CN111148756A - T细胞受体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与来源于生殖系癌抗原PRAME的HLA‑A*02限制性肽SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)结合的T细胞受体(TCR)。相对于天然PRAME TCR，所述TCR可以包含α和/或β可变结构域内的非天然突变。本发明的TCR特别适合用作用于治疗恶性疾病的新型免疫治疗剂。
Description
技术领域
本发明涉及与来源于生殖系癌抗原PRAME的HLA-A*02限制性肽SLLQHLIGL(SEQ IDNO:1)结合的T细胞受体(TCR)。相对于天然PRAME TCR，所述TCR可以包含α和/或β可变结构域内的非天然突变。本发明的TCR特别适合用作用于治疗恶性疾病的新型免疫治疗剂。
背景技术
T细胞受体(T cell receptor，TCR)由CD4+和CD8+T细胞天然表达。TCR被设计为识别在抗原呈递细胞表面上展示的与主要组织相容性复合物(Major HistocompatibilityComplex，MHC)分子(在人中，MHC分子也被称为人白细胞抗原或HLA)复合的短肽抗原(Daviset al.,Annu Rev Immunol.1998；16:523-44)。CD8+T细胞也称为细胞毒性T细胞，其具有特异性识别结合至MHC I类分子的肽的TCR。CD8+T细胞通常负责发现和介导病变细胞的破坏，包括癌细胞和病毒感染的细胞。由于胸腺选择，天然库中的癌症特异性TCR对相应抗原的亲和性通常较低，这意味着癌细胞经常逃避检测和破坏。旨在促进T细胞识别癌症的新型免疫治疗方法，为开发有效的抗癌疗法提供了非常有前景的策略。
最初黑色素瘤中的PRAME或优先表达的抗原被鉴定为在黑色素瘤中过度表达的抗原(Ikeda et al.,Immunity.1997Feb；6(2):199-208)；这种抗原也被称为CT130、MAPE、OIP-4，并且这种抗原的Uniprot登录号为P78395。该蛋白作为维甲酸受体信号转导的阻抑物起作用(Epping et al.,Cell.2005Sep 23；122(6):835-47)。PRAME属于被称为睾丸癌抗原的生殖系编码抗原家族。睾丸癌抗原是免疫治疗干预的有吸引力的靶标，因为它们通常在正常成人组织中表达受限或不表达。PRAME在许多实体瘤以及白血病和淋巴瘤中表达(Doolan et al Breast Cancer Res Treat.2008May；109(2):359-65；Epping et alCancer Res.2006Nov 15；66(22):10639-42；Ercolak et al Breast Cancer ResTreat.2008 May；109(2):359-65；Matsushita et al Leuk Lymphoma.2003 Mar；44(3):439-44；Mitsuhashi et al Int.J Hematol.2014；100(1):88-95；Proto-Sequeire et alLeuk Res.2006 Nov；30(11):1333-9；Szczepanski et al Oral Oncol.2013 Feb；49(2):144-51；Van Baren et al Br J Haematol.1998 Sep；102(5):1376-9)。本发明的PRAME靶向疗法可能特别适合于治疗癌症，包括但不限于：肺癌(NSCLC和SCLC)、乳腺癌(包括三阴性)、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、膀胱癌以及头颈癌。
肽SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)对应于全长PRAME蛋白的第425-433位氨基酸，并与HLA-A*02复合存在于细胞表面(Kessler et al.,J Exp Med.2001 Jan 1；193(1):73-88)。该肽-HLA复合物为基于TCR的免疫治疗干预提供了有用的靶标。
以高亲和力和高特异性结合至SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)HLA-A*02复合物的特定TCR序列的鉴定，对于开发新的免疫疗法是有利的。例如，治疗性TCR可用作可溶性靶向剂，用于将细胞毒性剂递送至肿瘤部位或激活针对肿瘤细胞的免疫效应子功能的目的(Lissin,et al.,“High-Affinity Monocloncal T-cell receptor(mTCR)Fusions”inFusion Protein Technologies for Biophamaceuticals:Applications andChallenges.2013.S.R.Schmidt,Wiley；Boulter et al.,Protein Eng.2003 Sep；16(9):707-11；Liddy,et al.,Nat Med.2012 Jun；18(6):980-7)，或者可选地，治疗性TCR可用于使T细胞工程化以进行过继性治疗(Fesnak et al.,Nat Rev Cancer.2016 Aug 23；16(9):566-81)。
先前已经报道了结合至与HLA-A*02复合的SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)的TCR(Amiret al.,Clin Cancer Res.2011 Sep 1；17(17):5615-25；Griffioen et al.,Clin CancerRes.2006 May 15；12(10):3130-6；WO2016142783)。但是，尚未对这些TCR进行工程化以使它们相对于天然TCR以增加的亲和力结合至靶抗原时。如下文进一步说明的，超生理抗原亲和力是治疗性TCR的期望特征，其产生并不简单，特别是当与其他期望特征(例如特异性)相平衡时。
本申请定义的TCR序列参考IMGT命名法进行描述，该命名法对于TCR领域的技术人员而言广为人知并且可以获得。例如，参见：LeFranc and LeFranc,(2001).“T cellReceptor Factsbook”,Academic Press；Lefranc,(2011),Cold Spring Harb Protoc2011(6):595-603；Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix 1:Appendix 10O；and Lefranc,(2003),Leukemia 17(1):260-266。简而言之，αβTCR由两条以二硫键连接的链组成。通常认为每条链(α和β)具有两个结构域，即可变结构域和恒定结构域。短连接区连接可变结构域和恒定结构域，并且通常被认为是α可变区的一部分。另外，β链通常包含在连接区旁的短的多样性区，该多样性区通常也被认为是β可变区的一部分。
每条链的可变结构域位于N端，并包含嵌入框架序列(Framework sequence，FR)的三个互补决定区(Complementarity Determining Region，CDR)。CDR包含肽-MHC结合的识别位点。存在若干个编码α链可变(Vα)区的基因和若干个编码β链可变(Vβ)区的基因，其区别在于它们的构架、CDR1和CDR2序列，以及部分定义的CDR3序列。在IMGT命名法中，Vα和Vβ基因分别用前缀“TRAV”和“TRBV”来表示(Folch and Lefranc,(2000),Exp ClinImmunogenet 17(1):42-54；Scaviner and Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(2):83-96；LeFranc and LeFranc,(2001),“T cell Receptor Factsbook”,AcademicPress)。同样地，α链和β链各有若干连接基因或J基因，分别被称为TRAJ或TRBJ，而β链有被称为TRBD的多样性或D基因(Folch and Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(2):107-114；Scaviner and Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(2):97-106；LeFrancand LeFranc,(2001),“T cell Receptor Factsbook”,Academic Press)。T细胞受体链的巨大多样性源于各种V、J和D基因之间的组合重排，该多样性包括等位基因变体和连接多样性(Arstila,et al.,(1999),Science 286(5441):958-961；Robins et al.,(2009),Blood114(19):4099-4107.)。TCRα和β链的恒定区或C区分别称为TRAC和TRBC(Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix 1:Appendix 10)。
本申请的发明人惊讶地发现了能够以高亲和力和高特异性结合至SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的新型TCR。所述TCR是由引入了许多突变的合适支架序列工程化而成的。本发明的TCR具有特别适合于治疗用途的特性。通常，这种TCR的鉴定并不简单，并且通常具有高损耗率。
在第一种情况下，技术人员需要鉴定合适的起始序列或支架序列。通常这种序列从天然来源获得，例如，从来自供体血液中提取的抗原应答T细胞获得。考虑到天然库中癌症特异性T细胞的稀有性，通常必须筛选许多种供体，例如20种或更多种，然后才能找到应答T细胞。筛选过程可能耗费数周或数月，甚至在发现应答T细胞的情况下，它也可能不适合免疫治疗用途。例如，应答可能太弱和/或可能对靶抗原无特异性。或者，可能不能产生克隆T细胞群，也不可能扩增或维持给定的T细胞系以产生足够的材料来鉴定正确的TCR链序列。适合作为起始序列或支架序列的TCR序列应具有一个或多个以下性质：对靶肽-HLA复合物具有良好的亲和力，例如200μM或更强；高水平的靶特异性，例如，与替代肽-HLA复合物的结合相对弱或不结合；可以适于在展示文库(例如噬菌体展示)中使用；并且能够重折叠和以高产率纯化。考虑到TCR识别的简并性，即使是熟练的专业人员也很难确定特定的支架TCR序列是否具有使其适于工程化以用于治疗用途的特异性特性(Wooldridge,et al.,J BiolChem.2012 Jan 6；287(2):1168-77)。
下一个挑战是使TCR工程化以对靶抗原具有更高的亲和力，同时保留所需的特性(例如特异性和产率)。与抗体相比，天然存在的TCR对靶抗原(低微摩尔范围)的亲和力弱，并且针对癌抗原的TCR通常具有弱于病毒特异性TCR的抗原识别(Aleksic,et al.Eur JImmunol.2012 Dec；42(12):3174-9)。这种弱亲和力与HLA对癌细胞的下调相结合意味着用于癌症免疫疗法的治疗性TCR通常需要工程化以增加其对靶抗原的亲和力，从而产生更有效的应答。这种亲和力增加对基于TCR的可溶性试剂是必不可少的。在这种情况下，期望的是抗原结合亲和力在纳摩尔至皮摩尔范围内，并且结合半衰期为若干小时。在Liddy等人(Liddy,et al.,Nat Med.2012 Jun；18(6):980-7)的图1e和1f中举例说明了在低表位数下通过高亲和力抗原识别引起效力改进。亲和力成熟过程通常涉及技术人员必须对起始TCR序列进行特定突变和/或突变组合工程化以增加抗原识别的强度，所述突变包括但不限于替换、插入和/或缺失。在给定的TCR上进行亲和力工程化以增强突变的方法是本领域已知的，例如使用展示文库(Li et al.,Nat Biotechnol.2005 Mar；23(3):349-54；Holler etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.2000 May 9；97(10):5387-92)。然而，为了引起给定TCR对给定靶标的亲和力显著增加，技术人员可能不得不从大量可能的替代方案中进行突变组合工程化。引起亲和力显著增加的特定突变和/或突变组合是不可预测的，并且存在高耗损率。在许多情况下，可能无法以给定TCR起始序列实现亲和力的显著增加。
亲和力成熟过程还必须考虑必须保持TCR抗原特异性。由于TCR抗原识别固有的简并性，增加TCR对其靶抗原的亲和力带来与其他非预期靶标显示交叉反应的显著风险(Wooldridge,et al.,J Biol Chem.2012 Jan 6；287(2):1168-77；Wilson,et al.,MolImmunol.2004 Feb；40(14-15):1047-55；Zhao et al.,J Immunol.2007 Nov 1；179(9):5845-54)。在天然亲和力水平下，交叉反应抗原的识别可能太低而不能产生应答。如果在正常健康细胞上展示交叉反应抗原，则体内脱靶结合的可能性很大，这可能表现为临床毒性。因此，除了增加抗原结合强度之外，技术人员还必须进行突变和/或突变组合工程化，以允许TCR保留对靶抗原的高特异性并在临床前测试中显示出良好的安全性。再者，合适的突变和/或突变组合是不可预测的。在这个阶段的损耗率甚至更高，并且在许多情况下可能根本不能由给定的TCR起始序列实现。
尽管存在上述困难，但本发明人已经鉴定出具有特别高的亲和力(皮摩尔范围)和高度抗原特异性的突变的TCR。所述TCR显示有效杀伤对制备作为与T细胞重定向部分融合的可溶性试剂时的PRAME阳性癌细胞。
发明内容
在第一方面，本发明提供一种T细胞受体(TCR)，该T细胞受体(TCR)具有结合至与HLA-A*02复合的SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)的性质并且包含TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域，TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域中的每个包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR为构架区，并且CDR为互补决定区，其中
(a)所述α链CDR具有以下序列：
CDR1–TISGTDY(SEQ ID NO:39)
CDR2–GLTSN(SEQ ID NO:40)
CDR3–CILILGHSGAGSYQLTF(SEQ ID NO:41)
其中任选地有一个或多个突变，
和/或
(b)所述β链CDR具有以下序列：
CDR1–LNHDA(SEQ ID NO:42)
CDR2–SQIVNDF(SEQ ID NO:43)
CDR3–CASSPWTSGSREQYF(SEQ ID NO:44)
其中任选地有一个或多个突变。
在第一方面的TCR中，所述α链可变结构域构架区可以包含以下构架序列：
FR1–SEQ ID NO:2的第1-25位氨基酸
FR2–SEQ ID NO:2的第33-49位氨基酸
FR3–SEQ ID NO:2的第55-87位氨基酸
FR4–SEQ ID NO:2的第105-114位氨基酸
或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的各序列，和/或
所述β链可变结构域构架区可以包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:3的第1-26位氨基酸
FR2–SEQ ID NO:3的第32-48位氨基酸
FR3–SEQ ID NO:3的第56-90位氨基酸
FR4–SEQ ID NO:3的第106-114位氨基酸
或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的各序列。
术语“突变”涵盖了替换、插入和缺失。对亲本(或野生型，或支架)TCR的突变可包括增加TCR对SLLQHLIGL–HLA-A*02复合物的结合亲和力(kD和/或结合半衰期)的突变。
按照惯例，β链残基F55被认为是构架区3的一部分。然而，为了本发明的目的，β链残基F55被认为是CDR2的一部分。
α链构架区FR1、FR2和FR3可以包含对应于TRAV 26-2链的氨基酸序列和/或β链构架区FR1、FR2和FR3可以包含对应于TRBV19链的氨基酸序列的氨基酸序列。
FR4区可以包含α和β可变链的连接区(分别为TRAJ和TRBJ)。
在TCRα链可变区中，可以存在至少一个突变。在α链CDR中可以存在1、2、3、4或5或更多个突变。在α链CDR3中可以存在1、2、3、4或5个突变。按照SEQ ID NO:2的编号，可以从以下突变中选择所述突变中的一个或多个：
| 野生型 | 突变 |
| G96(CDR3) | R |
| A97(CDR3) | L |
| S99(CDR3) | N |
| Q101(CDR3) | I |
| L102(CDR3) | A |
因此，上表中可存在任何突变或所有突变，任选地与其他突变结合。
α链CDR3可以包含以下突变组之一(按照SEQ ID NO:2的编号)：
| 1 | G96R | S99N | Q101I | L102A | |
| 2 | G96R | A97L | S99N | Q101I | L102A |
| 3 | G96R | A97L | S99N | L102A |
优选的一个突变组是第1组。另一个优选的突变组是第2组。
α链CDR3可具有选自以下的序列：
| CILILGHSRAGNYIATF(SEQ ID NO:45) |
| CILILGHSRLGNYIATF(SEQ ID NO:46) |
| CILILGHSRLGNYQATF(SEQ ID NO:47) |
一个优选的α链CDR3是CILILGHSRAGNYIATF(SEQ ID NO:45)。一个优选的α链CDR3是CILILGHSRLGNYIATF(SEQ ID NO:46)。
在TCRβ链可变区中，可以存在至少一个突变。在β链CDR中可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变。在β链CDR3中可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变。按照SEQID NO:3的编号，可以从以下突变中选择所述突变中的一个或多个：
| 野生型 | 突变 |
| V52(CDR2) | M |
| N53(CDR2) | G |
| F55(CDR2) | E |
| P95(CDR3) | W |
| S98(CDR3) | G |
| S100(CDR3) | A |
| R101(CDR3) | S或A |
| E102(CDR3) | P |
| Q103(CDR3) | I |
| Y104(CDR3) | S或R |
因此，上表中可能存在任何突变或所有突变，任选地与其他突变结合。
β链CDR2和CDR3可以包含以下突变组之一(按照SEQ ID NO:3的编号)：
| 1 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | S100A | R101S | E102P | Q103I | Y104S |
| 2 | V52M | N53G | F55E | P95W | S100A | R101S | E102P | Q103I | Y104S | |
| 3 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | R101A | E102P | Q103I | Y104R | |
| 4 | V52M | F55E | P95W | S98G | R101A | E102P | Q103I | Y104R | ||
| 5 | V52M | N53G | F55E | P95W | R101A | E102P | Q103I | Y104R | ||
| 6 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | R101A | Q103I | Y104R | ||
| 7 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | R101A | E102P | Q103I | ||
| 8 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | S100A | R101A | E102P | Q103I | Y104S |
| 9 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | S100A | R101S | E102P | Q103I | Y104R |
| 10 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | S100A | R101A | E102P | Q103I | Y104R |
| 11 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | S100A | R101S | Q103I | Y104S | |
| 12 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | R101A | E102P | Q103I | Y104S | |
| 13 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | R101S | E102P | Q103I | Y104S | |
| 14 | N53G | F55E | P95W | S98G | R101A | E102P | Q103I | Y104R | ||
| 15 | V52M | N53G | F55E | S98G | R101A | E102P | Q103I | Y104R | ||
| 16 | V52M | N53G | F55E | P95W | S98G | R101S | E102P | Q103I | Y104R |
优选的一个突变组是第1组。优选的一个突变组是第9组。
β链CDR2可具有选自以下的序列：
| SQIMGDE(SEQ ID NO:48) |
| SQIMNDE(SEQ ID NO:49) |
| SQIVGDE(SEQ ID NO:50) |
一个优选的β链CDR2是SQIMGDE(SEQ ID NO:48)。
β链CDR3可具有选自以下的序列：
| CASSWWTGGASPISF(SEQ ID NO:51) |
| CASSWWTSGASPISF(SEQ ID NO:52) |
| CASSWWTGGSAPIRF(SEQ ID NO:53) |
| CASSWWTSGSAPIRF(SEQ ID NO:54) |
| CASSWWTGGSAEIRF(SEQ ID NO:55) |
| CASSWWTGGSAPIYF(SEQ ID NO:56) |
| CASSWWTGGAAPISF(SEQ ID NO:57) |
| CASSWWTGGASPIRF(SEQ ID NO:58) |
| CASSWWTGGAAPIRF(SEQ ID NO:59) |
| CASSWWTGGASEISF(SEQ ID NO:60) |
| CASSWWTGGSAPISF(SEQ ID NO:61) |
| CASSWWTGGSAPISF(SEQ ID NO:62) |
| CASSPWTGGSAPIRF(SEQ ID NO:63) |
| CASSWWTGGSSPIRF(SEQ ID NO:64) |
一个优选的β链CDR3是CASSWWTGGASPISF(SEQ ID NO:51)。一个优选的β链CDR3是CASSWWTGGASPIRF(SEQ ID NO:58)。
优选的β链CDR2和CDR3的组合如下：
一个优选的组合是组合1。另一个优选的组合是组合9。
在一个优选的实施例中，TCRα和β链CDR序列选自：
一个优选的组合是组合1。一个优选的组合是组合17。
CDR内的突变优选地提高TCR对SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的结合亲和力，但是可以另外地或替代地赋予其他优点，例如改善分离形式的稳定性和改善特异性。一个或多个位置的突变可以另外地或替代地影响相邻位置与同源pMHC复合物的相互作用，例如通过提供更有利的相互作用角度。突变可以包括能够减少非特异性结合量的突变，即，减少结合至相对于SLLQHLIGL-HLA-A*02的替代性抗原的突变。突变可以包括提高折叠和/或制造效率的突变。一些突变可能有利于这些特征中的每一个；另一些可能有利于例如亲和力而非特异性，或者有利于特异性而非亲和力等。
通常，总共需要至少5个、至少10个、至少15个或更多个CDR突变以获得对靶抗原具有pM亲和力的TCR。可能总共需要至少5个、至少10个或至少15个CDR突变以获得对靶抗原具有pM亲和力的TCR。对靶抗原具有pM亲和力的TCR尤其适合作为可溶性治疗剂。用于过继性治疗应用的TCR对靶抗原可具有较低的亲和力，因此CDR突变较少，例如，总共至多1个、至多2个、至多5个或更多个CDR突变。用于过继性治疗应用的TCR可能对靶抗原具有较低的亲和力，因此CDR突变较少，例如，总共至多1个、至多2个、或至多5个CDR突变。
另外地或替代地，可以在构架区内CDR之外进行突变；这种突变可以提高可溶形式的纯化TCR的结合和/或特异性、和/或稳定性、和/或产率。例如，另外地或替代地，本发明的TCR可以包含α链可变结构域，其中α链可变区FR1在第-1位(使用SEQ ID NO:2的编号)具有G残基，即插入在第1位之前。在大肠杆菌中，发现在第-1位的G提高了生产过程中的N端甲硫氨酸的切割效率。无效切割可能对治疗不利，因为它可能导致异质蛋白产物，和/或起始甲硫氨酸的存在可能在人体中是致免疫的。
优选地，本发明的TCR的α链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:2的第1-25位、第33-49位、第55-87位、第105-114位构架氨基酸残基具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的各构架氨基酸序列。本发明的TCR的β链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:3的第1-26位、第32-48位、第56-90位、第106-114位构架氨基酸残基具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的各构架氨基酸序列。可替代地，当作为一个整体考虑时，所述百分比同一性可以是关于构架序列的。
α链可变结构域可以包含SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列中的任一个，并且β链可变结构域可以包含SEQ ID NO:9-24的氨基酸序列中的任一个。
例如，TCR可以包含以下α和β链对。
| α链可变结构域 | β链可变结构域 |
| SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:9 |
| SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:19 |
| SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:17 |
| SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:20 |
| SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:10 |
| SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:21 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:11 |
| SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:11 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:22 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:12 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:23 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:13 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:14 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:15 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:21 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:16 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:17 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:20 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:24 |
| SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:18 |
一个优选的TCR链配对是SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9。一个优选的TCR链配对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:17。
本文公开的本发明的任何TCR的表型沉默变体属于本发明的范围内。如本申请所用，术语“表型沉默变体”应理解为指并入除了上述那些之外的一个或多个其他氨基酸变化(包括替换、插入和缺失)的TCR可变结构域，该TCR TCR具有与相应的不含所述变化的TCR相似的表型。为了本申请的目的，TCR表型包含结合亲和力(KD和/或结合半衰期)和特异性。优选地，除了结合亲和力和特异性之外，与免疫效应子相关联的可溶性TCR的表型包括免疫激活和纯化产率的效力。当在相同的条件(例如在25℃下和/或在相同的SPR芯片上)下测量时，表型沉默变体对SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的KD和/或结合半衰期可以为不含所述变化的相应TCR的所测得的KD和/或结合半衰期的50％以内，或更优选为30％以内、25％以内或20％以内。实施例3中进一步提供了合适的条件。如本领域技术人员已知的，有可能生产这样的TCR：与以上详述的那些TCR相比，在该TCR的可变结构域中并入了变化，而不改变与SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的相互作用的亲和力，和/或其他功能特性。特别地，可以将这种沉默突变并入已知不直接参与抗原结合的序列的部分(例如，构架区和/或不与抗原接触的CDR的部分)中。这种变体包括在本发明的范围内。
表型沉默变体可包含一个或多个保守替换和/或一个或多个耐受替换。耐受替换意指那些不落入如下所提供的保守的定义但仍然是表型沉默的替换。技术人员知道各种氨基酸具有相似的性质并因此是“保守的”。蛋白质、多肽或肽的一种或多种这样的氨基酸通常可以被一种或多种其他这样的氨基酸替换，而不会消除该蛋白质、多肽或肽的所需活性。
因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(具有脂肪族侧链的氨基酸)通常可以互相替换。在这些可能的替换中，优选使用甘氨酸和丙氨酸来互相替换(因为它们具有相对短的侧链)，以及使用缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸来互相替换(因为它们具有较大的疏水脂肪族侧链)。通常可以互相替换的其他氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。应当理解，本发明范围内的氨基酸替换可以使用天然存在的或非天然存在的氨基酸来进行。例如，本文构思可以用乙基基团取代丙氨酸上的甲基基团，和/或可以对肽骨架进行微小的改变。无论是否使用天然氨基酸或合成氨基酸，优选仅存在L-氨基酸。
这种性质的替换通常被称为“保守”或“半保守”氨基酸替换。因此，本发明延伸至这样的TCR的用途：包含上述任意氨基酸序列但在该序列中具有一个或多个保守替换和/或一个或多个耐受替换，使得TCR的氨基酸序列与包含SEQ ID NO:2、6-8的第1-114位氨基酸或SEQ ID NO:3、9-24的第1-114位氨基酸的TCR具有至少90％同一性，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
如本领域已知的“同一性”是通过比较序列所确定的两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，同一性也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，如通过这种序列的串之间的匹配所确定。虽然存在许多测量两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的同一性的方法，但通常用于确定同一性的方法是在计算机程序中编码的。用于确定两个序列之间的同一性的优选的计算机程序包括但不限于GCG程序包(Devereux,et al.,Nucleic Acids Research,12,387(1984),BLASTP,BLASTN,and FASTA(Atschul et al.,J.Molec.Biol.215,403(1990))。
可以使用程序(例如CLUSTAL程序)来比较氨基酸序列。该程序比较氨基酸序列，并通过在任一序列中适当地插入空格来找到最优比对。可以计算氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸类型的保守性)以进行最优比对。像BLASTx这样的程序会比对延伸最长的相似序列，并为该拟合赋值。因此，可以在发现若干相似区的情况下获得比较，每个区具有不同的分数。在本发明中构思了两种类型的同一性分析。
通过出于最优比较目的对序列进行比对(例如，可以在第一序列中引入空位以与序列进行最佳比对)并且比较相应位置处的氨基酸残基或核苷酸，来确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性。“最佳比对”是获得最高的百分比同一性的两个序列的比对。百分比同一性由所比较序列中的相同氨基酸残基或核苷酸的数量来确定的(即，％同一性＝相同位置数/位置总数×100)。
可以使用本领域技术人员已知的数学算法来完成两个序列之间的百分比同一性的确定。用于比较两个序列的数学算法的例子是Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，该算法在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中进行了改进。Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序已经并入了这种算法。可以用BLASTn程序来进行两个核苷酸序列之间的同一性百分比的确定。可以用BLASTp程序来进行两个蛋白质序列之间的同一性百分比的确定。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul etal.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述使用Gapped BLAST。可替代地，可以使用PSI-Blast来执行迭代搜索，检测分子之间的远距离关系(Id.)。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如，BLASTp和BLASTp)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。默认的常规参数可以包括，例如，字体大小＝3，期望阈值＝10。可以选择参数以自动调整为输入短序列。用于序列比较的数学算法的另一例子是Myers and Miller,CABIOS(1989)的算法。作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(版本2.0)已经并入了这种算法。本领域已知的用于序列分析的其他算法包括如Torellisand Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.,10:3-5中所述的ADVANCE和ADAM；以及Pearsonand Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-8中所述的FASTA。在FASTA中，ktup是设置搜索的灵敏度和速度的控制选项。出于评估本发明中的百分比同一性的目的，使用BLASTp以及默认参数作为比较方法。另外，当所述同一性百分比提供氨基酸的非整数值(即，具有90％列同一性的25个氨基酸的序列提供的值为“22.5”)时，则将所得值向下舍入到下一个整数，即“22”)。因此，在提供的例子中，在25个氨基酸中具有22个匹配的序列在90％序列同一性内。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，在基本不影响TCR的功能特性的情况下，有可能将在其C端和/或N端所提供的序列截短或延伸1、2、3、4、5或更多个残基。在其C端和/或N端所提供的序列可以被截短或延伸1、2、3、4或5个残基。所有这些变体都涵盖在本发明中。
可以使用任何适当的方法将突变(包括保守和耐受的替换、插入和缺失)引入所提供的序列中，所述方法包括但不限于基于聚合酶链式反应(PCR)、基于限制酶的克隆或不依赖于连接的克隆(Ligation independent cloning，LIC)步骤的方法。这些方法在许多标准分子生物学文本中都有详细描述。有关聚合酶链式反应(PCR)和基于限制酶的克隆的更多细节，参见Sambrook&Russell,(2001)Molecular Cloning–A Laboratory Manual(3rd Ed.)CSHL Press。有关不依赖于连接的克隆(LIC)步骤的更多信息可以在Rashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6中找到。本发明提供的TCR序列可以从固态合成或本领域已知的任何其他合适的方法获得。
本发明的TCR具有结合SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的性质。本发明的TCR显示出对SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的高度特异性，并因此特别适合于治疗用途。在本发明的TCR背景下的特异性涉及该TCR识别抗原为阳性的HLA-A*02靶细胞的能力，同时具有最小的识别抗原为阴性的HLA-A*02靶细胞的能力。
特异性可以在体外测量，例如在细胞试验(比如实施例6、7和8中描述的细胞试验)中测量。为了测试特异性，TCR可以是可溶形式并与免疫效应子相关联，和/或可以在细胞(例如T细胞)的表面上表达。可以通过测量在抗原阳性和抗原阴性靶细胞存在的情况下的T细胞活化水平来确定特异性。抗原阴性靶细胞的最小识别被定义为在相同条件下和在治疗相关的TCR浓度下测量时低于存在抗原阳性靶细胞时产生的水平的20％，优选低于10％、优选低于5％、并且更优选低于1％的T细胞活化水平。对于与免疫效应子相关联的可溶性TCR，治疗相关浓度可以定义为10-9M或更低的TCR浓度，和/或大于相应EC50值的高达100倍、优选高达1000倍的浓度。优选地，对于与免疫效应子相关联的可溶性TCR，针对抗原阳性细胞对比针对抗原阴性细胞，所需的T细胞活化浓度上至少存在100倍的差异。可以使用合适的肽浓度通过肽脉冲来获得抗原阳性细胞以获得与癌细胞相当的抗原呈递水平(例如，10-9M肽，如Bossi et al.,(2013)Oncoimmunol.1；(11):26840中所描述)，或者抗原阳性细胞可以天然地呈递所述肽。优选地，抗原阳性细胞和抗原阴性细胞都是人细胞。优选地，抗原阳性细胞是人的癌细胞。抗原阴性细胞优选包括来源于人健康组织的细胞。
另外地或替代地，特异性可以涉及TCR结合至SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)HLA-A*02复合物而不结合至一组替代肽-HLA复合物的能力。这可以通过例如实施例3的Biacore方法来确定。所述组可含有至少5种，优选至少10种可替代肽-HLA-A*02复合物。替代肽可以与SEQ ID NO:1共享低水平的序列同一性，并且可以是天然存在的。替代肽优选衍生自在人健康组织中表达的蛋白质。TCR与SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的结合可以比其他天然呈递的肽HLA复合物高至少2倍，更优选高至少10倍，或高至少50倍或高至少100倍，甚至更优选高至少400倍。
确定TCR特异性的替代的或另外的方法可以是使用连续诱变(例如丙氨酸扫描)来鉴定TCR的肽识别基序。构成结合基序的一部分的残基是不允许替换的残基。不允许替换可以定义为如下肽位置：在该不允许替换中，TCR的结合亲和力相对于非突变肽的结合亲和力降低至少50％，或优选至少80％。在Cameron et al.,(2013),Sci Transl Med.2013 Aug7；5(197):197ra103 and WO2014096803中进一步描述了这种方法。在这种情况下，TCR特异性可以通过鉴定含有替代基序的肽，特别是在人蛋白质组中含有替代基序的肽，并测试这些肽与TCR的结合来确定。TCR与一种或多种替代肽的结合可表明缺乏特异性。在这种情况下，可能需要通过细胞试验进一步测试TCR特异性。
本发明的TCR可具有用作治疗剂的理想的安全性。在这种情况下，TCR可以是可溶形式，并且可以优选地与免疫效应子融合。合适的免疫效应子包括但不限于细胞因子(比如IL-2和IFN-γ)；超级抗原及其突变体；趋化因子(比如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白)；结合至免疫细胞(如T细胞或NK细胞)上的抗原的抗体(例如抗CD3、抗CD28或抗CD16)，包括其片段、衍生物和变体；以及补体激活剂。理想的安全性意味着除了显示良好的特异性外，本发明的TCR还可以通过进一步的临床前安全性测试。这种测试的例子包括：全血测定，以确认在存在全血的情况下细胞因子释放最少，并因此使在体内引起潜在细胞因子释放综合征的风险低；以及同种异体反应性测试，以确认识别替代性HLA类型的可能性低。
本发明的TCR可以适于高产率纯化，特别是可溶形式的TCR。可以基于纯化过程期间保留的物质量来确定产率(即，相对于重折叠前获得的水溶性物质的量的、在纯化过程结束时获得的正确折叠物质的量)，和/或产率可以基于相对于原始培养物体积在纯化过程结束时获得的正确折叠物质的量。高产率意指大于1％，或更优选大于5％，或更高的产率。高产率意指大于1mg/ml，或更优选大于3mg/ml，或大于5mg/ml，或更高的产率。
优选地，本发明的TCR对SLLQHLIGL–HLA-A*02复合物的KD大于(即，强于)非突变或支架TCR，例如在1pM至100μM范围内。在一方面，本发明的TCR对复合物的KD为约(即+/-0％)1pM至约400nM、约1pM至约1000pM、约1pM至约500pM。另外地或可替代地，所述TCR对该复合物的结合半衰期(T1/2)可以在约1分钟至约60小时、约20分钟至约50小时、或约2小时至约35小时的范围内。在一个特别优选的实施例中，本发明的TCR对SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的KD为约1pM至约500pM和/或结合半衰期为约2小时至约35小时。当与治疗剂和/或可检测标记物相关联时，这种高亲和力对于可溶形式的TCR是优选的。
在另一方面，本发明的TCR对复合物可具有约50nM至约200μM、或约100nM至约1μM的KD，和/或对复合物具有约3秒至约12分钟的结合半衰期。这种TCR对于过继性治疗应用可能是优选的。
确定结合亲和力(与平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)的方法是本领域技术人员已知的。在一个优选的实施例中，结合亲和力和结合半衰期分别使用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)或生物层干涉法(Bio-LayerInterferometry，BLI)来确定，例如分别使用BIAcore仪器或Octet仪器来确定。实施例3中提供了一种优选的方法。应当理解，TCR的亲和力加倍导致KD减半。根据ln2除以解离率(koff)计算T1/2。因此，T1/2加倍导致koff减半。TCR的KD和koff值通常对可溶形式(即被截短以去除细胞质和跨膜结构域残基的形式)的TCR进行测量的。为了考虑独立测量之间的变化，尤其是解离时间超过20小时下的相互作用，可以使用相同的测定方案测量给定TCR的结合亲和力和/或结合半衰期数次(例如3次或更多次)，并取结果的平均值。为了比较两个样品(即两个不同的TCR和/或同一TCR的两种制剂)之间的结合数据，优选使用相同的测定条件(例如温度)进行测量，例如实施例3中所述的那些条件。
本发明的某些优选的TCR对SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的结合亲和力和/或结合半衰期显著高于天然TCR。增加天然TCR的结合亲和力通常会降低TCR对其肽-MHC配体的特异性，这在Zhao et al.,(2007)J.Immunol,179:9,5845-5854中得到证实。然而，尽管本发明的这种TCR具有比天然TCR显著更高的结合亲和力，其仍保持对SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的特异性。
某些优选的TCR能够在体外产生针对抗原阳性细胞的高效T细胞应答，特别是那些呈递低水平的癌细胞典型抗原的细胞(即每个细胞大约5-100个抗原，例如50个抗原(Bossiet al.,(2013)Oncoimmunol.1；2(11):e26840；Purbhoo et al.,(2006).J Immunol 176(12):7308-7316))。这种TCR可以是可溶形式并且与免疫效应子(比如抗CD3抗体)连接。测量的T细胞应答可以是T细胞活化标记物(比如干扰素γ或颗粒酶B)的释放、或靶细胞杀伤、或T细胞活化(比如T细胞增殖)的其他量度。优选地，高效应答是EC50值在pM范围内(最优选地，100pM或更低)的应答。
本发明的TCR可以是αβ异二聚体。本发明的α-β异二聚体TCR通常包含α链TRAC恒定结构域序列和/或β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列。恒定结构域可以是全长的，这意味着存在胞外跨膜结构域和胞外胞质结构域，或者它们可以是可溶形式(即不具有跨膜结构域或胞质结构域)。相对于天然TRAC和/或TRBC1/2序列，恒定结构域中的一个或两个可包含突变、替换或缺失。术语TRAC和TRBC1/2也涵盖天然多态性变体，例如TRAC第4位处的N变为K(Bragado et al International immunology.1994 Feb；6(2):223-30)。
对于本发明的可溶性TCR，可通过截短或替换使TRAC的外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键缺失来修饰α和β链恒定结构域序列。α和/或β链恒定结构域序列可以在各恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，例如WO 03/020763中所描述。在一个优选的实施例中，可以通过用半胱氨酸残基替换TRAC的Thr48位和TRBC1或TRBC2的Ser57位来修饰α和β恒定结构域，所述半胱氨酸在TCR的α和β恒定结构域之间形成二硫键。TRBC1或TRBC2可另外包括恒定结构域第75位的半胱氨酸至丙氨酸突变和恒定结构域的第89位的天冬酰胺至天冬氨酸突变。在本发明的αβ异二聚体中存在的胞外恒定结构域中的一个或两个可以在C端或C末端截短，例如截短至多15个、或至多10个、或至多8个或更少的氨基酸。在本发明的αβ异二聚体中存在的胞外恒定结构域中的一个或两个可以在C端或C末端截短例如至多15个、或至多10个或至多8个氨基酸。α链胞外恒定结构域的C端可以截短8个氨基酸。可溶性TCR优选与治疗剂和/或可检测标记物相关联。
αβ异二聚体TCR的恒定结构域可以是全长的，具有跨膜结构域和胞质结构域。这种TCR可以包含对应于自然界中发现的在各α和β恒定结构域之间的二硫键。另外地或可替代地，在胞外恒定结构域之间可以存在非天然二硫键。所述非天然二硫键在WO03020763和WO06000830中进一步描述。非天然二硫键可以在TRAC的Thr48位与TRBC1或TRBC2的Ser57位之间。相对于天然TRAC和/或TRBC1/2序列，恒定结构域中的一个或两个可包含一个或多个突变、替换或缺失。具有全长恒定结构域的TCR优选用于过继性治疗。
本发明的TCR可以是单链形式。单链形式包括但不限于Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ、或Vα-Cα-L-Vβ-Cβ型的αβTCR多肽，其中Vα和Vβ分别为TCRα和TCRβ可变区，Cα和Cβ分别为TCRα和TCRβ恒定区，并且L为接头序列(Weidanz et al.,(1998)JImmunol Methods.Dec 1；221(1-2):59-76；Epel et al.,(2002),Cancer ImmunolImmunother.Nov；51(10):565-73；WO 2004/033685；WO9918129)。在存在的情况下，恒定结构域中的一个或两个(当存在时)可以是全长的，或者它们可以如上所述被截短和/或含有突变。优选地，单链TCR是可溶的。在某些实施例中，本发明的单链TCR可以在各恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，如WO 2004/033685中所描述的。WO2004/033685；WO98/39482；WO01/62908；Weidanz et al.(1998)J Immunol Methods 221(1-2):59-76；Hoo etal.(1992)Proc Natl Acad Sci U S A 89(10):4759-4763；Schodin(1996)Mol Immunol33(9):819-829中进一步描述了单链TCR。
本发明还包括展示本发明的TCR的颗粒以及颗粒文库内的所述颗粒的包涵体。这些颗粒包括但不限于噬菌体、酵母细胞、核糖体或哺乳动物细胞。产生这种颗粒和文库的方法是本领域已知的(例如，参见WO2004/044004；WO01/48145,Chervin et al.(2008)J.Immuno.Methods 339.2:175-184)。
本发明的可溶性TCR可用于将可检测标记物或治疗剂递送至抗原呈递细胞和含有抗原呈递细胞的组织。因此，它们可以(以共价或其他方式)与可检测标记物(用于诊断目的，其中TCR用于检测呈递同源抗原的细胞的存在)；和/或治疗剂；和/或PK修饰部分关联。
PK修饰部分的实例包括但不限于PEG(Dozier et al.,(2015)Int J Mol Sci.Oct28；16(10):25831-64和Jevsevar et al.,(2010)Biotechnol J.Jan；5(1):113-28)、PASylation(Schlapschy et al.,(2013)Protein Eng Des Sel.Aug；26(8):489-501)、白蛋白、和白蛋白结合域、(Dennis et al.,(2002)J Biol Chem.Sep 20；277(38):35035-43)、和/或非结构化多肽(Schellenberger et al.,(2009)Nat Biotechnol.Dec；27(12):1186-90)。其他PK修饰部分包括抗体Fc片段。
用于诊断目的的可检测标记物包括：例如，荧光标记物、放射性标记物、酶、核酸探针和造影剂。
出于某些目的，本发明的TCR可以聚集成包含若干个TCR的复合物，以形成多价TCR复合物。有许多人蛋白质含有可用于生产多价TCR复合物的多聚化结构域。例如，已使用p53的四聚化结构域来生产与单体scFv片段相比表现出血清持久性增加且解离速率显著降低的scFv抗体片段的四聚体(Willuda et al.(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白也具有可用于这种应用的四聚化结构域。与本发明的非多聚体野生型或T细胞受体异二聚体相比，本发明的多价TCR复合物可具有增强的对复合物的结合能力。因此，本发明的TCR多价复合物也包括在本发明内。根据本发明的这种多价TCR复合物特别可用于在体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还可用作生产具有这类用途的其他多价TCR复合物的中间体。
可以与本发明的TCR相关联的治疗剂包括免疫调节剂和效应因子、放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化疗剂(例如顺铂)。为了确保在所需位置发挥毒性作用，毒素可以在与TCR连接的脂质体内，以使得化合物缓慢释放。这将防止在体内转运过程中的损伤作用，并确保毒素在TCR与相关抗原呈递细胞结合后具有最大效应。
合适的治疗剂的实例包括但不限于：
·小分子细胞毒性剂，即具有杀死哺乳动物细胞的能力的分子量小于700道尔顿的化合物。这种化合物还可以含有能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒性剂还包括前药，即在生理条件下衰变或转化以释放细胞毒性剂的化合物。这种药剂的实例包括顺铂、美登素(maytansine)衍生物、雷卡霉素(rachelmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、吉西他滨(gemcitabine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、美法仑(melphalan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、卟吩姆钠光敏素II(sorfimersodiumphotofrin II)、替莫唑胺(temozolomide)、拓扑替康(topotecan)、trimetreate arbourate、奥瑞斯他汀E(auristatin E)、长春新碱(vincristine)和多柔比星(doxorubicin)；
·肽细胞毒素，即具有杀死哺乳动物细胞能力的蛋白质或其片段。例如，蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶；
·放射性核素，即随着α或β粒子或γ射线中的一种或多种的同时发射而衰变的元素的不稳定同位素。例如，碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；可以使用螯合剂来促进这些放射性核素与高亲和力TCR或其多聚体的缔合；
·免疫刺激剂，即刺激免疫应答的免疫效应子分子。例如，细胞因子，比如IL-2和IFN-γ；
·超级抗原及其突变体；
·TCR-HLA融合体，例如与肽-HLA复合物的融合体，其中，所述肽衍生自常见的人病原体，例如埃伯斯坦巴尔病毒(Epstein Barr Virus，EBV)；
·趋化因子，比如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；
·抗体或其片段，包括抗T细胞或NK细胞决定簇抗体(例如抗CD3、抗CD28或抗CD16)；
·具有抗体样结合特征的替代蛋白质支架；
·补充激活剂；
·异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。
一个优选的实施例由与免疫效应子相关联(通常通过与α或β链的N端或C端融合)的本发明的可溶性TCR提供。特别优选的免疫效应子是抗CD3抗体、或所述抗CD3抗体的功能片段或变体(这种TCR抗CD3融合体可以称为ImmTACTM分子)。如本文所用，术语“抗体”涵盖这种片段和变体。抗CD3抗体的实例包括但不限于OKT3、UCHT-1、BMA-031和12F6。适用于本文所述的组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括微型抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、dsFv和scFv片段、NanobodiesTM(这些构建体由Ablynx(比利时)销售，包含：衍生自骆驼科动物(例如骆驼或美洲驼)抗体和域抗体(Domantis(比利时)的合成的单一免疫球蛋白可变重结构域，包括亲和力成熟的单一免疫球蛋白可变重结构域或免疫球蛋白可变轻结构域)或表现出抗体样结合特性的替代蛋白质支架，例如Affibody(Affibody(瑞典)，其包含工程化蛋白A支架)或Anticalins(Pieris(德国))，其包括工程化的anticalins)，略举数例。
TCR和抗CD3抗体的连接可以通过共价或非共价连接。共价连接可以是直接的，或通过接头序列间接的。接头序列通常是柔性的，因为它们主要由氨基酸(比如不具有可能限制柔性的庞大侧链的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)组成。或者，可以期望具有更大刚性的接头。可以容易地确定可用的或最佳长度的接头序列。通常接头序列的长度小于约12个氨基酸，例如小于10个，或2-10个氨基酸。可用于本发明的TCR的合适接头的实例包括但不限于：GGGGS(SEQ ID NO:31)、GGGSG(SEQ ID NO:32)、GGSGG(SEQ ID NO:33)、GSGGG(SEQ ID NO:34)、GSGGGP(SEQ ID NO:35)、GGEPS(SEQ ID NO:36)、GGEGGGP(SEQ ID NO:37)和GGEGGGSEGGGS(SEQ ID NO:38)(如WO2010/133828中所述)。
本发明的抗CD3-TCR融合构建体的具体实施例包括α链和β链配对的构建体，在该配对中，α链由包含SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列的TCR可变结构域组成和/或β链由包含SEQID NO:9-24的氨基酸序列的TCR可变结构域组成。所述α和β链可以进一步包含含有非天然二硫键的恒定区。α链的恒定结构域可以截短8个氨基酸。α链和/或β链的N端或C端可以通过选自SEQ ID NO:31-38的接头与抗CD3 scFv抗体片段融合。下文提供了这种抗CD3-TCR融合构建体的某些优选实施例：
| α链SEQ ID NO | β链SEQ ID NO |
| SEQ ID NO 25 | SEQ ID NO 26 |
| SEQ ID NO 27 | SEQ ID NO 28 |
| SEQ ID NO 29 | SEQ ID NO 30 |
所述抗CD3-TCR融合构建体的功能变体也包括在本发明的范围内。所述功能变体优选与参考序列具有至少90％的同一性，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，但在功能上仍然等效。
在进一步的方面，本发明提供了编码本发明的TCR、或TCR抗CD3融合体的核酸。在一些实施例中，该核酸是cDNA。在一些实施例中，该核酸可以是mRNA。在一些实施例中，本发明提供了包含编码本发明TCR的α链可变结构域的序列的核酸。在一些实施例中，本发明提供了包含编码本发明TCR的β链可变结构域的序列的核酸。核酸可以是非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的。核酸序列可以根据所用的表达系统进行密码子优化。如本领域技术人员已知的，表达系统可以包括细菌细胞，例如大肠杆菌，或酵母细胞，或哺乳动物细胞，或昆虫细胞，或者该表达系统可以是无细胞表达系统。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸的载体。优选地，该载体是TCR表达载体。合适的TCR表达载体包括，例如，γ-逆转录病毒载体，或更优选地，慢病毒载体。可以在Zhang 2012及其参考文献(Zhang et al,.Adv Drug Deliv Rev.2012 Jun 1；64(8):756–762)中找到更多详细信息。
本发明还提供了携带本发明的载体的细胞，所述载体优选为TCR表达载体。合适的细胞包括哺乳动物细胞，优选为免疫细胞，甚至更优选为T细胞。载体可包含在单个开放阅读框中编码的本发明的核酸，或分别编码α链和β链的两个不同的开放阅读框的本发明的核酸。另一方面提供携带第一表达载体和第二表达载体的细胞，该第一表达载体包含编码本发明TCR的α链的核酸，该第二表达载体包含编码本发明TCR的β链的核酸。这种细胞在过继性治疗中特别有用。本发明的细胞可以是分离的和/或重组的和/或非天然存在的和/或工程化的。
由于本发明的TCR可用于过继性治疗，因此本发明包括非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞，特别是呈递本发明的TCR的T细胞。本发明还提供了呈递本发明的TCR的T细胞扩增群。存在许多适于用编码本发明的TCR的核酸(例如，DNA、cDNA或RNA)转染T细胞的方法(参见例如Robbins et al.,(2008)J Immunol.180:6116-6131)。表达本发明的TCR的T细胞将适用于基于过继性治疗的癌症治疗。如本领域技术人员将知晓的，有许多合适方法可以通过过继性治疗进行(参见例如Rosenberg et al.,(2008)Nat Rev Cancer 8(4):299-308)。
如本领域所熟知的，可以对TCR进行翻译后修饰。糖基化就是这样一种修饰，其包括寡糖部分与TCR链中限定的氨基酸的共价连接。例如，天冬酰胺残基或丝氨酸/苏氨酸残基是熟知的寡糖附着位置。特定蛋白质的糖基化状态取决于许多因素，包括蛋白质序列、蛋白质构象和某些酶的可用性。此外，糖基化状态(即寡糖类型、共价键和附着总数)会影响蛋白质功能。因此，当生产重组蛋白时，通常需要控制糖基化。受控糖基化已被用于改善基于抗体的治疗(Jefferis et al.,(2009)Nat Rev Drug Discov Mar；8(3):226-34.)。对于本发明的可溶性TCR，可以通过例如使用特定细胞系(包括但不限于哺乳动物细胞系，比如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞或人胚肾(Human embryonic kidney，HEK)细胞)或通过化学修饰来控制糖基化。这种修饰可能是可取的，因为糖基化可以改善药代动力学、降低免疫原性并且更接近地模拟天然人蛋白质(Sinclair and Elliott,(2005)Pharm Sci.Aug；94(8):1626-35)。
为了向患者给药，本发明的TCR(优选与可检测标记物或治疗剂相关联或在转染的T细胞上表达)、本发明的TCR抗CD3融合分子、核酸、表达载体或细胞可以作为无菌药物组合物的一部分与一种或多种药学上可接受的运载体或赋形剂一起提供。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于将其给药于患者的所需方法)。其可以以单位剂型提供，通常在密封容器中提供，并且可以作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒会通常(但并非必然)包括使用说明书。它可以包括多个所述单位剂型。
药物组合物可以适于通过任何适当途径的给药，例如肠胃外(包括皮下、肌内、囊内或静脉内)、肠内(包括口服或直肠)、吸入或鼻内途径。这种组合物可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与运载体或赋形剂混合来制备。
本发明的物质的剂量可以在宽限度内变化，这取决于待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和状况等，TCR抗CD3融合分子的合适剂量范围可以在25ng/kg至50μg/kg或1μg至1g的范围内。医师将最终确定所使用的适当剂量。
本发明的TCR、TCR抗CD3融合分子、药物组合物、载体、核酸和细胞可以以基本纯的形式提供，例如纯度为至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
本发明还提供：
·本发明的TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞，该TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞用于医学，优选用于治疗癌症或肿瘤的方法；
·本发明的TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞在制造用于治疗癌症或肿瘤的药物中的用途；
·治疗患者的癌症或肿瘤的方法，包括将本发明的TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞给药至患者；
·用于向人对象给药的可注射制剂，该可注射制剂包含本发明的TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞。
癌症可以是实体瘤或液体肿瘤。优选的，肿瘤表达PRAME。癌症可以是乳腺癌(包括三阴性)、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、肺癌(NSCLC和SCLC)、膀胱癌或头颈癌。替代地或另外地，癌症可以是白血病或淋巴瘤。在这些癌症中，乳腺癌(包括三阴性)、卵巢癌和子宫内膜癌是优选的。本发明的TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞可以通过注射给药，例如静脉内或直接肿瘤内注射。人对象可以是HLA-A*02亚型。
治疗方法可进一步包括分开、联合或依次给药另外的抗肿瘤剂。这种试剂的实例是本领域已知的，并且可以包括免疫激活剂和/或T细胞调节剂。
本发明的每个方面的优选特征在细节上作必要修改后用于每个其他方面。本文提到的现有技术文件在法律允许的最大范围内并入本文。
附图说明
图1-提供了支架PRAME TCRα和β链的胞外区的氨基酸序列；
图2-提供了支架PRAME TCRα和β链的可溶形式的胞外区的氨基酸序列；
图3-提供了突变的PRAME TCRα链可变区的示例性氨基酸序列；
图4-提供了突变的PRAME TCRβ链可变区的示例性氨基酸序列；
图5-提供了包含如图3和图4所示的某些突变的PRAME TCR可变结构域的ImmTAC分子(TCR抗CD3融合物)的氨基酸序列；
图6-提供了证明图5的ImmTAC分子的效力和特异性的细胞数据，该ImmTAC分子包含如图3和图4所示的突变的PRAME TCR可变结构域；
图7(组a和组b)-提供了证明图5的ImmTAC分子的特异性的细胞数据，该ImmTAC分子包含如图3和图4所示的突变的PRAME TCR可变结构域；
图8-提供了证明通过图5的ImmTAC分子杀死PRAME阳性黑素瘤癌细胞的细胞数据，该ImmTAC分子包含如图3和图4所示的突变的PRAME TCR可变结构域；
图9-提供了证明通过图5的ImmTAC分子杀死PRAME阳性肺癌细胞的细胞数据，该ImmTAC分子包含如图3和图4所示的突变的PRAME TCR可变结构域。
在以下非限制性实施例中进一步描述本发明。
具体实施方式
实施例
实施例1-可溶性TCR的表达、重折叠和纯化
方法
使用标准方法(如Sambrook,et al.Molecular cloning.Vol.2.(1989)New York:Cold spring harbour laboratory press中所描述)将编码本发明的可溶性TCR的α和β胞外区的DNA序列分别克隆到基于pGMT7的表达质粒中。将表达质粒分别转化到大肠杆菌菌株Rosetta(BL21pLysS)或T7 Express中，并且使单个氨苄青霉素抗性菌落在TYP(+氨苄青霉素100μg/ml)培养基中于37℃下生长至OD600为约0.6-0.8，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导3小时后通过离心收获细胞。根据制造商的说明书，用BugBuster蛋白提取试剂(Merck Millipore)裂解细胞团块。通过离心回收包涵体团块。将团块在Triton缓冲液(50mM Tris-HCI pH8.1,0.5％Triton-X100，100mM NaCl，10mM NaEDTA)中洗涤两次，并最终重悬于不含洗涤剂的缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.1，100mM NaCl，10mM NaEDTA)中。通过用6M盐酸胍溶解并测量OD280来对包涵体蛋白质产率定量。然后使用消光系数计算蛋白质浓度。通过用8M尿素溶解并在还原条件下将约2μg加载到4％-20％SDS-PAGE上来测量包涵体纯度。然后使用密度测定软件(Chemidoc，Biorad)估算或计算纯度。将包涵体储存于+4℃下以进行短期储存，储存于-20℃或-70℃下以进行长期储存。
对于可溶性TCR重折叠，首先将含有α链和β链的包涵体混合并稀释到10ml增溶/变性缓冲液(6M盐酸胍，50mM Tris HCl pH8.1，100mM NaCl，10mM EDTA，20mM DTT)中，然后在37℃下孵育30分钟。然后通过进一步稀释到1L重折叠缓冲液(100mM Tris pH8.1，800mM或1000mM L-精氨酸HCL，2mM EDTA，4M尿素，10mM半胱胺盐酸盐和2.5mM胱胺二盐酸盐)中并将溶液充分混合来引发重折叠。将重折叠的混合物在5℃±3℃下对10L H2O透析18-20小时。此后，将透析缓冲液用10mM Tris pH8.1(10L)更换两次，并继续再透析15小时。然后将重折叠混合物通过0.45μm纤维素过滤器过滤。
通过将透析后的重折叠物施加到
50HQ阴离子交换柱上，并且使用
Pure(GE Healthcare)用0-500mM NaCl梯度的20mM Tris pH8.1溶液以6柱体积洗脱结合的蛋白来启动可溶性TCR的纯化。通过SDS PAGE鉴定峰值TCR级分，然后将其合并并浓缩。接着将浓缩的样品施加到在Dulbecco's PBS缓冲液中预平衡的
200Increase 10/300GL凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。合并峰值TCR级分并浓缩，并计算纯化物质的最终产率。
实施例2-ImmTAC分子(可溶性TCR抗CD3融合分子)的表达、重折叠和纯化
方法
除了TCRβ链通过接头与抗CD3单链抗体融合之外，如实施例1所述进行ImmTAC制备。此外，在阴离子交换后的纯化过程中进行阳离子交换步骤。在这种情况下，将来自阴离子交换的峰值级分在20mM MES(pH6.5)中稀释20倍，并施加到
50HS阳离子交换柱上。用0-500mM NaCl梯度的20mM MES溶液洗脱结合蛋白。合并峰值ImmTAC级分并调节至50mM Tris pH8.1，然后浓缩并如实施例1中所述直接施加到凝胶过滤基质上。
实施例3-结合表征
使用BIAcore 3000或BIAcore T200仪器通过表面等离子体共振或使用ForteBioOctet仪器通过生物层干涉测量来进行纯化的可溶性TCR和ImmTAC分子结合至相关肽-HLA复合物的分析。将生物素化的I类HLA-A*02分子用目标肽重折叠并使用本领域技术人员已知的方法(O’Callaghan et al.(1999).Anal Biochem 266(1):9-15；Garboczi,et al.(1992).Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3429-3433)进行纯化。所有测量均在25℃下在补充有0.005％P20的Dulbecco's PBS缓冲液中进行。
BIAcore方法
将生物素化的肽-HLA单体固定在链霉亲和素偶联的CM-5传感器芯片上。使用连续稀释的可溶性TCR/ImmTAC来测定平衡结合常数，该可溶性TCR/ImmTAC以30μl/min的恒定流速注射至涂覆有约200个响应单位(Responseunit，RU)的肽-HLA-A*02复合物的流动细胞。通过减去在含有无关肽-HLA的对照流动细胞上的大量缓冲液响应，针对每个TCR浓度对平衡响应进行归一化。使用Prism软件和Langmuir结合等温线通过非线性曲线拟合来获得KD值，结合＝C*Max/(C+KD)，其中“结合”是注射的TCR浓度C下的平衡结合，并且Max是最大结合。
对于高亲和力相互作用，通过单循环动力学分析来确定结合参数。使用50-60μl/min的流速，在涂覆有约100RU-200RU的肽-HLA复合物的流动细胞上注射五种不同浓度的可溶性TCR/ImmTAC。通常，以50nM-100nM的最高浓度注射60μl-120μl可溶性TCR/ImmTAC，依次进行2倍稀释用于其他四次注射。首先注入最低浓度。然后，为了测量解离相，注入缓冲液直至发生≥10％解离，通常在1-3小时后。使用
软件计算动力学参数。将解离相拟合为单个指数衰减方程，从而能够计算半衰期。平衡常数KD由koff/kon计算。
Octet方法
将1nm生物素化的肽-HLA单体捕获于用链霉亲和素预先固定的(SA)链霉亲和素生物传感器(Pall ForteBio)上。将传感器用游离生物素(2μM)封闭2分钟。通过将加载好的生物传感器浸入在96孔或384孔样品板中连续稀释的可溶性TCR/ImmTAC中来测定平衡结合常数。将平板摇动设定为1000rpm。对于低亲和力相互作用(μM范围)，使用短缔合时间(约2分钟)和短解离时间(约2分钟)。使用Octet数据分析软件(Pall ForteBio)通过减去加载有无关pHLA的参考生物传感器的双参照来处理结合曲线。从拟合至等式“响应＝Rmax*浓度/(KD+浓度)”的稳定状态图上，使用平衡时的响应(nm)来估计KD值，其中，“响应”是在每种TCR浓度(conc)下以nm计的平衡结合，并且Rmax是pHLA饱和时的最大结合响应。
对于高亲和力相互作用(nM-pM范围)，动力学参数是由≥3TCR/ImmTAC浓度(通常为10nM、5nM和2.5nM)的结合曲线来确定的。缔合时间为30分钟，解离时间为1-2小时。通过减去加载有无关pHLA并用生物素封闭的参考生物传感器的双参照来处理结合曲线。使用Octet数据分析软件(Pall ForteBio)通过直接全局拟合为结合曲线来计算动力学参数kon和koff。从koff/kon计算KD，并且从t1/2＝0.693/koff计算解离半衰期。
实施例4-天然TCR的结合表征
根据实施例1中描述的方法制备可溶性天然TCR，并根据实施例3分析与pHLA的结合。α和β链的氨基酸序列对应于图2中所示的氨基酸序列。用PRAME肽SLLQHLIGL(SEQ IDNO:1)制备可溶性生物素化的HLA-A*02，并将其固定在BIAcore传感器芯片上。
结果
在各种浓度下测定了结合，并且相互作用的KD值测定为141μM。使用实施例3的平衡BIAcore方法针对一组14种不相关的肽HLA-A*02复合物评估交叉反应性(特异性)。将14种不相关的pHLA分成三组，并加载到三种流动细胞中的一种上，每种流动细胞供给大约1000RU的每种pHLA。在所有流动细胞中以20μL/min的速率以及130μM和488μM的浓度注射30μL可溶性野生型TCR。在任一浓度下均未检测到显著结合，表明天然TCR对SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物具有特异性。
这些数据表明该天然TCR具有适合用作用于工程化的高亲和力治疗性TCR的起始序列的特征。
实施例5-本发明的某些突变的TCR的结合表征
使用分别在图3和图4中提供的突变的TCRα和β可变结构域氨基酸序列(SEQ IDNO:6-24)来制备ImmTAC分子。注意，在大肠杆菌中，发现在α链的起始处(相对于SEQ ID NO:2的编号为第-1位)包含甘氨酸残基改善了生产过程中的N末端甲硫氨酸的切割效率。无效切割可能对治疗不利，因为它可能导致异质蛋白产物，和/或起始甲硫氨酸的存在可能在人体中是致免疫的。图5提供了包含以下α和β链的ImmTAC分子的完整氨基酸序列。
·a28b50–ImmTAC1
·a79b74–ImmTAC2
·a79b46–ImmTAC3
如实施例2中所述制备分子，并根据实施例3来确定与SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物的结合。
结果
下表中呈现的数据显示，包含所示的TCR可变结构域序列的ImmTAC分子识别了具有特别合适的亲和力和/或半衰期的SLLQHLIGL-HLA-A*02复合物。
实施例6-本发明的某些突变的TCR的效力和特异性表征
评估包含与实施例5中所述相同的TCR可变结构域序列的ImmTAC分子介导CD3+T细胞对PRAME阳性癌细胞的有效和特异性重定向的能力。干扰素-γ(IFN-γ)释放被用作T细胞激活的读数。图5提供了包含以下α和β链的ImmTAC分子的完整氨基酸序列。
·a28b50–ImmTAC1
·a79b74–ImmTAC2
·a79b46–ImmTAC3
根据制造商的说明书，使用人IFN-γELISPOT试剂盒(BD Biosciences)进行测定。简而言之，在测定培养基(含有10％热灭活的FBS和1％青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺的RPMI1640)中以1x106/ml的密度制备靶细胞，并以50μl体积每孔50,000个细胞铺板。将从新鲜供体血液中分离的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)用作效应细胞，并以每孔50μl体积50,000个细胞铺板(每个实验所用的确切的细胞数目取决于供体，并且可以进行调整以在适于测定的范围内产生响应)。对ImmTAC分子进行滴定以得到覆盖预期的临床相关范围的10nM、1nM、0.1nM、0.01nM和0.001nM的最终浓度，并以50μl体积添加到孔中。
根据制造商的说明书制备板。将靶细胞、效应细胞和ImmTAC分子添加到相关的孔中，并用测定培养基补足至终体积为200μl。所有反应以一式三份进行。还制备了对照孔，省去了ImmTAC、效应细胞或靶细胞。然后将平板孵育过夜(37℃/5％CO2)。第二天，用洗涤缓冲液(1×PBS小袋，含有0.05％吐温-20，在去离子水中配制)将板洗涤三次。然后将初级检测抗体以50μl的体积加入到每个孔中。将板在室温下孵育2小时，然后再次洗涤三次。通过向各孔中添加50μl稀释的链霉亲和素-HRP，在室温下孵育1小时，并重复洗涤步骤，来进行二次检测。在使用前不超过15分钟，向每1ml AEC底物中添加一滴(20μl)AEC发色团并混合，并向每个孔中添加50μl。定期监测点显影，并将板在自来水中洗涤以终止显影反应。接着将板在室温下干燥至少2小时，然后使用CTL分析仪(Cellular Technology Limited)通过免疫印迹软件来计算点。
在该实施例中，以下癌细胞系被用作靶细胞：
·Mel624(黑色素瘤)PRAME+ve HLA-A*02+ve
·Granta519(血淋巴细胞)PRAME-ve HLA-A*02+ve
·SW620(结肠癌)PRAME-ve HLA-A*02+ve
·HT144(黑色素瘤)PRAME+ve HLA-A*02-ve
结果
包含下表中所示的α和β可变结构域的ImmTAC分子中的每个均证明了在抗原阳性Mel624细胞的存在下有效激活了重定向的T细胞。在每种情况下，EC50值是根据数据计算得出的，并显示在下表中。另外，每个ImmTAC分子证明了在浓度高达1nM时，对两种抗原阴性的HLA-A*02阳性细胞的识别最小或不识别。ImmTAC分子也证明了不识别HLA-A*02阴性的PRAME阳性细胞(数据未显示)。图6示出了下表中列出的四个ImmTAC分子的代表性数据。
| α链(SEQ ID NO) | β链(SEQ ID NO) | EC<sub>50</sub>(mel624) |
| a28(SEQ ID NO:6) | b50(SEQ ID NO:9) | 34.8pM |
| a28(SEQ ID NO:6) | b60(SEQ ID NO:19) | 31.7pM |
| a28(SEQ ID NO:6) | b74(SEQ ID NO:17) | 24.3pM |
| a28(SEQ ID NO:6) | b75(SEQ ID NO:20) | 13.9pM |
| a28(SEQ ID NO:6) | b57(SEQ ID NO:10) | 13.4pM |
| a28(SEQ ID NO:6) | b58(SEQ ID NO:21) | 12pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b46(SEQ ID NO:11) | 18.6pM |
| a109(SEQ ID NO:8) | b46(SEQ ID NO:11) | 60.1pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b63(SEQ ID NO:22) | 22.9pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b64(SEQ ID NO:12) | 27.5pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b66(SEQ ID NO:23) | 16.7pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b67(SEQ ID NO:13) | 26.3pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b69(SEQ ID NO:14) | 39.8pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b71(SEQ ID NO:15) | 31.8pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b58(SEQ ID NO:21) | 10.6pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b73(SEQ ID NO:16) | 23.1pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b74(SEQ ID NO:17) | 9.55pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b75(SEQ ID NO:20) | 23.6pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b76(SEQ ID NO:24) | 17.2pM |
| a79(SEQ ID NO:7) | b77(SEQ ID NO:18) | 13.8pM |
这些数据证明了包含本发明的突变的TCR可变结构域序列的ImmTAC分子可以在适于治疗用途的浓度范围内介导针对PRAME阳性、HLA-A*02阳性的癌细胞的有效和特异性T细胞重定向。
实施例7-本发明的某些突变的TCR的进一步特异性表征
为了进一步证明包含突变的TCR序列的ImmTAC分子的特异性，使用与实施例6中描述的相同的ELISPOT方法，用一组来自人健康组织的正常细胞作为靶细胞进行了进一步的测试。
·正常组织包括心血管、肾、骨骼肌、肺、脉管系统、肝以及脑。在每种情况下，将抗原阳性的Mel624癌细胞用作阳性对照。
该实施例中呈现的数据包括包含以下TCRα和β链的ImmTAC分子。
·a28b50
·a79b74
·a79b46
·a79b77
在图5中提供了包含a28b50、a79b74和a79b46的ImmTAC分子的完整氨基酸序列(分别为ImmTAC 1-3)。
结果
图7(组a)中呈现的数据表明，相对于抗原阳性癌细胞，浓度高达1nM的包含突变的α和β链a28b50和a79b46的ImmTAC分子对一组8种正常细胞显示出最小的反应性。同样，图7(组b)中的数据表明，相对于抗原阳性癌细胞，浓度高达1nM的包含a28b57和a79b46的ImmTAC分子对一组4种正常细胞显示出最小的反应性。
实施例8-由本发明的某些突变的TCR介导的癌细胞杀伤
使用IncuCyte平台(Essen BioScience)研究了包含突变的TCR序列的ImmTAC分子介导有效重定向T细胞杀伤抗原阳性肿瘤细胞的能力。该测定允许通过显微镜检查来实时检测细胞凋亡标志物Caspase-3/7的释放。
方法
测定使用CellPlayer96孔Caspase-3/7细胞凋亡测定试剂盒(Essen BioScience，目录号4440)来进行并根据制造商的方案来实施。简而言之，将靶细胞(Mel624(PRAME+veHLA-A*02+ve)或NCI-H1755)以每孔10,000个细胞铺板并孵育过夜，以使细胞粘附。制备各种浓度的ImmTAC分子，然后将25μl的每种ImmTAC分子添加到相关的孔中，以使最终浓度在1pM和100pM之间。效应细胞以10：1(每孔100,000个细胞)的效应靶细胞比例使用。还制备了不含ImmTAC的对照样品以及仅包含效应细胞或仅包含靶细胞的样品。制备30μM的NucView测定试剂，并向每个孔中加入25μl，且使最终体积为150μl(得到5μM的最终浓度)。将板放入IncuCyte仪器中，并在3天内每2小时拍摄一次图像(每孔1个图像)。确定每个图像中凋亡细胞的数量并记录为每平方毫米凋亡细胞。测定以一式三份进行。
该实施例中呈现的数据包括包含以下TCRα和β链的ImmTAC分子。
·a28b50
·a79b74
·a79b46
在图5中提供了包含a28b50、a79b74和a79b46的ImmTAC分子的完整氨基酸序列(分别为ImmTAC 1、ImmTAC 2和ImmTAC 3)。
结果
图8和图9中呈现的数据示出了在浓度为100pM或更低的包含突变的TCR序列的ImmTAC分子的存在下，对抗原阳性癌细胞(图8中的黑色素瘤细胞系Mel624和图9只能的肺癌细胞系NCI-H1755)的实时杀伤。在ImmTAC分子不存在的情况下未观察到杀伤。
Claims (41)
1.一种T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体(TCR)具有结合至SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)HLA-A*02复合物的性质并且包含TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域，所述TCRα链可变结构域和/或所述TCRβ链可变结构域中的每个包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR为构架区，并且CDR为互补决定区，其中
(a)所述α链CDR具有以下序列：
CDR1–TISGTDY(SEQ ID NO:39)
CDR2–GLTSN(SEQ ID NO:40)
CDR3–CILILGHSGAGSYQLTF(SEQ ID NO:41)
其中任选地有一个或多个突变，
和/或
(b)所述β链CDR具有以下序列：
CDR1–LNHDA(SEQ ID NO:42)
CDR2–SQIVNDF(SEQ ID NO:43)
CDR3–CASSPWTSGSREQYF(SEQ ID NO:44)
其中任选地有一个或多个突变。
2.根据权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域构架区包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:2的第1-25位氨基酸
FR2–SEQ ID NO:2的第33-49位氨基酸
FR3–SEQ ID NO:2的第55-87位氨基酸
FR4–SEQ ID NO:2的第105-114位氨基酸
或与所述序列具有至少90％同一性的各序列，和/或
所述β链可变结构域构架区包含以下序列：
FR1-SEQ ID NO：3的第1-26位氨基酸
FR2-SEQ ID NO：3的第32-48位氨基酸
FR3-SEQ ID NO：3的第56-90位氨基酸
FR4-SEQ ID NO：3的第106-114位氨基酸
或与所述序列具有至少90％同一性的各序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的TCR，其特征在于，所述α链CDR中的所述突变中的一个或多个选自(按照SEQ ID NO：2的编号)：
。
4.根据权利要求3所述的TCR，其特征在于，所述α链CDR中存在1、2、3、4或5个突变，并且所述1、2、3、4或5个突变选自(按照SEQ ID NO：2的编号)：
。
5.根据权利要求4所述的TCR，其特征在于，所述α链CDR具有以下突变组之一(按照SEQID NO：2的编号)：
。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的TCR，其特征在于，所述α链CDR3具有选自以下的序列：
。
7.根据前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，所述β链CDR中的所述突变中的一个或多个选自(按照SEQ ID NO：3的编号)：
。
8.根据权利要求7所述的TCR，其特征在于，所述β链CDR中存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变，并且所述1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变选自(按照SEQ ID NO：3的编号)：
。
9.根据权利要求8所述的TCR，其特征在于，所述β链CDR具有以下突变组之一(按照SEQID NO：3的编号)：
。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的TCR，其特征在于，所述β链CDR2具有选自以下的序列：
。
11.根据权利要求8、9或10所述的TCR，其特征在于，所述β链CDR3具有选自以下的序列：
。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的TCR，其特征在于，所述各β链CDR2和CDR3如下：
13.根据前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR具有以下α链CDR和β链CDR的组合之一：
14.根据前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，使用所述SEQ ID NO:2的编号，所述α链可变区FR1在第-1位具有G残基。
15.根据前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含SEQ IDNO:6-8的氨基酸序列中的任一个，并且所述β链可变结构域包含SEQ ID NO:9-24的氨基酸序列中的任一个。
16.根据前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域和所述β链可变结构域选自以下氨基酸序列：
。
17.根据前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR是具有α链TRAC恒定结构域序列和β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列的α-β异二聚体。
18.根据权利要求17所述的TCR，其特征在于，通过截短或替换使TRAC的外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键缺失来修饰所述α链和β链恒定结构域序列。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的TCR，其特征在于，通过用半胱氨酸残基替换TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57来修饰所述α和/或β链恒定结构域序列，所述半胱氨酸在所述TCR的所述α和β恒定结构域之间形成非天然二硫键。
20.根据前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR为Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ型的单链形式，其中Vα和Vβ分别为TCRα和TCRβ可变区，Cα和Cβ分别为TCRα和TCRβ恒定区，并且L为接头序列。
21.根据前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR与可检测标记物、治疗剂或PK修饰部分相关联。
22.根据权利要求21所述的TCR，其特征在于，抗CD3抗体通过接头序列任选地与所述TCR的所述α链或β链的C端或N端共价连接。
23.根据权利要求21所述的TCR，其特征在于，所述接头序列选自GGGGS(SEQ ID NO:31)、GGGSG(SEQ ID NO:32)、GGSGG(SEQ ID NO:33)、GSGGG(SEQ ID NO:34)、GSGGGP(SEQ IDNO:35)、GGEPS(SEQ ID NO:36)、GGEGGGP(SEQ ID NO:37)和GGEGGGSEGGGS(SEQ ID NO:38)。
24.一种TCR抗CD3融合分子，其中α链可变结构域包含选自SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列，β链可变结构域包含选自SEQ ID NO:9-24的氨基酸序列，并且其中抗CD3抗体通过选自SEQ ID NO:31-38的接头序列与TCRβ链的N端或C端共价连接。
25.根据权利要求24所述的TCR抗CD3融合分子，其特征在于，所述TCR抗CD3融合分子包含：
α链氨基酸序列，所述α链氨基酸序列选自SEQ ID NO:25、27或29，或与SEQ ID NO:25、27和29中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；
和β链氨基酸序列，所述β链氨基酸序列选自SEQ ID Nos:26、28和30，或与SEQ ID Nos:26、28和30中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
26.根据权利要求25所述的TCR抗CD3融合分子，其特征在于，所述TCR抗CD3融合分子包含：
(a)对应于SEQ ID NO:25的α链氨基酸序列和对应于SEQ ID NO:26的β链氨基酸序列；
(b)对应于SEQ ID NO:27的α链氨基酸序列和对应于SEQ ID NO:28的β链氨基酸序列；或
(c)对应于SEQ ID NO:29的α链氨基酸序列和对应于SEQ ID NO:30的β链氨基酸序列。
27.一种核酸，所述核酸编码如前述权利要求中任一项所述的TCRα链和/或TCRβ链。
28.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求27所述的核酸。
29.一种细胞，所述细胞携带：
(a)根据权利要求28所述的表达载体，所述表达载体在单个开放阅读框中或两个不同的开放阅读框中编码如权利要求1至26中任一项所述的TCRα和β链；或
(b)第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码如权利要求1至26中任一项所述的TCR的α链的核酸，所述第二表达载体包含如权利要求1至26中任一项所述的TCR的β链的核酸。
30.一种非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞，尤其是T细胞，所述非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞呈递如权利要求1至20中任一项所述的TCR。
31.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-23中任一项所述的TCR、或如权利要求24-26中任一项所述的TCR抗CD3融合分子、或如利要求29或30所述的细胞，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
32.根据权利要求1至23中任一项所述的TCR、或根据权利要求24-26中任一项所述的TCR抗CD3融合分子、或根据权利要求27所述的核酸、根据权利要求31所述的药物组合物或根据权利要求29或30所述的细胞，在医药中的用途，优选用于人对象。
33.根据权利要求1至23中任一项所述的TCR、或根据权利要求24-26中任一项所述的TCR抗CD3融合分子、或根据权利要求27所述的核酸、根据权利要求31所述的药物组合物或根据权利要求29或30所述的细胞，在用于治疗癌症或肿瘤的方法中的用途，优选用于人对象。
34.根据权利要求33所述的所述TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或全部的用途，其特征在于，所述人对象患有表达PRAME的肿瘤。
35.用于根据权利要求33或34所述的所述TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或全部的用途，其特征在于，所述肿瘤是实体瘤。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的所述TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或全部的用途，其特征在于，所述人对象是具有HLA-A*02亚型的对象。
37.用于根据权利要求32至36中任一项所述的TCR、TCR抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞的用途，其特征在于，其通过注射给药，例如静脉内或直接瘤内注射。
38.一种治疗患有癌症的人对象的方法，所述方法包括以药学有效剂量的根据权利要求33所述的药物组合物向有需要的所述对象给药。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括分开、联合或依次给药抗肿瘤剂。
40.一种用于向人对象给药的可注射制剂，所述可注射制剂包含根据权利要求1至23中任一项所述的TCR或根据权利要求24-26中任一项所述的TCR抗CD3融合分子。
41.一种生产根据权利要求1至23中任一项所述的TCR或根据权利要求24-26中任一项所述的TCR抗CD3融合分子的方法，所述方法包括a)使根据权利要求29所述的细胞保持在用于表达TCR链酸的最优条件下，以及b)分离所述TCR链。
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