晶体结构与当Rosetta用于基于7-突变体Cα/Cβ结构的骨架坐标来预测氨基酸侧链的构象时的输出的比较。

图4A-4G显示有和没有稳定的Cα/Cβ亚基的四种不同的重组α/β TCR的表征。图4A显示在α166/β173稳定二硫化物不存在的情况下，具有零个(WT，虚线)或七个(实线)稳定Cα/Cβ突变的1G4_122TCR的DSC曲线。图4B显示全部在α166/β173二硫化物存在的情况下，具有零个(WT，虚线)或七个(实线)稳定突变的四种不同TCR的DSC曲线。图4C显示全部在α166/β173二硫化物存在的情况下，具有零个(WT，虚线)或七个(实线)稳定突变的四种不同TCR的非还原SDS-PAGE。图4D显示全部在α166/β173二硫化物存在的情况下，具有零个(WT，虚线)或七个(实线)稳定突变的四种不同TCR的分析SEC。图4E显示对氘交换的骨架保护的唯一重要区域在Cα中。每个肽区域下的热图表示在10秒、30秒、2分钟、10分钟、1小时和4小时时观察到的保护水平。缺少热图表明在该区域中观察到的氘交换没有显著差异。图4F显示来自野生型CE10 TCR(黑色方块)和稳定的CE10 TCR(灰色圆形)的肽的代表性氘摄取图。图4G显示含有Vα_N67 N-连接的糖基化位点的肽的提取离子色谱图。18.6 min的肽没有被糖基化，而19.9 min的峰出现在酶促去糖基化/转化为Asp之后。来自野生型TCR的肽是虚线，且来自稳定TCR的肽是实线。

图5A-5E显示有或没有稳定的Cα/Cβ亚基的1G4_122 TCR内的稳定和去稳定Vα/Vβ突变体的表征。图5A显示具有以淡紫色显示的各个Vα/Vβ突变的1G4_122 (pdb 2F53)的卡通描绘。在各种Vα/Vβ突变体组合存在的情况下，以及在稳定的Cα/Cβ亚基不存在(图5B)和存在(图5C)的情况下，1G4_122 TCR的DSF曲线。在稳定的Cα/Cβ亚基不存在(●)和存在(♦)的情况下，具有不同可变结构域突变的1G4_122 TCR的归一化表达水平(图5D)和最低Tm(图5E)。

图6A-6E显示IgG-样和串联-Fab样TCR/CD3蛋白的表征。图6A是TCR/CD3 IgG样和串联-Fab样双特异性分子的示意图。图6B显示TCR/CD3 IgG-样和串联-Fab样双特异性蛋白的非还原和还原SDS-PAGE。图6C显示使用野生型NY-ESO-1 TCR和稳定的NY-ESO-1 TCR的TCR/CD3 IgG-样BsAb以及仅使用稳定的NY-ESO-1的串联Fab BsAb的分析型SEC表征。图6D显示BsAb分子对用NY-ESO-1肽脉冲的Saos-2(顶部)和624.38(中) HLA-A2+肿瘤细胞和Jurkat(底部)CD3+细胞的流式细胞术细胞结合滴定。图6E显示用NY-ESO-1肽脉冲的Saos-2肿瘤细胞的T细胞重定向杀伤。

图7A-7B显示IgG-样TCR/CD3 BsAb的额外的TCR/CD3双功能物和小鼠药代动力学。图7A显示具有不同的亲和力或具有通过典型N-连接的糖基化位点突变而去糖基化的Cα的IgG-样TCR/CD3 BsAb的还原和非还原SDS-PAGE。图7B显示在Balb-c小鼠中单次5 mg/kg静脉内注射后在Cα中有或没有N-连接的糖基化的1G4_122/SP34 IgG-样BsAb的血清浓度。

实施例

重组TCR可用于重定向幼稚T细胞以消除病毒感染的细胞或癌细胞；然而，它们受到稳定性低和表达不均匀的困扰。分子建模用于鉴定TCR恒定结构域(Cα/Cβ亚基)中的突变，以改善Cα/Cβ稳定性，增加Cα/Cβ表达，并增加Cα/Cβ的解折叠温度。当将这些突变中的7个共同添加至Cα/Cβ亚基时，观察到热解折叠的中点增加20℃。添加稳定的Cα/Cβ亚基将四个分开的α/β TCR的表达和组装改善3至10倍。此外，所述突变挽救在可变结构域中具有不稳定突变的TCR的表达。有趣的是，TCR的稳定性和折叠改善导致糖基化减少。Cα/Cβ变体使得能够抗体样表达，允许开发一类新的双特异性分子，其将抗CD3抗体与稳定的TCR组合。这些TCR/CD3双特异性蛋白可以重定向T细胞以杀死表达HLA/肽抗原的肿瘤细胞。

Cα/Cβ亚基的总体稳定性可以改善α/β TCR的整体稳定性和折叠。近来的研究已经显示，α/β TCR的亚基之间存在强烈的热力学协同性。Cα需要与ER中的Cβ配对以进行折叠，类似于对于抗体C_H1/Cκ亚基所观察到的(Feige, 等人, Mol Cell, 2009. 34(5): 569-79; Toughiri, 等人, MAbs, 2016. 8(7): 1276-1285)。此外，在分离中的许多Vα/Vβ亚基本质上是解折叠的，并且需要Cα/Cβ亚基进行正确折叠(Feige, M.J., 等人, J BiolChem, 2015. 290(44): p. 26821-31)。为了支持该假设，已显示在Cα/Cβ结构域之间添加二硫化物对许多α/β TCR具有积极影响(Boulter, J.M., 等人, Protein Eng, 2003. 16(9): p. 707-11)。因此，更稳健的Cα/Cβ亚基被工程改造用于一般的TCR稳定化，目标是以抗体样水平生成正确组装的TCR。稳定的TCR应该是更易于与不同几何形状的抗体重组融合的构建块，包括包含抗体-Fc部分以增强其药代动力学特性的那些。

用分子建模软件Rosetta进行蛋白模拟以鉴定稳定Cα和Cβ结构域的突变(Leaver-Fay等人，Methods Enzymol, 2011. 487: 545-74)。用于寻找将稳定蛋白的突变的一种替代策略是收集蛋白家族的多序列比对(MSA)，并搜索在目标蛋白中不保守的高度保守的氨基酸(Magliery等人，Curr Opin Struct Biol, 2015. 33: 161-8)。在这里，基于Rosetta计算测试突变，并使用保守分析来过滤来自模拟的结果。

结果

稳定Cα/Cβ TCR亚基

首先，通过生成可溶形式的α/β TCR 1G4_122及其Vα/Vβ和Cα/Cβ亚基来检查α/βTCR的热力学特性；1G4_122结合NY-ESO-1抗原(Li, Y., 等人，Nat Biotechnol, 2005. 23(3): 349-54)。使用哺乳动物表达系统，在将Vα连接至Vβ或将Cα连接至Cβ的柔性(Gly4Ser)4接头(SEQ ID NO:43)存在或不存在的情况下，生成Vα/Vβ和Cα/Cβ亚基两者。在有或没有稳定性结构域间二硫化物的情况下测试亚基表达和组装。大多数Vα/Vβ和Cα/Cβ构建体或者无法表达，或者无法组装，包括单链变体。通过添加与用于稳定抗体可变结构域片段或Fv的V_H44/V_L100二硫化物同源的Vα44/Vβ110二硫化物获得了最佳Vα/Vβ亚基表达(Brinkmann等人，Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(16): 7538-42)，而使用结构域的C-末端处的天然Cα/Cβ二硫化物(Cα213/Cβ247)的顶部上的已知的稳定二硫化物(Cα166/Cβ173)获得最佳Cα/Cβ表达(Boulter等人，Protein Eng, 2003. 16(9): 707-11)。差示扫描量热法(DSC)实验显示(Cα166/Cβ173)二硫化物将全长TCR(两个亚基)的热解折叠中点(T_m)增加8℃。当将Vα/Vβ和Cα/Cβ亚基解折叠与完整细胞外TCR结构域的解折叠进行比较时，单个亚基在彼此不存在的情况下显然都不稳定(图1A)，与先前观察到的热力学协同性一致(Feige, 等人, JBiol Chem, 2015. 290(44): 26821-31)。

分子建模模拟也用于鉴定稳定恒定结构域的突变。对于每次模拟，TCR都固定在空间中，并且仅允许密切靠近突变的残基进行小运动(“松弛”)以容纳突变。使用没有任何突变的天然序列重复这些局部松弛。通过比较突变的Rosetta评分与天然序列的Rosetta评分来确定能量的变化。突变分为两个列表：在TCR的多序列比对(MSA)中观察到的突变列表和MSA中不存在的突变列表。挑选来自两个列表的具有最佳预测能量的突变用于实验筛选。

使用含有Cα166/Cβ173二硫键的分离的Cα/Cβ片段(图1A)，生成单一、计算选择的突变体文库，并在两个分开的块中表达。在不知情的情况下使用增加的表达水平来选择用于放大、纯化和通过差示扫描荧光法(DSF，表1)表征的突变体。增加的表达与蛋白稳定性密切相关。基于表达选择用于进一步评估的单一突变体中大约一半展示相比于野生型(天然)Cα/Cβ蛋白的稳定性的显著增加(表1)。鉴定的稳定突变体中的七种的T_m显示于图1B中，并且相比于野生型Cα/Cβ，范围为+1至+7℃。这些突变中的五个是在TCR的多序列比对中观察到的取代，但在多序列比对中没有观察到T_m产生最大增益的两个突变，D155P(+7.1℃)和S139F(+4.4℃)。

接下来，将稳定突变组合到携带所述突变中的四个的变体和具有所有七个突变的变体中。建模结果表明，每个突变都可能与彼此相容(即不太可能相互干扰)。与仅携带Cα166/Cβ173二硫化物的Cα/Cβ亚基(表示为“野生型”)相比，包括所有七个稳定突变导致表达增加7倍和T_m增加20℃ (表2，图1C)。在非还原性SDS-PAGE凝胶上探测野生型和突变型Cα/Cβ亚基的组装。具有七个突变的Cα/Cβ变体组装更有效，如通过缺乏二硫化物梯形所证明，并且更小/更紧凑，可能是由于经由维持更离散折叠和紧凑的结构导致虚假糖基化更少(下文详细描述)(图1D)。甚至对于稳定的变体，SDS-PAGE凝胶上的多个条带(图1D)是清楚的，这可能反映Cα中的三个N-连接糖基化位点和Cβ中的单个N-连接糖基化位点的部分聚糖占据。

根据Kabat表示法(Kabat等人，Sequences of Immunological Interest Vol. 1第五版 1991 US Department of Health and Human Services, Public HealthService, NIH)对每个突变的确切位置连同其正确编号的一级序列描述显示于图2中。

表1.通过建模推导的具有各个突变的Cα/Cβ亚基的表达

突变 (NY-ESO-1肽编号)	突变(Kabat编号)	滴度(mg/L)	滴度比率 (变体/匹配的WT)	DSF T<sub>m</sub>(°C)	Rosetta 预测dE (REU)	在MSA中存在	区域
								Cα/Cβ野生型		12.8	1.00	54.9
βP173A	βP178A	10.4	0.81		-1.61	+	核心
								βE129K	βE134K	14.1	1.10	57.5	-2.34	+	表面
αR126K	αR129K	17.5	1.37	53.1	-0.81	+	界面
								αV122L	αV125L	12.4	0.97		-1.17	+	表面
βA123D	βA128D	10.4	0.81		-1.50	+	界面
								βK115S	βK120S	13.8	1.08	53.7	-1.56	+	表面
αD183S	αD188S	16.1	1.26	53.3	0.66	+	表面
								αV176L	αV181L	11.3	0.88		-2.10	+	界面
αT145I	αT150I	13.6	1.06	55.7	-1.66	+	表面
								βH134R	βH139R	15	1.17	57.1	-3.11	+	界面
βQ199H	βQ204H	11.5	0.90		-3.11	+	界面
								βN116K	βN121K	5.31	0.41		-1.16	+	表面
βE121T	βE126T	10.8	0.84		-1.30	+	界面
								αD154E	αD159E	12.2	0.95		-0.25	+	表面
αA185T	αA190T	14.6	1.14	57.5	-1.87	+	表面
								αI157A	αI162A	8.61	0.67		3.61	-	核心
βL154A	βL159A	7.91	0.62		0.98	-	核心
								βL143A	βL148A	1.72	0.13		1.74	+	界面
Cα/Cβ野生型		21.3	1.00	53.3
								αQ116K	αQ119K	34.2	1.61		-2.95	+	表面
αR126F	αR129F	8.13	0.38		-3.45	-	界面
								αK129R	αK134R	30.9	1.45		-3.93	+	界面
αS130G	αS135G	8.64	0.41		-5.85	-	表面
								αS131G	αS136G	35.7	1.68	52.7	-2.71	+	表面
αS134F	αS139F	35.7	1.68	58.5	-4.50	-	表面
								αS134G	αS139G	28.38	1.33		0.92	-	表面
αS134Y	αS139Y	22.95	1.08		-4.21	-	表面
								αS143D	αS148D	24.54	1.15		-4.19	-	表面
αT145Q	αT150Q	22.74	1.07		-4.13	-	表面
								αK151V	αK156V	23.7	1.11		0.05	+	表面
αK151A	αK156A	59.1	2.77	54.3	-2.76	+	表面
								αK151D	αK156D	26.55	1.25		-4.01	-	表面
αK151N	αK156N	42	1.97	53.9	-3.57	-	表面
								αK151S	αK156S	26.85	1.26		-3.49	+	表面
αS167Y	αS172Y	4.62	0.21		-4.05	-	表面
								αK171Y	αK176Y	4.71	0.22		-4.18	-	表面
αN173Y	αN178Y	21.27	1.00		-3.13	+	核心
								αN191Y	αN196Y	11.88	0.56		-3.86	-	表面
βL114Y	βL119Y	28.86	1.35		-3.83	-	核心
								βA123T	βA128T	39	1.83	53.9	-2.78	+	界面
βA123V	βA128V	30.3	1.42		-2.99	+	界面
								βT135K	βT140K	6.48	0.30		-2.76	+	界面
βQ136G	βQ141G	4.65	0.22		-3.26	+	表面
								βK137L	βK142L	26.19	1.23		-4.52	-	界面
βD150P	βD155P	47.4	2.23	61.2	-3.72	-	界面/核心
								βV158I	βV163I	27.72	1.30		-4.00	-	表面
βS165D	βS170D	58.8	2.76	58.5	-2.84	+	界面
								βS165E	βS170E	37.8	1.77	57.5	-4.12	-	界面
βD170Q	βD175Q	26.37	1.23		-3.92	+	界面
								βA179W	βQ184W	18.57	0.87		-3.49	-	表面
βA179Y	βQ184Y	4.8	0.23		-3.44	-	表面
								βS194H	βS199H	26.01	1.22		-3.69	-	表面
βK137T	βK142T	20.85	0.98		-4.06	+	界面

^a所有CαCβ片段都含有αT166C/βS173C二硫化物。

最后，评价所述突变对TCR蛋白的潜在免疫原性的影响。EpiVax服务器用于研究任何增加的MHC-肽复合物是否对于所述突变中的每一种都是可能的(De Groot, 等人, ClinImmunol, 2009. 131(2): 189-201)。总体而言，对于Cα和Cβ两者观察到EpiMatrix评分的略微增加。在观察到增加的情况下，这些往往是基线评分的轻微增加，其没有达到如Epibars所述的预测引发显著MHC结合的水平。在天然序列中观察到Epibars的情况下，存在评分的一些细微增加，但很少导致Epibars移入更高的风险类别。一个值得关注的异常值包括Cα_T150I变体，其EpiMatrix评分在一种9-聚体中显著上升，并且在野生型Cα蛋白的第二肽中存在强大的现有EpiMatrix簇，这对于所述突变体也存在。识别野生型肽的TCR可以在免疫发育和耐受期间被消除。该突变对稳定性提供最小的贡献。Cβ_E134K_H139R突变体一起出现在多个单肽上，并且这两个残基的EpiMatrix评分略微增加。为这种双重突变体引入的Epibars主要在低风险类别中，没有增加至高风险类别。有趣的是，从T_m角度来看两种最有影响的突变体Cβ_D155P和Cβ_S170D变体，与野生型Cα/Cβ相比，降低了总体EpiMatrix评分。

表2. 野生型(WT) TCR和具有7个稳定突变(Des)的TCR的表达和热稳定性

^a除非另有说明，否则所有TCR都含有αT166C/βS173C二硫化物。

七种稳定Cα/Cβ突变的结构表征

接下来，进行结晶Cα/Cβ亚基的野生型和稳定形式两者的尝试。所述蛋白被酶促去糖基化，然后结晶。与所述蛋白的SDS-PAGE凝胶结果一致(图1D)，只有稳定的版本产生蛋白晶体。获得稳定的Cα/Cβ亚基的1.76Å晶体结构。所有七种突变体的侧链的结构都得到解析，并提供了所述突变如何稳定蛋白的指示(图3A和图3B)。

在晶体结构和Rosetta模型中，苯丙氨酸139 (CαS139F)填充了结构中部分埋藏的裂缝，并与Cα129Q的侧链形成紧密的堆积相互作用。值得注意的是，相互作用的方向使谷氨酰胺上的极性基团开放以用于与水形成氢键。尽管被溶剂暴露，但Cβ D155P对七个突变的蛋白稳定性具有最大影响。Rosetta能量计算偏好脯氨酸，因为所述残基具有与脯氨酸的闭合环相容的骨架扭转角

。图3B显示天冬氨酸和脯氨酸两者的重叠拉马钱德兰图，并强调Cβ 155在两个氨基酸的允许区域内。然而，突变为脯氨酸的一个益处是脯氨酸在拉马钱德兰空间中比天冬氨酸更有限制性，且因此当蛋白折叠时失去更少的熵。异亮氨酸150 (CαT150I)与周围的残基紧密堆积，并且苏氨酸的除去没有留下任何没有氢键配偶体的埋藏极性基团。

CαA190T处于溶剂暴露环中的转角的开始处。除了增加表面上的溶解度以外，Rosetta预测这个苏氨酸会与Cα129Q形成稳定的氢键。相反，晶体结构显示苏氨酸采用不同的旋转异构体以与环的转角的另一端的骨架(Cα193N的骨架氮)形成氢键。Rosetta预测CβS170D将形成跨越与Cα171R的侧链的界面的双齿氢键。晶体结构显示Cβ S170D与Cα171R的骨架氮原子(其先前不参与氢键)的氢键合，并允许精氨酸的侧链变得更多地溶剂暴露。CβH139R与Cα124D产生跨界面的氢键。Rosetta模拟精氨酸和天冬氨酸以形成双齿氢键，然而晶体结构显示它们仅形成一个氢键，使得精氨酸可以更好地与相邻的残基堆积。β链上的残基134处的新赖氨酸(Cβ E134K)具有高b-因子，并且可能与附近的几个带负电荷的氨基酸相互作用。

实施调查以查看为什么Rosetta没有预测观察到的侧链构象。一种可能性是Rosetta中的侧链和骨架采样方案无法对这些构象进行采样。或者，Rosetta可能已经对它们进行采样，但预测它们的能量更高。为了测试这些假设，来自稳定突变体的晶体结构的骨架坐标被用作固定骨架侧链预测模拟的起点。新晶体结构中的骨架构象与野生型蛋白的晶体结构相似，但存在可能影响侧链定位和形成氢键能力的小偏差。鉴于晶体结构骨架Rosetta正确预测突变体的大部分侧链构象，这就是已经观察到的结果(图3C)。该结果表明，Rosetta没有正确地预测原始模型中这些突变的侧链构象，因为它没有采样或有利于晶体结构中观察到的小骨架扰动。

Cα/Cβ突变对全长TCR的影响

为了评估Cα/Cβ突变对无关、全长、可溶性TCR的表达和稳定性的影响，在有和没有新型Cα/Cβ突变的情况下生成1G4_122抗NY-ESO-1TCR。在没有二硫化物的情况下，1G4_122TCR在哺乳动物细胞中表达极差，但在具有Cα/Cβ突变的情况下，表达增加超过10倍，并且通过DSC测量的T_m高8℃ (表2，图4A)。还在四种无关(且序列多样)的α/β TCR (包括靶向MAGE_A3 (pdb 5BRZ；NCBI：α=ABY74337.1/β=ACZ48691.1、HIV(pdb 3VXT；NCBI：α=ABB89050.1/β=ACY74607.1)和WT-1抗原(Raman, 等人, Sci Rep, 2016. 6: 18851;Shimizu, 等人, Sci Rep, 2013. 3: 3097; Richman, S.A., 等人, Mol Immunol,2009. 46(5): 902-16)的额外TCR)中存在CαT166C/CβS173C二硫化物的情况下，评估稳定Cα/Cβ突变。甚至CαT166C/CβS173C二硫化物存在的情况下，在稳定的Cα/Cβ亚基存在的情况下，每种TCR经历滴度的大致3倍增加和通过DSC的热稳定性增加(表2，图4B)。有趣的是，所有四种TCR更紧凑，如通过SDS-PAGE分析和分析型大小排阻色谱法(SEC，图4C-4D)所评价。

为了进一步研究TCR在Cα/Cβ突变存在的情况下更紧凑的性质，使用肽质量作图，用有和没有稳定Cα/Cβ突变的WT-1 TCR (CE10)进行氢氘交换(HDX)分析和聚糖占有率研究。除了Cα链的重要区域以外，有和没有Cα/Cβ突变的CE10 TCR的HDX模式几乎相同(图4E)。稳定后存在Cα结构域的情况下的HDX保护不局限于突变位点，而是更广泛地局限于Cα折叠的各个区域，包括在C-末端的一些保护。还针对在酶促N-连接和O-连接的去糖基化之前和之后N-连接的聚糖的存在/占据，评估野生型和稳定的CE10 TCR。Vα结构域中存在单个N-连接的糖基化基序，三个在Cα结构域中且一个在Cβ结构域中。Cα/Cβ稳定导致CE10 TCR内、包括Vα内的N-连接的糖基化的显著减少，表明稳定的Cα/Cβ突变也稳定Vα/Vβ结构域(表3，图4F)。O-连接的糖基化在Cα的C-末端处是可能的，因为在缺乏稳定突变的TCR中无法解析C-末端肽。该问题在Cα/Cβ突变存在的情况下被消除，其中具有良好解析的C-末端肽。Cα C-末端区域可变地存在于不同的TCR晶体结构中，并且在所使用的NY-ESO-1结构中不存在。有趣的是，Cβ H139R突变形成电荷-电荷相互作用以及可能稳定/锁定Cα C-末端构象的潜在π-堆叠相互作用，其也显示增强保护免于HDX。因此，通过SDS-PAGE和SEC对于所有稳定TCR观察到的的流体动力学半径的普遍减小被证实为糖基化的减少。

接下来，评价Cα/Cβ突变使得TCR能够承受可变结构域突变的能力。使用Rosetta，选择在Vα和Vβ结构域两者中的有限数量的突变。最终，在野生型1G4_122抗NY-ESO-1 TCR中，一个(βN66E)是稳定的，多个突变是中性的，且一个是显著不稳定的(βS49A)(图5A)。将Vα和Vβ突变组合，并且在Cα/Cβ稳定突变不存在和存在的情况下表达该小型TCR变体文库。在Cα/Cβ突变不存在的情况下，对于1G4_122 TCR，通过DSF观察到宽范围的T_m，而当存在Cα/Cβ突变时，1G4_122变体的稳定性几乎是恒定的(图5B-5C)。如用上述TCR所观察到的，在Cα/Cβ突变存在的情况下，整个1G4_122变体文库实现了滴度的大致3倍增加(图5D)。有趣的是，1G4_122变体的T_m范围为49–65℃，而Cα/Cβ稳定文库都具有在62℃附近紧密聚集的T_m(图5E)，并且不受可变结构域不稳定性的影响。这些结果表明Cα/Cβ突变可以挽救具有低内在稳定性的TCR的表达和稳定性。

表3. 在稳定Cα/Cβ突变不存在和存在的情况下CE10 TCR的聚糖占有率

N-连接的糖基化位点	野生型CE10 TCR的%聚糖占有率	Cα/Cβ稳定的CE10 TCR的%聚糖占有率
			Vα_N67	78	30
Cα_N151	70	20
			Cα_N185	65	5
Cα_N196	n.d.<sup>a</sup>	80
			Cβ_N186	60	25

^a无法解析肽。CαT204处可能的O-连接的糖基化阻碍肽解析。

Cα/Cβ突变在产生良好组装的可溶性TCR/CD3双特异性体，以用于将T细胞重定向至靶肿瘤细胞中的效用

稳定α/βTCR的一个主要益处是可以实现的双特异性体的新型形式。第一代TCR双特异性体以ImmTac形式组合可溶性α/β TCR的特异性与抗CD3 scFv (Liddy等人, NatMed, 2012. 18(6): 980-7)。这种形式使得实现精细的重定向裂解功效；然而，这种形式的低产率细菌表达和重折叠以及快速血清清除使得体内给药有挑战性。随着由Cα/Cβ突变提供的哺乳动物细胞中α/β TCR的表达和正确折叠的显著增加，应当可得到新的双特异性形式，其包括具有增强的药代动力学(PK)以及对肿瘤细胞的亲合力的部分。

生成IgG-样和串联Fab-样双特异性抗体(BsAbs)(图6A)。BsAbs利用结合HLA-A2/NY-ESO-1肽复合物的1G4_122 α/β TCR并被工程改造为以高亲和力(1 nM)结合(Li,Y., 等人, Nat Biotechnol, 2005. 23(3): 349-54)。IgG-样形式需要表达两条重链，这需要一组抗体Fc异二聚化突变来实现正确的重链组装。选择先前发表的7.8.60异二聚体突变(Leaver-Fay, 等人, Structure, 2016. 24(4): 641-651)。表达有或没有Cα/Cβ突变的TCR/CD3 IgG-样BsAb。如用可溶性TCR所观察到，含有稳定Cα/Cβ突变的TCR/CD3 IgG-样BsAb的表达比缺乏Cα/Cβ突变的构建体高超过2倍。还发现缺乏稳定突变的IgG-样BsAb蛋白是TCR/CD3 BsAb和抗CD3半抗体的混合物。在IgG-Fc亲和纯化后，通过分析型SEC可观察到作为低分子量(LMW)峰的抗CD3半抗体(图6B-6C)。基于它们在单个亲和色谱步骤后的概况，具有稳定Cα/Cβ突变的IgG-样BsAb和串联Fab-样BsAb被分泌为直接来自细胞培养物的>90%单分散(即纯)蛋白(图6B-6C)。

接下来，在小鼠中评估TCR/CD3 IgG-样BsAb的药代动力学(PK)特性(未测试串联Fab-样BsAb)。残留的糖基化可能通过结合去唾液酸聚糖受体导致TCR/CD3部分的全身(特别是肝脏)摄取(Sethuraman, 等人, Curr Opin Biotechnol, 2006. 17(4): 341-6;Lepenies, 等人, Adv Drug Deliv Rev, 2013. 65(9): 1271-81)。先前，含有非稳定Cα/Cβ的类似构建体表明显著的α-期清除，这可能是由于去唾液酸聚糖受体摄取(Wu，等人，MAbs, 2015. 7(2): p. 364-376)。由于此处描述的Cα/Cβ突变显著降低可溶性TCR上的糖基化水平，因此所述突变可能导致改善的PK特性。作为对照，生成第二种IgG BsAb，其在如先前所述突变的Cα结构域内具有N-连接的糖基化位点(Wu, 等人, MAbs, 2015. 7(2): p.364-76)。有趣的是，当N-连接的糖基化位点在非稳定Cα/Cβ亚基内被消除时，表达降低超过一个数量级(Wu, 等人, MAbs, 2015. 7(2): p. 364-76)。稳定的Cα/Cβ构建体中的N-连接的糖基化位点的敲除对表达没有影响(图7A)。通过静脉内注射至BALB/c小鼠中来评估稳定的和稳定/去糖基的TCR/CD3 IgG-样BsAb的PK (图7B)。IgG-样BsAb在Balb-c小鼠中表明接近相同的PK，其中β-半衰期为大致3-8天，这取决于拟合中包括的时间点。Fc-部分明显导致长的抗体-样血清半衰期，并且残留TCR糖基化的存在没有在任何大的程度上影响清除率。该PK比对于ImmTacs预期的好得多。在一周时间点，观察到TCR/CD3 IgG-样BsAb的分子浓度的非线性下降。浓度下降在第10天更显著，并且到14天，BsAb水平大大低于检测水平(图7B)。针对小鼠抗药物抗体(ADA)的存在检测血清，并且在7天时观察到低水平，其在10天和14天时显著增加，这可能解释了在7天时开始加速清除。早发ADA背后的原因不清楚。

接下来评估TCR/CD3 BsAb的功能。用Jurkat细胞进行流式细胞术以评价CD3结合，并且用624.38和Saos-2肿瘤细胞进行流式细胞术以评价HLA-A2/肽结合。IgG-样和串联Fab-样BsAb两者均能够结合CD3和HLA-A2/肽细胞抗原两者(图6D)。由于亲合力的丧失，与二价抗CD3抗体相比，两种BsAb均显示与Jurkat细胞的结合功效降低10至30倍。与IgG-样BsAb相比，串联Fab-样BsAb与两种分开的HLA-A2+肿瘤细胞的结合看起来稍好。鉴于对于IgG-样BsAb观察到的与肿瘤细胞的较弱结合，生成几种更高功效的TCR (Li, 等人，Nat.Biotechnol, 2005, 23(3): 349-54)版本的IgG BsAb以抵消功效损失(图7A)。通过流式细胞术，1G4_107TCR变体确实表明与1G4_122变体相比改善的与肿瘤细胞结合的功效(图6D)。

接下来，在未刺激的原代T细胞存在的情况下，将BsAb滴定至肽标记的肿瘤细胞上。对于IgG BsAb，在Saos-2细胞系上观察到弱的T细胞对于肿瘤细胞的重定向(图6E)。增加对HLA/肽复合物的功效没有改善弱活性(图6E)。串联Fab BsAb有效地重定向T细胞以杀死Saos-2细胞。

基于此处呈现的数据，新型Cα/Cβ突变将可能改善大多数重组TCR(包括具有低稳定性可变结构域的那些)的表达和稳定性。与在包涵体中产生、随后溶解、重折叠和纯化的传统细菌方法(Wilson, Curr Opin Struct Biol, 1997. 7(6): 839-48)相比，此处描述的完全组装/氧化的TCR的哺乳动物表达/分泌应当显著增加它们的生产便利性。稳定突变在有或没有稳定二硫键的情况下导致抗体-样表达水平(Boulter等人, Protein Eng.,2003. 16(9): p. 707-11) — 这是单独的二硫键没有提供的成就。这种增加的表达使得能够稳健产生各种TCR/抗体双功能分子。一种有趣的可能应用是在原代T细胞内转基因诱导的全长TCR内包括稳定突变。经由引入二硫键、α/β链的表达顺序或在跨膜区域引入疏水性，已经看到链缔合和表达的难度得到轻微改善(Jin等人, JCI Insight, 2018. 3(8);Scholten, 等人, Cell Oncol, 2010. 32(1-2): 43-56)。看看本文描述的Cα/Cβ突变是否普遍改善用于基于细胞的治疗方法的细胞表面TCR表达将是有趣的。

与其非稳定的对应物相比，稳定的TCR还展现降低的总体糖基化(可变结构域和恒定结构域二者)。糖基化可以自然地稳定和溶解许多不同的蛋白，包括抗体Fc，并且在特定情况下，抗体Fab部分(Zhou, J Pharm Sci, 2019. 108(4):1366-1377)。糖工程改造甚至已被用作稳定蛋白、降低其聚集/错误折叠的倾向或改善其溶解度的方法(Zhou, J PharmSci, 2019. 108(4):1366-1377)。显示Cα的糖基化的丧失显著降低含有Cα/Cβ亚基的IgG-样蛋白的表达(Wu等人, MAbs, 2015. 7(2): 364-76)。因此，令人惊讶地发现，对于整个TCR，稳定突变使每个位点的N-连接的糖基化显著降低大致50%。Cα的C-末端处假定的O-连接的糖基化在稳定形式中也不存在。据推测，稳定相互作用减少折叠中/折叠的蛋白内的这些位点的构象波动，减少酶修饰典型N-连接的基序和O-连接的位点的途径。这包括Vα内的N-连接的位点，提供了Cα/Cβ突变普遍稳定整个TCR的进一步证明。此外，经由突变完全消除Cα上的N-连接的聚糖对稳定构建体内的蛋白表达没有影响。

TCR/CD3 BsAb重定向T细胞以裂解肿瘤细胞的能力存在明显的几何限制。先前已对于双特异性抗体重定向证明此类限制(Bluemel, 等人, Cancer Immunol Immunother,2010. 59(8): 1197-209; Wu, 等人, MAbs, 2015. 7(2): 364-76; Li, 等人, CancerCell, 2017. 31(3): 383-395)。对于基于TCR的疗法没有显示类似的数据。考虑到含有相同可溶性TCR和抗CD3臂的IgG-样和串联Fab-样BsAb之间的总体活性和功效的显著差异，可溶性TCR和抗CD3 Fab亚基的灵活性和间距似乎对于实现高重定向裂解效力是重要的。已经提出许多关于抗原和/或双特异性构建体的大小以及它们适合免疫突触内的能力的讨论(Davis, 等人, Nat. Immunol, 2006, 7(8): 803-9)。然而，观察到，在T细胞不存在的情况下，IgG-样和串联Fab-样BsAb形式之间的与肿瘤细胞的结合的差异，这使大小/免疫突触解释复杂化。在这些BsAb的情况下，对每种细胞类型的个体结合特征可能发挥更大的作用。总体而言，稳定的Cα/Cβ突变所提供的显著优势不仅对基于可溶性TCR的疗法有价值，而且对改善细胞系统(包括使用TCR作为基于细胞的疗法的一部分的那些)中的重组α/β TCR表达也有价值。

材料和方法

分子生物学

NY-ESO-1 1G4_122可溶性TCR以及单个NY-ESO-1 Vα/Vβ和Cα/Cβ亚基最初使用gBlocks (Integrated DNA Technologies，IDT)生成并使用重组酶克隆(In-Fusion,Clontech)亚克隆至哺乳动物表达载体(Lonza)中。使用2F53晶体结构(Dunn, 等人,Protein Sci, 2006. 15(4): 710-21)和别处描述的CDR (Li, 等人, Nat Biotechnol,2005. 23(3): 349-54)得到1G4_122、107和113的序列。使用鼠κ轻链前导序列来驱动每种蛋白的分泌，并将8xHis标签重组添加至α链的N-末端。使用IDT优化的密码子算法得到DNA序列。

使用定点诱变方案创建单突变体文库。简而言之，该方案采用超螺旋双链DNA载体和两个含有期望突变的合成寡核苷酸引物(在IDT生成)。寡核苷酸引物(其各自与载体的相对链互补)在热循环期间通过DNA聚合酶(HotStar HiFidelity Kit，Qiagen)延伸，以生成全新的突变质粒。在温度循环后，用Dpn I酶处理产物以消除使用大肠杆菌(New EnglandBioLabs)制备的甲基化、非突变质粒。然后将每种新生成的突变质粒转化至Top 10大肠杆菌感受态细胞(Life Technologies)中。菌落被挑选、培养、小量制备(Qiagen)并验证序列。突变体组合通常作为gBlocks合成。

使用每个片段的重叠PCR和重组酶克隆来创建TCR/CD3构建体。嵌合SP-34抗CD3重链和轻链序列先前已发表(Wu等人, MAbs, 2015. 7(2): 364-76)。

蛋白表达和纯化

共转染α/β构建体以在24孔板(1 mL规模)或单个烧瓶(100-200 mL规模)中进行瞬时表达，如先前所述(Rajendra, 等人, Biotechnol Prog, 2017. 33(2): 469-477)。收获上清液用于纯化，如先前所述(Lewis, 等人, Nat Biotechnol, 2014. 32(2): 191-8;Froning, 等人, Protein Sci, 2017. 26(10): 2021-2038)。使用在Octet RED384系统上的Ni²⁺-NTA吸头(Pall Forte Bio)读取，对TCR和TCR片段的小规模表达进行定量。使用Ni²⁺固定树脂(cOmplete^TM His-Tag, Millipore Sigma)和AKTA Pure系统(GE Healthcare)纯化TCR/TCR片段His-标签蛋白。用至少5个柱体积的结合缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，0.5M NaCl)以1 mL/min (对于1mL柱)和5 mL/min (对于5mL柱)的流速进行柱平衡。在将CHO表达上清液通过柱以捕获his标记的TCR或TCR片段后，用10个柱体积的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、0.5M NaCl、250mM咪唑)洗脱TCR蛋白。随后，通过使蛋白通过制备型大小排阻柱(SRT-10C SEC300)，或使用具有10,000MW截止值的VIVASPIN 6浓缩器，经由针对pH 7.2-7.4的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)进行透析来除去咪唑。使用mAbSure树脂(GEHealthcare)和制备型大小排阻纯化含有IgG-Fc的蛋白。根据制造商(LifeTechnologies)，使用4-12% Bis Tris凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。用1 mM二硫苏糖醇(DTT)和1 mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)进行还原和烷基化。

差示扫描荧光法和量热法(DSF和DSC)

使用SYPRO Orange染料(Invitrogen, S6651)在Lightcycler 480II RT PCR机器(Roche)上监测蛋白解折叠。激发和发射滤光片分别设置为465 nm和580 nm。温度以1℃/s的速率从25℃升至95℃。将蛋白的储备溶液储存在运行缓冲液(1 X PBS pH 7.4)中。

最终测定条件为0.2 mg/mL蛋白和运行缓冲液中500倍Sypro稀释。实验通过如下进行：将蛋白稀释至0.4 mg/ml并将Sypro稀释250倍，然后将等份的稀释的蛋白和Sypro组合在96孔板中(最终体积：每孔30 μL)。在384多孔测定板(Roche, 04-729-749-001)上将样品分成6 μL，一式三份。

使用一阶导数方法，在LightCycler热偏移分析软件(Roche)上进行每种蛋白的热解折叠中点(T_m)测定。分析软件使原始荧光数据平滑，并通过确定荧光相对于温度的向上斜率最陡的温度(即解链曲线的一阶导数最大的温度)来收集T_m。

如先前所述收集和分析DSC数据(Dong, 等人, J Biol Chem, 2011. 286(6):4703-17)。

能量预测

使用具有PDB代码2F53的TCR晶体结构，其中除去A-C链，仅留下α和β链。使用Rosetta中的FastRelax方案松弛剩余的结构，并对每个残基的CA原子施加坐标约束(随着骨架原子偏离其起始位置而增加的能量罚分)(Conway, 等人, Protein Sci, 2014. 23(1): 47-55)。还使用FastRelax方案模拟所有可能的突变(除了突变为半胱氨酸)。FastRelax由两个子方案组成：(1)固定骨架旋转异构体取代(即侧链构象采样)和(2)骨架和侧链扭转角的全原子最小化。第一个子方案为每个残基位置生成旋转异构体文库，并在用户允许的位置随机采样旋转异构体。在多次重复该采样(数十万次)后，将最低能量的旋转异构体组合指定给蛋白。第二个子方案使用基于梯度的扭转角最小化来将结构松弛至其在Rosetta能量景观中的局部最小值。对于本研究使用能量函数REF2015 (Park, J ChemTheory Comput, 2016, 12(12): 6201-6212; O' Meara, 等人, J Chem Theory Comput,2015. 11(2): 609-22)。进行某些考虑以防止Rosetta能量预测中的噪声。对于FastRelax的第一个子方案，仅使用突变的10Å内的残基来采样替代侧链构象。将坐标约束添加至第二个子方案中的所有残基位置，以防止骨架与起始结构差异很大。在FastRelax完成后，进行最后一轮无坐标约束的全原子最小化；允许蛋白松弛至其局部的、不受约束的能量最小值。对于每个可能的突变运行十个独立的轨迹，并使用三个最低评分的轨迹的平均评分作为该突变的代表性评分。我们的Rosetta版本的版本标识符(git sha1)是在2017年6月4日发布的360d0b3a2bc3d9e08489bb9c292d85681bbc0cbd。

多序列比对

通过手工整理来自各种生物体的TCR序列的多序列比对(MSA)来评价39个CA序列和53个CB序列的列表。通过使用NCBI的非冗余蛋白序列数据库(数据库中的169,859,411个序列)将2F53结构的CA和CB链的序列传递至BLAST中，组装两个TCR相似序列的列表。两个列表都通过手动清除似乎不是TCR的任何序列。Rosetta认为稳定的突变列表分为两个列表：(1)MSA中存在的突变和(2)MSA中不存在的突变。从列表1选择30个突变，并且从列表2选择25个突变用于实验测试。选择决策主要由Rosetta评分做出，但为了增加多样性起见，除去一些候选物。通过将突变分成两个列表，如果已显示它们与任何T-细胞受体结构相容，则可以促进被Rosetta认为较低级别的突变。

建模Cα/Cβ突变体组合

在实验确定表现最佳的点突变后，运行Rosetta模拟以验证每个突变与每个其他突变相容。每个突变分别应用于预松弛的2F53结构并运行固定骨架侧链重新堆积。用每对突变进行相同的模拟，并确保该对的Rosetta能量与单个突变的能量总和没有什么不同。

蛋白结晶

使用沉滴蒸汽扩散法在8℃下使纯化的蛋白结晶。通过将一份15 mg/mL(10mMTris-HCl pH7.5和150 mM氯化钠)的蛋白溶液与一份含有23% PEG 4K、300 mM硫酸镁和10%甘油的储存溶液混合来获得晶体。液滴立即用从15% PEG 3350和100 mM甲酸镁生长的碎晶体接种。在一周内观察到单个板状晶体。将它们收集至一滴含有15%甘油的储存溶液中，并在液氮中快速冷冻。

X-射线数据收集和结构测定

在束线31-ID-D (LRL-CAT)上的高级光子源处的单晶上收集同步加速器X-射线衍射数据。所得数据使用autoPROC (Vonrhein等人，Acta Crystallogr D BiolCrystallogr, 2011. 67(Pt 4): 293-302)整合，并用SCALA (Evans, Acta CrystallogrD Biol Crystallogr, 2011. 67(Pt 4): 282-92)合并和缩放。使用先前解析的TCR-pMHC复合物(Protein Databank登录代码2F53)的TCR恒定结构域作为搜索模型，通过以Phaser的分子置换(McCoy等人，J Appl Crystallogr, 2007. 40 (Pt 4): 658-674)解析所述结构。用COOT (Emsley等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66 (Pt 4):486-501)和REFMAC5 (Murshudov等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011.67 (Pt 4): p. 355-67)进行几轮模型构建和细化，如在CCP4软件包(Winn等人，ActaCrystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67 (Pt 4): 235-42)中所实施。最终模型用MolProbity (Williams等人，Protein Sci, 2018. 27 (1): 293-315)进行验证。额外数据收集和细化细节可见于表4和表5中。

表4

数据收集
		空间群	C2
晶胞大小
		a, b, c (Å)	96.85, 59.85, 61.35
α, β, γ (°)	90, 110.2, 90
		分辨率(Å)	29.33–1.76 (1.86–1.76)*
R<sub>合并</sub>	0.057 (0.910)*
		I/σI	5.6 (0.8)*
完整性(%)	99.2 (99.1)*
		冗余度	3.8 (3.6)*

*括号中的值用于最高分辨率壳。

表5

细化
		反射数	30,717
R<sub>游离</sub>	0.230
		R<sub>工作</sub>	0.209
氨基酸数	217
		原子数
蛋白	1726
		配体/离子	3
水	175
		B-因素
蛋白	30.1
		配体/离子	29.5
水	37.4
		RMS偏差
键长(Å)	0.007
		键角(°)	1.242
拉马钱德兰图(%)
		有利值	99.5
允许值	0.5
		异常值	0.0

肽作图

野生型和稳定的CE10 TCR被变性、还原、半胱氨酸烷基化和消化以进行分析。简而言之，将100 μg TCR变体在6 M胍中变性，然后在37℃下用10 mM二硫苏糖醇还原30分钟。接下来，添加15 mM碘乙酰胺并使反应在黑暗中进行45分钟。然后使用旋转过滤器将每个样品缓冲液交换为10 mM TRIS，pH 7.5。将5 μg胰蛋白酶添加至还原/烷基化样品中，并在37℃下孵育4小时。胰蛋白酶化的样品被分成两等份。第一个样品通过添加1 µL PNGaseF(ProZyme)和5 uL 10x消化缓冲液进行去糖基化，并在室温下孵育过夜，而第二个样品不进行处理。

为了确定聚糖占有率，将PNGase F处理和未处理的胰蛋白酶消化物的等分试样注射至与Agilent 5210 QTOF质谱仪联用的Agilent 1290 UPLC上，以进行肽作图和质量比对。简而言之，将5 μg TCR消化物注入Waters 150mm x 2.1mm 1.7 µm C18 CSH UPLC柱上，并经30分钟从2% B(0.1%甲酸/乙腈)至35% B进行梯度分离。将洗脱肽注入质谱仪进行质量分析，其中扫描范围为200至2000 m/z，源温度为350℃，毛细管电压为4 kV，碎裂器为250V，毛细管出口为75 V，源气体为40 PSI，且锥形气体为12 PSI。肽质谱通过Mass Hunter/Bioconfirm 7.0软件与蛋白序列进行比对，其中质量准确度为5 ppm，导致超过90%的序列覆盖率。为了测量聚糖占有率，添加Asn的脱酰胺作为可变修饰，并通过提取离子色谱图(EIC)手动检查每个预测的聚糖，其中质量准确度为5 ppm。Asn与Asp的比率使用EIC计算并报告为百分比聚糖占有率：Asn未被占有且Asp被占有，因为酶促去糖基化将Asn转化为Asp。

与质谱偶联的氢/氘交换(HDX-MS)

HDX-MS实验在使用HDX技术的Waters nanoACQUITY系统(Wales等人, Anal Chem,2008. 80(17): 6815-20)(包括LEAP HDX机器人液体处理系统)上进行。氘交换实验通过在15℃下将55 μL含有0.1x PBS的D₂O缓冲液添加至5 μl的每种蛋白(浓度为25μM)中持续不同量的时间(0s、10s、1 min、10min、60min和240 min)来起始。在1℃下使用等体积的0.32 MTCEP、0.1 M磷酸盐(pH 2.5)将反应淬灭2分钟。在14℃下将50 µL淬灭的反应物注入在线胃蛋白酶柱(Waters BEH Enzymate)，其使用0.2%甲酸/水作为流动相，流速为100 µL/min，持续4 min。然后使用经10 min的3至85%乙腈(含有0.2%甲酸)梯度，在配备有Vanguard捕集柱的C18柱(Waters, Acquity UPLC BEH C18, 1.7 μm, 1.0 mm × 50 mm)上分离所得的胃酶解肽，流速为50 μL/min。将分离的肽引导入Waters Xevo G2飞行时间(qTOF)质谱仪。质谱仪被设置为以MS^E、ESI⁺模式；在m/z 255.00–1950.00的质量采集范围内收集数据；其中扫描时间为0.5 s。Xevo G2在使用前用Glu-纤维蛋白肽校准。每30秒，所有采集的数据使用LeuEnk于50% ACN、50% H₂O和0.1% FA中的2 µg/ml溶液以5 µl/min的流速进行质量校正(m/z为556.2771)。所述肽通过Waters Protein Lynx Global Server3.02鉴定。处理参数被设置为100.0计数的低能量阈值、50.0计数的升高能量阈值和1500.0计数的强度阈值。将所得的肽列表输入Waters Dynam X3.0软件，其中阈值为5 ppm质量，基于肽长度，每个肽有20%碎片离子。通过在DynamX 3.0 (Waters Corporation)中处理氘化样品连同非氘化对照的MS数据来确定每种肽的相对氘掺入。

药代动力学测量

进行TCR/CD3 IgG-样BsAb的药代动力学测量，如先前所述(Lewis等人, NatBiotechnol, 2014. 32(2): 191-8)。为了评估在小鼠中是否生成针对BsAb的抗药物抗体，通过在4℃下用50 mM碳酸钠(pH 9.3)中的2 μg/mL BsAb包被高结合U-孔96孔板(GreinerMicrolon)过夜来实施ELISA。所述板用PBS+0.1% Tween20 (PBST)洗涤，在室温(RT)下用PBS中的Blocker^TM酪蛋白(Thermo Scientific)封闭1小时，并用PBST洗涤。在室温下将在PBS中的Blocker^TM酪蛋白中从1:50开始以1:3连续稀释的小鼠血浆稀释液添加至板中持续1小时。所述板用PBST洗涤并添加1:1000山羊抗小鼠κ-AP多克隆(Southern Biotech目录号1050-04)：添加Blocker^TM酪蛋白一抗并孵育1小时。洗去检测试剂，随后添加PNPPSubstrate (Thermo Scientific)。通过在SpectraMax 190读板器上读取450 nm处的吸光度来进行比色读出。

T细胞重定向的裂解测定

Saos-2细胞来自ATCC，且624.38细胞来自NCI/NIH DTP,DCTD Tumor Repository，并且两者均在完全培养基(RPMI 1640, Corning)中培养。原代幼稚T细胞来自ALLCELLS。对于该测定，使用Accutase将肿瘤细胞从其培养瓶中取出并以1200 RPM离心10分钟。将肿瘤细胞重新悬浮于完全培养基中，并以5000个细胞/孔接种在96-孔黑色透明底板(PerkinElmer)中，并在5% CO₂培养箱中孵育16-24小时。然后，细胞用50 μL总体积的6 μg/mLSLLMWITQC (NY-ESO-1)肽(由CPC Scientific合成)脉冲3小时。然后，使用在100 nM开始且在0.001 nM结束的10X稀释度将TCR/CD3双功能物滴定至细胞上，一式三份(50 μL/样品)，持续30分钟。在该时段期间，将原代T细胞解冻并在完全培养基和庆大霉素中洗涤两次。然后以50K个细胞/孔(200 mL总体积)添加T细胞(100 μL)。细胞在5% CO₂和37℃下孵育48小时。在48小时时，所述板用无血清RPMI 1640轻轻洗涤(两次)。然后，添加100 μL RPMI 1640和100 μL Cell Titer Glo试剂(Promega)，在摇床上(缓慢)混合2分钟并在黑暗中孵育10分钟。最后，在EnVision 2130多标签阅读器上读取发光。

流式细胞术

如上所述进行细胞培养。在运行流式细胞术前一天，T25烧瓶用生长缓冲液(RPMI/10%胎牛血清(FBS)/庆大霉素-Gibco)中的Jurkat、Saos-2或624.38细胞接种。对于肿瘤细胞，第二天早上，细胞用生长缓冲液洗涤一次。在37℃、5% CO₂下，以6 μg/mL将肽添加至肿瘤细胞(或不添加，作为阴性对照)，持续3小时。然后，吸出过量的肽，并将细胞用PBS缓冲液洗涤3次。所有后续步骤均在冰上进行。使用Accutase (Innovative Technologies)从T25烧瓶取出肿瘤细胞。Jurkat细胞悬浮生长。将细胞转移至离心管中并通过以1200 RPM离心7分钟来沉淀。此后，‘洗涤缓冲液’是PBS/2% FBS/0.05% NaN₃。‘封闭缓冲液’是补充有10%正常山羊血清/10% FBS/人BD Fc封闭剂(BD)的洗涤缓冲液。将细胞在封闭缓冲液中重新悬浮15分钟，沉淀，洗涤3次，并在封闭缓冲液中重新悬浮，然后将50 μL细胞(0.2x10⁶)添加至96孔板(Corning 3799)。以30、3、0.3和0.03 μg/mL将TCR/CD3双功能物和对照mAb添加至孔中并孵育45分钟。将细胞沉淀、洗涤并再次吸出上清液，然后添加100 μL封闭缓冲液中稀释的R-藻红蛋白缀合的AffiniPure山羊抗人IgG-Fc (Jackson)或抗人Lambda LC (Jackson)，持续45分钟。将细胞沉淀并再次洗涤。最后，将细胞重新悬浮在具有1:1000 PI (MolecularProbes)的封闭缓冲液中，并用箔纸覆盖。然后，在Fortessa H647780000006流式细胞仪上对细胞进行分选，用Diva软件(BD)采集并使用FloJo 10.0.08版分析数据。

数据可用性

TCR恒定结构域结构的坐标和相应的结构因子已储存在蛋白数据库(http://www.rcsb.org)中，登录代码为6U07。

序列表

SEQ ID NO.1 WT TCRα恒定结构域(Cα)

SEQ ID NO. 2 WT TCRβ恒定结构域(Cβ)

SEQ ID NO. 3 具有二硫化物突变的WT TCRα恒定结构域(Cα)

SEQ ID NO. 4 具有二硫化物突变的WT TCRβ恒定结构域(Cβ)

SEQ ID NO. 5 具有3个稳定突变减去二硫化物的TCR的Cα

减去二硫化物_S139F_T150I_A190T的α恒定结构域

SEQ ID NO. 6 具有3个稳定突变与二硫化物突变的TCR的Cα

具有二硫化物_S139F_T150I_A190T的α恒定结构域

SEQ ID NO. 7 具有4个稳定突变减去二硫化物的TCR的Cβ

β恒定E134K_H139R_D155P_S170D

SEQ ID NO. 8 具有4个稳定突变与二硫化物突变的TCR的Cβ

β恒定E134K_H139R_D155P_S170D

SEQ ID NO.9 NY-ESO-1 Cα WT，没有二硫化物

SEQ ID NO.10 NY-ESO-1 Cα WT，具有二硫化物

SEQ ID NO.11 NY-ESO-1 Cα，具有二硫化物_S139F_T150I_A190T

SEQ ID NO.12 NY-ESO-1 Cα，没有二硫化物_S139F_T150I_A190T

SEQ ID NO.13 NY-ESO-1 Cβ WT，没有二硫化物

SEQ ID NO.14 NY-ESO-1 Cβ WT，具有二硫化物

SEQ ID NO.15 NY-ESO-1 Cβ，具有二硫化物_E134K_H139R_D155P_S170D

SEQ ID NO.16 NY-ESO-1 Cβ，没有二硫化物_E134K_H139R_D155P_S170D

SEQ ID NO.17 CE10 CαWT，具有二硫化物

SEQ ID NO.18 CE10 Cα，具有二硫化物_S139F_T150I_A190T

SEQ ID NO.19 CE10 Cβ WT，具有二硫化物

SEQ ID NO.20 CE10 Cβ，具有二硫化物_E134K_H139R_D155P_S170D

SEQ ID NO.21 抗NEF134-10 HIV TCR Cα WT，具有二硫化物

SEQ ID NO.22 抗NEF134-10 HIV TCR Cα，具有二硫化物_S139F_T150I_A190T

SEQ ID NO.23 抗NEF134-10 HIV TCR Cβ WT，具有二硫化物

SEQ ID NO.24 抗NEF134-10 HIV TCR Cβ，具有二硫化物_E134K_H139R_D155P_S170D

SEQ ID NO.25 MAGE-A3 Cα WT，具有二硫化物

SEQ ID NO.26 MAGE-A3 Cα，具有二硫化物_S139F_T150I_A190T

SEQ ID NO.27 MAGE-A3 Cβ WT，具有二硫化物

SEQ ID NO.28 MAGE-A3 Cβ，具有二硫化物_E134K_H139R_D155P_S170D

SEQ ID NO.29 IgG1AA_N297QNY-ESO-1 WT Cα，具有二硫化物Fc 7.8.60A

SEQ ID NO.30 IgG1AA_N297QNY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T，具有二硫化物和CH3 7.8.60A异二聚体突变

SEQ ID NO.31 IgG1AA_N297QSP34 mVH，具有7.8.60B异二聚体突变

SEQ ID NO.32 Ch SP34 mVL Lambda

SEQ ID NO.33 NY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T，具有二硫化物_(G4S)4接头_ChSP34 mVH串联FAb

SEQ ID NO.34 IgG1AA_N297QNY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T去糖基化，具有二硫化物7.8.60A

SEQ ID NO.35 IgG1AA_N297QNY-ESO-1 #107 Cα_S139F_T150I_A190T，具有二硫化物7.8.60A

SEQ ID NO. 36 NY-ESO-1#107 Cβ，具有二硫化物_E134K_H139R_D155P_S170D

SEQ ID NO.37 IgG1AA_N297QNY-ESO-1 #113 Cα_S139F_T150I_A190T，具有二硫化物7.8.60A

SEQ ID NO.38 NY-ESO-1#113 Cβ，具有二硫化物_E134K_H139R_D155P_S170D

SEQ ID NO.39 IgG1AA_N297Q NY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T，具有二硫化物_3XG4S_SP34mVH 7.8.60B

SEQ ID NO.40 NY-ESO-1 Cα_S139F_T150I_A190T，具有二硫化物_5XG4S_Ch SP34mVH串联FAb

SEQ ID NO.41 (G4S)₃接头

SEQ ID NO.42 (G4Q)₃接头

SEQ ID NO.43 (G4S)₄接头

SEQ ID NO.44 (G4S)₅接头

SEQ ID NO.45 (G4Q)₄接头

SEQ ID NO.46 (G4Q)₅接头

SEQ ID NO. 47 IgG1铰链区

SEQ ID NO. 48 具有L234A_L235A_N297Q的IgG1 Fc区

SEQ ID NO. 49 IgG4 (StoP)铰链区

SEQ ID NO. 50 IgG4AA Fc区

SEQ ID NO:51 人HPB-MLT Cβ

SEQ ID NO:52 人HPB-MLT Cα

Claims

1.蛋白，其包含：

第一多肽，其包含含有以下残基中的至少一个的T细胞受体(TCR) α恒定结构域(Cα)：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；和/或

第二多肽，其包含含有以下残基中的至少一个的TCR β恒定结构域(Cβ)：位置134 处的赖氨酸、位置139 处的精氨酸、位置155 处的脯氨酸、位置170 处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据 Kabat 编号进行编号)。

2.权利要求1的蛋白，其中：

所述第一多肽包含Cα，所述Cα包含以下残基中的至少一个：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；且

所述第二多肽包含Cβ，所述Cβ包含以下残基中的至少一个：位置134 处的赖氨酸、位置139 处的精氨酸、位置155 处的脯氨酸、位置170 处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据 Kabat编号进行编号)。

3.权利要求1或2的蛋白，其中：

所述第一多肽包含Cα结构域，所述Cα结构域包含以下残基：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；且

所述第二多肽包含Cβ结构域，所述Cβ结构域包含以下残基：位置134 处的赖氨酸、位置139 处的精氨酸、位置155 处的脯氨酸、位置170 处的天冬氨酸(残基根据 Kabat 编号进行编号)。

4.权利要求1或2的蛋白，其中：

所述第一多肽包含Cα结构域，所述Cα结构域包含以下残基：位置139处的苯丙氨酸和位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；且

5.权利要求1-4中任一项的蛋白，其中所述第一多肽通过链间二硫键与所述第二多肽连接。

6.权利要求1-5中任一项的蛋白，其中：

所述Cα结构域进一步包含在位置166处的半胱氨酸残基(残基根据Kabat编号进行编号)，且

所述Cβ结构域进一步包含在位置173处的半胱氨酸残基(残基根据Kabat编号进行编号)，

其中所述第一多肽和所述第二多肽通过Cα的位置166处的半胱氨酸残基和Cβ的位置173处的半胱氨酸残基之间的链间二硫键连接。

7.权利要求1-5中任一项的蛋白，其中：

所述Cα结构域包含SEQ ID NO:5；且

所述Cβ结构域包含SEQ ID NO:7。

8.权利要求1-5中任一项的蛋白，其中：

所述Cα结构域由SEQ ID NO:5组成；且

所述Cβ结构域由SEQ ID NO:7组成。

9.权利要求1-6中任一项的蛋白，其中：

所述Cα结构域包含SEQ ID NO:6；且

所述Cβ结构域包含SEQ ID NO:8。

10.权利要求1-6中任一项的蛋白，其中：

所述Cα结构域由SEQ ID NO:6组成；且

所述Cβ结构域由SEQ ID NO:8组成。

11.权利要求1-10中任一项的蛋白，其中：

所述第一多肽进一步包含TCRα可变结构域(Vα)；且

所述第二多肽进一步包含TCRβ可变结构域(Vβ)，

其中所述Vα和Vβ形成结合抗原的抗原结合结构域。

12.权利要求11的蛋白，其中：

Vα融合至Cα的N-末端；且

Vβ融合至Cβ的N-末端。

13.权利要求11的蛋白，其中所述抗原是肿瘤抗原或病毒抗原。

14.权利要求1-13中任一项的蛋白，其中所述蛋白进一步包含第二抗原结合结构域。

15.权利要求14的蛋白，其中所述第二抗原结合结构域结合T细胞表面上的抗原。

16.权利要求14的蛋白，其中所述第二抗原结合结构域结合CD3。

17.权利要求14-16中任一项的蛋白，其中所述第二抗原结合结构域是scFv、Fab、Fab'、(Fab')₂、单结构域抗体或骆驼科VHH结构域。

18.权利要求14-17中任一项的蛋白，其中所述第二抗原结合结构域是Fab。

19.权利要求18的蛋白，其中所述Fab包含Fab重链和Fab轻链，所述Fab重链包含重链可变结构域(VH)和人IgG CH1结构域，所述Fab轻链包含轻链可变结构域(VL)和人轻链恒定结构域(CL)，其中所述VH和VL形成结合CD3的第二抗原结合结构域。

20.权利要求18或19的蛋白，其中所述蛋白包含三个多肽：

包含Vα-Cα-接头-VH-CH1的第一多肽；

包含Vβ-Cβ的第二多肽；和

包含VL-CL的第三多肽；

其中所述第二和第三多肽通过链间二硫键与所述第一多肽连接。

21.权利要求1-20中任一项的蛋白，其中所述蛋白进一步包含人IgG Fc区(Fc)。

22.权利要求21的蛋白，其中所述人IgG Fc区是修饰的人IgG Fc区，其与对应的野生型人IgG Fc区相比具有降低的效应子功能。

23.权利要求1-19、21或22中任一项的蛋白，其中所述蛋白包含四个多肽：

包含Vα-Cα-铰链-第一Fc区的第一多肽；

包含Vβ-Cβ的第二多肽；

包含VL-CL的第三多肽；和

包含VH-CH1-铰链-第二Fc区的第四多肽；

其中所述第二和第四多肽通过链间二硫键与所述第一多肽连接；且所述第三多肽通过链间二硫键与所述第四多肽连接。

24.权利要求21或22的蛋白，其中所述蛋白包含四个多肽：

包含Vα-Cα-接头-VH-CH1-铰链-第一Fc区的第一多肽；

包含Vβ-Cβ的第二多肽；

包含VL-CL的第三多肽；

包含第二Fc区的第四多肽；且

其中所述第二、第三和第四多肽通过链间二硫键与所述第一多肽连接。

25.权利要求20或24的蛋白，其中所述接头包含选自SEQ ID NO:41-46中任一个的氨基酸序列。

26.权利要求23或24的蛋白，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:47且所述第一和第二Fc区包含SEQ ID NO:48。

27.权利要求23或24的蛋白，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:49且所述第一和第二Fc区包含SEQ ID NO:50。

28.权利要求23或24的蛋白，其中所述第一和第二Fc区包含一组CH3异二聚化突变。

29.权利要求28的蛋白，其中所述第一或第二Fc区之一包含CH3结构域，所述CH3结构域包含残基407处的丙氨酸、残基399处的甲硫氨酸和残基360处的天冬氨酸；且所述第一或第二Fc区中的另一个包含CH3结构域，所述CH3结构域包含残基366处的缬氨酸、残基409处的缬氨酸和残基345和347处的精氨酸(残基根据EU索引编号进行编号)。

30.权利要求1-29中任一项的蛋白，其中所述蛋白是可溶性蛋白。

31.权利要求1-30中任一项的蛋白，其中所述蛋白与除了以下之外包含相同氨基酸序列的蛋白相比具有更高的解折叠温度(Tm)：

包含位置139处的丝氨酸、位置150处的苏氨酸和位置190处的丙氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)的Cα结构域；和

包含位置134处的谷氨酸、位置139处的组氨酸、位置155处的天冬氨酸和位置170处的丝氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)的Cβ结构域。

32.权利要求1-30中任一项的蛋白，其中所述蛋白与除了以下之外包含相同氨基酸序列的蛋白相比具有增加的稳定性：

33.权利要求1-30中任一项的蛋白，其中，当在相同的温度下表达时，所述蛋白与除了以下之外包含相同氨基酸序列的蛋白相比具有增加的表达水平：

34.权利要求1-30中任一项的蛋白，其中所述蛋白与除了以下之外包含相同氨基酸序列的蛋白相比具有降低的糖基化水平：

35.权利要求1-13中任一项的蛋白，其中：

(a)所述第一多肽进一步包含TCRα链的跨膜和细胞内结构域；且

(b)所述第二多肽进一步包含TCRβ链的跨膜和细胞内结构域。

36.权利要求1-35中任一项的蛋白，其中所述蛋白与可检测标记物连接。

37.权利要求1-36中任一项的蛋白，其中所述蛋白与治疗剂连接。

38.权利要求37的蛋白，其中所述治疗剂是细胞毒性剂、抗炎剂或免疫刺激剂。

39.核酸，其编码权利要求1-38中任一项的蛋白的多肽。

40.载体，其包含权利要求39的核酸。

41.细胞，其包含权利要求39的核酸或权利要求40的载体。

42.药物组合物，包含权利要求1-38中任一项的蛋白、权利要求39的核酸、权利要求40的载体或权利要求41的细胞。

43.治疗有此需要的受试者中的癌症或感染的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-38中任一项的蛋白、权利要求39的核酸、权利要求40的载体、权利要求41的细胞或权利要求42的药物组合物。

44.权利要求1-38中任一项的蛋白、权利要求39的核酸、权利要求40的载体、权利要求41的细胞或权利要求42的药物组合物，其用于治疗癌症或感染。