CN116715750A - 特异性识别prame抗原的tcr及其与cd8共表达来重定向cd4 t细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性结合PRAME抗原短肽的T细胞受体(TCR)、包含所述TCR的融合蛋白或缀合物、编码所述TCR的核酸及包含其的工程化细胞，以及制备所述工程化细胞的方法。本发明还涉及将外源性CD8分子与所述TCR基因共表达于T细胞以增强T细胞的功能。本发明提供了所述TCR和所述基因工程化细胞在检测、预防和/或治疗PRAME相关的疾病(例如，PRAME相关的癌症)中的用途。
Description
技术领域
本发明总体上涉及免疫学领域。具体地，本发明涉及特异性识别PRAME抗原的T细胞受体(下文中也缩写为TCR)、表达所述TCR的基因工程化细胞、以及制备所述基因工程化细胞的方法。本发明还涉及将外源性CD8分子与所述TCR基因共表达于T细胞以增强T细胞的功能。本发明提供了所述TCR和所述基因工程化细胞在检测、预防和/或治疗PRAME相关的疾病(例如，PRAME相关的癌症)中的用途。
背景技术
黑素瘤优先表达抗原(preferentially expressed antigen of melanoma，PRAME，也称为“CT130“)是癌-睾丸抗原(Cancer-testis antigen，简称为“CTA”或“CT抗原”)家族成员之一，最早从黑色素瘤细胞中分离，是具有免疫原性的肿瘤相关抗原。
PRAME在绝大多数正常健康组织中不表达，仅在睾丸、增生子宫内膜有较强表达、以及在胎盘基底膜和卵巢黄体颗粒细胞中有局灶性微弱表达(Maciej Kaczorowski等人，PRAME Expression in Cancer.A Systematic Immunohistochemical Study of＞5800Epithelial and Nonepithelial Tumors.Am J Surg Pathol，2022；46(11)：1467-1476)，但在83.2％的原发性黑色素瘤和87％的转移黑素瘤中过量表达。PRAME也在其他多种肿瘤(包括实体瘤和血液系统肿瘤)中过量表达，所述肿瘤例如，非小细胞癌、乳腺癌、肾癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、滑膜肉瘤、黏液样脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病。
由于黑素瘤优先表达抗原(PRAME)在健康组织中仅具有少量表达和选择性表达的模式，而在许多不同的癌症中以高水平表达，因此，PRAME是一种非常合适的癌症靶抗原。本领域需要开发出针对PRAME的特异性免疫细胞，例如，TCR-T细胞，以有效检测、预防和治疗PRAME相关的疾病(例如，PRAME相关的癌症)。
发明内容
本发明人通过锐意研究，获得了能与PRAME特异性结合的T细胞受体(TCR)，并制备了重组表达该TCR的淋巴细胞，由此，能够通过TCR与PRAME抗原特异性结合来检测哺乳动物中PRAME相关的疾病(例如，PRAME相关的癌症)的存在；和/或能够通过体内介导针对表达PRAME的靶细胞的免疫应答来杀伤表达PRAME的癌细胞，从而满足了上述需求。
因此，在一个方面，本发明提供了分离的或纯化的T细胞受体(TCR)，其与PRAME抗原短肽特异性结合，优选地，所述TCR包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区(CDR)，并且α链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：269、272、275、278、281、284、287、290、293、296、299、302、305、308、311、314、317、320、323、326、329、332、335、338、341、344、347、350、353、356、359、362、365、368、371、374、377、380和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一个实施方案中，本发明的TCRα链的CDR3的氨基酸序列和β链的CDR3的氨基酸序列是：
(a)SEQ ID NO：3所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：269所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(b)SEQ ID NO：6所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：272所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(c)SEQ ID NO：9所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：275所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(d)SEQ ID NO：12所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：278所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(e)SEQ ID NO：15所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：281所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(f)SEQ ID NO：18所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：284所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(g)SEQ ID NO：21所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：287所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(h)SEQ ID NO：24所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：290所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(i)SEQ ID NO：27所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：293所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(j)SEQ ID NO：30所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：296所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(k)SEQ ID NO：33所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：299所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(l)SEQ ID NO：36所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：302所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(m)SEQ ID NO：39所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：305所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(n)SEQ ID NO：42所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：308所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(o)SEQ ID NO：45所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：311所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(p)SEQ ID NO：48所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：314所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(q)SEQ ID NO：51所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：317所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(r)SEQ ID NO：54所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：320所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(s)SEQ ID NO：57所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：323所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(t)SEQ ID NO：60所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：326所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(u)SEQ ID NO：63所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：329所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(v)SEQ ID NO：66所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：332所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(w)SEQ ID NO：69所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：335所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(x)SEQ ID NO：72所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：338所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(y)SEQ ID NO：75所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：341所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(z)SEQ ID NO：78所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：344所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(aa)SEQ ID NO：81所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：347所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(bb)SEQ ID NO：84所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：350所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(cc)SEQ ID NO：87所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：353所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(dd)SEQ ID NO：90所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：356所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ee)SEQ ID NO：93所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：359所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ff)SEQ ID NO：96所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：362所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(gg)SEQ ID NO：99所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：365所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(hh)SEQ ID NO：102所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：368所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ii)SEQ ID NO：105所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：371所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(jj)SEQ ID NO：108所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：374所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(kk)SEQ ID NO：111所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：377所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或
(ll)SEQ ID NO：114所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：380所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一个实施方案中，本发明的TCR的α链包含的三个互补决定区(CDR)的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：
(a)SEQ ID NO：1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：267、268、269所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(b)SEQ ID NO：4、5、6所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：270、271、272所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(c)SEQ ID NO：7、8、9所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：273、274、275所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(d)SEQ ID NO：10、11、12所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：276、277、278所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(e)SEQ ID NO：13、14、15所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：279、280、281所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(f)SEQ ID NO：16、17、18所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：282、283、284所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(g)SEQ ID NO：19、20、21所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：285、286、287所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(h)SEQ ID NO：22、23、24所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：288、289、290所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(i)SEQ ID NO：25、26、27所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：291、292、293所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(j)SEQ ID NO：28、29、30所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：294、295、296所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(k)SEQ ID NO：31、32、33所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：297、298、299所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(1)SEQ ID NO：34、35、36所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：300、301、302所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(m)SEQ ID NO：37、38、39所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：303、304、305所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(n)SEQ ID NO：40、41、42所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：306、307、308所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(o)SEQ ID NO：43、44、45所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：309、310、311所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(p)SEQ ID NO：46、47、48所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：312、313、314所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(q)SEQ ID NO：49、50、51所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：315、316、317所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(r)SEQ ID NO：52、53、54所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：318、319、320所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(s)SEQ ID NO：55、56、57所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：321、322、323所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(t)SEQ ID NO：58、59、60所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：324、325、326所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(u)SEQ ID NO：61、62、63所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：327、328、329所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(v)SEQ ID NO：64、65、66所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：330、331、332所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(w)SEQ ID NO：67、68、69所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：333、334、335所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(x)SEQ ID NO：70、71、72所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：336、337、338所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(y)SEQ ID NO：73、74、75所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：339、340、341所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(z)SEQ ID NO：76、77、78所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：342、343、344所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(aa)SEQ ID NO：79、80、81所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：345、346、347所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(bb)SEQ ID NO：82、83、84所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：348、349、350所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(cc)SEQ ID NO：85、86、87所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：351、352、353所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(dd)SEQ ID NO：88、89、90所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：354、355、356所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ee)SEQ ID NO：91、92、93所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：357、358、359所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ff)SEQ ID NO：94、95、96所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：360、361、362所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(gg)SEQ ID NO：97、98、99所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：363、364、365所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(hh)SEQ ID NO：100、101、102所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：366、367、368所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ii)SEQ ID NO：103、104、105所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：369、370、371所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(jj)SEQ ID NO：106、107、108所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：372、373、374所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(kk)SEQ ID NO：109、110、111所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：375、376、377所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ll)SEQ ID NO：112、113、114所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：378、379、380所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一些实施方案中，本发明的TCR包含任一SEQ ID NO：191-228所示的α链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和任一SEQ ID NO：459-496所示的β链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了T细胞受体融合蛋白或T细胞受体缀合物，其包含本发明第一方面所述的TCR和其他生物活性分子，其中所述其他生物活性分子是例如抗体、细胞因子、细胞毒性剂、酶、放射性物质、可检测标记，其中所述TCR和其他生物活性分子之间具有或不具有接头。
本发明还提供了编码本发明TCRα链和/或β链的核酸。
此外，本发明提供了载体，优选地为质粒、穿梭质粒、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和/或同源重组修复(HDR)载体，其包含一个或多个如上所述的核酸。
在第二方面，本发明提供了用以上载体转化并表达本发明第一方面所述TCR的工程化细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种不使用病毒载体表达本发明的外源性TCR的打靶策略来制备TCR-T细胞的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了一种编辑人细胞基因组的方法，所述方法包括将以下核酸序列插入人细胞中内源性T细胞受体(TCR)α链恒定区基因的外显子1的靶区域中，所述核酸序列从N端到C端包含：
(i)编码第一可裂解接头多肽的序列；
(ii)编码本发明第一方面所述TCR的β链的序列；
(iii)编码第二可裂解接头多肽的序列；
(iv)编码本发明第一方面所述TCR的α链可变区的序列；
其中，所述第一可裂解接头多肽和所述第二可裂解接头多肽是相同或不同的病毒2A肽。
通过所述方法制备的表达外源性TCR的细胞与SLLQHLIGL-HLA-A*02：01复合物有很高的结合亲和力以及对呈递SEQ ID NO：541所示的PRAME_425-433肽的肿瘤细胞具有很强的体外杀伤作用。
在一些实施方案中，制备表达外源性TCR的细胞的方法是通过采用CRISPR/Cas9技术和同源重组技术，敲除内源性TCR和敲入外源性TCR实施的。
在第三方面，本发明提供了改善细胞疗法的方法和工程化细胞。
在一些实施方案中，本发明涉及外源性TCR和CD8aa分子在T细胞中进行了共表达。又在一些实施方案中，本发明涉及外源性TCR和CD8ab分子在T细胞中进行了共表达。
通过将CD8aa分子和/或CD8ab分子与TCR基因共表达于CD8+和CD4+ T细胞，对CD8+和CD4+ T细胞的功能产生了有益的作用。特别地，通过将MHC I类TCR和CD8分子共表达于CD4+ T细胞，将CD4+ T细胞重编程为多功能杂化T细胞，其同时具有细胞毒性效应功能和天然的辅助功能。
在第四方面，本发明提供了第一方面所述的TCR、第二方面和第三方面所获得的工程化细胞在检测、预防和/或治疗PRAME相关的疾病(例如，PRAME相关的癌症)中的用途。
附图说明
结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1A显示了采用gRNA002将外源性TCR敲入TRAC位点的打靶策略图。
图1B显示了采用gRNA004基因敲除TRBC1和TRBC2位点的打靶策略图。
图2显示了流式细胞术检测TCR基因编辑效率的结果示意图(Day 7)。流式细胞术数据分析为4个象限(Q1、Q2、Q3、Q4)的细胞分布图，其中，Q2是完成了内源性TCR敲除(knock-out；KO)和外源性TCR敲入(knock-in；KI)，表达了nwTCR的细胞群；Q3是未进行基因编辑的野生型T细胞；Q4是完成了内源性TCR敲除的KO细胞。
图3A-图3LL例示了电穿孔转染不同nwTCR的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞用pMHC四聚体染色的流式细胞术结果(Day 7)。
图4A-图4D显示了分别表达各nwTCR的T细胞对HLA-A*02：01呈递的SEQ ID NO：541所示短肽的结合亲和力检测实验结果和EC50值。
图5A-图5B显示了表达各nwTCR的T细胞特异性杀伤呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的PANC-1细胞系的实时荧光成像结果(细胞开始共孵育时为0h，16h后被杀伤的靶细胞为红色)。图中的“Blank”表示只有抗原呈递细胞且未添加表达任一nwTCR的T细胞。
图5C-图5D显示了表达各nwTCR的T细胞特异性杀伤呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的NCI-H1703细胞系的实时荧光成像结果(细胞开始共孵育时为0h，16h后被杀伤的靶细胞为红色)。图中的“Blank”表示只有抗原呈递细胞且未添加表达任一nwTCR的T细胞。
图6A显示了表达各nwTCR的T细胞杀伤PANC-1细胞的实时分析数据。结果显示基因编辑过的T细胞对呈递了SLLQHLIGL抗原短肽的PANC-1细胞有特异性杀伤效果。图6A中的“Blank”表示只有PANC-1细胞且未添加表达任一nwTCR的T细胞。
图6B-图6C显示了表达各nwTCR的T细胞杀伤NIH-OVCAR-3细胞的实时分析数据。结果显示基因编辑过的T细胞对呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的NIH-OVCAR-3细胞有特异性杀伤效果。图中的“Blank”表示只有NIH-OVCAR-3细胞且未添加表达任一nwTCR的T细胞。
图6D显示了表达各nwTCR的T细胞杀伤NCI-H1703细胞的实时分析数据。结果显示基因编辑过的T细胞对呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的NCI-H1703细胞有特异性杀伤效果。图中的“Blank”表示只有NCI-H1703细胞且未添加表达任一nwTCR的T细胞。
图7显示了nwTCR-CD8ab的打靶策略图。
图8A显示了电穿孔转染nwTCR-2081的CD4+ T细胞、CD8+ T和CD8+CD4+T细胞用pMHC四聚体染色的流式细胞术结果。
图8B显示了电穿孔转染nwTCR-2081-CD8ab的CD4+T细胞、CD8+T和CD8+CD4+T细胞用pMHC四聚体染色的流式细胞术结果。
图9显示了表达nwTCR2081-CD8ab的T细胞杀伤NIH-OVCAR-3细胞的实时分析数据。结果显示基因编辑过的T细胞对呈递了SLLQHLIGL抗原短肽的NIH-OVCAR-3细胞有特异性杀伤效果。图中的“Blank”表示只有NIH-OVCAR-3细胞且未添加表达任一nwTCR的T细胞。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。
I.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10％的下限和比指定数字数值大10％的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“PRAME”或“黑素瘤优先表达抗原”是指在许多癌症类型中高表达的公知的癌-睾丸抗原(CTA)，其是一种肿瘤相关抗原。全长PRAME的氨基酸序列是已知的，并且可以在例如GenBank登录号NP_001278646.1找到。本文中的术语“PRAME”包括重组PRAME或其片段。该术语还包括连接有例如组氨酸标签、小鼠或人Fc等的PRAME或其片段。在一些实施方案中，该术语包含与HLA-A2连接或由HLA-A2展示的PRAME或其片段。
术语“抗原”是能够被生物体的免疫系统特异性检测的任何分子。术语“肿瘤抗原”包含肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)。术语“肿瘤相关抗原”(TAA)是指在肿瘤细胞上存在的蛋白，以及在胎儿期间(曾经的胚胎抗原)和出生后在所选的器官中的正常细胞上存在的蛋白，但其浓度远远低于在肿瘤细胞中的浓度。肿瘤相关抗原也可以存在于肿瘤细胞附近的间质中，但以较低的量在体内其他间质中表达。术语“肿瘤特异性抗原”(TSA)是指主要存在于哺乳动物受试者的肿瘤细胞上但通常在哺乳动物受试者的正常细胞上无发现的抗原。
术语“HLA”指人白细胞抗原(HLA)系统或复合体，它是编码人主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的基因复合体。这些细胞表面蛋白负责调节人的免疫系统。术语“HLA-A”是指由HLA-A基因座编码的一组人白细胞抗原(HLA)。HLA-A是人MHC I类细胞表面受体的三种主要类型中的一种。受体是异二聚体，并由重α链和较小的β链构成。α链由变异HLA-A基因编码，并且β链(β2-微球蛋白)是不变的β2微球蛋白分子。
T细胞受体(T cell receptor，TCR)是T细胞表面负责特异性识别与MHC(主要组织相容性复合体)结合的抗原肽的蛋白。当TCR与抗原肽和MHC结合时，T淋巴细胞通过信号转导被激活，进入后续的免疫应答过程。人类基因组中有4个TCR基因：两个编码轻链TCR：TRA基因编码TCRα，TRG基因编码TCRγ；两个编码重链TCR：TRB基因编码TCRβ，TRD基因编码TCRδ。重链TCR和轻链TCR形成异源二聚体，组成完整的TCR。在人类中存在两种TCR：TCRa/β和TCRγ/δ，其中95％的T细胞表达TCRα/β，称为αβT细胞；5％的T细胞表TCRγ/δ，称为γ/δT细胞。该比例在个体发育过程中和患病状态(例如白血病)中发生变化，物种之间也有所不同。
成熟的重链TCR基因由可变区(V)、多变区(D)、连接区(J)和恒定区(C)四部分基因片段组成(VDJC)，轻链TCR则缺少D区(VJC)。重链和轻链TCR都具有3个互补决定区(CDR)，在抗原识别中起主要作用，其中CDR1和CDR2相对保守，负责识别MHC；CDR3是负责识别抗原的主要CDR。
TCR基因是人类基因组中复杂度最高的基因，也是变异程度最高的基因。人外周血中大概含有2x1016-1018种表达不同TCR的T细胞。这个复杂度主要源自3个因素：(i)组成的多样性：成熟TCR的VDJC/VJC结构，是通过复杂的重排生成的。基因组中有65-100种V基因片段、2种D基因片段和13种J基因片段，TCR重组时需要从上述三种片段中各选一个，这赋予了TCR高度的多样性；(ii)连接的机动性：在重排的过程中，在V-D及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除，进一步增加了CDR3区的多样性；(iii)体细胞突变：T细胞D区的突变频率约为正常的1000倍。
术语“特异性地结合”或“与......特异性地结合”等是指TCR与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合体。确定两个分子是否特异性地结合的方法是本领域公知的，并且包括例如表面等离子共振等。如本文所述，本发明的TCR与HLA-A2呈递的癌睾丸黑素瘤优先表达抗原(PRAME)短肽特异性地结合，例如，包含PRAME的氨基酸残基425-433的肽。
如本领域已知，在本文中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。
如下进行序列之间序列同一性的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是同一的。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS，4：11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如，B-细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合体。APC加工抗原且将抗原呈递给T细胞。
术语“引导RNA(guide RNA，gRNA)”指特异于靶DNA的RNA，其可以与Cas蛋白质形成复合体并将Cas蛋白质带至靶DNA，从而Cas蛋白质在靶DNA的位点处引入双链断裂。在本发明中，引导RNA可以由两个RNA，即CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)组成，或者引导RNA可以是通过融合crRNA和tracrRNA的必要部分而产生的一条单链引导RNA(single guide RNA，sgRNA)。
核糖核蛋白复合物(Ribonucleoprotein，RNP)是Cas9蛋白和gRNA复合形成的具有基因编辑功能的复合物。
CRISPR/Cas9基因编辑系统主要由两部分组成：相当于“扳手”作用的Cas9蛋白与相当于“螺纹钉”作用的CRISPR引导RNA。引导RNA负责对靶位点进行定位，并招募和激活Cas9蛋白；Cas9蛋白则负责切割靶DNA。
术语“重组”，当用于例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质、或改变天然核酸或蛋白质而被修饰。
术语“靶位点”指在目标基因组中任何一段欲加以改造或修复的DNA序列。靶位点附近的DNA序列允许外源序列在靶位点处的整合，所述整合包括但不限于基因敲入(knock-in，KI)。在具体实施方式中，目标DNA序列是双链的DNA序列，包括但不限于，细胞的染色体基因组中的DNA序列、细胞染色体基因组外的DNA序列(例如线粒体基因组)、质粒、病毒等的DNA序列。
在本发明中，术语“定点重组”是指，将外源序列通过非随机的方式整合到特定的靶位点处，包括整合到某特定靶位点的5’上游、3’下游、或者靶位点之间。
在本发明中，术语“外源DNA序列”是指，期望被定点重组到靶位点处的DNA序列。外源DNA序列可以是靶位点处不存在或被改变的序列。
术语“供体DNA”或“供体核酸序列”是指包含待表达的目的多核苷酸序列的多核苷酸，该目的多核苷酸序列被插入目标基因组中的靶位点处。在某些实施方案中，供体DNA进一步包含与基因组序列同源的序列(也被称为“同源臂”)。“同源”意指类似的DNA序列。同源臂足以发生与同源基因组序列的同源重组。例如，同源臂可以包含至少50-3500或更多个碱基长度。
术语“同源定向DNA修复(Homology directed repair，HDR)”是基于同源重组的修复，可用于特异性地将供体DNA模板(编码目的序列)高效地插入目标基因组位点，是细胞DNA双链损伤后启动的一种修复途径。只有当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。HDR载体可以指采用CRISPR/Cas9和同源重组技术电穿孔转染用的载体。HDR效率可以指采用CRISPR/Cas9和同源重组技术电穿孔转染的基因敲入效率。
同义突变(synonymous mutation)是一种中性突变，遗传密码是简并性的，即，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换往往不会改变氨基酸的组成。虽然三联体密码子中第三个核苷酸发生了突变，但编码的氨基酸没有改变，这种突变是同义突变。
如本文所用，“载体(vector)”表示一种构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、质粒、粘粒或噬菌体载体。载体可以包含允许所关注的基因或序列在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起始区。载体还可以包含一种或多种可选择的标志物基因和本领域技术人员已知的其他遗传元件。载体优选地是包含根据本发明的核酸的表达载体，所述核酸与容许所述核酸表达的序列有效连接。
术语“有效连接”是指核酸表达调节序列和编码目的蛋白的核酸序列之间的功能性连接，以便执行总体功能。可使用本领域众所周知的基因重组技术制备与重组载体的有效连接，并使用本领域众所周知的酶进行位点特异性DNA切割和连接。
在本发明中，术语“工程化细胞”是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。工程化细胞包括“转染的细胞”，其包括原代转染细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转染的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。
在本文中，“受试者”、“个体”指需要缓解和/或治疗PRAME抗原短肽相关癌症的动物，优选哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。
过继性免疫细胞治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy，ACT)，是指从受试者或患者体内分离出具有免疫活性的细胞，在体外进行激活扩增、基因编辑等处理之后，再回输到患者体内，从而实现对靶细胞的杀伤。
II.本发明的T细胞受体(TCR)和编码TCR的核酸
本发明提供了分离的或纯化的TCR(本文中也简称为nwTCR)，其对由HLA-A分子呈递的PRAME抗原短肽具有抗原特异性。所述由HLA-A分子呈递的PRAME抗原短肽具有适合于结合任何HLA-A分子的任何长度。
在一些实施方案中，所述PRAME抗原短肽具有约9个至约10个氨基酸残基的长度，其包括PRAME蛋白中任何连续的约9个至约10个氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的TCR对PRAME抗原短肽具有抗原特异性，PRAME抗原短肽具有约9个氨基酸残基或约10个氨基酸残基的长度。可以被本发明的TCR识别的PRAME抗原短肽的实例是PRAME第425到第433位氨基酸序列的短肽SLLQHLIGL(SEQ ID NO：541)(文中也简称为“PRAME_425-433肽”)。
T细胞受体(TCR)是存在于T细胞表面的分子，其负责识别抗原肽-MHC复合物(即，pMHC)。TCR与抗原肽-MHC复合物的特异性结合引发T细胞通过一系列由相关酶、共受体和辅助性分子介导的生化事件而活化。在95％的T细胞中，TCR异二聚体由α和β链组成，而在5％的T细胞中，TCR异二聚体由γ和δ链组成。
TCR的每一条链均属于免疫球蛋白超家族的成员，具有一个N端免疫球蛋白(Ig)可变(V)结构域、一个Ig恒定(C)结构域、跨细胞膜区域(即，跨膜区)以及在C末端的短胞质尾。在TCRα链和β链的可变结构域中，各可变结构域具有三个高变区或互补决定区(CDR)，其中各可变结构域中的CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR。认为CDR2识别MHC分子。
TCR的恒定结构域由短的连接序列组成，其中的半胱氨酸残基形成二硫键，在TCRα链和β链之间产生连接。
在T细胞成熟过程中，TCR与CD3形成TCR/CD3复合体。TCR/CD3复合体形成过程通常是按以下序进行的；首先CD3γ、δ和ε三种肽链通过形成γ-ε和δ-ε两种异源二聚体成为稳定的复合物核心，TCRαβ(或TCRγδ)与之结合，随后ζ-ζ或ζ-η二聚体与TCRαβ(或TCRγδ)/CD3γεδε复合物结合，最后转移到T细胞表面。通过TCR/CD3复合体将信号从TCR传导至细胞内。
来自TCR/CD3复合体的信号通过MHC与特异性共受体的同时结合而增强。在辅助T细胞中，这一共受体是CD4分子，所述CD4分子对II类MHC是特异性的；而在细胞毒性T细胞中，这一共受体是CD8，所述CD8分子对I类MHC是特异性的。
在本文中，术语“T细胞受体”具有本领域的常规意义，用于表示能够识别由MHC分子呈递的肽的分子。该分子是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体。
本发明的TCR提供对PRAME抗原短肽的特异性亲和识别。PRAME抗原在细胞内被蛋白酶体降解为8到10个氨基酸长的短肽，例如，SEQ ID NO：541所示的PRAME_425-433肽。这些短肽被MHC I类以肽/MHC复合物(pMHC)呈递在细胞表面。已证明一些pMHC与各种癌症有关，因此，可以成为TCR治疗的潜在靶标。
本发明提供了分离的或纯化的T细胞受体(TCR)α链和/或β链。本发明的TCR可以是包含衍生自超过一种物种的序列的杂合TCR。例如，考虑到鼠科TCR在人T细胞中能够比人TCR更有效地表达，TCR可包含人可变区和鼠科恒定区。
在一个实施方案中，本发明的TCR包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区(CDR)，且其中主要负责抗原识别的TCRα链CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：269、272、275、278、281、284、287、290、293、296、299、302、305、308、311、314、317、320、323、326、329、332、335、338、341、344、347、350、353、356、359、362、365、368、371、374、377、380和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一个实施方案中，本发明的TCR包含α链和β链，所述α链包含的三个互补决定区(CDR)的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：
(a)SEQ ID NO：1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：267、268、269所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(b)SEQ ID NO：4、5、6所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：270、271、272所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(c)SEQ ID NO：7、8、9所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：273、274、275所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(d)SEQ ID NO：10、11、12所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：276、277、278所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(e)SEQ ID NO：13、14、15所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：279、280、281所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(f)SEQ ID NO：16、17、18所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：282、283、284所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(g)SEQ ID NO：19、20、21所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：285、286、287所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(h)SEQ ID NO：22、23、24所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：288、289、290所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(i)SEQ ID NO：25、26、27所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：291、292、293所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(j)SEQ ID NO：28、29、30所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：294、295、296所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(k)SEQ ID NO：31、32、33所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：297、298、299所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(l)SEQ ID NO：34、35、36所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：300、301、302所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(m)SEQ ID NO：37、38、39所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：303、304、305所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(n)SEQ ID NO：40、41、42所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：306、307、308所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(o)SEQ ID NO：43、44、45所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：309、310、311所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(p)SEQ ID NO：46、47、48所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：312、313、314所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(q)SEQ ID NO：49、50、51所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：315、316、317所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(r)SEQ ID NO：52、53、54所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：318、319、320所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(s)SEQ ID NO：55、56、57所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：321、322、323所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(t)SEQ ID NO：58、59、60所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：324、325、326所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(u)SEQ ID NO：61、62、63所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：327、328、329所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(v)SEQ ID NO：64、65、66所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：330、331、332所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(w)SEQ ID NO：67、68、69所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：333、334、335所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(x)SEQ ID NO：70、71、72所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：336、337、338所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(y)SEQ ID NO：73、74、75所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：339、340、341所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(z)SEQ ID NO：76、77、78所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：342、343、344所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(aa)SEQ ID NO：79、80、81所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：345、346、347所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(bb)SEQ ID NO：82、83、84所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：348、349、350所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(cc)SEQ ID NO：85、86、87所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：351、352、353所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(dd)SEQ ID NO：88、89、90所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：354、355、356所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ee)SEQ ID NO：91、92、93所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：357、358、359所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ff)SEQ ID NO：94、95、96所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：360、361、362所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(gg)SEQ ID NO：97、98、99所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：363、364、365所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(hh)SEQ ID NO：100、101、102所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：366、367、368所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ii)SEQ ID NO：103、104、105所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：369、370、371所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(jj)SEQ ID NO：106、107、108所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：372、373、374所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(kk)SEQ ID NO：109、110、111所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：375、376、377所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ll)SEQ ID NO：112、113、114所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：378、379、380所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一个实施方案中，本发明的TCR包含任一SEQ ID NO：191-228所示的α链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和任一SEQ ID NO：459-496所示的β链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。优选地，本发明的TCR的恒定区是小鼠恒定区。
在一些实施方案中，本发明的TCR变体中所述氨基酸残基的改变是任一SEQ IDNO：191-228所示的α链序列、任一SEQ ID NO：459-496所示的β链序列中的氨基酸残基的取代、添加或缺失，条件是该TCR变体仍保留了或改善了与PRAME抗原短肽的表位肽-MHC复合物结合的能力。在一个实施方案中，所述取代是保守性取代。下表A中给出了保守性取代的例子。
表A
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氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将使这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。
在一些实施方案中，本发明的TCR能够识别并结合由HLA I类分子呈递的PRAME蛋白的表位肽，引发免疫应答。
在一些实施方案中，所述HLA I类分子是任何HLA-A分子，例如，HLA I类分子是HLA-A2分子。所述HLA-A2分子可以是任何HLA-A2分子。HLA-A2分子的实例包括但不限于HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03或HLA-A*02:04。优选地，HLA I类分子是HLA-A*02:01分子。到目前为止，在人类身上测试的最常见的人类白细胞抗原限制性TCR是针对HLA-A*02:01的，它在大约50％的高加索人、大约40％的拉美裔人和大约20％-24％的非裔美国人中被发现。HLA-A*02:01在日本人中的频率约为22％，在美国亚洲人中约为18％，在中国人中高度可变(0-24％)。
本发明还涉及编码本发明TCR或其部分的核酸，所述TCR部分例如，一个或多个CDR；一个或多个可变区；α链；或β链等。该核酸可以是双链或单链的，并且可以是RNA或DNA。该核酸序列可以是经密码子优化的，以实现哺乳动物生产细胞中的高表达。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择是本领域公知的。密码子优化还可包括移除mRNA不稳定基序和隐藏的剪接位点。
本发明的TCR可经多种方法(例如，基因融合、化学共轭等)进行修饰，从而使TCR与其他生物活性分子连接。可与其他生物活性分子连接的TCR可以是TCR异二聚体或其可溶性型式，更优选地为可溶性、单链TCR。所述其他生物活性分子可以是各种生物活性效应物，例如抗体、细胞因子、细胞毒性剂、酶、放射性物质、可检测标记等。所述TCR和其他生物活性分子之间具有或不具有接头。
在一些实施方案中，TCR融合蛋白是将TCR与抗体融合，所述抗体包括完整抗体(例如IgG、IgM或IgA类)或者其片段(例如Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双体抗体(diabody)；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体)；以及多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
在一些实施方案中，TCR融合蛋白是将TCR与细胞因子融合，所述细胞因子例如白细胞介素(例如IL-2)、趋化因子(例如MIP-1β)、生长因子(例如GCSF)。
在一些实施方案中，TCR缀合物是将TCR共价连接至细胞毒性剂，例如阿霉素。
在一些实施方案中，TCR缀合物是将TCR共价连接至放射性物质，例如I125。
在一些实施方案中，TCR缀合物是将TCR共价连接至可检测标记，例如荧光标记物。
本发明的T细胞受体融合蛋白或T细胞受体缀合物可用于各种应用，包括体内检测细胞和/或使细胞或组织成像，以及治疗用途，例如在体内或体外杀死具有特异性结合TCR的表达PRAME抗原短肽的靶细胞或靶组织。
III.包含编码本发明TCR的核酸的载体
本发明还涉及包含编码本发明TCR的核酸的载体。在又一个实施方案中，使用了pUC57-HA载体，所述pUC57-HA载体是在pUC57-Simple载体基础上优化后的载体，其仅保留了pUC57-Simple载体的Ori和Amp序列，然后将Amp序列替换为Kana序列，并添加TRAC位点的左右同源臂(HA)序列(800bp左右)。
载体将编码本发明TCR的核酸转移至细胞中，诸如T细胞、NK细胞、干细胞，例如多能干细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)中，使得所述经工程化的细胞表达PRAME抗原短肽特异的TCR。
所述PRAME抗原短肽特异的TCR是指这样的TCR，其能够以高亲和力特异性结合且免疫性识别PRAME。例如，约1×105个表达TCR的T细胞与经PRAME脉冲的且HLA I类分子过表达的抗原呈递细胞例如T2细胞或K562细胞共培养后，以TCR的EC50约1×10-6 M或更少(例如，1×10-7M或更少、1×10-8M或更少、1×10-9M或更少、1×10-10M或更少、1×10-11M或更少)引起分泌IFN-γ，则认为TCR对PRAME具有抗原特异性。HLA I类分子可以是本文所述的任何HLA I类分子(例如HLA-A*02：01分子)。
优选地，载体使得在工程化的细胞(例如，工程化的T细胞)中持续高水平表达引入的外源性TCR，且引入的外源性TCR可成功地与内源TCR竞争有限的CD3分子池。备选地，增加CD3分子供应也可增加基因修饰细胞中的外源性TCR表达。因此载体任选地包含CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε和/或CD3-ζ的基因。在一个实施方案中，载体包含CD3-ζ的基因。另外，也可提供一个或多个编码CD3基因的单独的载体用于与外源性TCR编码载体共转移入细胞中。
载体形式不限于同源重组修复(HDR)载体，也可以是病毒载体。病毒载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体，用来实施对细胞基因组的编辑。
基因组的编辑技术是指在细胞基因组DNA中进行核酸插入、缺失或者替换的一项技术。利用基因编辑技术对于人原代T细胞的基因改造后的T细胞，已经在多种过继性免疫治疗药物的临床试验中展现了优异的疗效。其中，嵌合抗原受体(Chimeric AntigenReceptors，CAR)或者T细胞受体(T Cell Receptor，TCR)常被用于改造人的原代T细胞，从而实现对某些特定靶点表位(epitope)的识别。这些经改造后的T细胞可以对特定的靶细胞起到特异性杀伤作用。
常见的TCR基因编辑手段根据基因整合方式可以大致分为两类，一类是基因的随机整合：包括慢病毒(Lenti Virus，LV)体系，腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)体系，转座子(Transposon)体系等。另一类是精准的基因编辑手段：包括锌指核酸酶(ZFN)，转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)技术等。其中，CRISPR技术通过gRNA的导向来识别及编辑DNA，通过同源重组的方式进行大基因片段的定点插入，具有易于操作，具有更强的可拓展性等优势。
IV.工程化细胞的制备
可以使用病毒载体将目的TCR导入细胞。但是，基于病毒载体将外源性TCRα/β基因导入细胞的方法没有敲除细胞内源性的TCR，可能造成外源性TCRα链和β链的错配，即使通过修饰二硫键或换用鼠源恒定区可以减少外源性TCRα链和β链的错配问题，但病毒载体随机插入到细胞基因组中，这仍会带来破坏其他基因的潜在风险。
也可以使用非病毒载体将目的TCR导入细胞，将外源性TCRα/β基因精确整合到细胞的特定基因组位点。在一些实施方案中，非基于病毒载体的基因编辑方法可以通过CRISPR/Cas9技术和同源重组技术敲除人源T细胞的内源性T细胞受体α链和β链，并在TRAC基因外显子处敲入外源性目的T细胞受体α和β链编码核苷酸。由此，既破坏了内源性的TCR表达，又采用内源性TCR启动子来表达外源性目的TCRα和β。
在一个实施方案中，在内源性TRAC基因外显子1处敲入外源性目的T细胞受体α和β链编码核苷酸，且该外源性敲入片段不用添加TRAC基因，由此减少了基因敲入的片段长度，降低了基因敲入的难度。相比于采用病毒载体表达TCR的技术，可以将采用非病毒载体方式表达TCR的技术作为一种快速、简便、低成本的外源性TCRα/β基因导入细胞方式。
IV.1敲除位点的选择
TCR是一个二聚体，由TCRα链和TCRβ链组合而成。TCRα链基因是由TRAV、TRAJ和TRAC基因重排而成，其中TRAV和TRAJ基因分别含有多个序列，且该多个序列之间有差异，重排时只能分别随机选择其中一个序列表达。如果选择TRAV和TRAJ基因作为敲除位点，则很难避免任何随机TCRα链基因的产生，而TRAC基因只有一个，通过敲除该TRAC基因可以敲除任何随机TCRα链基因，因此TRAC适合作为敲除位点。TCRβ链基因是由TRBV、TRBJ、TRBD和TRBC基因重排而成，其中TRBV和TRBJ基因分别含有多个序列，且该多个序列之间有差异，不适合作为敲除位点。TRBC基因包含TRBC1和TRBC2，两者含有部分相同序列，可以选择该共同序列作为敲除位点，通过敲除该共同序列而敲除任何随机TCRβ基因。
在一些实施方案中，敲除了内源性TRAC基因、内源性TRBC1基因和/或TRBC2基因中的一者或多者。在一些实施方案中，同时敲除了内源性TRAC基因和内源性TRBC1和TRBC2基因，由此可以获得更高的内源性TCR敲除效率，降低了内源性TCR表达可能导致的外源性TCR和内源性TCR的链之间的错配风险。
可以使用基于核酸酶的基因组编辑工具，通过非同源端连接(NHEJ)诱导双链断裂和DNA修复来靶向破坏内源性TRAC基因和TRBC基因。这些工具包括大范围的核酸酶(meganucleases)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)、megaTAL核酸酶，以及CRISPR/CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)。
IV.2敲入位点的选择
由于内源性TRAC基因唯一且所有的TCRα表达均需要TRAC基因，将外源性TCRα/β基因敲入位点选择为内源性TRAC位点，由此，在消除内源性TCR的同时，可以采用人源T细胞的内源性TCR启动子来表达本发明的外源性TCRα/β基因(也称为“nwTCR基因)且不用额外添加TRAC基因，从而减少敲入片段的大小，有利于提高基因编辑的效率。
在一些实施方案中，将nwTCR的表达构建体克隆于打靶载体(例如pUC57-HA载体)，通过设计同源臂使nwTCR定点敲入到TCRα链恒定区，并受该基因座的转录调控序列调控表达。由于该敲入位点处其内源启动子的调控水平优于其他位点，确保了nwTCR基因的持续稳定表达。
IV.3工程化细胞
本发明提供了表达外源性TCR的工程化细胞。
在一些实施方案中，自来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官的细胞，例如，淋巴细胞或干细胞制备表达TCR的工程化细胞，所述淋巴细胞包括但不限于T细胞、NK细胞，所述干细胞例如多能干细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)。
细胞通常是原代细胞，例如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的细胞。细胞可以是同种异体细胞和/或自体细胞。
在一些实施方案中，通过CRISPR/Cas9和同源重组技术，采用RNP和质粒的方式来电穿孔转染CD3/CD28激活后的原代细胞(例如，分选的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞)，由此制备工程化的TCR细胞。
在一些实施方案中，设计了针对内源性TRAC基因的sgRNA，并设计了针对内源性TRBC1基因和TRBC2基因的sgRNA。
通过sgRNA引导Cas9蛋白结合于目标基因组的特异性位点，Cas9蛋白切割该特异性位点。对于使用RNP所致内源性TRAC基因形成的双链断裂，在具有同源臂的供体DNA存在的条件下可以发生同源重组，由此实现目的nwTCR基因的定点插入。
在一个具体实施方案中，sgRNA引导Cas9蛋白结合的目标基因组的特异性位点位于TRAC基因的外显子1，Cas9蛋白切割该特异性位点，所设计并经验证的高效靶向其的sgRNA识别序列和PAM序列包含TCAGGGTTCTGGATATCTGT-GGG所示的核苷酸序列(为SEQ IDNO：542所示的sgRNA识别序列-SEQ ID NO：544所示的PAM序列，“-”用来区分隔开CRISPR/Cas9识别位点和PAM序列)。
在一个具体实施方案中，sgRNA引导Cas9蛋白结合的目标基因组的特异性位点位于TRBC1和TRBC2基因的外显子1，Cas9蛋白切割所述特异性位点，所设计并经验证的高效靶向其的sgRNA识别序列和PAM序列包含CTGCCTGAGCAGCCGCCTGA-GGG所示的核苷酸序列(为SEQ ID NO：543所示的sgRNA识别序列-SEQ ID NO：544所示的PAM序列，“-”用来区分隔开CRISPR/Cas9识别位点和PAM序列)。
CRISPR/Cas系统中可包含蛋白质形式或编码Cas蛋白质的核酸形式的Cas成分。
在本发明中，Cas蛋白质可以是任何Cas蛋白质，只要当其与引导RNA复合时具有核酸内切酶或切口酶活性即可。
优选地，Cas蛋白质是Cas9蛋白质或其变体或其功能片段。
Cas蛋白质可以是从生物体如链球菌属物种(Streptococcus sp.)，优选化脓性链球菌(Streptococcus pyogens)中分离的蛋白质、或重组蛋白质，但并不限于此。
在一个实施方案中，Cas蛋白质包含源自化脓性链球菌的Cas9，例如具有SEQ IDNO：550所示氨基酸序列的Cas9。
在另一个实施方案中，Cas蛋白质包含与SEQ ID NO：550所示的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO：550所示的氨基酸序列具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％的同源性，但不限于此。
就本发明而言，Cas蛋白质编码核酸可以是载体形式，如包含在启动子如CMV或CAG下的Cas编码序列的质粒。当Cas蛋白质是Cas9时，Cas9编码序列可源自链球菌属，优选源自化脓性链球菌。例如，Cas9编码核酸可以包含编码SEQ ID NO：550的核苷酸序列。此外，Cas9编码核酸可包含与编码SEQ ID NO：550的核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列，优选地与编码SEQ ID NO：550的核苷酸序列具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％同源性的核苷酸序列，但不限于此。
在一个实施方案中，供体DNA中依次包含编码可裂解接头多肽的序列和外源性TCRα/β基因或其功能片段。所述编码可裂解接头多肽的序列在表达后，可裂解接头多肽被裂解。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含2A核糖体跳跃元件例如T2A、E2A、P2A和F2A。
在一个实施方案中，供体DNA位于打靶载体中。不特别地限制作为骨架的基础打靶载体，只需具备用于细菌中的载体增殖的原核复制起点和选择标记即可。
在一个优选的实施方案中，为了增加外源性TCRα/β基因或其片段的表达，在打靶载体中分别在外源性TCRα链基因和外源性TCRβ链基因的N端连接编码可裂解接头多肽的序列和信号肽序列。
在一个具体实施方案中，用于敲入nwTCR基因序列的打靶载体包含有效连接的以下结构：2A核糖体跳跃元件-SP-TCRβ-2A核糖体跳跃元件-SP-TRAV-TRAJ
其中：
SP为信号肽编码序列。
将用于敲入nwTCR基因序列的打靶载体、RNP复合体和细胞混合并实施nwTCR基因序列向细胞的递送步骤。在一些实施方案中，递送步骤选自：电穿孔、转染、通过物理手段使细胞膜变形、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒样颗粒(VLP)和声处理。在一些实施方案中，递送步骤包括电穿孔。
在一些实施方案中，工程化的细胞是原代细胞。
在一些实施方案中，工程化的细胞是分离的细胞，其中分离的细胞是从受试者分离的。
在一些实施方案中，工程化的细胞是离体培养的细胞。在一些实施方案中，离体培养的细胞包括经刺激的细胞。在一些实施方案中，经刺激的细胞包括细胞因子刺激的T细胞，任选地，其中细胞因子刺激的T细胞包括CD3刺激的T细胞、CD28刺激的T细胞或CD3和CD28刺激的T细胞。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞是在IL7、IL15或其组合的存在下培养的。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞是在IL2的存在下培养的。
在一些实施方案中，工程化的细胞是干细胞，例如，造血干细胞(HSC)。将nwTCR基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR，因为干细胞不表达CD3分子。然而，当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体细胞(lymphoid precursor)时，CD3表达的启动将导致在胸腺细胞的表面表达该引入的nwTCR。这一方法的优点是成熟T细胞一旦产生，其仅表达引入的nwTCR，而表达很少的或不表达内源TCR链，因为引入的nwTCR链的表达抑制了内源TCR基因片段重排形成功能性TCRα和β基因。这一方法的其他益处是，TCR基因修饰的干细胞是具有期望的抗原特异性的成熟T细胞的持续来源。因此，nwTCR基因修饰的干细胞在分化后产生表达本发明TCR的T细胞。
V.检测、预防或治疗PRAME相关的疾病(例如，PRAME相关的癌症)的方法
本发明提供了一种预防或治疗PRAME相关的疾病(例如，PRAME相关的癌症)的方法，其包括对有需要的受试者施用本发明的工程化细胞、本发明的TCR核酸、载体或药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括给予编码TCR的多核苷酸。在一些实施方案中，该方法包括施用包含编码TCR的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，该方法包括施用有效量的本发明的工程化细胞。
在一些实施方案中，使用本发明的工程化细胞、本发明的TCR核酸、载体或药物组合物预防或治疗PRAME相关的疾病(例如，PRAME相关的癌症)。不受任何理论的束缚，认为本发明的TCR能够特异性结合PRAME抗原短肽，由此，介导针对表达PRAME抗原短肽的靶细胞的免疫应答。
所述治疗或预防可以包括对被治疗或预防的癌症的一种或多种症状的治疗或预防，包括促进肿瘤消退、延迟癌症或其症状的发作、预防或延迟癌症或其症状的复发。
本发明还提供了检测哺乳动物中癌症存在的方法。该方法包括：(i)使包含来自哺乳动物的一个或多个细胞的样品与本文所述的本发明TCR、表达本发明TCR的细胞群体、或包含表达本发明TCR的细胞群体的药物组合物中的任一种接触，从而形成复合物；以及(ii)检测复合物，其中检测到复合物指示哺乳动物存在癌症。所述接触可以于哺乳动物的体外或体内实施。在一个实施方案中，所述接触是在体外实施的。可以通过本领域已知的多种方式来检测所述复合物。在一些实施方案中，将本发明的TCR或者表达本发明TCR的细胞群体用可检测的标记物进行标记，所述可检测标记物是例如放射性同位素、荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红素(PE))、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如金颗粒)。
本发明还提供了诱导抗肿瘤免疫的方法，其中所述肿瘤是PRAME抗原短肽相关的肿瘤，所述方法包括给予受试者有效量的本发明的工程化细胞。
本发明提供了在受试者中诱导免疫应答的方法，包括给予有效量的本发明的工程化细胞。在一些实施方案中，免疫应答是T细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，T细胞介导的免疫应答针对一种或多种靶细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞包含本发明的TCR。在一些实施方案中，靶细胞是PRAME抗原短肽相关的癌细胞。
在一些实施方案中，用于T细胞治疗的供体T细胞从患者获得(例如，用于自体T细胞治疗)。在其它实施方案中，待分化为T细胞用于T细胞治疗的供体干细胞是从非患者的受试者获得的。
T细胞可以治疗有效量施用。例如，治疗有效量的T细胞可为至少约104个细胞、至少约105个细胞、至少约106个细胞、至少约107个细胞、至少约108个细胞、至少约109个细胞或至少约1010个细胞/kg体重。
对于本发明的各种方法中提及的癌症可以是任何癌症，包括但不限于：卵巢癌、胰腺癌、肝癌、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病、成神经细胞瘤、黑素瘤、转移性黑素瘤、骨髓瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结肠直肠癌、胃肿瘤、胃癌、横纹肌肉瘤、子宫内膜癌、子宫癌、葡萄膜黑素瘤、肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌、胸腺瘤、结肠腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈肿瘤、肝细胞癌和间皮瘤。
VI.改善细胞疗法的方法和工程化细胞
本发明还提供了改善细胞疗法的方法和工程化细胞。
天然的CD8+细胞表达CD8分子。CD8分子是以两条CD8a链组成的同二聚体形式(本文中也简称为“CD8aa”)和/或以一条CD8a链和一条CD8b链组成的异二聚体形式(本文中也简称为“CD8ab”)表达于细胞表面的I型跨膜醣蛋白。
在一些实施方案中，本发明涉及在T细胞中共表达外源性TCR和CD8aa分子。基于CRISPR/Cas9技术的非病毒基因编辑方法，采用编码本发明nwTCR的核酸和编码CD8a链的核酸对CD8+ T细胞/CD4+ T细胞进行基因编辑，表明外源性nwTCR和CD8aa分子在CD8+ T细胞/CD4+ T细胞中共表达，能够增强TCR-T细胞与pMHC分子的结合。当外源性nwTCR和CD8aa分子在CD8+ T细胞中共表达时，由于CD8+ T细胞中能够被外源性nwTCR使用的CD8aa分子增加，预期会改善CD8+ T细胞的TCR特异性细胞毒性(包括其连续杀伤能力)和体内抗肿瘤功能。当外源性nwTCR和CD8aa分子在CD4+ T细胞中共表达时，伴随着内源性CD4分子的表达，CD4+T细胞表现出杂化表型，预期其以与天然CD8+ T细胞相似的亲和力识别抗原，并杀死靶细胞，表现出细胞毒性效应功能；同时保留CD4+ T细胞的天然辅助功能。
又在一些实施方案中，本发明将外源性TCR和CD8ab分子在T细胞中进行了共表达。基于CRISPR/Cas9技术的非病毒基因编辑方法，采用编码本发明nwTCR的核酸、编码CD8a链的核酸和编码CD8b链的核酸对CD8+ T细胞/CD4+ T细胞进行基因编辑，表明外源性nwTCR和CD8ab分子在CD8+ T细胞/CD4+ T细胞中共表达，能够增强TCR-T细胞与pMHC分子的结合。当外源性nwTCR和CD8ab分子在CD8+ T细胞中共表达时，由于CD8+T细胞中能够被外源性nwTCR使用的CD8ab分子增加，预期会改善CD8+ T细胞的TCR特异性细胞毒性(包括其连续杀伤能力)和体内抗肿瘤功能。当外源性nwTCR和CD8ab分子在CD4+ T细胞中共表达时，伴随着内源性CD4分子的表达，CD4+ T细胞表现出杂化表型，预期其以与天然CD8+ T细胞相似的亲和力识别抗原，并杀死靶细胞，表现出细胞毒性效应功能；同时保留CD4+ T细胞的天然辅助功能。
因此，将CD8aa分子和/或CD8ab分子与TCR基因共表达于CD8+和CD4+ T细胞时，对CD8+和CD4+ T细胞的功能具有有益的作用。可以通过MHC I类TCR和CD8分子将CD4+ T细胞重编程为多功能杂化T细胞，其同时具有细胞毒性效应功能和天然的辅助功能。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。
实施例
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明的范围。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部进行了的实验或仅进行了的实验。
实施例1.识别PRAME抗原短肽的T细胞和TCR的生成和克隆
化学合成PRAME第425到第433位氨基酸序列的短肽SLLQHLIGL(SEQ ID NO：541)(文中也简称为“PRAME_425-433肽”)。
使用重悬于DMSO中的PRAME_425-433肽体外脉冲刺激来源于HLA-A*02：01基因型且表达PRAME的肺癌患者的树突状细胞(DC细胞)，并与该患者外周血中分选出的CD8+ T细胞共培养10天。阴性对照为使用DMSO体外脉冲刺激该患者DC细胞并与该患者外周血中分选出的CD8+ T细胞共培养10天。
然后，检测培养上清中细胞因子IFN-γ的释放量和CD8+ T细胞上CD137的表达，分选出释放IFN-γ且CD137表达的反应性T细胞。使用基于流式细胞术的染色来评估分选出的释放IFN-γ且CD137表达的反应性T细胞与肽-MHC(HLA-A*02：01)四聚体(SLLQHLIGL-HLA-A*02：01)的结合；含有无关肽的四聚体用作阴性对照。
筛选到38个具有所需的高亲和力的特异性T细胞克隆。将这38个T细胞克隆上的与PRAME_425-433表位肽特异性结合的抗原特异性T细胞受体(TCR)分别命名为nwTCR-1829、nwTCR-1906、nwTCR-1953、nwTCR-1954、nwTCR-2006、nwTCR-2081、nwTCR-2157、nwTCR-2159、nwTCR-2169、nwTCR-2170、nwTCR-2228、nwTCR-2285、nwTCR-2286、nwTCR-2316、nwTCR-2382、nwTCR-2383、nwTCR-2418、nwTCR-2522、nwTCR-2523、nwTCR-2555、nwTCR-2583、nwTCR-2614、nwTCR-2718、nwTCR-2719、nwTCR-2720、nwTCR-2793、nwTCR-2845、nwTCR-2915、nwTCR-2916、nwTCR-2970、nwTCR-3028、nwTCR-3095、nwTCR-3125、nwTCR-3173、nwTCR-3271、nwTCR-3272、nwTCR-3273和nwTCR-3274，使用高通量配对TCR测序，在单细胞基础上确定了这38个T细胞克隆上配对的TCRα链和β链的氨基酸序列。
由于多个核苷酸可以翻译成同一个氨基酸，在不同生物体中使用密码子频率是不同的，因此，对TCRα链和β链氨基酸序列的编码核苷酸进行了密码子序列优化，旨在于真核细胞中表达时增加TCR的表达量。获得了通过密码子优化后的特异性识别PRAME_425-433表位肽的38个TCR的核苷酸序列。
表1A和表1B分别列出了测序生成的克隆T细胞系所表达的38个TCR的α链和β链的氨基酸序列信息以及核苷酸序列信息。
表1A.PRAME抗原短肽特异性TCRα链的氨基酸和核苷酸序列
/>
表1B.PRAME抗原短肽特异性TCRβ链的氨基酸和核苷酸序列
/>
实施例2.自T细胞制备PRAME抗原短肽特异性TCR-T细胞
本实施例描述了通过CRISPR/Cas9技术敲除原代T细胞中的TCR基因并通过同源重组技术敲入PRAME抗原短肽特异性TCR基因，由此制备并表征PRAME抗原短肽特异性TCR-T细胞。
2.1 T细胞的分选和激活
商业获得T细胞(例如，冷冻人外周血CD4+CD45RA+ T细胞，Stem CellTechnology，目录号70029)或者自白细胞单采样本制备T细胞(Day 0)。
对于自白细胞单采样本制备T细胞，从白细胞单采样本中富集和分选CD4 T细胞和CD8 T细胞的混合物(文中也称为“CD4+/CD8+ T细胞”)。将富集和分选的CD4+/CD8+T细胞等分并冷冻(5x106个细胞/冻存管)以便将来使用。
根据需要解冻冻存管，并且通过在T细胞培养基(例如，RPMI 1640、FBS、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、HEPES缓冲液、2-巯基乙醇和任选的IL2)中加入1∶100倍稀释的T细胞激活剂Miltenyi T cell TransACT(Miltenyi目录号：130-111-160)对分选得到的T细胞进行激活，培养细胞约48小时(2天)后用于电穿孔转染。
2.2打靶策略和打靶载体的制备
采用CRISPR/Cas9和同源重组技术，将外源TCR表达于原代T细胞的细胞膜表面。gRNA采用gRNA002和gRNA004(见表2)，gRNA002的打靶位点位于内源性TRAC基因的外显子1(图1A)；gRNA004的打靶位点位于内源性TRBCl和TRBC2基因的外显子1(图1B)。Cas9酶购自金斯瑞生物科技有限公司，目录号：Z03469。
表2.TRAC和TRBC基因对应的sgRNA
打靶载体(也称为HDR载体)采用的骨架为pUC57-HA载体，是在pUC57-Simple载体基础上优化后的载体。其仅保留了pUC57-Simple载体的Ori和Amp序列，然后将Amp序列替换为Kana序列，并添加TRAC位点的左右同源臂(HA)序列(800bp左右)。可以将待基因敲入(KI)的序列构建到左右HA之间。nwTCR的KI序列构建体从N端到C端包含：2A或其变体-SP-TCRβ-2A或其变体-SP-TRAV-TRAJ，其中2A为核糖体跳跃元件；SP为信号肽；对打靶载体的TRBC基因中引入了4个同义突变碱基，分别为将TRBCS77的编码核苷酸由AGC突变为TCC和将TRBCS78的编码核苷酸由AGC突变为TCC。
对于nwTCR-2081，其KI序列构建体核苷酸序列和编码的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：545和SEQ ID NO：546所示，其中：2A或其变体分别如SEQ ID NO：547和SEQ ID NO：549所示；SP为SEQ ID NO：548所示信号肽序列；TCRβ为nwTCR-2081完整TRB(TCRβ链)的核苷酸序列(SEQ ID NO：502)，其中将TRBC S77的编码核苷酸由AGC突变为TCC和将S78的编码核苷酸由AGC突变为TCC，由此在TRBC基因上引入了4个同义突变碱基；TRAV为nwTCR-2081 TRAV基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：158)；TRAJ为nwTCR-2081 TRAJ基因的核苷酸序列(SEQ IDNO：458)。
2.3.电穿孔转染(Day 2)
将实施例2.2的sgRNA与Cas9酶充分混合，室温孵育10min，制备RNP。
将实施例2.2制备的含有KI TCR序列的打靶载体与孵育好的RNP、实施例2.1制备的指定浓度的T细胞(约1.25E6个T细胞/电击管)进行充分混合，以用于敲除(KO)内源性TCR和敲入(KI)外源性TCR。
将上述混合液装载到电穿孔转染仪(Celetrix；目录号：CTX-1500A LE)中进行细胞电穿孔转染，电穿孔转染的条件为480-560V，20ms。
电穿孔转染结束后，静置细胞15min后再取出经电穿孔转染的T细胞，转移至预温的培养基中(ImmunoCultTM-XF T Cell Expansion Medium，Stemcell公司目录号：10981)。培养细胞5天后，于Day 7或Day 8进行流式细胞术表征。
2.4.nwTCR表达的流式细胞术分析(Day 7或Day 8)
充分混匀自实施例2.3获得的细胞悬液，进行细胞计数，收集适量细胞进行标记的肽-MHC(HLA-A*02：01)四聚体(SLLQHLIGL-HLA-A*02：01四聚体，为pMHC)染色。
提前配制好含有所述标记的肽-MHC(HLA-A*02：01)四聚体染液以及LIVE/DEADTMFixable Near-IR，购自Invitrogen，目录号：L10119；CD4-FITC购自BioLegend，目录号：357406；CD8-PerCP-cy5.5购自BioLegend，目录号：344710；抗人TCRα/β-BV510抗体购自BioLegend，目录号：306734。
对收集的细胞进行所述标记的肽-MHC(HLA-A*02：01)四聚体染液染色，洗涤后，用流式细胞术进行表征。
图3A-图3LL例示了用不同nwTCR电穿孔转染CD4+和CD8+ T细胞后，CD4+和CD8+T细胞上表达的各不同nwTCR结合标记的pMHC四聚体的染色结果。可以看出，Day7的细胞分为三群：
1)未进行基因编辑的野生型T细胞(Q3)；
2)完成了内源性TCR敲除的KO细胞(Q4)；
3)完成了KO和KI，表达了nwTCR的细胞群(Q2)。
流式细胞术检测TCR基因编辑效率的结果示意图如图2所示。
由图3A-图3LL可见，分别敲入各nwTCR的CD8+T细胞均能够与肽-MHC复合物(pMHC)四聚体结合；分别敲入各TCR的CD4+T细胞与肽-MHC复合物(pMHC)四聚体的结合存在显著性差异。这是因为如实施例1所示，本发明中的各nwTCR均是利用CD8+T细胞进行筛选得到的nwTCR，因此，当分别敲入各nwTCR至CD8+T细胞后，表达各nwTCR的CD8+T细胞均能够与肽-MHC复合物(pMHC)四聚体特异性结合；而当分别敲入各nwTCR至CD4+T细胞后，表达各nwTCR的CD4+T细胞存在如下情形：一般地，当nwTCR与MHC的亲和力足够强的时候，TCR可以在不借助CD8分子协助的情况下结合MHC分子，例如，认为nwTCR-2970与MHC分子的结合能力较nwTCR-2555更强，因而它们在CD4+ T细胞的pMHC四聚体染色上会有差异。因此，将各nwTCR分别编辑到CD4+ T细胞中并表达后，亲和力强的nwTCR仍然可以结合MHC I类抗原，而亲和力弱的nwTCR结合MHC I类抗原的能力也弱。
实施例3.PRAME抗原短肽特异性TCR-T细胞的体外功能性研究
在Day7或Day8对实施例2的PRAME抗原短肽特异性TCR-T细胞使用TransACT激活剂(Miltenyi目录号：130-111-160)进行选择性激活。继续培养TCR-T细胞至Day14。在Day14对各TCR-T细胞进行了体外功能性研究。
3.1各TCR-T细胞与肽结合的亲和力检测
如下实施TCR-T细胞亲和力检测方法。收集抗原呈递细胞(T2细胞或HLA-A*02：01过表达的K562细胞)，进行细胞计数，加适量培养基(如RPMI-1640培养基，购自Gibco，目录号：22400089；FBS，购自Gibco，目录号：10099141C)重悬细胞至细胞密度为1E6个/mL，分别加1mL细胞悬液到24孔板的每孔中。将待检测多肽溶液(所述多肽是SEQ ID NO：541所示的PRAME_425-433肽)进行梯度稀释到10-10-10-3M，并分别加10ul稀释后的多肽溶液到24孔板对应孔中，在培养箱(37℃，5％CO2)中孵育2h后，将孵育好的抗原呈递细胞收集洗涤，取100ul 1E6/mL的抗原呈递细胞至96孔板对应孔中。
收集待检测的nwTCR-T细胞，加适量T细胞培养基(购自STEMCELL，目录号：10981)至细胞密度为1E6/mL，加100ul细胞悬液至中96孔板对应孔中。将各nwTCR-T细胞分别与抗原呈递细胞共培养(37℃，5％CO2)16h后，收集细胞上清用ELISA试剂盒(购自Biolegend，目录号：430104)检测IFN-γ浓度。通过检测IFN-γ的释放水平来检测表达各nwTCR的T细胞对HLA-A*02：01呈递的SEQ ID NO：541所示短肽的结合亲和力。
图4A-图4D显示了分别表达各nwTCR的T细胞对HLA-A*02：01呈递的SEQ ID NO：541所示短肽的结合亲和力检测实验结果和EC50值。
图4A-图4D的结果表明，呈递肽-MHC复合物的T2细胞与表达各nwTCR的T细胞共孵育后，检测到表达各nwTCR的T细胞与肽-MHC复合物特异性结合，导致了IFN-γ释放。
3.2各TCR-T细胞对靶细胞的杀伤
如下实施各TCR-T细胞对靶细胞的杀伤检测方法。
收集靶细胞(NCI-H1703细胞系、NIH-OVCAR-3细胞系和PANC-1细胞系(购自：南京斑马生物科技有限公司和宁波明舟生物科技有限公司))，细胞计数后用靶细胞培养基(RPMI-1640培养基，购自Gibco，目录号：22400089，FBS，购自Gibco，目录号：10099141C)重悬靶细胞至细胞密度为1E6个细胞/mL。准备E-plate(获自Agilent，目录号：300600890)，在对应孔中加入100μL混合均匀的靶细胞悬液。
收集待检测的各TCR-T细胞，细胞计数后加适量T细胞培养基(购自STEMCELL，目录号：10981)重悬细胞至细胞密度为1E6/mL，加100μL待检测的nwTCR-T细胞悬液至96孔板的孔中，与上述96孔板孔中的靶细胞混合。向该细胞混合液中添加1μL溴化乙锭(1mg/mL)溶液，混合均匀后，将细胞培养板置于实时荧光成像系统(BioTek Lionheart)中进行细胞杀伤表征实验。被T细胞特异性杀伤的靶细胞在进入凋亡状态后，会被溴化乙锭染色，呈现出红色的荧光信号。
图5A-图5B显示了表达各nwTCR的T细胞与呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的PANC-1细胞系开始共孵育时(0h)和共孵育16小时时(16h)的荧光成像结果，共孵育16小时时(16h)红色的荧光信号表明了nwTCR-T细胞对于PANC-1细胞系的特异性杀伤。图5C-图5D显示了表达各nwTCR的T细胞与呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的NCI-H1703细胞系开始共孵育时(0h)和共孵育16小时时(16h)的荧光成像结果，共孵育16小时时(16h)红色的荧光信号表明了nwTCR-T细胞对于NCI-H1703细胞系的特异性杀伤。
另外，收集待检测的各TCR-T细胞，细胞计数后加适量T细胞培养基(购自STEMCELL，目录号：10981)重悬细胞。将该T细胞悬液与上述96孔板孔中的靶细胞混合。混合均匀后，将细胞培养板放回到RTCA实时细胞分析仪(real-time cell analyzer)(购自Agilent，型号：xCELLigence RTCA DP)中检测，得到48小时的细胞指数。每一个独立的实验分三次进行。利用RTCA软件自动计算区间斜率，评价细胞指数的变化率。为了证明处理的效果，在标准化时间点将细胞指数标准化为相等的值。
各TCR-T细胞对靶细胞体外杀伤的实时分析结果如图6A-图6D所示。图6A显示了表达各nwTCR的T细胞特异性杀伤呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的PANC-1细胞；图6B-图6C显示了表达各nwTCR的T细胞特异性杀伤呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的NIH-OVCAR-3细胞；图6D显示了表达各nwTCR的T细胞特异性杀伤呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的NCI-H1703细胞。
实施例4.外源性TCR与CD8分子的共表达
本实施例描述了通过采用CRISPR/Cas9和同源重组技术将外源性TCR和CD8分子共表达于CD4+ T细胞膜表面，从而将CD4+ T细胞重定向。并且，这种基因编辑方法可以增强TCR-T细胞与pMHC分子的结合。
4.1T细胞的分选和激活
可以商业获得T细胞(例如，冷冻人外周血CD4+CD45RA+ T细胞，Stem CellTechnology，目录号70029)或者自白细胞单采样本制备T细胞(Day 0)。
对于自白细胞单采样本制备T细胞，从白细胞单采样本中富集和分选CD4/CD8 T细胞。将富集和分选的CD4/CD8 T细胞等分并冷冻(5x106个细胞/冻存管)以便将来使用。
4.2打靶策略和打靶载体制备
TCR的打靶策略和打靶载体同上述实施例2.2。当TCR序列采用nwTCR-2081时，由图3F可见，表达nwTCR-2081的CD8+ T细胞能与标记的肽-MHC(HLA-A*02：01)四聚体结合，但表达nwTCR-2081的CD4+ T细胞几乎不能与标记的肽-MHC(HLA-A*02：01)四聚体结合。本实施例选择pMHC四聚体几乎不与基因编辑后表达TCR的CD4+ T细胞结合旨在表明，即使对于这样的nwTCR，通过在CD4 T细胞中引入CD8分子，可以增强基因编辑nwTCR后的CD4 T细胞与pMHC分子的结合，因此，本实施例中使用的特定nwTCR可以用任何本发明的其他nwTCR替换且能够实现增强基因编辑nwTCR后的CD4 T细胞与pMHC分子的结合的作用。
为了使CD4+ T细胞能与呈递SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的pMHC分子结合，进一步构建了如下构建体，并插入pUC57-HA打靶载体(也称为HDR载体)：
nwTCR-2081-CD8ab的KI核苷酸序列为：2A或其变体-CD8a-2A或其变体-CD8b-2A或其变体-SP-TCRβ-2A或其变体-SP-TRAV-TRAJ(SEQ ID NO：540)，其氨基酸序列如SEQ IDNO：539所示。
nwTCR-CD8ab的打靶策略图如图7所示。
4.3.电穿孔转染(Day 2)
将实施例2.2设计并合成的sgRNA与Cas9酶充分混合，室温孵育10min，制备RNP。
将实施例4.2制备的用于敲入nwTCR-2081-CD8ab的打靶载体与孵育好的RNP、实施例4.1制备的指定浓度的T细胞(1.25E6/电击管)进行充分混合，以用于敲除(KO)内源性TCR和敲入(KI)外源性TCR和CD8ab。
将上述混合液装载到电穿孔转染仪(Celetrix；目录号：CTX-1500A LE)中进行细胞电穿孔转染，电穿孔转染的条件为480-560V，20ms。
电穿孔转染结束后，静置细胞15min后再取出经电穿孔转染的细胞，转移至预温的培养基中(ImmunoCultTM-XF T Cell Expansion Medium，Stemcell公司目录号：10981)。培养细胞5天后，于Day 7进行流式细胞术表征。
4.4.nwTCR表达的流式细胞术分析(Day 7)
充分混匀自实施例4.3获得的细胞悬液，细胞计数后收集适量细胞，进行标记的肽-MHC(HLA-A*02∶01)四聚体染色。
提前配制好含有特异性抗原的标记的肽-MHC四聚体染液以及LIVE/DEADTMFixable Near-IR，购自Invitrogen，目录号：L10119；CD4-FITC购自BioLegend，目录号：357406；CD8-PerCP-cy5.5购自BioLegend，目录号：344710；抗人TCRα/β-BV510抗体购自BioLegend，目录号：306734。
对收集的细胞进行标记的肽-MHC四聚体染液染色，洗涤后，用流式细胞术进行表征。结果如下所示。在流式细胞图中，Day7的细胞分为三群：
1)未进行基因编辑的野生型T细胞(Q3)；
2)完成了内源性TCR敲除的KO细胞(Q4)；
3)完成了KO和KI，表达了nwTCR的细胞群(Q2)。
当将CD8ab分子与nwTCR-2081共同编辑入原代T细胞后(所述原代T细胞包含CD4+T细胞和CD8+ T细胞)，通过流式细胞术表征，可以看出，nwTCR-2081细胞中的CD4+细胞不与特异性标记的肽-MHC(HLA-A*02：01)四聚体结合(图8A)，而nwTCR-2081-CD8ab细胞中的部分CD4+表达了外源CD8分子，重定向的CD4+ T细胞在外源CD8分子的辅助作用下，可以特异性结合标记的肽-MHC(HLA-A*02：01)四聚体(图8B)。
同时，得益于本方法可以重定向CD4+ T细胞，使得对于T细胞整体的基因编辑效率提高(表3)。
表3.nwTCR-2081和nwTCR-2081-CD8细胞中各群细胞的基因编辑效率。
4.5.nwTCR-T细胞对靶细胞的杀伤
如实施例3.2类似地，进行了将CD8ab分子与nwTCR-2081共同编辑入原代T细胞后，该T细胞对靶细胞体外杀伤的实时分析。结果如图9所示。
图9显示了表达nwTCR-2081和CD8分子的T细胞特异性杀伤呈递了SLLQHLIGL抗原短肽(SEQ ID NO：541)的NIH-OVCAR-3细胞。
以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。
示例性序列
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Claims (13)
1.分离的或纯化的T细胞受体，所述T细胞受体也简称为TCR，其特征在于，与PRAME抗原短肽特异性结合，所述TCR包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区，所述互补决定区也简称为CDR，并且α链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：269、272、275、278、281、284、287、290、293、296、299、302、305、308、311、314、317、320、323、326、329、332、335、338、341、344、347、350、353、356、359、362、365、368、371、374、377、380和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
2.根据权利要求1所述的TCR，其中，所述α链的CDR3的氨基酸序列和β链的CDR3的氨基酸序列是：
(a)SEQ ID NO：3所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：269所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(b)SEQ ID NO：6所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：272所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(c)SEQ ID NO：9所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：275所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(d)SEQ ID NO：12所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：278所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(e)SEQ ID NO：15所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：281所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(f)SEQ ID NO：18所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：284所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(g)SEQ ID NO：21所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：287所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(h)SEQ ID NO：24所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：290所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(i)SEQ ID NO：27所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：293所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(j)SEQ ID NO：30所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：296所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(k)SEQ ID NO：33所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：299所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(l)SEQ ID NO：36所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：302所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(m)SEQ ID NO：39所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：305所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(n)SEQ ID NO：42所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：308所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(o)SEQ ID NO：45所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：311所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(p)SEQ ID NO：48所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：314所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(q)SEQ ID NO：51所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：317所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(r)SEQ ID NO：54所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：320所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(s)SEQ ID NO：57所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：323所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(t)SEQ ID NO：60所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：326所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(u)SEQ ID NO：63所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：329所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(v)SEQ ID NO：66所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：332所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(w)SEQ ID NO：69所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：335所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(x)SEQ ID NO：72所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：338所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(y)SEQ ID NO：75所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：341所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(z)SEQ ID NO：78所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：344所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(aa)SEQ ID NO：81所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：347所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(bb)SEQ ID NO：84所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：350所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(cc)SEQ ID NO：87所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：353所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(dd)SEQ ID NO：90所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：356所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ee)SEQ ID NO：93所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：359所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ff)SEQ ID NO：96所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：362所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(gg)SEQ ID NO：99所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：365所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(hh)SEQ ID NO：102所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：368所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ii)SEQ ID NO：105所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：371所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(jj)SEQ ID NO：108所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：374所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(kk)SEQ ID NO：111所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：377所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或
(ll)SEQ ID NO：114所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：380所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
优选地，所述α链的CDR3的氨基酸序列和β链的CDR3的氨基酸序列是：
(a)SEQ ID NO：3所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：269所示的β链CDR3氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：6所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：272所示的β链CDR3氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：9所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：275所示的β链CDR3氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：12所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：278所示的β链CDR3氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：1 5所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：281所示的β链CDR3氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO：1 8所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：284所示的β链CDR3氨基酸序列；
(g)SEQ ID NO：21所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：287所示的β链CDR3氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：24所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：290所示的β链CDR3氨基酸序列；
(i)SEQ ID NO：27所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：293所示的β链CDR3氨基酸序列；
(j)SEQ ID NO：30所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：296所示的β链CDR3氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：33所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：299所示的β链CDR3氨基酸序列；
(l)SEQ ID NO：36所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：302所示的β链CDR3氨基酸序列；
(m)SEQ ID NO：39所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：305所示的β链CDR3氨基酸序列；
(n)SEQ ID NO：42所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：308所示的β链CDR3氨基酸序列；
(o)SEQ ID NO：45所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：311所示的β链CDR3氨基酸序列；
(p)SEQ ID NO：48所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：314所示的β链CDR3氨基酸序列；
(q)SEQ ID NO：51所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：317所示的β链CDR3氨基酸序列；
(r)SEQ ID NO：54所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：320所示的β链CDR3氨基酸序列；
(s)SEQ ID NO：57所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：323所示的β链CDR3氨基酸序列；
(t)SEQ ID NO：60所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：326所示的β链CDR3氨基酸序列；
(u)SEQ ID NO：63所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：329所示的β链CDR3氨基酸序列；
(v)SEQ ID NO：66所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：332所示的β链CDR3氨基酸序列；
(w)SEQ ID NO：69所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：335所示的β链CDR3氨基酸序列；
(x)SEQ ID NO：72所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：338所示的β链CDR3氨基酸序列；
(y)SEQ ID NO：75所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：341所示的β链CDR3氨基酸序列；
(z)SEQ ID NO：78所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：344所示的β链CDR3氨基酸序列；
(aa)SEQ ID NO：81所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：347所示的β链CDR3氨基酸序列；
(bb)SEQ ID NO：84所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：350所示的β链CDR3氨基酸序列；
(cc)SEQ ID NO：87所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：353所示的β链CDR3氨基酸序列；
(dd)SEQ ID NO：90所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：356所示的β链CDR3氨基酸序列；
(ee)SEQ ID NO：93所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：359所示的β链CDR3氨基酸序列；
(ff)SEQ ID NO：96所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：362所示的β链CDR3氨基酸序列；
(gg)SEQ ID NO：99所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：365所示的β链CDR3氨基酸序列；
(hh)SEQ ID NO：102所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：368所示的β链CDR3氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO：105所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：371所示的β链CDR3氨基酸序列；
(jj)SEQ ID NO：108所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：374所示的β链CDR3氨基酸序列；
(kk)SEQ ID NO：111所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：377所示的β链CDR3氨基酸序列；
(ll)SEQ ID NO：114所示的α链CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：380所示的β链CDR3氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的TCR，其中，所述α链包含的三个CDR的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：
(a)SEQ ID NO：1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：267、268、269所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(b)SEQ ID NO：4、5、6所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：270、271、272所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(c)SEQ ID NO：7、8、9所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：273、274、275所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(d)SEQ ID NO：10、11、12所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：276、277、278所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(e)SEQ ID NO：13、14、15所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：279、280、281所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(f)SEQ ID NO：16、17、1 8所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：282、283、284所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(g)SEQ ID NO：19、20、21所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：285、286、287所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(h)SEQ ID NO：22、23、24所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：288、289、290所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(i)SEQ ID NO：25、26、27所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：291、292、293所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(j)SEQ ID NO：28、29、30所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：294、295、296所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(k)SEQ ID NO：31、32、33所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：297、298、299所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(l)SEQ ID NO：34、35、36所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：300、301、302所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(m)SEQ ID NO：37、38、39所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：303、304、305所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(n)SEQ ID NO：40、41、42所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：306、307、308所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(o)SEQ ID NO：43、44、45所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：309、310、311所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(p)SEQ ID NO：46、47、48所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：312、313、314所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(q)SEQ ID NO：49、50、51所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：315、316、317所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(r)SEQ ID NO：52、53、54所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：318、319、320所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(s)SEQ ID NO：55、56、57所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：321、322、323所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(t)SEQ ID NO：58、59、60所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：324、325、326所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(u)SEQ ID NO：61、62、63所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：327、328、329所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(v)SEQ ID NO：64、65、66所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：330、331、332所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(w)SEQ ID NO：67、68、69所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：333、334、335所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(x)SEQ ID NO：70、71、72所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：336、337、338所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(y)SEQ ID NO：73、74、75所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：339、340、341所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(z)SEQ ID NO：76、77、78所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：342、343、344所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(aa)SEQ ID NO：79、80、81所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：345、346、347所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(bb)SEQ ID NO：82、83、84所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：348、349、350所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(cc)SEQ ID NO：85、86、87所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：351、352、353所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(dd)SEQ ID NO：88、89、90所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：354、355、356所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ee)SEQ ID NO：91、92、93所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：357、358、359所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ff)SEQ ID NO：94、95、96所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：360、361、362所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(gg)SEQ ID NO：97、98、99所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：363、364、365所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(hh)SEQ ID NO：100、101、102所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：366、367、368所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ii)SEQ ID NO：103、104、105所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEO ID NO：369、370、371所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(jj)SEQ ID NO：106、107、108所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：372、373、374所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(kk)SEQ ID NO：109、110、111所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：375、376、377所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或
(ll)SEQ ID NO：112、113、114所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO：378、379、380所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
优选地，所述α链包含的三个CDR的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：
(a)SEQ ID NO：1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：267、268、269所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：4、5、6所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：270、271、272所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：7、8、9所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：273、274、275所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：10、11、12所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：276、277、278所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：13、14、1 5所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：279、280、281所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(f)SEQ ID NO：16、17、1 8所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：282、283、284所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(g)SEQ ID NO：19、20、21所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：285、286、287所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：22、23、24所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：288、289、290所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(i)SEQ ID NO：25、26、27所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：291、292、293所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(j)SEQ ID NO：28、29、30所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：294、295、296所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：31、32、33所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：297、298、299所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(l)SEQ ID NO：34、35、36所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：300、301、302所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(m)SEQ ID NO：37、38、39所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：303、304、305所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(n)SEQ ID NO：40、41、42所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：306、307、308所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(o)SEQ ID NO：43、44、45所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：309、310、311所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(p)SEQ ID NO：46、47、48所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：312、313、314所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(q)SEQ ID NO：49、50、51所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：315、316、317所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(r)SEQ ID NO：52、53、54所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：318、319、320所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(s)SEQ ID NO：55、56、57所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：321、322、323所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(t)SEQ ID NO：58、59、60所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：324、325、326所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(u)SEQ ID NO：61、62、63所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：327、328、329所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(v)SEQ ID NO：64、65、66所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：330、331、332所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(w)SEQ ID NO：67、68、69所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：333、334、335所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(x)SEQ ID NO：70、71、72所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：336、337、338所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(y)SEQ ID NO：73、74、75所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：339、340、341所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(z)SEQ ID NO：76、77、78所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：342、343、344所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(aa)SEQ ID NO：79、80、81所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：345、346、347所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(bb)SEQ ID NO：82、83、84所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：348、349、350所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(cc)SEQ ID NO：85、86、87所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：351、352、353所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(dd)SEQ ID NO：88、89、90所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：354、355、356所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(ee)SEQ ID NO：91、92、93所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：357、358、359所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(ff)SEQ ID NO：94、95、96所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：360、361、362所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(gg)SEQ ID NO：97、98、99所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：363、364、365所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(hh)SEQ ID NO：100、101、102所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：366、367、368所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO：103、104、105所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：369、370、371所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(jj)SEQ ID NO：106、107、108所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：372、373、374所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(kk)SEQ ID NO：109、110、111所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：375、376、377所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；
(ll)SEQ ID NO：112、113、114所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO：378、379、380所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的TCR，其中，所述TCR还包含恒定区，例如，所述恒定区是小鼠恒定区；
优选地，所述TCR包含任一SEQ ID NO：191-228所示的α链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和任一SEQ ID NO：459-496所示的β链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
更优选地，所述TCR包含SEQ ID NO：191所示的α链序列和SEQ ID NO：459所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：192所示的α链序列和SEQ ID NO：460所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：193所示的α链序列和SEQ ID NO：461所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：194所示的α链序列和SEQ ID NO：462所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：195所示的α链序列和SEQ ID NO：463所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：196所示的α链序列和SEQ ID NO：464所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：197所示的α链序列和SEQ ID NO：465所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：198所示的α链序列和SEQ ID NO：466所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：199所示的α链序列和SEQ ID NO：467所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：200所示的α链序列和SEQ ID NO：468所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：201所示的α链序列和SEQ ID NO：469所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：202所示的α链序列和SEQ ID NO：470所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：203所示的α链序列和SEQ ID NO：471所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：204所示的α链序列和SEQ ID NO：472所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：205所示的α链序列和SEQ ID NO：473所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：206所示的α链序列和SEQ ID NO：474所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：207所示的α链序列和SEQ ID NO：475所示的β链序列；
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所述TCR包含SEQ ID NO：210所示的α链序列和SEQ ID NO：478所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：211所示的α链序列和SEQ ID NO：479所示的β链序列；
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所述TCR包含SEQ ID NO：222所示的α链序列和SEQ ID NO：490所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：223所示的α链序列和SEQ ID NO：491所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：224所示的α链序列和SEQ ID NO：492所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：225所示的α链序列和SEQ ID NO：493所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：226所示的α链序列和SEQ ID NO：494所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：227所示的α链序列和SEQ ID NO：495所示的β链序列；
所述TCR包含SEQ ID NO：228所示的α链序列和SEQ ID NO：496所示的β链序列。
5.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1-4中任一项所述的TCR，优选地，所述核酸分子是密码子优化的、编码权利要求1-4中任一项所述的TCR的核苷酸序列。
6.载体，其特征在于，包含权利要求5所述的核酸分子，所述载体优选地为质粒、穿梭质粒、噬菌粒、粘粒、表达载体；更优选地为同源重组修复(HDR)载体或病毒载体，例如，慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体。
7.T细胞受体融合蛋白或T细胞受体缀合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的TCR和其他生物活性分子，其中所述其他生物活性分子是例如抗体、细胞因子、细胞毒性剂、酶、放射性物质、可检测标记，其中所述TCR和其他生物活性分子之间具有或不具有接头。
8.一种工程化细胞，其特征在于，表达权利要求1-4中任一项所述的TCR，优选地，所述工程化细胞是工程化的T细胞、工程化的NK细胞；或者所述工程化细胞是工程化的干细胞，例如，所述工程化细胞是工程化的人CD4+T细胞或工程化的人CD8+T细胞，或者是工程化的人CD4+T细胞和工程化的人CD8+T细胞的混合细胞群；或者，所述工程化细胞是工程化的造血干细胞。
9.制备权利要求8的工程化细胞的方法，包括将权利要求5的核酸分子或权利要求6的载体转移到细胞中，和在培养基中培养所述细胞。
10.一种工程化的人CD4+T细胞和/或工程化的人CD8+T细胞，其特征在于，表达权利要求1-4中任一项所述的TCR并表达外源CD8a或者CD8ab。
11.产生权利要求10所述的T细胞的方法，所述方法包括用外源CD8a或者CD8ab；以及权利要求1-4中任一项所述的TCR转染CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的步骤，例如，所述外源CD8a或者CD8ab以及权利要求1-4中任一项所述的TCR在所述CD4+T细胞和/或CD8+T细胞中从相同载体表达，例如，其中表达所述外源CD8a或者CD8ab的构建体以及表达权利要求1-4中任一项所述TCR的构建体被2A元件或IRES元件分开。
12.药物组合物，其特征在于，包含权利要求8所述的工程化细胞和/或权利要求10所述的工程化的人CD4+T细胞和/或工程化的人CD8+T细胞。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的TCR、权利要求8或10所述的工程化细胞、权利要求12所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备检测、预防和/或治疗PRAME相关的疾病(例如，PRAME相关的癌症)的试剂或药物，例如，所述PRAME相关的癌症选自肺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病、成神经细胞瘤、黑素瘤、转移性黑素瘤、骨髓瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢上皮癌、前列腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、转移性实体瘤、结肠直肠癌、胃肿瘤、胃癌、横纹肌肉瘤、子宫内膜癌、子宫癌、葡萄膜黑素瘤、肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌、胸腺瘤、结肠腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈肿瘤、肝细胞癌和间皮瘤；优选地，所述癌症选自肺癌、卵巢癌、胰腺癌和黑素瘤。
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