CN114917329A - 抗cd87抗体与抗pd1抗体联合治疗胃癌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的抗CD87抗体及其特异性嵌合抗原受体、包含其特异性嵌合抗原受体的CAR‑T细胞及其与抗PD1抗体联合治疗胃癌中的应用。

Description

抗CD87抗体与抗PD1抗体联合治疗胃癌

技术领域

本发明涉及生物与医药技术领域，特别涉及一种新的抗CD87抗体及其特异性嵌合抗原受体、包含其特异性嵌合抗原受体的CAR-T 细胞及其与抗PD1抗体联合治疗胃癌中的应用。

背景技术

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类生命健康。由于胃癌组织的异质性较高，手术、化疗及放疗等传统治疗手段效果不够理想，进展期胃癌五年生存率不足30％，徐瑞华报道了748 例D2胃癌根术后患者的疗效，结果显示Lauren分型为弥漫型的胃癌患者临床预后最差，比肠型胃癌患者5年总体生存率低8％左右。因而，胃癌传统治疗方法效果欠佳，亟待研发新的治疗模式来提高其疗效。

CAR-T疗法是目前治疗肿瘤的新方法。主要应用于血液肿瘤。 2017年美国FDA已经被批准了两款针对CD19靶点治疗白血病与淋巴瘤的CAR-T细胞药物。CAR-T疗法在实体瘤领域进展较慢，主要原因CAR-T细胞在浸润至实体肿瘤组织后会被抑制性肿瘤微环境 (TumorMicroenvironment TME)抑制，科学家们通过在CAR-T 细胞表达趋化因子受体来增强CAR-T细胞向肿瘤的迁移能力和抗肿瘤活性，或者直接靶向与肿瘤微环境相关的蛋白。因而，研究靶向实体瘤及其微环境的CAR-T疗法是未来该领域有待突破的难点。

针对胃癌的CAR-T疗法较多。陈凛组报道了以HER2为靶点的 CAR-T细胞杀伤胃癌细胞作用研究，结果表明体内和体外均具较强的杀伤效果，但HER2在胃癌中的阳性率较低，有报道仅为5％左右。李鹏组报道了以间皮素(Mesothelin)为靶点的胃癌CAR-T研究，在构建的NSI小鼠中展现了很好的杀伤效果，关于胃癌尚未重点关注。李宗海组研制了特异针对Claudin18.2的高亲和力人源化单克隆抗体，并开发了第二代CAR-T细胞进行了体外和体内的抗肿瘤活性研究，结果表明：针对Claudin18.2的CAR-T细胞在人源胃癌PDX小鼠模型中展现出了较好的抗肿瘤活性，关于胃癌也未专门涉及。综上，胃癌CAR-T细胞疗法具有良好的应用前景，然而，针对传统疗法较差的胃癌尚未开发有效的特异性CAR-T细胞疗法。

发明内容

本发明人收集15对病理确诊为胃癌的癌组织和癌旁组织样本，采用非标记定量蛋白质组学法(label-free)筛选到了胃癌特异蛋白 CD87。CD87即PLAUR或uPAR(其在本文互换使用)为尿激酶型血浆纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen，uPA)受体，通过GPI锚定在细胞膜上，在炎症、组织重构和多种癌症中高表达且预后不良。CD87通过与uPA、整合素(integrin)和玻连蛋白 (vitronectin)协同作用调控细胞外基质蛋白质降解和激活多条胞内信号通路，在肿瘤细胞迁移、增殖过程中起重要作用，是治疗癌症潜在靶点。我们研究发现CD87与肿瘤微环境相关，不仅可以参与细胞外基质的降解，而且能够促进免疫细胞浸润，可以作为胃癌CAR-T 治疗的靶点。

目前CAR-T治疗胃癌的临床前研究和临床试验层出不穷，但是针对不同靶点的不同CAR-T治疗策略相对于CAR-T在血液系统肿瘤治疗上取得的成效而言仍然不理想。而CD87在胃癌细胞表面高表达，在正常组织中低表达，靶向CD87可促进细胞外基质的降解，改善肿瘤微环境的物理屏障，可以促进免疫细胞浸润，以此为靶点采用 CAR-T疗法可以攻克肿瘤微环境的物理屏障，取得较好的肿瘤杀伤效果。

因此，在一个方面，本发明提供了一种抗CD87抗体，其包含与 SEQ ID NO：10或14具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的VH 序列和与SEQ ID NO：12或16具有至少90％(例如至少91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的VL序列。

在优选的实施方案中，抗CD87抗体包含SEQ ID NO：10或14 的VH序列和SEQ IDNO：12或16的VL序列。

在另一个方面，本发明提供了一种抗CD87抗体，其包含与SEQ ID NO：2或6具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的重链和与SEQ ID NO：4或8具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的轻链。

在优选的实施方案中，抗CD87抗体包含SEQ ID NO：2或6 的重链和SEQ ID NO：4或8的轻链。

在另一个方面，本发明发现抗CD87抗体可用于改变肿瘤微环境。因此，在一个实施方案中，本发明提供了抗CD87抗体可用于改变肿瘤微环境的用途。在优选的实施方案中，抗CD87抗体是如上文定义的抗CD87抗体。

在另一个方面，本发明提供了如上文定义的抗CD87抗体用于治疗患者(例如人)的胃癌的用途。

在另一个方面，本发明提供了一种CD87特异性嵌合抗原受体 (CAR)多肽，其包含CD87抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在具体的实施方案中，所述CD87抗原结合结构域包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述VH包含与SEQ ID NO： 10或14具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：12或16具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。在优选的实施方案中，VH包含SEQ ID NO：10或14的序列，VL包含SEQ ID NO：12或16的序列。

关于嵌合抗原受体，可参考M.Sadelain，I.Rivière，R.Brentjens， Targetingtumours with genetically enhanced T lymphocytes.Nat. Rev.Cancer 3,35-45(2003)。

在具体的实施方案中，所述CD87特异性嵌合抗原受体(CAR) 多肽还包含信号肽，例如信号肽IL2-SP(例如由SEQ ID NO：18编码的序列或与其具有至少80％的序列同一性的序列)。在具体的实施方案中，所述CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽还包含在 CD87抗原结合结构域的VH和VL之间的接头多肽(例如由SEQ ID NO：19编码的序列或与其具有至少80％的序列同一性的序列)。在具体的实施方案中，所述CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽还包含在CD87抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区，例如 hCD8a铰链(例如由SEQID NO：20编码的序列或与其具有至少80％的序列同一性的序列)。在具体的实施方案中，所述跨膜结构域可以是例如CD8tTM(例如由SEQ ID NO：21编码的序列或与其具有至少80％的序列同一性的序列)。在具体的实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含共刺激结构域和信号传导结构域，所述共刺激结构域可以是例如4-1BB共刺激结构域(例如由SEQ ID NO：22编码的序列或与其具有至少80％的序列同一性的序列)，所述信号传导结构域可以是例如CD3ζ信号传导域(例如由SEQ ID NO：23编码的序列或与其具有至少80％的序列同一性的序列)。

在另一个方面，本发明提供了如上文所述的CD87特异性嵌合抗原受体多肽用于改变肿瘤微环境的用途。

在另一个方面，本发明提供了如上文所述的CD87特异性嵌合抗原受体多肽用于治疗患者(例如人)的胃癌的用途。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸序列，其编码如上文所述的抗体或嵌合抗原受体多肽。

在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含如上文所述的分离的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种细胞，其包含如上文所述的载体。在具体的实施方案中，该细胞选自：αβT细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、先天淋巴细胞(1LC)、细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞、调节性T细胞、或其任何组合。在具体的实施方案中，该细胞表达如上文所述的CD87特异性嵌合抗原受体多肽。

在另一个方面，本发明提供了如上文所述的细胞用于改变肿瘤微环境的用途。

在另一个方面，本发明提供了如上文所述的细胞用于治疗患者的胃癌的用途。

本发明人还令人惊讶地发现，通过靶向CD87，还可以显著改善 PD-1抑制剂在胃癌治疗中的作用。不受理论限制，据信CD87抑制剂通过靶向CD87改变了机体内的肿瘤微环境，从而帮助PD-1抑制剂更好地发挥治疗作用。CD87抑制剂和PD-1抑制剂的这种联合效果，更特别地，协同效果，对于本领域技术人员而言是无法预料到的。

如本文所用，CD87抑制剂可以是抑制CD87的任何试剂。优选地，CD87抑制剂是如上文所述的抗CD87抗体、CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽或包含CD87特异性嵌合抗原受体(CAR) 多肽的细胞。如本文所用，PD-1抑制剂可以是抑制PD-1的任何试剂。优选地，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。

因此，在一个方面，本发明提供了抗CD87抗体、CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽或包含CD87特异性嵌合抗原受体(CAR) 多肽的细胞与PD-1抑制剂联合用于治疗患者的胃癌的用途。在具体的实施方案中，所述抗CD87抗体、CD87特异性嵌合抗原受体(CAR) 多肽或包含CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽的细胞改变患者中的肿瘤微环境。如本文所用，患者可以是任何哺乳动物或非哺乳动物，优选为人。

在优选的实施方案中，所述抗CD87抗体、CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽或包含CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽的细胞是如上文所述的抗CD87抗体、CD87特异性嵌合抗原受体 (CAR)多肽或包含CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽的细胞。

附图说明

图1为本发明提供的CD87在胃癌和正常组中的表达情况。A：利用qRT-PCR验证胃癌患者PLAUR基因表达水平，结果表明 PLAUR在胃癌组织中高表达，在癌旁组织中低表达(P＜0.05，n＝12)。 B、C：利用Western Blot验证胃癌患者PLAUR蛋白表达水平，结果表明PLAUR在胃癌组织中显著高表达，在癌旁组织中低表达 (P＜0.01，n＝8)。

图2为CD87在胃癌细胞系中的表达水平，A：qRT-PCR；B：流式细胞。A：利用qRT-PCR验证PLAUR在胃癌细胞系(MKN-45、 AGS、SNU-216、N87、HGC-27和GES)中的表达水平，结果表明 PLAUR在AGS和SNU-216细胞中高表达。B：利用流式细胞仪检测PLAUR在胃癌细胞系(MKN-45、AGS、SNU-216、N87、HGC-27 和GES)中的表达水平，结果同样表明PLAUR在AGS和SNU-216细胞中高表达。

图3为细胞实验：CD87敲除后抑制肿瘤细胞增殖：A：SNU216； B：AGS。C，D：分别在SNU-216细胞和AGS细胞中敲除PLAUR， MTT结果表明，敲除PLAUR抑制了肿瘤细胞增殖。

图4为动物实验。A：肿瘤体积变化；B：肿瘤重量；C：小动物成像。A：NSG小鼠皮下分别接种MKN-45细胞、MKN-45-PLAUR^-/-和MKN-45-PLAUR^OE细胞，结果表明，在MKN-45细胞中敲除 PLAUR抑制了肿瘤细胞增殖(p＜0.05)，回复PLAUR使得功能恢复。B：小鼠肿瘤组织重量。C：小动物成像结果。

图5：AGS和SNU-216敲除PLAUR之后细胞外基质蛋白表达情况。

图6为CD87单克隆抗体(也称为抗UPAR抗体)制备：A：细胞免疫；B：阳性B细胞筛选及抗体流式验证；C：筛选到的两种高亲和力单克隆抗体。

图7为CD87单克隆流式验证。

图8：抗uPAR抗体与uPA竞争uPAR结合：(A)通过表面等离子共振评估抗uPAR单克隆抗体(mAb)与人uPAR的结合亲和力(KD)。(B-C)免疫荧光(IF)(B)和免疫电子显微镜(C) 分析抗uPAR与表达uPAR的HEK-293T细胞的结合。(D-E) 通过流式细胞术(FCM)(D)和蛋白质印迹法(E)显示的抗uPAR mAb检测不同形式的uPAR。(F)竞争性结合测定显示通过FCM 检测到的抗uPAR mAb抑制uPA与uPAR的结合。

图9：抗uPAR抗体抑制胃癌细胞中uPAR依赖性信号传导(A)在pro-uPA刺激后用抗uPAR或ctrl mAb预处理的 SNU-216细胞中磷酸化ERK(p-ERK)和总ERK(T-ERK)的蛋白质印迹。(B-E)用抗uPAR或ctrl mAb处理的AGS和 SNU-216细胞的生长曲线(B、C)、transwell侵袭试验(D)和细胞粘附试验(E)。数据表示为平均值±SEM(＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001)。

图10为细胞实验：CD87单抗封闭抑制肿瘤细胞增殖：A：AGS； B：SNU216

图11为CD87单克隆抗体杀伤CDX模型数据。

图12为CD87单克隆抗体杀伤CDX模型组肿瘤组织重量及小鼠重量变化。

图13为CD87单克隆抗体杀伤CDX模型小动物成像结果。

图14：单独使用抗uPAR或与抗PD-1联合使用可提高携带患者来源异种移植物的人源化小鼠的存活率。(A)实验程序图。(B-C) 抗体治疗携带来自患者的PDX的小鼠的肿瘤生长(B)和存活曲线 (C)(n＝5/组，10mg/kg/抗体，I.P.，从8dpi开始每5天)；表示为平均值±SEM(ns不显著，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001)。

图15：单独使用抗uPAR或与抗PD-1一起使用可增强细胞毒性CD8+T细胞的浸润和活化。

(A-B)在实验结束时源自患者A的PDX中的CD8+T细胞的IF染色(A)和量化(B)。(C-D)与(A-B)中相同的PDX的 CD8 IHC染色和数据分析。(E)qRT-PCR检测到的如(A-B)中的PDX中趋化因子的mRNA表达水平。(F)肿瘤接种后第21天用不同抗体治疗的患者A衍生的PDX中的活化细胞毒性T细胞 (CD45⁺CD8⁺CD107a⁺)、调节性T细胞(Tregs，CD45⁺CD4⁺FOXP3⁺) 和M2巨噬细胞(CD45⁺CD11b⁺CD68⁺CD206⁺)的频率，如FCM 所示。数据表示为平均值±SEM(ns不显著，＊p＜0.05，＊＊p＜ 0.01，＊＊＊p＜0.001)。

图16为CD87-CAR的构建的示意图。

图17为本发明的CD87-CAR结构示意图。

图18为对T细胞进行感染的感染效率图，初始感染效率为 27.8％，分选富集后感染效率达到99.9％。

图19为设立CD87-CAR-T+AGS-荧光素酶和对照-T细胞+AGS- 荧光素酶两组进行共同培养，并且在1∶1、2∶1、4∶1、8∶1和16∶1的比例下观察各组肿瘤细胞的荧光素酶释放情况绘制成的折线图。(效应细胞：靶细胞结合力/杀伤力筛选)。

图20为以MKN-45细胞在NSG小鼠中造CDX模型，分为T 细胞对照组，CAR-T细胞杀伤组和CAR-T细胞联合PD-1抗体治疗组。A：肿瘤体积变化；B：动物生存分析。

图21为各组动物血清中IFN-γ和Granzyme B表达水平。

图22为小动物成像结果。

图23为CAR-T细胞杀伤PDX模型实验结果。分为T细胞对照组，CAR-T细胞杀伤组和CAR-T细胞联合PD-1抗体治疗组。A：治疗后肿瘤组织体积变化；B：治疗后生存曲线分析。

图24为各组动物血清中IFN-γ和Granzyme B表达水平。

图25为CAR-T细胞和PD-1抗体联用组CD8+T细胞浸润图。

实施例

下面结合实施例对本发明实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下面实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中的未注明具体条件者，按照常规条件或制作商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

CAR-T靶点筛选及验证：收集16名胃癌患者癌和癌旁组织进行了基因表达谱分析，共鉴定了605个表达上调基因。收集15对胃癌和癌旁组织的新鲜手术样本，采用非标记定量蛋白质组学法 (label-free)分析，共鉴定了186个在癌中高表达，癌旁不表达的蛋白。利用TCGA胃癌数据做了弥漫性胃癌与正常组织的差异基因，将得到的上述2个数据与免疫相关基因求交集，最终得到2个关键蛋白 FCGR3A和CD87，在TISIDB数据库分析与免疫细胞浸润和免疫检查点的相关性。按照CAR-T膜蛋白须在人体正常组织器官表达水平较低，癌组织表达较高且与其生物学行为有关的基本原则，结合CD87 在人体正常多组织器官表达分布情况，初步确定CD87为胃癌CAR-T 治疗靶点。

实施例2

通过qRT-PCR和流式细胞仪检测胃癌细胞株HGC-27、 MKN-45、AGS、SNU-216、HS746T和NCI-N87中CD87的表达水平，结果表明在AGS、SNU-216和HS746T中CD87高表达，在HGC-27、MKN-45和NCI-N87中低表达，

在此基础上设计了待敲除基因CD87的gRNA序列分别为： gRNA1：TTCCACACGGCAATCCCCGT。gRNA2：GGACCACGA TCGTGCGCTTG。对AGS、SNU-216中的CD87进行敲除，结果表明在AGS和SNU216中敲除CD87抑制了肿瘤细胞增殖，抗体封闭取得了同样的效果，分别用2×10⁶个MKN-45细胞、 MKN-45-CD87^-/-细胞和回复CD87的MKN-45-CD87^-/-细胞在NSG小鼠中成瘤，每隔两天测量小鼠肿瘤体积，用小动物成像仪观察荷瘤小鼠的肿瘤变化情况。

CD87可通过改变肿瘤微环境：检测ECM相关黏附蛋白的变化发现Smad2、vitronectin和vimetin等黏附相关蛋白表达明显下调，使得细胞间黏附变得松散，这可能与肿瘤微环境的改变相关。

实施例3

CD87单克隆抗体制备

制备CD87单克隆抗体构建慢病毒质粒 Lenti-CMV-CD87-T2A-GFP：

将构建好的质粒和包装质粒pDD和pVSVg按1∶1∶0.5的比例利用PEI转染293T细胞，培养36小时后收上清，离心并浓缩病毒，测定滴度后感染293T细胞，嘌呤霉素筛选并成功获得了稳定表达抗原CD87的细胞。

实验步骤：

1.1利用Gibson连接体系设计引物分别扩增CD87序列和GFP 序列，PCR产物胶回收。

1.2将Lenti-CMV-Puro质粒BamHI酶切，胶回收酶切产物。

1.3利用Gibson连接体系连接、转化、提取质粒测序并表达验证。

1.4鉴定正确者，命名为Lenti-CMV-CD87-T2A-GFP质粒。

构建稳定表达CD87的293T细胞系：293T-CD87：

实验材料

慢病毒载体质粒Lenti-CMV-CD87-T2A-GFP；包装质粒：pDD、 pVsVG；293T细胞；0.25％胰酶；DMEM；FBS；Opti-MEM；lip2000； BSAo

实验步骤

1)293T细胞接种：将生长状态良好的293T细胞用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为6×10⁵个/mL，取10mL接种于10cm培养皿中，37℃，5％二氧化碳培养18小时，使细胞融合度达到60％-70％，转染前半小时将培养液换为Opti-MEM。

2)病毒包装：将7ug Lenti-CMV-CD87-T2A-GFP质粒、5ug pDD 和3.5ug pVsVg加入到500uL OPTI-MEM中混匀；取30uL lip2000 加入500uL OPTI-MEM中混匀，室温静置5分钟，缓慢加入到质粒混合液中混匀，室温静置15分钟，逐滴加入到培养皿中，充分混匀。 6小时后更换为含10％FBS 1％BSA的DMEM新鲜培养液。

3)病毒浓缩：培养60小时之后，收集上清，4℃ 3000rpm离心 10分钟，0.45um滤膜滤过，4℃ 25000rpm超高速离心2小时，弃上清，用300uL含10％FBS 1％BSA的DMEM培养液重悬沉淀，4℃过夜，50uL/管分装，干冰速冻后储存在-80℃。

4)利用慢病毒感染293T细胞构建稳定表达CD87的293T细胞系，命名为293T-CD87。

利用制备的293T-CD87细胞制备靶向CD87的单克隆抗体。

293T-CD87的细胞进行细胞免疫：取6～8周龄SPF级Balb/c雌鼠4只，免疫前一天眼眶采血，分离血清用作阴性对照。将1×10⁷个稳定表达CD87的293T细胞皮下多点注射小鼠。第10天和20天分别用5×106个稳定表达CD87的293T细胞进行第二次和第三次免疫。第25天小鼠眼眶采血，应用ELISA检测CD87抗体效价。选取抗体效价最高的小鼠注射2×10⁶个细胞加强免疫。第30天制备免疫小鼠脾细胞，流式细胞仪(FCM)对可产生CD87抗体的阳性B细胞进行分选，利用单细胞RT-PCR技术获取VH和VL序列并验证，最终筛选出2种针对CD87的高亲和力单克隆抗体(A7和E2)。

实施例4

实施例3制备的靶向CD87的单克隆抗体表征，分别利用流式细胞术，WB和激光共聚焦验证制备的单克隆抗体A7和E2。

实施例5

实施例3制备的靶向CD87的单克隆抗体对胃癌细胞系CDX模型的治疗效果及联合PD-1治疗效果。

NSG小鼠皮下注射约2×10⁶个过表达CD87-T2A-luciferase的 MKN-45细胞造小鼠CDX模型，分为对照组、CD87单抗治疗组、 PD-1单抗治疗组和CD87单抗联用PD-1抗体组，待瘤体体积约达到 90mm³时，尾静脉分别注射2×10⁷个人PBMC、给药组分别给予 10mg/kgCD87单抗、PD-1单抗和CD87单抗+PD-1抗体，对照组给予相同剂量人IgG抗体，每周给药两次。没两天测量小鼠肿瘤大小，每隔4天用小动物活体成像系统分析检测瘤体变化情况，验证CD87单抗治疗效果。

实施例6

实施例3制备的靶向CD87的单克隆抗体对胃癌患者来源的PDX 模型的治疗效果及联合PD-1治疗效果。

取病理确诊CD87+胃癌患者的肿瘤组织，组织切块后皮下移植至NSG小鼠，待瘤体长大后取出，一部分肿瘤组织冻存，另一部分进行基因表达分析，剩余部分继续接种NSG小鼠，第三代肿瘤无差异可用于肿瘤杀伤实验。制备该模型小鼠20只，分为对照组、CD87 单抗治疗组、PD-1单抗治疗组和CD87单抗联用PD-1抗体组，待瘤体体积约达到90mm3时，尾静脉分别注射2×10⁷个人PBMC、给药组分别给予10mg/kgCD87单抗、PD-1单抗和CD87单抗+PD-1抗体，对照组给予相同剂量人IgG抗体，每周给药两次。没两天测量小鼠肿瘤大小，每隔4天用小动物活体成像系统分析检测瘤体变化情况，验证CD87单抗治疗效果。

实施例7

制备CD87-CAR

制备CD87-CAR质粒，所述CD87-CAR结构由EF1a启动子核酸序列、IL2的信号肽、CD87 scFv序列、hCD8a铰链区核酸序列、 CD8TM跨膜区域核酸序列、41-BB协同刺激信号域核酸序列、CD3ζ信号传导结构域串联而成，命名为EF1a-CD87 scFv-hCD8a hinge-CD8TM-41-BB-CD3ζ。本实施例构建的CD87-CAR基因结构的核酸序列如序列表中的SEQ ID No.24所示。

实验步骤：

1.利用Gibson连接体系设计引物扩增CD87 scFv序列，PCR产物胶回收。

2.将lenti-EF1a-hCAR-Puro质粒分别用EcoRI和BamHI双酶切，胶回收酶切产物。

3.利用Gibson连接体系连接、转化、提取质粒测序并表达验证。

4.鉴定正确者为CAR质粒，命名为CD87-CAR质粒。

利用构建的CD87-CAR质粒包装及浓缩慢病毒

实验材料

慢病毒载体质粒CD87-CAR；包装质粒：pMD2.G、pSPAX2； 293T细胞；0.25％胰酶；DMEM；FBS；Opti-MEM；lip2000；BSA。

实验步骤

1)293T细胞接种：将生长状态良好的293T细胞用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为6×10⁵个/mL，取10mL接种于10cm培养皿中，37℃，5％二氧化碳培养18小时，使细胞融合度达到60％-70％，转染前半小时将培养液换为Opti-MEM。

2)病毒包装：将7ug CD87-CAR质粒、5ug psPAX2和3.5ug pMD2.G加入到500uLOPTI-MEM中混匀；取30uL lip2000加入 500uL OPTI-MEM中混匀，室温静置5分钟，缓慢加入到质粒混合液中混匀，室温静置15分钟，逐滴加入到培养皿中，充分混匀。6 小时后更换为含10％FBS 1％BSA的DMEM新鲜培养液。

3)病毒浓缩：培养60小时之后，收集上清，4℃ 3000rpm离心 10分钟，0.45um滤膜滤过，4℃25000rpm超高速离心2小时，弃上清，用300uL含10％FBS 1％BSA的DMEM培养液重悬沉淀，4℃过夜，50uL/管分装，干冰速冻后储存在-80℃。

利用提供的慢病毒感染人外周血T细胞

实验材料

EasySep^TM Human T Cell Isolation Kit(StemCell，Catalog# 17951)；Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies，Catalog number：11131D)；PBS；FBS；RMPI-1640； human IL-2；Lymphoprep(Catalog#07801)；SepMate-50(Catalog #15450)。

实验步骤

1)人PBMC细胞准备：移液管量取15mL淋巴细胞分离液 (Lymphoprep，Catalog#07801)加入离心管中(SepMate-50， Catalog#15450)，淋巴细胞分离液上端应淹没过滤网。取新鲜血浆 10-15mL，用等体积2％FBS-PBS稀释，轻轻吹吸混匀，保持离心管垂直，沿管壁加入混匀后的样品(滤网上部离心液与样本混合)，室温1200g离心10分钟，倒出上层液体至新的离心管中，300g室温离心8分钟(如有必要2％FBS-PBS洗一次)。获得的PBMC用于T 细胞分选。

2)T细胞分选：PBMC加入0.5-2mL T细胞分离buffer，用 EasySep^TM Human T CellIsolation Kit(StemCell，Catalog#17951) 分选T细胞：流式管中加入2mL准备好的PBMC，加入50uL/mL isolation Cocktail混匀，常温5min，将RapidSpheres涡旋30s使混匀，加入40uL/mL，补充至2.5mL，吹吸3次使混匀。至于磁力架上5min，小心吸出上清至一新的5mL流式管中，再次置于磁力架上 5min，小心吸出上清置于离心管中离心，将T细胞用完全培养基10％FBS+RMPI-1640+IL2+1％P/S培养。

3)T细胞活化：将T cell加入24孔板中，2×10⁶cell/孔，加入 50uL清洗好的Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(4×10⁷ beads/mL)：磁珠和T细胞比率为1：1，CO2培养箱37℃培养24 小时。

4)T细胞感染：激活的T细胞活化24-48小时，加入浓缩的病毒和4.4ug/mLPolybrene，32℃离心90min(1000×g)感染。 (MOI＝5-10)

5)T细胞培养：离心感染后8-10小时离心移去培养基，合并所有感染孔用完全培养基10％FBS+RMPI-1640+IL2+1％P/S培养。每 48小时更换培养基。

6)CD87-CAR-T细胞分选和测定：培养6天后，移去磁珠(在磁力架上放置1-2min，上清转移至新的培养瓶中，继续培养24小时，有必要时重复此步骤)，GFP检测CAR表达情况。

7)CD87-CAR-T细胞冻存：10％DMSO-FBS冻存CAR-T细胞， 3×10⁶cell/管。

8)CD87-CAR基因结构表达的测序验证：取1×10⁶个CAR-T 细胞，TRIzol提取细胞总RNA并逆转录成cDNA，PCR扩增含 CD87-CAR基因结构片段，其中上游引物为：5′ -GTGTCGTGATCTAGAGCTAGCGGCCACCATGTACAG GATGCAACTCCTG-3′；下游引物为：5′-GACITCCTCTGCCCTCAGCGGCCGC CCGAGGCGGCAGGGCCTGCATGTG-3′。扩增结果送测序鉴定。

实施例8

利用实施例7制备的CD87-CAR-T细胞，检测此CD87-CAR-T 细胞对肿瘤细胞系的杀伤效果。

将CD87-CAR-T细胞与过表达luciferase的胃癌细胞系AGS、 AGS-CD87^-/-、MKN-45按一定比例共培养，37℃共培养4小时后，取50uL上清和准备好的荧光素酶试剂(Promina#E2610)加入96 孔板中(Corning#3904)，酶标仪检测上清中luciferase释放情况并计算杀伤能力。验证CD87-CAR-T细胞对胃癌靶细胞的结合能力及杀伤效果。

实施例9

利用实施例7制备的CD87-CAR-T细胞，检测此CD87-CAR-T 细胞对胃癌细胞系CDX模型的杀伤效果。

NSG小鼠皮下注射约2×10⁶个过表达CD87-T2A-luciferase的 MKN-45细胞造小鼠CDX模型，分为T细胞对照组、CD87-CAR-T 细胞治疗组和CD87-CAR-T细胞和PD-1抗体联用组，待瘤体体积约达到90mm³时，尾静脉分别注射1×10⁶个T细胞、CD87-CAR-T细胞，CD87-CAR-T细胞和PD-1抗体。小动物活体成像系统分析检测瘤体变化情况、应用ELISA检测外周血中IFN-γ和Granzyme B细胞因子水平变化，验证CD87-CAR-T细胞体内结合胃癌靶细胞的能力及杀伤效果。

实施例10

利用实施例7制备的CD87-CAR-T细胞，检测此CD87-CAR-T 细胞对胃癌患者来源PDX模型的杀伤效果。

取病理确诊CD87+胃癌患者的肿瘤组织，组织切块后皮下移植至NSG小鼠，待瘤体长大后取出，一部分肿瘤组织冻存，另一部分进行基因表达分析，剩余部分继续接种NSG小鼠，第三代肿瘤无差异可用于肿瘤杀伤实验。制备该模型小鼠20只，分为T细胞对照组、CD87-CAR-T细胞治疗组和CD87-CAR-T细胞和PD-1抗体联用组，待瘤体体积约达到90mm³时，尾静脉分别注射1×10⁶个T细胞、 CD87-CAR-T细胞，CD87-CAR-T细胞和PD-1抗体。监测小鼠体重、瘤体大小、应用ELISA检测外周血中IFN-γ和Granzyme B等细胞因子水平变化，验证CD87-CAR-T细胞体内杀伤胃癌PDX模型的能力。

序列表

<110> 兰州大学第二医院

兰州华帜天成生物科技有限责任公司

<120> 抗CD87抗体与抗PD1抗体联合治疗胃癌

<130> SH.1

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1416

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-A7-H链

<400> 1

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacgaggtgc agctgcagga gtctggggct gaacttgtga agcctggggc ttcagtaaag 120

atgtcctgta aggcttctgg gtacaccttc accagctact ggataacctg ggtgaagcag 180

aggcctggac aaggccttga gtggattgga aatatttatc ctggtagtgg tagtactaac 240

tataatgaga agttcaagag caaggccaca ctgactgtag acacatcgtc ccgcacagcc 300

tacatgcagc tcagcagcct gacatctgag gactctgcgg tctatcactg tgcaagagag 360

ggggcgtggg ggacctatgc tatggactac tggggtcaag ggacctctct caccgtctcc 420

tcagctaaga caacagctcc atcggtctat ccactggccc ctgtgtgtgg agatacaact 480

ggctcctcgg tgactctagg atgcctggtc aagggttatt tccctgagcc agtgaccttg 540

acctggaact ctggatccct gtccagtggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600

gacctctaca ccctcagcag ctcagtgact gtaacctcga gcacctggcc cagccagtcc 660

atcacctgca atgtggccca cccggcaagc agcaccaagg tggacaagaa aattgagccc 720

agagggccca caatcaagcc ctgtcctcca tgcaaatgcc cagcacctaa cctcttgggt 780

ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc 840

cccatagtca catgtgtggt ggtggatgtg agcgaggatg acccagatgt ccagatcagc 900

tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca gctcagacac aaacccatag agaggattac 960

aacagtactc tccgggtggt cagtgccctc cccatccagc accaggactg gatgagtggc 1020

aaggagttca aatgcaaggt caacaacaaa gacctcccag cgcccatcga gagaaccatc 1080

tcaaaaccca aagggtcagt aagagctcca caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa 1140

gagatgacta agaaacaggt cactctgacc tgcatggtca cagacttcat gcctgaagac 1200

atttacgtgg agtggaccaa caacgggaaa acagagctaa actacaagaa cactgaacca 1260

gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac 1320

tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca gtggtccacg agggtctgca caatcaccac 1380

acgactaaga gcttctcccg gactccgggt aaatga 1416

<210> 2

<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-A7-H链

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Arg Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr His Cys Ala Arg Glu Gly Ala Trp Gly Thr Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr

130 135 140

Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr

145 150 155 160

Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser

195 200 205

Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn

210 215 220

Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro

225 230 235 240

Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys

260 265 270

Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn

290 295 300

Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp

325 330 335

Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg

355 360 365

Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys

370 375 380

Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp

385 390 395 400

Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys

405 410 415

Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser

435 440 445

Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser

450 455 460

Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

465 470

<210> 3

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-A7-L链

<400> 3

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacgatattg tgatgaccca gtctccaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 120

agcgtcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtggtcatg tagcctggta tcaacagaaa 180

ccagggctct ctcctaaagc actgatttac tcggcatcct accggtacag tggagtccct 240

gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 300

tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatataaca cctatccgtg gacgttcggt 360

ggggggacca agctggaaat caaacgggca gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420

ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480

taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540

ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600

acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660

acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag 708

<210> 4

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-A7-L链

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met

20 25 30

Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln

35 40 45

Asn Val Gly Gly His Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ser

50 55 60

Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

100 105 110

Asn Thr Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

130 135 140

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

165 170 175

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

195 200 205

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

210 215 220

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 5

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-E2-H链

<400> 5

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacgaggtgc agctgcagga gtctggggtt gaaccggtga agcctggggc ctcagtgaag 120

atttcctgca aagcttctgg ctatgcattc agtaactact ggatgaactg ggtgaagcag 180

aggcctggaa agggtcttga gtggattgga cagatttatc ctggagatgg tgatactaac 240

tacaatagaa aattcaagga cagggcctca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcc 300

tacatgcagt tcagcagcct ggcctctgaa gactctgcgg tctatttctg tgcaagaagc 360

cccctctatg atagtgaccc cccttactct agtatggact actggggtca agggaccaca 420

ctcaccgtct cctcggctaa gacaacagct ccatcggtct atccactggc ccctgtgtgt 480

ggagatacaa ctggctcctc ggtgactcta ggatgcctgg tcaagggtta tttccctgag 540

ccagtgacct tgacctggaa ctctggatcc ctgtccagtg gtgtgcacac cttcccagct 600

gtcctgcagt ctgacctcta caccctcagc agctcagtga ctgtaacctc gagcacctgg 660

cccagccagt ccatcacctg caatgtggcc cacccggcaa gcagcaccaa ggtggacaag 720

aaaattgagc ccagagggcc cacaatcaag ccctgtcctc catgcaaatg cccagcacct 780

aacctcttgg gtggaccatc cgtcttcatc ttccctccaa agatcaagga tgtactcatg 840

atctccctga gccccatagt cacatgtgtg gtggtggatg tgagcgagga tgacccagat 900

gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat 960

agagaggatt acaacagtac tctccgggtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 1020

tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca aagacctccc agcgcccatc 1080

gagagaacca tctcaaaacc caaagggtca gtaagagctc cacaggtata tgtcttgcct 1140

ccaccagaag aagagatgac taagaaacag gtcactctga cctgcatggt cacagacttc 1200

atgcctgaag acatttacgt ggagtggacc aacaacggga aaacagagct aaactacaag 1260

aacactgaac cagtcctgga ctctgatggt tcttacttca tgtacagcaa gctgagagtg 1320

gaaaagaaga actgggtgga aagaaatagc tactcctgtt cagtggtcca cgagggtctg 1380

cacaatcacc acacgactaa gagcttctcc cggactccgg gtaaatga 1428

<210> 6

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-E2-H链

<400> 6

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Val Glu Pro

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ala Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Arg Lys Phe Lys Asp Arg Ala Ser Leu Thr Ala Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Phe Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Pro Leu Tyr Asp Ser Asp Pro Pro

115 120 125

Tyr Ser Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

130 135 140

Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys

145 150 155 160

Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly

165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr

195 200 205

Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser

210 215 220

Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

225 230 235 240

Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys

245 250 255

Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser

290 295 300

Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His

305 310 315 320

Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile

325 330 335

Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn

340 345 350

Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys

355 360 365

Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu

370 375 380

Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe

385 390 395 400

Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu

405 410 415

Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr

420 425 430

Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg

435 440 445

Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His

450 455 460

Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 7

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-E2-L链

<400> 7

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacgatattg tgctcaccca gtctccaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 120

agcgtcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtcctaatg tggcctggta tcaacagaaa 180

ccaggccaat ctcctaaacc actgatttac tcggcatcct accggtacag tggagtccct 240

gatcgtttca caggcagtaa atctgggaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 300

tctgaagact tggcggagta tttctgtcag caatatcaca actatcctct cacgttcggt 360

gctgggacca agctggaaat caaacgggca gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420

ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480

taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540

ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600

acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660

acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag 708

<210> 8

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-E2-L链

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met

20 25 30

Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln

35 40 45

Asn Val Gly Pro Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

50 55 60

Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Lys Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

100 105 110

His Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

130 135 140

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

165 170 175

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

195 200 205

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

210 215 220

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 9

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-A7-VH

<400> 9

gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgaa cttgtgaagc ctggggcttc agtaaagatg 60

tcctgtaagg cttctgggta caccttcacc agctactgga taacctgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggaaat atttatcctg gtagtggtag tactaactat 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca catcgtcccg cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atcactgtgc aagagagggg 300

gcgtggggga cctatgctat ggactactgg ggtcaaggga cctctctcac cgtctcctca 360

<210> 10

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-A7-VH

<400> 10

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ala Trp Gly Thr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-A7-VL

<400> 11

gatattgtga tgacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt ggtcatgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggctctctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacacct atccgtggac gttcggtggg 300

gggaccaagc tggaaatcaa acgg 324

<210> 12

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-A7-VL

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Gly His

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 13

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-E2-VH

<400> 13

gaggtgcagc tgcaggagtc tggggttgaa ccggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60

tcctgcaaag cttctggcta tgcattcagt aactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggaaagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180

aatagaaaat tcaaggacag ggcctcactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagttca gcagcctggc ctctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagaagcccc 300

ctctatgata gtgacccccc ttactctagt atggactact ggggtcaagg gaccacactc 360

accgtctcct cg 372

<210> 14

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-E2-VH

<400> 14

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Val Glu Pro Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Arg Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Ser Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Phe Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Leu Tyr Asp Ser Asp Pro Pro Tyr Ser Ser Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-E2-VL

<400> 15

gatattgtgc tcacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt cctaatgtgg cctggtatca acagaaacca 120

ggccaatctc ctaaaccact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgtttcacag gcagtaaatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cggagtattt ctgtcagcaa tatcacaact atcctctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggaaatcaa acgg 324

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Anti-PLAUR-E2-VL

<400> 16

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Pro Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Lys Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 17

<211> 1178

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EF1α启动子

<400> 17

gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttgtggg 60

gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120

atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180

tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240

tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300

cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360

agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420

ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480

tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540

aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600

cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660

cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720

gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780

ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840

cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900

cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960

agttctcgac cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020

agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080

tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140

tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽IL2-SP

<400> 18

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaactcg 60

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GSlinker

<400> 19

ggcggaggcg gaagtggagg cggaggatct ggcggcggag gctct 45

<210> 20

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区 hCD8a

<400> 20

accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60

tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120

gacttcgcct gcgat 135

<210> 21

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 跨膜区 CD8tTM

<400> 21

atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60

actctttact gt 72

<210> 22

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 胞内刺激信号域 41-BB

<400> 22

aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60

actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120

gaactg 126

<210> 23

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3zeta

<400> 23

cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60

tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120

cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180

gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240

agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300

tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336

Claims (5)

1.抗CD87抗体、CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽或包含CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽的细胞与PD-1抑制剂联合用于治疗患者的胃癌的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述抗CD87抗体、CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽或包含CD87特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽的细胞改变患者中的肿瘤微环境。

3.权利要求1或2的用途，其中所述抗CD87抗体包含与SEQ ID NO：10或14具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO：12或16具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的VL序列，

优选地，其包含SEQ ID NO：10或14的VH序列和SEQ ID NO：12或16的VL序列，

优选地，其包含与SEQ ID NO：2或6具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的重链和与SEQ ID NO：4或8具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的轻链，

优选地，其包含SEQ ID NO：2或6的重链和SEQ ID NO：4或8的轻链。

4.权利要求1或2的用途，其中所述嵌合抗原受体(CAR)多肽包含CD87抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，

优选地，其中所述CD87抗原结合结构域包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述VH包含与SEQ ID NO：10或14具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列，所述VL包含与SEQ ID NO：12或16具有至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列，

优选地，VH包含SEQ ID NO：10或14的序列，VL包含SEQ ID NO：12或16的序列。

5.权利要求1或2的用途，其中该细胞选自：αβT细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、B细胞、先天淋巴细胞(ILC)、细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞、调节性T细胞、或其任何组合。

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