CN116731155B - 人乳头瘤病毒特异性t细胞受体、表达其的细胞和其用途 - Google Patents

人乳头瘤病毒特异性t细胞受体、表达其的细胞和其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合人乳头瘤病毒E7的T细胞受体(TCR)、编码所述TCR的核酸及包含其的工程化细胞，以及制备所述工程化细胞的方法。本发明还涉及包含所述TCR的融合蛋白或缀合物、编辑人细胞基因组的方法以及用于编辑人细胞基因组的组合物。提供了选择性扩增所述工程化细胞的方法，以及所述TCR和所述工程化细胞在预防和/或治疗人乳头瘤病毒感染中的用途。

Description

人乳头瘤病毒特异性T细胞受体、表达其的细胞和其用途
技术领域
本发明总体上涉及免疫学领域。具体地，本发明涉及特异性结合人乳头瘤病毒E7的T细胞受体(下文中也缩写为TCR)、表达所述TCR的基因工程化细胞、以及制备所述基因工程化细胞的方法。本发明还涉及选择性扩增所述基因工程化细胞的方法，以及所述TCR和所述基因工程化细胞在预防和/或治疗人乳头瘤病毒感染中的用途。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种小型的双链DNA病毒。在人类中，已经分离鉴定了超过200种类型的人乳头瘤病毒。在一些情况下，HPV可通过皮肤与皮肤接触传播并且是常见的性传播病毒。一些HPV亚型，例如HPV 16可导致宫颈癌和其他癌症。
根据诱发病变的性质不同，可以将HPV分类为诱发恶性肿瘤的致癌型(包括HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68等高危型及HPV 26,30,53,66,67,69,70,73,82,85等可能及可疑高危型)，及诱发疣状增生等良性病变的低危型(包括HPV 6,7,11,13,32,40,42,44,61,62,72,74,81,83,84,86,87,89,90,91,106等)。
对HPV的致癌机制研究发现，HPV感染诱导细胞恶性转化的关键是，HPV的两个晚期基因E6和E7整合到宿主细胞基因组中，并在细胞中稳定表达E6和E7。HPV E6和E7通过分别结合并促进肿瘤抑制蛋白p53和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)的降解而发挥病毒癌蛋白的作用(Yugawa，T.和Kiyono，T.，Reviews in medical virology 19：97-113，2009)。由于HPVE6和E7在正常人体组织中并无表达，因此，HPV E6和E7可作为HPV相关肿瘤及癌前病变治疗的靶分子。鉴于HPV16是世界范围内的优势流行病毒型别，约53.5％的宫颈癌是由HPV16感染引起的，其余46.5％的宫颈癌由其它约22种高危型和可疑高危型HPV感染引起，因此，深入研究针对HPV16 E7的疫苗或药物具有重大意义。
目前，市场上已存在针对高危型HPV16、18型的2价HPV疫苗、针对高危型HPV16、18和针对低危型HPV6和11型的4价HPV疫苗、以及针对高危型HPV16、18、31、33、45、52、58和针对低危型HPV6和11型的9价HPV疫苗。通过接种所述HPV疫苗可以有效预防相关HPV感染所引发的癌症。但是，对于在接种HPV疫苗前已经感染HPV的人群，接种所述HPV疫苗不能清除HPV病毒。
另外，尽管受HPV感染的细胞表达HPV E6和E7，但是，研究显示在宫颈癌患者的外周血中没有或仅存在数量稀少的HPV16 E7特异性的淋巴细胞。考虑到细胞免疫应答在清除HPV病毒和受HPV病毒感染的细胞上发挥着重要的作用，预期提高人体中具备HPV E7特异性的淋巴细胞数量是治疗HPV感染的最行之有效的方法，本领域需要开发出针对HPV病毒特异性抗原的特异性淋巴细胞，例如，TCR-T细胞、TCR-NK细胞，来有效预防和治疗HPV感染。
发明内容
本发明人通过锐意研究，获得了能与人乳头瘤病毒E7特异性结合的T细胞受体(TCR)，并制备了重组表达该TCR的淋巴细胞，由此，能够通过细胞免疫应答来清除人体内的HPV病毒和被HPV病毒感染的细胞，从而满足了上述需求。
因此，在一个方面，本发明提供了分离的或纯化的T细胞受体(TCR)，其与人乳头瘤病毒E7特异性结合，优选地，所述TCR包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区(CDR)，并且α链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:80、83、86、89、92、95、98和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一个实施方案中，本发明的TCRα链的CDR3的氨基酸序列和β链的CDR3的氨基酸序列是：
(i)SEQ ID NO:3所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:80所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ii)SEQ ID NO:6所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:83所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(iii)SEQ ID NO:9所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:86所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(iv)SEQ ID NO:12所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:89所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(v)SEQ ID NO:15所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:92所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(vi)SEQ ID NO:18所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:95所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或
(vii)SEQ ID NO:21所示的α链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:98所示的β链CDR3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一个实施方案中，本发明的TCR的α链包含的三个互补决定区(CDR)的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：
(i)SEQ ID NO:1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:78、79、80所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ii)SEQ ID NO:4、5、6所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:81、82、83所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(iii)SEQ ID NO:7、8、9所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:84、85、86所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(iv)SEQ ID NO:10、11、12所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:87、88、89所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(v)SEQ ID NO:13、14、15所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:90、91、92所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(vi)SEQ ID NO:16、17、18所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:93、94、95所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或
(vii)SEQ ID NO:19、20、21所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:96、97、98所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一些实施方案中，本发明的TCR包含SEQ ID NO:64、66、68、70、72、74或76所示的α链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和SEQ ID NO:155、157、159、161、163、165或167所示的β链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，本发明提供了T细胞受体融合蛋白或T细胞受体缀合物，其包含本发明第一方面所述的TCR和其他生物活性分子，其中所述其他生物活性分子是例如抗体、细胞因子、细胞毒性剂、酶、放射性物质、可检测标记，其中所述TCR和其他生物活性分子之间具有或不具有接头。
本发明还提供了编码本发明TCRα链和/或β链的核酸。
此外，本发明提供了载体，优选地为质粒、穿梭质粒、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和/或同源重组修复(HDR)载体，其包含一个或多个如上所述的核酸。
在第二方面，本发明提供了用以上载体转化并表达本发明第一方面所述TCR的工程化细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种不使用病毒载体表达本发明的外源性TCR的打靶策略来制备TCR-T细胞的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了一种编辑人细胞基因组的方法，所述方法包括将以下核酸序列插入人细胞中内源性T细胞受体(TCR)α链恒定区基因的外显子1的靶区域中，所述核酸序列从N端到C端包含：
(i)编码第一可裂解接头多肽的序列；
(ii)编码本发明第一方面所述TCR的β链的序列；
(iii)编码第二可裂解接头多肽的序列；
(iv)编码本发明第一方面所述TCR的α链可变区的序列；
其中，所述第一可裂解接头多肽和所述第二可裂解接头多肽是相同或不同的病毒2A肽。
通过所述方法制备的表达外源性TCR的细胞与MLDLQPETT-HLA-A*02:01复合物有很高的结合亲和力以及对CaSki(HLA-A*02:01，HPV16+)细胞具有很强的体外杀伤作用。
在一些实施方案中，制备表达外源性TCR的细胞的方法是通过采用CRISPR/Cas9技术和同源重组技术，敲除内源性TCR和敲入外源性TCR实施的。
本发明提供了用于制备表达外源性TCR的细胞的组合物，所述组合物包含：
(i)第一引导RNA，其靶区域中的打靶位点位于内源性TRAC基因的外显子1，例如，其打靶位点位于内源性TRAC基因的外显子1的第23bp处或者其打靶位点位于内源性TRAC基因的外显子1的第2bp处；例如，所述第一引导RNA包含SEQ ID NO:177或SEQ ID NO:178所示的序列；或者SEQ ID NO:177或SEQ ID NO:178所示的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；或者与SEQ ID NO:177或SEQ ID NO:178所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％同一的序列；优选地，在所述第一引导RNA两端修饰1-10bp碱基数，例如，甲氧基修饰，或硫代磷酸和甲氧基修饰，或硫代乙酰胺和甲氧基修饰；
(ii)第二引导RNA，其靶区域中的打靶位点位于内源性TRBC1基因和TRBC2基因的共有序列中，例如，其打靶位点位于内源性TRBC1基因和TRBC2基因的外显子1中，例如，其打靶位点位于内源性TRBC1基因和TRBC2基因的外显子1的第237bp处；例如，所述第二引导RNA包含SEQ ID NO:179所示的序列；或者SEQ ID NO:179所示的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；或者与SEQ ID NO:179所示的序列至少95％、96％、97％、98％、99％同一的序列；优选地，在所述第二引导RNA两端修饰1-10bp碱基数，例如，甲氧基修饰，或硫代磷酸和甲氧基修饰，或硫代乙酰胺和甲氧基修饰；
(iii)CRISPR相关蛋白或编码该CRISPR相关蛋白的核酸，例如，其中该CRISPR相关蛋白包含与SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％的同源性的氨基酸序列；优选地，还包含C端和/或N端的1-10个核定位信号；
(iv)权利要求10中所述的核酸序列，优选地，在同源臂中的TRAC基因编码的氨基酸序列(例如，选自SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、和与所述序列具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％的同源性的氨基酸序列)中，TRAC A8的编码核苷酸为GCT、TRAC V9的编码核苷酸为GTC、TRAC Y10的编码核苷酸为TAT和/或TRAC R13的编码核苷酸为CGC；和/或在TRBC1或TRBC2基因编码的氨基酸序列(例如，选自SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、和与所述序列具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％的同源性的氨基酸序列)中，TRBC S77的编码核苷酸为TCC和/或TRBC S78的编码核苷酸为TCC。
在第三方面，本发明提供了选择性扩增所制备的表达TCR的工程化细胞的方法。
在一些实施方案中，通过对采用CRISPR/Cas9技术和同源重组技术转染后的TCR-T细胞进行选择性扩增，能显著性地提高TCR-T细胞的数量。
在第四方面，本发明提供了第一方面所述的TCR、第二方面和第三方面所获得的TCR-T细胞在预防和/或治疗人乳头瘤病毒感染中的用途。
附图说明
结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1A显示了采用gRNA001将外源性TCR敲入TRAC位点的打靶策略图。
图1B显示了采用gRNA002将外源性TCR敲入TRAC位点的打靶策略图。
图1C显示了采用gRNA004基因敲除TRBC1和TRBC2位点的打靶策略图。
图2显示了使用gRNA002、gRNA004和Cas9酶以及使用实施例2.3的nwTCR-0509构建体，电穿孔转导T细胞后，nwTCR表达的流式细胞术(Day 7)检测结果。在所述nwTCR-0509构建体中，位于同源臂中的相应TRAC基因未引入同义突变碱基，相应TRBC基因引入了4个同义突变碱基，分别为“TRBC S77，从AGC突变为TCC”和“TRBC S78，从AGC突变为TCC”；基因敲入位置为gRNA002-K0位置；左右同源臂均约为800bp。
在本说明书中，将sgRNA切割位点定义为“位置0”，即，PAM(NGG)位点上游3bp为“位置0”，从位置0向PAM方向延伸的序列为正编号位置，从位置0向PAM反方向延伸的序列为负编号位置。gRNA001打靶序列为TCTCTCAGCTGGTACACGGC-AGG(其中，“-”后连接的是PAM序列，为AGG)，如在TCTCTCAG和CTGGTACACGGC-AGG序列之间敲入KI序列，则为KI位点的-9位置，本发明也将其简短描述为“K-9”；又如在TCTCTCAGCTGGTACAC和GGC-AGG序列之间敲入KI序列，则为KI位点的0位置，本发明也可将其简短描述为“K0”；再如在TCTCTCAGCTGGTACACG和GC-AGG序列之间敲入KI序列，则为KI位点的+1位置，本发明也可将其描述为“K+1”。
图3显示了相同敲入位点情况下引入不同数量的同义突变碱基时CD8+T细胞KI效率。图3中，R14-5M-K-9表示：采用gRNA001和gRNA004的打靶载体；且KI位点位于gRNA001(TCTCTCAGCTGGTACACGGC-AGG)的切割位点朝向PAM反方向9bp处；在打靶载体上的TRAC基因上引入了5个同义突变碱基，分别为“TRAC A8，从GCC突变为GCT”、“TRAC V9，从GTG突变为GTC”、“TRAC Y10，从TAC突变为TAT”和“TRAC R13，从AGA突变为CGC”；在TRBC基因上引入4个同义突变碱基，分别为“TRBC S77，从AGC突变为TCC”和“TRBC S78，从AGC突变为TCC”；左右同源臂大小均约为1000bp。
R14-3M-K-9表示：采用gRNA001和gRNA004的打靶载体；且KI位点位于gRNA001(TCTCTCAGCTGGTACACGGC-AGG)切割位点朝向PAM反方向9bp处；在TRAC基因上引入了3个同义突变碱基，分别为“TRAC A8，从GCC突变为GCT”、“TRAC V9，从GTG突变为GTC”和“TRACY10，从TAC突变为TAT”。
R14-5M-K0表示：采用gRNA001和gRNA004的打靶载体；且KI位点位于gRNA001(TCTCTCAGCTGGTACACGGC-AGG)切割位点处，即K0位置；在TRAC基因上引入了5个同义突变碱基，分别为“TRAC A8，从GCC突变为GCT”、“TRAC V9，从GTG突变为GTC”、“TRAC Y10，从TAC突变为TAT”和“TRAC R13，从AGA突变为CGC”。
R14-3M-K0表示：采用gRNA001和gRNA004的打靶载体；且KI位点位于gRNA001(TCTCTCAGCTGGTACACGGC-AGG)切割位点处，即K0位置；在TRAC基因上引入了3个同义突变碱基，分别为“TRAC A8，从GCC突变为GCT”、“TRAC V9，从GTG突变为GTC”和“TRAC Y10，从TAC突变为TAT”。
注：图3中这4个打靶载体均含有TRBC基因上引入的4个同义突变碱基，分别为“TRBC S77，从AGC突变为TCC”和“TRBC S78，从AGC突变为TCC”。
图4显示了相同数量的同义突变碱基情况下改变敲入位点的CD8+T细胞KI效率。在图4中，R14表示采用的sgRNA为gRNA001和gRNA004；R24表示采用的sgRNA为gRNA002和gRNA004。5M表示引入5个同义突变碱基；3M表示引入3个同义突变碱基；K-9表示KI位点距离sgRNA切割位点9bp；K0表示KI位点位于sgRNA切割位点；K-6表示KI位点距离sgRNA切割位点6bp；K-3表示KI位点距离sgRNA切割位点3bp。图4中横坐标所示的前4个打靶载体与上述图3中的描述相一致，后2个打靶载体的信息如下。
R24-K-6表示：采用gRNA002和gRNA004的打靶载体；且KI位点位于gRNA002(TCAGGGTTCTGGATATCTGT-GGG)切割位点朝向PAM反方向6bp处；在TRAC基因上没有引入同义突变。
R24-K-3表示：采用gRNA002和gRNA004的打靶载体；且KI位点位于gRNA002(TCAGGGTTCTGGATATCTGT-GGG)切割位点朝向PAM反方向3bp处；在TRAC基因上没有引入同义突变。
注：图4中这6个打靶载体均含有TRBC基因上引入的4个同义突变碱基，分别为“TRBC S77，从AGC突变为TCC”和“TRBC S78，从AGC突变为TCC”。
图5显示了打靶载体中不同同源臂大小时，对CD8+T细胞的KI效率。R24表示采用的sgRNA为gRNA002和gRNA004，HA表示同源臂。
图6显示了CD8+T细胞电穿孔转染RNP和具有不同同源臂大小的质粒时，使用流式细胞术的检测结果。
图7显示了选择性激活表达nwTCR的基因编辑T细胞的柱状图，柱状图上的数字代表了nwTCR的KI效率。
图8A-图8G显示了电穿孔转染不同nwTCR的CD4+T细胞、CD8+T细胞与pMHC四聚体染色结果(CD4,CD8)。
图9A和图9B显示了表达各nwTCR的T细胞的亲和力检测实验结果以及IFN-γ释放结果和EC50值。
图10显示了各nwTCR细胞对CaSki(HLA-A*02:01,HPV16+)在不同E:T比下的体外杀伤效果。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。
I.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小10％的下限和比指定数字数值大10％的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
T细胞受体(T cell receptor，TCR)是T细胞表面负责特异性识别与MHC(主要组织相容性复合体)结合的抗原肽的蛋白。当TCR与抗原肽和MHC结合时，T淋巴细胞通过信号转导被激活，进入后续的免疫应答过程。人类基因组中有4个TCR基因：两个编码轻链TCR：TRA基因编码TCRα，TRG基因编码TCRγ；两个编码重链TCR：TRB基因编码TCRβ，TRD基因编码TCRδ。重链TCR和轻链TCR形成异源二聚体，组成完整的TCR。在人类中存在两种TCR：TCRα/β和TCRγ/δ，其中95％的T细胞表达TCRα/β，称为αβT细胞；5％的T细胞表TCRγ/δ，称为γ/δT细胞。该比例在个体发育过程中和患病状态(例如白血病)中发生变化，物种之间也有所不同。
成熟的重链TCR基因由可变区(V)、多变区(D)、连接区(J)和恒定区(C)四部分基因片段组成(VDJC)，轻链TCR则缺少D区(VJC)。重链和轻链TCR都具有3个互补决定区(CDR)，在抗原识别中起主要作用，其中CDR1和CDR2相对保守，负责识别MHC；CDR3是负责识别抗原的主要CDR。
TCR基因是人类基因组中复杂度最高的基因，也是变异程度最高的基因。人外周血中大概含有2x1016－1018种表达不同TCR的T细胞。这个复杂度主要源自3个因素：(i)组成的多样性：成熟TCR的VDJC/VJC结构，是通过复杂的重排生成的。基因组中有65－100种V基因片段、2种D基因片段和13种J基因片段，TCR重组时需要从上述三种片段中各选一个，这赋予了TCR高度的多样性；(ii)连接的机动性：在重排的过程中，在V-D及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除，进一步增加了CDR3区的多样性；(iii)体细胞突变：T细胞D区的突变频率约为正常的1000倍。
“亲和力”是指分子(例如TCR)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如TCR与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用结合解离平衡常数(KD)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的那些方法。
如本领域已知，在本文中可交换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。
如下进行序列之间序列同一性的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是同一的。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。
还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如，B-细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合体。APC加工抗原且将抗原呈递给T细胞。
术语“引导RNA(guide RNA，gRNA)”指特异于靶DNA的RNA，其可以与Cas蛋白质形成复合体并将Cas蛋白质带至靶DNA，从而Cas蛋白质在靶DNA的位点处引入双链断裂。在本发明中，引导RNA可以由两个RNA，即CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)组成，或者引导RNA可以是通过融合crRNA和tracrRNA的必要部分而产生的一条单链引导RNA(single guide RNA，sgRNA)。
核糖核蛋白复合物(Ribonucleoprotein，RNP)是Cas9蛋白和gRNA复合形成的具有基因编辑功能的复合物。
CRISPR/Cas9基因编辑系统主要由两部分组成：相当于“扳手”作用的Cas9蛋白与相当于“螺纹钉”作用的CRISPR引导RNA。引导RNA负责对靶位点进行定位，并招募和激活Cas9蛋白；Cas9蛋白则负责切割靶DNA。
术语“重组”，当用于例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质、或改变天然核酸或蛋白质而被修饰。
术语“靶位点”指在目标基因组中任何一段欲加以改造或修复的DNA序列。靶位点附近的DNA序列允许外源序列在靶位点处的整合，所述整合包括但不限于基因敲入(knock-in，KI)。在具体实施方式中，目标DNA序列是双链的DNA序列，包括但不限于，细胞的染色体基因组中的DNA序列、细胞染色体基因组外的DNA序列(例如线粒体基因组)、质粒、病毒等的DNA序列。
在本发明中，术语“定点重组”是指，将外源序列通过非随机的方式整合到特定的靶位点处，包括整合到某特定靶位点的5’上游、3’下游、或者靶位点之间。
在本发明中，术语“外源DNA序列”是指，期望被定点重组到靶位点处的DNA序列。外源DNA序列可以是靶位点处不存在或被改变的序列。
术语“供体DNA”或“供体核酸序列”是指包含待表达的目的多核苷酸序列的多核苷酸，该目的多核苷酸序列被插入目标基因组中的靶位点处。在某些实施方案中，供体DNA进一步包含与基因组序列同源的序列(也被称为“同源臂”)。“同源”意指类似的DNA序列。同源臂足以发生与同源基因组序列的同源重组。例如，同源臂可以包含至少50-3500或更多个碱基长度。
术语“同源定向DNA修复(Homology directed repair，HDR)”是基于同源重组的修复，可用于特异性地将供体DNA模板(编码目的序列)高效地插入目标基因组位点，是细胞DNA双链损伤后启动的一种修复途径。只有当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。HDR载体可以指采用CRISPR/Cas9和同源重组技术电穿孔转染用的载体。HDR效率可以指采用CRISPR/Cas9和同源重组技术电穿孔转染的基因敲入效率。
同义突变(synonymous mutation)是一种中性突变，遗传密码是简并性的，即，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换往往不会改变氨基酸的组成。虽然三联体密码子中第三个核苷酸发生了突变，但编码的氨基酸没有改变，这种突变是同义突变。
术语“磁珠细胞分选技术(magnetic-activated cell sorting，MACS)”是基于细胞表面抗原与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，在外加磁场的作用下将磁珠标记的细胞与其它细胞分离，从而实现目的细胞的富集和纯化。磁珠细胞分选方法基本可以分为阳选和阴选两种方法，由阴选方法得到的细胞表面没有抗体和磁珠标记，因此能够比阳选更好地保持细胞活性。
如本文所用，“载体(vector)”表示一种构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、质粒、粘粒或噬菌体载体。载体可以包含允许所关注的基因或序列在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起始区。载体还可以包含一种或多种可选择的标志物基因和本领域技术人员已知的其他遗传元件。载体优选地是包含根据本发明的核酸的表达载体，所述核酸与容许所述核酸表达的序列有效连接。
术语“有效连接”是指核酸表达调节序列和编码目的蛋白的核酸序列之间的功能性连接，以便执行总体功能。可使用本领域众所周知的基因重组技术制备与重组载体的有效连接，并使用本领域众所周知的酶进行位点特异性DNA切割和连接。
在本发明中，术语“工程化细胞”是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。工程化细胞包括“转染的细胞”，其包括原代转染细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转染的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。
在本文中，“受试者”、“个体”指需要缓解、预防和/或治疗人乳头瘤病毒相关疾病的动物，优选哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。该术语包括具有人乳头瘤病毒感染或处于具有HPV病毒感染风险的人受试者。
过继性免疫治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy,ACT)，是指从受试者或患者体内分离出具有免疫活性的细胞，在体外进行激活扩增、基因编辑等处理之后，再回输到患者体内，从而实现对靶细胞的杀伤。
II.本发明的T细胞受体(TCR)和编码TCR的核酸
HPV病毒E7蛋白在细胞中经加工，通过主要组织相容性复合物(MHC)分子携带至细胞表面，呈现为肽-MHC复合物形式。
T细胞受体(TCR)是存在于T细胞表面的分子，其负责识别肽-MHC复合物。TCR与肽-MHC复合物的特异性结合引发T细胞通过一系列由相关酶、共受体和辅助性分子介导的生化事件而活化。在95％的T细胞中，TCR异二聚体由α和β链组成，而在5％的T细胞中，TCR异二聚体由γ和δ链组成。
TCR的每一条链均属于免疫球蛋白超家族的成员，具有一个N端免疫球蛋白(Ig)可变(V)结构域、一个Ig恒定(C)结构域、跨细胞膜区域(即，跨膜区)以及在C末端的短胞质尾。在TCRα链和β链的可变结构域中，各可变结构域具有三个高变区或互补决定区(CDR)，其中各可变结构域中的CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR。认为CDR2识别MHC分子。
TCR的恒定结构域由短的连接序列组成，其中的半胱氨酸残基形成二硫键，在TCRα链和β链之间产生连接。
在T细胞成熟过程中，TCR与CD3形成TCR/CD3复合体。TCR/CD3复合体形成过程通常是按以下顺序进行的；首先CD3γ、δ和ε三种肽链通过形成γ-ε和δ-ε两种异源二聚体成为稳定的复合物核心，TCRαβ(或TCRγδ)与之结合，随后ζ-ζ或ζ-η二聚体与TCRαβ(或TCRγδ)/CD3γεδε复合物结合，最后转移到T细胞表面。通过TCR/CD3复合体将信号从TCR传导至细胞内。
来自TCR/CD3复合体的信号通过MHC与特异性共受体的同时结合而增强。在辅助T细胞中，这一共受体是CD4分子，所述CD4分子对II类MHC是特异性的；而在细胞毒性T细胞中，这一共受体是CD8，所述CD8分子对对I类MHC是特异性的。
在本文中，术语“T细胞受体”具有本领域的常规意义，用于表示能够识别由MHC分子呈递的肽的分子。该分子是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体。
在一些实施方案中，本发明提供了用于产生针对靶抗原的T细胞受体的方法。所述方法涉及使含有T细胞的生物样品经历多轮抗原暴露，所述T细胞可以是原代T细胞，包括来源于正常供体或患有目的疾病(例如，宫颈癌)的患者的原代T细胞。在一些实施方案中，所述抗原暴露的轮次涉及使用经靶抗原脉冲并经MHC(例如I类或II类MHC)呈递抗原肽的自体树突细胞或其他抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，进行多轮抗原暴露，并且在一些实施方案中，基于T细胞与抗原肽-MHC四聚体结合的能力，在一轮或多轮抗原暴露之后对T细胞通过流式细胞术进行分选，然后在单细胞水平上对样品中存在的TCR对进行测序。
在一个具体实施方案中，产生了与HPV16 E7上表位肽特异性结合的抗原特异性T细胞受体(TCR)，所述表位肽例如E7(12-20)肽，例如，通过多轮抗原刺激后所述肽在MHC-I类分子上呈递。在一些实施方案中，生成了克隆T细胞系，并且使用高通量配对TCR测序，在单细胞基础上确定了各个群体中各配对的TCRα链和β链的序列。
本发明提供了分离的或纯化的T细胞受体(TCR)α链和/或β链。本发明的TCR可以是包含衍生自超过一种物种的序列的杂合TCR。例如，考虑到鼠科TCR在人T细胞中能够比人TCR更有效地表达，TCR可包含人可变区和鼠科恒定区。
在一个实施方案中，本发明的TCR包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区(CDR)，且其中主要负责抗原识别的TCRα链CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:80、83、86、89、92、95、98和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一个实施方案中，本发明的TCR包含α链和β链，所述α链包含的三个互补决定区(CDR)的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：
(i)SEQ ID NO:1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:78、79、80所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(ii)SEQ ID NO:4、5、6所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:81、82、83所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(iii)SEQ ID NO:7、8、9所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:84、85、86所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(iv)SEQ ID NO:10、11、12所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:87、88、89所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(v)SEQ ID NO:13、14、15所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:90、91、92所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
(vi)SEQ ID NO:16、17、18所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:93、94、95所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；或
(vii)SEQ ID NO:19、20、21所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及SEQ ID NO:96、97、98所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列或与所述序列分别具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
在一个实施方案中，本发明的TCR包含SEQ ID NO:64、66、68、70、72、74或76所示的α链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；和SEQ ID NO:155、157、159、161、163、165或167所示的β链序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。优选地，本发明的TCR的恒定区是小鼠恒定区。
在一些实施方案中，本发明的TCR变体中所述氨基酸残基的改变是任一SEQ IDNO:64、66、68、70、72、74或76所示的α链序列、任一SEQ ID NO:155、157、159、161、163、165或167所示的β链序列中的氨基酸残基的取代、添加或缺失，条件是该TCR变体仍保留了或改善了与人乳头瘤病毒E7的表位肽-MHC复合物结合的能力。在一个实施方案中，所述取代是保守性取代。下表A中给出了保守性取代的例子。
表A
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将使这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。
本发明的TCR识别或结合MHC分子(例如，MHC I类分子)呈递的HPV 16E7表位。在一些方面，MHC-I类分子是HLA-A2分子，包括其任何一种或多种亚型，例如，HLA-A*02:01、*02:02、*02:03、*02:06或*02:07。在一些实施方案中，MHC分子是HLA-A*02:01。
本发明还涉及编码本发明TCR或其部分的核酸，所述TCR部分例如，一个或多个CDR；一个或多个可变区；α链；或β链等。该核酸可以是双链或单链的，并且可以是RNA或DNA。该核酸序列可以是经密码子优化的，以实现哺乳动物生产细胞中的高表达。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择是本领域公知的。密码子优化还可包括移除mRNA不稳定基序和隐藏的剪接位点。
本发明的TCR可经多种方法(例如，基因融合、化学共轭等)进行修饰，从而使TCR与其他生物活性分子连接。可与其他生物活性分子连接的TCR可以是TCR异二聚体或其可溶性型式，更优选地为可溶性、单链TCR。所述其他生物活性分子可以是各种生物活性效应物，例如抗体、细胞因子、细胞毒性剂、酶、放射性物质、可检测标记等。所述TCR和其他生物活性分子之间具有或不具有接头。
在一些实施方案中，TCR融合蛋白是将TCR与抗体融合，所述抗体包括完整抗体(例如IgG、IgM或IgA类)或者其片段(例如Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双体抗体(diabody)；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体)；以及多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
在一些实施方案中，TCR融合蛋白是将TCR与细胞因子融合，所述细胞因子例如白细胞介素(例如IL-2)、趋化因子(例如MIP-1β)、生长因子(例如GCSF)。
在一些实施方案中，TCR缀合物是将TCR共价连接至细胞毒性剂，例如阿霉素。
在一些实施方案中，TCR缀合物是将TCR共价连接至放射性物质，例如I125。
在一些实施方案中，TCR缀合物是将TCR共价连接至可检测标记，例如荧光标记物。
本发明的T细胞受体融合蛋白或T细胞受体缀合物可用于各种应用，包括体内检测细胞和/或使细胞或组织成像，以及治疗用途，例如在体内或体外杀死具有特异性结合TCR的配体的靶细胞或靶组织，例如靶细胞包括病变细胞(例如，宫颈病变细胞)、肿瘤细胞(例如，宫颈癌细胞)以及人乳头瘤病毒感染细胞。
III.包含编码本发明TCR的核酸的载体
本发明还涉及包含编码本发明TCR的核酸的载体。在一个实施方案中，所述载体是pUC57-Simple载体(购自金斯瑞生物科技有限公司)。在又一个实施方案中，使用了pUC57-S载体，所述pUC57-S载体是在pUC57-Simple载体基础上优化后的载体，其仅保留了pUC57-Simple载体的Ori和Amp序列，并将Amp序列替换为Kana序列而获得。
载体将编码本发明TCR的核酸转移至细胞中，诸如T细胞、NK细胞、干细胞，例如多能干细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)中，使得所述经工程化的细胞表达人乳头瘤病毒特异的TCR。
优选地，载体使得在工程化的细胞(例如，工程化的T细胞)中持续高水平表达引入的外源性TCR，且引入的外源性TCR可成功地与内源TCR竞争有限的CD3分子池。备选地，增加CD3分子供应也可增加基因修饰细胞中的外源性TCR表达。因此载体任选地包含CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε和/或CD3-ζ的基因。在一个实施方案中，载体包含CD3-ζ的基因。另外，也可提供一个或多个编码CD3基因的单独的载体用于与外源性TCR编码载体共转移入细胞中。
载体形式不限于同源重组修复(HDR)载体，也可以是病毒载体。病毒载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体，用来实施对细胞基因组的编辑。
基因组的编辑技术是指在细胞基因组DNA中进行核酸插入、缺失或者替换的一项技术。利用基因编辑技术对于人原代T细胞的基因改造后的T细胞，已经在多种过继性免疫治疗药物的临床试验中展现了优异的疗效。其中，嵌合抗原受体(Chimeric AntigenReceptors，CAR)或者T细胞受体(T Cell Receptor，TCR)常被用于改造人的原代T细胞，从而实现对某些特定靶点表位(epitope)的识别。这些经改造后的T细胞可以对特定的靶细胞起到特异性杀伤作用。
常见的TCR基因编辑手段根据基因整合方式可以大致分为两类，一类是基因的随机整合：包括慢病毒(Lenti Virus，LV)体系，腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)体系，转座子(Transposon)体系等。另一类是精准的基因编辑手段：包括锌指核酸酶(ZFN)，转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)技术等。其中，CRISPR技术通过gRNA的导向来识别及编辑DNA，通过同源重组的方式进行大基因片段的定点插入，具有易于操作，具有更强的可拓展性等优势。
IV.工程化细胞的制备
可以使用病毒载体将目的TCR导入细胞。但是，基于病毒载体将外源性TCRα/β基因导入细胞的方法没有敲除细胞内源性的TCR，可能造成外源性TCRα链和β链的错配，即使通过修饰二硫键或换用鼠源恒定区可以减少外源性TCRα链和β链的错配问题，但病毒载体随机插入到细胞基因组中，这仍会带来破坏其他基因的潜在风险。
也可以使用非病毒载体将目的TCR导入细胞，将外源性TCRα/β基因精确整合到细胞的特定基因组位点。在一些实施方案中，非基于病毒载体的基因编辑方法可以通过CRISPR/Cas9技术和同源重组技术敲除人源T细胞的内源性T细胞受体α链和β链，并在TRAC基因外显子处敲入外源性目的T细胞受体α和β链编码核苷酸。由此，既破坏了内源性的TCR表达，又采用内源性TCR启动子来表达外源性目的TCRα和β。
在一个实施方案中，在内源性TRAC基因外显子1处敲入外源性目的T细胞受体α和β链编码核苷酸，且该外源性敲入片段不用添加TRAC基因，由此减少了基因敲入的片段长度，降低了基因敲入的难度。相比于采用病毒载体表达TCR的技术，可以将采用非病毒载体方式表达TCR的技术作为一种快速、简便、低成本的外源性TCRα/β基因导入细胞方式。
IV.1敲除位点的选择
TCR是一个二聚体，由TCRα链和TCRβ链组合而成。TCRα链基因是由TRAV、TRAJ和TRAC基因重排而成，其中TRAV和TRAJ基因分别含有多个序列，且该多个序列之间有差异，重排时只能分别随机选择其中一个序列表达。如果选择TRAV和TRAJ基因作为敲除位点，则很难避免任何随机TCRα链基因的产生，而TRAC基因只有一个，通过敲除该TRAC基因可以敲除任何随机TCRα链基因，因此TRAC适合作为敲除位点。TCRβ链基因是由TRBV、TRBJ、TRBD和TRBC基因重排而成，其中TRBV和TRBJ基因分别含有多个序列，且该多个序列之间有差异，不适合作为敲除位点。TRBC基因包含TRBC1和TRBC2，两者含有部分相同序列，可以选择该共同序列作为敲除位点，通过敲除该共同序列而敲除任何随机TCRβ基因。
在一些实施方案中，敲除了内源性TRAC基因、内源性TRBC1基因和/或TRBC2基因中的一者或多者。在一些实施方案中，同时敲除了内源性TRAC基因和内源性TRBC1和TRBC2基因，由此可以获得更高的内源性TCR敲除效率，降低了内源性TCR表达可能导致的外源性TCR和内源性TCR的链之间的错配风险。
可以使用基于核酸酶的基因组编辑工具，通过非同源端连接(NHEJ)诱导双链断裂和DNA修复来靶向破坏内源性TRAC基因和TRBC基因。这些工具包括大范围的核酸酶(meganucleases)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)、megaTAL核酸酶，以及CRISPR/CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)。
IV.2敲入位点的选择
由于内源性TRAC基因唯一且所有的TCRα表达均需要TRAC基因，将外源性TCRα/β基因敲入位点选择为内源性TRAC位点，由此，在消除内源性TCR的同时，可以采用人源T细胞的内源性TCR启动子来表达本发明的外源性TCRα/β基因(也称为“nwTCR”基因)且不用额外添加TRAC基因，从而减少敲入片段的大小，有利于提高基因编辑的效率。
在一些实施方案中，将nwTCR的表达构建体克隆于打靶载体(例如pUC57-S载体)，通过设计同源臂使nwTCR定点敲入到TCRα链恒定区，并受该基因座的转录调控序列调控表达。由于该敲入位点处其内源启动子的调控水平优于其他位点，确保了nwTCR基因的持续稳定表达。
IV.3工程化细胞
本发明提供了表达外源性TCR的工程化细胞。
在一些实施方案中，自来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官的细胞，例如，淋巴细胞或干细胞制备表达TCR的工程化细胞，所述淋巴细胞包括但不限于T细胞、NK细胞，所述干细胞例如多能干细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)。
细胞通常是原代细胞，例如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的细胞。细胞可以是同种异体细胞和/或自体细胞。
在一些实施方案中，通过CRISPR/Cas9和同源重组技术，采用RNP和质粒的方式来电穿孔转染CD3/CD28激活后的原代细胞(例如，分选的CD4+T细胞和CD8+T细胞)，由此制备工程化的TCR细胞。
在一些实施方案中，设计了针对内源性TRAC基因的sgRNA，并设计了针对内源性TRBC1基因和TRBC2基因的sgRNA。
通过sgRNA引导Cas9蛋白结合于目标基因组的特异性位点，Cas9蛋白切割该特异性位点。对于使用RNP所致内源性TRAC基因形成的双链断裂，在具有同源臂的供体DNA存在的条件下可以发生同源重组，由此实现目的nwTCR基因的定点插入。
为了提高位点基因敲入效率，通常设计多条sgRNA，通过转染细胞来计算其编辑效率(Zuo E,Cai Y J,Li K等人,“One-step generation of complete gene knockout miceand monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs”[J].Cell research,2017,27(7):933-945.)。根据检测结果选择编辑效率最高的sgRNA进行后续实验。
在一个具体实施方案中，sgRNA引导Cas9蛋白结合的目标基因组的特异性位点是TRAC基因的外显子1的第23bp处，Cas9蛋白切割该特异性位点，所设计并经验证的高效靶向其的sgRNA识别序列和PAM序列包含TCTCTCAGCTGGTACACGGC-AGG所示的核苷酸序列(sgRNA识别序列-PAM序列，“-”用来区分隔开CRISPR/Cas9识别位点和PAM序列)。
在一个具体实施方案中，sgRNA引导Cas9蛋白结合的目标基因组的特异性位点是TRAC基因的外显子1的第2bp处，Cas9蛋白切割该特异性位点，所设计并经验证的高效靶向其的sgRNA识别序列和PAM序列包含TCAGGGTTCTGGATATCTGT-GGG所示的核苷酸序列(sgRNA识别序列-PAM序列，“-”用来区分隔开CRISPR/Cas9识别位点和PAM序列)。
在一个具体实施方案中，sgRNA引导Cas9蛋白结合的目标基因组的特异性位点是TRBC1和TRBC2基因的外显子1的第237bp处，Cas9蛋白切割所述特异性位点，所设计并经验证的高效靶向其的sgRNA识别序列和PAM序列包含CTGCCTGAGCAGCCGCCTGA-GGG所示的核苷酸序列(sgRNA识别序列-PAM序列，“-”用来区分隔开CRISPR/Cas9识别位点和PAM序列)。
在一些实施方案中，sgRNA可以是合成的一整段序列；在一些实施方案中，sgRNA可以分成两段序列合成，分别为crRNA和tracrRNA。在一些实施方案中，sgRNA和/或crRNA和/或tracrRNA两端可以是未修饰的；在一些实施方案中，sgRNA和/或crRNA和/或tracrRNA两端可以是修饰的，在一些实施方案中，sgRNA和/或crRNA和/或tracrRNA两端修饰的碱基数可以是对等的；在一些实施方案中，sgRNA和/或crRNA和/或tracrRNA两端修饰的碱基数可以是不对等的；在一些实施方案中，sgRNA和/或crRNA和/或tracrRNA两端修饰的碱基数可以是1-10bp。修饰方式可以为甲氧基修饰，或硫代磷酸和甲氧基修饰，或硫代乙酰胺和甲氧基修饰等等，其中所述甲氧基修饰为：所述硫代磷酸和甲氧基修饰为：所述硫代乙酰胺和甲氧基修饰为：/>所述修饰有利于sgRNA的稳定(Hendel A,Bak R O,Clark J T,et al.Chemically modified guide RNAsenhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells[J].Naturebiotechnology,2015,33(9):985-989)。
CRISPR/Cas系统中可包含蛋白质形式或编码Cas蛋白质的核酸形式的Cas成分。
在本发明中，Cas蛋白质可以是任何Cas蛋白质，只要当其与引导RNA复合时具有核酸内切酶或切口酶活性即可。
优选地，Cas蛋白质是Cas9蛋白质或其变体或其功能片段。
Cas蛋白质可以是从生物体如链球菌属物种(Streptococcus sp.)，优选化脓性链球菌(Streptococcus pyogens)中分离的蛋白质、或重组蛋白质，但并不限于此。
在一个实施方案中，Cas蛋白质包含源自化脓性链球菌的Cas9，例如具有SEQ IDNO：169所示氨基酸序列的Cas9。
在另一个实施方案中，Cas蛋白质包含与SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％的同源性，但不限于此。
就本发明而言，Cas蛋白质编码核酸可以是载体形式，如包含在启动子如CMV或CAG下的Cas编码序列的质粒。当Cas蛋白质是Cas9时，Cas9编码序列可源自链球菌属，优选源自化脓性链球菌。例如，Cas9编码核酸可以包含编码SEQ ID NO：169的核苷酸序列。此外，Cas9编码核酸可包含与编码SEQ ID NO：169的核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列，优选地与编码SEQ ID NO：169的核苷酸序列具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％同源性的核苷酸序列，但不限于此。
在一些实施方案中，Cas9酶具有可以促进其运输到细胞核中的1-10个核定位信号(NLS)，例如，Cas9核酸酶在其C端和N端均具有核定位信号(NLS)。相比只有一个NLS的Cas9核酸酶，C端和N端均具有NLS的Cas9核酸酶可介导Cas9核酸酶更高效地转染进细胞核内。两个NLS可以是相同的(例如，两个SV40 NLS)或不同的。在一些实施方案中，Cas9核酸酶可以与3个NLS融合。
在确定了引导RNA后，根据引导RNA的作用位置构建供体DNA来敲入(Knock-in，KI)nwTCR基因序列至所选择的细胞基因组敲入位点。在供体DNA中，5’同源臂、3’同源臂分别是与引导RNA作用位置左、右两边各150－3500个核苷酸长度的基因组序列同源的序列，用于有效介导同源重组。在一些实施方案中，5’同源臂、3’同源臂分别是约250、500、850、1000、1200、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250个核苷酸长度的基因组序列同源的序列。此处所用的术语“同源”，除了序列彼此完全(即，100％)同一的情况以外，只要能够有效介导同源重组即可，因此，也包含部分序列不同的情况。通常至少95％以上、优选为97％以上、进一步优选为99％以上的序列同一。通过细胞基因组区域与供体DNA上的5’同源臂、3’同源臂相互作用，供体DNA上位于5’同源臂和3’同源臂之间的核酸序列敲入至细胞基因组的特定位置。
在一个实施方案中，供体DNA中依次包含5’同源臂、编码可裂解接头多肽的序列、外源性TCRα/β基因或其功能片段和3’同源臂。所述编码可裂解接头多肽的序列在表达后，可裂解接头多肽被裂解。在一些实施方案中，可裂解接头多肽序列包含2A核糖体跳跃元件例如T2A、E2A、P2A和F2A。
在一个实施方案中，供体DNA位于打靶载体中。不特别地限制作为骨架的基础打靶载体，只需具备用于细菌中的载体增殖的原核复制起点和选择标记即可。
在一个优选的实施方案中，为了增加外源性TCRα/β基因或其片段的表达，在打靶载体中分别在外源性TCRα链基因和外源性TCRβ链基因的N端连接编码可裂解接头多肽的序列和信号肽序列。
在一个具体实施方案中，用于敲入nwTCR基因序列的打靶载体包含有效连接的以下结构：5’HA-2A核糖体跳跃元件-SP-TCRβ-2A核糖体跳跃元件-SP-TRAV-TRAJ-3’HA
其中：
HA为同源臂；
SP为信号肽编码序列。
将用于敲入nwTCR基因序列的打靶载体、RNP复合体和细胞混合并实施nwTCR基因序列向细胞的递送步骤。在一些实施方案中，递送步骤选自：电穿孔、转染、通过物理手段使细胞膜变形、脂质纳米颗粒(LNP)、病毒样颗粒(VLP)和声处理。在一些实施方案中，递送步骤包括电穿孔。
在一些实施方案中，工程化的细胞是原代细胞。
在一些实施方案中，工程化的细胞是分离的细胞，其中分离的细胞是从受试者分离的。
在一些实施方案中，工程化的细胞是离体培养的细胞。在一些实施方案中，离体培养的细胞包括经刺激的细胞。在一些实施方案中，经刺激的细胞包括细胞因子刺激的T细胞，任选地，其中细胞因子刺激的T细胞包括CD3刺激的T细胞、CD28刺激的T细胞或CD3和CD28刺激的T细胞。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞是在IL7、IL15或其组合的存在下培养的。在一些实施方案中，细胞因子刺激的T细胞是在IL2的存在下培养的。
在一些实施方案中，工程化的细胞是干细胞，例如，造血干细胞(HSC)。将nwTCR基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR，因为干细胞不表达CD3分子。然而，当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体细胞(lymphoid precursor)时，CD3表达的启动将导致在胸腺细胞的表面表达该引入的nwTCR。这一方法的优点是成熟T细胞一旦产生，其仅表达引入的nwTCR，而表达很少的或不表达内源TCR链，因为引入的nwTCR链的表达抑制了内源TCR基因片段重排形成功能性TCRα和β基因。这一方法的其他益处是，TCR基因修饰的干细胞是具有期望的抗原特异性的成熟T细胞的持续来源。因此，nwTCR基因修饰的干细胞在分化后产生表达本发明TCR的T细胞。
V.对经工程化细胞的选择性激活
利用CRISPR技术对于原代T细胞的TCR进行基因编辑，可以相对简便、快速的得到表达特定TCR的T细胞。但是，表达改造后的TCR的T细胞的比例(TCR基因编辑效率)一直都无法与传统的基于病毒载体的转导体系相比。目前，绝大多数报道的对于原代T细胞的TCR的基因编辑效率普遍在30％以下。这一较低的基因编辑效率，导致了回输给患者的绝大多数细胞无法表达有特异性识别功能的TCR，这部分细胞在临床应用中无法起到杀伤靶细胞的作用。
本发明尝试了提高CRISPR基因编辑的方法，包括优化sgRNA切割位点、优化插入基因载体同源臂长度、使用更高效的Cas9酶、添加增强剂等等。
进一步地，本发明利用T细胞的激活生长特性，即，T细胞活化、增殖并分化为效应T细胞需要双信号刺激：第一信号是有T细胞受体(TCR)转导并受粘附分子(CD3)增强；第二信号为共刺激信号，由CD28分子介导，其中只有第一信号并不能诱导T细胞的免疫应答，这两种信号的协同刺激才可以活化T细胞，从而实现T细胞的扩增，本发明通过调整经工程化后的T细胞的培养条件，选择性地扩增整合有nwTCR基因的T细胞，从而将成功地敲入有nwTCR的T细胞的比例大大提升。
由于TCR与CD3分子通常是共表达的，当通过本发明的细胞工程化方法对T细胞的内源性TCR进行敲除(KO)之后，这部分KO细胞的CD3分子表达水平相应降低，当用基于CD3/CD28的激活剂进行T细胞激活时，这部分KO细胞因为无法被激活从而不会进行大量扩增。
对于T细胞的内源性TCR被敲除(KO)且实现了外源性nwTCR敲入(KI)的细胞群，当使用基于CD3/CD28的激活剂时，能够被正常地激活并扩增。当使用流式细胞术表征时，检测到KO细胞的比例减少且KI细胞的比例增加。通过对经工程化的细胞实施选择性激活，可以将nwTCR的TCR基因编辑效率提高到50％以上。
在一些实施方案中，提供了T细胞的初级刺激信号和共刺激信号对经工程化细胞进行选择性激活。例如，将两种作用剂(即，提供初级刺激信号的作用剂和提供共刺激信号的作用剂)都固定在珠上，其中固定在相同的珠上，即“顺式”，或固定在不同的珠上，即“反式”。例如，提供初级刺激信号的作用剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的作用剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种作用剂以等同的分子数量被共同固定在相同珠上。在一个方面，使用与所述珠结合的每种抗体的1:1的比率，用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的一些实施方案中，使用与所述珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特别的方面，与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个方面，与所述珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100及其中所有整数值。在一个方面，与珠结合的抗CD28抗体比抗CD3抗体多，即CD3:CD28的比率少于1。在某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特别的方面，使用1:100的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在另一方面，使用1:75的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个进一步的方面，使用1:50的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。在另一个实施方案，使用1:30的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个方面，使用1:10的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个优选的方面，使用1:3的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在还有一个方面中，使用3:1的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。
在一个实施方案中，将本发明的经工程化细胞在所述选择性激活的培养中扩增几个小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)到约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一个实施方案中，细胞被扩增4至9天。在一个实施方案中，细胞被扩增8天或更短，例如，7、6或5天，并显示细胞扩增，例如至少1、2、3或4倍增加。
VI.预防或治疗人乳头瘤病毒感染的方法
本发明还提供了一种预防或治疗人乳头瘤病毒感染的方法，其包括对有需要的受试者施用本发明的工程化细胞、本发明的TCR核酸、载体或药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括给予编码TCR的多核苷酸。在一些实施方案中，该方法包括施用包含编码TCR的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，该方法包括施用有效量的本发明的工程化细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了预防或治疗人乳头瘤病毒(例如，HPV16)感染相关的疾病。所述人乳头瘤病毒(例如，HPV16)感染相关的疾病。在一些实施方案中，所述疾病的特征在于：与致癌HPV感染相关的上皮细胞异常，例如中空细胞病；角化过度；癌前状态，包括上皮内瘤变或上皮内病变；高度异型增生；和侵袭性或恶性癌症。可以治疗的HPV16相关疾病包括但不限于宫颈癌、子宫癌、肛门癌、结肠直肠癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、口咽癌、扁桃体癌、咽癌、喉癌、口腔癌、皮肤癌、食道癌、头颈癌如鳞状细胞癌(SCC)头颈癌或小细胞肺癌。
本发明提供了诱导抗肿瘤免疫的方法，其中所述肿瘤是人乳头瘤病毒感染所引起的肿瘤，所述方法包括给予受试者有效量的本发明的工程化细胞。
本发明提供了在受试者中诱导免疫应答的方法，包括给予有效量的本发明的工程化细胞。在一些实施方案中，免疫应答是T细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，T细胞介导的免疫应答针对一种或多种靶细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞包含本发明的TCR。在一些实施方案中，靶细胞是人乳头瘤病毒感染的细胞。
在一些实施方案中，用于T细胞治疗的供体T细胞从患者获得(例如，用于自体T细胞治疗)。在其它实施方案中，待分化为T细胞用于T细胞治疗的供体干细胞是从非患者的受试者获得的。
T细胞可以治疗有效量施用。例如，治疗有效量的T细胞可为至少约104个细胞、至少约105个细胞、至少约106个细胞、至少约107个细胞、至少约108个细胞、至少约109个细胞或至少约1010个细胞/kg体重。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。
实施例
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明的范围。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部进行了的实验或仅进行了的实验。
实施例1.人HPV特异性T细胞和TCR的生成和克隆
化学合成HPV16 E7第12-20位氨基酸序列的短肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:170)(文中也简称为“HPV16_E7_12-20肽”)。
使用HPV16_E7_12-20肽体外刺激来源于HLA-A02:01基因型且HPV阳性宫颈癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)。经过2轮HPV16_E7_12-20肽刺激后，将获得的多克隆T细胞(1×105个细胞)与1×105个负载有短肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:170)的T2细胞(靶细胞)或1×105个负载有非目标短肽的T2细胞(对照细胞)于37℃共培养过夜。第二天检测培养上清中细胞因子IFN-γ的释放量。所述T2细胞(CRL-1992，ATCC)是天然地表达人HLA-A0201的TAP2缺陷型淋巴母细胞，培养在增补有12％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠和非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中。
将阳性多克隆T细胞(靶细胞OD450－对照细胞OD450＞1.0)进行有限稀释克隆，14天后ELISA检测有限稀释后各孔T细胞与靶细胞的反应性。挑取阳性单克隆T细胞进行快速扩增。快速扩增14天后，使用基于流式细胞术的染色来评估克隆细胞系以肽特异性方式与标记的肽-MHC(HLA-A02:01)四聚体(MLDLQPETT-HLA-A02:01)的结合；含有无关肽的四聚体用作阴性对照，筛选到7个具有所需的高亲和力的特异性T细胞克隆，分别命名为nwTCR-0509、nwTCR-0511、nwTCR-0512、nwTCR-0513、nwTCR-0514、nwTCR-0625、nwTCR-0626。
对这7个T细胞克隆上的与HPV16_E7_12-20表位肽特异性结合的抗原特异性T细胞受体(TCR)使用高通量配对TCR测序，在单细胞基础上确定了这7个T细胞克隆上配对的TCRα链和β链的氨基酸序列。
由于多个核苷酸可以翻译成同一个氨基酸，在不同生物体中使用密码子频率是不同的，因此，对TCRα链和β链氨基酸序列的编码核苷酸进行了密码子序列优化，旨在于真核细胞中表达时增加TCR的表达量。获得了通过密码子优化后的特异性识别HPV16_E7_12-20表位肽的7个TCR的核苷酸序列。
表1A和表1B分别列出了测序生成的克隆T细胞系所表达的7个TCR的α链和β链的氨基酸序列信息以及通过密码子优化生成的核苷酸序列。
表1A.HPV特异性TCRα链的氨基酸和核苷酸序列
名称 氨基酸序列 核苷酸序列
nwTCR-0509完整TRA(TCRα链) SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65
nwTCR-0511完整TRA(TCRα链) SEQ ID NO:66 SEQ ID NO:67
nwTCR-0512完整TRA(TCRα链) SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:69
nwTCR-0513完整TRA(TCRα链) SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:71
nwTCR-0514完整TRA(TCRα链) SEQ ID NO:72 SEQ ID NO:73
nwTCR-0625完整TRA(TCRα链) SEQ ID NO:74 SEQ ID NO:75
nwTCR-0626完整TRA(TCRα链) SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:77
表1B.HPV特异性TCRβ链的氨基酸和核苷酸序列
名称 氨基酸序列 核苷酸序列
nwTCR-0509完整TRB(TCRβ链) SEQ ID NO:155 SEQ ID NO:156
nwTCR-0511完整TRB(TCRβ链) SEQ ID NO:157 SEQ ID NO:158
nwTCR-0512完整TRB(TCRβ链) SEQ ID NO:159 SEQ ID NO:160
nwTCR-0513完整TRB(TCRβ链) SEQ ID NO:161 SEQ ID NO:162
nwTCR-0514完整TRB(TCRβ链) SEQ ID NO:163 SEQ ID NO:164
nwTCR-0625完整TRB(TCRβ链) SEQ ID NO:165 SEQ ID NO:166
nwTCR-0626完整TRB(TCRβ链) SEQ ID NO:167 SEQ ID NO:168
实施例2.自T细胞制备人乳头瘤病毒特异性TCR-T细胞
本实施例描述了通过CRISPR/Cas9技术敲除原代T细胞中的TCR基因并通过同源重组技术敲入人乳头瘤病毒特异性TCR基因，由此制备并表征人乳头瘤病毒特异性TCR-T细胞。
2.1 T细胞的分选和激活
可以商业获得T细胞(例如，冷冻人外周血CD4+CD45RA+T细胞，Stem CellTechnology，目录号70029)或者自白细胞单采样本制备T细胞(Day 0)。
对于自白细胞单采样本制备T细胞，从白细胞单采样本中富集和分选CD4/CD8 T细胞。将富集和分选的CD4/CD8 T细胞等分并冷冻(5x106个细胞/冻存管)以便将来使用。
根据需要解冻冻存管，并且通过在T细胞培养基(例如，RPMI 1640、FBS、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、HEPES缓冲液、2-巯基乙醇和任选的IL2)中加入1:100倍稀释的T细胞激活剂Miltenyi T cell TransACT(Miltenyi目录号：130-111-160)对分选得到的T细胞进行激活，培养细胞约48小时(2天)后用于电穿孔转染。
2.2 sgRNA的设计
设计了多条sgRNA用来敲除人源T细胞的内源性T细胞受体α和β。对设计的多条sgRNA进行了敲除内源性T细胞受体(TCR)的筛选，获得了如下表所示的sgRNA识别位点和PAM序列。
表2.TRAC和TRBC基因对应的sgRNA
表2示出了CRISPR/Cas9识别位点是由20bp的crRNA序列和3bp的PAM(前间隔序列邻近基序)组成的，Cas9酶识别的PAM位点为NGG。
Cas9酶(购自：金斯瑞生物科技有限公司，目录号：Z03469)是两端带有NLS的Cas9核酸酶，相比只有一个NLS的Cas9核酸酶，更有利于入核发生基因编辑。针对TRAC基因，gRNA001的打靶位点位于内源性TRAC基因的外显子1的第23bp处(图1A)；针对TRAC基因，gRNA002的打靶位点位于内源性TRAC基因的外显子1的第2bp处(图1B)；针对TRBC基因，gRNA004的打靶位点设计在TRBC1和TRBC2基因的共同部分序列中。gRNA004的打靶位点位于内源性TRBC1和TRBC2基因的外显子1的第237bp处(图1C)。
2.3敲入(Knock-in，KI)外源性TCR序列的打靶载体制备
打靶载体(也称为HDR载体)上的待敲入TCR序列表达构建体结构为5’HA-P2A或其变体-SP-TCRβ-P2A或其变体-SP-TRAV-TRAJ-3’HA。
以nwTCR-0509为例，在使用gRNA002和gRNA004的技术方案中，打靶载体pUC57-S上的待敲入TCR序列表达构建体结构如下：5’HA-P2A-SP-TCRβ-P2A变体-SP-TRAV-TRAJ-3’HA(不包含Ori复制子和原核抗性基因)(SEQ ID NO:171)
其中：
HA为同源臂(5’HA如SEQ ID NO:172所示，3’HA如SEQ ID NO:176所示)；
P2A和P2A变体为可剪接的接头序列(分别如SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:175所示)；
SP为hGH信号肽序列(SEQ ID NO:174)；
TCRβ为nwTCR-0509完整TRB(TCRβ链)的核苷酸序列(SEQ ID NO:156)，其中将TRBCS77的编码核苷酸由AGC突变为TCC和将S78的编码核苷酸由AGC突变为TCC；
TRAV为nwTCR-0509TRAV基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)；
TRAJ为nwTCR-0509TRAJ基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)。
采用gRNA001和gRNA004时，经同源重组敲入后的片段中5’HA的3’端为TRAC基因的外显子1的第23bp处，3’HA的5’端为TRAC基因的外显子1的第24bp处。
采用gRNA002和gRNA004时，经同源重组敲入后的片段中5’HA的3’端为TRAC基因的外显子1的第2bp处，3’HA的5’端为TRAC基因的外显子1的第3bp处。
2.4.电穿孔转染(Day 2)
将实施例2.2设计并合成的sgRNA与Cas9酶充分混合，室温孵育10min，制备RNP。
将实施例2.3制备的含有KI TCR序列的打靶载体与孵育好的RNP、实施例2.1制备的指定浓度的T细胞(1.25E6/电击管)进行充分混合，以用于敲除(KO)内源性TCR和敲入(KI)外源性TCR。
将上述混合液装载到电穿孔转染仪(Celetrix；目录号：CTX-1500A LE)中进行细胞电穿孔转染，电穿孔转染的条件为480-560V，20ms。
电穿孔转染结束后，静置细胞15min后再取出经电穿孔转染的细胞，转移至预温的培养基中(ImmunoCultTM-XF T Cell Expansion Medium，Stemcell公司目录号：10981)。培养细胞5天后，于Day 7进行流式细胞术表征。
2.5.nwTCR表达的流式细胞术分析(Day 7)
充分混匀自实施例2.4.获得的细胞悬液，进行细胞计数，收集适量细胞进行标记的肽-MHC(HLA-A02:01)四聚体(MLDLQPETT-HLA-A02:01)四聚体染色。
提前配制好含有特异性抗原的标记的肽-MHC(HLA-A02:01)四聚体(MLDLQPETT-HLA-A02:01)染液及抗体染液，分别为LIVE/DEADTM Fixable Near-IR购自Invitrogen，目录号：L10119；CD4-FITC购自BioLegend，目录号：357406；CD8-PerCP-cy5.5购自BioLegend，目录号：344710；抗人TCRα/β-BV510抗体购自BioLegend，目录号：306734。
对收集的细胞进行标记的肽-MHC(HLA-A02:01)四聚体(即，MLDLQPETT-HLA-A02:01)染液染色，洗涤后，用流式细胞术进行表征。
对于采用gRNA002和gRNA004时，敲入实施例2.3的TCR序列表达构建体后，T细胞上的TCR结合标记的四聚体的染色结果如图2所示。可以看出，Day7的细胞分为三群:
1)未进行基因编辑的野生型T细胞(Q3)；
2)完成了内源性TCR敲除的KO细胞(Q4)；
3)完成了KO和KI，表达了nwTCR的细胞群(Q2)。
从图2中可以看出，CD8+T细胞中成功表达nwTCR的细胞占比为30％左右。
实施例3.对基因编辑效率的优化
为了提高基因编辑效率，在本实施例中，对实施例2的TCR-T细胞的制备方法实施了如下优化。
3.1.引入同义突变
本发明中TCR的基因编辑是通过CRISPR/Cas9技术和同源重组技术来完成的，如果打靶载体上存在与sgRNA一致的序列，则也会被Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNP)切割，即使对没有被切割的打靶载体，在其与细胞基因组完成同源重组后，RNP也可能对编辑成功的基因组回切。
本发明人在敲入sgRNA切割位点附近的打靶载体序列上引入同义突变，以避免打靶载体被RNP切割或对编辑成功的基因组产生回切。引入同义突变的数量会影响同源重组的效率从而影响基因编辑。本实施例采用gRNA001和gRNA004切割的情形对引入同义突变的数量进行了测试，比较了在gRNA001附近引入5个同义突变和3个同义突变的基因编辑效率。
通过流式细胞术检测CD8+T细胞的基因编辑效率。图3显示了相同敲入位点情况下引入不同数量的同义突变碱基时CD8+T细胞KI效率。
由图3可见，在采用gRNA001和gRNA004的打靶载体时，对打靶载体上的TRAC基因引入3个同义突变碱基且对打靶载体上的TRBC基因引入的4个同义突变碱基能够显著地提高打靶构建体的敲入功效。引入3个同义突变的基因编辑效率高于引入5个同义突变的基因编辑效率。
3.2.对基因敲入位点距离sgRNA切割位点的远近的优化
基因敲入位点距离sgRNA切割位点的远近也会影响基因重组进而影响基因编辑的效率。
本发明对采用gRNA001和gRNA004的KI位点距离sgRNA切割位点0bp和-9bp进行了测试。通过流式细胞术检测CD8+T细胞的基因编辑效率发现KI位点距离sgRNA切割位点0bp的基因编辑效率优于KI位点距离sgRNA切割位点-9bp的基因编辑效率。
本发明也对采用gRNA002和gRNA004的KI位点距离sgRNA切割位点-6bp和-3bp进行了测试。通过流式细胞术检测CD8+T细胞的基因编辑效率(图4)发现KI位点距离sgRNA切割位点-3bp的基因编辑效率优于KI位点距离sgRNA切割位点-6bp的基因编辑效率。
由图4可见，在打靶载体中含有相同数目的同义突变碱基时，KI位点距离sgRNA切割位点越小，则基因编辑效率越高，其中当KI位点距离sgRNA切割位点0bp时，具有最高的基因编辑效率。
3.3.对打靶载体中同源臂大小的优化
打靶载体中同源臂的大小也会影响同源重组进而影响基因编辑的效率。本发明构建了同源臂大小为1000bp、800bp、600bp、400bp和200bp的打靶载体并采用gRNA002和gRNA004切割的情形进行了测试，在Day7通过流式细胞术检测CD8+T细胞的基因编辑效率。
由图5可见，800bp同源臂的基因编辑效率较优于其他同源臂大小的，流式细胞术检测图见图6。
实施例4.对人乳头瘤病毒特异性TCR-T细胞的选择性激活
在Day7对实施例2和实施例3的人乳头瘤病毒特异性TCR-T细胞进行了选择性激活。
具体而言，充分混匀电穿孔转染之后培养的细胞悬液，进行细胞计数，收集适量的细胞准备进行选择性激活。将收集好的细胞离心、换液，并转移至新的培养容器中。按照1:500的体积比添加TransACT激活剂(Miltenyi目录号：130-111-160)，进行T细胞的选择性激活。继续培养细胞至Day14。使用在Day7未实施选择性激活的TCR-T细胞作为对照。
在Day14进行流式细胞术表征，得到基因编辑效率(nwTCR KI效率)。
如图7所示，对于选取的实施了nwTCR-0511KI的T细胞，当进行了选择性激活之后，nwTCR的KI效率有显著提升，其中CD8+T细胞的KI效率从15.20％(常规培养)提高至54.30％(选择性激活)，CD4+T细胞的KI效率从17.50％(常规培养)提高至55.80％(选择性激活)。由此表明了本方法可以适用于选择性激活基因编辑了TCR的T细胞，具有优异的nwTCR KI效率提高作用。
实施例5.人乳头瘤病毒特异性TCR-T细胞的体外功能性研究
在Day7对实施例2和实施例3的人乳头瘤病毒特异性TCR-T细胞进行了选择性激活，在Day14对各TCR-T细胞进行了体外功能性研究。
5.1流式细胞术表征各TCR-T细胞与肽-MHC复合物(pMHC)四聚体的结合
充分混匀细胞悬液，进行细胞计数，收集适量细胞。提前配制好含有特异性抗原的pMHC四聚体染液及其他抗体(LIVE/DEADTM Fixable Near-IR购自Invitrogen，目录号：L10119；CD4-FITC购自BioLegend，目录号：357406；CD8-PerCP-cy5.5购自BioLegend，目录号：344710；抗人TCRα/β-BV510抗体购自BioLegend，目录号：306734)染液。对收集的细胞进行染色，洗涤后，用流式细胞仪进行表征。
图8A-图8G为电穿孔转染不同nwTCR的CD4+,CD8+T细胞与pMHC四聚体染色结果。由图8A-图8G可见，分别敲入nwTCR-0509、nwTCR-0511、nwTCR-0512、nwTCR-0513、nwTCR-0514、nwTCR-0625、nwTCR-0626的各T细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞)均能够与肽-MHC复合物(pMHC)四聚体结合。
5.2各TCR-T细胞与肽结合的亲和力检测
如下实施TCR-T细胞亲和力检测方法。收集抗原呈递细胞细胞(T2细胞或K562细胞)，进行细胞计数，加适量培养基(如RPMI-1640培养基，购自Gibco，目录号：22400089；FBS，购自Gibco，目录号：10099141C)重悬细胞至细胞密度为1E6个/mL，分别加1mL细胞悬液到24孔板的每孔中。将待检测多肽溶液(所述多肽是SEQ ID NO:170所示的HPV16_E7_aa12-20)进行梯度稀释到10-10-10-3M，并分别加10ul稀释后的多肽溶液到24孔板对应孔中，在培养箱(37℃，5％CO2)中孵育2h后，将孵育好的抗原呈递细胞收集洗涤，取100ul 1E6/mL的抗原呈递细胞至96孔板对应孔中。收集待检测的nwTCR-T细胞，加适量T细胞培养基(购自STEMCELL，目录号：10981)至细胞密度为1E6/mL，加100ul细胞悬液至中96孔板对应孔中。将T细胞与抗原呈递细胞共培养(37℃，5％CO2)16h后，收集细胞上清用ELISA试剂盒(购自Biolegend，目录号：430104)检测IFN-γ浓度。通过检测IFN-γ的释放水平来检测表达各nwTCR的T细胞对HLA-A02:01呈递的SEQ ID NO:170所示短肽的结合亲和力。
图9A和图9B显示了分别表达各nwTCR的T细胞的亲和力检测实验结果。呈递肽-MHC复合物的T2细胞与表达各nwTCR的T细胞共孵育后，检测到表达各nwTCR的T细胞与肽-MHC复合物特异性结合，导致了IFN-γ释放。
5.3各TCR-T细胞对靶细胞的杀伤
如下实施各TCR-T细胞对靶细胞的杀伤检测方法。收集靶细胞(为CaSki细胞系(获自中国科学院细胞库))，细胞计数后用靶细胞培养基(如：RPMI-1640培养基，购自Gibco，目录号：22400089，FBS，购自Gibco，目录号：10099141C)重悬靶细胞至细胞密度为1E6个细胞/mL。准备E-plate(获自Agilent，目录号：300600890)，在对应孔中加入100μL混合均匀的靶细胞悬液后，将其放入至RTCA实时细胞分析仪(real-time cell analyzer)(购自Agilent，型号：xCELLigence RTCA DP)中，过夜检测。
收集待检测的T细胞，细胞计数后加适量T细胞培养基(购自STEMCELL，目录号：10981)重悬细胞。取出上述接种有靶细胞的E-plate，按照图10所示的相应效靶比加入T细胞悬液，将E-Plate放回到RTCA分析仪中检测，得到72小时的细胞指数。每一个独立的实验分三次进行。利用RTCA软件自动计算区间斜率，评价细胞指数的变化率。为了证明处理的效果，在标准化时间点将细胞指数标准化为相等的值。
各TCR-T细胞对宫颈癌CaSki细胞(HLA-A*02:01,HPV16+)在不同E:T比下的体外杀伤结果如图10所示。
由图10可见，各TCR-T细胞对作为靶细胞的CaSki细胞系显示出显著的体外杀伤效果。
以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。
序列表
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Claims (36)

1.分离的或纯化的T细胞受体，所述T细胞受体也简称为TCR，其特征在于，与人乳头瘤病毒E7特异性结合，所述TCR包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区，所述互补决定区也简称为CDR，其中，所述α链包含的三个CDR的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列分别是：SEQ ID NO:1、2、3所示的α链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列；以及SEQ ID NO:78、79、80所示的β链CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的TCR，其中，所述TCR还包含恒定区。
3.根据权利要求2所述的TCR，其中，所述恒定区是小鼠恒定区。
4.根据权利要求2所述的TCR，其中，所述TCR包含与SEQ ID NO:64所示的α链序列具有至少90％同一性的序列；和与SEQ ID NO:155所示的β链序列具有至少90％同一性的序列。
5.根据权利要求4所述的TCR，其中，所述TCR包含与SEQ ID NO:64所示的α链序列具有至少95％同一性的序列；和与SEQ ID NO:155所示的β链序列具有至少95％同一性的序列。
6.根据权利要求5所述的TCR，其中，所述TCR包含SEQ ID NO:64所示的α链序列和SEQID NO:155所示的β链序列。
7.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1－6任一项所述的TCR。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其为SEQ ID NO:65所示的α链核苷酸序列和SEQ IDNO:156所示的β链核苷酸序列。
9.载体，其特征在于，包含权利要求7或8所述的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的载体，其为质粒。
11.根据权利要求9所述的载体，其为噬菌粒或粘粒。
12.根据权利要求9所述的载体，其为同源重组修复载体或病毒载体。
13.根据权利要求12所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
14.根据权利要求12所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体或杆状病毒载体。
15.一种核酸分子，其中，所述核酸分子从N端到C端包含：
(i)编码第一可裂解接头多肽的序列；
(ii)编码权利要求1－6任一项所述TCR的β链的序列；
(iii)编码第二可裂解接头多肽的序列；
(iv)编码权利要求1－6任一项所述TCR的α链可变区的序列；
其中，所述第一可裂解接头多肽和所述第二可裂解接头多肽是相同或不同的病毒2A肽；
其中，所述核酸分子用于插入人细胞中内源性TCRα链恒定区基因的外显子1的靶区域中。
16.一种核酸分子，其中，所述核酸分子从N端到C端包含：
(i)编码第一可裂解接头多肽的序列；
(ii)编码第一信号肽和权利要求1－6任一项所述TCR的β链的序列；
(iii)编码第二可裂解接头多肽的序列；
(iv)编码第二信号肽和权利要求1－6任一项所述TCR的α链可变区的序列；
其中，所述第一可裂解接头多肽和所述第二可裂解接头多肽是相同或不同的可裂解接头多肽；所述第一信号肽和所述第二信号肽是相同或不同的信号肽；
其中，所述核酸分子用于插入人细胞中内源性TCRα链恒定区基因的外显子1的靶区域中。
17.根据权利要求15或16所述的核酸分子，其中，所述第一可裂解接头多肽和所述第二可裂解接头多肽是2A核糖体跳跃元件。
18.根据权利要求17所述的核酸分子，其中，所述2A核糖体跳跃元件是T2A、E2A、P2A或F2A。
19.根据权利要求15或16所述的核酸分子，其中当所述核酸分子通过同源定向DNA修复而插入人细胞中内源性T细胞受体(TCR)α链恒定区基因的外显子1的靶区域中时，所述核酸分子的5’末端和3’末端还包含与侧接靶区域的基因组序列同源的5’同源臂和3’同源臂核苷酸序列。
20.根据权利要求19所述的核酸分子，其中，所述5’同源臂和3’同源臂核苷酸序列分别是与侧接靶区域的250－3250个核苷酸长度的基因组序列同源的核苷酸序列。
21.一种组合物，所述组合物包含：
(i)第一引导RNA，其靶区域中的打靶位点位于内源性TRAC基因的外显子1，识别位点为SEQ ID NO:177或SEQ ID NO:178所示的序列；
(ii)第二引导RNA，其靶区域中的打靶位点位于内源性TRBC1基因和TRBC2基因的共有序列中，识别位点为SEQ ID NO:179所示的序列；
(iii)CRISPR相关蛋白或编码该CRISPR相关蛋白的核酸；
(iv)权利要求19或20所述的核酸分子，其中，在同源臂中的TRAC基因编码的SEQ IDNO:50所示氨基酸序列中，TRAC A8的编码核苷酸为GCT、TRAC V9的编码核苷酸为GTC、TRACY10的编码核苷酸为TAT和/或TRAC R13的编码核苷酸为CGC；和/或在TRBC1或TRBC2基因编码的SEQ ID NO:141所示氨基酸序列中，TRBC S77的编码核苷酸为TCC和/或TRBC S78的编码核苷酸为TCC。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，在所述第一引导RNA两端修饰1-10bp碱基数，所述修饰为甲氧基修饰，或硫代磷酸和甲氧基修饰，或硫代乙酰胺和甲氧基修饰；在所述第二引导RNA两端修饰1-10bp碱基数，所述修饰为甲氧基修饰，或硫代磷酸和甲氧基修饰，或硫代乙酰胺和甲氧基修饰。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述CRISPR相关蛋白为SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述CRISPR相关蛋白还包含C端和/或N端的1-10个核定位信号。
25.根据权利要求21所述的组合物，所述组合物包含：
(i)第一引导RNA，其识别位点为SEQ ID NO:177所示的序列；且在其前3bp和tracrRNA末端的最后3bp为硫代磷酸和甲氧基修饰；
(ii)第二引导RNA，其识别位点为SEQ ID NO:179所示的序列；且在其前3bp和tracrRNA末端的最后3bp为硫代磷酸和甲氧基修饰；
(iii)CRISPR相关蛋白或编码该CRISPR相关蛋白的核酸，其中，该CRISPR相关蛋白是C端和N端各为1个核定位信号的Cas9核酸酶，其与第一引导RNA组合时识别的PAM是AGG，其与第二引导RNA组合时识别的PAM是GGG；
(iv)权利要求19或20所述的核酸分子，其中，在同源臂中的TRAC基因编码的SEQ IDNO:50所示氨基酸序列中，TRAC A8的编码核苷酸为GCT、TRAC V9的编码核苷酸为GTC和TRACY10的编码核苷酸为TAT；或者TRAC A8的编码核苷酸为GCT、TRAC V9的编码核苷酸为GTC、TRAC Y10的编码核苷酸为TAT和TRAC R13的编码核苷酸为CGC；和在TRBC1或TRBC2基因编码的SEQ ID NO:141所示氨基酸序列中，TRBC S77的编码核苷酸为TCC和TRBC S78的编码核苷酸为TCC；
以及，(i)第一引导RNA的切割位点与(iv)权利要求19或20所述的核酸分子的敲入位点之间的距离为0bp至9bp；且5’同源臂和3’同源臂分别是与侧接靶区域的800－1000个核苷酸长度的基因组序列同源的核苷酸序列；或者
所述组合物包含：
(i)第一引导RNA，其识别位点为SEQ ID NO:178所示的序列；且在其前3bp和tracrRNA末端的最后3bp为硫代磷酸和甲氧基修饰；
(ii)第二引导RNA，其识别位点为SEQ ID NO:179所示的序列；且在其前3bp和tracrRNA末端的最后3bp为硫代磷酸和甲氧基修饰；
(iii)CRISPR相关蛋白或编码该CRISPR相关蛋白的核酸，其中，该CRISPR相关蛋白是C端和N端各为1个核定位信号的Cas9核酸酶，其与第一引导RNA组合时识别的PAM是GGG，其与第二引导RNA组合时识别的PAM是GGG；
(iv)权利要求19或20所述的核酸分子，其中，在TRAC基因编码的SEQ ID NO:50所示氨基酸序列中，TRAC A8的编码核苷酸为GCC、TRAC V9的编码核苷酸为GTG、TRAC Y10的编码核苷酸为TAC和TRAC R13的编码核苷酸为AGA；和在TRBC1或TRBC2基因编码的SEQ ID NO:141所示氨基酸序列中，TRBC S77的编码核苷酸为TCC和TRBC S78的编码核苷酸为TCC；
以及，(i)第一引导RNA的切割位点与(iv)权利要求19或20所述的核酸分子的敲入位点之间的距离为0bp至9bp；且5’同源臂和3’同源臂分别是与侧接靶区域的800－1000个核苷酸长度的基因组序列同源的核苷酸序列。
26.一种工程化细胞，其特征在于，表达权利要求1－6任一项所述的TCR。
27.根据权利要求26所述的工程化细胞，其中，所述工程化细胞是工程化的T细胞、工程化的NK细胞；或者所述工程化细胞是工程化的造血干细胞。
28.根据权利要求27所述的工程化细胞，其中，所述工程化细胞是工程化的人CD4+辅助T细胞或工程化的人CD8+细胞毒性T细胞，或者是工程化的人CD4+辅助T细胞和工程化的人CD8+细胞毒性T细胞的混合细胞群。
29.根据权利要求26－28任一项所述的工程化细胞的制备方法，其包括：将权利要求20－25任一项所述的组合物转染入细胞中。
30.根据权利要求29所述的制备方法，其中，将权利要求21－25任一项所述的组合物通过电穿孔转染入细胞中。
31.根据权利要求29或30所述的制备方法，其还包括：使用提供初级刺激信号的作用剂和提供共刺激信号的作用剂对经转染的细胞进行选择性扩增。
32.根据权利要求31所述的制备方法，其中，所述提供初级刺激信号的作用剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，所述提供共刺激信号的作用剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段。
33.药物组合物，其特征在于，包含权利要求26－28任一项所述的工程化细胞。
34.根据权利要求33的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防人乳头瘤病毒16感染的药物和/或用于制备治疗人乳头瘤病毒16感染相关的疾病的药物。
35.根据权利要求34所述的用途，其中，人乳头瘤病毒16感染相关的疾病是宫颈病变。
36.根据权利要求34所述的用途，其中，人乳头瘤病毒16感染相关的疾病是宫颈癌。
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