KR20170036087A

KR20170036087A - 암 면역요법을 위한 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체

Info

Publication number: KR20170036087A
Application number: KR1020177005490A
Authority: KR
Inventors: 쎄실 쉬퍼-만니오우이
Original assignee: 화이자 인코포레이티드
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2017-03-31
Also published as: IL250339A0; RU2017102769A; RU2017102769A3; AU2015295346A1; BR112017001818A2; MX2017001229A; CN107074973A; JP2017522884A; WO2016016341A1; EP3174556A1; KR20180125632A; US20170275366A1; CA2956307A1

Abstract

본 발명은 면역 세포 특이성 및 반응성의 방향을 선택된 막 항원 쪽으로 바꿀 수 있는 재조합 키메라 단백질인 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 보다 구체적으로 세포외 리간드 결합 도메인이 EGFRvIII 양성 세포에 대한 특이적 면역을 부여하는, EGFRvIII 단일클론 항체로부터 유래된 scFv인, CAR에 관한 것이다. 이러한 CAR을 제공받은 TCR KO 조작된 면역 세포는 폐암, 항문암 및 다형성 신경교모세포종의 치료에 특히 적합하다.

Description

암 면역요법을 위한 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체{EGFRvIII SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY}

본 발명은 면역 세포 특이성 및 반응성의 방향을, 신경교모세포종, 신경교종, 비-소세포 폐 암종, 난소 암종 및 전립선 암종을 비롯한 인간 종양 상에서 발견되는 세포 표면 당단백질인 EGFRvIII 쪽으로 바꿀 수 있는 재조합 키메라 단백질인 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CAR은 T 세포 또는 NK 세포에서 발현될 때 EGFRvIII 항원을 보유하는 악성 세포를 치료하는 데 특히 유용하다. 생성된 조작된 면역 세포는 면역요법을 위한 안전성 및 효율성을 부여하는, 악성 세포에 대한 고도의 특이성을 나타낸다.

생체외에서 생성된 자가 항원 특이적 T 세포의 전달을 포함하는 입양 면역요법(adoptive immunotherapy)은 바이러스 감염 및 암을 치료하는 유망한 방법이다. 입양 면역요법을 위해 사용되는 T 세포는 유전적 조작을 통한 항원 특이적 T 세포의 증폭 또는 T 세포의 방향전환에 의해 생성될 수 있다(Park, Rosenberg et al. 2011). 바이러스 항원 특이적 T 세포의 전달은 이식 관련 바이러스 감염 및 희귀 바이러스 관련 악성종양의 치료에 이용되는 잘 확립된 절차이다. 유사하게, 종양 특이적 T 세포의 단리 및 전달은 흑색종의 치료에 있어서 성공적인 것으로 밝혀졌다.

T 세포의 신규 특이성은 형질전환 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)의 유전적 전달을 통해 성공적으로 생성되었다(Jena, Dotti et al. 2010). CAR은 단일 융합 분자로 하나 이상의 신호전달 도메인과 연결되어 있는 표적화 모이어티(moiety)로 구성된 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 유연성 링커에 의해 연결된 단일클론 항체의 경쇄 및 가변 단편들을 포함하는, 단일 쇄 항체(scFv)의 항원 결합 도메인으로 구성된다. 수용체 또는 리간드 도메인에 기초한 결합 모이어티도 성공적으로 사용되고 있다. 제1세대 CAR들을 위한 신호전달 도메인은 CD3ζ 또는 Fc 수용체 γ 쇄의 세포질 영역으로부터 유래된다. 제1세대 CAR들은 T 세포 세포독성의 방향을 성공적으로 바꾸는 것으로 확인되었다. 그러나, 이들은 생체내에서 연장된 증폭 및 항-종양 활성을 제공하지 못하였다. 보조자극 분자의 신호전달 도메인뿐만 아니라 경막 및 힌지 도메인들도 추가되어, 인간에서 일부 성공적인 치료 시험들을 이끌어내는 제2세대 CAR들 및 제3세대 CAR들을 형성하였는데, 이때 T 세포의 방향은 CD19를 발현하는 악성 세포 쪽으로 바뀔 수 있었다(June et al., 2011). 그러나, CD19 ScFv와 관련하여 사용된 신호전달 도메인, 경막 도메인 및 보조자극 도메인의 특정 조합물은 다소 항원 특이적이고 임의의 항원 마커까지 확장될 수 없다.

악성 신경교종은 가장 흔하고 치명적인 뇌 종양이다. 그럼에도 불구하고, 가장 공격적인 신경교종인 신경교모세포종을 가진 환자에 대한 생존은 개별적으로 가변적이지만 관리 표준의 개선으로 인해 마지막 5년에서 진단 후 평균 10개월부터 14개월까지 개선되었다. 방사선요법은 수십년 동안 이들 병변들의 치료에 매우 중요하였고, 강도-조절된 또는 영상-안내된 기법으로 빔의 초점을 뇌 종양의 불규칙한 윤곽에 맞추고 이를 조정하고 인접 중추적인 구조물로 향하는 선량을 최소화하는 능력은 크게 개선되었다. 단순한 경구 투여 및 유리한 독성 프로파일을 가진 알킬화제인 테모졸로마이드(temozolomide)는 방사선요법과 함께 및 방사선요법 후 사용된다. 더 새로운 수술적 기법, 예컨대, 형광-안내된 절제 및 신경내시경 기법이 악성 신경교종의 관리에 있어서 중요해졌다(Van Meir et al, 2010).

이들 진보에도 불구하고, 신경교모세포종에 대한 비-침습적 요법들이 여전해 절실히 필요하다. 구체적으로, EGFRvIII에 의해 매개된 병리의 치료, 특히 폐암, 항문암, 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종 및 다형성 신경교모세포종(GBM), 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종 또는 GBM의 치료에 사용될 "오프 더 쉘브(off the shelve) CAR T 세포"가 필요하다. 본원에서, 본 발명자들은 신경교모세포종에서 유일하게 발현되되, 정상 뇌 조직에서는 발현되지 않는 당단백질이고 유니프롯(Uniprot) 데이터베이스에서 P00533(NCBI 참조번호 NM-00522를 가진 유전자에 의해 코딩됨)으로서 지칭되는 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)을 항원으로서 표적화하는 효과적인 키메라 항원 수용체를 개발하였다. 본 발명은 상당한 임상적 장점을 가진 면역요법, 특히 CAR 발현 T 세포를 사용하는 면역요법으로 인간 종양, 예컨대, 신경교모세포종을 치료하는 길을 연다.

본 발명은 본원에서 확인된 문제점을 해결하는 하기 실시양태들을 제공한다:

1. 도 2에 나타낸 V1 내지 V6으로부터 선택된 하나의 폴리펩티드 구조를 가진 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(EGFRvIII CAR)로서, 상기 구조가

단일클론 항-EGFRvIII 항체의 VH 및 VL, 및 임의적으로 링커, 특히 n이 1 내지 3인, 바람직하게는 n은 3(서열번호 10)인 식 (G4S)n의 링커를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인;

힌지;

경막 도메인; 및

4-1BB의 CD3ζ 신호전달 도메인 및 보조자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인

을 포함하는, EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(EGFRvIII CAR).

2. 본 발명은 실시양태 1에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서,

단일클론 항-EGFRvIII 항체의 VH 및 VL, 및 식 (G4S)3(서열번호 10)의 링커를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인;

힌지;

CD8α의 경막 도메인; 및

을 포함하는 EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

3. 본 발명은 실시양태 1 또는 2에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 인간 CD28의 도메인을 포함하지 않는, 특히 인간 CD28의 보조자극 도메인을 포함하지 않는 EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

4. 본 발명은 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, VH 및 VL이 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 11 내지 14로부터 선택된 폴리펩티드 서열과 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

5. 본 발명은 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 4-1BB의 보조자극 도메인이 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 8과 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

6. 본 발명은 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, CD3ζ 신호전달 도메인이 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 9와 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

7. 본 발명은 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, CD8α 경막 도메인이 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 6과 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

8. 본 발명은 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, EGFRvIII에 대해 특이적이지 않은 다른 세포외 리간드 결합 도메인을 추가로 포함하는 EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

9. 본 발명은 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 신호 펩티드를 추가로 포함하는 EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

10. 본 발명은 실시양태 9에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 신호 펩티드가 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 1 또는 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

11. 본 발명은 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 구조 V1이 FcγRIIIα 힌지 및 CD8α 경막 도메인을 포함하는 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

12. 본 발명은 실시양태 11에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, FcγRIIIα 힌지가 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 3과 80% 이상의 서열 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

13. 본 발명은 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 구조 V3이 CD8α 힌지 및 CD8α 경막 도메인을 포함하는 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

14. 본 발명은 실시양태 13에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, CD8α 힌지가 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 4와 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

15. 본 발명은 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 구조 V5가 IgG1 힌지 및 CD8α 경막 도메인을 포함하는 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

16. 본 발명은 실시양태 15에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, IgG1 힌지가 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 5와 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

17. 본 발명은 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 따른 구조 V1의 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 서열번호 15 또는 서열번호 17과 80% 이상의 동일성을 가진 폴리펩티드 서열을 포함하는 구조 V1의 EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

18. 본 발명은 유리하게는 실시양태 1 내지 10, 13 및 14 중 어느 한 실시양태에 따른 구조 V3의 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 서열번호 24 및 서열번호 26으로부터 선택된 서열과 80% 이상의 동일성을 가진 구조 V3의 EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

19. 본 발명은 실시양태 1 내지 10, 15 및 16 중 어느 한 실시양태에 따른 구조 V5의 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 서열번호 25 및 서열번호 27로부터 선택된 서열과 80% 이상의 동일성을 가진 구조 V5의 EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

20. 본 발명은 실시양태 1 내지 10, 13, 14 및 18 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, CD8α의 신호 펩티드, 힌지 및 TM 도메인을 가진 EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 상기 실시양태 1 내지 20에 기재된 본 발명의 상기 EGFRvIII CAR은 상기 EGFRvIII CAR을 발현하는 T 세포, 바람직하게는 상기 EGRFvIII CAR을 발현하는 하기 조작된 T 세포가 EGFRvIII, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 세포, 보다 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포에 결합할 수 있게 한다.

또 다른 실시양태에서, 상기 실시양태 1 내지 20에 기재된 본 발명의 상기 EGFRvIII CAR은 상기 EGFRvIII CAR을 발현하는 T 세포, 바람직하게는 상기 EGFRvIII CAR을 발현하는 하기 조작된 T 세포가 EGFRvIII, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 세포, 보다 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포에 결합할 수 있게 하고 상기 EGFRvIII 발현 세포, 보다 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포를 파괴한다.

21. 본 발명은 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR로서, 폴리펩티드 서열이 인간 CD28의 서열을 함유하지 않는 것인, EGFRvIII 특이적 CAR을 제공한다.

특정 실시양태에서, 실시양태 1 내지 20의 본 발명의 EGFRvIII CAR은 인간 CD28과 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 동일성을 가진 서열을 포함하지 않는다.

특정 실시양태에서, 실시양태 1 내지 20의 본 발명의 EGFRvIII CAR의 세포질내 및/또는 경막 도메인은 인간 CD28로부터 유래된 서열을 포함하지 않고, 특히 인간 CD28과 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 동일성을 가진 서열을 갖지 않는다.

22. 본 발명은 실시양태 21의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

23. 본 발명은 실시양태 22에 따른 발현 벡터로서, 렌티바이러스(lentiviral) 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터 pCLD27600인 발현 벡터를 제공한다.

특정 실시양태에서, 상기 발현 벡터는 실시양태 1 내지 20에 기재된 본 발명의 EGFRvIII CAR의 안정한 발현을 가능하게 한다.

24. 본 발명은 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포를 제공한다.

25. 본 발명은 실시양태 24에 따른 조작된 면역 세포로서, 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 및 헬퍼 T-림프구로부터 선택된 면역 세포, 바람직하게는 세포독성 T-림프구로부터 유래된 조작된 면역 세포를 제공한다.

본 발명은 실시양태 24에 따른 조작된 면역 세포로서, 세포독성 T-림프구로부터 유래된 조작된 면역 세포를 제공한다.

26. 본 발명은 실시양태 24에 따른 조작된 면역 세포로서, NK 세포로부터 유래된 조작된 면역 세포를 제공한다.

27. 본 발명은 실시양태 24 내지 26 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포로서, TCR의 발현이 억제되는 것인, 조작된 세포를 제공한다.

28. 본 발명은 실시양태 24 내지 27 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포로서, 하나 이상의 MHC 단백질, 바람직하게는 β2m 또는 HLA의 발현이 억제되는 것인, 조작된 세포를 제공한다.

29. 본 발명은 실시양태 24 내지 28 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포로서, 하나 이상의 면역 억제 또는 화학요법 약물에 대한 내성을 가진 조작된 세포를 제공한다.

30. 본 발명은 실시양태 24 내지 29 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포로서, 환자에서 질환을 예방하거나 치료하기 위한 요법에 사용되는 조작된 세포를 제공한다.

31. 본 발명은 실시양태 30에 따른 조작된 세포로서, EGFRvIII 발현 암세포를 특징으로 하는 전구-악성 또는 악성 암 질환의 치료를 위한 요법에 사용되는 조작된 세포를 제공한다.

32. 본 발명은 실시양태 30 또는 31에 따른 조작된 세포로서, EGFRvIII 발현 암세포의 과다존재를 특징으로 하는 질환의 치료를 위한 요법에 사용되는 조작된 세포를 제공한다.

33. 본 발명은 요법에 사용되는 실시양태 30 내지 32 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포로서, 질환이 폐암, 항문암, 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종 및 다형성 신경교모세포종(GBM)으로부터 선택된 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종 또는 GBM인, 조작된 세포를 제공한다.

본 발명은 요법에 사용되는 실시양태 30 내지 32 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포로서, 질환이 GBM인, 조작된 세포를 제공한다.

본 발명은 요법에 사용되는 실시양태 30 내지 32 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포로서, 질환이 재발성 EGFRvIII+ 신경교종인, 조작된 세포를 제공한다.

본원은 실시양태 24 내지 32의 본 발명의 조작된 세포로서, 본 발명의 EGFRvIII CAR이 EGFRvIII, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 세포, 보다 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포에 결합하는 것인, 본 발명의 조작된 세포도 개시한다.

바람직하게는, 실시양태 24 내지 32 중 어느 한 실시양태에 따른 개시된 본 발명의 조작된 세포는 EGFRvIII 발현 암세포에 결합하고 EGFRvIII 발현 암세포의 생존에 영향을 미치고, 보다 바람직하게는 상기 실시양태들 중 어느 한 실시양태에 따른 본원에 개시된 본 발명의 조작된 세포는 신경교종, 구체적으로 GBM을 앓고 있는 환자의 생존을 개선한다.

34. 본 발명은 암세포를, 이 암세포의 손상을 야기하기에 효과적인 양의 실시양태 24 내지 29 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암세포를 손상시키는 방법을 제공한다.

35. 본 발명은 면역 세포를 조작하는 방법으로서,

(a) 면역 세포를 제공하는 단계; 및

(b) 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 따른 하나 이상의 EGFRvIII 특이적 CAR을 상기 세포의 표면에서 발현시키는 단계

를 포함하는 방법을 제공한다.

36. 본 발명은 실시양태 35의 면역 세포를 조작하는 방법으로서,

(a) 면역 세포를 제공하는 단계;

(b) 실시양태 21에 따른, 상기 EGFRvIII 특이적 CAR을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내로 도입하는 단계; 및

(c) 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내에서 발현시키는 단계

를 포함하는 방법을 제공한다.

37. 본 발명은 실시양태 35 또는 36에 따른 면역 세포를 조작하는 방법으로서,

(a) 면역 세포를 제공하는 단계;

(b) 상기 EGFRvIII 특이적 CAR을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내로 도입하는 단계; 및

(c) EGFRvIII에 대해 특이적이지 않은 하나 이상의 다른 CAR을 도입하는 단계

를 포함하는 방법을 제공한다.

38. 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,

(a) EGFRvIII 특이적 CAR을 표면에서 발현하는, 실시양태 24 내지 29 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포를 제공하는 단계; 및

(b) 상기 조작된 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계

를 포함하는 방법을 제공한다.

39. 본 발명은 실시양태 38에 따른 방법으로서, 상기 조작된 세포가 기증자에 의해 제공된 면역 세포를 사용함으로써 제조되는 것인, 방법을 제공한다.

40. 본 발명은 실시양태 39에 따른 방법으로서, 상기 기증자가 환자이고, 바람직하게는 상기 환자가 실시양태 35 내지 37 중 어느 한 실시양태에 따라 조작된 자신의 면역 세포를 사용함으로써 치료받을 것인, 방법을 제공한다.

본 발명은 하기 실시양태들도 제공한다:

1. EGFRvIII에 대해 특이적인 항체의 항원 결합 도메인, 리더(leader) 서열, 세포외 힌지 도메인, 경막 도메인 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는, EGFRvIII에 대해 특이적인 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)(EGFRvIII CAR).

2. 실시양태 1에 있어서, 항원 결합 도메인이 서열번호 11 또는 서열번호 13을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, EGFRvIII CAR.

3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 항원 결합 도메인이 서열번호 12 또는 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인, EGFRvIII CAR.

4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항원 결합 도메인이 서열번호 10을 포함하는 링커 펩티드를 포함하는 것인, EGFRvIII CAR.

5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항원 결합 도메인이 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하는 리더 서열을 포함하는 것인, EGFRvIII CAR.

6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항원 결합 도메인이 서열번호 1의 리더 서열을 포함하는 것인, EGFRvIII CAR.

7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포외 힌지 도메인을 추가로 포함하는 EGFRvIII CAR.

8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 리더 서열, 세포외 힌지 도메인 및 경막 도메인이 CD8α 쇄의 서열(서열번호 6)을 포함하는 것인, EGFRvIII CAR.

9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 4-1BB(서열번호 8) 및 CD3ζ(서열번호 9)를 포함하고, 바람직하게는 CD28 서열을 갖지 않는 것인, EGFRvIII CAR.

10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.

11. 실시양태 10의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.

12. 실시양태 11의 재조합 발현 벡터를 포함하는 단리된 일차 세포.

13. 실시양태 11의 재조합 발현 벡터를 포함하는 TCR-KO 단리된 일차 세포.

14. 실시양태 1 내지 9 중 어느 한 실시양태의 EGFRvIII CAR을 포함하는 TCR-KO 단리된 일차 세포.

15. 실시양태 12, 13 또는 14의 하나 이상의 단리된 일차 세포를 포함하는 일차 세포 집단.

16. 실시양태 1 내지 9 중 어느 한 실시양태의 EGFRvIII CAR, 실시양태 10의 핵산, 실시양태 11의 재조합 발현 벡터, 실시양태 12, 13 또는 14의 단리된 일차 세포 또는 실시양태 15의 일차 세포 집단, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.

17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 숙주, 바람직하게는 신경교종, 보다 바람직하게는 신경교모세포종을 앓고 있는 숙주에서 암의 치료 또는 예방에 사용되는 EGFRvIII CAR, 핵산, 재조합 발현 벡터, 단리된 일차 세포, 단리된 일차 세포 집단 또는 약학 조성물.

1. 본 발명은 마지막으로 도 2에 나타낸 V1 내지 V4로부터 선택된 하나의 폴리펩티드 구조를 가진 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 상기 구조가 단일클론 항-EGFRvIII 항체의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인, 힌지, 경막 도메인, 및 4-1BB의 CD3ζ 신호전달 도메인 및 보조자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 것인, EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.

2. 실시양태 1에 있어서, 구조 V1이 FcγRIIIα 힌지 및 CD8α 경막 도메인을 포함하는 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

3. 실시양태 1에 있어서, 구조 V2가 FcγRIIIα 힌지 및 4-1BB 경막 도메인을 포함하는 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

4. 실시양태 1에 있어서, 구조 V3이 CD8α 힌지 및 CD8α 경막 도메인을 포함하는 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

5. 실시양태 1에 있어서, 구조 V4가 CD8α 힌지 및 4-1BB 경막 도메인을 포함하는 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, VH 및 VL이 서열번호 11 내지 서열번호 14로부터 선택된 폴리펩티드 서열과 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 4-1BB의 보조자극 도메인이 서열번호 8과 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

8. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, CD3ζ 신호전달 도메인이이 서열번호 9와 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

9. 실시양태 1 또는 2에 있어서, FcγRIIIα 힌지가 서열번호 3과 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

10. 실시양태 3 또는 4에 있어서, CD8α 힌지가 서열번호 4와 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

11. 실시양태 5에 있어서, IgG1 힌지가 서열번호 5와 80% 이상의 동일성을 가진 것인 EGFRvIII 특이적 CAR.

12. 실시양태 2 또는 4에 있어서, CD8α 경막 도메인이 서열번호 6과 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

13. 실시양태 1, 3 및 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 4-1BB 경막 도메인이 서열번호 7과 80% 이상의 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, EGFRvIII에 대해 특이적이지 않은 다른 세포외 리간드 결합 도메인을 추가로 포함하는 EGFRvIII 특이적 CAR.

15. 실시양태 2에 있어서, 서열번호 15 및 서열번호 17과 80% 이상의 동일성을 가진 폴리펩티드 서열을 포함하는 구조 V1의 EGFRvIII 특이적 CAR.

16. 실시양태 3에 있어서, 서열번호 16 및 서열번호 18과 80% 이상의 동일성을 가진 폴리펩티드 서열을 포함하는 구조 V2의 EGFRvIII 특이적 CAR.

17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 신호 펩티드를 추가로 포함하는 EGFRvIII 특이적 CAR.

18. 실시양태 17에 있어서, 신호 펩티드가 서열번호 1 또는 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 가진 것인, EGFRvIII 특이적 CAR.

19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 한 실시양태에 따른 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

20. 실시양태 6 또는 7의 핵산을 포함하는 발현 벡터.

21. 실시양태 1 내지 18 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체를 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포.

22. 실시양태 21에 있어서, 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 또는 헬퍼 T-림프구로부터 유래된 조작된 면역 세포.

23. 실시양태 21에 있어서, NK 세포로부터 유래된 조작된 면역 세포.

24. 실시양태 21 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 요법에 사용되는 조작된 세포.

25. 실시양태 21 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간 요법에 사용되는 조작된 세포.

26. 실시양태 21 내지 25 중 어느 한 실시양태에 있어서, 질환이 EGFRvIII 발현 세포를 특징으로 하는 전구-악성 또는 악성 암 질환인, 조작된 세포.

27. 실시양태 21 내지 26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 질환이 EGFRvIII 발현 세포의 과다존재를 특징으로 하는 질환인, 조작된 세포.

28. 실시양태 21 내지 27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 질환이 암 질환인, 조작된 세포.

29. 실시양태 21 내지 28 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암 질환이 폐암, 항문암 또는 다형성 신경교모세포종인, 조작된 세포.

30. 실시양태 21 내지 29 중 어느 한 실시양태에 있어서, TCR의 발현이 상기 면역 세포에서 억제되는 것인, 조작된 세포.

31. 실시양태 21 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 MHC 단백질, 바람직하게는 β2m 또는 HLA의 발현이 상기 면역 세포에서 억제되는 것인, 조작된 세포.

32. 실시양태 21 내지 31 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 면역 억제 또는 화학요법 약물에 대한 내성을 부여하도록 돌연변이되어 있는 조작된 세포.

33. 암세포를, 이 암세포의 손상을 야기하기에 효과적인 양의 실시양태 21 내지 32 중 어느 한 실시양태에 따른 조작된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암세포를 손상시키는 방법.

34. (a) 면역 세포를 제공하는 단계; 및

(b) 실시양태 1 내지 19 중 어느 한 실시양태에 따른 하나 이상의 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체를 상기 세포의 표면에서 발현시키는 단계

를 포함하는, 면역 세포를 조작하는 방법.

35. 실시양태 34의 면역 세포를 조작하는 방법으로서,

(a) 면역 세포를 제공하는 단계;

(b) EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내로 도입하는 단계; 및

를 포함하는 방법.

36. 실시양태 34의 면역 세포를 조작하는 방법으로서,

(a) 면역 세포를 제공하는 단계;

(c) EGFRvIII에 대해 특이적이지 않은 하나 이상의 다른 키메라 항원 수용체를 도입하는 단계

를 포함하는 방법.

37. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,

(a) 실시양태 1 내지 19 중 어느 한 실시양태에 따른 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체를 표면에서 발현하는 면역 세포를 제공하는 단계; 및

(b) 상기 면역 세포를 환자에게 투여하는 단계

를 포함하는 방법.

38. 실시양태 37에 있어서, 면역 세포가 기증자로부터 제공되는 것인 방법.

39. 실시양태 37에 있어서, 면역 세포가 환자 자신으로부터 제공되는 것인 방법.

본 발명자들은 상이한 구조를 갖고 상이한 EGFRvIII 특이적 항체로부터 유래된 상이한 scFv를 포함하는 EGFRvIII 특이적 CAR을 생성하였다. 본 발명의 바람직한 CAR 폴리펩티드는 서열번호 15 내지 서열번호 19로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 CAR은 V3 또는 V5 구조(표 A 및 B), 훨씬 더 바람직하게는 V3 구조(표 A)를 가진 EGFRvIII 특이적 CAR이고, 훨씬 더 바람직하게는 본 발명의 CAR은 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 24 및 서열번호 26으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII 특이적 CAR이다.

본 발명의 훨씬 더 바람직한 CAR은 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로부터 선택된 인간화된 CAR이고, 이때 비-인간화된 EGFRvIII CAR의 인간 EGFRvIII에 대한 선택성 및 친화성과 유사한 또는 이보다 더 우수한, 인간 EGFRvIII에 대한 선택성 및 친화성을 유지하면서 HAMA 반응을 감소시키기 위해 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 5개 이상, 8개 이상 또는 10개 이상의 아미노산이 변경되어 있다.

용어 "유사한"은 0.05 내지 0.5(n=2)의 표준 편차로 비-인간화된 CAR의 친화성을 가진다는 것을 의미한다. 용어 "개선된"은 1.2배 이상 증가된, 비-인간화된 EGFRvIII CAR의 친화성을 가진다는 것을 의미한다.

본 발명에 따라, "인간화된"은 야생형 EGFRvIII CAR 또는 원래의 EGFRvIII CAR 서열과 80% 이상의 동일성을 가진 EGFRvIII CAR도 의미한다.

(예를 들면, 항-CD3/CD28 코팅된 비드 및 재조합 IL-2를 사용한) 시험관내 비-특이적 활성화 후, 바이러스 형질도입을 이용하여 이들 CAR들을 발현하는 폴리뉴클레오티드들로 기증자의 T 세포를 형질전환시킨다. 일부 경우, 보다 구체적으로 TCR의 성분(αβ - T 세포 수용체)의 파괴로 비-동종반응성(alloreactive) T 세포를 생성하여 이식편 대 숙주 반응을 방지하기 위해 T 세포를 더 조작하였다.

생성된 조작된 T 세포는 다양한 정도로 EGFRvIII 양성 세포에 대한 시험관내 반응성을 나타내었는데, 이것은 본 발명의 CAR들이 T 세포의 항원 의존적 활성화 및 증식에 기여하므로, 면역요법에 유용하다는 것을 입증한다.

생성된 조작된 T 세포는 EGFRvIII 양성 세포에 대한 생체내 반응성을 나타내었는데, 이것은 본 발명의 CAR들이 생체내에서 T 세포의 항원 의존적 활성화 및 증식에 기여하므로, 면역요법에 유용하다는 것을 입증한다.

본 발명의 CAR들을 코딩하는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열들은 본 명세서에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조작된 면역 세포는 치료적 적용, 예컨대, 다발성 골수종의 치료에 특히 유용하다.

본 발명의 조작된 면역 세포는 치료적 적용, 예컨대, 다형성 신경교모세포종(GBM)(신경교모세포종, 성상세포종 등급 IV, 및 등급 IV 성상세포종으로서도 공지되어 있음)의 치료에 특히 유용하다. 바람직하게는, 암은 EGFRvIII을 발현하는 세포를 특징으로 한다.

또한, 본원은 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물, 바람직하게는 V3 구조를 가진 EGFRvIII CAR을 제공받은 조작된 면역 세포로서, 힌지 도메인이 CD8α의 힌지 도메인인, 조작된 면역 세포를 개시한다.

본 발명의 조작된 면역 세포는 CD8의 힌지와 CD8α의 신호 펩티드 및/또는 경막 영역을 겸비한 EGFRvIII CAR 구축물을 제공받을 수 있다.

도 1: 본 발명에 따른 조작된 면역 세포의 도식적 표시. 이 도면에 제시된 조작된 면역 세포는 CAR을 코딩하는 레트로바이러스 폴리펩티드로 형질도입된 T 세포이다. 이 T 세포는 본 발명의 프레임 내에서 임의적인, 환자 내로의 더 우수하고 더 안전한 생착을 가능하게 하도록 더 조작된다. X 유전자는 예를 들면, TCR의 성분(TCRα 또는 TCRβ)을 발현하는 유전자일 수 있고, Y는 면역 억제 약물, 예컨대, CD52(캄패쓰(Campath)의 경우) 또는 HPRT(6-티오구아닌의 경우)에 대한 T 세포의 민감성과 관련된 유전자일 수 있다.
도 2: 상이한 CAR 구조(V1 내지 V4), 및 V5 및 V6의 도식적 표시.
도 3: EGFRvIII CAR 구축물의 도식적 표시.
도 4: CAR mRNA 생성을 위한 골격.
도 5: CAR 렌티바이러스 벡터 생성을 위한 골격.
도 6: FACS에 의해 분석된 일차 T 세포에서의 EGFRvIII CAR 발현.
도 7: 웨스턴-블롯에 의한 EGFRvI 또는 EGFRvIII 단백질 과다발현 U87 신경교종 세포 특징규명.
도 8: 표적 세포와의 공-배양 후 FACS 분석에 의해 평가된 EGFRvIII CAR T 탈과립화 능력.
도 9: 본 발명의 EGFRvIII CAR T 세포의 세포독성 분석.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

본원에서 달리 구체적으로 정의되어 있지 않은 한, 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 유전자요법, 생화학, 유전학 및 분자생물학의 분야에서 숙련된 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.

본원에 기재된 방법들 및 재료들과 유사하거나 균등한 모든 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법들 및 재료들이 본원에 기재되어 있다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌들, 특허출원들, 특허들 및 다른 참고문헌들은 전체로서 참고로 도입된다. 불일치가 있는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 추가로, 달리 특정되어 있지 않은 한, 재료들, 방법들 및 예들은 단지 예시적이고 한정하기 위한 것이 아니다.

달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명의 실시는 당분야의 기술 내에 있는, 세포생물학, 세포 배양, 분자생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기법들을 이용할 것이다. 이러한 기법들은 문헌에서 전체적으로 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)]; 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)]; 미국 특허 제4,683,195호(Mullis et al.); 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984)]; 문헌[Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)]; 문헌[Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)]; 문헌[Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)]; 문헌[B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; 문헌[the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.)]; 문헌[Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)]; 문헌[Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)]; 문헌[Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]; 및 문헌[Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)]을 참조한다.

[표 A]

[표 B]

EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체

본 발명은 세포외 리간드 결합 도메인, 경막 도메인 및 신호 전달도입 도메인을 포함하는 항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체(CAR 또는 EGFRvIII CAR 또는 항-EGFRvIII CAR)의 신규 디자인에 관한 것이다.

일반적으로, 용어 "포함한다"는 "구성된다"를 포함하고, 바람직한 실시양태에서, "포함한다"는 "구성된다"를 의미한다.

본 발명의 각각의 실시양태에서, 용어 "포함한다"는 "구성된다"를 의미할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "세포외 리간드 결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드로서 정의된다. 바람직하게는, 상기 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들면, 세포외 리간드 결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 세포외 리간드 결합 도메인은 유연성 링커에 의해 연결된, 표적 항원 특이적 단일클론 항-EGFRvIII 항체의 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 가변 단편을 포함하는 단일 쇄 항체 단편(scFv)을 포함한다. 상기 VL 및 VH는 바람직하게는 표 2에 표시된 바와 같이 139 및 MR1로서 지칭되는 항체들로부터 선택된다. 이들은 바람직하게는 예를 들면, 서열번호 10의 서열을 포함하는 유연성 링커에 의해 함께 연결된다. 즉, 상기 CAR들은 바람직하게는 서열번호 11 내지 서열번호 14로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 동일성을 나타내는 폴리펩티드 서열을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다.

본 발명에 따른 CAR의 신호 전달도입 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포의 활성화 및 면역 반응을 야기하는, 세포외 리간드 결합 도메인과 표적의 결합 후 세포내 신호전달을 담당한다. 즉, 신호 전달도입 도메인은 CAR이 발현되는 면역 세포의 정상 이펙터 기능들 중 하나 이상의 정상 이펙터 기능의 활성화를 담당한다. 예를 들면, T 세포의 이펙터 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "신호 전달도입 도메인"은 이펙터 신호 기능 신호를 전달도입하고 세포로 하여금 전문화된 기능을 수행하게 하는 단백질의 부분을 지칭한다.

CAR에서 사용될 신호 전달도입 도메인의 바람직한 예는 항원 수용체 맞물림 후 신호 전달도입을 시작하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 및 보조수용체의 세포질 서열들일 수 있을 뿐만 아니라, 이들 서열들의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 성능을 가진 임의의 합성 서열일 수도 있다. 신호 전달도입 도메인은 세포질 신호전달 서열의 두 상이한 클래스들, 즉 항원 의존적 일차 활성화를 시작하는 클래스, 및 이차 또는 보조자극 신호를 제공하도록 항원 독립적 방식으로 작용하는 클래스를 포함한다. 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프인 ITAM으로서 공지되어 있는 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. ITAM은 syk/zap70 클래스 티로신 키나제에 대한 결합 부위로서 작용하는 다양한 수용체들의 세포질내 꼬리에서 발견되는 잘 정의된 신호전달 모티프이다. 본 발명에서 사용되는 ITAM의 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 ITAM들을 비-한정적 예로서 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, CAR의 신호 전달도입 도메인은 서열번호 9로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR의 세포질내 도메인은 인간 CD28의 임의의 서열을 배제하거나 인간 CD28로부터 유래된 서열을 포함하지 않는다.

훨씬 더 바람직한 실시양태에서, EGFRvIII CAR의 신호전달 도메인은 서열번호 9와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 97%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하고, CD28 신호전달 도메인의 임의의 서열을 배제한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달도입 도메인은 보조자극 신호 분자를 포함한다. 보조자극 분자는 효율적인 면역 반응을 위해 요구되는 항원 수용체 또는 이의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. "보조자극 리간드"는 T 세포 상의 동족 보조자극 분자에 특이적으로 결합함으로써, 예를 들면, TCR/CD3 복합체와 펩티드로 적재된 MHC 분자의 결합에 의해 제공된 일차 신호 이외에 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는, 항원 제시 세포 상의 분자를 지칭한다. 보조자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도가능한 보조자극 리간드(ICOS-L), 세포내 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신(lymphotoxin) 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 톨(Toll) 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체, 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 보조자극 리간드는 특히 T 세포 상에 존재하는 보조자극 분자, 예컨대, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드(그러나, 이들로 한정되지 않음)에 특이적으로 결합하는 항체도 포괄한다.

"보조자극 분자"는 보조자극 리간드에 특이적으로 결합함으로써 세포에 의한 보조자극 반응, 예컨대, 증식(그러나, 이것으로 한정되지 않음)을 매개하는, T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 보조자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 보조자극 분자의 예에는 CD27, CD28, CD8, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달도입 도메인은 4-1BB(진뱅크: AAA53133) 및 CD28(NP_006130.1)의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 보조자극 신호 분자의 부분을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 CAR의 신호 전달도입 도메인은 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR의 신호 전달도입 도메인은 4-1BB의 보조자극 신호 분자를 포함하고 인간 CD28의 임의의 보조자극 신호 분자를 배제한다.

본 발명에 따른 CAR은 세포의 표면 막 상에서 발현된다. 따라서, 이러한 CAR은 경막 도메인을 추가로 포함한다. 적절한 경막 도메인의 구별되는 특징은 세포, 바람직하게는 본 발명에서 면역 세포, 특히 림프구 세포 또는 천연 살해(NK) 세포의 표면에서 발현되고 면역 세포의 세포 반응을 소정의 표적 세포 쪽으로 향하게 하기 위해 함께 상호작용하는 능력을 포함한다. 경막 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 경막 도메인은 임의의 막-결합된 또는 경막 단백질로부터 유래될 수 있다. 비-한정적 예로서, 경막 폴리펩티드는 T 세포 수용체의 서브유닛, 예컨대, CD3 복합체를 구성하는 α, β, γ 또는 δ 폴리펩티드, IL-12 수용체 p55(α 쇄), p75(β 쇄) 또는 γ 쇄, Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체 III의 서브유닛 쇄 또는 CD 단백질일 수 있다. 대안적으로, 경막 도메인은 합성 경막 도메인일 수 있고 주로 소수성 잔기, 예컨대, 류신 및 발린을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 경막 도메인은 인간 CD8α 쇄(예를 들면, NP_001139345.1)로부터 유래된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR의 TM 도메인은 CD8α 쇄(예를 들면, NP_001139345.1)로부터 유래된다.

경막 도메인은 상기 세포외 리간드 결합 도메인과 상기 경막 도메인 사이에서 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "힌지 영역"은 일반적으로 경막 도메인을 세포외 리간드 결합 도메인에 연결하는 기능을 수행하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 구체적으로, 힌지 영역은 더 높은 유연성 및 더 높은 접근가능성을 세포외 리간드 결합 도메인에게 제공하는 데 사용된다. 힌지 영역은 최대 300개의 아미노산들, 바람직하게는 10개 내지 100개의 아미노산들, 가장 바람직하게는 25개 내지 50개의 아미노산들을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 천연 분자의 전부 또는 일부, 예컨대, CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역의 전부 또는 일부, 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 힌지 영역은 천연 힌지 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 전체 합성 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 힌지 도메인은 본 명세서에서 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로서 지칭되는 인간 CD8α 쇄, FcγRIIIα 수용체 또는 IgG1, 또는 이들 폴리펩티드들과 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 힌지 폴리펩티드의 부분을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR은 서열번호 4의 CD8α의 힌지, CD8α의 TM 도메인, 및 CD8α의 펩티드 신호를 포함한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR은 서열번호 4와 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 CD8α 힌지, CD8α의 TM 도메인 및 CD8α의 펩티드 신호를 포함한다.

본 발명에 따른 CAR은 서열번호 6 또는 서열번호 7의 폴리펩티드와 동일성을 보이는, 보다 구체적으로 CD8α 및 4-1BB로부터 선택된 경막 도메인(TM)을 추가로 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 EGFRvIII CAR은 서열번호 6의 폴리펩티드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 보이는 TM을 포함한다.

본원은 힌지 영역이 CD8α의 힌지 영역인 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물도 개시한다. 예를 들면, 본 발명의 CAR 구축물은 CD8α로부터 유래된 힌지 영역과 CD8α로부터 유래된 신호 펩티드 및/또는 CD8α로부터 유래된 경막 영역을 겸비할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물은 CD8α의 힌지 영역과 CD8α의 신호 펩티드 및 CD8α로부터 유래된 경막 영역을 겸비할 수 있다.

훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 CAR 구축물은 CD8α의 힌지 영역과 CD8α로부터 유래된 신호 펩티드 및 CD8α로부터 유래된 경막 영역을 겸비할 수 있고 CD28 신호전달 도메인의 임의의 서열을 배제한다.

항원-상실 탈출 변이체를 생성하는, 표적 항원의 하향조절 또는 돌연변이는 암세포에서 흔히 관찰된다. 따라서, 종양 탈출을 상쇄하고 면역 세포가 표적에 대한 더 높은 특이성을 갖게 하기 위해, 본 발명에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR은 표적에서 상이한 요소들에 동시적으로 결합하여 면역 세포 활성화 및 기능을 증강시키기 위해 다른 세포외 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 세포외 리간드 결합 도메인들은 동일한 경막 폴리펩티드 상에 일렬로 놓일 수 있고, 임의적으로 링커에 의해 분리될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 상기 상이한 세포외 리간드 결합 도메인들은 CAR을 구성하는 상이한 경막 폴리펩티드들 상에 놓일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상이한 세포외 리간드 결합 도메인들을 각각 하나씩 포함하는 CAR들의 집단에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계 및 상이한 세포외 리간드 결합 도메인들을 각각 하나씩 포함하는 CAR들의 집단을 상기 세포의 표면에서 발현시키는 단계를 포함하는, 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계 및 상이한 세포외 리간드 결합 도메인들을 각각 하나씩 포함하는 CAR들의 집단을 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. CAR들의 집단은 상이한 세포외 리간드 결합 도메인들을 각각 하나씩 포함하는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CAR들을 의미한다. 본 발명에 따른 상이한 세포외 리간드 결합 도메인들은 바람직하게는 표적에서 상이한 요소들에 동시적으로 결합하여 면역 세포 활성화 및 기능을 증강시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 상이한 세포외 리간드 결합 도메인들을 각각 하나씩 포함하는 CAR들의 집단을 포함하는 단리된 면역 세포에 관한 것이다.

본 발명은

- EGFRvIII에 대해 특이적인 결합 도메인, 바람직하게는 인간 EGFRvIII에 대해 특이적인 결합 도메인, 보다 바람직하게는 인간 EGFRvIII에 대해 특이적이고 단일 쇄 가변 단편(scFv)인 결합 도메인;

- 힌지;

- 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 인간 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

을 포함하는 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(EGFRvIII CAR)를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR은 인간 CD28의 서열을 갖지 않는다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR은 CD28로부터 유래된 서열을 포함하지 않고, 특히 인간 CD28과 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 동일한 아미노산을 가진 서열을 갖지 않는다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR의 세포질내 및/또는 경막 도메인은 인간 CD28로부터 유래된 서열을 포함하지 않고, 특히 인간 CD28과 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 동일한 아미노산을 가진 서열을 갖지 않는다.

본 발명의 EGFRvIII CAR은

- 힌지;

- 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 인간 CD3ζ 신호전달 도메인으로 구성되되, 인간 CD28 신호전달 도메인을 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인

을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR은 CD28의 임의의 서열을 함유하지 않고 CD8α의 신호 펩티드(또는 리더 서열), TM 도메인 및 힌지를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR은 인간 CD8α의 리더 서열(서열번호 1), 또는 서열번호 1과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성, 바람직하게는 서열번호 1과 100%의 동일성을 가진 리더 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR은 서열번호 2의 리더 서열, 또는 서열번호 2와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 동일성, 바람직하게는 서열번호 2와 100%의 동일성을 가진 리더 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은

- CD8α 쇄(CD8α)의 힌지;

- 인간 CD8α의 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

본 발명은

- 인간 IgG1의 힌지;

- 인간 CD8α의 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 신호 펩티드를 가진 본 발명의 EGFRvIII CAR을 포괄한다.

본 발명에서, scFv는 바람직하게는 4개 내지 25개의 아미노산들, 보다 바람직하게는 서열번호 10의 짧은 링커 펩티드와 연결된, EGFRvIII에 대해 특이적인 면역글로불린의 중쇄 가변 영역(VH 도메인)과 경쇄 가변 영역(VL 도메인)(또는 VL 도메인과 VH 도메인)의 융합 단백질이다.

본 발명의 scFv는 EGFRvIII에 대해 특이적인 항체로부터 유래되고, 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된 VH 도메인을 포함하고, 상기 VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 EGFRvIII에의 결합에 함께 기여한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 상기 scFv는 리더 서열(또는 신호 펩티드)을 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 리더 서열은 VH 도메인에 연결된다.

상기 리더 서열이 VL 도메인에 연결되어 있는 한 실시양태는 본 발명의 일부이다.

바람직하게는, 상기 리더 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다.

한 실시양태에서, VH 도메인은 힌지에 연결되고, 또 다른 실시양태에서 VL 도메인은 상기 힌지에 연결된다.

본 발명은 상이한 길이를 가진 힌지, 바람직하게는 CD8α, IgG1 또는 FCRIII의 힌지(도 2 참조), 보다 바람직하게는 CD8α의 힌지, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 4를 가진 힌지에 연결된 항-EGFRvII scFv를 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은

- 신호 펩티드, 바람직하게는 CD8α의 신호 펩티드, 보다 바람직하게는 CD8α의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 신호 펩티드;

- 링커에 의해 분리되어 있고 EGFRvIII에의 결합에 기여하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 scFv;

- 인간 CD8α 쇄의 힌지 또는 인간 IgG1의 힌지;

- CD8α의 경막 도메인(TM);

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 제공한다.

보다 바람직하게는, 본 발명은

- 인간 CD8α의 신호 펩티드;

- 인간 CD8α 쇄의 힌지 또는 인간 IgG1의 힌지;

- CD8α의 경막 도메인(TM);

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 제공한다.

훨씬 더 바람직하게는, 본 발명은

- 인간 CD8α의 신호 펩티드;

- 링커에 의해 분리되어 있고 EGFRvIII에의 결합에 기여하는 인간화된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 scFv;

- 인간 CD8α 쇄의 힌지 또는 인간 IgG1의 힌지;

- CD8α의 경막 도메인(TM);

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 제공한다.

훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 EGFRvIII CAR은

- 리더 서열(예를 들면, CD8α 리더 서열 또는 CD8α 신호 펩티드);

- VH, 링커 및 VL을 포함하는 항-EGFRvIII scFv;

- CD8α 힌지;

- CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함한다.

훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 EGFRvIII CAR은

- VL, 링커 및 VH를 포함하는 항-EGFRvIII scFv;

- CD8α 힌지;

- CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함한다.

훨씬 더 바람직하게는, 본 발명의 EGFRvIII CAR은

- VH, 링커 및 VL을 포함하는 항-EGFRvIII scFv;

- CD8α 힌지;

- CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

으로 구성된다.

한 실시양태에서, 상기 링커는 식 (G4S)n의 링커이고, 이때 n은 1 내지 3, 바람직하게는 3이고, 상기 서열은 보다 바람직하게는 서열번호 10의 (G4S)3이다.

본 발명의 한 EGFRvIII CAR은

- 인간 CD8α 리더 서열(CD8α 리더 또는 CD8α 신호 펩티드);

- VH, 링커 및 VL을 포함하는 항-EGFRvIII scFv로서, 유리하게는 인간화된 항-EGFRvIII scFv;

- 인간 CD8α 힌지;

- 인간 CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

으로 구성된다.

한 실시양태에서, 본 발명은

- 서열번호 1의 인간 CD8α 리더 서열(CD8α 리더 또는 CD8α 신호 펩티드);

- 서열번호 11의 VH, 서열번호 10의 링커 및 서열번호 12의 VL, 또는 서열번호 13의 VH, 서열번호 10의 링커 및 서열번호 14의 VL을 포함하는 항-EGFRvIII scFv로서, 유리하게는 인간화된 항-EGFRvIII scFv;

- 서열번호 4의 인간 CD8α 힌지;

- 서열번호 6의 인간 CD8α TM;

- 4-1BB의 서열번호 8의 보조자극 신호 분자; 및

- 서열번호 9의 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은

- 서열번호 12의 VL, 서열번호 10의 링커 및 서열번호 11의 VH, 또는 서열번호 14의 VL, 서열번호 10의 링커 및 서열번호 13의 VH를 포함하는 항-EGFRvIII scFv로서, 유리하게는 인간화된 항-EGFRvIII scFv;

- 서열번호 4의 인간 CD8α 힌지;

- 서열번호 6의 인간 CD8α TM;

- 4-1BB의 서열번호 8의 보조자극 신호 분자; 및

- 서열번호 9의 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은

- 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리펩티드와 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 신호 펩티드, 바람직하게는 서열번호 1의 폴리펩티드와 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 신호 펩티드;

- 서열번호 11 또는 서열번호 13의 폴리펩티드와 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 VH 도메인 및 서열번호 12 또는 서열번호 14의 폴리펩티드와 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 VL 도메인으로서, 서열번호 10의 폴리펩티드와 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 링커에 의해 분리되어 있고 EGFRvIII에의 결합에 기여하는 VH 도메인 및 VL 도메인;

- 서열번호 4의 폴리펩티드와 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진, 인간 CD8α 쇄로부터 유래된 힌지;

- 서열번호 6의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진, CD8α로부터 유래된 경막 도메인;

- 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진, 인간 4-1BB(또는 4-1BB 세포내 도메인)로부터 유래된 보조자극 신호 분자; 및

- 서열번호 9로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(EGFRvIII CAR)는 CD28 또는 인간 CD28, 특히 인간 CD28 세포내 신호전달 도메인의 임의의 서열을 포함하지 않는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(EGFRvIII CAR)는 인간 CD28, 특히 인간 CD28 세포내 신호전달 도메인의 임의의 서열을 포함하지 않고, 바람직하게는 EGFRvIII에 대해 특이적인 scFv의 VH 도메인에 융합된, CD8α의 신호 펩티드를 추가로 함유한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 25의 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 26의 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 27의 EGFRvIII CAR을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24 또는 서열번호 25, 보다 바람직하게는 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 25의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 26의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 27의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR의 항-EGFRvIII 결합 도메인은 인간화된 항-EGFRvIII 결합 도메인이다.

본 발명의 임의의 항-EGFRvIII CAR은 CAR의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치지 않거나 이러한 결합 특성을 변경시키지 않고/않거나, 변경된 아미노산 서열을 함유하는 CAR T 세포의 활성에 유의하게 영향을 미치지 않고 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 감소시키거나 제거하는 아미노산 변경을 가진 인간화된 항-EGFRvIII 결합 도메인일 수 있다.

"인간화"는 CAR의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치지 않거나 이러한 결합 특성을 변경시키지 않고/않거나, 변경된 아미노산 서열을 함유하는 CAR T 세포의 활성에 유의하게 영향을 미치지 않고 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 감소시키거나 제거하는 아미노산 변경을 지칭하기 위한 것이다.

"인간화"는 CAR의 결합 특성(친화성 친화력)을 유의하게 개선할 수 있고/있거나, 변경된 아미노산 서열을 함유하는 CAR T 세포의 활성에 유의하게 영향을 미치지 않고 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 감소시키거나 제거하는 아미노산 변경을 지칭하기 위한 것이다.

이러한 보존적 변경은 상기 CAR의 상기 항체 단편 및/또는 상기 CAR 분자의 임의의 다른 부분에서의 아미노산 치환, 추가 및 결실을 포함한다. 변경은 당분야에서 공지된 표준 기법, 예컨대, 부위-지정된 돌연변이유발, PCR-매개된 돌연변이유발 또는 최적화된 생식세포주 서열의 사용에 의해 항체, 항체 단편 또는 본 발명의 CAR 분자의 임의의 다른 부분 내로 도입될 수 있다.

용어 "보존적 서열 변경" 또는 "아미노산 변화"는 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치지 않거나 이러한 결합 특성을 변경시키지 않는 아미노산 변경을 지칭하기 위한 것이다. 이러한 보존적 변경은 아미노산 치환, 추가 및 결실을 포함한다. 변경은 당분야에서 공지된 표준 기법, 예컨대, 부위-지정된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체되는 아미노산 치환이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기들의 패밀리들은 당분야에서 정의되어 있다. 이 패밀리들은 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전된 극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 CAR은 본원에 기재된 기능 분석의 이용을 통해 시험될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 보존적 아미노산 변경(또는 아미노산 서열 변화)을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 2개의 아미노산 변화를 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 3개의 아미노산 변화를 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 4개의 아미노산 변화를 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 5개의 아미노산 변화를 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 5개의 아미노산 변화를 가진 아미노산 서열을 갖되, 서열번호 24의 모든 CDR들이 보존되어 있는 EGFRvIII CAR을 제공한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 1개 내지 15개의 아미노산 변화를 가진 아미노산 서열을 갖되, 서열번호 24의 모든 CDR들이 보존되어 있는 EGFRvIII CAR을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CAR의 서열은 상기 CAR이 그의 표적(EGFRvIII)에 결합하는 능력을 변경시키지 않으면서 HAMA(인간 항-마우스 반응)을 감소시키기 위해 서열번호 24에 비해 1개 이상의 아미노산, 바람직하게는 2개 내지 15개의 아미노산을 변화시킴으로써 변경된다. 한 실시양태에서, 상기 결합은 개선될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 일차 T 세포에서 EGFRvIII CAR의 결합 및/또는 활성에 영향을 미치지 않거나 이러한 결합 및/또는 활성을 개선하는 1개 이상의 아미노산 변화를 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 EGFRvIII CAR과 관련된 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단 및 약학 조성물도 제공한다.

본원은 힌지가 CD8α의 TM 도메인 및 신호 펩티드와 조합될 때 조합된 이들 구조적 요소들 및 기술적 특징을 갖지 않는 종래 CAR 구축물에 비해 (도 9에서 확인된 바와 같이) EGFRvIII 발현 세포에 대한 EGFRvIII CAR의 더 우수한 친화성 및 선택성을 부여하는 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물도 개시한다. 바람직하게는, EGFRvIII 발현 세포에 대한 더 우수한 친화성 및 선택성을 가진 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물은 V3 구조의 기술적 특징들을 겸비하고, 보다 바람직하게는 EGFRvIII 발현 세포에 대한 더 우수한 친화성 및 선택성을 가진 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물은 서열번호 24와 80% 이상의 동일성을 가진 서열을 갖고 인간화되어 있다.

본원은 조합된 이 구조적 요소들 및 기술적 특징을 갖지 않는 종래 CAR 구축물에 비해 (도 9에서 확인된 바와 같이) EGFRvIII 발현 세포에 대한 EGFRvIII CAR의 더 우수한 친화성 및 선택성을 부여하는 구조를 가진 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물도 개시한다.

바람직하게는, EGFRvIII 발현 세포에 대한 보다 더 우수한 친화성 및 선택성을 가진 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물은 V3 구조의 기술적 특징들을 겸비하고, 보다 바람직하게는 EGFRvIII 발현 세포에 대한 보다 더 우수한 친화성 및 선택성을 가진 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물은 서열번호 24와 80% 이상의 동일성을 가진 서열을 갖고 인간화되어 있다.

폴리뉴클레오티드 및 벡터

본 발명은 전술된 본 발명에 따른 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터에 관한 것이기도 하다.

상기 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트 또는 발현 벡터(예를 들면, 세균 숙주 세포 내로 도입될 플라스미드, 또는 곤충 숙주 세포의 형질감염용 바이러스 벡터, 예컨대, 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터, 또는 포유동물 숙주 세포의 형질감염용 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스(lentivirus))로 구성될 수 있다.

특정 실시양태에서, 상이한 핵산 서열들이 리보좀 스킵(skip) 서열을 코딩하는 핵산 서열, 예컨대, 2A 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 1개의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터에 포함될 수 있다. 피코르나바이러스(picornaviruses)의 아프쏘바이러스(Aphthovirus) 하위군에서 확인된 2A 펩티드는 코돈에 의해 코딩된 2개의 아미노산들 사이의 펩티드 결합의 형성 없이 리보좀이 한 코돈으로부터 다음 코돈으로 "건너뛰게" 한다(문헌[Donnelly and Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008] 참조). "코돈"은 리보좀에 의해 1개의 아미노산 잔기로 번역되는, mRNA(또는 DNA 분자의 센스 가닥) 상의 3개 뉴클레오티드들을 의미한다. 따라서, 2개의 폴리펩티드들이 프레임 내에 존재하는 2A 올리고펩티드 서열에 의해 분리되어 있을 때 mRNA 내의 단일 연속 개방 판독 프레임으로부터 합성될 수 있다. 이러한 리보좀 스킵 기작은 당분야에서 잘 공지되어 있고 단일 메신저 RNA에 의해 코딩된 여러 단백질들의 발현을 위해 여러 벡터들에 의해 사용되는 것으로 공지되어 있다.

본 발명의 EGFRvIII CAR이 세포에서 발현되게 하는 벡터는 본 발명의 또 다른 목적이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 벡터는 본 발명의 EGFRvIII CAR의 일시적인 발현을 가능하게 한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 벡터는 세포 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 본 발명의 EGFRvIII CAR의 항시적 및 안정한 발현을 가능하게 한다. 본 발명의 EGFRvIII CAR의 발현 및/또는 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 세포의 생존은 조절될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 EGFRvIII CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로부터 선택된, 본 발명의 EGFRvIII CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 4에 표시된 바와 같은) pCLS 9632 벡터를 제공한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로부터 선택된, CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 4에 표시된 바와 같은) pCLS 9632 벡터를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 25의 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 4에 표시된 바와 같은) pCLS 9632 벡터를 제공한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 27의 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 4에 표시된 바와 같은) pCLS 9632 벡터를 제공한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 26의 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 4에 표시된 바와 같은) pCLS 9632 벡터를 제공한다.

훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 4에 표시된 바와 같은) pCLS 9632 벡터를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 (도 5에 표시된 바와 같은) pCLS 26700 벡터를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26 및 서열번호 27로부터 선택되고 인간화된 또는 비-인간화된 CAR을 코딩하는 CAR 서열을 포함하는 (도 5에 표시된 바와 같은) pCLS 26700 벡터를 제공한다.

또 다른 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 5에 표시된 바와 같은) pCLS 26700 벡터를 제공한다. 또 다른 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 25의 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 5에 표시된 바와 같은) pCLS 26700 벡터를 제공한다.

또 다른 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 26의 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 5에 표시된 바와 같은) pCLS 26700 벡터를 제공한다.

또 다른 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 27의 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 (도 5에 표시된 바와 같은) pCLS 26700 벡터를 제공한다.

경막 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로 내로 향하게 하기 위해, 분비 신호 서열(리더 서열, 예비전구 서열 또는 예비 서열로서도 공지되어 있음)이 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터 서열 내에 제공된다. 분비 신호 서열은 경막 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 즉, 상기 2개의 서열들은 새로 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로 내로 향하게 하도록 정확한 판독 프레임으로 연결되고 위치한다. 일부 분비 신호 서열들은 관심 있는 핵산 서열에서 임의의 부위에 위치할 수 있지만, 분비 신호 서열은 통상적으로 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대해 5' 방향 쪽으로 위치한다(예를 들면, 미국 특허 제5,037,743호(Welch et al.) 및 미국 특허 제5,143,830호(Holland et al.) 참조). 바람직한 실시양태에서, 신호 펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 신호 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

당업자는 유전 코드의 축퇴성을 고려하여 이들 폴리뉴클레오티드 분자들 사이에 상당한 서열 변이가 가능하다는 것을 인식할 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 서열은 포유동물 세포에서 발현되도록, 바람직하게는 인간 세포에서 발현되도록 코돈-최적화된다. 코돈-최적화는 관심 있는 서열에서 주어진 종의 고도로 발현되는 유전자에서 일반적으로 드문 코돈을 이러한 종의 고도로 발현되는 유전자에서 일반적으로 흔한 코돈, 예컨대, 교환되는 코돈과 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈으로 교체하는 것을 지칭한다.

CAR을 제공받은 면역 세포를 조작하는 방법

본 발명은 전술된 바와 같은 EGFRvIII CAR들 중 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 생체외에서 면역 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 면역요법용 면역 세포를 제조하는 방법을 포괄한다.

본 발명은 바람직하게는 면역요법, 보다 바람직하게는 암의 치료를 위해 본 발명의 EGFRvIII CAR들 중 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 렌티바이러스 벡터를 제공받은 면역 세포를 포함하는 일차 면역 세포도 포괄한다.

본 발명의 일차 면역 세포는 EGFRvIII 발현 암세포에 대한 보다 더 우수한 친화성 및 선택성을 가진 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에서 안정하게 발현되는 점을 고려하여 (바람직하게는 도 5에 표시된 바와 같은) 렌티바이러스 벡터 내에 포함된다.

추가 실시양태에 따라, 상기 방법은 상기 세포를 동종이계(allogeneic) 이식에 더 적합하게 만들기 위해 상기 세포를 유전적으로 변경시키는 단계를 추가로 포함한다.

제1 양태에 따라, 면역 세포는 예를 들면, HLA 또는 β2m 단백질 발현을 코딩하거나 조절하는 유전자의 불활성화와 조합될 수 있는, 국제 특허출원 공개 제WO 2013/176915호에 기재된 바와 같은 T 세포 수용체(TCR)의 하나 이상의 성분을 발현하는 하나 이상의 유전자의 불활성화에 의해 동종이계 면역 세포가 될 수 있다. 따라서, 이식편 대 숙주 증후군 및 이식편 거부의 위험은 상당히 감소된다.

또 다른 양태에 따라, 면역 세포는 EGFRvIII 양성 악성 세포를 치료하기 위한 표준 관리로서 사용되는 면역억제 약물 또는 화학요법 치료에 대한 그의 내성을 개선하도록 더 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들면, 캄패쓰(알렘투주맙) 및 글루코코르티코이드 치료의 약물 표적인 CD52 및 글루코코르티코이드 수용체(GR)는 세포가 이 치료들에 대한 내성을 갖게 하고 특이적 EGFRvIII CAR을 제공받지 않은 환자 자신의 T 세포에 비해 경쟁적 장점을 상기 세포에게 제공하기 위해 불활성화될 수 있다. CD3 유전자의 발현도 또 다른 면역억제 약물인 테플리주맙에 대한 내성을 부여하기 위해 억제될 수 있거나 감소될 수 있다. HPRT의 발현도 특히 급성 림프모구성 백혈병의 치료를 위한 화학요법에서 통상적으로 사용되는 세포증식정지제인 6-티오구아닌에 대한 내성을 부여하기 위해 본 발명에 따라 억제될 수 있거나 감소될 수 있다.

본 발명의 추가 양태에 따라, 면역 세포는 T 세포 활성화의 조절제로서 작용하는 "면역 체크포인트"로서 작용하는 단백질, 예컨대, PDCD1 또는 CTLA-4를 코딩하는 유전자를 불활성화시킴으로써 더 높은 활성을 갖게 되거나 고갈을 한정하도록 더 조작될 수 있다. 발현이 감소될 수 있거나 억제될 수 있는 유전자들의 예는 표 9에 표시되어 있다.

[표 9]

바람직한 실시양태에서, 면역 세포를 더 조작하는 상기 방법은 DNA 절단으로 상기 언급된 유전자들을 선택적으로 불활성화시키기 위해 특이적 희귀-절단 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 특히 mRNA를 상기 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제 또는 Cas9 엔도뉴클레아제이다. TALE-뉴클레아제는 지금까지 다른 유형의 희귀-절단 엔도뉴클레아제들에 비해 더 높은 특이성 및 절단 효율을 보였고, 이러한 장점으로 인해 이 뉴클레아제는 조작된 면역 세포를 일정한 전환율로 대규모로 생성하기 위한 엔도뉴클레아제로서 선택된다.

전달 방법

전술된 상이한 방법들은 CAR을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 비-한정적 예로서, 상기 CAR은 1개의 플라스미드 벡터에 의해 코딩된 형질전환유전자(transgenes)로서 도입될 수 있다. 상기 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 제공받은 세포의 확인 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커도 함유할 수 있다.

폴리펩티드는 이 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입한 결과로서 세포 내의 제자리에서 합성될 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리펩티드는 세포 외부에서 생성된 후 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 구축물을 세포 내로 도입하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 폴리뉴클레오티드 구축물이 세포의 게놈 내로 통합되는 안정한 형질전환 방법, 폴리뉴클레오티드 구축물이 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 일시적인 형질전환 방법 및 바이러스-매개된 방법을 비-한정적 예로서 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 재조합 바이러스 벡터(예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스), 리포좀 등에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 일시적인 형질전환 방법은 예를 들면, 미세주입, 전기천공 또는 입자 폭격(bombardment)을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현된다는 점을 고려하여 벡터, 보다 구체적으로 플라스미드 또는 바이러스 내에 포함될 수 있다.

조작된 면역 세포

본 발명의 EGFRvIII CAR을 제공받은 일차 면역 세포(또는 조작된 면역 세포)는 본 발명의 또 다른 목적이다. 바람직하게는, 상기 세포는 일차 T 세포, 보다 바람직하게는 EGFRvIII 발현 세포의 파괴를 초래하는, EGFRvIII 발현 세포에 대한 CTL 활성을 가진 일차 T 세포이다.

바람직하게는, 상기 일차 T 세포는 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 제공받는다.

바람직하게는, 상기 일차 T 세포는 서열번호 25의 EGFRvIII CAR을 제공받는다.

바람직하게는, 상기 일차 T 세포는 서열번호 26의 EGFRvIII CAR을 제공받는다.

바람직하게는, 상기 일차 T 세포는 서열번호 27의 EGFRvIII CAR을 제공받고, 보다 바람직하게는 상기 일차 T 세포는 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 제공받는다.

본 발명은 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하고 EGFRvIII 발현 세포, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포에 대한 CTL 및/또는 탈과립화 활성을 나타내는 일차 T 세포를 제공하고, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 세포, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포에 대한 CTL 및/또는 탈과립화 활성을 나타내는 상기 일차 T 세포는 서열번호 27의 EGFRvIII CAR을 제공받고, 보다 바람직하게는 상기 일차 T 세포는 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 제공받는다.

본 발명은 EGFRvIII 발현 세포, 특히 EGFRvIII 발현 종양 세포를 용해시키기 위한 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포도 제공한다.

본원은 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하고 EGFRvIII 발현 세포, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포에 대한 CTL 및/또는 탈과립화 활성을 나타내는 일차 T 세포도 개시한다.

하기 추가 및 특정 보호대상도 제공된다:

- 힌지;

- 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 본 발명의 일차 면역 T 세포.

한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포에서 발현되는 EGFRvIII CAR은 인간 CD28의 서열을 갖지 않는다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포는 CD28로부터 유래된 서열, 특히 인간 CD28과 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 동일성을 가진 서열을 포함하지 않는 EGFRvIII CAR을 발현한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포에서 본 발명의 EGFRvIII CAR의 세포질내 및/또는 경막 도메인은 인간 CD28로부터 유래된 서열, 특히 인간 CD28과 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 동일성을 가진 서열을 포함하지 않는다.

본 발명의 일차 면역 T 세포는

- 힌지;

- 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포는 CD28의 서열을 포함하지 않고 CD8α의 신호 펩티드(리더 서열), TM 도메인 및 힌지를 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포는 인간 CD8α의 리더 서열(서열번호 1), 또는 서열번호 1과 95% 이상의 동일성을 가진, 바람직하게는 서열번호 1의 리더 서열을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포는 서열번호 2의 리더 서열, 또는 서열번호 2와 95% 이상의 동일성을 가진 리더 서열을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포는

- 인간 CD8α 쇄(CD8α)의 힌지;

- 인간 CD8α의 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포는

- 인간 IgG1의 힌지;

- 인간 CD8α의 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현한다.

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 신호 펩티드를 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 본 발명의 일차 면역 T 세포를 포괄한다.

본 발명은 힌지, 바람직하게는 CD8α, IgG1 또는 FCRIII의 힌지(도 2 참조), 보다 바람직하게는 CD8α의 힌지, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 4를 가진 힌지에 연결된 항-EGFRvII scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 본 발명의 일차 면역 T 세포를 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은

- 인간 CD8α 쇄의 힌지 또는 인간 IgG1의 힌지;

- CD8α의 경막 도메인(TM);

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

보다 바람직하게는, 본 발명은

- 인간 CD8α의 신호 펩티드;

- 인간 CD8α 쇄의 힌지 또는 인간 IgG1의 힌지;

- CD8α의 경막 도메인(TM);

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

훨씬 더 바람직하게는, 본 발명은

- 인간 CD8α의 신호 펩티드;

- 인간 CD8α 쇄의 힌지 또는 인간 IgG1의 힌지;

- CD8α의 경막 도메인(TM);

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포는

- VH, 링커 및 VL을 포함하는 항-EGFRvIII scFv;

- CD8α 힌지;

- CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함한다.

본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포는

- VL, 링커 및 VH를 포함하는 항-EGFRvIII scFv;

- CD8α 힌지;

- CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함한다.

본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포는

- VH, 링커 및 VL을 포함하는 항-EGFRvIII scFv;

- CD8α 힌지;

- CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

으로 구성된다.

본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포는

- 인간 CD8α 리더 서열(CD8α 리더 또는 CD8α 신호 펩티드);

- 인간 CD8α 힌지;

- 인간 CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은

- 서열번호 4의 인간 CD8α 힌지;

- 서열번호 6의 인간 CD8α TM;

- 4-1BB의 서열번호 8의 보조자극 신호 분자; 및

- 서열번호 9의 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함하는 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은

- 서열번호 4의 인간 CD8α 힌지;

- 서열번호 6의 인간 CD8α TM;

- 4-1BB의 서열번호 8의 보조자극 신호 분자; 및

- 서열번호 9의 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

한 실시양태에서, 본 발명은

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포에서 발현되는 본 발명의 EGFRvIII CAR은 CD28 또는 인간 CD28, 특히 인간 CD28 세포내 신호전달 도메인의 임의의 서열을 포함하지 않는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포에서 발현되는 본 발명의 EGFRvIII CAR은 인간 CD28, 특히 인간 CD28 세포내 신호전달 도메인의 임의의 서열을 포함하지 않고, 바람직하게는 EGFRvIII에 대해 특이적인 scFv의 VH 도메인에 융합된, CD8α의 신호 펩티드를 추가로 함유한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 25의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 26의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 27의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24 또는 서열번호 25, 보다 바람직하게는 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 EGFRvIII 발현 세포, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포에 대한 CTL 및/또는 탈과립화 활성을 나타내는, 서열번호 24 또는 서열번호 25, 보다 바람직하게는 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 24의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 25의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 26의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 27의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

본 발명은 세포를 조작하는 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 세포 또는 세포주에 관한 것이기도 하다. 구체적으로, 상기 단리된 세포는 전술된 본 발명의 하나 이상의 CAR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단리된 세포는 상이한 세포외 리간드 결합 도메인들을 각각 하나씩 포함하는 CAR들의 집단을 포함한다. 구체적으로, 상기 단리된 세포는 CAR을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 유전적으로 변경된 면역 세포는 항원 결합 기작과 관계 없이 활성화되고 증식한다.

이전에 기재된 방법들 중 어느 한 방법에 따라 수득된 단리된 면역 세포, 바람직하게는 T 세포도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 면역 세포는 선천성 면역 반응 및/또는 후천성 면역 반응의 시작 및/또는 실시에 기능적으로 관여하는 조혈 유래의 세포를 지칭한다. 본 발명에 따른 상기 면역 세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 성인 줄기 세포, 비-인간 배아 줄기 세포, 보다 구체적으로 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 원시 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 대표적인 인간 세포는 CD34+ 세포이다. 상기 단리된 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK 세포, B 세포, 또는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 및 헬퍼 T-림프구로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포일 수도 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포는 CD4+ T-림프구 및 CD8+ T-림프구로 구성된 군으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 세포의 증폭 및 유전적 변경 전, 세포의 공급원은 다수의 비-한정적 방법들을 통해 대상체로부터 수득될 수 있다. 세포는 말초혈 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 비롯한 다수의 비-한정적 공급원들로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태들에서, 당업자에게 입수가능하고 공지되어 있는 임의의 수의 T 세포주들이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포는 건강한 기증자, 암으로 진단받은 환자 또는 감염으로 진단받은 환자로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포는 상이한 표현형적 특성들을 나타내는 세포들의 혼합된 집단의 부분이다. 이전에 기재된 방법에 따라 형질전환된 T 세포로부터 수득된 세포주도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 면역억제 치료에 대한 내성을 갖고 종래 방법에 의해 수득될 수 있는 변경된 세포는 본 발명의 범위 내에 포함된다.

바람직한 실시양태로서, 본 발명은 환자 내로의 동종이계 이식을 위한, 기능성 TCR을 발현하지 않고 EGFRvIII 양성 세포에 대한 반응성을 나타내는, 전술된 EGFRvIII CAR을 제공받은 T 세포 또는 T 세포 집단을 제공한다.

T 세포의 활성화 및 증폭

T 세포의 유전적 변경 전 또는 후, 심지어 본 발명의 유전적으로 변경된 면역 세포가 항원 결합 기작과 관계 없이 활성화되거나 증식하는 경우에도, 예를 들면, 미국 특허 제6,352,694호, 제6,534,055호, 제6,905,680호, 제6,692,964호, 제5,858,358호, 제6,887,466호, 제6,905,681호, 제7,144,575호, 제7,067,318호, 제7,172,869호, 제7,232,566호, 제7,175,843호, 제5,883,223호, 제6,905,874호, 제6,797,514호 및 제6,867,041호; 및 미국 특허출원 공개 제2006/0121005호에 기재된 방법들을 일반적으로 이용하여 본 발명의 면역 세포, 특히 T 세포를 더 활성화시킬 수 있고 증폭시킬 수 있다. T 세포를 시험관내에서 또는 생체내에서 증폭시킬 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 T 세포는 T 세포의 표면 상의 CD3 TCR 복합체 및 보조자극 분자를 자극하여 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하는 물질과의 접촉에 의해 증폭된다. 예를 들면, 화학물질, 예컨대, 칼슘 이오노포어(ionophore) A23187, 포볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 또는 유사분열촉진성 렉틴(mitogenic lectins), 예컨대, 파이토헤마글루티닌(PHA)이 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하는 데 사용될 수 있다.

비-한정적 예로서, T 세포 집단은 예컨대, 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면 상에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들면, 브리오스타틴(bryostatin))와의 접촉에 의해 시험관내에서 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 보조자극을 위해, 상기 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들면, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들면, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-g, IL-4, IL-7, GM-CSF, -10, -2, IL-15, TGFp 및 TNF, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 세포 생장용 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존에 필요한 인자들을 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들면, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640, 또는 X-vivo 5, (Lonza))를 포함한다. 다른 세포 생장용 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate), 및 환원제, 예컨대, N-아세틸-시스테인 및 2-머캡토에탄올을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 배지는 아미노산, 나트륨 피루베이트 및 비타민이 첨가되어 있고 혈청을 함유하지 않거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정해진 호르몬 세트 및/또는 T 세포의 생장 및 증폭에 충분한 양의 사이토카인으로 보충된 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 및 X-Vivo 20(Optimizer)을 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들면, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물에만 포함되고, 대상체 내로 주입될 세포 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 생장을 뒷받침하기 위해 필요한 조건, 예를 들면, 적절한 온도(예를 들면, 37℃) 및 대기(예를 들면, 공기 플러스 5% C0₂) 하에 유지된다. 변경된 자극 횟수에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다.

또 다른 특정 실시양태에서, 상기 세포는 조직 또는 세포와의 공-배양에 의해 증폭될 수 있다. 상기 세포는 생체내에서, 예를 들면, 상기 세포를 대상체 내로 투여한 후 대상체의 혈액에서 증폭될 수도 있다.

치료적 적용

본 발명은 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는, 본 발명의 또 다른 목적인 조성물을 제공한다.

본원은 특히 면역요법용 약제로서 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포도 개시한다.

본원은 암의 치료에 사용되거나 염증을 약화시키기 위한 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포도 개시한다.

또 다른 실시양태에서, 상이한 방법들에 의해 수득된 단리된 세포 또는 이전에 기재된 바와 같이 상기 단리된 세포로부터 유래된 세포주는 약제로서 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약제는 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암의 치료, 특히 B 세포 림프종 및 백혈병의 치료에 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 세포 또는 상기 단리된 세포로부터 유래된 세포주는 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.

용어 "암"은 한 유형 또는 여러 유형의 세포의 신속한 및 비조절된 생장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암의 예는 본원에 기재되어 있고, 신경교모세포종, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 대장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병 및 폐암을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 EGFRvIII CAR로 예방되거나 치료되는 암은 신경교종, 바람직하게는 신경교모세포종, 보다 바람직하게는 다발성 신경교모세포종이다.

본원에서 사용된 용어 "EGFRvIII의 발현과 관련된 질환"은 EGFRvIII의 발현과 관련된 질환, 또는 다양한 암들, 예컨대, 신경교모세포종(신경교모세포종 줄기 세포를 포함함); 유방, 난소 및 비-소세포 폐 암종들; 두경부 편평 세포 암종; 수모세포종, 대장암, 전립선암 및 방광 암종의 종양 세포들을 포함하는, EGFRvIII을 발현하는 세포의 활성과 연관된 상태를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 용해는 본 발명의 EGFRvIII CAR T 세포가 EGFRvIII 발현 세포에 작용하여, 종양을 감소시키거나 제거하고, 종양 부위로의 숙주 면역 세포의 침윤을 용이하게 하고 항-종양 반응을 향상/연장시키는 기작들 중 하나이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 하기 단계들 중 하나 이상의 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:

(a) 이전에 기재된 방법들 중 어느 한 방법에 의해 수득될 수 있는 면역 세포를 제공하는 단계; 및

(b) 형질전환된 면역 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계.

한 실시양태에서, 본 발명의 상기 T 세포는 강력한 생체내 T 세포 증폭을 겪을 수 있고 연장된 시간 동안 지속될 수 있다.

상기 치료는 완화적, 치유적 또는 예방적 치료일 수 있다. 상기 치료는 자가 면역요법의 부분 또는 동종이계 면역요법 치료의 부분일 수 있다. 자가는 환자를 치료하는 데 사용되는 세포, 세포주 또는 세포 집단이 상기 환자 또는 인간 백혈구 항원(HLA) 적합성 기증자로부터 유래한다는 것을 의미한다. 동종이계는 환자를 치료하는 데 사용되는 세포 또는 세포 집단이 상기 환자로부터 유래하는 것이 아니라 기증자로부터 유래한다는 것을 의미한다.

개시된 방법들과 함께 사용될 수 있는 세포는 이전 단락에 기재되어 있다. 상기 치료는 진단받은 환자를 치료하는 데 사용될 수 있고, 이때 전구-악성 또는 악성 암은 EGFRvIII 발현 세포, 특히 EGFRvIII 발현 세포의 과다존재를 특징으로 하는 상태이다. 이러한 상태는 암, 예컨대, 폐암, 항문암 및 다형성 신경교모세포종에서 발견된다.

본 발명의 CAR로 치료되는 암의 유형은 폐암, 항문암 및 다형성 신경교모세포종을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암도 포함된다.

본 발명은 EGFRvIII과 관련된 질환 및 장애를 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. EGFRvIII과 관련된 질환 또는 장애의 일례는 신경교종이다.

신경교종은 신경아교 세포(예를 들면, 신경 세포를 둘러싸고 지지하고 희소돌기아교세포, 성상세포, 미세아교세포 및 뇌실막 세포를 포함하는 세포)에서 시작하는 중추신경계의 암을 지칭한다. 신경교종은 그의 상세한 병리학적 조직 유형에 따라 7개 초과의 유형들, 예컨대, 신경교모세포종 및 역형성 성상세포종으로 분류된다.

질환 단계(종양 크기, 원위 전이의 존재) 및 조직학적 악성은 일차 뇌 종양의 악성 정도를 결정할 때 사용된다. 조직학적 악성은 뇌 종양의 치료를 위한 지침에 따라 4개의 수준, 즉 G1 내지 G4로 분류되고((2002) Kanehara & Co., Ltd.), 이들은 각각 WH01 내지 WH04에 상응한다. 숫자가 클수록 악성 정도가 더 높아진다. 예를 들면, 신경교모세포종의 악성은 G4(WH04)인 반면, 역형성 성상세포종의 악성은 G3(WH03)이고, G3 및 G4 둘 다가 악성으로서 분류된다.

따라서, 특정 실시양태에 따라, 본 발명의 방법은 악성 신경교종을 표적화한다. 다른 양태에서, 본 발명은 다형성 신경교모세포종(GBM) 또는 다발성 신경교모세포종을 표적화한다.

추가 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 역형성 성상세포종, 거대 세포 신경교모세포종, 신경교육종, 역형성 희소돌기신경교종, 역형성 상의세포종, 맥락막총 암종, 역형성 신경절신경교종, 송과체모세포종, 수질상피종, 뇌실막모세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 및 비정형 기형종/횡문근양 종양을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 신경교종들의 치료에 사용될 수 있다.

신경교모세포종은 성인에서 가장 흔한 일차 뇌 종양이다. 해마다 악성 일차 뇌 종양으로 진단받은 환자의 절반 이상이 다형성 신경교모세포종을 가진다. 다형성 신경교모세포종은 높은 증식 지수, 미세혈관 증식 및 국소 괴사를 가진 역형성 고도 세포성 종양이다.

이들 병소들의 고도 증식성은 다수의 유사분열촉진 효과들로부터 비롯될 가능성이 높다. GBM의 특성들 중 하나는 내피 증식이다. 다수의 혈관신생 성장 인자들 및 이들의 수용체들이 GBM에서 발견된다.

다형성 신경교모세포종 예후는 여전히 암울하다. 생존 시간은 대다수의 환자들의 경우 2년 미만이다.

일차 다형성 신경교모세포종은 처음부터 신경아교 세포로부터 발생하고, 전형적으로 6개월 미만의 임상 이력을 갖고, 노인 환자에서 더 흔하고 소세포 조직구조를 나타낸다. 이차 다형성 신경교모세포종은 기존 저등급 성상세포종으로부터 수개월 또는 수년에 걸쳐 발생하고, 젊은 사람들에게 주로 영향을 미치고 거대 세포 조직구조를 나타낸다.

악성 신경교종도 고등급 신경교종으로서 공지되어 있다. 이 신경교종은 뇌 및 척수에 영향을 미칠 수 있다. 일부 양태들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 뇌 악성 신경교종, 예를 들면, 역형성 성상세포종(AA), 다형성 신경교모세포종(GBM), 역형성 희소돌기신경교종(AO) 및 역형성 올리고성상세포종(AOA) 중에서 선택된 뇌 악성 신경교종을 가진 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법은 EGFRvIII을 발현하는 세포 또는 조직을 가진 것을 특징으로 하는 대상체, 또는 EGFRvIII을 발현하는 세포 또는 조직을 가진 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 치료로부터 이익을 얻는 대상체는 예를 들면, 두통, 구역 및 구토 중 하나 이상, 발작, 시력 상실, 통증, 쇠약, 사지의 무감각, 및/또는 증가된 두개내 압력의 결과로서 두개 신경 장애의 존재에 의해 입증될 때 신경교종을 가진 대상체 또는 신경교종을 가진 것으로 의심되는 대상체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료되는 신경교종은 다형성 신경교모세포종이다. 본 실시양태에 따라, 다형성 신경교모세포종은 뇌 또는 척수에 존재할 수 있다.

본 발명에서, 면역 세포는 일차 면역 세포, 단리된 일차 면역 세포, 단리된 일차 면역 T 세포, 단리된 일차 면역 NK 세포, 단리된 일차 면역 TCR-KO T 세포, 바람직하게는 화학요법, 예컨대, 푸린 뉴클레오티드 유사체, 플라틴(시스플라틴 또는 카보플라틴), 항-토포이소머라제 I(이리노테칸), 항-토포이소머라제 II(에토포사이드) 및 메토트렉세이트(엽산 유사체)로부터 선택된 약물에 대한 내성을 나타내는 단리된 일차 면역 TCR-KO T 세포를 의미한다.

바람직하게는, 본 발명은 신경교모세포종, 보다 구체적으로 다발성 신경교모세포종의 치료에 사용되는, 본 발명의 효율적인 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포를 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 신경교모세포종, 보다 구체적으로 다형성 신경교모세포종의 치료에 사용되는, 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 24의 본 발명의 효율적인 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 환자는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 또는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교모세포종을 가진 환자이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 신경교모세포종, 보다 구체적으로 다발성 신경교모세포종의 치료에 사용되는, 본 발명의 효율적인 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포를 제공한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 역형성 성상세포종, 신경교모세포종, 신경교종, 신경교육종 또는 신경상피종을 가진 환자의 치료에 사용되는, 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 24의 본 발명의 효율적인 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포를 제공한다.

본원은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, EGFRvIII 발현 세포, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포에 대한 CTL 및/또는 탈과립화 활성을 나타내는 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포도 개시한다.

본원은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는,

- 힌지;

- 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포는 CD28로부터 유래된 서열, 특히 인간 CD28과 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 동일성을 가진 서열을 포함하지 않는 EGFRvIII CAR을 발현하고, 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되기 위해 제공된다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 일차 면역 T 세포에서 본 발명의 EGFRvIII CAR의 세포질내 및/또는 경막 도메인은 인간 CD28로부터 유래된 서열, 특히 인간 CD28과 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 동일성을 가진 서열을 포함하지 않고, 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되기 위해 제공된다.

암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는,

- 힌지;

- 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 본 발명의 일차 면역 T 세포가 제공된다.

바람직한 실시양태에서, 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, CD28의 서열을 포함하지 않고 CD8α의 신호 펩티드(리더 서열), TM 도메인 및 힌지를 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 본 발명의 일차 면역 T 세포가 제공된다.

한 실시양태에서, 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, 인간 CD8α의 리더 서열, 또는 서열번호 1과 95% 이상의 동일성을 가진, 바람직하게는 서열번호 1의 리더 서열을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 본 발명의 일차 면역 T 세포가 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, 서열번호 2의 리더 서열 또는 서열번호 2와 95% 이상의 동일성을 가진 리더 서열을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 본 발명의 일차 면역 T 세포가 제공된다.

한 실시양태에서, 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는,

- 인간 CD8α 쇄(CD8α)의 힌지;

- 인간 CD8α의 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 인간 IgG1의 힌지;

- 인간 CD8α의 경막 도메인;

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 신호 펩티드를 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 포괄한다.

본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, 힌지, 바람직하게는 CD8α, IgG1 또는 FCRIII의 힌지(도 2 참조), 보다 바람직하게는 CD8α의 힌지, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 4를 가진 힌지에 연결된 항-EGFRvII scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, 힌지, 바람직하게는 CD8α의 힌지, CD8α의 TM 및 CD8α의 신호 펩티드, 훨씬 더 바람직하게는 서열번호 4를 가진 힌지, CD8α의 TM 및 CD8α의 신호 펩티드에 연결된 항-EGFRvII scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는,

- 신호 펩티드, 바람직하게는 CD8α의 신호 펩티드, 보다 바람직하게는 CD8α의 서열번호 1의 신호 펩티드;

- 인간 CD8α 쇄의 힌지 또는 인간 IgG1의 힌지;

- CD8α의 경막 도메인(TM);

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

보다 바람직하게는, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는,

- 인간 CD8α의 신호 펩티드;

- 인간 CD8α 쇄의 힌지 또는 인간 IgG1의 힌지;

- CD8α의 경막 도메인(TM);

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

훨씬 더 바람직하게는, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는,

- 인간 CD8α의 신호 펩티드;

- 인간 CD8α 쇄의 힌지 또는 인간 IgG1의 힌지;

- CD8α의 경막 도메인(TM);

- 인간 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인

- VH, 링커 및 VL을 포함하는 항-EGFRvIII scFv;

- CD8α 힌지;

- CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함하는 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포가 제공된다.

- VL, 링커 및 VH를 포함하는 항-EGFRvIII scFv;

- CD8α 힌지;

- CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

- VH, 링커 및 VL을 포함하는 항-EGFRvIII scFv;

- CD8α 힌지;

- CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

으로 구성된 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포가 제공된다.

- 인간 CD8α 리더 서열(CD8α 리더 또는 CD8α 신호 펩티드);

- 인간 CD8α 힌지;

- 인간 CD8α TM;

- 4-1BB의 보조자극 신호 분자; 및

- 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

을 포함하는 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포가 제공된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는,

- 서열번호 4의 인간 CD8α 힌지;

- 서열번호 6의 인간 CD8α TM;

- 4-1BB의 서열번호 8의 보조자극 신호 분자; 및

- 서열번호 9의 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

- 서열번호 4의 인간 CD8α 힌지;

- 서열번호 6의 인간 CD8α TM;

- 4-1BB의 서열번호 8의 보조자극 신호 분자; 및

- 서열번호 9의 세포내 CD3ζ 신호전달 도메인

- 서열번호 8로 구성된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진, 인간 4-1BB(또는 4-1BB 세포내 도메인)로부터 유래된 보조자극 신호 분자; 및

바람직한 실시양태에서, 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는 일차 면역 T 세포에서 발현되는 본 발명의 EGFRvIII CAR은 CD28 또는 인간 CD28, 특히 인간 CD28 세포내 신호전달 도메인의 임의의 서열을 포함하지 않는다.

보다 바람직한 실시양태에서, 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는 본 발명의 일차 면역 T 세포에서 발현되는 본 발명의 EGFRvIII CAR은 인간 CD28, 특히 인간 CD28 세포내 신호전달 도메인의 임의의 서열을 포함하지 않고, 바람직하게는 EGFRvIII에 대해 특이적인 scFv의 VH 도메인에 융합된, CD8α의 신호 펩티드를 추가로 함유한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는 서열번호 25의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는 서열번호 26의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는 서열번호 27의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는 서열번호 24 또는 서열번호 25의 EGFRvIII CAR, 보다 바람직하게는 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는 서열번호 24 또는 서열번호 25의 EGFRvIII CAR, 보다 바람직하게는 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, EGFRvIII 발현 세포, 바람직하게는 EGFRvIII 발현 암세포에 대한 CTL 및/또는 탈과립화 활성을 나타내는 서열번호 24의 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, 서열번호 24의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, 서열번호 25의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, 서열번호 26의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종, 보다 바람직하게는 다형성 신경교모세포종(GBM)의 치료에 사용되는, 서열번호 27의 폴리펩티드와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 면역 T 세포를 제공한다.

본 발명에 따른 조작된 면역 세포를 사용한 치료는 항체 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법 및 방사선 요법으로 구성된 군으로부터 선택된, 암에 대한 하나 이상의 요법과 병용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 상기 치료는 면역억제 치료를 받는 환자 내로 투여될 수 있다. 사실상, 본 발명은 바람직하게는 면역억제제에 대한 수용체를 코딩하는 유전자의 불활성화로 인해 하나 이상의 면역억제제에 대한 내성을 갖게 되는 세포 또는 세포 집단에 의존한다. 이와 관련하여, 면역억제 치료는 환자 내에서 본 발명에 따른 T 세포의 선택 및 증폭을 도울 것이다.

본 발명에 따른 세포 또는 세포 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 매식 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내로, 근육내로, 정맥내 또는 림프내 주사에 의해, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여된다.

세포 또는 세포 집단의 투여는 체중 kg당 10⁴개 내지 10⁹개의 세포, 바람직하게는 체중 kg당 10⁵개 내지 10⁶개의 세포(이 범위들 내의 세포 수의 모든 정수 값들을 포함함)의 투여로 구성될 수 있다. 세포 또는 세포 집단은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 세포가 단일 용량으로서 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 세포가 일정 기간에 걸쳐 하나 초과의 용량으로서 투여되다. 투여 시간조절은 관리하는 의사의 판단 내에 있고 환자의 임상적 상태에 의해 좌우된다. 세포 또는 세포 집단은 임의의 공급원, 예컨대, 혈액 은행 또는 기증자로부터 수득될 수 있다. 개별 요구가 다르지만, 특정 질환 또는 상태에 대한 소정의 유형의 세포의 유효량의 최적 범위의 결정은 당분야의 기술 내에 있다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 용량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 존재하는 경우 현행 치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질에 의해 좌우될 것이다.

또 다른 실시양태에서, 유효량의 세포 또는 이 세포를 포함하는 조성물이 비경구 투여된다. 상기 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내로의 주사에 의해 직접적으로 수행될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태들에서, 세포는 항바이러스 요법, 시도포비르(cidofovir) 및 인터류킨-2와 같은 물질을 사용한 치료, MS 환자를 위한 사이타라빈(Cytarabine)(ARA-C로서도 공지되어 있음) 또는 나탈리주맙(natalizumab) 치료, 건선 환자를 위한 에팔리즈티맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자를 위한 다른 치료를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 수의 관련 치료 방식과 함께(예를 들면, 전에, 동시에 또는 후에) 환자에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 T 세포는 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506, 항체 또는 다른 면역제거제, 예컨대, CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코플리에놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및 방사선조사와 함께 사용될 수 있다. 이 약물들은 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린(calcineurin)을 억제하거나(사이클로스포린 및 FK506), 성장 인자에 의해 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다(라파마이신)(Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993).

추가 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 화학요법제, 예컨대, 플루다라빈을 사용한 T 세포 제거 요법, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스프아미드, 또는 항체, 예컨대, OKT3 또는 CAMPATH와 함께(예를 들면, 전에, 동시에 또는 후에) 환자에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 B 세포 제거 요법, 예컨대, CD20과 반응하는 물질, 예를 들면, 리툭산(Rituxan) 후에 투여된다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 대상체는 고용량 화학요법을 사용한 표준 치료를 받은 후, 말초혈 줄기 세포 이식을 받을 수 있다. 일부 실시양태들에서, 이식 후, 대상체는 본 발명의 증폭된 면역 세포의 주입을 제공받는다. 추가 실시양태에서, 증폭된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.

다른 정의

폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기는 본원에서 1-문자 코드에 따라 표기되는데, 예를 들면, Q는 Gln 또는 글루타민 잔기를 의미하고, R은 Arg 또는 아르기닌 잔기를 의미하고, D는 Asp 또는 아스파르트산 잔기를 의미한다.

아미노산 치환은 펩티드 서열에서 한 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것, 예를 들면, 아르기닌 잔기가 글루타민 잔기로 대체되는 것을 의미한다.

뉴클레오티드는 다음과 같이 표기된다: 1-문자 코드가 뉴클레오시드의 염기를 표기하는 데 사용된다: a는 아데닌이고, t는 타이민이고, c는 사이토신이고, g는 구아닌이다. 축퇴된 뉴클레오티드의 경우, r은 g 또는 a(푸린 뉴클레오티드)를 표시하고, k는 g 또는 t를 표시하고, s는 g 또는 c를 표시하고, w는 a 또는 t를 표시하고, m은 a 또는 c를 표시하고, y는 t 또는 c(피리미딘 뉴클레오티드)를 표시하고, d는 g, a 또는 t를 표시하고, v는 g, a 또는 c를 표시하고, b는 g, t 또는 c를 표시하고, h는 a, t 또는 c를 표시하고, n은 g, a, t 또는 c를 표시한다.

본원에서 사용된 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오티드, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성된 단편, 및 라이게이션(ligation), 절단(scission), 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 작용에 의해 생성된 단편을 지칭한다. 핵산 분자는 천연 뉴클레오티드(예컨대, DNA 및 RNA) 또는 천연 뉴클레오티드의 유사체(예를 들면, 천연 뉴클레오티드의 거울상이성질체 형태), 또는 이들의 조합물인 단량체로 구성될 수 있다. 변경된 뉴클레오티드는 당 모이어티 및/또는 피리미딘 또는 푸린 염기 모이어티에서 변경을 가질 수 있다. 당 변경은 예를 들면, 할로겐, 알킬 기, 아민 및 아지도 기에 의한 하나 이상의 하이드록실 기의 대체를 포함하거나, 당은 에테르 또는 에스테르로서 작용화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 모이어티는 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조물, 예컨대, 아자-당 및 카보사이클릭 당 유사체로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변경의 예에는 알킬화된 푸린 및 피리미딘, 아실화된 푸린 또는 피리미딘, 또는 다른 잘 공지된 헤테로사이클릭 치환기가 포함된다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 결합의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산일 수 있다.

키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 세포 상에 존재하는 성분에 대한 결합 도메인, 예를 들면, 원하는 항원(예를 들면, 종양 항원)에 대한 항체-기초 특이성과 T 세포 수용체 활성화 세포내 도메인을 겸비하여, 특이적 항-표적 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하는 분자를 의미한다. 일반적으로, CAR은 T 세포 항원 수용체 복합체 ζ 쇄의 세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 단일 쇄 항체(scFvFc)(scFvFc:ζ)로 구성되고, T 세포에서 발현될 때 단일클론 항체의 특이성에 기초한 항원 인식의 방향을 바꾸는 능력을 가진다. 본 발명에서 사용되는 CAR의 일례는 EGFRvIII 항원 쪽으로 향하는 CAR이고 하기 아미노산 서열들을 비-한정적 예로서 포함할 수 있다: 서열번호 15 내지 18, 바람직하게는 서열번호 24 내지 27, 보다 바람직하게는 서열번호 24, 보다 바람직하게는 인간화된 서열번호 24 내지 27, 보다 바람직하게는 인간화된 서열번호 24.

본 발명의 CAR을 발현하는 일차 T 세포는 EGFRvIII에 대한 하나 이상의 결합 도메인, 예를 들면, 원하는 종양 항원(EGFRvIII)에 대한 항체-기초 특이성과 T 세포 수용체 활성화 세포내 도메인을 겸비하여, 특이적 항-표적 세포 면역 활성(CTL 활성)을 나타내는 키메라 단백질을 생성하는 분자를 발현하는 일차 T 세포를 의미한다.

일반적으로, 본 발명의 EGFRvIII CAR을 발현하는 T 세포는 단일클론 항체의 특이성에 기초한 항원 인식의 방향을 바꾸고 표적화된 세포의 파괴를 유도한다. 용어 "엔도뉴클레아제"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내에서 핵산들 사이의 결합의 가수분해(절단)를 촉진할 수 있는 임의의 야생형 또는 변이체 효소를 지칭한다. 엔도뉴클레아제는 그의 서열과 관계 없이 DNA 또는 RNA 분자를 절단하지 않으나, "표적 서열" 또는 "표적 부위"로서도 지칭되는 특정 폴리뉴클레오티드 서열에서 DNA 또는 RNA 분자를 절단한다. 엔도뉴클레아제는 전형적으로 길이 면에서 12개 염기쌍(bp)보다 더 큰, 보다 바람직하게는 14 내지 55 bp의 폴리뉴클레오티드 인식 부위를 가질 때 희귀-절단 엔도뉴클레아제로서 분류될 수 있다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 정해진 좌위에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 유도함으로써 HR을 유의하게 증가시킨다(Perrin, Buckle et al. 1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud and Silva 2007). 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 예를 들면, 귀소(homing) 엔도뉴클레아제(Paques and Duchateau 2007), 조작된 징크-핑거(Zinc-Finger) 도메인과 제한효소의 촉매 도메인, 예컨대, Fok-I의 융합으로부터 생성된 키메라 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)(Porteus and Carroll 2005), CRISPR 시스템의 Cas9 엔도뉴클레아제(Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) 또는 화학적 엔도뉴클레아제(Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006)일 수 있다. 화학적 엔도뉴클레아제에서, 화학적 또는 펩티드성 절단제는 핵산의 중합체, 또는 특정 표적 서열을 인식하는 또 다른 DNA에 접합됨으로써, 절단 활성을 특정 서열에 표적화한다. 화학적 엔도뉴클레아제는 특정 DNA 서열에 결합하는 것으로 공지되어 있는 합성 뉴클레아제, 예컨대, 오르토펜안쓰롤린, DNA 절단 분자 및 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)의 접합체도 포괄한다(Kalish and Glazer 2005). 이러한 화학적 엔도뉴클레아제는 본 발명에 따른 용어 "엔도뉴클레아제"에 포함된다.

"TALE-뉴클레아제"(TALEN)는 전형적으로 전사 활성화제 유사 이펙터(TALE) 로부터 유래된 핵산 결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하는 하나의 뉴클레아제 촉매 도메인으로 구성된 융합 단백질을 의미한다. 촉매 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인, 보다 바람직하게는 엔도뉴클레아제 활성을 가진 도메인, 예를 들면, I-Tevl, ColE7, NucA 및 Fok-I이다. 특정 실시양태에서, TALE 도메인은 메가뉴클레아제, 예를 들면, I-Crel 및 I-Onul 또는 이들의 기능성 변이체에 융합될 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 뉴클레아제는 단량체성 TALE-뉴클레아제이다. 단량체성 TALE-뉴클레아제는 특이적 인식 및 절단을 위해 이량체화, 예컨대, 조작된 TAL 반복부와 국제 특허출원 공개 제WO2012/138927호에 기재된 I-Tevl의 촉매 도메인의 융합을 요구하지 않는 TALE-뉴클레아제이다. 전사 활성화제 유사 이펙터(TALE)는 복수의 반복된 서열들을 포함하는, 세균 종 잔토모나스(Xanthomonas)의 단백질이고, 이때 각각의 반복부는 핵산 표적화된 서열의 각각의 뉴클레오티드 염기에 대해 특이적인 위치 12 및 13(RVD)에서 2개의 잔기들을 포함한다. 유사한 모듈식 염기-당-염기 핵산 결합 성질(MBBBD)을 가진 결합 도메인들도 상이한 세균 종들에서 본 출원인에 의해 최근에 발견된 신규 모듈식 단백질로부터 유래될 수 있다. 신규 모듈식 단백질은 TAL 반복부보다 더 큰 서열 가변성을 나타낸다는 장점을 가진다. 바람직하게는, 상이한 뉴클레오티드들의 인식과 관련된 RVD들은 C를 인식하기 위한 HD, T를 인식하기 위한 NG, A를 인식하기 위한 NI, G 또는 A를 인식하기 위한 NN, A, C, G 또는 T를 인식하기 위한 NS, T를 인식하기 위한 HG, T를 인식하기 위한 IG, G를 인식하기 위한 NK, C를 인식하기 위한 HA, C를 인식하기 위한 ND, C를 인식하기 위한 HI, G를 인식하기 위한 HN, G를 인식하기 위한 NA, G 또는 A를 인식하기 위한 SN, T를 인식하기 위한 YG, A를 인식하기 위한 TL, A 또는 G를 인식하기 위한 VT, 및 A를 인식하기 위한 SW이다. 또 다른 실시양태에서, 핵심적인 아미노산들 12 및 13은 뉴클레오티드 A, T, C 및 G에 대한 그들의 특이성을 조절하기 위해, 구체적으로 이 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다. TALE-뉴클레아제는 이미 기재되어 있고 유전자 표적화 및 유전자 변경을 자극하는 데 사용되고 있다(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). 주문제작된 TAL-뉴클레아제는 상표명 TALEN™(Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France) 하에 상업적으로 입수될 수 있다.

본 발명에 따른 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제일 수도 있다. 최근에, II형 원핵 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats) 입양 면역 시스템(검토를 위해서는 문헌[Sorek, Lawrence et al. 2013] 참조)으로부터 RNA-안내된 Cas9 뉴클레아제(Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013)에 기초한 새로운 게놈 조작 수단이 개발되었다. CRISPR 관련(Cas) 시스템은 세균에서 먼저 발견되었고 외래 바이러스 또는 플라스미드 DNA에 대한 방어로서 작용한다. CRISPR-매개된 게놈 조작은 프로토스페이서(protospacer) 인접 모티프(PAM)로서 지칭되는 짧은 서열 모티프에 의해 종종 플랭킹된 표적 서열의 선택에 의해 먼저 진행된다. 표적 서열 선택 후, 이 표적 서열에 상보적인 특이적 crRNA가 조작된다. CRISPR II형 시스템에서 요구되는 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)는 crRNA와 페어링되고 제공된 Cas9 단백질에 결합한다. Cas9는 tracRNA와 cRNA의 염기 페어링을 용이하게 하는 분자 고착제(anchor)로서 작용한다(Deltcheva, Chylinski et al. 2011). 이 사원 복합체에서, 이중 tracrRNA:crRNA 구조물은 엔도뉴클레아제 Cas9를 동족 표적 서열로 향하게 하는 가이드 RNA로서 작용한다. Cas9-tracrRNA:crRNA 복합체에 의한 표적 인식은 표적 서열과 crRNA 사이의 상동성에 대해 표적 서열을 스캐닝함으로써 시작된다. 표적 서열-crRNA 상보성 이외에, DNA 표적화는 프로토스페이서에 인접한 짧은 모티프(프로토스페이서 인접 모티프 - PAM)의 존재를 요구한다. 이중 RNA와 표적 서열 사이의 페어링 후, Cas9는 후속적으로 PAM 모티프의 3개 염기 업스트림에서 블런트 이중 가닥 절단을 도입한다(Garneau, Dupuis et al. 2010).

희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제라는 명칭으로서도 공지되어 있는 귀소 엔도뉴클레아제일 수 있다. 이러한 귀소 엔도뉴클레아제는 당분야에서 잘 공지되어 있다(Stoddard 2005). 귀소 엔도뉴클레아제는 DNA 표적 서열을 인식하고 단일 또는 이중 가닥 절단을 생성한다. 귀소 엔도뉴클레아제는 고도로 특이적이므로, 길이 면에서 12개 내지 45개 염기쌍들(bp), 통상적으로 길이 면에서 14개 내지 40개 bp를 가진 DNA 표적 부위를 인식한다. 본 발명에 따른 귀소 엔도뉴클레아제는 예를 들면, LAGLIDADG 엔도뉴클레아제, HNH 엔도뉴클레아제 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 상응할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 귀소 엔도뉴클레아제는 I-Crel 변이체일 수 있다.

"전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"은 본 발명에서 요구되는 물질/화학물질 및 분자(단백질 또는 핵산)를 세포와 접촉시키거나(즉, "접촉") 세포 또는 하위세포 구획 내부로 전달하기(즉, "도입") 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 임의의 전달 벡터를 의미한다. 전달 벡터는 리포좀 전달 벡터, 바이러스 전달 벡터, 약물 전달 벡터, 화학적 담체, 중합체성 담체, 리포플렉스(lipoplexes), 폴리플렉스(polyplexes), 덴드리머(dendrimers), 마이크로버블(microbubbles)(초음파 조영제), 나노입자, 에멀전 또는 다른 적절한 전달 벡터를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이들 전달 벡터들은 분자, 화학물질, 거대분자(유전자, 단백질), 다른 벡터, 예컨대, 플라스미드, 또는 디아토스(Diatos)에 의해 개발된 펩티드의 전달을 가능하게 한다. 이 경우, 전달 벡터는 분자 담체이다. "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"은 형질감염을 수행하기 위한 전달 방법도 의미한다.

용어 "벡터" 또는 "벡터들"은 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 본 발명에서 "벡터"는 염색체성, 비-염색체성, 반합성 또는 합성 핵산으로 구성될 수 있는 바이러스 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 또는 선형 또는 환형 DNA 또는 RNA 분자를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 벡터들은 자가복제할 수 있고/있거나(에피좀성 벡터) 그 자신에 연결되어 있는 핵산을 발현할 수 있는(발현 벡터) 벡터들이다. 많은 수의 적합한 벡터들이 당업자에게 공지되어 있고 상업적으로 입수될 수 있다(예는 도 4 및 5에 표시되어 있음).

바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스(예를 들면, 아데노 관련 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 오르토믹소바이러스(예를 들면, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스(예를 들면, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들면, 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 피코르나바이러스 및 알파바이러스, 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들면, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 및 2형, 엡스테인-바 바이러스, 사이토메갈로바이러스) 및 폭스바이러스(예를 들면, 백시니아, 파울폭스 및 카나리폭스)를 포함하는 이중 가닥 DNA 바이러스를 포함한다. 다른 바이러스는 예를 들면, 노르워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예에는 조류 백혈병-육종, 포유동물 C형 바이러스, B형 바이러스 및 D형 바이러스, HTLV-BLV 군, 렌티바이러스 및 스푸마바이러스가 포함된다(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

"렌티바이러스 벡터"는 그의 상대적으로 큰 팩키징 성능, 감소된 면역원성 및 매우 다양한 유형의 상이한 세포들을 고효율로 안정하게 형질도입하는 그의 능력 때문에 유전자 전달용으로 매우 유망한 HIV-기초 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 렌티바이러스 벡터는 통상적으로 3개 이상의 플라스미드들(팩키징, 외피 및 전달)을 생산자 세포 내로 일시적으로 형질감염시킨 후 생성된다. 렌티바이러스 벡터는 HIV처럼 바이러스 표면 당단백질과 세포 표면 상의 수용체의 상호작용을 통해 표적 세포 내로 들어간다. 들어갔을 때, 바이러스 RNA는 바이러스 역전사효소 복합체에 의해 매개되는 역전사를 겪는다. 역전사의 생성물은 감염된 세포의 DNA 내로의 바이러스 통합을 위한 기질인 이중 가닥 선형 바이러스 DNA이다. "통합형 렌티바이러스 벡터(또는 LV)"는 비-한정적 예로서 표적 세포의 게놈과 통합할 수 있는 이러한 벡터를 의미한다. 대조적으로, "비-통합형 렌티바이러스 벡터(또는 NILV)"는 바이러스 인티그라제(integrase)의 작용을 통해 표적 세포의 게놈과 통합하지 않는 효율적인 유전자 전달 벡터를 의미한다.

전달 벡터 및 벡터는 임의의 세포 투과능화 기법, 예컨대, 초음파천공(sonoporation) 또는 전기천공, 또는 이 기법들로부터 유도된 기법들과 공용될 수 있거나 병용될 수 있다.

세포 또는 세포들은 임의의 진핵 생체 세포들, 및 시험관내 배양을 위해 이 유기체들로부터 유도된 일차 세포 및 세포주를 의미한다.

"일차 세포" 또는 "일차 세포들"은 생체 조직(즉, 생검 물질)으로부터 직접적으로 채취된 후 시험관내에서 생장하도록 확립된 세포로서, 연속적 종양발생성 또는 인공적으로 불멸화된 세포주에 비해 매우 적은 집단 배증(doubling)을 겪음으로써, 그 자신이 유래된 조직의 주요 기능적 성분들 및 특성들을 더 잘 대표하는 세포를 의미한다.

비-한정적 예로서, 세포주는 CHO-K1 세포; HEK293 세포; Caco2 세포; U2-OS 세포; NIH 3T3 세포; NSO 세포; SP2 세포; CHO-S 세포; DG44 세포; K-562 세포, U-937 세포; MRC5 세포; IMR90 세포; Jurkat 세포; HepG2 세포; HeLa 세포; HT-1080 세포; HCT-116 세포; Hu-h7 세포; Huvec 세포; 및 Molt 4 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

모든 이들 세포주들은 관심 있는 유전자 또는 단백질을 생성하거나, 발현시키거나, 정량하거나, 검출하거나 연구하기 위한 세포주 모델을 제공하도록 본 발명의 방법에 의해 변경될 수 있고; 이들 모델들은 연구 및 생산, 및 다양한 분야들, 예컨대, 비-한정적 예로서 화학물질, 생물연료, 치료제 및 농업경제에서 관심 있는 생물학적 활성 분자를 스크리닝하는 데 사용될 수도 있다.

"돌연변이"는 폴리뉴클레오티드(cDNA, 유전자) 또는 폴리펩티드 서열에서의 최대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 또는 더 많은 수의 뉴클레오티드/아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 돌연변이는 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다. 돌연변이는 게놈 서열의 구조 또는 코딩된 mRNA의 구조/안정성에도 영향을 미칠 수 있다.

"변이체"는 모 분자의 아미노산 서열에서의 하나 이상의 잔기의 돌연변이 또는 교체에 의해 수득된 반복부 변이체, 변이체, DNA 결합 변이체, TALE-뉴클레아제 변이체 또는 폴리펩티드 변이체를 의미한다.

"기능성 변이체"는 단백질 또는 단백질 도메인의 촉매 활성 돌연변이체를 의미하고; 이러한 돌연변이체는 그의 모 단백질 또는 단백질 도메인과 비교될 때 동일한 활성, 추가 성질, 또는 더 높거나 더 낮은 활성을 가질 수 있다.

"동일성"은 2개의 핵산 분자들 또는 폴리펩티드들 사이의 서열 동일성을 지칭한다. 동일성은 비교를 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열에서 위치를 비교함으로써 확인될 수 있다. 비교된 서열에서 한 위치가 동일한 염기에 의해 점유되어 있을 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산 서열들 사이의 유사성 또는 동일성의 정도는 핵산 서열들에 의해 공유된 위치에서 동일한 또는 일치하는 뉴클레오티드의 수의 함수이다. GCG 서열 분석 팩키지(University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 부분으로서 입수될 수 있는 FASTA 또는 BLAST를 포함하는 다양한 정렬 알고리즘들 및/또는 프로그램들이 2개의 서열들 사이의 동일성을 계산하는 데 사용될 수 있고, 예를 들면, 디폴트(default) 설정으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 특정 폴리펩티드와 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖고 바람직하게는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 폴리펩티드뿐만 아니라, 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 고려된다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 유사성 점수는 BLOSUM62의 사용에 기초할 것이다. BLASTP가 사용될 때, 퍼센트 유사성은 BLASTP 양의 점수에 기초하고, 퍼센트 서열 동일성은 BLASTP 동일성 점수에 기초한다. BLASTP "동일성" 점수는 동일한 고점수 서열 쌍에서 총 잔기들의 수 및 분율을 보여주고; BLASTP "양의" 점수는 정렬 점수가 양의 값을 갖고 서로 유사한 잔기들의 수 및 분율을 보여준다. 본원에 개시된 아미노산 서열과 이들 정도의 동일성 또는 유사성, 또는 임의의 중간 정도의 동일성 또는 유사성을 가진 아미노산 서열은 본 개시에 의해 고려되고 포괄된다. 유사한 폴리펩티드들의 폴리뉴클레오티드 서열들은 유전 코드의 이용을 통해 유추되고 통상적인 수단, 특히 유전 코드를 사용한 그의 아미노산 서열의 역번역에 의해 수득될 수 있다.

"신호 전달도입 도메인" 또는 "보조자극 리간드"는 T 세포 상의 동족 보조자극 분자에 특이적으로 결합함으로써, 예를 들면, TCR/CD3 복합체와 펩티드로 적재된 MHC 분자의 결합에 의해 제공된 일차 신호 이외에 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포 상의 분자를 지칭한다. 보조자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 보조자극 리간드(ICOS-L), 세포내 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 톨 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체, 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 보조자극 리간드는 특히 T 상에 존재하는 보조자극 분자, 예컨대, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드(그러나, 이들로 한정되지 않음)에 특이적으로 결합하는 항체도 포괄한다.

"보조자극 분자"는 보조자극 리간드에 특이적으로 결합함으로써, 세포에 의한 보조자극 반응, 예컨대, 증식(그러나, 이것으로 한정되지 않음)을 매개하는, T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 보조자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 "보조자극 신호"는 일차 신호, 예컨대, TCR/CD3 라이게이션과 함께 T 세포 증식 및/또는 핵심 분자의 상향조절 또는 하향조절을 유발하는 신호를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "세포외 리간드 결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드로서 정의된다. 바람직하게는, 상기 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들면, 세포외 리간드 결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예에는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암세포와 관련된 세포 표면 마커가 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 비-인간 영장류 및 인간을 포함하는 동물 계의 모든 구성원들을 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 신경교종, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종을 가진 인간이다. 환자는 본 발명에 따른 치료로부터 이익을 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 설명은 임의의 당업자가 본 발명을 만들고 사용할 수 있도록 본 발명을 만들고 사용하는 방식 및 방법을 제공하는데, 이 실시가능성은 특히 원래의 설명의 일부를 구성하는, 첨부된 청구범위의 보호대상을 위해 제공된다.

수치적 한계 또는 범위가 본원에서 언급되는 경우, 종점이 포함된다. 또한, 수치적 한계 또는 범위 내의 모든 값들 및 하위범위들은 마치 명확히 작성된 것처럼 구체적으로 포함된다.

상기 설명은 당업자가 본 발명을 만들고 사용할 수 있기 위해 제공되고, 특정 적용 및 이의 요건과 관련하여 제공된다. 바람직한 실시양태들에 대한 다양한 변경들은 당업자에게 용이하게 자명할 것이고, 본원에서 정의된 일반 이론은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시양태들 및 분야에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 제시된 실시양태들로 한정되지 않고, 본원에 개시된 원리 및 특징과 일치하는 가장 넓은 범위가 부여되어야 한다.

일반적인 방법

EGFRvIII CAR

전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2010/0105136호 및 제2010/0105136호(A1)에 이미 기재된 방법에 따라 상이한 scFv를 사용하여 EGFRvIII CAR들을 제조하였다.

CAR의 스크리닝 및 선택

일차 T 세포 배양

피콜(Ficoll) 구배 밀도 배지를 사용하여 EFS(Etablissement Francais du Sang, Paris, France)에 의해 제공된 버피 코트(Buffy coat) 샘플로부터 T 세포를 정제하였다. PBMC 층을 회수하고 상업적으로 입수될 수 있는 T 세포 농축 키트를 사용하여 T 세포를 정제하였다. 정제된 T 세포를 20 ng/㎖ 인간 IL-2, 5% 인간 혈청 및 다이나비드(Dynabeads) 인간 T 활성화제 CD3/CD28(Life Technologies)로 보충된 X-Vivo™-15 배지(Lonza)에서 1:1의 비드:세포 비로 활성화시켰다.

CAR mRNA 형질감염

상이한 CAR 구축물들을 코딩하는 CAR mRNA들의 형질감염을 T 세포 정제 및 활성화 후 4일째 날 또는 11일째 날에 수행하였다. 세포를 X-Vivo™-15 배지로 즉시 희석하고 5% CO₂와 함께 37℃에서 항온처리하였다. 전기천공을 수행한 지 2시간 후, 20 ng/㎖의 IL-2를 첨가하였다.

CAR의 발현을 가능하게 하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 사용한 T 세포 형질도입

T 세포 정제/활성화를 수행한 지 3일 후, CAR을 발현하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 사용한 T 세포의 형질도입을 수행하였다. HEK-293 세포에서의 게놈 및 헬퍼 플라스미드의 형질감염에 의해 벡타라이스 에스에이(Vectalys SA)(프랑스 툴루즈 소재)에 의해 제조된 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 형질감염을 5의 감염 다중도(multiplicity of infection)에서 수행하였다. 뮤린 IgG1 Fc 단편(레이크파마(LakePharma)에 의해 제조됨)과 함께 융합된 인간 EGFRvIII 단백질의 세포외 도메인으로 구성된 재조합 단백질을 사용하여 T 세포의 표면에서 CAR 검출을 수행하였다. 이 단백질과 CAR 분자의 결합을, 상기 단백질의 마우스 Fc 부분을 표적화하는 PE-접합된 이차 항체(Jackson Immunoresearch)로 검출하고 유세포분석(flow cytometry)으로 분석하였다.

일차 T 세포에서의 특정 유전자의 불활성화

CAR을 T 세포 내로 도입하기 전 또는 후, 일차 T 세포에서의 특정 유전자의 불활성화를 수행할 수 있다.

하나 이상의 유전자를 불활성화시키고, 한 단계에서 1개, 2개 또는 3개의 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 2개의 유전자들, 바람직하게는 TCRα 유전자, 및 푸린 뉴클레오티드 유사체, 플라틴(시스플라틴 또는 카보플틴), 항-토포이소머라제 I(이리노테칸), 항-토포이소머라제 II(에토포사이드) 및 메토트렉세이트(엽산 유사체)로부터 선택된 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 불활성화시킨다.

일반적으로, 표적 유전자 내의 스페이서에 의해 분리된 2개의 긴 서열들(절반 표적으로서 지칭됨)을 표적화하는 이종이량체성 뉴클레아제, 특히 TALE-뉴클레아제를 디자인하고 생성한다.

각각의 TALE-뉴클레아제 구축물을 적절한 포유동물 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 프로모터의 다운스트림에서 코딩 서열을 보유하는 플라스미드로부터 표적화된 게놈 서열을 절단하는 TALE-뉴클레아제를 코딩하는 mRNA를 합성할 수 있다. 항-CD3/CD28 코팅된 비드에 의해 미리 활성화된 정제된 T 세포를 사용하고 절반 TALE-뉴클레아제들 둘 다를 코딩하는 2개의 mRNA들 각각으로 형질감염시킨다. 세포를 가용성 항-CD28로 재활성화시켜 다양한 시간 동안 세포 증식을 측정할 수 있고 활성화 마커 CD25를 검출하여 세포의 활성화 상태를 평가할 수 있다.

탈과립화 분석(CD107a 이동)

T 세포를, 다양한 수준의 표적화된 단백질(EGFRvIII)을 발현하는 동일한 양의 세포와 함께 96-웰 플레이트에서 항온처리하였다. 5% CO₂를 사용하여 37℃에서 6시간 동안 공-배양을 유지하였다. 대조군으로서 항-CD49d, 항-CD28 및 1x 모넨신(Monensin) 용액과 함께 형광 항-CD107a 항체를 공-배양의 초기에 첨가함으로써 세포 자극 동안 CD107a 염색을 수행하였다. 6시간 항온처리 기간 후, 세포를 고정가능한 생존력 염료 및 플루오로크롬(fluorochrome)-접합된 항-CD8로 염색하고 유세포분석으로 분석하였다. CD8+ 세포들 중에서 CD107a 염색에 대한 평균 형광 강도 신호(MFI)를 측정함으로써 탈과립화 활성을 CD8+/CD107a+ 세포의 %로서 측정하였다. mRNA 형질감염을 수행한 지 24시간 후, 탈과립화 분석을 수행하였다.

IFNγ 방출 분석

mRNA 형질감염을 수행한 지 24시간 후, CAR 발현 T 세포를, 37℃에서 24시간 동안 다양한 수준의 표적화된 단백질을 발현하는 세포주와 함께 항온처리하였다. 상청액을 회수하였고 세포 배양물 상청액에서의 IFNγ 검출을 ELISA 분석으로 수행하였다.

세포독성 분석

T 세포를 동일한 웰에서 10,000개의 표적 세포들(다양한 수준의 표적화된 단백질을 발현함) 또는 (음성 대조군) 세포와 함께 항온처리하였다. 표적 세포 및 대조군 세포를 형광 세포내 염료(CFSE 또는 세포 추적 바이올렛(Cell Trace Violet))로 표지한 후, CAR+ T 세포와 함께 공-배양하였다. 공-배양물을 37℃에서 4시간 동안 항온처리하였다. 이 항온처리 시간 후, 세포를 고정가능한 생존력 염료로 표지하고 유세포분석으로 분석하였다. 각각의 세포 집단(표적 세포 또는 음성 대조군 세포)의 생존력을 측정하였고, 특이적 세포 용해의 %를 계산하였다. mRNA 형질감염을 수행한 지 48시간 후, 세포독성 분석을 수행하였다.

항-종양 마우스 모델

종양 세포(신경교모세포종), 또는 표적화된 단백질 발현 -루시퍼라제 세포를 면역결핍 마우스들의 옆구리 내에 이식하였다. 그 후, 세포를 마우스 뇌에 이식하였다. 추가 세대의 마우스들 내로의 연속 이식은 생체내 이종이식편 세포주가 계속 유지되게 한다. 임의적으로, 마우스들은 CAR+ T 세포를 사용한 주사 전 또는 이러한 주사와 함께 항암 치료를 제공받았다. 그 다음, 상이한 용량의 시험될 CAR+ T 세포, 또는 CAR 렌티바이러스 벡터로 형질도입되지 않은 T 세포를 (종양 세포주를 주사한 지 2일 또는 7일 후) 마우스들에게 정맥내 주사하였다. 상이한 동물들에서 종양 진행을 추적하기 위해 T 세포 주사 당일(D0), 및 T 세포 주사 후 7일째 날, 14일째 날, 21일째 날, 28일째 날 및 40일째 날에 생체발광 신호를 측정하였다.

임의의 다른 신경교종 모델, 예컨대, 문헌(Chen, Jian et al., Malignant Glioma: Lessons from Genomics, Mouse Models, and Stem Cells. Cell: Volume 149, Issue 1, 36 - 47)에 기재된 모델이 본 연구에 적합하다.

임상 연구

일차 목적

뇌암, 신경교모세포종 또는 신경교육종, 구체적으로 신경교모세포종, 보다 구체적으로 다발성 신경교모세포종을 가진 환자에서 항-EGFRvIII CAR을 발현하는 일차 T 세포(항-EGFRvIII CAR-조작된 T-림프구)인 TCR KO의 투여의 안전성 및 효율을 평가하는 것이 일차 목적이다.

골수를 제거하지 않으나 림프구를 고갈시키는 예비 요법 후 항-EGFRvIII CAR-조작된 T-림프구 및 임의적으로 알데스류킨을 제공받은 환자의 6개월 무진행 생존을 확인하는 것도 일차 목적이다.

이차 목적

항-EGFRvIII CAR-조작된 T-림프구의 생체내 생존의 측정

치료 후 방사선사진상의 변화 평가

적격성

IHC 또는 RT-PCR에 의해 확인되었을 때 EGFRvIII을 발현하는, 조직학적으로 입증된 신경교모세포종 또는 신경교육종

화학요법과 함께 또는 화학요법 없이 방사선요법을 사용한 선행 표준 치료의 실패

60% 이상의 카르노프스카이(Karnofsky) 점수

허용가능한 한계 이내의 심장, 폐 및 실험실 파라미터.

디자인

I/II 단계 디자인을 이용하여 연구를 수행하였다.

환자는 사이클로포스프아미드 및 플루다라빈으로 구성된, 골수를 제거하지 않으나 림프구를 고갈시키는 예비 요법을 제공받은 후, 임의적으로 IV 알데스류킨과 함께 생체외 종양 반응성 항-EGFRvIII CAR-조작된 T-림프구의 정맥내 주입을 제공받았다.

일단 MTD가 확인되면, 연구는 II 단계 부분까지 진행되었다.

시험의 2 단계 부분에서, 환자는 2개의 군들로 배정되었다:

o 치료 시작 시 스테로이드 사용을 요구하는 재발성 악성 신경교종을 가진 환자들

o 치료 시작 시 스테로이드를 요구하지 않는 재발성 악성 신경교종을 가진 환자들

연구 유형 중재적 연구

연구 단계 1 단계 - 2 단계

연구 디자인

배정: 비-무작위화됨

종점 분류: 안전성/효능 연구

중재 모델: 단일 군 배정

마스킹: 개방 표지

일차 목적: 치료

상태

신경교종(악성)

신경교모세포종, 다발성 신경교모세포종

뇌암

중재

생물학적 물질: 항-EGFRvIII CAR-조작된 T-림프구

0일째 날(마지막 용량의 플루다라빈 후 1일 내지 4일), 세포를 20분 내지 30분에 걸쳐 환자 케어 유닛(Patient Care Unit)으로 정맥내(i.v.) 주입하였다.

약물: 비히클의 부재

약물: 알데스류킨

세포를 주입한 지 24시간 이내에 시작하여 최대 5일 동안 최대 15회 용량까지 계속 약 8시간(+/- 1시간)마다 15분에 걸쳐 수행된 알데스류킨 (총 체중을 기준으로) 72,000 IU/kg IV

약물: 플루다라빈

5일 동안 30분에 걸쳐 매일 플루다라빈 25 mg/m²/일 IVPB

약물: 사이클로포스프아미드

1시간에 걸쳐 250 ㎖ D5W 중의 사이클로포스프아미드 60 mg/kg/일 X 2일 IV

연구 아암 (Arm)

실험: 단일 아암

환자들은 사이클로포스프아미드 및 플루다라빈으로 구성된, 골수를 제거하지 않으나 림프구를 고갈시키는 예비 요법을 제공받은 후, 항-EGFRvIII CAR-조작된 T-림프구의 정맥내 주입을 제공받았다.

중재:

생물학적 물질: 항-EGFRvIII CAR-조작된 T-림프구

약물: 부재

약물: 전술된 바와 같은 알데스류킨

약물: 전술된 바와 같은 플루다라빈

약물: 전술된 바와 같은 사이클로포스프아미드

본 발명이 일반적으로 기재되어 있지만, 본원에서 단지 예시 목적으로 제공되고, 달리 특정되어 있지 않은 한, 한정하기 위한 것이 아닌 일부 구체적인 실시예들을 참고함으로써 더 이해할 수 있다.

실시예

실시예 1: EGFRvIII CAR을 발현하는 TCRα 불활성화된 세포의 증식

T 세포 수용체 α 불변 쇄 영역(TRAC) 유전자 내에서 15-bp 스페이서에 의해 분리된 2개의 17-bp 길이 서열들(절반 표적으로서 지칭됨)을 표적화하는 이종이량체성 TALE-뉴클레아제를 디자인하고 생성하였다. 각각의 절반 표적은 표 10에 나열된 절반 TALE-뉴클레아제들의 반복부에 의해 인식된다.

[표 10]

T7 프로모터의 조절 하에 있는 포유동물 발현 벡터에서 제한효소 분해를 이용하여 각각의 TALE-뉴클레아제 구축물을 서브클로닝하였다. TRAC 게놈 서열을 절단하는 TALE-뉴클레아제를 코딩하는 mRNA를, T7 프로모터의 다운스트림에서 코딩 서열을 보유하는 플라스미드로부터 합성하였다.

항-CD3/CD28 코팅된 비드에 의해 72시간 동안 미리 활성화된 정제된 T 세포를, 절반 TRAC_T01 TALE-뉴클레아제들 둘 다를 코딩하는 2개의 mRNA들 각각으로 형질감염시켰다. 형질감염을 수행한 지 48시간 후, 동일한 기증자의 상이한 T 세포 군들을, 앞서 기재된 EGFRvIII CAR들(서열번호 15 내지 18) 중 하나를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 각각 형질도입하였다. 형질도입을 수행한 지 2일 후, 항-CD3 자성 비드를 사용하여 CD3_NEG 세포를 정제하였고, 형질도입을 수행한 지 5일 후 가용성 항-CD28(5 ㎍/㎖)을 사용하여 세포를 재활성화시켰다.

주당 2회 세포를 카운팅함으로써 재활성화 후 최대 30일 동안 세포 증식을 추적하였다. 특히 항-CD28로 재활성화되었을 때, 형질도입되지 않은 세포에 비해 EGFRvIII CAR을 발현하는 TCRα 불활성화된 세포에서 증가된 증식이 관찰되었다.

EGFRvIII CAR을 발현하는 인간 T 세포가 활성화된 상태를 나타내는 지를 조사하기 위해, 형질도입을 수행한 지 7일 후, 활성화 마커 CD25의 발현을 FACS로 분석하였다. EGFRvIII CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 정제된 세포를 그의 표면에서의 CD25 발현에 대해 분석하여, 형질도입되지 않은 세포에 비해 그의 활성화를 평가하였다. CD28 재활성화 조건 및 재활성화 부재 조건 둘 다에서 증가된 CD25 발현이 예상된다.

본 발명은 신경교모세포종의 치료를 위한, 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)을 표적화하는 조작된 EGFRvIII CAR TCR KO T 세포를 제공한다.

본 발명은 다발성 신경교모세포종의 치료를 위한, 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)을 표적화하는 조작된 EGFRvIII CAR TCR KO T 세포를 제공한다.

실시예 2: EGFRvIII CAR-T

신경교모세포종의 치료를 위한, 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII)을 표적화하는 조작된 CAR T 세포의 개발

EGFRvIII은 가장 흔한 EGFR 돌연변이체이고 엑손 2 내지 7의 인-프레임 결실로 구성된다. 이 결실은 절두된 세포외 리간드 결합 도메인을 초래하고, 단백질이 리간드 독립적 방식으로 항시적으로 활성을 갖게 만든다. EGFRvIII 발현은 종양발생성을 향상시키고 세포 이동을 촉진하고 방사선 및 화학요법에 대한 내성을 부여하는 것으로 밝혀졌다. EGFRvIII 발현은 24% 내지 67%의 신경교모세포종에서 보고되어 있으나 임의의 정상 조직에서는 보고되어 있지 않으므로, CAR T 세포를 사용한 면역요법을 위한 흥미로운 표적이 된다(도 1).

1. EGFRvIII CAR:

1.1. 구축물

4개의 EGFRvIII CAR들을 디자인하였고(도 2 및 도 3) 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제2010/0105136호 및 제2010/0105136호(A1)에 이미 기재된 바와 같이 상이한 scFv를 사용하여 이러한 EGFRvIII CAR들을 제조하였다. 국제 특허출원 제PCT/US2012/029861호에서 로젠버그(Rosenberg)에 의해 기재된 139 항체로부터 유도된 139 scFv, 또는 미국 특허출원 공개 제2010/0105136호(A1)에서 카터(Carter)에 의해 기재된 MR1 항체로부터 유도된 MR1 scFv를 사용하였다. 2개의 상이한 CAR 구조물들(도 2 및 도 3)을 디자인하였고 4-1BB 보조자극 도메인, CD3α 활성화 도메인, CD8α 경막 도메인 및 2개의 상이한 힌지들(CD8α 힌지(V3 구조물) 또는 IgG1 힌지(V5 구조물))(서열번호 24 내지 서열번호 27)을 사용하여 이러한 CAR 구조물들을 제조하였다.

본 발명자들은 로젠버그에 의해 기재된 CAR도 그의 활성을 입증하기 위해 제조하였다(도 3). 디자인된 CAR들의 일시적인 발현 및 스크리닝을 위해 구축물들을 pCLS9632(도 4) 내로 삽입하였다. AscI 및 HindIII 제한부위를 사용하여 CAR 구축물을 이 골격 내로 도입하였다.

일차 T 세포에서의 추가 형질도입을 위해 동일한 구축물들을 XmaI 제한부위와 SpeI 제한부위 사이에서 pCL26700 psew EF1a BFP 벡터(pCL26700 벡터)(도 5) 내로 삽입하였다.

EGFRvIII CAR들은 139-V3 CAR(서열번호 24), 139-V5 CAR(서열번호 25), MR1-V3 CAR(서열번호 26) 및 MR1-V5 CAR(서열번호 27)이었다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 EGFRvIII CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 pCL26700 psew EF1a BFP 벡터, 예컨대, 서열번호 24를 코딩하는 서열을 포함하는 pCL26700 psew EF1a BFP 벡터, 서열번호 25를 코딩하는 서열을 포함하는 pCL26700 psew EF1a BFP 벡터, 서열번호 26을 코딩하는 서열을 포함하는 pCL26700 psew EF1a BFP 벡터, 서열번호 27을 코딩하는 서열을 포함하는 pCL26700 psew EF1a BFP 벡터, 바람직하게는 서열번호 24를 코딩하는 서열을 포함하는 pCL26700 psew EF1a BFP 벡터를 제공한다.

1.2. CAR 발현(도 6)

항-CD3CD28 코팅된 비드 및 IL-2로 활성화시킨 지 5일 후, CAR mRNA들을 일차 TCR KO T 또는 T 세포 내로 형질감염시켰다. CAR 발현을 유세포분석으로 평가하였다. 139-V3 CAR 및 139-V5 CAR을 검출하였다. 다른 CAR들 발현은 낮았거나(MR1); 사용된 구조(V3 또는 V5)와 관계 없이 이 방법의 이용에 의해 검출될 수 없었다(로젠버그에 의해 디자인된 CAR)(도 6).

2. EGFRvIII 세포주의 제조(도 7)

항-EGFRvIII CAR들의 기능성을 시험하기 위해, U87 과다발현 EGFRvIII 세포주를 제조하였다.

2.1. U87 세포에서의 EGFR 및 EGFRvIII의 과다발현

2.1.1. 세포주 개발

EGFR(EGFRvI) 또는 EGFRvIII을 과다발현하는 U87 세포를 생성하고 FACS 및 웨스턴-블롯으로 특징규명하였다(도 7). 도 7은 EGFRvI(170 Kda) 또는 EGFRvIII(155 Kda/140 Kda) 단백질을 과다발현하는 U87 신경교종 세포를 보여준다.

FACS 분석에 의해 수득된 결과는 56.6%의 세포들이 검출가능한 수준의 EGFRvI을 발현하고 57.3%의 세포들이 검출가능한 수준의 EGFRvIII을 발현한다는 것을 보여주었다.

이들 EGFRvI 발현 세포들 및 EGFRvIII 발현 세포들을 최종적으로 분류하고 단리하였다.

2.1.2. EGFRvIII CAR T 세포에 대한 표적 세포로서의 신규 세포주의 검증

2.1.2.1. 탈과립화 분석

세포주 및 CAR 구축물을 검증하기 위해, EGFRvIII CAR을 발현하는 T 세포들을 사용하여 이들 신규 표적 세포들에 대한 탈과립화 분석을 수행하였다(도 3). CAR T 탈과립화를 유세포분석으로 평가하였다. 판독대상은 표적 세포와의 5시간 항온처리 후 T 세포 원형질막에서의 CD107a 발현이다. 놀랍게도, CAR 139-V3, CAR 139-V5, MR1-V3 및 MR1-V5는 그들의 발현이 낮았을 때조차도 탈과립화할 수 있었다. 대조적으로, 결과는 로젠버그 CAR이 이들 실험 조건들에서 활성을 나타내지 않았다는 것을 보여주었다.

도 8은 표적 세포와의 공-배양 후 FACS 분석에 의해 평가된 EGFRvIII CAR T 탈과립화 능력을 보여준다. 로젠버그 CAR은 검출불가능하였고 탈과립화하지 않았으므로, 더 연구되지 않았다.

2.1.2.2. 세포독성 분석

4개의 EGFRvIII CAR들을 발현하는 T 세포들을 사용하여 이들 신규 표적 세포들에 대한 세포독성 분석을 수행하였다. 본 발명의 EGFRvIII CAR들의 경우, 결과는 EGFRvIII 세포(U87-EGFRvIII)의 특이적 용해를 보여주었으나(도 9), EGFRvI (U87-EGFR) 세포 및 U87 야생형 세포 둘 다의 특이적 용해를 보여주지 않았다. 도 9는 EGFRvIII CAR T 세포의 세포독성 분석을 보여준다.

수득된 데이터는 본 발명의 EGFRvIII CAR T 세포, 특히 V3 구조의 EGFRvIII CAR T 세포가 시험관내 및 생체내, 콜로니화된 척수 및 뇌에서 신경교종 세포를 유의하게 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.

CAR 폴리펩티드 서열의 예:

테두리 내의 서열들은 바람직한 VH 및 VL 서열들에 상응한다. VH 및 VL은 CAR 효율을 개선하기 위해 교환될 수 있다.

139-v1(서열번호 1 + 서열번호 15)

139-v2(서열번호 1 + 서열번호 16)

MR1-v1(서열번호 1 + 서열번호 17)

MR1-v2(서열번호 1 + 서열번호 18)

서열들

서열번호 28: 로젠버그 CAR

서열번호 24: 139-v3

서열번호 25: 139-v5

서열번호 26: MR1-v3

서열번호 27: MR1-v5

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. <120> EGFRvIII SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY <130> P81404825PCT00 <140> PCT/EP2015/067439 <141> 2015-07-29 <150> PA201470466 <151> 2014-07-29 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> CD8alpha signal peptide <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> signal peptide <400> 2 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> FcgRIIIa hinge <400> 3 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 4 <211> 45 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> CD8alpha hinge <400> 4 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 5 <211> 231 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> IgG1 hinge <400> 5 Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> CD8alpha transmembrane domain <400> 6 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> 41BB transmembrane domain <400> 7 Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15 Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val 20 25 <210> 8 <211> 42 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> Fragment of 4-1BB (residues 214-255) <400> 8 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> fragment of T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain <400> 9 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> G4Sx3 linker sequence <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 139- heavy chain <400> 11 Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 139- light chain variable region <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 13 <211> 118 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MR1- heavy chain <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val 115 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MR1- light chain <400> 14 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Lys Ala Leu 100 105 <210> 15 <211> 461 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 139-v1 polypolypeptide CAR sequence <400> 15 Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 130 135 140 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile 145 150 155 160 Arg Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 165 170 175 Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg 180 185 190 Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser 195 200 205 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser 210 215 220 Tyr Pro Leu Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr 225 230 235 240 Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln 245 250 255 Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala 260 265 270 Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala 275 280 285 Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr 290 295 300 Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln 305 310 315 320 Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser 325 330 335 Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys 340 345 350 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 355 360 365 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 370 375 380 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 385 390 395 400 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 405 410 415 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 420 425 430 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 435 440 445 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 460 <210> 16 <211> 647 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 139-v2 polypolypeptide CAR sequence <400> 16 Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 130 135 140 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile 145 150 155 160 Arg Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 165 170 175 Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg 180 185 190 Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser 195 200 205 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser 210 215 220 Tyr Pro Leu Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 245 250 255 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 465 470 475 480 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 485 490 495 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 500 505 510 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 515 520 525 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 530 535 540 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 545 550 555 560 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 565 570 575 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 580 585 590 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 595 600 605 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 610 615 620 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 625 630 635 640 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 <210> 17 <211> 464 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MR1-v1 polypolypeptide CAR sequence <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 130 135 140 Ser Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr 145 150 155 160 Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro 165 170 175 Pro Lys Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile 195 200 205 Glu Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 210 215 220 Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Lys Ala 225 230 235 240 Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 245 250 255 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 260 265 270 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 275 280 285 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 290 295 300 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 305 310 315 320 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 325 330 335 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 340 345 350 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 355 360 365 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 370 375 380 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 385 390 395 400 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 405 410 415 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 420 425 430 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 435 440 445 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 450 455 460 <210> 18 <211> 650 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MR1-v2 polypolypeptide CAR sequence <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu 130 135 140 Ser Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr 145 150 155 160 Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro 165 170 175 Pro Lys Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile 195 200 205 Glu Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 210 215 220 Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Lys Ala 225 230 235 240 Leu Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 245 250 255 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 465 470 475 480 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 485 490 495 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 500 505 510 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 515 520 525 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 530 535 540 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 545 550 555 560 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 565 570 575 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 580 585 590 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 595 600 605 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 610 615 620 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 625 630 635 640 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 650 <210> 19 <211> 49 <212> NUCLEIC <213> homo sapiens <220> <223> Target TALEN TRAC_T01 <400> 1 ttgtcccaca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgaga 49 <210> 20 <211> 530 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TAL binding domain TRAC_T01-L <400> 19 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 35 40 45 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 50 55 60 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 65 70 75 80 Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 85 90 95 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 100 105 110 Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 115 120 125 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 130 135 140 Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 145 150 155 160 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 165 170 175 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 180 185 190 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 210 215 220 Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 225 230 235 240 Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala 245 250 255 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 260 265 270 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys 275 280 285 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 290 295 300 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 305 310 315 320 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 325 330 335 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 340 345 350 Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val 355 360 365 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 370 375 380 Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 385 390 395 400 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 405 410 415 Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala 420 425 430 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 435 440 445 Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 450 455 460 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 465 470 475 480 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 485 490 495 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 500 505 510 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala 515 520 525 Leu Glu 530 <210> 21 <211> 530 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TAL binding domain TRAC_T01-R <400> 20 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly 35 40 45 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 50 55 60 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His 65 70 75 80 Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 85 90 95 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 100 105 110 Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu 115 120 125 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 130 135 140 Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 145 150 155 160 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 165 170 175 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 180 185 190 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 195 200 205 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 210 215 220 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 225 230 235 240 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala 245 250 255 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 260 265 270 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 275 280 285 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 290 295 300 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly 305 310 315 320 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 325 330 335 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 340 345 350 Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val 355 360 365 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 370 375 380 Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 385 390 395 400 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 405 410 415 Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala 420 425 430 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 435 440 445 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 450 455 460 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 465 470 475 480 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 485 490 495 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 500 505 510 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala 515 520 525 Leu Glu 530 <210> 22 <211> 2814 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> polynucleotide encoding TRAC_T01-L TALEN <400> 2 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60 gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120 aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180 acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240 aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300 ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360 agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420 gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600 gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720 ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780 cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020 agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080 caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1140 caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200 ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1260 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320 atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1380 ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1560 acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620 gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740 attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1860 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040 agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100 ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160 cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220 aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280 gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340 aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400 aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460 gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520 aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580 gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640 aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700 tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760 gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814 <210> 23 <211> 2832 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> polynucleotide encoding TRAC_T01-R TALEN <400> 3 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60 gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120 cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180 ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240 ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300 gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360 acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420 attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480 acgggtgccc cgctcaactt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 540 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 660 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720 gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 840 attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 960 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140 agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200 caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1260 caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320 ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1440 atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500 ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560 ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1680 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740 gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1860 gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1980 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040 caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100 cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160 gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220 agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280 ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340 gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400 aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460 gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520 caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580 cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640 tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700 tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760 ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820 gccgactgat aa 2832 <210> 24 <211> 482 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 139-v3 polypolypeptide CAR sequence <400> 24 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Gly Ile Arg Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His 100 105 110 His Ser Tyr Pro Leu Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 130 135 140 Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 145 150 155 160 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 165 170 175 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 180 185 190 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 195 200 205 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 210 215 220 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 225 230 235 240 Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 245 250 255 Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 260 265 270 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 275 280 285 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 290 295 300 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 305 310 315 320 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 325 330 335 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 340 345 350 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 355 360 365 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 370 375 380 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 385 390 395 400 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 405 410 415 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 420 425 430 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 435 440 445 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 450 455 460 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 465 470 475 480 Pro Arg <210> 25 <211> 672 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 139-v5 polypolypeptide CAR sequence <400> 25 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Gly Ile Arg Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His 100 105 110 His Ser Tyr Pro Leu Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 130 135 140 Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 145 150 155 160 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 165 170 175 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 180 185 190 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 195 200 205 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 210 215 220 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 225 230 235 240 Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 245 250 255 Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 260 265 270 Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 275 280 285 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 290 295 300 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 305 310 315 320 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 325 330 335 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 340 345 350 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 355 360 365 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 370 375 380 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 385 390 395 400 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 405 410 415 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 420 425 430 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 435 440 445 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 450 455 460 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 465 470 475 480 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Ile Tyr 485 490 495 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 500 505 510 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 515 520 525 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 530 535 540 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 545 550 555 560 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 565 570 575 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 580 585 590 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 595 600 605 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 610 615 620 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 625 630 635 640 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 645 650 655 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 660 665 670 <210> 26 <211> 485 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MR1-v3 polypolypeptide CAR sequence <400> 26 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys 50 55 60 Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln 145 150 155 160 Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg 165 170 175 Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln 180 185 190 Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu 195 200 205 Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp 210 215 220 Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr 245 250 255 Lys Leu Glu Lys Ala Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 260 265 270 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 275 280 285 Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 290 295 300 Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val 305 310 315 320 Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys 325 330 335 Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu 355 360 365 Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 370 375 380 Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 385 390 395 400 Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 405 410 415 Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr 420 425 430 Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly 435 440 445 Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 450 455 460 Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 465 470 475 480 Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 27 <211> 675 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MR1-v5 polypolypeptide CAR sequence <400> 27 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys 50 55 60 Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln 145 150 155 160 Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg 165 170 175 Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln 180 185 190 Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu 195 200 205 Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp 210 215 220 Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr 245 250 255 Lys Leu Glu Lys Ala Leu Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr 260 265 270 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 275 280 285 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu 290 295 300 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 305 310 315 320 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 325 330 335 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 340 345 350 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 355 360 365 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 370 375 380 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 385 390 395 400 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 405 410 415 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 420 425 430 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 435 440 445 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 450 455 460 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 465 470 475 480 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro 485 490 495 Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu 500 505 510 Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu 515 520 525 Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln 530 535 540 Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 545 550 555 560 Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 565 570 575 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 580 585 590 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 595 600 605 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 610 615 620 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 625 630 635 640 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 645 650 655 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 660 665 670 Pro Pro Arg 675 <210> 28 <211> 548 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Rosenberg CAR <400> 28 Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Arg Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile 85 90 95 Val Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 His His Ser Tyr Pro Leu Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu 130 135 140 Gly Ser Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 145 150 155 160 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 165 170 175 Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 180 185 190 Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp 195 200 205 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 210 215 220 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 245 250 255 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro 260 265 270 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 275 280 285 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 290 295 300 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 305 310 315 320 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 325 330 335 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg 340 345 350 Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 355 360 365 Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 370 375 380 Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys 385 390 395 400 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 405 410 415 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 420 425 430 Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 435 440 445 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 450 455 460 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 465 470 475 480 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 485 490 495 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 500 505 510 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 515 520 525 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 530 535 540 Leu Pro Pro Arg 545

Claims

도 2에 나타낸 V1 내지 V6으로부터 선택된 하나의 폴리펩티드 구조를 가진 EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(EGFRvIII 특이적 CAR)로서, 상기 구조가
단일클론 항-EGFRvIII 항체의 VH 및 VL, 및 임의적으로 링커, 특히 n이 1 내지 3인, 바람직하게는 n이 3(서열번호 10)인 식 (G4S)n의 링커를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인;
힌지(hinge);
경막 도메인; 및
4-1BB의 CD3ζ 신호전달 도메인 및 보조자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인
을 포함하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항에 있어서,
단일클론 항-EGFRvIII 항체의 VH 및 VL, 및 식 (G4S)3(서열번호 10)의 링커를 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인;
힌지;
CD8α의 경막 도메인; 및
4-1BB의 CD3ζ 신호전달 도메인 및 보조자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인
을 포함하는 EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 또는 제2항에 있어서,
인간 CD28의 도메인, 특히 인간 CD28의 보조자극 도메인을 포함하지 않는 EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
VH 및 VL이 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 11 내지 서열번호 14로부터 선택된 폴리펩티드 서열과 80% 이상의 동일성을 가진, EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
4-1BB의 보조자극 도메인이 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 8과 80% 이상의 동일성을 가진, EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
CD3ζ 신호전달 도메인이 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 9와 80% 이상의 동일성을 가진, EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
CD8α 경막 도메인이 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 6과 80% 이상의 동일성을 가진, EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
EGFRvIII에 대해 특이적이지 않은 다른 세포외 리간드 결합 도메인을 추가로 포함하는 EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
신호 펩티드를 추가로 포함하는 EGFRvIII 특이적 CAR.
제9항에 있어서,
신호 펩티드가 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 1 또는 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 가진, EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
구조 V1이 FcγRIIIα 힌지 및 CD8α 경막 도메인을 포함하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
제11항에 있어서,
FcγRIIIα 힌지가 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 3과 80% 이상의 동일성을 가진, EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
구조 V3이 CD8α 힌지 및 CD8α 경막 도메인을 포함하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
제13항에 있어서,
CD8α 힌지가 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 4와 80% 이상의 동일성을 가진, EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
구조 V5가 IgG1 힌지 및 CD8α 경막 도메인을 포함하는, EGFRvIII 특이적 CAR.
제15항에 있어서,
IgG1 힌지가 인간화된 또는 비-인간화된 서열번호 5와 80% 이상의 동일성을 가진, EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 15 또는 서열번호 17과 80% 이상의 동일성을 가진 폴리펩티드 서열을 포함하는 구조 V1의 EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제10항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 24 및 서열번호 26으로부터 선택된 서열과 80% 이상의 동일성을 가진 구조 V3의 EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제10항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 25 및 서열번호 27로부터 선택된 서열과 80% 이상의 동일성을 가진 구조 V5의 EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제10항, 제13항, 제14항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
CD8α의 신호 펩티드, 힌지 및 TM 도메인을 가진 EGFRvIII 특이적 CAR.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제21항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제22항에 있어서,
렌티바이러스(lentiviral) 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터 pCLD27600인 발현 벡터.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포.
제24항에 있어서,
염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 및 헬퍼 T-림프구로부터 선택된 면역 세포, 바람직하게는 세포독성 T-림프구로부터 유래된 조작된 면역 세포.
제24항에 있어서,
NK 세포로부터 유래된 조작된 면역 세포.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
TCR의 발현이 억제되는, 조작된 면역 세포.
제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 MHC 단백질, 바람직하게는 β2m 또는 HLA의 발현이 억제되는, 조작된 면역 세포.
제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 면역 억제 또는 화학요법 약물에 대한 내성을 가진 조작된 면역 세포.
제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
환자에서 질환을 예방하거나 치료하기 위한 요법에 사용되는 조작된 면역 세포.
제30항에 있어서,
EGFRvIII 발현 암세포를 특징으로 하는 전구-악성 또는 악성 암 질환의 치료를 위한 요법에 사용되는 조작된 면역 세포.
제30항 또는 제31항에 있어서,
EGFRvIII 발현 암세포의 과다존재를 특징으로 하는 질환의 치료를 위한 요법에 사용되는 조작된 면역 세포.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
질환이 폐암, 항문암, 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종 및 다형성 신경교모세포종(GBM)으로부터 선택된 암, 바람직하게는 잔류 또는 재발성 EGFRvIII+ 신경교종 또는 GBM인 조작된 면역 세포.
암세포의 손상을 야기하기에 효과적인 양의 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포를 암세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암세포를 손상시키는 방법.
(a) 면역 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 하나 이상의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 EGFRvIII 특이적 CAR을 상기 면역 세포의 표면에서 발현시키는 단계
를 포함하는, 면역 세포를 조작하는 방법.
제35항에 있어서,
(a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) EGFRvIII 특이적 CAR을 코딩하는 하나 이상의 제21항에 따른 폴리뉴클레오티드를 상기 면역 세포 내로 도입하는 단계; 및
(c) 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내에서 발현시키는 단계
를 포함하는, 면역 세포를 조작하는 방법.
제35항 또는 제36항에 있어서,
(a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) EGFRvIII 특이적 CAR을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 면역 세포 내로 도입하는 단계; 및
(c) EGFRvIII에 대해 특이적이지 않은 하나 이상의 다른 CAR을 도입하는 단계
를 포함하는, 면역 세포를 조작하는 방법.
(a) 표면에서 EGFRvIII 특이적 CAR을 발현하는 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 조작된 면역 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 조작된 면역 세포를 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
제38항에 있어서,
조작된 면역 세포가 기증자에 의해 제공된 면역 세포를 사용함으로써 제조되는, 방법.
제39항에 있어서,
기증자가 환자이고, 바람직하게는 상기 환자가 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따라 조작된 자신의 면역 세포를 사용함으로써 치료받는, 방법.