CN102781961A - 乙型肝炎病毒特异抗体和其应用 - Google Patents

Abstract

提供至少一种分离的TCR样抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能特异性结合至少一种HBV衍生肽。

Description

乙型肝炎病毒特异抗体和其应用

技术领域

本发明总体涉及免疫介导疗法用于检测和治疗乙肝病毒(HBV)和HBV相关疾病的领域和制备这些疗法的方法。具体地，所述免疫介导疗法可为HBV特异T细胞受体(TCR)样抗体的形式。

发明背景

乙肝病毒(HBV)感染是全世界主要的公众健康问题，造成慢性肝病的严重发病率和死亡率。估计全球有3.5-4亿HBV携带者。75％的慢性HBV患者在亚洲，且美国约有150万人感染。而且，尽管可获得有效疫苗，每年美国约报道50000-100000个新病例。感染更常见于某些风险人群中，如与男人发生性行为的男人、肾透析患者和血友病患者，慢性乙肝影响10-15％的第一代亚裔美国人且约5％的收养自俄罗斯、亚洲和东欧的儿童患有慢性肝炎。慢性HBV还导致包括肝硬化和肝癌(肝细胞癌)在内的严重肝脏疾病，每年造成多于100万例死亡。

治疗这样大量的慢性感染对象存在问题，因为现有药物抑制但不消除HBV。这些药物控制病毒的能力有限且造成严重的副作用，导致许多HBV患者过早中断使用。

感染的肝细胞的清除需要存在能分泌抗病毒细胞因子的病毒特异性T细胞。然而，这些病毒特异性T细胞在慢性HBV感染的患者中功能性受损。这些患者中HBV特异性T细胞免疫缺陷被认为是治疗停止后大多数患者经历HBV复发的原因。

80％的肝细胞癌(HCC)与慢性HBV感染有关，使3.5亿慢性感染HBV的人成为有发展HCC风险的最大人群。慢性HBV患者中发展的HCC通常具有整合到肿瘤细胞染色体中的部分HBV基因组，导致所述肿瘤表达病毒抗原。因此HBC抗原可在HCC细胞上表达。这些病毒感染的细胞被人体免疫系统识别，因为所述细胞在其表面暴露的小肽衍生自与主要组织相容性复合抗体(MHC)I类分子相关的病毒蛋白。

TCR样单克隆抗体已用标准杂交瘤方法或通过使用噬菌体抗体库生产。但是，这些抗体与其相应抗原HBV或肿瘤相关抗原有较低的结合亲合力。

发明概述

本发明解决上述问题，且具体提供对至少一种HBV和/或HBV感染细胞特异的至少一种新抗体。

根据第一方面，本发明提供至少一种分离的T细胞受体(TCR)样抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能特异性结合至少一种HBV衍生的肽。所述HBV衍生肽可包括至少一种乙肝核心抗原和/或至少一种乙肝包被抗原。所述HBV衍生肽可与主要组织相容性复合物(MHC)I类分子有关。

所述抗体可选自下组：

(a)杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068生产的抗体；

(b)具有杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的结合特征的抗体；

(c)与能结合杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的抗原结合的抗体；

(d)结合包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：24、其变体、突变或片段的氨基酸序列的抗原的抗体；和

(e)包含至少一种轻链和至少一种重链的抗体，其中所述轻链包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：32、其变体、突变或片段的氨基酸序列且所述重链包含SEQID NO：2、SEQ ID NO：33、其变体、突变或片段的氨基酸序列。

根据另一方面，本发明提供至少一种分离的杂交瘤细胞系，其于2009年7月2日以登录号PTA-10167和2010年6月18日以登录号PTA-11068保藏于ATCC(弗吉尼亚州20110马纳萨斯的大学大道10801)。

根据另一方面，本发明提供生产至少一种杂交瘤、乙肝病毒(HBV)特异抗体或其中片段的方法，所述方法包括以下步骤：

a.用至少一种与MHC I类分子关联的HBV衍生肽免疫至少一种非人哺乳动物，形成至少一种对与MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；

b.选择至少一种对与MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；和

c.将所选B细胞与至少一种永生细胞融合以产生至少一种杂交瘤，其中所述杂交瘤能生产至少一种对与MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的HBV特异抗体或其片段；和

任选地从所述杂交瘤中分离所述HBV特异抗体。

根据其他方面，本发明提供检测和/或定量存在的HBV的方法，治疗HBV和/或至少一种HBV关联疾病的方法，用作药物的本发明的抗体或其片段，就制备药物、药盒、核酸和其用途而言本发明的抗体或其片段的应用。

附图简要说明

图1(A)是c18/A2mAb特异性的图，其中用c18-27肽脉冲细胞观察特异染色。

图1(B)显示c18/A2mAb的结合/识别能力没有受到HBeAg抑制。

图2(A)显示用c18/A2mAb检测所需的c18-27肽的最小浓度。低至1pM的c18-27肽足以实现显著的染色。

图2(B)证实c18/A2特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的c18/A2mAb方法的灵敏度。

图2(C)取自Gehring A.J等，2007，显示用不同c18-27肽浓度激活c18/A2特异CTL。

图3为c18/A2mAb的BIAcore分析结果。单体和c18-A2mAb的结合分别以1.1X10⁵M^-1.S^-1和2.5X10^-3M^-1.S^-1的结合和解离速率发生，产生的K_D(K_off/K_on)为22.6nM。

图4是细胞内加工产生的c18/A2复合物的识别结果。(A)使用EBVB-核心细胞(组成型表达转移的HBV核心蛋白)、EBV-pol细胞(对照)或DMSO(同种型对照)。用EBVB-核心细胞观察到EBVB-pol细胞或同种型对照上方的显著染色。(B)使用IFN-γ处理的表达HBV的HepG2-117细胞。HepG2-117细胞中观察到c18/A2mAb的显著染色。这些结果证实了细胞内加工产生的C18/A2复合物被c18/A2mAb识别。

图5是c18-27-MHC复合物的免疫细胞化学染色结果。c18/A2mAb能识别通过核心抗原HBc18-27的天然胞内加工呈递的c18/A2复合物。

图6显示c18/A2mAb识别天然产生的具有逃逸CTL识别的HBc18-27突变的能力。除了E22和P21，c18/A2mAb能识别数种CTL不能识别的突变肽。

图7是TCR样抗体生产的示意图。(A)如实施例所述的HLA-A2复合物合成、小鼠免疫、B细胞选择和特异抗体生产的特征。表格报道筛选的杂交瘤的总数量；(B)代表B细胞杂交瘤上清的不同染色分布的柱状图。染色的细胞为用1μM各FluMp58-66或HBV c18-27肽脉冲处理的T2细胞。用50μl杂交瘤上清或无关的IgGl小鼠抗体孵育细胞，然后清洗并用抗小鼠IgG-AF488孵育30分钟。在流式细胞仪上清洗并分析细胞。示出三种不同分布(阴性、对HLA-A2分子特异和对核心18-27/HLA-A2复合物(c 18/A2)特异)。

图8是TCR样抗体表征的结果。(A)评估选择的TCR样抗体的特异性：用1μM各所述肽孵育T2细胞1小时、清洗3次并用0.5μg的c18/A2mAb或E183/A2mAb染色并如上分析。绘出平均荧光强度(MFI)；(B)TCR样抗体不受到循环HBV抗原的抑制：c18/A2Ab或e183/A2Ab用100μl所述血清和产生HBV的HepG2-11细胞培养物上清预孵育。该预孵育的mAb-血清混合物用于染色加载c18-27或E183-91肽(1μM)的T2细胞。绘制用流式细胞分析和MFI分析的细胞。mAb的识别能力不受患者血清的循环抗原抑制；(C)两种TCR样Ab的结合特征。所述两种TCR样Ab的滴定浓度用肽脉冲的T2细胞测试。柱代表TCR样Ab的所述浓度下获得的MFI值。

图9显示TCR样Ab特异性的精细作图结果。(A)显示核心18-27内的AA突变和env 183-91表位对TCR样Ab和CD8T细胞识别的影响。在所述位置含有或不含(wt)丙氨酸取代时，用1μM核心18-27或env 183-91脉冲处理T2细胞。柱状图显示WT核心18-27(左四分之一)和env 183-91(右四分之一)肽上的丙氨酸取代诱发的TCR样Ab结合(上四分之一)和CD8T细胞活化(下四分之一)的抑制。用下式计算抑制百分数：丙氨酸取代肽获得的MFI(或CD 107表达)值除以WT肽所得值x100；(B)天然产生的核心18-27突变的c18/A2 Ab识别。T2细胞用1μM的wt c18-27或氨基酸取代肽脉冲处理，然后用c18/A2 Ab染色。柱代表流式细胞分析获得的MFI值；(C)E183/A2 Ab专一特异于HBV genA/C/D的env183-91肽。T2细胞用1μM的187位置有所述取代的env 183-91肽脉冲处理。187R是HBV gen A/C/D分离物的特征，K 187是HBV基因型B/E/F的特征。

图10显示TCR样抗体检测pMHC复合物，与HBV特异性CD8T细胞的灵敏度相似。T2细胞与所述浓度的c18-27或E183-91肽孵育1小时，并用于结合各抗体(柱)-或CD8T细胞活化(线)。通过流式细胞分析检测抗体结合。CD8 T细胞活化用与靶细胞孵育5小时后的表达CD107的CD8 T细胞百分数计算。平行并重复进行实验。标记表示两次实验的均值。

图11描述细胞内加工产生的pMHC复合物的检测：HepG2细胞为转导有慢病毒载体的HBcAg(A)或HBsAg(B)。空载体转导细胞用作对照。存在或没有多西环素条件下培养HepG2-117细胞并用c18/A2 Ab(C)或e183/A2 Ab(D)染色。(E)观察pMHC复合物。HepG2-117+Dox(无HBV)和-Dox(HBV)细胞用1％PFA固定，并用c18/A2 Ab和e183/A2 Ab染色。Alexa Fluor-647-酪胺信号放大试剂盒用于观察抗体结合(红色，图11中的亮灰色)。用DAPI染色核(蓝色，图11中的暗灰色)。

图12显示纯化自CHB肝活检的细胞上pMHC的识别。点图显示衍生自CHB患者肝活检的悬浮细胞的正面和侧面散射。门控细胞上Ck-18(肝细胞特异性蛋白)的表达显示于柱状图。超过90％的有所示形态的细胞表达Ck-18。为了检测衍生自肝活检的细胞上的特异性pMHC，机械加工的细胞用所述TCR样抗体染色。显示HLA-A2阳性和不同患者的临床/病毒学特征。

图13是pMHC和CTL活化的定量结果。为了获得pMHC精确数量，等分细胞(用c18-27肽和e183-191肽浓度孵育)的MFI内插到用校准珠生成的显示已知量小鼠IgG mAb的校准曲线中。

图14是杂交瘤上清的筛选结果。T2细胞用1μM的各env183-91或无关的M1肽脉冲处理1小时，清洗3次并用50μl杂交瘤培养物上清孵育，然后清洗并用抗小鼠IgG-AF488孵育30分钟。在流式细胞仪上清洗并分析细胞。培养物上清特异性染色用env 183-91而不是M1肽脉冲处理的靶细胞。

图15A显示E183/A2mAb的特异性。T2细胞与1μM各所列肽孵育一小时，清洗3次并用0.5μg mAb染色。清洗3次后，用抗小鼠IgG-PE abs孵育细胞30分钟，清洗并在流式细胞仪上获得。仅在env183-91肽脉冲细胞中观察到特异性染色。

图15(B)显示E183/A2mAb的结合能力没有受到HBeAg抑制。E183/A2mAb用单独来自两个不同患者的100μl HBsAg+ve血清、产HBV的HepG2细胞的培养物上清和健康个体血清(AB血清)预孵育。该预孵育的mAb-血清混合物用于染色env183-91脉冲处理的T2细胞。E183/A2mAb的识别能力不受到患者血清的HBsAg抑制。

图16显示用E183/A2mAb检测所需的最小env183-91肽浓度。T2细胞用滴定量的env183-91肽脉冲处理1小时并用TCR样mAb染色。低至pM的肽足以实现显著染色。

图17显示肽图。用1μM所述肽脉冲处理T2细胞1小时且细胞用E183/A2mAb孵育1小时。通过流式细胞分析检测E183/A2抗体结合。氨基酸186和188是抗体用于识别复合物的残基。

图18表示细胞内加工产生的pMHC复合物的识别。用HBsAg(A)慢病毒载体转导HepG2细胞。空载体转导细胞用作对照。细胞用E183/A2抗体孵育，然后用山羊抗小鼠IgG-APC孵育并用流式细胞仪分析。能清楚看到比空载体转导细胞显著的染色。(B)存在或没有多西环素和IFN-γ条件下培养产生HBV的HepG2-117细胞并如上所述用E183/A2mAb染色。两种情况中均能清楚地看到比空载体对照细胞显著的染色。

图19是E183/A2复合物的免疫细胞化学染色的照片。表达HBV的HepG2细胞(HepG2-117)和载体对照HepG2细胞用DMSO和IFN-γ处理并用1％PFA固定，用E183/A2mAb染色。采用酪胺信号放大试剂盒检测所述结合。用DAPI染色核(蓝色，图19中的亮灰色)。E183/A2mAb能呈现HBV生产细胞内由HBsAg的天然细胞内加工呈递的E183/A2复合物(红色，图19中的暗灰色)。

图20显示E183/A2mAb识别含天然HBV整合的HCC细胞的能力。用表达HLA-A2的载体(Hep3B-A2)转导Hep3B(表达HBV包被抗原的天然HCC细胞系)。如前所述细胞用或不用1000IU/ml IFN-γ处理2天并用E183/A2mAb染色，且细胞在流式细胞仪上分析。

图21显示免疫荧光物的靶向递送的照片。HepG2细胞用E183-91肽脉冲处理且且抗体-荧光物偶联物孵育1小时，清洗并在盖玻片上37℃孵育。孵育后的不同时间点，收集盖玻片并与DiI红孵育(图21中所示的中等灰色)以标记质膜或与用LysoTracker染料以示踪细胞中的溶酶体。用DAPI染色细胞核(蓝色，图21中的暗灰色)。盖玻片上的细胞用1％PFA固定并装配用于共聚焦成像。图21中的绿/亮灰色显示E183/A2mAb-荧光物。

发明详述

本说明书提及的参考书目为了方便以参考文献的列表形式列出并加在实施例后。所述参考书目的全部内容通过引用纳入本文。

定义

方便起见，将本说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语收集在此。

本文所用的术语“抗体”指结合特定表位的任何免疫球蛋白或完整分子以及其片段。所述抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、完整抗体的Fab、Fab’、F(ab)’片段和/或F(v)部分。例如，抗体“c18/A2mAb”可与“HBc18-27抗体”、“针对HBc18-27的抗体”和“抗c18/A2 TCR样抗体”互换使用，其能特异性结合至少一种HBV衍生肽，包括但不限于HBc18-27(SEQ IDNO：3)，或结合其变体或片段，且包括保留亲本抗体的抗原结合能力的单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和其片段。相似地，抗体“E183/A2mAb”可与“HBe183-191抗体”、“针对HBe183-191的抗体”和“抗e183/A2mAb TCR样抗体”互换使用，其能特异结合至少一种HBV衍生肽，包括但不限于HBe183-191(SEQ ID NO：24)，或结合其变体或片段，且包括保留亲本抗体的抗原结合能力的单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和其片段。

本文所用的术语“抗体片段”指保留亲本抗体的抗原结合功能的抗体完整序列的不完整或分离部分。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和抗体片段形成的多特异性抗体。c18/A2mAb和E183/A2mAb的片段包括在本发明中，只要其保留与全长抗体的所需亲合力。具体地，其可缩短至少一个氨基酸。例如，c18/A2mAb抗体片段包含能使其结合HBc18-27(SEQ ID NO：3)、或其变体或片段的抗原结合功能且E183/A2mAb抗体片段包含能使其结合HBe183-191(SEQ ID NO：24)、或其变体或片段的抗原结合功能。

本文所用的术语“抗原”指促使抗体生成并引起免疫应答的物质。本发明中其可与术语“免疫原”互换使用。严格意义上，免疫原是引发免疫系统响应的物质，而抗原定义为结合特异抗体的物质。抗原或其片段可为接触具体抗体的分子(即表位)。蛋白或蛋白片段用于免疫宿主动物时，大量蛋白区域可诱导抗体生成(即引发免疫应答)，其特异性结合所述抗原(蛋白上的给定区域或三维结构)。所述抗原可包括但不限于与“HBc18-27肽”和“c18/A2互换使用的HBc18-27、与“HBe183-191肽”和“E183/A2互换使用的HBe183-191及其片段。

本文术语“包含”定义为各种组分、成分或步骤可联用于实施本发明。因此，术语“包含”涵盖了限定性更强的术语“主要由组成”和“由组成”。术语“主要由组成”理解为本发明的表位/抗原“主要”包含所述序列作为“基本”元件。额外序列可包括在5端和/或3端。因此，鉴于已知多肽偶然包含序列X，“主要由序列X组成”的多肽可为新的。术语“由组成”理解为按照本发明的多肽、多核苷酸和/或抗原对应于至少一种所述序列(例如SEQ ID编号所示的具体序列或其同源序列或片段)。

本文所用的术语“衍生物”指至少一种HBV衍生肽、或编码至少一种HBV衍生肽的多核苷酸序列、或与编码至少一种HBV衍生肽的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列的化学修饰。多核苷酸的化学修饰包括例如，用烷基、酰基或氨基取代氢。衍生多核苷酸编码的多肽保留天然分子的至少一种生物学或免疫学功能。衍生多肽是通过糖基化、聚乙二醇化或任何相似过程修饰的多肽，它保留了其来源多肽的至少一种生物学功能或免疫学功能。

短语“HBV衍生肽”指衍生自HBV的蛋白/肽。具体地，HBV衍生肽可包括但不限于核心抗原、包被抗原、表面抗原和/或其突变体。更具体地，HBV衍生肽可为HBc18-27和/或HBe183-191。

本文术语“HBc18-27定义为能刺激HLA I类限制性T细胞且和“c18/A2互换使用的表位。所述表位的序列可为″FLPSDFFPSV”(SEQ ID NO：3)。本发明中，除非另有说明，术语HBc18-27用于指白种人常见的基因型A/D的序列为SEQ IDNO：3的HBc18-27表位。

本文术语“HBe183-191定义为能刺激HLA I类限制性T细胞且和“E183/A2互换使用的表位。所述表位的序列可为″FLLTRILTI”(SEQ ID NO：24)。

本文所用的术语“片段”指至少一种HBV衍生肽的完整序列的不完整或分离部分，其包含赋予所述序列所述肽的特征和功能的活性位置。具体地，其可缩短至少一个核苷酸或氨基酸且可为免疫原性片段。例如HBc18-27片段包含使c18/A2mAb或其片段识别的活性位置和/或HBe183-191的片段包含使E183/A2mAb或其片段识别的活性位置。片段还可指本发明任何方面的抗体的片段，其中所述抗体包含识别相应抗原的活性位置。所述片段长度可至少为10氨基酸。

本文所用的术语“人源化抗体”指至少一种抗体分子，其中非抗原结合区的氨基酸序列已改变从而所述抗体与人抗体更紧密相似，且仍保留其原始结合能力。

如本文所用，术语“杂交瘤”指已工程改造成大量生产所需抗体的细胞。例如为了生产至少一种杂交瘤，B细胞从已用相关抗原刺激的动物脾中移出并与至少一种永生细胞融合。该融合通过使细胞膜更通透来实现。融合杂交细胞(成为杂交瘤)会快速和无限地增加且会产生至少一种抗体。按照本发明的方法产生的杂交瘤细胞系示例包括但不限于产生HBc18-27、c18/A2mAb的单抗的c18/A2mAb#1。

本文所用的“永生细胞”还称为转化细胞即生长特性被改变的细胞。这并不一定表示这些是“癌”或“肿瘤”细胞(即引入实验动物时能形成肿瘤)，尽管在一些情况中它们可能是。永生细胞系包括但不限于NS1、Jurkat、HeLa、HepG2、SP2/0、Hep-3b等。

本文术语“分离的”定义为与生物体细胞中其他生物组分充分隔离、分开产生或从中纯化出的生物组分(如核酸、肽或蛋白)，其中所述组分天然产生即其他染色体和染色体外的DNA和RNA和蛋白。因此已分离的核酸、肽和蛋白包括由标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白以及化学合成的核酸。

本文所用的术语“单体”包含至少一种抗原、重链和/或轻链。例如，本发明中，实施例1所用的单体包含HBc18-27和至少一种HLA重链和轻链。具体地，所述单体可包含SEQ ID NO：3或其片段、重链和轻链。本发明中术语“单体”可与术语“c18/A2复合物”和“c18/A2单体”互换使用。

术语HBV衍生肽的“突变体”在本文定义为具有通过取代、缺失或添加至少一种氨基酸而与至少一种参考病毒编码序列不同的至少一种氨基酸序列的肽，但其保留结合和活化本发明抗体且可被非突变肽活化的能力。HBc18-27的例子包括但不限于表2提供的SEQ ID NO：4-16。

本文所用的术语“样品”在本文中以最广义使用。疑似含编码至少一种HBV衍生肽或其片段的核酸的生物样品，或至少一种HBV衍生肽自身可包含体液、细胞提取物、染色体、细胞器官、或分离自细胞的膜、细胞；基因组DNA、RNA、或cDNA(溶于溶液或结合于固体支持物)、组织、组织印迹等。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异地结合”指蛋白或肽和激动剂、抗体或拮抗剂之间的相互作用。具体地，所述结合在抗原和抗体之间。该相互作用依赖于结合分子(即抗原或表位)识别的蛋白质特定结构的存在。例如，若抗体对表位“A”特异，则含游离标记A和抗体的溶液中存在的含表位A的多肽或存在的游离未标记A会降低结合所述抗体的标记A的量。例如，c18/A2mAb可特异性结合抗原HBc18-27且E183/A2mAb可特异性结合抗原HBe183-191。

本文所用的术语“对象”定义为脊椎动物，具体是哺乳动物，更具体是人。为了研究目的，所述对象可具体为至少一种动物模型，如小鼠、大鼠等。

本文所用的术语“TCR样单克隆抗体”指至少一种与T细胞受体(TCR)抗体性能相似的抗体。具体地，所述TCR样单克隆抗体可指能识别MHC结合肽的抗体。TCR样单克隆抗体的示例可包括但不限于c18/A2mAb和E183/A2mAb。

如本文所用的至少一种HBV衍生肽的“变体”指一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。所述变体可有“保守性”改变，其中取代的氨基酸具有相似结构或化学特性(如用异亮氨酸取代亮氨酸)。更少见的，变体可有“非保守性”变化(如用色氨酸替换甘氨酸)。类似的小变化还可包括氨基酸缺失或插入或两者均有。使用本领域熟知计算机程序如DNASTAR软件可发现确定可对哪一氨基酸残基进行取代、插入或缺失而不破坏生物学或免疫学活性的指南。

本领域技术人员会理解本发明可实施而不需按照本文提供的方法进行过度实验。所述方法、技术和化学品如给定参考文献所述或来自标准生物技术和分子生物学教科书中的实验方案。

本发明第一方面，提供至少一种分离的T细胞受体(TCR)样抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能特异性结合至少一种HBV衍生的肽。所述HBV衍生肽可包括至少一种乙肝核心抗原和/或至少一种乙肝包被抗原。所述新抗体可具有靶向HBV感染细胞和HBV衍生的肝细胞癌(HCC)细胞的能力，这基于这些细胞胞内表达重要抗原和其与人MHC I类的关联(在称为人白细胞抗原-HLA-A201的形式上特异)。所述HBV衍生肽可与主要组织相容性复合物(MHC)I类分子结合，尤其是HLA I类分子。所述HLA I类分子可为HLA-A2。更具体地，所述HBV衍生肽可为MHC-I肽复合物的部分，所述复合物包含HBV衍生肽和HLA I类分子。

人类中MHC I类蛋白统称为HLA且在人体几乎全部有核细胞表面表达，其结合衍生自内源产生的病毒的小肽(通常9-10氨基酸长)或内质网中自身改变(肿瘤)的蛋白以产生复合物。HLA I类蛋白和其结合肽的复合物转运到感染细胞的表面，这里其能被细胞毒性CD8T淋巴细胞上呈递的T细胞受体识别。不同HLA类型包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、和HLA-DRB1。

细胞毒性CD8T淋巴细胞上呈递的T细胞受体和HLA I类分子呈递的病毒肽之间的特异相互作用活化能破坏病毒感染细胞或产生抗病毒细胞因子(TNF-α和IFN-γ)的CD8T细胞，所述细胞因子能清除非细胞病变病毒感染的细胞。

所述感染细胞内产生的病毒蛋白不易为典型抗体进入，但免疫系统通过CD8T淋巴细胞上呈递的T细胞受体识别病毒感染细胞。因为产生病毒特异性CD8T细胞需要高度熟练的技术且该细胞体外极其不稳，所以生成特异性识别病毒感染细胞表面上HLA限制性病毒肽配体的抗体可在体内检测人中的病毒感染细胞然后能递送有治疗或诊断效力的部分。

因为HLA I类/病毒肽复合物通常在不同个体中有差异，所以不同的TCR样抗体仅在携带所定义HLA I类分子的选定人群中作用。定位于人染色体6上的基因复合物产生的HLA I类分子和这些基因在更大的程度上多样化，因此各单一个体可呈递不同HLA I类蛋白的具体组合。针对不同病毒肽选择不同HLA I类分子的分子结构且因此感染细胞上呈递的HLA I类病毒肽复合物有极度的多样性。

约50％的人群表达HLA I类分子HLA-A2，其代表许多HLA-A*02等位基因的基因产物产生的HLA I类分子家族，所述基因产物包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206和*0207基因产物。白种人和亚洲人群之间的亚型中有显著差异。超过95％的HLA-A2阳性白种人群为HLA-A0201，HLA-A2阳性，中国人群可分为23％HLA-A0201；45％HLA-A0207；8％HLA-A0206；23％HLA-A0203。

按照本发明的任何方面的TCR样抗体可靶向HLA-A2分子不同等位基因呈递的HBV衍生肽，且因此其可靶向约50％的HBV感染人群。按照本发明的任何方面的TCR样抗体具有与病毒特异性CD8T淋巴细胞天然产生的T细胞受体相似的特异性，其能识别病毒感染的细胞且因此能被称为T细胞受体(TCR)样抗体。

按照本发明的任何方面的TCR样抗体具有与其相应MHC肽复合物相当高的结合亲和性，且因此能识别天然产生的通常在其表面显示极低量病毒肽/HLA I类配体的病毒感染细胞。这些TCR样抗体还能识别HBV感染的人肝细胞。

HBV衍生肽可包括但不限于乙肝核心抗原、包被抗原、表面抗原和/或其突变体。具体地，所述HBV衍生肽可包括至少一种乙肝核心抗原和/或乙肝包被抗原。具体地，所述HBV衍生肽可包括以下组分、由其组成或主要由其组成：HBc18-27和/或HBe183-19、其变体、突变或片段。更具体地，HBc18-27包括以下组分、由其组成或主要由其组成：SEQ ID NO：3、其变体、突变体或片段，且HBe183-191包括以下组分、由其组成或主要由其组成：SEQ ID NO：24、其变体、突变或片段。本发明的抗体可结合HBV感染细胞和肿瘤细胞表面的c18/A2和/或E183/A2单体且靶向它们用于免疫介导的裂解(即天然杀伤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC))。

所述抗体可选自下组：

(a)杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068生产的抗体；

(b)具有杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的结合特征的抗体；

(c)与能结合杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的抗原结合的抗体；

(d)结合包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：24、其变体、突变或片段的氨基酸序列的抗原的抗体；和

(e)包含至少一种轻链和至少一种重链的抗体，其中所述轻链包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：32、其变体、突变或片段的氨基酸序列且所述重链包含SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：33、其变体、突变或片段的氨基酸序列。

所述抗体可为至少一种人、人源化或嵌合抗体。所述抗体可为能高度特异性靶向HBV感染细胞的小鼠IgG1(含κ轻链)，因为其靶向HBV感染细胞表面专有呈递的HLA-A201-HBV核心18-27复合物和/或HLA-A201-HBV包被183-191复合物。

可采用通过将有合适抗原特异性的小鼠抗体分子和有合适生物活性的人抗体分子基因一起剪接来产生“嵌合抗体”的开发技术(Morrison，等，1984通过引用全文纳入本文)。例如，对自诱导物特异的小鼠抗体分子基因可与有合适生物活性的人抗体分子的基因一起剪接。嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物种类的分子，如具有衍生自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。

此外，已开发用于生产人源化抗体的的技术(参见例如，US 5,585,089和/或US 5,225,539，其通过引用全文纳入本文)。免疫球蛋白轻链或重链可变区由三个称为互补决定区(CDR)的高变区中断的“框架”区组成。简要地，人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个CDR以及来自人免疫球蛋白分子的框架区。

所述抗体可标记有至少一种放射性核和/或荧光团从而改善体内HBV感染的肿瘤细胞至少在诊断和/或治疗能力中的靶向。例如，通过正电子发射断层显像(PET)检测HBV感染的HCC细胞。用放射性核标记的抗体可就手术和/或放疗而言更好地靶向疾病细胞。抗体还可用至少一种毒素和/或化疗剂标记。具体地，标记的抗体可用作使这些毒性剂更好靶向肿瘤细胞的“免疫毒素”。

本发明任何方面的TCR样抗体还可用于直接定量感染细胞或任何抗原呈递细胞上的肽/HLA I类复合物的数量和位置，因此可用于评估不同细胞类型中HBV抗原的加工和呈递效率。

所述抗体可识别HLA-A201环境中的c18-27和/或env183-91肽。该TCR样mAb可代表HBV免疫学的两个主要领域中有价值的新工具。首先，该mAb可用于通过流式细胞分析和免疫组织化学的标准方法检测和直接观察pMHC复合物的存在。通过确定APC、肝细胞癌肿瘤细胞和淋巴细胞上pMHC的表达，其可用于研究和分析抗原呈递。有关抗原呈递期间某些事件如何和在何处发生的问题可被直接解决，且可观察并定量T细胞表位在APC上的表达。

根据本发明任何方面的抗体提供了用作各种基于抗体的免疫治疗方法中靶向部分的新可能。TCR样mAb可与药物连接，得到的‘ab-偶联物’可用于递送药物到感染细胞。

具体地，所述抗体可与至少一种药物、抗病毒药物、毒素和/或化疗剂相连。具体地，所述抗体可用于递送药物到具有高度特异性的感染肝细胞中以抑制病毒感染和肿瘤。所述药物可包括但不限于IFN-α、TLR-激动剂、阿德福韦、恩替卡韦、拉米夫定、瑞莫夫韦、替比夫定、替诺福韦等。本发明的抗体连接至少一种抗病毒药物，可能增加HBV感染细胞的药物可用性，其可提高对感染细胞的IFN-α效应并同时降低系统性IFN-α暴露，因此降低抗病毒药物通常引起的副作用。这可产生慢性HBV的新治疗，可能阻止肝癌和其他有关HBV的并发症。

c18/A2mAb和/或E183/A2mAb可与至少一种可示踪剂连接且可能用于体外或体内定量HBV感染的肝细胞。所述可示踪剂可为任何可示踪的生物或化学组分。所述可示踪剂包括但不限于环境剂、血液标记、抗原、农药、药物、化学品、毒素、PCBS、PBBS、铅、神经毒素、血液电解质、代谢物、分析物、NA+、K+、CA+、尿素氮、肌酸酐、生化血液标记和组分、ChE、AChE、BuChe、肿瘤标记、PSA、PAP、CA 125、CEA、AFP、HCG、CA 19-9、CA 15-3、CA 27-29、NSE、羟基丁酸盐、乙酸乙酯、抗疟疾药物如阿莫待喹、蒿甲醚、青蒿素、青蒿酯、阿托伐醌、辛可宁、辛可尼定、氯奎、多西环素、卤方特瑞(halofanthne)、甲氟喹、伯氨喹、乙嘧啶、奎宁、奎纳定、和磺胺多辛；抗生素药物如氨苄青霉素、阿奇霉素、多西环素、红霉素、青霉素、和四环素；抗逆转录病毒药物如阿巴卡韦、阿德福韦、地达诺新、恩替卡韦、茚地那韦、拉米夫定、奈韦拉平、瑞莫夫韦、利托那韦、甲磺酸沙奎那韦、替比夫定、替诺福韦、扎西他滨、和齐多夫定。

根据本发明任何方面的TCR样mAb可用于肝细胞癌(HCC)患者。HBV基因组整合到感染细胞中是HCC恶性肿瘤中最一致相关的因子。TCR样mAb可用于解决HCC患者肝活检上的抗原呈递研究。连接至少一种药物的TCR样mAb制备的免疫偶联物可具有杀死癌细胞的能力。HBV免疫治疗的方法可产生残余副作用最小的改良HBV患者治疗的临床应用。

c18/A2mAb和E183/A2mAb可用于获得有关病毒感染细胞的表面和专职抗原呈递细胞上pMHC复合物的呈递、表达模式和分布的精确信息。体外和体内的抗原呈递细胞的直接示踪还可用c18/A2mAb和/或E183/A2mAb进行。c18/A2mAb和E183/A2mAb还可用于c18/A2mAb和E183/A2mAb分别与抗病毒细胞因子或toll样受体或抗病毒药物的偶联，作为新的免疫治疗策略用于靶向递送免疫偶联物到感染细胞中。人源化mAb-药物偶联物能靶向在表达病毒抗原的HBV感染患者中产生的肝细胞癌。mAb还可通过将其连接合适的荧光团或放射性核而用作诊断剂。

按照另一方面，本发明提供生产至少一种杂交瘤、乙肝病毒(HBV)特异抗体或其中片段的至少一种方法，所述方法包括以下步骤：

a.用至少一种MHC I类分子结合的HBV衍生肽免疫至少一种非人哺乳动物，形成至少一种对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；

b.选择至少一种对MHC I类分子结合的联HBV衍生肽特异的B细胞；和

c.将所选B细胞与至少一种永生细胞融合以产生至少一种杂交瘤，其中所述杂交瘤能生产至少一种对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的HBV特异抗体或其片段；和

任选地从所述杂交瘤中分离所述HBV特异抗体。

按照本发明方法的步骤(b)可包含将对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的至少一种B细胞和下述一起孵育：

i.至少一种生物素化抗原，所述抗原能结合对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；和

ii.至少一种抗生物素偶联珠。

此生产杂交瘤、HBV特异抗体或其片段的新方法可开发TCR样HLA/HBV特异单克隆抗体，其可靠性高于现有可能。为了制备本发明至少一种HBV特异抗体，可使用通过培养连续细胞系生产抗体分子的任何方法，只要选择对所述抗原特异的B细胞的步骤在与永生细胞融合前进行。更具体地，步骤(b)可用新加坡的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)的磁激活细胞分选(MACS)进行。

所述HBV衍生肽可包含以下组分、由其组成或主要由其组成：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：24、其变体、突变或片段的氨基酸序列。

用于生产本发明抗体的方法示例示于实施例1。实施例1提供用于生产对SEQID NO：3的肽特异的单克隆抗体的方法，所述肽衍生自用BALB/c小鼠的HBV核心抗原。

按照另一方面，本发明提供按照本发明的任何方法生产的至少一种分离抗体或其片段。

按照另一方面，本发明提供检测和定量对象中至少一种HBV感染细胞的存在和分布的方法，所述方法包括：

a.将本发明任何方面的至少一种抗体或其片段与从至少一个对象获得的至少一种样品接触；和

b.检测和定量抗体与所述HBV感染细胞的结合。

所述抗体可特异性结合HBc18-27、HBe183-191、其变体、突变或片段或HBV感染细胞的其片段。所述结合证实所述细胞可被HBV感染、所述样品含至少一种HBV感染细胞和/或所述对象可为HBV阳性。更具体地，本方法可为体外检测和定量的方法。

按照另一方面，本发明提供检测对象中HBV相关的肝细胞癌(HCC)的方法，所述方法包括：

a.将本发明任何方面的至少一种抗体或其片段与从至少一个对象获得的至少一种样品接触；和

b.检测抗体与所述HBV相关的HCC感染细胞的结合。

本发明任何方面的检测和定量方法可为诊断的非侵入性方法且还可用于研究HBV的数种免疫学方面。所述方法可通过流式细胞分析和免疫组化的标准方法用于检测和直接观察抗原(pMHC)复合物的表型分析的存在，通过确定APC、HCC肿瘤细胞和淋巴细胞上pMHC的表达用于研究和分析抗原呈递。本方法可用于确定抗原呈递期间某些事件的存在及其背后的原因，且可观察和定量T细胞表位在APC上的表达。

按照其他方面，本发明提供至少一种治疗HBV和/或至少一种HBV相关疾病的方法，所述方法包括给予需要的对象至少一种按照本发明任何方面的抗体或其片段。本发明的抗体可与靶向不同HLA型结合的不同HBV肽的其他相似抗体联合给予。因此所述肿瘤细胞和病毒可能没有机会应用于此类治疗中。

按照另一方面，本发明提供按照本发明任何方面的至少一种抗体或其片段用于药物应用。

按照另一方面，本发明提供本发明任何方面的抗体或其片段在制备用于治疗HBV和/或至少一种HBV相关疾病的药物中的至少一种应用。BV相关疾病包括硬化、HCC等。所有HCC中的75％由慢性HBV引起。

按照其他方面，本发明提供至少一种用于诊断HBV和/或至少一种HBV相关疾病的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本发明的抗体或其片段。

按照一个方面，本发明提供至少一种分离的核酸分子，其编码：

(a)本发明任何方面的抗体或其片段的至少一种轻链，其中所述轻链包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：32、其变体、突变或片段；和/或

(b)本发明任何方面的抗体或其片段的至少一种重链，其中所述重链包含SEQID NO：2、SEQ ID NO：33、其变体、突变或片段。

按照另一方面，本发明提供确定对象中疫苗效力的方法，所述方法包括：

-给予所述疫苗后5-15天，将本发明任何方面的至少一种抗体或其片段与获自所述对象的至少一种样品接触；和

-检测抗体或其片段与HBV感染细胞的结合；和

-对比给予所述疫苗前后HBV感染细胞的数量，其中HBV感染细胞数量减少说明疫苗有效。

确定HCC细胞中HBV抗原的存在可用于检测疫苗的抗原加工或不同个体中抗原加工的缺陷。

按照本发明任何方面的TCR样抗体还可用于疫苗验证，作为确定所需HBV-T细胞表位是否在细胞上展示的有用工具和作为理解体内和体外抗原加工和呈递的命运的研究试剂，且可在实体瘤细胞、转移瘤细胞、接触化学剂的细胞、接触疫苗后的肿瘤细胞等之间评估这些过程。

按照另一方面，本发明提供确定细胞中抗原加工和呈递的精确性的方法，所述方法包括用本发明任何方面的至少一种抗体或其片段与所述细胞接触的步骤。

按照另一方面，本发明提供包含本发明核酸的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。具体地，所述载体可包含但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒载体。更具体地，逆转录病毒载体可用于体外、离体或体内递送所述构建体。

按照本发明任何方面的TCR样抗体可用作治疗剂，作为抗体或双特异性分子/双特异性抗体，或者可用作药物转运载剂将有毒物质载荷转运到肿瘤细胞和/或病毒感染细胞中。

本发明任何方面的TCR样抗体还可用于致癌物概况分析以提供癌症检测和治疗的个体化方法。因此，术语“致癌物概况分析”指用TCR样抗体筛选癌细胞以确定HLA I类分子呈递的HBV肽是否展示在HCC的表面。

目前总体描述了本发明内容，通过参照以说明方式提供的以下实施例能更容易理解本发明，但这些实施例不应限制本发明。

本领域技术人员会理解本发明可实施而不需按照本文提供的方法进行过度实验。所述方法、技术和化学品如所附参考文献所述或来自标准生物技术和分子生物学教科书中的实验方案。

实施例

本领域已知且未具体描述的标准分子生物学技术一般按照Sambrook和Russel，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，纽约的冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(2001)所述。

实施例1

抗原/单体的制备

靶向的HBV抗原为FLPSDFFPSV的HBc18-27(SEQ ID NO：3)。制备的单体为至少一种HLA-A201重链和轻链加SEQ ID NO：3抗原肽的FPLC纯化重组、无膜、完全折叠的异源三聚体复合物。

人主要组织相容性复合物(MHC)I类HLA-A201重链(HC)和轻链(LC)(B2微球蛋白)在BL21大肠杆菌(E.coli)(德国，诺瓦基公司(Novagen))中表达为重组蛋白。所述重链和轻链分离为包含体并溶于8M尿素。

然后选择来自HBV的HBc18-27的SEQ ID NO：3抗原肽并用HLA重链和轻链再折叠以形成体外c18/A2单体。采用阴离子交换色谱纯化所述单体然后c18/A2单体四聚化。

抗c18/A2 TCR样抗体的生成

上述步骤的c18/A2单体用作抗原来源以刺激免疫的Balb/C小鼠中的抗体响应。雌性Balb/c小鼠用完全弗氏佐剂中25μg的纯化c18/A2单体腹膜内免疫(初次给药)(美国西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))，然后用相同单体加不完全弗氏佐剂加强给药(3次加强给药)(美国西格玛-艾尔德里奇公司)。最后一次不含佐剂的加强给药通过与NS1骨髓瘤细胞融合前3天的尾部注射进行。

处死该小鼠并通过温和均质化制备脾细胞。通过孵育所述脾细胞和生物素化c18/A2单体来纯化具有所需特异性的B细胞，所述单体结合对所述单体特异的B细胞表面发现的特异性B细胞受体。然后偶联免疫-磁珠的抗生物素(新加坡美天旎生物技术公司)用于通过免疫磁性选择法正选择磁柱上结合的B细胞。免疫小鼠的骨髓瘤细胞融合前抗原特异B细胞的预纯化采用连接免疫磁珠的生物素化形式单体，相较标准杂交瘤方法大大改善具有校正特异性的杂交瘤百分比。

使用标准技术通过PEG1500(美国西格玛-奥德里奇公司)将所选的B细胞与NS1骨髓瘤细胞(新加坡的新加坡国立大学的Chan Soh Ha教授惠赠)融合。得到的杂交瘤细胞混合物接种在96孔板上并在HAT培养基(美国西格玛-奥德里奇公司)中选择2周。约筛选到1500个杂交瘤细胞用于经流式细胞仪选择所需mAb特异性。SEQ ID NO：3的c18-27肽脉冲处理或SEQ ID NO：17的M1肽(GILGFVFTL)脉冲处理的C1R细胞与杂交瘤上清4℃孵育30分钟，清洗并与抗小鼠IgG-alexafluor-488二抗(美国英杰公司(Invitrogen))再室温孵育30分钟，清洗并用细胞搜索软件在BD FACSCAN流式细胞仪上分析。仅一个克隆(即c18/A2mAb#449)展现限于c18/A2单体的所需识别特征且与M1肽脉冲处理细胞不显示反应性。此阳性克隆通过有限稀释亚克隆2次，稳定扩增并大量收集培养物上清。这些上清中的c18/A2mAb用蛋白G琼脂糖柱纯化。

c18/A2mAb的特异性

通过孵育获自ATCC的T2细胞和衍生自HBV聚合酶、X和包被蛋白以及衍生自EBV、flu(尤其是H1N1)、CMV的不同HLA-A2限制性肽和各种肿瘤相关抗原表位来检测c18/A2mAb的特异性。所用的肽序列(即SEQ ID NO：17-29)在表1中提供。T2细胞与1μM各肽孵育1小时，清洗3次并用0.5μg c18/A2mAb染色。清洗3次后，用抗小鼠IgG-AlexaFluor488抗体(美国英杰公司)孵育细胞30分钟，清洗并在流式细胞仪上获得。

肽	序列	SEQ ID NO：
			M1肽/FEC1(Flu)	GILGFVFTL	17
HBV X，52-60	HLSLRGLPV	18
			Mage A10，254-262	GLYDGMEHL	19
SSX2，41-49	KASEKIFYV	20
			HBV pol，455-463	GLSRYVARL	21
Mage3，271-279	FLWGPRALV	22
			NY-ESO-1，157-165	SLLMWITQA	23
HBV env，183-191	FLLTRILTI	24
			HBV env，348-357	GLSPTVWLSV	25
FEC19(HCMV)	NLVPMVATV	26
			FEC11(EBV)	GLCTLVAML	27
FEC10(EBV)	CLGGLLTMV	28
			FEC2(Flu)	FMYSDFHFI	29

表1.用于特异测试图lA所示HBc18/A2mAb的肽。

如图1A所示，c18/A2mAb与c18-27脉冲处理的细胞特异性反应，且不染色任何其他肽脉冲处理的任何细胞。相似地，c18/A2mAb不识别任何单独肽或单独HLA-A2，因为所述抗体与任何肽的预孵育不减少c18-27肽脉冲处理细胞的染色。

为了确定c18/A2mAb是否在甚至患者血清组分和病毒抗原存在时仍保留其结合能力，c18/A2mAb分别与100μl的3种不同HBeAg+患者血清(新加坡的国立大学医院的Lim Seng Gee博士惠赠)和健康个体(英杰公司的AB血清)的血清预孵育。该预孵育的c18/A2mAb-血清混合物用于染色c18-27脉冲处理的T2细胞。图1B证明c18/A2mAb与HBeAg+血清的预孵育对c18/A2mAb识别c18/A2复合体没有抑制效果。总之，这些结果清楚的证明肽特异性和MHC限制性抗体(即c18/A2mAb)显示出与T细胞受体一样良好的特异性，且所述c18/A2mAb结合能力没有被HBeAg干扰。

c18/A2mAb的灵敏度

为了发现达到c18/A2mAb显著染色所需的最小肽浓度，T2细胞与各种浓度的SEQ ID NO：3的c18-27肽孵育1小时，然后用c18/A2mAb染色。如图2A所示，低至1pM的c18-27肽足以实现显著的染色。在FACS Canto流式细胞仪上获得细胞并用Flow Jo软件分析细胞荧光强度水平。

为了研究c18/A2mAb是否能以与c18/A2复合物特异性T细胞的TCR一样的灵敏度检测c18/A2复合物，获自ATCC的T2和HepG2细胞与各种浓度的c18-27肽孵育1小时并清洗。细胞用c18/A2mAb染色然后与抗小鼠IgG-Alexafluor488抗体(美国英杰公司)孵育。用FACS Canto流式细胞仪记录了总共10000个事件。减去同种型值得到特异性平均荧光强度。如图2B所示，对于c18/A2mAb显著染色，EBV-B细胞和HepG2细胞分别需要1pM和1nM的最小c18-27肽浓度。这些结果与活化(IFN-γ生成)最小量的c18/A2特异细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所需的报道浓度相似，如取自Ghering等，2007的图2C所示。因此c18/A2mAb以与c18/A2特异性CTL相似的灵敏度识别pMHC复合物。

c18/A2 mAb的亲和性

用BIAcore表面等离振子共振技术测定c18/A2mAb的亲和性。c18/A2mAb用标准氨偶联方法固定在CM5芯片上。LMP-1抗体(新加坡国立大学的PaulMacAry博士惠赠)用作对照。然后，将纯化的c18/A2单体以不同浓度按20微升/分钟的流速注射。如图3所示，结果证实c18/A2mAb而不是LMP-1抗体结合c18/A2单体。与c18-A2mAb的结合分别以1.1X10⁵M^-1.S^-1和2.5X10^-3M^-1.S^-1的结合和解离速率发生，产生的亲合性(K_D)为22.6nM。

细胞内加工形成的c18/A2复合物的识别

为了检测c18/A2mAb识别生理加工产生的肽-MHC复合物的能力，使用组成表达HBV的转染核心蛋白的EBVB-核心细胞(A202)(Scripps研究所的F.Chisari惠赠)。表达HBV的聚合酶的EBVE-pol细胞(Scripps研究所的F.Chisari惠赠)用作对照。用图4A所示的EBVB-核心细胞可观察到EBVB-pol细胞或同种型对照上方的显著染色。

稳定转染有全HBV基因组的HLA-A2阳性HepG2-117细胞(德国弗赖堡大学的M.Nassal惠赠)用于检测产生HBV的细胞上的c18/A2复合物。从培养基物中移除多西环素后这些HepG2-117细胞产生HBV。用1％DMSO和100单位/毫升的IFN-γ处理这些细胞分别使病毒和MHC产量增加。HepG2-117细胞用1μg的c18/A2mAb孵育1小时，清洗并再用抗小鼠IgG-APC抗体(美国英杰公司)孵育30分钟。清洗3次后，在流式细胞仪上获得所述细胞并用Flow-Jo

软件分析荧光强度水平。如图4B所示，HepG2-117细胞中观察到c18/A2mAb的显著染色。用作对照的LMP-1抗体(新加坡国立大学的Paul MacAry博士惠赠)没有染色这些HepG2-117细胞。总之这些结果表明TCR样c18/A2mAb能检测活性且天然产生的内源胞内加工后形成的特定复合物。

免疫细胞化学检测c18/A2复合物

TCR样抗体的另一主要可能的应用是用免疫细胞化学方法在未扰动组织中直接原位观察含配体的细胞。为了测定c18/A2mAb能否用于这类研究，测试其检测生成病毒的HepG2细胞(HepG2-117)(德国弗赖堡大学的M.Nassal惠赠)上c18/A2复合物的能力。表达HBV的HepG2细胞(HepG2-117)在用0.5％皂角苷透化的1％多聚甲醛中室温固定15分钟，清洗并用c18/A2mAb或对照LMP-1抗体(新加坡国立大学的Paul MacAry博士惠赠)孵育。将其清洗并用酪胺信号放大试剂盒(美国英杰公司)检测所述结合。用DAPI对核进行染色。如图5所示，用c18/A2mAb可观察到阳性染色，且同种型对照或LMP-1抗体对照的染色为阴性。这些结果证明c18/A2mAb可用于观察通过核心抗原的天然胞内加工呈递到感染细胞上的c18/A2复合物。

c18-A2mAb识别突变c18-27肽的能力

已报道HBV感染期间CTL表位内出现有助于病毒持续的病毒突变。CTL表位中的取代耐受较差且可引起CTL活化的显著下降，表明表位中出现突变可使病毒逃逸。

已报道HBV核心分子中有影响CTL功能的天然氨基酸取代。为了验证c18/A2mAb能否识别可抑制CTL识别的天然发生的突变肽，用1μM野生型c18-27(SEQID NO：3)或天然产生的突变肽脉冲处理获自ATCC的T2细胞，并用c18/A2mAb染色和进行流式细胞术分析。表2提供了突变体列表。如图6所示，c18/A2mAb能识别数种显示抑制CTL活性的天然突变肽。然而，细胞与E22和P21突变肽孵育时，mAb的识别能力显著降低。这些结果证明c18/A2mAb能识别数种不能被c18/A2特异性CTL识别的天然产生的突变肽。

表2.c18-27mAb轻链和重链以及天然产生的HBc18-27表位突变肽的氨基酸序列。

表3.c18-27mAb轻链和重链的核苷酸序列。

实施例2

肽-HLA-A2复合物的生产

存在5-10倍过量的c18-27或env183-91肽时，重链和β2m的胞外结构域表达为大肠杆菌中的内涵体并体外重折叠。重折叠后，浓缩肽-HLA-A2混合物并用离子交换和尺寸排阻柱色谱法从污染物中分离适当折叠的复合物。该复合物指定为单体。

TCR样抗体的生成

BALB/c小鼠通过腹膜内注射含25μg纯化单体(c18/A2单体或E183/A2单体)和完全弗氏佐剂(初次给药)或不完全弗氏佐剂(3次加强给药)的溶液以2周间隔免疫共计4次。最后一次不含佐剂的盐水中加强给药通过融合前3天的尾部注射进行。融合前一天，从BALB/c小鼠腹腔收集小鼠腹膜巨噬细胞并以2x10⁴细胞/孔接种在96孔板上。加强小鼠的脾细胞使用标准技术通过PEG1500与NS1骨髓瘤细胞以1∶1的比融合。得到的杂交瘤细胞混合物在HAT选择培养基中悬浮并接种于96孔板上，其中腹膜巨噬细胞已接种并选择2周。收集形成杂交瘤(生长)的孔的上清并通过流式细胞仪检测合适的mAb特异性。1μM HBV c18-27肽或甲型流感A基质肽(Ml肽)脉冲处理的T2细胞与50μl杂交瘤上清4℃孵育30分钟，清洗并与抗小鼠IgG alexa-488二抗(英杰公司)室温再孵育30分钟，清洗并用细胞搜索软件在BD FACSCAN流式细胞仪上分析。阳性培养物通过有限稀释亚克隆2次并进一步扩增。用相似的实验方案生成E183/A2抗体。

TCR样抗体的选择

通过用HLA-A0201和β2-微球蛋白结合的HBV c18-27或env183-191肽形成的纯化复合物免疫BALB/c小鼠来产生能识别HBV肽/A201复合物的抗体(图7A)。pMHC的正确折叠和其稳定性用构象特异的HLA-A2mAb，w6/32监控，其仅当正确折叠时识别HLA-A2复合物。用w6/32抗体在western印迹上观察到单条带，证实形成适当折叠的单体(数据未显示)。免疫动物的脾细胞与NS1骨髓瘤细胞以1∶1的比融合并用无关的HLA-A201-结合M1肽(甲流基质肽58-66，GILGFVFTL)或HBV核心18-27肽(FLPSDFFPSV)或HBVe183-91肽(FLLTRILTI，SEQ IDNO：34)脉冲处理的HLA-A201+T2细胞筛选所得杂交瘤的上清(约2000)。图7A所示为选择过程的示意图。上清中存在的抗体与肽脉冲细胞的结合用APC偶联的山羊抗小鼠IG二抗检测，且所述细胞用流式细胞仪分析。三种杂交瘤产生抗体(定义为c18/A2Ab)，其识别HBVc18-27肽(而不是M1肽)脉冲处理的T2细胞(图7B)。相似地，衍生自HBVenv183-91/A2复合物免疫小鼠的2种杂交瘤产生抗体(定义为E183/A2)，其仅识别HBVenv183-91脉冲处理的T2细胞(未显示)。这些B细胞杂交瘤克隆稳定扩增并大量收集对各HBV肽特异的一个克隆的培养物上清，用蛋白G琼脂糖柱纯化抗体(数据未显示)。因此用HBV肽-MHC复合物重复免疫小鼠能产生具TCR样特异性的抗体。

细胞系

T2细胞在补充有10％胎牛血清、20mM HEPES、0.5mM丙酮酸钠、MEM和MEM非必须氨基酸、Glutamex、5μg/ml Plasmocin(英韦沃基公司(InvivoGen))、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640中培养。表达HBV的HepG2(HepG2-117)和载体对照亲本细胞系(HepG2TA2-7)细胞在补充有10％无四环素FBS(加利福尼亚州圣迭戈的BD生物科学公司(BD Sciences))、20mM HEPES、0.5mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、MeM非必须氨基酸(英国佩斯利的英杰有限公司)、200μg/ml G418硫酸盐、80μg/ml潮霉素B(英国威尔特郡的自动基因生物公司(AutogenBioclear))的杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco′smodified Eagle′s medium)(DMEM)中培养。培养基中加入1μg/ml的多西环素抑制HBV表达。HEK293细胞和NS1骨髓瘤细胞在补充有10％FBS的DMEM中生长。

TCR样抗体的鉴定

尽管初始杂交瘤筛选已显示TCR样抗体对其关联配体的特异性，但进行一系列分析以排除与其他HLA-A201/肽复合物的交叉反应。T2细胞与材料和方法中所述的衍生自HBV聚合酶、X和包被蛋白的各种HLA-A201结合肽以及衍生自EBV、flu、CMV和各种肿瘤相关抗原表位的肽一起孵育(表4)。图8A显示c18/A2和E183/A2 TCR样mAb都仅与各肽脉冲处理的靶细胞特异反应。

肽	序列	SEQ ID NO：
			HBc18-27	FLPSDFFPSV	3
HBe183-91	FLLTRILTI	24
			HBc19-27I	LPSDFFPSI	34
HBe348-57	GLSPTVWLSV	25
			HBpo1455-63	GLSRYVARL	21
Flu M1-58-66	GILGFVFTL	17
			Flu PA46-54	FMYSDFHFI	29
EBV LMP2 426-34	CLGGLLTMV	28
			EBV BMLF 259-67	GLCTLVAML	27
HBX52-60	HLSLRGLPV	18
			Mage 254-62	GLYDGMEHL	19
Mage3-271-79	FLWGPRALV	22
			SSX 2(41-49)	KASEKIFYV	20
NY-ESO-1(157-65)	SLLMWITQA	23

表4.TCR样抗体的鉴定中所用的肽

由于慢性乙肝患者存在高水平的循环可溶性HBsAg和HBeAg，我们还研究了HBV循环抗原是否干扰pMHC复合物的识别。这通过将HBV慢性患者中收集的HBeAg或HBsAg阳性血清和产HBV的HepG2-117的培养物上清与TCR样抗体孵育1小时进行测试。得到的混合物用于染色表达各pMHC复合物的细胞。图8B显示TCR样抗体不被HBV循环抗原或其他血清组分改变的能力。

两种TCR样mAb和其单独关联肽(c18-27和e183-91肽-1uM)的预孵育没有使特异靶标的染色下降(未显示)。

为了定义最优染色所需的浓度，c18/A2和e183/A2Abs在1μg-0.001μg/ml的浓度范围滴定，然后用于染色1μM HBV核心18-27或HBV env 183-91肽脉冲处理的T2细胞(图8C)。用肽脉冲的T2获得的MFI减去非肽脉冲T2细胞(对照)的平均荧光值获得抗体染色的特异性MFI值。c18/A2Ab的染色反应在0.5μg/ml时饱和，e183/A2 Ab为0.06μg/ml。即使染色水平较低，两种抗体在0.004-0002μg/ml的工作浓度都显示区分肽脉冲与非肽脉冲细胞的能力(c18/A2 Ab的MFI＝～200；e183/A2 Ab的MFI＝～300)。在整个测试浓度范围中，e183/A2 Ab获得的MFI值高于c18/A2 Ab获得的值，表明e183/A2 Ab对其特异pMHC复合物的亲和性高于c18/A2 Ab。因为两种抗体在0.5μg/ml都获得饱和染色，除非另有说明，否则该浓度用于下述实验。

用流式细胞术检测靶细胞上的pMHC复合物

T2是缺失能有效装载肽的抗原处理相关转运体(TAP)1和2的突变细胞。HepG2细胞是HLA-A2+肝细胞瘤系。肽脉冲处理的T2细胞、肽脉冲处理或HBV转染的HepG2细胞与每管含0.5μg c18/A2或E183/A2mAb的50μl FACS染色缓冲液(含1％BSA和0.01％叠氮化钠的PBS)4℃孵育1小时。所述细胞清洗3次，与含合适荧光团标记的1μg抗小鼠-IgG二抗的50μl染色缓冲液孵育。再次清洗后，细胞用BD FACSC自动流式细胞仪分析。合适时，用Flowjo软件覆盖柱状图。

TCR样抗体识别的简并性

检测TCR样mAb耐受HLA-A201分子呈递的病毒肽中氨基酸(AA)取代的能力。将TCR样抗体的识别模式与对相同表位特异的CD8T细胞作比较。这些实验能阐明TCR样mAb和CD8T细胞之间可能不同的识别性质，并能直接测试TCR样mAb识别含靶向HBV表位内突变的不同HBV基因型或HBV准物种的能力。

测试核心18-27特异性CD8 T细胞和mAb识别AA取代的核心18-27肽的能力。图9A和B显示CD8 T细胞和c18-27/A2mAb都不耐受位置22和23的AA取代。该数据与现有功能性CD8 T细胞识别结果和有关核心18-27/HLA-A201复合物的晶体学数据相一致。22和23位置的AA从HLA I类丛中突起，因此结构上的位置对HBV-病毒肽/A2复合物和其受体之间的相互作用有重要影响。对靶向识别e183/A2特异性抗体和CD8 T细胞进行相似分析。产生E183/A2特异性CD8 T细胞克隆并与针对单AA取代env 183-91肽脉冲处理的靶细胞的E183/A2特异mAb平行测试。187和189位置的氨基酸取代不被e183/A2 Ab耐受(图8C)，而186和188为TCR结合所需(图9)，表明特异于E183/A2的抗体和CD8+T细胞的识别方式不同。

测试存在于不同HBV病毒分离物中的天然AA取代是否能抑制TCR样mAb识别。显示核心18-27表位内的这些天然AA取代能改变所述核心18-27特异性CD8T细胞响应。图8A显示c18/A2mAb能耐受除了V-21取代以外的数种突变，包括M-19、Asn-21、L-24、Y-24、G-26、ILeu-27、A-27、M-25G-26和A-21-I-27(图9B)。重要的是，代表HBV基因型B、C和一些F株系中核心18-27序列特征的27位置上异亮氨酸取代为缬氨酸的核心18-27肽没有影响c18/A2mAb识别。这与该突变仅改变所述肽与HLA-A201分子的结合而不改变其识别的事实一致。因此，该数据表明c18/A2抗体可能识别6种其他HBV基因型(A、B、C、D、E和F)和数种天然产生的核心18-27表位的突变肽。

相反，e183/A2 Ab专一地特异于HBV基因型A/C/D的env183-91表位序列而非HBV基因型B、E、F。HBV基因型A/C/D中常规发现的Arg-187在基因型B、E、F中取代为Lys-187。图9C显示e183/A2抗体在HLA-A201环境中不能识别env183-191(K)，表明所述抗体对多数HBV基因型A/C/D中检测到的包被蛋白的专有特异性。

HBV特异性CD8 T细胞的脱粒试验

在CD8T细胞和不同肽脉冲处理或不脉冲处理的靶细胞孵育5小时开始时将CD107 PE抗体(圣迭戈的BD药物基因公司(BD Pharmigen))加入孔中。孵育后，清洗细胞，用Cy-铬-偶联的抗CD8(加利福尼亚州圣迭戈的BD药物基因公司)染色，清洗并用流式细胞仪分析。

TCR样mAb的灵敏度

分析两种TCR样mAb对pMHC复合物的识别是否接近对相同pMHC复合物特异的CD8 T细胞的灵敏度。用所述浓度的合成肽脉冲处理T2细胞，清洗然后用两种TCR样Ab染色。图10(柱)显示c18/A2mAb和env183/A2 MAb染色强度与脉冲T2细胞所用的肽浓度成比例，且10^-12M(1pM-图8A)的核心18-27和10^-13M(100fM-图8B)的env 183-91肽足以检测特异性结合。

然后，将TCR样MAb检测感染细胞表面的复合物的能力与具相同特异性的CD8T细胞作比较。核心18-27特异性和env 183-91特异性CD8 T细胞针对用于抗体检测染色的不同特异性肽浓度脉冲处理的T2细胞加以刺激，CD8 T细胞的活化通过测量CD107(脱粒)在CD8 T细胞上的表达来定量。CD8 T细胞被肽脉冲T2细胞特异性活化的频率与有关TCR样Ab检测能力的数据重叠(图10)。数据显示核心18-27特异性CD8 T细胞在低于检测肽脉冲T2的c18/A2 Ab特异染色所需的肽浓度(10-100fM与1pM-图10)下活化。相反，env 183-91特异性CD8细胞需要高于检测env 183/A2 Ab介导T2染色所需的肽浓度(10pM与100fM)脉冲处理的靶细胞。两种TCR样抗体可检测低pM范围的肽脉冲处理的细胞且其灵敏度至少就env 183-91/A2特异性抗体而言超过相同复合物特异性CD8 T细胞。

HepG2细胞的慢病毒转导

4x10⁶ HEK293细胞接种在10厘米组织培养板上且用CaCl₂与pLVX-HBc或pLVX-HBs和Lenti HT包装混合物(BD克隆泰克公司(BD Clontech))中提供的包装载体共转染。转染24-48小时后，收集载体上清并澄清。存在7μg/ml聚凝胺时用载体上清转导HepG2细胞24小时。细胞在7μg/ml嘌呤霉素中选择2天，然后在c18/A2mAb或E183/A2mAb染色后用流式细胞术分析。

观察pMHC复合物

HepG2和HepG2-117细胞在盖玻片上含1％DMSO的DMEM培养基中培养。从培养基中去除多西环素以产生HBV。抗体染色前用1000U/ml IFN-γ处理细胞2天。盖玻片用PBS清洗3次并在新鲜制备的1％多聚甲醛中室温固定15分钟。PBS清洗3次后，盖破片用5％山羊血清封闭1小时，然后用1μg的c18/A2或E183/A2抗体4℃孵育过夜。盖玻片在PBS+0.05％吐温20(PBST)中清洗3次。采用AlexaFluor 647-酪胺信号放大试剂盒(英杰公司)显示一抗结合，除了用山羊抗小鼠IgG-HRP聚合物(DAKO)替代试剂盒内提供的抗小鼠IgG-HRP。其余实验方案与生产商推荐的一样。盖玻片装在含DAPI的不变色金试剂(英杰公司)中，并用卡尔蔡司LSM 510 META直立共聚焦显微镜获取图像。

TCR样抗体识别HBV感染细胞的能力。

为了测试患者样品中直接的TCR样抗体，需要稳健的证明该抗体能直接识别HBV感染的肝细胞。TCR样Ab识别pM浓度范围的肽和识别水平类似HBV-特异CTL的脉冲处理的T2细胞的能力受到促进，但肝细胞组成型表达低水平的HLA I类分子。此外，其抗原加工器在生成肽HLA I类复合物中极度无效，因此HBV感染的肝细胞表达的TCR特异性配体的量可比HBV肽脉冲处理的T2靶细胞中的水平低很多。

TCR样mAb识别生理活性胞内加工肽在HLA-A2环境中产生的pMHC复合物的能力首先用流式细胞分析评估。为此，我们用分别表达全长HBcAg或HBsAg蛋白的pLVX-HBcAg或pLVX-HBsAg质粒对HepG2细胞(为HLA-A201+)进行慢病毒介导的转导。可清晰观察到c18/A2和E183/A2抗体高于空载体转导细胞的显著染色(图11A和B)，证明这些抗体可识别肝细胞内源产生的pMHC复合物。

然后测试稳定转染有四环素(Tet)响应启动子控制的HBV基因组的肝细胞瘤细胞系(HepG2)是否可被所述两种TCR样Abs染色。该Tet可控制的HBV转染HepG2系(HepG2-117)在移除多西环素(Dox)后产生不同量的HBV病毒体和HBcAg抗原，而HBsAg生成受内部启动子的调节且因此其表达很大程度上不受Dox的影响。此外，HepG2-117的DMSO处理显著增加HBV-DNA x细胞的总数量，因此是我们能在广泛范围的HBV生产上研究HBV pMHC表达水平。

与转染有空载体(HepG2-对照)的HepG2细胞和存在Dox时HepG2-117培养物上观察到的染色水平相比，移除Dox 6天后HepG2-117细胞上的c18-27/A2 Ab观察到最低水平的染色。仅用含DMSO(增加HBV-DNA含量)和IFN-γ(增加肝细胞的Ag-加工/呈递能力)的HepG2-117处理可用所有细胞的c18/A2 Ab清楚染色。

与转染有空载体(HepG2-对照)的HepG2上检测的染色相比，观察到E183/A2Ab对HepG2-117有特异染色。然而，根据HBV包被mRNA不完全经受Tet调节的事实，Dox处理或未处理HepG2-117的E183/A2 Ab染色相同。E183/A2 Ab染色检测2种可能表达不同量HBsAg的细胞群。用DMSO和IFN-γ对HepG2-117细胞的处理显著增加用e183/A2 Ab的染色水平。

因此所述两种TCR样Abs能识别肝细胞样细胞，内源合成的HBV抗原的胞内加工产物，其表达为单蛋白(图11A，B)或全长HBV复制的结果(图11C，D)。

所述两种TCR样抗体识别产HBV肝细胞样细胞上其相应pMHC(c18-27/A2和E183/A2)的能力也用免疫组织学方法证实。Dox-培养基中培养并用DMSO处理的HepG2-117细胞在1％多聚甲醛中室温固定15分钟，清洗，然后用c18/A2或E183/A2mAb孵育。采用酪胺信号放大试剂盒观察抗体染色。如图11E所示，pMHC的识别可用两种抗体观察，且非HBV转染的HepG2细胞中和用对照抗体的染色为阴性。用E183/A2抗体获得明亮的染色，因为感染的HepG2-117细胞上的E183/A2复合物密度较高。然而，用c18/A2和e183/A2 Ab在无DMSO的HepG2-117Dox-细胞上观察到非常模糊/阴性染色(数据未显示)。

无Dox下扩增的HepG2-117细胞平均携带约130 HBV-DNA拷贝x细胞。该量与HBeAg+CHB患者肝细胞上检测的HBV-DNA x细胞的平均量(约100拷贝x细胞)一致。由于用此HBV复制水平的HepG2-117特异TCR样Abs染色仅由流式细胞分析实现，机械处理CHB患者的活检以实现单独细胞悬浮，用抗体染色并立即用流式细胞术分析(图12)。CHB患者首先测试HLA-A201表达，且HLA-A2阴性对象的活检用作阴性对照并测试与肝细胞形态学一致的细胞(正面和侧面散射上复杂性和大小提高的细胞)是否表达细胞标记如肝细胞特异性标记Ck-18。而获自HLA-A2+活检的细胞仅用c18/A2和E183/A2 Abs和EBV M/A2复合物特异性对照抗体染色。肝活检可获得的细胞数量有限以及二抗需要用于染色的事实是目前妨碍获自肝活检的细胞多重染色的限制因素。图12显示c18/A2和e183/A2 Abs而不是对照A2-EBV抗体能区分HLA-A201阳性CHB患者的肝活检中纯化的细胞，而HLA-A2阴性患者中没有检测到阳性染色。感染有基因型C的A2+患者仅用e183/A2 Ab显示阳性染色而非c18/A2 Abs，尽管HBV-DNA的水平高于HBV Gen D患者2中所存在的，该患者中C18/A2和e183/A2 Abs细胞都能特异性染色肝活检细胞。可能该染色多样性与HBV gen D的核心18-27表位的亲和性高于HBV gen C有关。HBV gen D核心18-27序列在27位置有Val，而HBV genC的核心18-27在27位置是Isoleu。后一种突变降低核心18-27表位与A2分子的结合并因此降低感染细胞表面呈递的特定pMHC A2/核心18-27含量。

HBV特异性TCR样抗体的高灵敏度被其能以接近(c18/A2 Ab)或优于(e183/A2Ab)HBV-特异CD8 T细胞的效率识别靶细胞表面的pMHC复合物的事实所证实。具体地，e183/A2特异性Ab能特定区分env 183-91肽以低至(100fM)不能活化env 183-91特异性CD8 T细胞的浓度脉冲处理的细胞。

pMHC的定量

QIFIKIT(DAKO)用于定量细胞表面呈递的pMHC。用于定量的实验方案如生产商所推荐。简而言之，用含1μg c18/A2或E183/A2mAb的50μl FACS染色缓冲液4℃孵育细胞1小时，然后清洗3次。在单独管中，细胞、装置珠、和展示不同但明确量的小鼠IgG mAb分子的校准珠平行与抗小鼠IgG-APC二抗4℃孵育1小时。细胞清洗3次并在FACSCanto上获得。获得各校准珠群的MFI并用于构建校准曲线。确定细胞的MFI并通过减去同种型对照细胞的MFI获得其特异性MFI，并通过内插到校准曲线上计算抗原(pMHC)的精确数量(图13)。采用相似的实验方案定量来自产HBV的HepG2细胞的pMHC，所述细胞在胞内、内源加工后表达pMHC。

产HBV的HepG2-117细胞上的pMHC复合物的定量。

TCR样Abs用于进行个体感染细胞上展示的特异pMHC复合物的相对定量。测量产HBV的HepG2-117细胞中表达的pMHC复合物数量以及产HBV细胞上的包被和核心肽的HLA-A2占有率。用TCR样Abs或抗HLA-A2Ab染色的不同细胞系(HepG2 117-Dox、Hep G2 117+Dox)的荧光强度与每珠含已知数量结合位置的校准珠(QuantiBRITE珠方法-图13)的荧光强度相比较。表5显示含约130HBV-DNA拷贝x细胞的HepG2-117细胞分别表达140 c18-27/A2和1020e183-91/A2复合物x细胞。c18-27和env 183-91表位的总HLA-A2分子占有率分别为0.036％和0.26％。

表5.肝细胞样细胞表面的HBV表位/A2复合物的定量。染色细胞的荧光强度(MFI)与材料与方法中详述的含已知数量配体x珠的校准珠的MFI相比较。HBV-DNA/细胞的相对评估源自Sun等的数据。

表6.HBe183-191mAb轻链和重链的氨基酸序列

所述两种TCR样抗体的高灵敏度可直接识别感染的肝细胞表面的pMHC复合物。表达非常低水平的HLA-I类分子且抗原加工能力较弱的肝细胞还可识别为本发明的抗体，其不仅识别产HepG2-HBV细胞上的pMHC配体，还直接离体识别CHB患者活检中的pMHC配体。

HBV感染细胞表面的包被和核心衍生pMHC复合物数量的比较分析表明包被-MHC复合物含量超过了产HBV的HepG2细胞中和慢性HBV感染患者的肝细胞上的核心MHC复合物含量。此数量差异可能取决于HBsAg相比HBcAg/HbeAg更高的合成产量。该结果能表明就HBV-特异CD8 T细胞介导的对照而言HBV包被是优于HBV核心的靶标。有趣的是，细胞表面表达的TCR-配体的这种数量分级与HBV感染患者中HBV-特异的CD8 T细胞频率的免疫优势分级相冲突。尽管存在于大多数HLA-A201+急性HBV患者中，但E183/A2特异CD8 T细胞通常以低于c18/A2特异CD8 T细胞的频率检测到。该结果的差异表明TCR样抗体用于深入研究HBV发病机理的潜力。

通过在固定的活检和HepG2 117上用免疫组化染色进行pMHC检测实验，我们注意到TCR样抗体的检测灵敏度在固定细胞中下降。

分析含未干扰组织中细胞的TCR-配体的可能性可例如，定量并定位HBV感染的肝细胞，研究慢性HBV感染的不同阶段中抑制分子的共表达(即PD-1L)和检测与CD8 T细胞或NK细胞可能的共定位。

所述两种TCR样抗体显示两种表位中天然突变的不同程度的识别简并性。e183/91 Ab似乎对HBV Gen A、C、D的env 183-91序列特征有专一特异性，而HBVGen B、E、F分离物中发现的187位置的单AA取代(Lys变为Arg)完全消除了识别。然后肽脉冲处理的T2细胞所得的这些结果通过HBVgen C和D感染的CHB患者活检的直接染色证实，其都可用e183/A2抗体成功染色。c18/A2抗体显示高度简并性，因为其能识别许多核心18-27肽，所述肽含核心18-27中存在的许多天然突变的AA取代特征且其中27位置的Ile取代为Val。AA的变化改变所述肽和A201分子的结合亲和性，因此其降低肽/A2复合物的稳定性，使此序列在A201对象中免疫原性较低，并降低感染细胞表面的pMHC复合物含量。该假设通过c18/A2 Ab不能染色HBV gen C感染患者的活检得到证实，尽管其有相当高水平的HBV复制。因为对env 183-91/A2复合物中的突变特异的TCR样抗体的识别模式与env183-91特异性CD8细胞的TCR不同，可能CD8T细胞压力选择的表位中的可能突变不能消除TCR样Ab对所选变体病毒的识别。

TCR样mAb对表达正确pMHC的严格特异性和循环HBV抗原不能抑制所述特异性结合的结果促进治疗和诊断中所述人源化形式的TCR样抗体的应用。在个性化药物的新时期，该抗原能用于首次观察感染靶标的存在和数量，然后可直接用于递送特异抗病毒药物或细胞因子给所述病毒感染的细胞。

实施例3

抗E183/A2 TCR样抗体的生成

用含25μg纯化的E183/A2单体和弗氏完全佐剂(初次给药)或弗氏不完全佐剂(3次加强给药)的溶液腹膜内重复免疫小鼠。最后一次不含佐剂的加强给药通过融合前3天的尾部注射进行。加强小鼠的脾细胞使用标准技术通过PEG1500与NS1骨髓瘤细胞融合。得到的杂交瘤细胞混合物接种在96孔板上并在HAT培养基中选择2周。约筛选到2000杂交瘤细胞用于通过流式细胞术选择所需mAb特异性。env183-91肽脉冲处理或无关的M1(flu)肽脉冲处理的T2细胞与杂交瘤上清4℃孵育30分钟，清洗并与抗小鼠IgG-alexafluor-488二抗再室温孵育30分钟，清洗并用细胞搜索软件在BD FACSCAN流式细胞仪上分析。仅一个克隆展现限于env183-HLA-A2的所需识别特征且M1肽脉冲处理细胞不显示反应性(图14)。此阳性克隆通过有限稀释亚克隆2次，稳定表达并大量收集培养物上清。这些上清中的E183/A2mAb用蛋白G琼脂糖柱纯化。

E183/A2 mAb的特异性

通过孵育T2细胞和衍生自HBV聚合酶、X和包被蛋白以及衍生自EBV、flu、CMV的不同HLA-A2结合肽；和各种肿瘤相关抗原表位来检测此mAb的特异性。如图15A所示，E183/A2mAb与env183-91肽脉冲处理的细胞特异性反应，且不染色任何其他肽脉冲处理的细胞。相似地，mAb不识别单独肽或单独HLA-A2，因为mAb与肽的预孵育不减少env183-91肽脉冲处理细胞的染色(数据未显示)。治疗抗体的结合/识别能力不应被患者血清的组分以及病毒抗原抑制。为了确定在甚至包括高水平的HBsAg和游离病毒体在内的患者血清组分存在时，E183/A2mAb是否保留其结合能力，所述mAb与HBsAg+ve患者的血清、产HBV的HepG2细胞的培养物上清以及和健康个体的血清(AB血清)一起预孵育。然后得到的混合物用于染色env183-91脉冲处理的T2细胞。图15B证明mAb与HBeAg+ve血清的预孵育对E183/A2mAb识别E183/A2复合物没有抑制效果。总之，这些结果清楚证明肽特异性和MHC限制性E183/A2mAb显示出与T细胞受体一样良好的特异性，且其结合能力没有被HBsAg干扰。

E183/A2 mAb的灵敏度

为了找出实现E183/A2mAb显著染色所需的最小肽浓度，T2细胞用各种浓度的env183-91肽孵育并用mAb染色。如图16所示，低至1pM的肽足以实现显著的染色。

env 183-191肽上抗体结合位置的作图

为了解决env183-91肽上的哪些氨基酸残基直接参与E183/A2mAb识别，T2细胞用所述残基上携带丙氨酸取代的env183-191肽孵育，并测试E183/A2mAb识别AA取代的肽的能力。图17显示E183/A2mAb不耐受187和189位置的AA取代，表明这些残基参与抗体识别。

细胞内加工形成的E183/A2复合物的识别。

TCR样mAb识别生理活性胞内加工肽在HLA-A2环境中产生的pMHC复合物的能力首先用流式细胞分析评估。为此，用表达全长HBsAg蛋白的pLVX-HBsAg载体对HepG2细胞(为HLA-A201+)进行慢病毒介导的转导。可清晰观察到E183/A2mAb高于空载体转导细胞的显著染色(图18A)，证明这些抗体可识别肝细胞内源产生的pMHC复合物。

然后测试TCR样抗体识别产HBV的HepG2(HepG2-117)细胞上的pMHC复合物的能力。这些细胞稳定转染有全HBV基因组并在从培养基中移除多西环素后产生HBV。从HepG2-117细胞中移除Dox 6天后，约40％的细胞用E183/A2mAb染色(图18B)。为了提高HBV和MHC I类的表达，用DMSO和IFN-γ处理HepG2-117细胞，且观察到E183/A2抗体染色的显著增加，证明TCR样抗体识别产HBV细胞上其关联pMHC的能力。总之这些结果表明TCR样E183/A2mAb能检测活性和天然产生的内源胞内加工后形成的特定复合物。

免疫细胞化学检测E183/A2复合物

TCR样抗体的另一主要可能的应用是用免疫细胞化学方法在未干扰组织中直接原位观察含配体的细胞。作为评估此能力的首先步骤，我们通过测试E183/A2mAb检测产HBV的HepG2细胞(HepG2-117)上E183/A2复合物的能力来确定其能否用于所述研究。如图18B处理的细胞在1％多聚甲醛中室温固定15分钟，清洗并用E183/A2mAb孵育。清洗3次后，用Alexa fluor647-酪胺信号放大试剂盒观察染色，除了用抗小鼠IgG-HRP聚合物替代抗小鼠IgG-HRP。如图19所示，用E183/A2mAb可观察到显著染色，且不产HBV的HepG2细胞中没有观察到染色。这些结果证明E183/A2mAb能用于观察固定的感染细胞上的E183/A2复合物。

检测HCC细胞系上的E183/A2复合物

为了探索E183/A2TCR样mAb识别天然整合HBV DNA的HCC细胞系上产生的内源衍生pMHC复合物的能力，使用良好表征的患者衍生细胞系Hep3B。此HCC细胞系先前显示表达并精炼HBsAg而不用人工异位转染，且其刺激患者中的染病肝细胞，在这里预期pMHC复合物会相较负载肽的细胞以低密度呈递到细胞表面。由于此细胞系不表达HLA-A2，我们用HLA-A2载体转导细胞。流式细胞分析表明与E183/A2mAb孵育后有显著染色。不表达HLA-A2的细胞没有观察到染色(图20)。这些细胞用IFNg处理显著增强了抗体染色。此数据表明E183/A2抗体能识别天然HCC细胞系上的pMHC且因此可最终用于观察天然表达HBsAg的HCC细胞系表面上的这些复合物。

连接E183/A2mAb的荧光物的特定递送

为了证明抗体作为特定靶向分子的能力，荧光物-Fab(Alexa Fluor 488，Zenon标记)与E183/A2抗体偶联并测试所述免疫-荧光物偶联物是否被特定递送到表达pMHC的细胞。流式细胞分析表明mAb-荧光物偶联物保留其亲本抗体的特异性，因为E183-91肽负载细胞但不是负载无关肽的细胞观察到特异性结合(数据未显示)。E183-91肽负载的HepG2细胞与mAb-荧光物偶联物孵育后，细胞在37℃孵育。固定时间点收集等分的细胞并用DiI红孵育标记质膜观察偶联物的内化。在共聚焦成像中，0小时的细胞显示细胞表面荧光沿着质膜特异染料DiI红的类似环状的分布。4小时孵育后，多数表面荧光递送到细胞并在细胞内出现小斑点。作为有效的药物递送载剂抗体，不仅应内化到靶细胞中，还应沿着胞内途径最终递送药物到正确的胞内位置。16小时的这些等分细胞与LysoTracker红孵育(图21中的中等灰色)以确定内化的抗体是否与溶酶体共染色。图21中所示结果的分析证实mAb-荧光物和溶酶体的共定位(图21中的亮灰色)。总之这些结果清楚的表明mAb能递送其上所附的物质到表达pMHC的肝细胞中。

参考文献

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US 5,225,539；

US 5,585,089；

PCT/RO/134表

申请人或代理人档案号122562-1PWCN

国际申请号PCT/SG2010/000440

                        关于微生物保藏的说明

                    (专利合作条约实施细则13之2)

PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)

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Claims (32)

1.一种分离的TCR样抗体或其片段，其中所述抗体或其片段能特异性结合至少一种HBV衍生肽。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述HBV衍生肽包括至少一种乙肝核心抗原和/或至少一种乙肝包被抗原。

3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述HBV衍生肽与主要组织相容性复合物(MHC)I类分子结合。

4.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述MHC I类分子是人白细胞抗原(HLA)I类分子。

5.如权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述HLA I类分子是HLA-A2。

6.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述HBV衍生肽为MHC-I肽复合物的部分，所述复合物包含HBV衍生肽和HLA I类分子。

7.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述HBV衍生肽含HBc18-27和/或HBe183-191、其变体、突变或片段。

8.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自下组：

a.杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068生产的抗体；

b.具有杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的结合特征的抗体；

c.与能结合杂交瘤细胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生产抗体的抗原结合的抗体；

d.结合包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：24、其变体、突变或片段的氨基酸序列的抗原的抗体；和

e.包含至少一种轻链和至少一种重链的抗体，其中所述轻链包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：32、其变体、突变或片段的氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：33、其变体、突变或片段的氨基酸序列。

9.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体为至少一种人、人源化或嵌合抗体。

10.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体用至少一种放射性核和/或荧光团标记。

11.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体连接至少一种药物、抗病毒药物、毒素和/或化疗剂。

12.一种分离的杂交瘤细胞系，所述细胞系以登录号PTA-10167和/或PTA-11068保藏于ATCC。

13.一种生产至少一种杂交瘤、乙肝病毒(HBV)特异性抗体或其片段的方法，所述方法包括以下步骤：

a.用与MHC I类分子结合的至少一种HBV衍生肽免疫至少一种非人哺乳动物，形成至少一种对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；

b.选择至少一种对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；和

c.将所选B细胞与至少一种永生细胞融合以产生至少一种杂交瘤，其中所述杂交瘤能生产至少一种对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的HBV特异性抗体或其片段；和

d.任选地从所述杂交瘤中分离所述HBV特异性抗体。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)包含对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的至少一种B细胞和下述一起孵育：

i.至少一种生物素化抗原，所述抗原能结合对MHC I类分子结合的HBV衍生肽特异的B细胞；和

ii.至少一种抗生物素偶联珠。

15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述HBV衍生肽为HBc18-27或HBe183-191。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述HBc18-27包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列和/或HBe183-191包含SEQ ID NO：24、其变体、突变或片段的氨基酸序列。

17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述MHC I类分子是人白细胞抗原(HLA)I类分子。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述HLA I类分子是HLA-A2。

19.一种按照权利要求13-18中任一项所述的方法生产的分离的抗体或其片段。

20.一种检测和定量对象中至少一种HBV感染细胞的存在和分布的方法，所述方法包括：

a.将如权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段与从至少一个对象获得的至少一种样品接触；和

b.检测和定量抗体与所述HBV感染细胞的结合。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗体特异性结合HBc18-27、HBe183-191、其变体、突变或片段或HBV感染细胞的其片段。

22.一种检测对象中HBV相关的肝细胞癌(HCC)的方法，所述方法包括：

a.将如权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段与

从至少一个对象获得的至少一种样品接触；和

b.检测抗体与所述HBV连接的HCC感染细胞的结合。

23.一种治疗HBV和/或至少一种HBV相关疾病的方法，所述方法包括将权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段给予需要的对象。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述HBV相关疾病是HCC。

25.如权利要求1-11和19中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段用于药物应用。

26.如权利要求1-11和19中任一项所述的抗体或其片段在制备治疗HBV和/或至少一种HBV相关疾病的药物中的应用。

27.一种诊断HBV和/或至少一种HBV相关疾病的药盒，所述药盒包括如权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段。

28.一种确定对象中疫苗效力的方法，所述方法包括：

a.给予所述疫苗后5-15天，将权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段与从所述对象获得的至少一种样品接触；和

b.检测所述抗体或其片段与HBV感染细胞的结合；和

c.对比给予所述疫苗前后HBV感染细胞的数量，其中HBV感染细胞数量减少说明疫苗有效。

29.一种确定细胞中抗原加工和呈递的精确性的方法，所述方法包括将权利要求1-11和19中任一项所述的至少一种抗体或其片段与所述细胞接触的步骤。

30.一种分离的核酸分子，所述分子编码

a.如权利要求1-11和19中任一项所述的抗体或其片段的至少一种轻链，其中所述轻链包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：32、其变体、突变或片段；和/或

b.如权利要求1-11和19中任一项所述的抗体或其片段的至少一种重链，其中所述重链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：33、其变体、突变或片段。

31.一种包含权利要求30所述核酸的表达载体。

32.一种包含权利要求31所述表达载体的宿主细胞。

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