JPH10511542A

JPH10511542A - 標的化ｔリンパ球

Info

Publication number: JPH10511542A
Application number: JP8515856A
Authority: JP
Inventors: ストリンガー，ブラッドリー，マイケル，ジョン
Original assignee: ストリンガー，ブラッドリー，マイケル，ジョン
Priority date: 1994-11-16
Filing date: 1995-11-16
Publication date: 1998-11-10
Also published as: EP0792354A1; EP0792354B1; HUT77472A; AU3875495A; KR970707280A; CA2203934A1; CZ144297A3; DE69529473T2; DE69529473D1; MX9703535A; WO1996015238A1; GB9423085D0; NZ295418A; DK0792354T3; PT792354E; ATE231550T1; ES2191065T3; CZ289455B6; AU687271B2

Abstract

(57)【要約】標的化細胞毒性Ｔリンパ球は、病気誘発標的細胞へのＭＨＣクラスＩ制限特異性をリンパ球に付与する異種αおよびβペプチドからなるＴｃＲを有する。このリンパ球は、単一クラスの標的細胞への特異性を付与する単一種のＴｃＲを有し、単価である。このリンパ球は、ワクチンとして、および養子免疫療法、例えば癌、ＡＩＤＳまたは抗ウイルス治療に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】標的化Ｔリンパ球本発明は、標的化細胞毒性Ｔリンパ球およびその用途に関し、特に、病気誘発標的細胞にＭＨＣ制限特異性を与える異種αおよびβ−Ｔ細胞抗原レセプターポリペプチドを有する標的化細胞毒性Ｔリンパ球に関する。免疫系は、体中に分布する複数の異なる細胞型および分子を含む。健康な個体において、免疫系は、侵入してくる病原体、寄生虫および感染したまたは癌性の細胞に対する防御および保護を行う。免疫系の幾つかの基本的性質（反応の免疫的記憶、特異性および多様性を含む）の原因となる細胞性主成分はリンパ球である。リンパ球は二つのクラス、すなわち、体液性反応（可溶性抗体により媒介される）の発生の究極的原因となるＢリンパ球（またはＢ細胞）および細胞媒介反応の発生の究極的原因となるＴリンパ球（またはＴ細胞）に分けられる。Ｔ細胞は、さらに、特に細胞毒性Ｔリンパ球（感染、異常または悪性標識細胞を認識し殺す）およびヘルパーＴ細胞（免疫反応の実施に含まれる広範囲の細胞型を刺激、回復および活性化する）に分けられる。Ｔリンパ球はＴ細胞レセプター（以下、ＴｃＲｓと呼ぶ）を介して標識細胞を認識する。ＴｃＲｓは、通常、抗原単体には結合しない。むしろ、ＴｃＲｓは、主要組織適合性複合体のクラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子（以下、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩと呼ぶ）により符号化される細胞表面糖タンパク質複合体の一部として抗原を認識する。細胞毒性Ｔリンパ球は、通常、ＭＨＣクラスＩと共に抗原を認識するが、ヘルパーＴリンパ球は、通常、ＭＨＣクラスＩＩと共に抗原を認識する。その結果、Ｔリンパ球標的細胞の認識は、特別の宿主タンパク質（すなわち、クラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ分子）と共に抗原を示すことのできる標的細胞に限定される。従って、Ｔリンパ球の主要な役割は、体内の細胞表面において異常、感染または悪性細胞が認識され（または、ヘルパーＴ細胞の場合は検出され）、最終的に除去されるのをモニターすることと考えることができる。Ｔ細胞レセプター（ＴｃＲ）ＴｃＲはタンパク質複合体であり、その一つの型は、他の分子と共にＴリンパ球細胞表面に結合している二つのジスルフィド架橋ポリペプチド鎖（αおよびβ 鎖）を含む。ＴｃＲのαおよびβ鎖は、抗原およびＭＨＣ（クラスＩまたはクラスＩＩのもの）特異性の両方をＴリンパ球に付与するのに充分であり：従って、ＴｃＲのαおよびβ成分だけが、二重（すなわちＭＨＣおよび抗原）のＴリンパ球特異性を完全に定めることを要求される。 αおよびβ鎖は、イムノグロブリンＶおよびＣ領域に相同性の定常および可変領域を含み、対応する構造遺伝子はイムノグロブリン遺伝子に類似のＤＮＡ配列をとる。実際に、イムノグロブリンおよびＴｃＲｓの構造量は似ている（一つ当たり約１０¹²）。ＴｃＲのαおよびβ鎖を符号化する遺伝子がクローニングされ配列された（例えば、ロバートソン（Robertson）（1985年）、ネイチャー317巻、768〜771頁を参照）。さらに、ＴｃＲαおよびβ鎖遺伝子が一つのＴ細胞からもう一つのＴ細胞に転移されて特異性の異なるＴ細胞クローンが生成された（例えば、デムビック（Dembic）ら、1986年、ネイチャー320巻、232〜238頁を参照）。ＴｃＲｓはクローン的に分布しており：各Ｔリンパ球のＴｃＲｓは一つの抗原決定基にのみ特異的である（各細胞上には数十万のＴｃＲの同じ種が存在し得るが）。すなわち、各Ｔリンパ球は、普通、ＴｃＲ媒介結合に関して一価である。 αおよびβ鎖は、ＣＤ３複合体および結合しているゼータおよびイータペプチドのタンパク質を含む幾つかの他の分子と結合している。ＴｃＲ−ＣＤ３複合体は、適当なペプチド−ＭＨＣ複合体を認識してときに、ＴｃＲからの信号をＴリンパ球の内側に導入し、Ｔ細胞の活性化に役立つ。異常遺伝子発現、病気およびＴ細胞反応個体の健康は、幾千の異なる遺伝子の同等の厳しく制御された発現に依存する。遺伝子発現の異常または変化は、たとえ僅かであっても、癌、エイズおよび種々の自己免疫疾患を含む異なる病気の多血症を引き起こし得る。多くの異なる因子が異常遺伝子発現を誘発し得る。例えば、内因性の遺伝子の発現またはそれにより符号化されるタンパク質の構造は突然変異により変化し得る。そのような突然変異は自発的であってよいが、環境中に存在する発癌物質により誘発されることが多い。また、外因性遺伝材料の個体の細胞への導入（例えば、ウイルス感染の結果として）により、遺伝発現パターンの崩壊、通常はサイレントな遺伝子の活性化および／または異種（例えばウイルス性の）タンパク質の合成が起こり得る。遺伝子発現において誘発された異常の結果の一つの重要な例は、腫瘍の形成である。腫瘍の形成は大部分の癌を特性付け、身体細胞における腫瘍遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子の突然変異に付随する外因性遺伝子の過発現または構造変化の結果として腫瘍が発生する。例えば、ある型の乳癌において、腫瘍形成は、ＨＥＲ−２／神経プロト癌遺伝子の過発現および増幅から生じる。有機体レベルでの病気の開始とは異なり、異常遺伝子発現の別の表現型の結果は腫瘍抗原の生成である。本明細書で用いられる「腫瘍抗原」という用語は、突然変異のまたは異種のアミノ酸配列から生じる新しい抗原のみならず、通常はサイレントな野生型遺伝子の発現または通常は比較的弱く発現される野生型遺伝子の過発現から生じる「新しい」抗原も含むことを意図する。腫瘍抗原の生成は、細胞表面抗原に変化を生じさせることができ、その変化が次に免疫反応を誘発させ得る。例えば、腫瘍患者の血清において腫瘍遺伝子生成物に対する抗体が発見されており、腫瘍細胞を認識し除去する細胞毒性Ｔリンパ球が多くのモデル系において示されている。細胞毒性Ｔリンパ球により認識することのできるペプチド−ＭＨＣクラス−Ｉ複合体の一部として細胞表面に示され得るペプチドフラグメントを生成するための突然変異、異種または過発現タンパク質の細胞内加工に続いて、細胞毒性Ｔリンパ球反応を誘発することのできる細胞表面抗原における変化が生じ得る。このようにして、Ｔリンパ球により異常細胞が認識され除去され得る。細胞表面抗原における変化に加えて、タンパク質過発現、異種（例えば、ウイルス由来）または突然変異タンパク質生成は、究極的に外因性の腫瘍抗原（例えば、ウイルス粒子またはフラグメント）の出現につながり得る。これらは、Ｂリンパ球の表面上の薄膜結合イムノグロブリンにより認識され、内在化され、加工され、続いてＢ細胞の表面におけるＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体としてのヘルパーＴ細胞抗原として現され得る。このように抗原を現すＢ細胞は、特異性ＴｃＲペプチドＭＨＣクラスＩＩ相互作用を介してヘルパーＴ細胞により認識され得、外因性抗原に特異性の可溶性抗体を多量に分泌する血漿細胞内に進行するように刺激され得る。このようにして、ヘルパーＴリンパ球は、体液性免疫反応を刺激し、広範囲の免疫細胞型を間接的に活性化することができる。腫瘍特異性または腫瘍関連腫瘍抗原の多くの報告がある。例えば、ＥＲＢＢ２レセプターの過発現は、多くの人の乳および子宮癌に関連しており、細胞表面におけるＥＲＢＢ２起因腫瘍抗原の出現にもつながる。結腸癌において、腺腫性結腸ポリポーシス症（ＡＰＣ）遺伝子は、通常、初期突然変異を行う。突然変異は、しばしば、単に停止コドン（翻訳を終了させてサイ形ＡＰＣタンパク質を生成させる）の導入につながってしまうが、多くの場合、突然変異は、新しいタンパク質配列および潜在的独自抗原の生成につながる枠シフトである。一旦細胞内で加工されＭＨＣタンパク質に結合すると、そのような抗原は細胞表面において現されＴリンパ球により認識される。他の多くの場合において、外因性タンパク質の構造変化または過発現が、これらのタンパク質の細胞内加工における変化および細胞表面上におけるＭＨＣタンパク質と付随する腫瘍抗原の発現につながることが期待される。前記異常遺伝子発現の免疫抗原性結果に拘わらず、感染、異常または悪性細胞と戦うようにされる天然免疫反応は不適当なことが多い。この失敗の理由は充分に理解されていないが、腫瘍抗原は組織特異性抗原としての免疫系によりしばしば処理され同様にそのように耐性があると考えられる。さらに、腫瘍抗原は、通常、ＭＨＣクラスＩ誘導加工のためにペプチドの微量原料しか構成せず、そのため腫瘍抗原の加工および出現は極めて非効率的である。最後に、免疫抗原性は、腫瘍抗原が発現される組織型により部分的に決められるようであり、そのためその耐性はある組織型において大きくなり得る（および／または加工および出現の効率が低い）ようである。異常、感染または悪性細胞標的に対するより効果的な免疫反応を発生させるために幾つかの手段が開発された。例えば、腫瘍特異性細胞媒介免疫を誘発させるためのワクチンとして悪性細胞からの抗原を用いることが提案されている。さらに最近では、癌治療の一つの方式として養子免疫療法が提案されている。この方式の治療は抗腫瘍活性を有する免疫細胞の癌患者への移入に基づく。使用する免疫細胞は、癌患者から採種され、培養され、増殖後、組織培地に再度導入される。養子免疫療法において使用される細胞は、リンフォカイン活性化キラー細胞、腫瘍浸潤リンパ球、および細胞毒性Ｔリンパ球から誘導された生体外感作化リンパ球を含む。リンフォカイン活性化キラー細胞は、広範囲の標的細胞と反応する細胞溶解細胞である。それらはＭＨＣ限定的でなく、腫瘍細胞および正常細胞の療法を溶解する。従って、これらの細胞の使用に基づく治療は、腫瘍細胞を殺すことが正常組織への大きな損害を伴うという不利益を被る。腫瘍浸潤リンパ球は、腫瘍組織から誘導される。それらは、リンフォカイン活性化キラー細胞よりも性能が優れ、最初の腫瘍に比較的特異的であり、それによりリンフォカイン活性化キラー細胞の使用に関連する正常組織の非選択的切除から生じる問題を避ける。しかしながら、これらの細胞の有用性は、腫瘍組織および生体外のそれらの増幅物におけるそれらの自然発生に基づいて厳しく制限される。すなわち、これらの細胞の使用に基づく治療は一部の場合にのみ利用できる。前記養子免疫療法の各々が腫瘍の後退をある程度媒介し得ることが示されている一方、幾つかの場合にしか治療的反応が観察されていない(および治療した患者の一部においてしか示されなかった)。細胞毒性Ｔリンパ球の認識特異性を生体外で操作してそれらに一定の腫瘍細胞特異性を付与することによりリンパ球媒介腫瘍治療の効果を向上させることが提案されている（モリツ（Moritz）ら、（1994年）、PNAS、91巻、4318〜4322頁）。モリツらは、（ヒンジを介して）ＴｃＲ複合ゼータ鎖に（結合特異性を付与するために）結合している単一鎖抗体を含む全体的に合成の「プソイドレセプター」を形成するためにＴｃＲ系（および従ってＭＨＣ制限）特異性を操ることにより、この問題を解決しようとした。合成プソイドレセプターを有する細胞毒性Ｔ細胞が、抗体成分により付与される特異性を有するＭＨＣ非依存性認識を示すことがわかった。しかしながら、全体的に合成のプソイドレセプターの使用は、非効率的信号導入およびＴ細胞活性の低下につながるようである。さらに、モリツらの文献に記載されている標識化細胞毒性Ｔリンパ球の認識特異性はＭＨＣ非依存性なので、リンパ球による細胞表面走査の効率は低下するようである。最後に、合成プソイドレセプターは、それ自体、望ましくない免疫反応を引き出すかもしれない。本発明の目的は、例えば、全体的に合成のプソイドレセプターを発現しないでその代わりに構造が正常ＴｃＲに本質的に類似しているＴｃＲを介して標的化される養子免疫治療において使用される別の標的化Ｔリンパ球を提供することにある。従って正常信号導入経路は保存され、望ましくない免疫反応の危険性は最小化される。さらに、本発明の標的化Ｔ細胞はＭＨＣ制限されているので、それらは細胞表面を異常抗原について効果的に走査することができる。従って、本発明は、病気誘発標的細胞についてのＭＨＣクラスＩ制限特異性をリンパ球上に付与する異種αおよびβポリペプチドを含むＴｃＲを有する標的化細胞毒性Ｔリンパ球を提供する。本明細書で用いられる「異種αおよびβＴｃＲポリペプチド」という用語は、Ｔ細胞中において正常に発現されないαおよびβＴｃＲ鎖を示すことを意図する。一つの態様において、異種ＴｃＲポリペプチドは、組み替えまたは全体的合成ＤＮＡの発現により誘導されるキメラまたは合成分子である。他の態様において、異種ＴｃＲポリペプチドは、もう一つのＴ細胞から（例えばＴｃＲ遺伝子ライブラリーを介して）直接的または間接的に誘導される。他のＴ細胞は、要求される特異性のＴｃＲ成分を発現する限りそれ自体いかなる源からも誘導され得る。例えば、他のＴ細胞は、同じ種から（または同じ個体からさえ）、あるいは異なる種からのものであってよい。それはＴ細胞ハイブリドーマであってもよい。病気誘発標的細胞の特異性は絶対的である必要はない。本発明の目的のために、特異性が、正常または非病気組織のいかなる付随的自己免疫型切除も患者により耐えうるようなものであれば充分である。例えば、病気誘発細胞が、それ自体なくても済む特別の組織の全ての要素である環境において、標的化Ｔリンパ球がその組織について効果的に特異的であるなら充分である。これは、標的化病気誘発細胞が悪性前立腺腫瘍細胞である場合であり、ここで、正常および癌性前立腺細胞の両方を切除（一方で、他の組織は影響されないまたはより低く許容できる程度に切除され）する充分な特異性で細胞毒性Ｔ細胞が標的化されれば充分である。もう一つの例は黒色腫であるが、網膜、脳および内耳の特定の細胞において一部のメラノサイト特異性抗原も現れ、これら後者の細胞はメラノサイト特異性抗原を基準とする免疫治療への感受性がより低いようである。絶対的特異性が要求されないもう一つの状況が生じ、そこでは特別の腫瘍の正常組織対応部分が非常に低い水準でＭＨＣクラスＩを発現し、それにより細胞毒性Ｔ細胞攻撃からの遮蔽が成される。本明細書における「病気誘発細胞」という用語は、病気に直接含まれる細胞（例えば、腫瘍細胞または自己免疫細胞）のみならず病気の進行に関係するまたは病状の促進または維持を助ける細胞（例えば、ウイルス的感染細胞）を示すために広い意味で用いられる。従って、それはともかく個体の健康に有害であり異常であるいかなる細胞も含む。本発明の標識化細胞毒性Ｔリンパ球は、例えばウイルスベクターで形質導入される組み替え型である。本発明の標識化細胞毒性Ｔリンパ球は、好ましくは、単一クラスの標識細胞について単一種のＴｃＲ付与ＭＨＣクラスＩ制限特異性を有する標識化細胞に関して一価である。そのような一価リンパ球は、例えば、残留（または内因性）αおよびβ鎖遺伝子を（補足するよりむしろ）必要な特異性を付与する異種αおよび β鎖で置換することにより生成され得る。本発明の一価リンパ球は、任意の利用できる広範囲の技術により内因性ＴｃＲの発現を抑制または遮断することによっても生成され得る。例えば、標的化挿入突然変異誘発を用いて内因性ＴｃＲ遺伝子を破壊することができる。一価リンパ球の使用は、不釣り合いの（および従って不活性および／または非選択的）αおよびβダイマーの形成から生じる問題を避ける。そのような不活性ヘテロダイマーの形成は、標的細胞の認識および溶解を損なうまたは防止し得るＴｃＲの活性細胞表面密度を低下させる。本発明のリンパ球の一価性を確保することにより、ＴｃＲの細胞表面密度が最適化される。しかしながら、ある環境においては、二つ以上のクラスの標的細胞へのＭＨＣクラスＩ制限特異性を一緒に付与する二つ以上の異種のＴｃＲを有する多価細胞毒性Ｔリンパ球を提供することが好ましいまたは好都合であり得る。そのような多価リンパ球は、例えば、残留αおよびβ鎖に（置換するよりむしろ）必要な特異性を付与する一または二対の異種αおよびβ鎖を補足することにより生成され得る。本発明の多価標的化細胞毒性Ｔリンパ球は、二つ以上の異なるクラスの標的細胞を標的にする必要がある環境において特別の用途を見いだし得る。本発明の標的化細胞毒性Ｔリンパ球が多価である場合、異種αおよびβＴｃＲポリペプチドは好ましくは単一融合ポリペプチドとして提供される。これは、不適合な（および従って不活性および／または非選択的）αおよびβダイマーの形成を防止して、前述の低下した有効細胞表面ＴｃＲ密度に係わる問題を避ける。標的細胞は、好ましくは、腫瘍細胞、自己免疫反応に寄与する細胞および／または病因に感染された細胞（および特に、ウイルス感染細胞）を含む。特に好ましい態様において、標的細胞は、ＨＩＶ感染リンパ球を含む。他のウイルス感染は、肝炎（例えばＢ型、Ｃ型肝炎および非Ａ非Ｂ型肝炎）およびウイルス誘発バーキットリンパ腫を含む。異種αおよびβＴｃＲポリペプチドはキメラであり得、例えば、イムノグロブリン可変領域またはそのフラグメントを含み得る。そのようなキメラＴｃＲは、ＴｃＲのαおよびβ鎖の定常および可変領域とイムノグロブリンＶおよびＣ領域との間の親密な構造的類似性を利用する。そのようなキメラαおよびβＴｃＲポリペプチドの使用は、（例えば、既知のまたは予想されるＴ細胞抗原への抗体を生じさせることにより）必要な特異性を示すイムノグロブリンが利用できるまたは容易に得ることができる場合に、特に好都合であり得る。もう一つの局面において、本発明は、（ａ）病気誘発標的細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡ（例えば、ドナー細胞毒性Ｔリンパ球から誘導されるＤＮＡ）を含むベクターを提供する工程、および（ｂ）受容体細胞毒性Ｔリンパ球を工程（ａ）のベクターでトランスフェクトして病気誘発標的細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡを有する組み換え細胞毒性Ｔリンパ球を生成する工程を含んでなり、それにより工程（ｂ）の組み換え細胞毒性Ｔリンパ球がαおよび βＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡを発現してリンパ球にＭＨＣクラスＩ制限特異性を付与し、それによりリンパ球を標的細胞に向ける、本発明の標的化細胞毒性Ｔリンパ球の生成方法も提供する。工程（ａ）のベクターは、病気誘発標的細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡをクローニングする、集めるまたは合成する（例えば、固相オリゴヌクレオチド合成）ことにより提供することができる。好ましくは、αおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡは、（ａ）例えば、血液バンク、血液サンプルまたは腫瘍バイオプシーからドナーＴリンパ球のサンプルを得、（ｂ）例えば、特異的誘発増殖および／または特異的クローン拡大により、病気誘発標的細胞に特異性を有する細胞毒性Ｔリンパ球のためのドナーＴリンパ球のサンプルを増加させ、（ｃ）ドナー細胞毒性Ｔリンパ球から染色体ＤＮＡを抽出し、および（ｄ）例えば、プライマー特異性ＰＣＲ増幅によりｏおよび３ＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡを単離することによりクローニングされる。ベクターは、任意の適当な方法によって受容体細胞毒性Ｔリンパ球に導入することができる。エレクトロポレーションによるトランスフェクション、プロトプラスト融合またはウイルス（例えば、レトロウイスル）トランスフェクションを含む多くの異なる方法が当業者に知られている。さらなる局面において、本発明は、病気誘発細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡを含んでなる、本発明の方法において用いるためのベクターにも関する。このベクターのＤＮＡは、好ましくは、単一または複数の発現要素に操作可能に結合して、適当な水準でＴｃＲポリペプチドの発現を提供することができる。操作可能に結合されている遺伝子の発現を（少なくともある環境下において）導くおよび／または制御するようにし得る限り、任意の広く種々の発現要素を用いることができ、その要素はいかなる形状をとることもできる。単一または複数の発現要素は、例えば、転写および／または翻訳要素を含み、プロモータ、リボゾーム結合部位、エンハンサー、およびアクチベーターおよびリプレッサー（オペレーター）部位を含む制御部位を含む。単なる例として、本発明で用いるための発現要素は、αおよび／またはβＴｃＲペプチド遺伝子と天然に結合しているものから選択することができる。都合良いことに、本発明のベクターはウイルスベクターであり、例えば、シミアンウイルス４０、アデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス）、レトロウイルスおよびパピロマウイルスに基づくものである。ベクターは、さらに、（ａ）例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、単純疱疹ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびハイポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼから選択される陽性選択可能マーカー、および／または（ｂ）例えば、単純疱疹ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびハイポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼから選択される陰性選択可能マーカーを含み得る。陽性選択可能マーカーの使用はトランスフェクトされたＴリンパ球の選択および／または同定を容易にし、陰性選択可能マーカーの存在は、（例えば望ましくない副次効果が生じる場合）生体外においてまたは生体内においてトランスフェクトされたＴ細胞のその後の除去を許容する。例えば哺乳動物細胞における、特に加工した細胞毒性Ｔリンパ球におけるαおよびβユニットの転写および翻訳を許容するための構成を生み出すためのプラスミド調製方法が当業者に良く知られている。特に有利なベクターは、単一のプロモーターの制御下においてαおよびβ鎖の両方を発現する。特に好ましいのは、Ｔ細胞および／またはＴ細胞前駆体／幹細胞発現に特異的なプロモーターであり、その構成はポリオウイルス誘導内部リボソーマル導入部位（ＩＲＥＳ）により分離され得る。ＩＲＥＳは、配列の５’末端に配された同じプロモーター／エンハンサーの制御下に二つの分離した遺伝子要素が発現されることを許容する。ベクターはレトロウイルスベクターが有利である。哺乳動物細胞のレトロウイルス形質導入は非常に効果的であり、選択されたＴ細胞レセプターのαおよびβ 鎖のような遺伝子をヒト細胞に形質導入するのに用いることができる。レトロウイルスベクターは、好ましくは、特異性３’ＬＴＲ欠失を有する。加工すべき細胞のベクターによる形質導入の際、およびその後にホストゲノムに組み込むためのプロウイルスＤＮＡを形成するためのベクターの逆転写の際に、５’ＬＴＲプロモーター／エンハンサー要素活性が失われる。これにより、発現は、選択されたプロモーターの制御下に置かれ、細胞毒性Ｔ細胞特異的発現が可能となる（ユー（Yu SF）ら、1986年、PNAS、USA 83 3194）。しかしながら、そのようなレトロウイスルベクターにおいてベクター寸法抑制が制限され過ぎていると、アデノウイルスベクターのような別のベクターを考慮することもできる。本発明の標的化細胞毒性Ｔリンパ球およびベクターは、種々の治療、特に養子免疫療法のために使用される。リンパ球およびベクターは、(ａ)患者から細胞毒性Ｔリンパ球を除去し要すればそれらを組織培地中で拡張する工程、（ｂ）工程（ａ）で除去された細胞毒性Ｔリンパ球を本発明のベクターでトランスフェクションして標的化細胞毒性Ｔリンパ球を生成する工程、および（ｃ）工程（ｂ）の標的化細胞毒性Ｔリンパ球を患者に再導入する工程を含む養子免疫治療において特に有用である。前述の方法において、養子免疫治療で用いたＴリンパ球は自己由来のものである。これは、患者への再導入後の標的細胞の効率的認識に必要な適当な再刺激および接着因子をＴリンパ球が有することを確実にするので特別の利益を有する。この治療法は、癌患者、ＡＩＤＳ患者、自己免疫疾患を患っている個体、または日和見感染を患っている免疫抑制個体（例えば、移植器官を有する個体）に適用することができる。本発明の標的化細胞毒性Ｔリンパ球およびベクターは、ワクチンとしても、例えば病気の危険性が高い個体の予防用途に適用される。そのような、危険性の高い個体の例は、遺伝的または環境的要因により（例えば、癌、ＡＩＤＳまたは肝炎に）罹患しやすい個体を含む。例えば、本発明のＴリンパ球を用いて、ローランド−ジョーンズ（Rowland-Jones）ら、（1995年）、ネイチャー・メディスン（Nature Medecine）、第１（１）巻、59〜64頁に開示されている種類のＡＩＤＳに対する免疫を提供することができる。（修正をしてまたはしないで）実用的であると考えられる提案されたプロトコールの特定の例により本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は、いかなる点においても限定を意図するものではない。実施例１：ＴｃＲクローニングＴ細胞レセプターのクローニングは、歴史的に、目的のレセプターを有するＴ細胞からのｃＤＮＡライブラリーの形成に依存してきた。これは、各Ｔ細胞レセプターについて、新しいｃＤＮＡリブラリーが、時間を消費するプロセスである適当なクローン細胞系からつくられなくてはならなかったことを意味していた。しかしながら、Ｔ細胞レセプター二つのサブユニットαおよびβの遺伝子の間において、同一配列の領域がある。これらは定常領域として知られており、各α およびβサブユニット遺伝子において見つけられる。これらの領域の配列は、クローニングされたＴ細胞レセプターサブユニットの公表されたデータから見つけられ、これらを比較することにより、同一配列の定常領域を同定することができる。これらの領域は定常領域と呼ばれるが、分析により今までクローニングされてきた定常領域間に幾分かの変動があることが示された。しかしながら、レセプターサブユニット内において配列の一致する小さな領域を同定することができる。これらの領域を用いて、オクマン（Ochman）ら（ジェネティクス（Genetics）（1988年）120巻：621〜623頁）に記載の逆ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）として知られている方法により全長αおよびβサブユニット転写物を得ることができる。この方法は、ｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡの、環化され、および転写物の既知の配列に対して設計された既知のＰＣＲプライマーを用いて、環化ＤＮＡの非特性付け領域を通る鎖延長による全ｃＤＮＡを増幅する能力に依存する。しかしながら、得られるＰＣＲ生成物は目的の配列を正確な配位で付与せず、従ってそれらを配列するためにＰＣＲ生成物をクローニングする必要がある。配列データを用いて、配列を正確な配位に視覚化し、正確な配位で全長ｃＤＮＡを増幅するように正常ＰＣＲプライマーを設計することができる。これらｃＤＮＡクローンは、次に、さらに処理される発現ベクター内にクローニングすることができる。逆プライマーが定常領域に対して設計されたので、異なるＴ細胞クローンのために同じ方法およびプライマーを用いることができる。これは、大いに細胞数必要値を減少させＴｃＲクローニングの速度および効率を増加させる。この方法は以下のように要約される（図１〜３）。（１）トリゾール（Trizol）試薬を用いて目的のＴ細胞クローンから全ＲＮＡを単離する。（２）転写のためのプライマーとしてオリゴ（Oligo）ｄＴを用いて逆転写により全ＲＮＡからｃＤＮＡを製造する。（３）ＤＮＡ合成のための３’−ＯＨプライマー部位を提供するハイブリッド化ｍＲＮＡストランドにおいてニックおよびギャップを形成するためにＲＮＡase Ｈの存在下にＤＮＡポリメラーゼにより第２のストランド合成を達成する。（４）単量体環の形成に望ましい希薄ＤＮＡ濃度においてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環化を達成する。（５）次に、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた処理により線状ｃＤＮＡを除去する。（６）得られる閉鎖環状ｃＤＮＡを用いて、目的の転写物を逆ＰＣＲにより増幅する。逆プライマーは、最初にｃＤＮＡを反対方向に複製（図１に示すように）して線状生成物を得るように設計される。これらの生成物を、次に、普通のＰＣＲ法を用いて期待されるように複製する。（７）ＰＣＲ生成物をアガロースゲル上で分離し、幾つかの最大バンドをゲルから切除し精製する。精製した生成物を、次に、さらなるＰＣＲ反応で用いる。しかしながら、対照として、一つのＴ細胞レセプターサブユニットの短い定常領域を増幅するように設計された正常ＰＣＲプライマーを用いる。逆ＰＣＲから得られたフラグメントは定常領域を含むので、それらが真にＴ細胞レセプターサブユニット転写物であるなら、これらのプライマーを用いる正常ＰＣＲは、アガロースゲル上で視覚化され得る短いフラグメントを増幅する。適当な正常プライマーを用いて増幅したときに正常ＰＣＲ生成物を付与しなかったフラグメントは目的のクローンを表さず、廃棄される。（８）残りのフラグメントは、Ｔａｑポリメラーゼによる各複製工程中に形成される３’アデニル化部位に依存するプラスミドベクターであるＴＡベクター（インヴィトロゲン社（Invitrogen）から得られる）中にクローニングしてＰＣＲ生成物を組み込むことができる。次に、コンピテントバクテリアを得られるプラスミドを用いて形質転換し、形質転換株をアンピシリン抵抗により選択する。挿入部を有するプラスミドは、破壊されたｌａｃＺ遺伝子を有し、従って、Ｘ−ｇａｌを含む普通寒天上に乗せたときに白く見える。（９）選択されたクローンからのプラスミドＤＮＡの微小製剤上で確認（Confir matory）消化を行った。次に、選択されたクローンを拡張し、自動配列のための大規模プラスミド製剤をつくる。（１０）一旦配列データが得られると、開始コドンＡＴＧを同定することにより転写物の正確な配列を区別することができる（より明確な説明のために図２を参照）。このデータを用いて、Ｔ細胞クローンからの最初の線状ｃＤＮＡ製剤から全転写物を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計することができる。これらを、次に、真核生物発現ベクターを含む種々のベクター内にクローニングすることができる。適当なＴ細胞クローンが利用できるなら、（手順の最後の全長転写物の増幅の場合を除いて）新しいプライマーを設計する必要なく、この方法を多数のＴ細胞レセプターサブユニットに使用することができる。さらに、ｃＤＮＡライブラリー生成の場合に数週間かかるのに対して、全手順を数日で行うことができる。実施例２：ＭＡＧＥ−１黒色腫抗原を標的とする細胞毒性Ｔ細胞の形成ＭＡＧＥ−１遺伝子生成物ＭＺ２−Ｅを認識する細胞毒性Ｔリンパ球（例えば、チェン（Chen）ら、（1994 年）、PNAS、91 巻、1004〜1008頁；ヴァン・デン・アインデ（Van den Eynde）ら、（1989年）、Int.J.Cancer、44巻、634〜640頁; ヴァン・デル・ブルッゲン(van der Bruggen)ら、（1991 年）、サイエンス、25 4 巻、1643〜1647 頁；トラバーサリ（Traversari）ら、（1992年）、イムノジェネティクス（Immunogenetics）、35巻、145〜152頁；トラバーサリら、（1992 年）、J.Exp.Med．、176巻、1453〜1457頁）を集め、それらのＤＮＡを抽出した。ラムダｇｔ１１ベクターを用いて抽出ＤＮＡから相補ＤＮＡライブラリーを形成した。次に、ｏおよび３鎖を符号化する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、例えば、デムビック（Dembic）ら、（1985年）、ネイチャー、314巻、271〜273頁、およびスノドグラス（Snodgrass）ら、（1985年）、ネイチャー、315巻、232〜233頁に記載のｏおよび３鎖定常領域ハイブリッド化プローブを用いて単離した。使用した手順は、デムビック（Dembic）ら、（1986年）、ネイチャー、320巻、232〜 238頁に記載のものと同様である。次に、ｏおよび３鎖の両方のための遺伝子を、陽性選択マーカーとしてのネオマイシン抵抗遺伝子と共に同じ転写配位でコスミドベクター中にクローニングした。適当な発現要素を、効果的発現を保証するために、ｏおよび３符号配列に機能的に結合させた。次に、ｏおよび３鎖を含むコスミドベクターをプロトプラスト融合により適当な受容体細胞毒性Ｔ細胞ハイブリドーマ内に転移させて、ＭＡＧＥ−１遺伝子生成物への特異性を有する組み換えＴ細胞ハイブリドーマを産出した。当業者は、前記方法を他のＴｃＲの回復および転移に容易に適合させることができ、適当な修正によりいかなる受容体細胞毒性Ｔ細胞集団にも適用し得ることを理解する。実施例３：インフルエンザ（Ｆｌｕ）ウイルスを発現する細胞に対する細胞毒性活性を発現するように遺伝子的に加工されたヒトＴリンパ球の生成ＨＬＡ−Ｌ２制限態様で発現されることが知られているＦｌｕペプチドの存在下に標準培地中で、クラス１ＭＣＨＨＬＡ−Ａ２血液ドナーから誘導されたヒト全末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し生体外で培養した。すなわち、抗原を発現する細胞が形成された。また、抗原を発現する細胞は、ＨＬＡ−Ａ２制限ドナーから単離された樹状突起細胞の集団にペプチドを添加することにより形成することができる。ペプチドで24時間培養した後、最近インフルエンザを免疫化したヒトドナーから誘導された、またＨＬＡ−Ａ２クラス１ＭＨＣ制限イディオタイプからのＣＤ４／ＣＤ８細胞にＰＢＭＣを添加した。免疫化ドナーから誘導されたＣＤ４／ＣＤ８細胞集団を、微小プレート内に制限希釈（１００から１に細胞低下）で乗せ、発現細胞の存在下に培地を適当に変化させて10〜14日放置した。次に、抗原発現細胞を認識することができそれらに細胞毒性である活性化ＣＤ４／ＣＤ８細胞を発現したＴリンパ球の拡張しているコロニーについてプレートをスクリーニングした。次に、実施例１に記載されているように、クラス１ＭＨＣ制限態様で細胞により発現されるときにインフルエンザ抗原を認識することができる活性化Ｔリンパ球のこれらの拡張コロニーをクローニングし、完全なＴ細胞レセプターαおよび β鎖配列を調製するのに用いた。また、当業者に知られているαおよびβｃＤＮＡを製造および単離する他の方法を用いることができる。一旦単離すると、次にαおよびβ鎖のｃＤＮＡを用いて非免疫クラス１ＭＨＣＨＬＡ−Ｓ２ドナーから誘導されたＴ細胞を加工した。これにより、遺伝的に加工したＴ細胞に、クラス１制限態様でインフルエンザ感染細胞を認識しクロム放出アッセイにより決められる細胞毒性を媒介する能力を付与した。実施例４：ｒａｓ腫瘍遺伝子ファミリーの一員を発現する細胞に対する細胞毒性活性を発現するように遺伝子的に加工されたヒトＴリンパ球の生成ＨＬＡ−Ｌ２制限態様で発現されることが知られているハーヴェイ（Harvey）ｒａｓまたはカーステン（Kirsten）ｒａｓあるいはＮ−ｒａｓ腫瘍遺伝子ペプチドの存在下に標準培地中で、クラス１ＭＣＨＨＬＡ−Ａ２血液ドナーから誘導されたヒト全末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し生体外で培養した。すなわち、抗原を発現する細胞が形成された。また、抗原を発現する細胞は、ＨＬＡ−Ａ２制限ドナーから単離された樹状突起細胞の集団に前記ペプチドを添加することにより形成することができる。ペプチドで24時間培養した後、一連のヒトドナーから誘導された、またＨＬＡ −Ａ２クラス１ＭＨＣ制限イディオタイプからのＣＤ４／ＣＤ８細胞にＰＢＭＣを添加した。ドナーから誘導されたＣＤ４／ＣＤ８細胞集団を、微小プレート内に制限希釈（１００から１に細胞低下）で乗せ、発現細胞の存在下に培地を適当に変化させて10〜14日放置した。次に、抗原発現細胞を認識することができそれらに細胞毒性である活性化ＣＤ４／ＣＤ８細胞を発現したＴリンパ球の拡張しているコロニーについてプレートをスクリーニングした。次に、前述のように、クラス１ＭＨＣ制限態様で細胞により発現されるときにｒａｓ腫瘍細胞遺伝子を認識することができる活性化Ｔリンパ球のこれらの拡張コロニーをクローニングし、完全なＴ細胞レセプターαおよびβ鎖配列を調製するのに用いた。一旦単離すると、次にＮ−ｒａｓ腫瘍遺伝子ペプチドのハーヴェイ（Harvey）ｒａｓまたはカーステン（Kirsten）ｒａｓのいずれかの認識に関するαおよび β鎖のｃＤＮＡを用いて非免疫クラス１ＭＨＣＨＬＡ−Ｓ２ドナーから誘導されたＴ細胞を加工した。これにより、遺伝的に加工したＴ細胞に、クラス１制限態様での細胞内のｒａｓ腫瘍遺伝子活性化を認識しクロム放出アッセイにより決められるそのような細胞への細胞媒介細胞毒性を提供する能力を付与した。実施例５：ＨＩＶペプチドを発現する細胞に対する細胞毒性活性を発現するように遺伝子的に加工されたヒトＴリンパ球の生成ＨＬＡ−Ｂ３５制限態様で発現されることが知られているＨＩＶペプチドの存在下に標準培地中で、クラス１ＭＣＨＨＬＡ−Ｂ３５血液ドナーから誘導されたヒト全末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し生体外で培養した。すなわち、抗原を発現する細胞が形成された。また、抗原を発現する細胞は、ＨＬＡ−Ｂ３５制限ドナーから単離された樹状突起細胞の集団にペプチドを添加することにより形成することができる。ペプチドで24時間培養した後、潜在的ＨＩＶ免疫を有するヒトドナーから誘導された、またＨＬＡ−Ｂ３５クラス１ＭＨＣ制限イディオタイプからのＣＤ４／ＣＤ８細胞にＰＢＭＣを添加した。潜在的免疫ドナーから誘導されたＣＤ４／ＣＤ８細胞集団を、微小プレート内に制限希釈（１００から１に細胞低下）で乗せ、発現細胞の存在下に培地を適当に変化させて10〜14日放置した。次に、抗原発現細胞を認識することができそれらに細胞毒性である活性化ＣＤ４／ＣＤ８細胞を発現したＴリンパ球の拡張しているコロニーについてプレートをスクリーニングした。次に、クラス１ＭＨＣ制限態様で細胞により発現されるときにＨＬＡ−Ｂ３５加工HＩＶ抗原を認識することができる活性化Ｔリンパ球のこれらの拡張コロニーをクローニングし、前述のような方法で用いて、または当業者に知られている αおよびβｃＤＮＡを製造および単離する方法により、完全なＴ細胞レセプター αおよびβ鎖配列を調製した。一旦単離すると、次にαおよびβ鎖のｃＤＮＡを用いて非免疫クラス１ＭＨＣＨＬＡ−Ｂ３５ドナーから誘導されたＴ細胞を加工した。これにより、遺伝的に加工したＴ細胞に、クラス１ＭＨＣ制限態様でのＨＩＶ感染細胞の認識を付与した。これら加工細胞により細胞媒介細胞毒性をクロム放出アッセイにより示した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１１月２１日【補正内容】請求の範囲１．病気誘発標的細胞へのＭＨＣクラスＩ制限特異性をリンパ球に付与する異種αおよびβペプチドからなるＴｃＲを有してなり、単一クラスの標的細胞へのＭＨＣクラスＩ制限特異性を付与する単一種のＴｃＲを有し、単価である標的化細胞毒性Ｔリンパ球。２．組み換え型である請求項１に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。３．ウイルスベクターで形質導入される請求項２に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。４．標的細胞が腫瘍細胞、自己免疫反応に寄与する免疫細胞および／または病因に感染された細胞からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。５．標的細胞がヒト黒色腫細胞からなり、異種αおよびβポリペプチドが、（ａ）ＭＡＧＥ−１腫瘍抗原、（ｂ）ＭＡＧＥ−３腫瘍抗原、（ｃ）ＭＡＲＴ１／Ａａ腫瘍抗原、（ｄ）ｇｐ１００腫瘍抗原および／または（ｅ）チロシナーゼ腫瘍抗原への特異性を付与する請求項４に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。６．病因がウイルスである請求項４に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。７．標的細胞がＨＩＶ感染リンパ球である請求項６に記載の標的細胞毒性Ｔリンパ球。８．異種αおよびβＴｃＲポリペプチドが単一融合ポリペプチドとして提供される請求項１〜７のいずれか１項に記載の標的細胞毒性Ｔリンパ球。９．異種αおよびβＴｃＲポリペプチドがキメラである請求項１〜８のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。１０．キメラＴｃＲポリペプチドがイムノグロブリン可変領域またはそのフラグメントを有する請求項９に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。１１．（ａ）病気誘発標的細胞に特異的であるαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡ（例えば、ドナー細胞毒性Ｔリンパ球から誘導されるＤＮＡ）を有するベクターを提供する工程、および（ｂ）受容体細胞毒性Ｔリンパ球を工程（ａ）のベクターでトランスフェクションして、病気誘発標的細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチド符号化するＤＮＡを有する組み換え細胞毒性Ｔリンパ球を生成する工程を有し、それにより工程（ｂ）の組み換え細胞毒性Ｔリンパ球がαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡを発現してリンパ球にＭＨＣクラスＩ制限特異性を付与し、それによりリンパ球を標的細胞に向けることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球の生成方法。１２．工程（ａ）のベクターが、病気発生標的細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡをクローニングする、集めるまたは合成する（例えば、固相オリゴヌクレオチド合成により）ことにより提供される請求項１１に記載の方法。１３．αおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡが、（ａ）例えば、血液バンク、血液サンプルまたは腫瘍バイオプシーからドナーＴリンパ球のサンプルを得、（ｂ）例えば、特異的誘発増殖および／または特異的クローン拡大により、病気誘発標的細胞に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球のためのドナーＴリンパ球のサンプルを増加させ、（ｃ）ドナー細胞毒性Ｔリンパ球から染色体ＤＮＡを抽出し、および（ｄ）例えば、プライマー特異性ＰＣＲ増幅によりαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡを単離することによりクローニングされる請求項１２に記載の方法。１４．ベクターが受容体細胞毒性Ｔリンパ球内に、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合またはウイルス（例えば、レトロウイルス）トランスフェクションにより導入される請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。１５．請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法により生成することのできる標的化細胞毒性Ｔリンパ球。１６．例えば、転写および／または翻訳要素、プロモータ、リボゾーム結合部位、エンハンサー、制御部位（例えば、アクチベーターおよびリプレッサー（オペレーター）部位およびαおよび／またはβＴｃＲペプチド遺伝子と天然に結合している発現要素から選択される発現要素に例えば操作可能に結合している、病気誘発細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡからなる請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法に用いるベクター。１７．例えば、シミアンウイルス４０、アデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス）、レトロウイルスおよびパピロマウイルスに基づくウイルスベクターである請求項１６に記載のベクター。１８．さらに、（ａ）例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、単純疱疹ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびハイポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼから選択される陽性選択可能マーカー、および／または（ｂ）例えば、単純疱疹ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびハイポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼから選択される陰性選択可能マーカーを有する請求項１６または１７に記載のベクター。１９．治療に用いるための、標的細胞へのＭＨＣクラスＩ制限特異性をリンパ球に付与する異種αおよびβポリペプチドを有するＴｃＲを有する請求項１〜１０または１５のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。２０．（ａ）請求項１９に定義されている標的化細胞毒性Ｔリンパ球または（ｂ）請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のベクターの、養子免疫療法に用いられる薬剤の調製のための使用。２１．養子免疫療法が、（ａ）患者から細胞毒性Ｔリンパ球を除去する工程、（ｂ）工程（ａ）で除去された細胞毒性Ｔリンパ球を請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクションして標的化細胞毒性Ｔリンパ球を生成する工程、および（ｃ）工程（ｂ）の標的化細胞毒性Ｔリンパ球を患者に再導入する工程、かを有する請求項２０に記載の使用。２２．工程（ｂ）および（ｃ）の前に工程（ａ）で除去された細胞毒性Ｔ細胞を組織培地中で選択的に拡大する工程をさらに含む請求項２１に記載の使用。２３．患者が、癌患者、ＡＩＤＳ患者、自己免疫疾患を患っている個体、または日和見感染を患っている免疫抑制個体（例えば、移植器官を有する個体）である請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の使用。２４．（ａ）請求項１９に定義されている標的化細胞毒性Ｔリンパ球または（ｂ）請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のベクターの、養子免疫療法または予防に用いられる、例えばＡＩＤＳの治療または予防に用いられるワクチンの調製のための使用。２５．例えば、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、請求項１〜１０または１５のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球からなるワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ０７Ｋ 14/725 // Ｃ０７Ｋ 14/725 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．病気誘発標的細胞へのＭＨＣクラスＩ制限特異性をリンパ球に付与する異種αおよびβペプチドからなるＴｃＲを有する標的化細胞毒性Ｔリンパ球。２．例えばウイルスベクターで形質導入される組み換え型である請求項１に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。３．単一クラスの標的細胞へのＭＨＣクラスＩ制限特異性を付与する単一種のＴｃＲを有する、単価である請求項１または２に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。４．二つ以上のクラスの標的細胞へのＭＨＣクラスＩ制限特異性を一緒になって付与する異なる二種以上のＴｃＲを有する、多価である請求項１または２に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。５．標的細胞が腫瘍細胞、自己免疫反応に寄与する免疫細胞および／または病因に感染された細胞からなる請求項１〜４のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。６．標的細胞がヒト黒色腫細胞からなり、異種αおよびβポリペプチドが、（ａ）ＭＡＧＥ−１腫瘍抗原、（ｂ）ＭＡＧＥ−３腫瘍抗原、（ｃ）ＭＡＲＴ１／Ａａ腫瘍抗原、（ｄ）ｇｐ１００腫瘍抗原および／または（ｅ）チロシナーゼ腫瘍抗原への特異性を付与する請求項５に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。７．病因がウイルスである請求項５に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。８．標的細胞がＨＩＶ感染リンパ球である請求項７に記載の標的細胞毒性Ｔリンパ球。９．異種αおよびβＴｃＲポリペプチドが単一融合ポリペプチドとして提供される請求項１〜８のいずれか１項に記載の標的細胞毒性Ｔリンパ球。１０．異種αおよびβＴｃＲポリペプチドがキメラであり、例えばイムノグロブリン可変領域またはそのフラグメントを有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球。１１．（ａ）病気誘発標的細胞に特異的であるαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡ（例えば、ドナー細胞毒性Ｔリンパ球から誘導されるＤＮＡ）を有するベクターを提供する工程、および（ｂ）受容体細胞毒性Ｔリンパ球を工程（ａ）のベクターでトランスフェクションして、病気誘発標的細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチド符号化するＤＮＡを有する組み換え細胞毒性Ｔリンパ球を生成する工程、を有し、それにより工程（ｂ）の組み換え細胞毒性Ｔリンパ球がαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡを発現してリンパ球にＭＨＣクラスＩ制限特異性を付与し、それによりリンパ球を標的細胞に向けることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球の生成方法。１２．工程（ａ）のベクターが、病気発生標的細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡをクローニングする、集めるまたは合成する（例えば、固相オリゴヌクレオチド合成により）ことにより提供される請求項１１に記載の方法。１３．αおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡが、（ａ）例えば、血液バンク、血液サンプルまたは腫瘍バイオプシーからドナーＴリンパ球のサンプルを得、（ｂ）例えば、特異的誘発増殖および／または特異的クローン拡大により、病気誘発標的細胞に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球のためのドナーＴリンパ球のサンプルを増加させ、（ｃ）ドナー細胞毒性Ｔリンパ球から染色体ＤＮＡを抽出し、および（ｄ）例えば、プライマー特異性ＰＣＲ増幅によりαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡを単離することによりクローニングされる請求項１２に記載の方法。１４．ベクターが受容体細胞毒性Ｔリンパ球内に、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合またはウイルス（例えば、レトロウイルス）トランスフェクションにより導入される請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。１５．請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法により生成することのできる標的化細胞毒性Ｔリンパ球。１６．例えば、転写および／または翻訳要素、プロモータ、リボゾーム結合部位、エンハンサー、制御部位（例えば、アクチベーターおよびリプレッサー（オペレーター）部位およびαおよび／またはβＴｃＲペプチド遺伝子と天然に結合している発現要素から選択される発現要素に例えば操作可能に結合している、病気誘発細胞に特異的なαおよびβＴｃＲポリペプチドを符号化するＤＮＡからなる請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法に用いるベクター。１７．例えば、シミアンウイルス４０、アデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス）、レトロウイルスおよびパピロマウイルスに基づくウイルスベクターである請求項１６に記載のベクター。１８．さらに、（ａ）例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、単純疱疹ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびハイポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼから選択される陽性選択可能マーカー、および／または（ｂ）例えば、単純疱疹ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびハイポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼから選択される陰性選択可能マーカーからなる請求項１６または１７に記載のベクター。１９．治療に用いるための、標的細胞へのＭＨＣクラスＩ制限特異性をリンパ球に付与する異種αおよびβポリペプチドからなるＴｃＲを有する標的化細胞毒性Ｔリンパ球（例えば、請求項１〜１０または１５のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球）。２０．（ａ）請求項１９に定義されている標的化細胞毒性Ｔリンパ球または（ｂ）請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のベクターの、養子免疫療法に用いられる薬剤の調製のための使用。２１．養子免疫療法が、（ａ）患者から細胞毒性Ｔリンパ球を除去する工程、（ｂ）工程（ａ）で除去された細胞毒性Ｔリンパ球を請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクションして標的化細胞毒性Ｔリンパ球を生成する工程、および（ｃ）工程（ｂ）の標的化細胞毒性Ｔリンパ球を患者に再導入する工程、を有する請求項２０に記載の使用。２２．工程（ｂ）および（ｃ）の前に工程（ａ）で除去された細胞毒性Ｔ細胞を組織培地中で選択的に拡大する工程をさらに含む請求項２１に記載の使用。２３．患者が、癌患者、ＡＩＤＳ患者、自己免疫疾患を患っている個体、または日和見感染を患っている免疫抑制個体（例えば、移植器官を有する個体）である請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の使用。２４．（ａ）請求項１９に定義されている標的化細胞毒性Ｔリンパ球または（ｂ）請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のベクターの、養子免疫療法または予防に用いられる、例えばＡＩＤＳの治療または予防に用いられるワクチンの調製のための使用。２５．例えば、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、請求項１〜１０または１５のいずれか１項に記載の標的化細胞毒性Ｔリンパ球からなるワクチン。