CN117624340A - 识别人乙型肝炎病毒（hbv）抗原的t细胞受体（tcr）及其用途 - Google Patents
识别人乙型肝炎病毒（hbv）抗原的t细胞受体（tcr）及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及识别人乙型肝炎病毒（HBV）抗原的T细胞受体（TCR）及其用途。具体地，本发明所述T细胞抗原受体（TCR）包括α链的CDR1、CDR2和CDR3以及β链的CDR1、CDR2和CDR3；所述α链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2‑4、SEQ ID NO.15‑17、SEQ ID NO.23‑25或SEQ ID NO.31‑33所示；所述β链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.5‑7、SEQ NO.18‑20、SEQ NO.26‑28或SEQ NO.34‑36所示。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及识别人乙型肝炎病毒（HBV）抗原的T细胞受体（TCR）及其用途。
背景技术
乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个重大的全球公共卫生问题，全球估计有2.96亿人长期感染，每年约有82万人因此而死亡。在大约5%的受感染成人中，因免疫系统不足以抵抗HBV感染而导致慢性乙型肝炎。针对慢性乙型肝炎感染的治疗方法包括核苷或核苷酸类似物（NUC）。NUC通过抑制逆转录来控制HBV感染，但不能完全根除。目前的抗病毒治疗在从感染细胞核中消除HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）方面效率低下，停用药物后会导致病毒再激活、病毒药物抵抗，而且长期使用抗病毒药物的治疗效果与病毒耐药性和毒性相关，难以实现功能性治愈。此外，HBV感染还会增加宿主细胞基因组的不稳定性，引起宿主DNA的表观遗传学重塑，并通过整合或诱导宿主基因突变，导致肝细胞恶性转化。另一方面，肝脏微环境在HBV感染诱导的慢性炎症、病毒与先天免疫细胞和适应性免疫细胞之间的相互作用下发生改变。肝脏微环境的改变有助于病毒逃避免疫监测，并促进疾病从炎症演变为肝细胞癌（HCC），HBV感染是HCC最主要的高危因素（约占80%）。手术切除、化疗和放疗作为HCC的常规治疗方法主要用于极早期至中期疾病进展的HCC患者，然而晚期HCC及肝移植后复发患者的治疗选择十分有限。
T细胞受体（T cell receptor，TCR）工程T细胞疗法是从患者的外周血中分离T细胞，然后对T细胞进行特异性TCR改造，并将这些自体工程化T细胞重新输注到患者体内的疗法。TCR-T细胞疗法的核心是选择适当的靶点以将T细胞重定向。研究表明，HBV表面抗原（HBsAg）已被用作TCR-T治疗HBV-HCC的靶点，3例肝移植后的乙肝病毒相关肝细胞癌（HBV-HCC）患者应用HBsAg特异性TCR重定向的T细胞免疫治疗的分析结果表明了这一疗法安全且有效。另一项开放的、剂量递增的I期临床研究（NCT03899415）共纳入了8例晚期HBV-HCC患者，研究者通过过继转移表达HBV特异性TCR的自体T细胞对患者进行治疗。结果表明，在晚期HBV-HCC患者中过继转移HBV-TCR-T细胞对患者而言是安全的、可耐受的、有治疗效果的。
TCR-T的活化依赖于主要组织相容性复合体分子（MHC）将抗原肽呈递给TCR-T，从而实现对肿瘤细胞的靶向杀伤。在人体中，MHC分子也称人类白细胞抗原或HLA。现有报道的HBV TCR-T细胞疗法的研究主要局限在HLA-A*02人群，对其它HLA人群的关注不足。HLA-A*02分子在西方人群中占优势（约25%），而中国人群中占据优势的是HLA-A*11分子（约21%）。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种可特异性地与靶细胞上对应地HBV表位肽/HLA-A*02:01复合物或HBV表位肽/HLA-A*11:01复合物高亲和力结合的T细胞抗原受体（TCR），转染TCR的效应T细胞被激活后看释放高水平的细胞因子IFNγ、CD107a、TNFα，显著地杀伤靶细胞。
具体地，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种靶向HBV的T细胞抗原受体（TCR），所述T细胞抗原受体（TCR）包括α链的CDR1、CDR2和CDR3以及β链的CDR1、CDR2和CDR3；所述α链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4-6（ZZ1）、SEQ ID No.12-14（ZZ2）、SEQ ID No.20-22（ZZ3）或SEQ ID No.28-30（ZZ4）所示；所述β链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次如SEQID No.7-9（ZZ1）、SEQ No.15-17（ZZ2）、SEQ No.23-25（ZZ3）或SEQ No.31-33（ZZ4）所示。
优选地，所述ZZ1、ZZ2、ZZ4是HLA-A*11:01限制型的TCR。
优选地，所述ZZ3是HLA-A*02:01限制型的TCR。
优选地，所述α链可变区的氨基酸序列与SEQ ID No.10、18、26或34所示序列具有至少80％、85%、90%、95%或更高的同源性。优选地，所述β链可变区的氨基酸序列与SEQ IDNo.11、19、27或35所示序列具有至少80％、85%、90%、95%或更高的同源性。
优选地，所述α链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.10、18、26或34所示序列。
优选地，所述β链可变区的氨基酸序列与SEQ ID No. 11、19、27或35所示序列。
优选地，所述α链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID No.36所示序列。
优选地，所述β链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID No.37所示序列。
优选地，所述α链和β链之间直接连接或间接连接。
优选地，所述α链和β链之间通过自断裂肽间接连接。
优选地，所述α链和β链的连接顺序可以是α链-自断裂肽-β链，或者，β链-自断裂肽-α链。
本发明具体实施例中使用了fp2A （furin-SGSG-p2A）作为自断裂肽。
具体地，本发明具体实施例中按照“α链-自断裂肽-β链”的方式连接，完整的TCR的氨基酸序列如SEQ ID No.40（ZZ4）所示。
本发明所述术语“T细胞抗原受体（TCR）”是T细胞识别靶细胞表面特异性抗原的蛋白分子。TCR的α链和β链的V区（可变区）包含互补决定区（complement-determiningregions，CDRs）和抗体骨架区（Framework region，FR），其中，CDRs的氨基酸序列决定了该抗体结合抗原的特异性，FR的主要作用是稳定CDRs的空间构型，以利于CDRs与抗原决定簇间的结合。
优选地，所述TCR是可溶性TCR。
另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白含有前述TCR。
优选地，所述融合蛋白还含有抗体。
优选地，所述融合蛋白还含有CD3激动剂。
优选地，所述融合蛋白还含有特异性靶向CD3的抗体。
优选地，所述抗体包括单链抗体（Single chain fragment variable，scFv）、单克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体。
优选地，所述抗体是单链抗体。
优选地，所述抗体是人源化抗体。
CD3抗原存在于成熟的人类T细胞、胸腺细胞和一个子集的天然杀伤细胞上。它与TCR相关并参与TCR的信号转导。对人类CD3抗原特异性的抗体是众所周知的。
另一方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述TCR。
在本发明中，“核酸分子”或“核酸”可交换使用，其是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA或RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。
另一方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带前述核酸分子，或者，所述重组质粒表达前述TCR。
优选地，所述重组质粒包括细菌质粒载体、噬菌体载体、酵母质粒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。
在一些实施方式中，本发明所述重组质粒中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和其他表达控制元件（例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等）。
本发明的重组质粒或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞或以任何方式进入宿主细胞内，用于保存或表达TCR等目的。用于引入基因工程改造的组分（例如本发明所述TCR）的各种方法是熟知的，并可用于本文提供的方法和组合物。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的方法，包括经由病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒，非病毒载体或转座子系统。基因转移的方法可以包括转导、电穿孔或导致基因转移到细胞中的其他方法。
另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有前述重组质粒或核酸分子，或者，所述宿主细胞表达（携带）前述TCR。
优选地，所述宿主细胞是T细胞。
优选地，所述T细胞可以是分离自人体组织、细胞群，或由体外培养获得，例如由干细胞诱导分化得到的，或者所述宿主细胞也可以是成熟的商品化细胞系产品。优选地，所述T细胞来源于外周血。
优选地，当所述宿主细胞是T细胞时，也可以称为T细胞受体工程化T细胞（TCR-Tcell）。
另一方面，本发明提供了一种治疗乙型肝炎病毒（HBV）相关疾病的药物组合物，所述药物组合物中含有前述TCR、核酸分子、重组质粒、宿主细胞中的至少一种。
优选地，所述乙型肝炎病毒（HBV）相关疾病包括急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭、肝癌等。
在本发明中，“药物组合物”可指用于疾病的治疗，也可用于细胞的体外培养实验。用于疾病的治疗时，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的辅料相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体辅料、细碎固体辅料或这两者相结合，制备组合物。
优选地，所述药物组合物进一步包括：药学上可接受的辅料。
在本发明中，术语“药学上可接受的辅料”或者“药学上可接受的载体”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。
另一方面，本发明提供了前述TCR、核酸分子、重组质粒、宿主细胞、药物组合物在制备治疗乙型肝炎病毒（HBV）相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述乙型肝炎病毒（HBV）相关疾病是急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭、肝癌等。
另一方面，本发明提供了一种制备用于治疗乙型肝炎病毒（HBV）相关疾病的细胞的方法，所述方法包括将前述核酸分子、重组质粒导入细胞的步骤。
优选地，所述细胞是T细胞，更具体的是TCR-T细胞。
优选地，所述方法还包括诱导蛋白表达的步骤。
优选地，所述乙型肝炎病毒（HBV）相关疾病是急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭、肝癌等。
另一方面，本发明还提供了一种治疗乙型肝炎病毒（HBV）相关疾病的方法，所述方法包括对受试者施用前述TCR、核酸分子、重组质粒、宿主细胞、药物组合物中的至少一种。
具体地，所述受试者疑似患有/患有乙型肝炎病毒（HBV）相关疾病。本发明所述乙型肝炎病毒（HBV）相关疾病是指乙型肝炎病毒感染引起或加重的疾病或病症、或者，是指HBV感染是其风险因素的疾病或病症；具体例如急性肝炎（包括急性乙型肝炎）、慢性肝炎（包括慢性乙型肝炎）、肝硬化、肝脏瘢痕形成（肝硬化）、肝癌（包括肝细胞癌）等。
附图说明
图1是自制四聚体与商业化四聚体检测结果差异图。
图2是HBV特异性T细胞的流式检测结果图。
图3是HBV特异性T细胞的细胞因子IFN-γ的检测结果图。
图4是TCR的结构示意图。
图5是mRNA纯化的结果图。
图6是HLA表达载体的结构示意图。
图7是HLA阳性率的检测结果图。
图8是表达TCR的NFAT-Luc Jurkat细胞流式检测结果图。
图9是表达TCR的NFAT-Luc Jurkat报告系统检测结果图。
图10是表达TCR的外周血激活T细胞流式检测结果图。
图11是20:1、10:1、5:1、2.5:1、1:1效靶比下TCR-T细胞对负载表位肽的K562细胞的杀伤力检测结果图。
图12是IFN-γ和CD107a的T细胞内染色结果图。
图13是ELISA检测TCR-T分泌IFN-γ细胞因子的结果图。
图14是4-1BB阳性T细胞的流式检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
通用方法：自制四聚体（Tetramer）及性能验证
在本次实验中需要使用多肽自制Tetramer进行流式检测特异性T细胞的扩增，自制Tetramer流程如下：将实验所需试剂拿出并冰浴放置，使温度保持在0℃，使用D-PBS将HBV抗原表位肽稀释到400 μM，冰浴放置待用。取一个底部为V型的96孔板，在孔内分别加入稀释好的HBV抗原表位肽、CMV抗原肽（金斯瑞）及PBS，再向每个孔中加入peptide Flex-TTMmonomer UVX（Biolgend），比例均为1:1，移液枪吹打使混匀。将96孔板进行离心，离心条件为4℃，2500 g，2分钟确保孔中液体离心至孔底。离心结束后，将孔板冰浴状态下正置于紫外灯下紫外（366 nm），照射30 分钟、样品与灯距离为1 厘米。紫外照射结束后，将孔板放置在37℃避光孵育30 分钟，使抗原肽与单体充分结合。用Assay Buffer A稀释制备好的Flex-TTM monomer复合物样品使单体复合物的浓度到50 ng/mL，此为单体复合物样品母液。使用cELISA kit （Biolgend） 及酶标仪检测制备好的Flex-TTM monomer复合物样品OD450及OD570吸光值，比较HBV抗原表位肽与CMV表位肽及UV only组OD值。通过如下公式计算目标肽置换活性率：目标肽置换活性率= (OD450目标 – OD450Neg)/ (OD450Pos –OD450Neg)
通过cELISA确认单体与抗原肽交换充分后，将制备好的 Flex-TTM monomer复合物分别并移到1.5 mL的EP管中，加入偶联有荧光的链霉亲和素PE-streptavidin（Biolgend），避光冰浴30分钟。将D-Biotin和NaN3添加到D-PBS中，涡旋震荡使混匀，此为制备好的封闭液。单体复合物同链霉亲和素孵育结束后，向其中加一定量封闭液，用移液枪上下吹打使充分混匀。在2-8℃环境下继续避光孵育过夜或避光冰浴30 分钟，此步反应后可获得HBV及MAGEA1抗原表位四聚体。使用制备好的MAGEA3四聚体与商业化的MAGEA3四聚体分别对MAGEA3特异性T细胞进行染色，流式检测结果CD8+Tetramer+为特异性T细胞，实验结果见图1。MBL四聚体阳性T细胞比例为0.11%，自制四聚体阳性T细胞分群独立，比例为0.17%。
以上结果证明，本发明制备得到的四聚体（Tetramer）可以有效检测特异性T细胞，可以用于后续实验，以下称为自制Tetramer。
实施例1、扩增HBV特异性T细胞
采集HLA-A*11:01或HLA-A*02:01供者外周血，使用密度梯度离心的方式分离外周血中的PBMC。将分离得到的PBMC按一定细胞密度接种于孔板或瓶中，使用含人血清、GM-CSF（厦门特宝生物工程股份有限公司）及IL-2（北京双鹭药业股份有限公司）等细胞因子的X-VIVO15（LONZA）进行培养。使用DMSO或X-VIVO15溶解HBV表位肽（金斯瑞；SEQ ID No.1-3混合），浓度为100μg/mL。细胞培养至第二天及第四天时，加入过滤后的无菌HBV混合表位肽，终浓度为5μg/mL。
细胞培养周期为14至16天，培养过程中每2-3天观察一次细胞，使用培养基进行半量换液，并使用细胞计数仪记录活细胞密度、细胞悬液体积和细胞活率。在第14天，用鼠抗人CD8抗体 （Biolegend） 及HLA-A*11:01或HLA-A*02:01 HBV表位四聚体（自制）染色对T细胞进行检测。
实验结果如图2所示，样品一为HLA-A*11:01型别，特异性T细胞占比为0.34%。样品二为HLA-A*02:01型别，特异性T细胞比例为0.09%，样品三为HLA-A*11:01型别，特异性T细胞比例为0.87%。
以细胞因子为IFN-γ为检测对象，取一定量细胞并使用X-VIVO15培养基进行洗涤。用含10%FBS的X-VIVO15重悬细胞后，按每孔2x104的细胞数，将细胞接种于Elispot-IFN-γ检测板中（Mabtech）。使用10μg/mL的HBV表位肽（SEQ ID NO: 2）刺激18至24小时后进行抗体孵育及显色。将孔板放置在室温阴凉避光处，待其自然晾干后使用C.T.L S6对免疫斑点进行成像和读取，实验结果如图3，行A为不使用表位肽刺激的T细胞组，B至F图分别为使用不同表位肽刺激T细胞分泌的IFN-γ的斑点，每组设置两个复孔（图中两列）。实验结果显示，表位肽（SEQ ID NO: 2）可使得T细胞IFN-γ分泌增加（D）。
通过流式分选仪分别分选出样品一至样品三中CD8阳性且Tetramer阳性的单个细胞并进行反转录获得cDNA。根据多重PCR原理，扩增出TCRα、β基因片。样品一选择高频克隆ZZ1、ZZ2，样品二选择高频克隆ZZ3，样品三选择ZZ4分别进行IVT质粒合成。
ZZ1的α链如SEQ ID No.10所示，β链如SEQ ID No.11所示，α链CDR1-3依次如SEQID No.4-6所示，β链CDR1-3依次如SEQ No.7-9所示；ZZ2的α链如SEQ ID No.18所示，β链如SEQ ID No.19所示，α链CDR1-3依次如SEQ ID No.12-14所示，β链CDR1-3依次如SEQ No.15-17所示；ZZ3的α链如SEQ ID No.26所示，β链如SEQ ID No.27所示，α链CDR1-3依次如SEQ IDNo.20-22所示，β链CDR1-3依次如SEQ No.23-25所示；ZZ4的α链如SEQ ID No.34所示，β链如SEQ ID No.35所示，α链CDR1-3依次如SEQ ID No.28-30所示，β链CDR1-3依次如SEQ No.31-33所示。
实施例2、表达HBV特异性TCR的体外转录质粒载体构建和mRNA制备
将以上特到的4个HBV特异性TCR的α、β可变区序列分别与小鼠的α恒定区和β恒定区融合，所述α恒定区的序列如SEQ ID No.36所示，所述β恒定区的序列如SEQ ID No.37所示，并将TCRα和TCRβ链用内部自裂解猪捷申病毒 （Porcine teschovirus） 的2A序列连接，结构如图4所示。以ZZ4为例， ZZ4的完整TCR序列如SEQ ID No.40所示。
将TCRα/β在经过密码子优化的外源TCR基因通过基因合成并进行BamHI、SacI限制性内切酶酶切，克隆到pIPM体外转录 （In vitro transcription， IVT） 质粒载体的BamHI和SacI酶切位点之间。BamHI酶切位点下游添加Kozak （GCCACC） 序列，SacI酶切位点上游添加双终止密码子 （TGATAA） 序列。体外转录质粒载体构建后，进行mRNA合成。
mRNA产物纯化结果见图5。结果显示mRNA产物均符合标准，可进行后续实验。
实施例3 、HBV特异性TCR的激活验证
步骤1、制备HLA过表达的K562
为了满足对HLA-A*02:01和HLA-A*11:01限制型TCR序列的功能验证需求，我们在构建了不同HLA亚型的稳转K562细胞株。首先利用293FT工具细胞将HLA表达基因包装成慢病毒，HLA慢病毒表达质粒图谱如图6所示，然后利用慢病毒感染的方式将HLA基因稳定整合到K562细胞的基因组内，使其能够稳定遗传和表达。
通过流式检测其HLA表达强度与阳性率，挑选表达效果最好的细胞，结果如图7所示。K562-HLA-A1101OE细胞HLA阳性率为98.68%；K562-HLA-A0201OE细胞HLA阳性率为98.61%。
步骤2、制备NFAT-Luc Jurkat
基因工程改造的NFAT-Luc Jurkat细胞是一种用于建立新型生物药的发现和开发的产品，可以通过检测Luciferase荧光值验证TCR通路的激活状态。
培养NFAT-Luc Jurkat细胞数量至2×107以上，收集细胞，用DPBS （Cytiva）清洗1遍后用R液（Thermo Fisher Scientific）重悬细胞至2×107/mL，将上述细胞分100μL/份加至1.5mL EP管内，同时加入5μg CD8 mRNA和5μg HBV TCR mRNA，电转杯中加入电转E2溶液（Thermo Fisher Scientific）3mL，将电转杯放入电转仪（Thermo Fisher Scientific）杯槽中，用100μL转枪头吸取细胞混合液，电转条件1400V，20ms，2pulse，将TCR mRNA导入NFAT-Luc Jurkat 细胞中，得到表达TCR的Jurkat 细胞。电转24h后用HBV Tetramer（自制）对上述表达TCR的NFAT-Luc Jurkat细胞染色。染色结果见图8，实验结果显示Jurkat细胞HBV tetramer阳性率为32.62%，表明Jurkat细胞表达ZZ4 TCR，该细胞可用于后续验证实验。
步骤3、TCR通路的激活状态检测及结果
培养改造后的K562细胞数量至1×107以上，收集细胞，1640培养基（ThermoFisher Scientific）清洗1遍并重悬至2×106/mL，吸取上述细胞200μL至48孔细胞培养板，同时加入60μL 200μM的多肽（SEQ ID No.2），1640培养基补齐至400μL，置于37℃二氧化碳培养箱，过夜孵育。
将表达TCR的NFAT-Luc Jurkat细胞与上述K562细胞按照20:1的比例于二氧化碳培养箱共孵育4小时。同时将Bio-Lite检测试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）平衡至室温。待96孔板孵育4 h后取出，DPBS （Cytiva） 清洗一遍，除尽上清。每孔中加入100μLBio-Lite检测试剂。避光静置2-5min，酶标仪检测。
各组NFAT-Luc Jurkat荧光值结果见图9，图A至D为分别表达ZZ1、ZZ2、ZZ3及ZZ4的Jurkat细胞的荧光值图上，组A为表达TCR的Jurkat细胞与负载表位肽的K562共孵育组，组B为表达TCR的Jurkat细胞与未负载表位肽的K562共孵育组，组C为Jurkat细胞与负载表位肽的K562共孵育组，组D为Jurkat细胞与未负载表位肽的K562共孵育组。
实验结果显示表达ZZ4 TCR的Jurkat荧光值最高，是对照组的50倍，后续对ZZ4进行体外功能验证。
实施例4 、TCR-T细胞的杀伤功能评价
1、制备表达TCR的T细胞
通过Ficoll密度梯度离心分离来自健康供体外周血中的PBMC，并将其重悬于XVIVO15培养基中。用磁珠纯化分离T细胞，并用CD3/CD28磁珠激活T细胞，将其重悬于含有2.5%人自体血清及30IU/mL IL-2的XVIVO15培养基中培养三天。第三天收集细胞，DPBS清洗1遍后用R液重悬细胞至2×107/mL，将上述细胞分100μL/份加至1.5mL EP管内，同时加入5μg HBV TCR mRNA，电转杯中加入E2溶液3mL，将电转杯放入电转仪杯槽中，用100μL转枪头吸取细胞混合液，电转参数1400V/10ms/3pulse，将TCR mRNA导入激活T细胞中，得到表达TCR的T细胞。电转24h后用HBV Tetramer（自制）对上述表达TCR的T细胞染色。染色结果见图10，与对照组相比，电转了TCR的T细胞Tetramer阳性率为26.35%，证明激活T细胞可表达待验证ZZ4 TCR，该TCR-T可用于后续实验。
2、准备K562细胞
培养K562细胞数量至1×107以上，收集细胞，1640培养基清洗1遍并重悬至2×106/mL，吸取上述细胞200μL至48孔细胞培养板，同时加入60μL 200μM多肽（SEQ ID No.2）到1640培养基补齐至400μL，置于37℃二氧化碳培养箱，过夜孵育。
3、杀伤效率检测及结果
K562细胞按8×105/mL加入1μL EuTDA染料，置于在二氧化碳培养箱中孵育20分钟，离心，并用1mL 1×PBS清洗细胞3次。最后一次洗涤后，用T细胞培养基重悬细胞。
将表达TCR的T细胞与上述K562细胞按照20:1、10:1、5:1、2.5:1、1:1的比例于37℃二氧化碳培养箱共孵育4h。孵育完毕后，500g室温离心5分钟。吸取20μL上清液转移至EuTDA Cytotoxicity Reagents试剂盒的平底96孔板中，每孔加入200μL Eu溶液，室温250rpm震动孵育10分钟。于5小时内用酶标仪记录在激发光330/80，发射光620/10波长下的荧光值，根据各组荧光值计算杀伤效率，结果见图11，结果显示相比对照组 ，ZZ4 TCR-T对负载HBV表位肽的靶细胞具有明显杀伤效果，杀伤效率最高接近100%。
4、CD107a-violet780、IFN-γ PC7抗体染色
将表达TCR的T细胞与上述K562细胞按照1:1比例混合加入至24孔细胞培养板，加入阻断剂，置于二氧化碳培养箱中孵育3h。细胞孵育完成后收集至对应标记的流式管中，350g 4℃离心5分钟，弃上清，并使用2mL 1×PBS清洗细胞，350g 4℃离心5分钟，弃上清，反复拨弹管底将细胞弹至松散，加入CD107a-violet780、IFN-γ PC7抗体（Biolegend）染色。
染色结果见图12，流式检测结果显示与未经HBV表位肽刺激的T细胞组相比，HBV表位肽（SEQ ID No.2）可刺激表达ZZ4 TCR的T细胞分泌IFN-γ和CD107a。IFN-γ阳性T细胞比例为0.54%，CD107a阳性T细胞比例为6.36%
实施例5、TCR肽敏感性评价
将制备的带有目的TCR的T细胞分别与负载10-5M至10-12M的 HBV表位肽的K562按1:1的比例孵育18至24小时。孵育结束后，收集各组细胞及上清液。使用流式检测细胞CD3+4-1BB+/CD3+比例 （%），绘制拟合曲线估算EC50。通过ELISA检测各组细胞上清中IFN-γ的浓度，绘制拟合曲线估算EC50。具体方法如下：
1、收集K562细胞，使用细胞计数仪计数，记录活细胞密度和细胞活率。清洗细胞1遍后使用RPMI 1640（Thermo）培养基重悬细胞。将5×105的K562接种于24孔板中，共9组。向不同组别加入不同浓度的HBV表位肽，肽终浓度为10-12至10-5 M，负载时间为4小时。收集电转了目的TCR的T细胞，使用细胞计数仪计数，记录活细胞密度和细胞活率。使用含10% FBS（Cytiva）的X-VIVO 15重悬细胞并取2×105的细胞进行Tetramer检测。
2、ELISA检测TCR-T分泌IFN-γ细胞因子：收集负载表位肽的K562，使用含10%FBS的XVIVO 15将密度调至1×106 cells/mL。取100μL细胞悬液加入至96U型孔板中，每组3复孔。使用含10%FBS的XVIVO 15将TCR-T细胞密度调至1×106 cells/mL，取100μL细胞悬液加入至盛有靶细胞悬液的96U型孔板中，混合均匀，效应细胞与靶细胞比例即为1:1。TCR-T与K562共孵育18至24小时后，将96孔板样本离心后，取上清进行ELISA-IFN-γ检测（达科为），取细胞进行流式4-1BB检测。通过ELISA检测TCR-T分泌IFN-γ细胞因子。
3、通过流式检测4-1BB阳性TCR-T。
使用鼠抗人4-1BB （Biolgend）及CD8抗体 （Biolgend）对收集的细胞进行染色，染色结束后通过流式检测4-1BB阳性T细胞比例（CD3+4-1BB+/CD3+）。使用GraphPad Prism 9对结果进行统计，并绘制拟合曲线，IFN-γ分泌拟合曲线如图13所示，4-1BB阳性T细胞比例拟合曲线如图14所示。
实验结果显示，表达ZZ4 TCR的T细胞的IFN-γ浓度及4-1BB阳性T细胞比例均随表位肽（SEQ ID No.2）刺激浓度增加而增加，EC50值约为10-7M。说明ZZ4 TCR对pMHC分子的亲和力较强。
实施例6、TCR基序评价
丙氨酸（Ala）是最小的手性氨基酸，通过将Ala系统性地、依次地替换序列中每一个氨基酸，来分辨出某一特定氨基酸对整个蛋白生物活性的影响。因此，Alanine Scanning是用来鉴别与TCR功能、稳定性和构象密切相关的特定的氨基酸位点的常规方式。本实验中构建的丙氨酸扫描肽库 （Alanine Scanning Library）。
具体操作如下：从健康供体获得血液，通过Ficoll密度梯度离心分离来自供体的PBMC，并将其重悬于XVIVO15培养基中。用磁珠纯化分离T细胞，并用CD3/CD28磁珠激活T细胞，将其重悬于含有2.5%人自体血清及30IU/mL IL-2的XVIVO15培养基中培养三天。第三天收集细胞，DPBS清洗1遍后用R液重悬细胞至2×107/mL，将上述细胞分100μL/份加至1.5mLEP管内，同时加入5μg HBV TCR mRNA，电转杯中加入E2溶液3mL，将电转杯放入电转仪杯槽中，用100μL转枪头吸取细胞混合液，电转条件1400V，10ms，3pulse，将TCR mRNA导入激活T细胞中，得到表达TCR的T细胞。
培养K562细胞至数量1×107以上，收集细胞，1640培养基清洗1遍并重悬至2×106/mL，吸取上述细胞200μL至48孔细胞培养板，同时加入60μL表位肽（SEQ ID No.41-48），1640培养基补齐至400μL，置于37℃二氧化碳培养箱，过夜孵育。
将表达TCR的T细胞与上述K562细胞按照1:2的比例于二氧化碳培养箱共孵育24h，实验结果显示电转ZZ4 TCR mRNA的T细胞可被负载SEQ 39及SEQ43表位肽的靶细胞激活，而对其他组别无反应；因此，ZZ4 TCR的识别基序为-VVRR-FPH（SEQ ID No.49），较为保守，该TCR特异性较强。
Claims (10)
1.一种靶向HBV的T细胞抗原受体，所述T细胞抗原受体包括α链的CDR1、CDR2和CDR3以及β链的CDR1、CDR2和CDR3；所述α链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4-6、SEQID NO.12-14、SEQ ID NO.20-22或SEQ ID NO.28-30所示；所述β链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID No.7-9、SEQ NO.15-17、SEQ NO.23-25或SEQ NO.31-33所示。
2.如权利要求1所述T细胞抗原受体，所述α链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No . 10、18、26或34所示序列。
3.如权利要求1所述T细胞抗原受体，所述β链可变区的氨基酸序列与SEQ ID No. 11、19、27或35所示序列。
4.一种产品，所述产品选自以下任意一种：
1）一种融合蛋白，所述融合蛋白含有权利要求1所述T细胞抗原受体；
2）一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述T细胞抗原受体；
3）一种重组质粒，所述重组质粒携带2）所述核酸分子，或者，所述重组质粒表达权利要求1所述T细胞抗原受体；
4）一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有2）所述核酸分子或3）所述重组质粒，或者，所述宿主细胞表达权利要求1所述T细胞抗原受体。
5.如权利要求4所述产品，所述融合蛋白还含有抗体。
6.如权利要求5所述产品，所述抗体是靶向CD3的抗体。
7.如权利要求4所述产品，所述宿主细胞是T细胞。
8.一种治疗乙型肝炎病毒相关疾病的药物组合物，所述药物组合物中含有权利要求1所述T细胞抗原受体、权利要求4所述融合蛋白、权利要求4所述核酸分子、权利要求4所述重组质粒、权利要求4所述宿主细胞中的至少一种。
9.权利要求1所述T细胞抗原受体、权利要求4所述融合蛋白、权利要求4核酸分子、权利要求4所述重组质粒、权利要求4所述宿主细胞、权利要求8述药物组合物在制备治疗乙型肝炎病毒相关疾病的药物中的应用。
10.如权利要求9所述应用，所述乙型肝炎病毒相关疾病包括急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭、肝癌。
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Citations (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102781961A (zh) * | 2009-11-19 | 2012-11-14 | 新加坡科技研究局 | 乙型肝炎病毒特异抗体和其应用 |
| WO2015042187A1 (en) * | 2013-09-19 | 2015-03-26 | Chrontech Pharma Ab | Treatment of hepatitis d virus infections by redirection of t cells |
| WO2017048902A1 (en) * | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | T-cell receptor (tcr)-binding antibodies and uses thereof |
| CN107921285A (zh) * | 2015-03-25 | 2018-04-17 | Igm生物科学股份有限公司 | 多价乙型肝炎病毒抗原结合分子及其应用 |
| CN108137688A (zh) * | 2015-06-01 | 2018-06-08 | 基因医疗免疫疗法有限责任公司 | 产生抗t细胞受体的抗体的方法 |
| CN108778291A (zh) * | 2016-01-06 | 2018-11-09 | 健康研究公司 | 包含重组t细胞受体的组合物和文库以及使用重组t细胞受体的方法 |
| CN109485721A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-19 | 杜学明 | 一种获得肿瘤特异性t细胞受体的方法 |
| US20190321478A1 (en) * | 2016-12-08 | 2019-10-24 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel t cell receptors and immune therapy using the same |
| CN111148756A (zh) * | 2017-06-20 | 2020-05-12 | 英美偌科有限公司 | T细胞受体 |
| CN111592590A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-28 | 深圳市因诺转化医学研究院 | 识别人乙型肝炎病毒核心抗原的t细胞受体 |
| CN111592589A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-28 | 深圳市因诺转化医学研究院 | 识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr |
| CN112940105A (zh) * | 2019-11-26 | 2021-06-11 | 中国科学院微生物研究所 | HLA-A11限制性乙型肝炎病毒HBc141-151表位肽的T细胞受体及其应用 |
| CN113121676A (zh) * | 2020-01-15 | 2021-07-16 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种靶向巨细胞病毒抗原的特异性t细胞受体及其应用 |
| CN113785065A (zh) * | 2019-03-04 | 2021-12-10 | 大学健康网络 | T细胞受体及其使用方法 |
| CN114085281A (zh) * | 2021-10-15 | 2022-02-25 | 北京臻知医学科技有限责任公司 | 一种肿瘤抗原表位肽及其多聚体和应用 |
| WO2022164805A1 (en) * | 2021-01-26 | 2022-08-04 | Vir Biotechnology, Inc. | Compositions and methods for treating hepatitis b virus infection |
| CN116199766A (zh) * | 2022-06-22 | 2023-06-02 | 清华大学 | 筛选tcr的方法及其分离的tcr |
| CN116693666A (zh) * | 2023-08-02 | 2023-09-05 | 南方医科大学南方医院 | 一种抗乙型肝炎核心抗原的单克隆抗体及其应用 |
| CN117003856A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-07 | 南方医科大学南方医院 | 一种靶向乙肝表面抗原的t细胞受体工程化t细胞 |
| WO2023239290A1 (en) * | 2022-06-05 | 2023-12-14 | Scg Cell Therapy Pte. Ltd. | Hbv surface antigen specific t cell receptors and uses thereof |
-
2024
- 2024-01-23 CN CN202410092757.1A patent/CN117624340B/zh active Active
Patent Citations (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102781961A (zh) * | 2009-11-19 | 2012-11-14 | 新加坡科技研究局 | 乙型肝炎病毒特异抗体和其应用 |
| WO2015042187A1 (en) * | 2013-09-19 | 2015-03-26 | Chrontech Pharma Ab | Treatment of hepatitis d virus infections by redirection of t cells |
| CN107921285A (zh) * | 2015-03-25 | 2018-04-17 | Igm生物科学股份有限公司 | 多价乙型肝炎病毒抗原结合分子及其应用 |
| CN108137688A (zh) * | 2015-06-01 | 2018-06-08 | 基因医疗免疫疗法有限责任公司 | 产生抗t细胞受体的抗体的方法 |
| WO2017048902A1 (en) * | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | T-cell receptor (tcr)-binding antibodies and uses thereof |
| CN108778291A (zh) * | 2016-01-06 | 2018-11-09 | 健康研究公司 | 包含重组t细胞受体的组合物和文库以及使用重组t细胞受体的方法 |
| US20190321478A1 (en) * | 2016-12-08 | 2019-10-24 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel t cell receptors and immune therapy using the same |
| CN111148756A (zh) * | 2017-06-20 | 2020-05-12 | 英美偌科有限公司 | T细胞受体 |
| CN109485721A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-19 | 杜学明 | 一种获得肿瘤特异性t细胞受体的方法 |
| CN113785065A (zh) * | 2019-03-04 | 2021-12-10 | 大学健康网络 | T细胞受体及其使用方法 |
| CN112940105A (zh) * | 2019-11-26 | 2021-06-11 | 中国科学院微生物研究所 | HLA-A11限制性乙型肝炎病毒HBc141-151表位肽的T细胞受体及其应用 |
| CN113121676A (zh) * | 2020-01-15 | 2021-07-16 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种靶向巨细胞病毒抗原的特异性t细胞受体及其应用 |
| CN111592589A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-28 | 深圳市因诺转化医学研究院 | 识别人乙型肝炎病毒核心抗原c18-27表位的特异性tcr |
| CN111592590A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-28 | 深圳市因诺转化医学研究院 | 识别人乙型肝炎病毒核心抗原的t细胞受体 |
| WO2022164805A1 (en) * | 2021-01-26 | 2022-08-04 | Vir Biotechnology, Inc. | Compositions and methods for treating hepatitis b virus infection |
| CN114085281A (zh) * | 2021-10-15 | 2022-02-25 | 北京臻知医学科技有限责任公司 | 一种肿瘤抗原表位肽及其多聚体和应用 |
| WO2023239290A1 (en) * | 2022-06-05 | 2023-12-14 | Scg Cell Therapy Pte. Ltd. | Hbv surface antigen specific t cell receptors and uses thereof |
| CN116199766A (zh) * | 2022-06-22 | 2023-06-02 | 清华大学 | 筛选tcr的方法及其分离的tcr |
| CN116693666A (zh) * | 2023-08-02 | 2023-09-05 | 南方医科大学南方医院 | 一种抗乙型肝炎核心抗原的单克隆抗体及其应用 |
| CN117003856A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-07 | 南方医科大学南方医院 | 一种靶向乙肝表面抗原的t细胞受体工程化t细胞 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LIU Q等: "In vivo therapeutic effects of affinity-improved-TCR engineered T-cells on HBV-related hepatocellular carcinoma", 《 J IMMUNOTHER CANCER》, vol. 8, no. 2, 15 December 2020 (2020-12-15), pages 1 - 13 * |
| 朴文花等: "HLA-A2肽四聚体的构建及其在乙、丙型肝炎中的初步应用", 《中华医学杂志》, no. 21, 15 November 2004 (2004-11-15), pages 1818 - 1822 * |
| 陈剑霞等: "HBV疫苗接种后机体T细胞应答和TCR CDR3受体库特征的研究进展", 《现代免疫学》, vol. 42, no. 3, 31 May 2022 (2022-05-31), pages 259 - 263 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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