DE69529473T2

DE69529473T2 - Gezielte t-lymfozyten

Info

Publication number: DE69529473T2
Application number: DE69529473T
Authority: DE
Inventors: Bradley Michael John Stringer
Original assignee: CellFactors PLC
Current assignee: CellFactors PLC
Priority date: 1994-11-16
Filing date: 1995-11-16
Publication date: 2004-01-08
Anticipated expiration: 2015-11-17
Also published as: DK0792354T3; ATE231550T1; DE69529473D1; AU687271B2; AU3875495A; NZ295418A; HUT77472A; CA2203934A1; EP0792354B1; JPH10511542A; PT792354E; KR970707280A; ES2191065T3; CZ144297A3; MX9703535A; CZ289455B6; GB9423085D0; WO1996015238A1; EP0792354A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft targetierte zytotoxische T-Lymphozyten und ihre Verwendung und insbesondere targetierte zytotoxische T-Lymphozyten mit heterologen α- und β-T-Zellantigenrezeptor-Polypeptiden, die auf MHC beschränkte Spezifität für krankheitsverursachende Targetzellen übertragen.
Das Immunsystem besteht aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen und Moleküle, die im ganzen Körper verteilt sind. Bei gesunden Personen wehrt das Immunsystem eindringende Krankheitserreger, Parasiten und Zellen, die infiziert oder karzinös sind, ab und bietet einen Schutz vor ihnen.
Die Zellbasis für verschiedene grundlegende Eigenschaften des Immunsystems (einschließlich des immunologischen Gedächtnisses, der Spezifität und Diversität von Reaktionen) ist der Lymphozyt. Lymphozyten sind in zwei Klassen unterteilt: der B-Lymphozyt (oder die B-Zelle), der letztlich für die Erzeugung humoraler Reaktionen verantwortlich ist (vermittelt durch lösliche Antikörper), und der T-Lymphozyt (oder die T-Zelle), der letztlich für die Erzeugung zellvermittelter Reaktionen verantwortlich ist.
T-Lymphozyten werden unter anderem ferner in zytotoxische T-Lymphozyten (die infizierte, abweichende oder bösartige Targetzellen erkennen) und Helfer-T-Lymphozyten unterteilt (die eine große Auswahl an Zelltypen stimulieren, rekrutieren und aktivieren, die an einer Immunantwort beteiligt sind).
T-Lymphozyten erkennen Targetzellen über T-Zell-Rezeptoren (nachfolgend als TcRs bezeichnet). TcRs weisen im Allgemeinen keine alleinige Bindung ans Antigen auf. Stattdessen erkennen TcRs ein Antigen als einen Bestandteil eines Zelloberflächen-Glykoproteinkomplexes, der durch Gene der Klasse I oder Klasse II des Haupthistokompatibilitätskomplexes (nachfolgend als MHC Klasse I oder MHC Klasse II bezeichnet) kodiert ist.
Zytotoxische T-Lymphozyten erkennen im Allgemeinen Antigene in Verbindung mit MHC Klasse I, wohingegen Helfer-T-Lymphozyten im Allgemeinen Antigene in Verbindung mit MHC Klasse II erkennen.
Folglich ist die T-Lymphozyten-Targetzellerkennung auf Targetzellen beschränkt, die Antigen in Verbindung mit bestimmten Wirtsproteinen (nämlich die MHC-Moleküle der Klasse I oder Klasse II) präsentieren können. Als Hauptfunktion des T-Lymphozyten kann daher die Beobachtung von Zelloberflächen im Körper angesehen werden, damit abweichende, infizierte oder bösartige Zellen identifiziert (oder, im Falle von Helfer-T-Zellen, nachgewiesen) und letztlich beseitigt werden können.
Der T-Zell-Rezeptor (TcR)
Der TcR ist ein Proteinkomplex, von dem ein Typ zwei disulfidvernetzte Polypeptidketten beinhaltet (die α- und β-Ketten), die auf der T-Lymphozyt-Zelloberfläche mit anderen Molekülen assoziiert sind. Die α- und β-Ketten des TcR reichen aus, um einen T-Lymphozyt mit Antigen- und MHC(Klasse I oder II)-Spezifität zu versehen: es sind daher nur die α- und β-Komponenten des TcR erforderlich, um die Dual(d. h. MHC und Antigen)-T-Lymphozytenspezifität vollständig zu definieren.
Die α- und β-Ketten umfassen konstante und variable Regionen, die homolog zu Immunglobulin-V- und -C-Regionen sind, und die entsprechenden Strukturgene werden DNA-Anordnungen unterzogen, die an die der Immunglobulingene erinnern. In der Tat ist das Strukturrepertoire von Immunglobulinen und TcRs ähnlich (etwa 10¹² pro Individuum).
Die Gene, die die α- und β-Ketten des TcR kodieren, wurden kloniert und sequenziert (s. beispielsweise Robertson (1985), Nature 317, 768-771). Ferner wurden die α- und β-Ketten-Gene des TcR von einer T-Zelle zu einer anderen übertragen, um einen T-Zellklon unterschiedlicher Spezifität zu erzeugen (s. beispielsweise Dembic et al., 1986, Nature 320, S. 232-238).
TcRs sind klonal verteilt: die TcRs jedes T-Lymphozyten sind für nur eine Antigendeterminante spezifisch (obschon es hunderttausende der gleichen TcR-Spezies auf jeder Zelle geben kann). Jeder T-Lymphozyt ist daher normalerweise mit Bezug auf die TcR-vermittelte Bindung monovalent.
Die α- und β-Ketten sind mit verschiedenen anderen Molekülen assoziiert, einschließlich Proteine des CD3-Komplexes und assoziierter Zeta- und Eta-Peptide. Der TcR-CD3-Komplex transduziert ein Signal vom TcR zum Inneren des T-Lymphozyten, wenn er den passenden Peptid-MHC-Komplex erkennt, und trägt somit zur T-Zellaktivierung bei.
Abweichende Genexpression, Krankheit und die T-Zellreaktion
Die Gesundheit eines Individuums ist von der koordinierten und streng regulierten Expression von vielen tausend verschiedenen Genen abhängig. Eine Abweichung oder Änderung der Genexpression kann daher, auch wenn sie noch so subtil ist, zu einer Fülle verschiedener Erkrankungen führen, einschließlich Krebs, AIDS und verschiedener Autoimmunkrankheiten.
Viele verschiedene Faktoren können eine abnorme Genexpression bewirken. Die Expression endogener Gene oder die Struktur der Proteine, die davon kodiert werden, kann beispielsweise durch Mutation verändert werden. Solche Mutationen können spontan erfolgen, werden jedoch oft durch in der Umgebung vorhandene Karzinogene verursacht. Alternativ kann die Einführung von exogenem genetischem Material in Zellen der Person (z. B. infolge einer Virusinfektion) zu einer Zerstörung von Genexpressionsmustern, einer Aktivierung normalerweise stummer Gene und/oder einer Synthese fremder (z. B. viraler) Proteine führen.
Ein wichtiges Beispiel für die Konsequenzen induzierter Abweichungen bei der Genexpression ist die Tumorbildung. Die meisten Krebsarten sind durch eine Tumorbildung gekennzeichnet, wobei die Tumore infolge einer strukturellen Veränderung oder Überexpression endogener Proteine entstehen, die mit der Mutation von Onkogenen und Tumorsuppressionsgenen in somatischen Zellen verbunden sind. Bei bestimmten Brustkrebsarten ergibt sich die Tumorbildung aus einer Amplifikation und Überexpression des HER-2/neu-Proto-Onkogens.
Abgesehen vom Krankheitsausbruch auf Organismenebene ist eine weitere phänotypische Folge einer abweichenden Genexpression möglicherweise die Produktion von Neoantigenen. Es ist beabsichtigt, dass der hierin verwendete Begriff "Neoantigen" nicht nur neue Antigene beinhaltet, die von mutierten oder fremden Aminosäuresequenzen entstehen, sondern auch "neue" Antigene, die sich aus der Expression normalerweise stummer Wildtypgene oder der Überexpression normalerweise relativ schwach exprimierter Wildtypgene ergeben.
Aus der Produktion von Neoantigenen gehen möglicherweise Veränderungen in Zelloberflächenantigenen hervor, und diese Veränderungen können wiederum eine Immunantwort bewirken. Gegen Onkogenprodukte gerichtete Antikörper wurden beispielsweise im Serum von Tumorpatienten gefunden, und zytotoxische T-Lymphozyten, die Tumorzellen erkennen und eliminieren, wurden in einer Reihe von Modellsystemen nachgewiesen.
Veränderungen bei Zelloberflächenantigenen, die eine zytotoxische T-Lymphozytenreaktion auslösen können, können im Anschluss an eine intrazelluläre Verarbeitung der mutierten, fremden oder überexprimierten Proteine entstehen, um Peptidfragmente zu produzieren, die sich auf der Zelloberfläche als Bestandteil eines Peptidkomplexes der MHC Klasse I zeigen können, der durch zytotoxische T-Lymphoyten erkannt werden kann. Auf diese Weise können abweichende Zellen von T-Lymphozyten erkannt und eliminiert werden.
Zusätzlich zu Veränderungen in Zelloberflächenantigenen kann eine Proteinüberexpression, eine Produktion fremder (z. B. virenstämmiger) oder mutierter Proteine letztlich in dem Erscheinen exogener Neoantigene resultieren (z. B. Viruspartikel oder -fragmente). Diese können durch membrangebundene Immunglobuline auf der Oberfläche von B-Lymphozyten erkannt, internalisiert, verarbeitet und nachfolgend als Helfer-T-Zellantigene als ein Komplex mit MHC-Klasse-II-Molekülen auf der Oberfläche der B-Zelle präsentiert werden. Eine B-Zelle, die ein Antigen auf diese Weise präsentiert, kann von einer Helfer-T-Zelle über eine spezifische TcR-Peptid-MHC-Klasse-II-Interaktion erkannt und stimuliert werden, um sich zu einer Plasmazelle zu entwickeln, die große Mengen an löslichen Antikörpern sekretiert, die für das exogene Antigen spezifisch sind. Auf diese Weise kann der Helfer-T-Lymphozyt eine humorale Immunantwort stimulieren und indirekt eine große Auswahl von Immunzelltypen aktivieren.
Es gibt viele Berichte über tumorspezifische oder tumorassoziierte Neoantigene. Die Überexpression des ERBB2-Rezeptors steht zum Beispiel mit vielen humanen Brust- und Eierstockkrebsarten in Zusammenhang und führt außerdem dazu, dass ERBB2-stämmige Neoantigenen an der Zelloberfläche erscheinen. Beim Kolonkrebs durchläuft das Adenomatose-Polyposis-Koli-Gen (APC) gewöhnlich eine frühzeitige Mutation. Obwohl die Mutation oft einfach in der Einführung eines Stoppcodons resultiert (das die Translation beendet und zur Produktion eines verkürzten APC-Proteins führt), so ist die Mutation in vielen Fällen eine Rasterverschiebung, die die Produktion neuer Proteinsequenzen und potentiell einmaliger Antigene zur Folge hat. Nachdem solche Antigene intrazellulär verarbeitet und an die MHC-Proteine gebunden wurden, können sie an der Zelloberfläche präsentiert und von T-Lymphozyten erkannt werden.
In vielen anderen Fällen würde man erwarten, dass eine Strukturveränderung oder Überexpression endogener Proteine zu Veränderungen der intrazellulären Verarbeitung dieser Proteine und der Präsentation von Neoantigenen in Verbindung mit MHC-Proteinen an der Zelloberfläche führen würde.
Trotz der oben beschriebenen immunogenen Konsequenzen der abweichenden Genexpression ist die natürliche Immunantwort zur Bekämpfung infizierter, abweichender oder bösartiger Zellen oft unzureichend. Die Gründe für diesen Mangel werden zwar nicht völlig verstanden, doch wird davon ausgegangen, dass Neoantigene durch das Immunsystem oft als gewebespezifische Antigene behandelt und so in der gleichen Weise toleriert werden. Ferner stellen Neoantigene gewöhnlich nur eine unbedeutende Quelle von Peptiden für die MHC-Klasse-I-gerichtete Verarbeitung dar, so dass die Neoantigenverarbeitung und -präsentation äußerst ineffizient sein kann. Schließlich scheint die Immunogenität teilweise durch den Gewebetyp bestimmt zu werden, in dem das Neoantigen exprimiert ist, so dass es den Anschein hat, dass die Toleranz in bestimmten Gewebetypen größer (und/oder die Verarbeitung und Präsentation weniger effizient) ist.
Mehrere Ansätze wurden entwickelt, um effektivere Immunantworten auf abweichende, infizierte oder bösartige Zelltargets zu erzeugen. Es wurde zum Beispiel vorgeschlagen, Antigene von bösartigen Zellen als Impfstoffe zu verwenden, um tumorspezifische, zellvermittelte Immunität zu induzieren.
Kürzlich wurde die adoptive Immuntherapie als ein Verfahren zur Krebsbehandlung vorgeschlagen. Dieses Therapieverfahren basiert auf der Übertragung von Immunzellen mit Antitumoraktivität in Krebspatienten. Die verwendeten Immunzellen stammen von dem Krebspatienten; sie werden kultiviert und nach einer Expansion in Gewebekultur wieder eingeführt.
Die in der adoptiven Immuntherapie verwendeten Zellen schließen Lymphokin-aktivierte Killerzellen, Tumorinfiltrierende Lymphozyten und in-vitro-sensibilisierte Lymphozyten ein, die von zytotoxischen T-Lymphozyten stammen.
Lymphokin-aktivierte Killerzellen sind zytolytische Zellen, die mit einem breiten Spektrum von Targetzellen reagieren. Sie sind nicht MHC-beschränkt und lysieren sowohl Tumor- als auch normale Zellen. Therapien, die auf die Verwendung dieser Zellen gestützt sind, haben folglich den Nachteil, dass die Tumorzellenabtötung von einer signifikanten Schädigung normalen Gewebes begleitet wird.
Tumor-infiltrierende Lymphozyten stammen von Tumorgewebe. Sie sind potenter als Lymphokin-aktivierte Killerzellen und für ihre Ursprungstumore relativ spezifisch, so dass das Problem umgangen wird, das aus einer nichtselektiven Ablation normalen Gewebes in Verbindung mit der Verwendung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen entsteht. Die Verfügbarkeit dieser Zellen ist jedoch stark beschränkt und von ihrem natürlichen Vorkommen in Tumorgewebe und ihrer Expansion in vitro abhängig. Therapien, die auf die Verwendung dieser Zellen gestützt sind, wären daher nur in einem Bruchteil von Fällen verfügbar.
Es wurde zwar nachgewiesen, dass die zuvor beschriebenen jeweiligen adoptiven Immuntherapien in der Lage sind, eine Tumorregression in gewissem Maße zu vermitteln, doch wurden therapeutische Reaktionen in nur wenigen Fällen beobachtet (und zeigten sich selbst dann in nur einem Bruchteil der behandelten Patienten).
Es wurde vorgeschlagen (Moritz et al. (1994), PNAS, 91, S. 4318-4322), die Wirksamkeit der Lymphozyten-vermittelten Tumortherapie durch In-vitro-Manipulation der Erkennungsspezifität von zytotoxischen T-Lymphozyten zu verbessern, um sie mit einer definierten Tumorzellspezifität zu versehen. Moritz et al. gingen dieses Problem an, indem sie die TcR-gestützte (und daher MHC-beschränkte) Spezifität umgingen, um einen völlig synthetischen "Pseudorezeptor" zu schaffen, der einen einkettigen Antikörper umfasst (um Bindungsspezifität zu übertragen), der (über ein Gelenk) mit einer TcR-Komplex-Zeta-Kette verbunden ist. Man stellte fest, dass zytotoxische T-Zellen mit dem synthetischen Pseudorezeptor eine MHC-unabhängige Erkennung mit einer Spezifität aufwiesen, die von der Antikörperkomponente übertragen wurde.
Die Verwendung eines völlig synthetischen Pseudorezeptors scheint jedoch zu einer unwirksamen Signaltransduktion und zu einem Rückgang der T-Zellaktivität zu führen. Da die Erkennungsspezifität der targetierten zytotoxischen T-Lymphozyten, die in Moritz et al. beschrieben werden, ferner MHC-unabhängig ist, wird die Wirksamkeit der Zelloberflächenabtastung durch die Lymphozyten voraussichtlich beeinträchtigt. Schließlich ruft der synthetische Pseudorezeptor möglicherweise selbst unerwünschte Immunantworten hervor.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, alternative targetierte T-Lymphozyten bereitzustellen, die beispielsweise in der adoptiven Immuntherapie verwendet werden und nicht völlig synthetische Pseudorezeptoren exprimieren, sondern stattdessen über TcRs targetiert werden, die im Wesentlichen eine ähnliche Struktur wie normale TcRs haben. Der normale Signaltransduktionsweg bleibt daher erhalten und die Risiken unerwünschter Immunantworten werden gering gehalten. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen targetierten T-Zellen MHC-beschränkt, so dass sie Zelloberflächen hinsichtlich abweichender Antigene abtasten können.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung einen targetierten zytotoxischen T-Lymphozyten mit einem TcR bereit, umfassend heterologe α- und β-Polypeptide, wobei die heterologen Polypeptide auf den Lymphozyt auf MHC Klasse I beschränkte Spezifität für krankheitsverursachende Targetzellen übertragen, wobei der targetierte zytotoxische T-Lymphozyt mit Bezug auf die targetierten Zellen monovalent ist, mit einer einzelnen TcR-Gattung, die auf MHC Klasse I beschränkte Spezifität für eine einzelne Klasse von Targetzellen überträgt.
Der hierin verwendete Begriff "heterologe α- und β-TcR-Polypeptide" bezieht sich auf α- und β-TcR-Ketten, die in der T-Zelle normalerweise nicht exprimiert werden. In einer Ausgestaltung sind die heterologen TcR-Polypeptide Chimäre oder synthetische Moleküle, die von der Expression rekombinanter oder völlig synthetischer DNA abstammen. In anderen Ausgestaltungen sind die heterologen TcR-Polypeptide direkt oder indirekt (z. B. über eine TcR-Genbibliothek) von einer anderen T-Zelle abgeleitet. Die andere T-Zelle kann selbst von jeder beliebigen Quelle abstammen, solange sie TcR-Komponenten der erforderlichen Spezifität exprimiert. Die andere T-Zelle kann beispielsweise von derselben Gattung (oder sogar demselben Individuum) oder von einer anderen Gattung stammen. Sie kann auch ein T-Zellhybridom sein.
Die Spezifität für krankheitsverursachende Targetzellen braucht nicht absolut zu sein. Für die Zwecke der Erfindung reicht es aus, wenn die Spezifität derart ist, dass jede beliebige damit verbundene Autoimmunablation von normalem oder nicht erkranktem Gewebe von dem Patienten toleriert werden kann.
In Situationen, in denen zum Beispiel die krankheitsverursachenden Zellen alle Bestandteile eines bestimmten Gewebes sind, das selbst entbehrlich ist, reicht es aus, wenn der targetierte T-Lymphozyt für dieses Gewebe effektiv spezifisch ist. Dies kann der Fall sein, wenn die targetierten krankheitsverursachenden Zellen bösartige Prostatatumorzellen sind – hier reicht es aus, wenn die zytotoxischen T-Zellen mit ausreichender Spezifität targetiert werden, um sowohl normales als auch karzinöses Prostatagewebe abzutragen (während anderes Gewebe unberührt bleibt oder in geringerem und tolerierbarem Maße abgetragen wird). Ein weiteres Beispiel sind Melanome – obschon einige melanozytenspezifische Antigene auch in bestimmten Zellen der Netzhaut, des Gehirns und des Innenohres auftreten, wobei diese letzteren Zellen weniger empfindlich auf die Immuntherapie auf der Basis des melanozytenspezifischen Antigens zu reagieren scheinen.
Eine andere Situation, in der eine absolute Spezifität möglicherweise nicht erforderlich ist, tritt dann auf, wenn die normale Gewebsentsprechung eines bestimmten Tumors MHC Klasse I auf extrem niedrigem Niveau exprimiert, so dass sie vor einem zytotoxischen T-Zellangriff geschützt wird.
Der Begriff "krankheitsverursachende Zelle" ist hierin im allgemeinen Sinne zu verstehen, um nicht nur auf Zellen hinzudeuten, die direkt an einer Krankheit beteiligt sind (zum Beispiel Tumorzellen oder Autoimmunzellen),.sondern auch auf Zellen, die mit dem Voranschreiten einer Krankheit zusammenhängen oder den Krankheitszustand fördern oder aufrechterhalten (zum Beispiel viral infizierte Zellen). Er erfasst somit jede Zelle, die abweichend und für die Gesundheit des Individuums in irgendeiner Weise von Nachteil ist.
Der erfindungsgemäße targetierte zytotoxische T-Lymphozyt ist vorzugsweise rekombinant und wird beispielsweise mit einem viralen Vektor transduziert.
Monovalente Lymphozyten der Erfindung können zum Beispiel durch Ersetzen (anstelle von Ergänzen) der residenten (oder endogenen) α- und β-Ketten-Gene durch heterologe α- und β-Ketten erzeugt werden, die die erforderliche Spezifität übertragen.
Erfindungsgemäße monovalente Lymphozyten können auch durch Abwärtsregulieren oder Blockieren der Expression des endogenen TcR durch irgendeine der großen Auswahl verfügbarer Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel kann die targetierte Insertionsmutagenese zum Zerteilen der endogenen TcR-Gene angewendet werden.
Durch die Verwendung monovalenter Lymphozyten werden die Probleme umgangen, die sich aus der Bildung fehlangepasster (und daher inaktiver und/oder nichtselektiver) α- und β-Dimere ergeben. Durch die Bildung solcher inaktiver Heterodimer wird die effektive Zelloberflächendichte der TcRs reduziert, wodurch eine Targetzellerkennung und Lyse beeinträchtigt oder verhindert wird. Durch die Gewährleistung von Monovalenz der erfindungsgemäßen Lymphozyten wird die Zelloberflächendichte der TcRs optimiert.
Dembic, Nature, Bd. 320, 1986, Seiten 232-238, offenbart den Transfer von Alpha- und Beta-Ketten-Genen von einem auf MHC Klasse I beschränkten zytotoxischen T-Zellklon, nach dem Klonieren in einen Cosmid-Vektor, auf einen anderen zytolytischen T-Zellklon einer anderen Spezifität durch Protoplastenfusion. Ein Neomycin-Resistenzgen wurde als positiver Selektionsmarker verwendet. Dies belegt, dass von einer zytotoxischen T-Zelle isolierte TcR-Alpha-und Beta-Ketten-Gene ausreichen, um die auf MHC beschränkte Antigenspezifität dieser Zelle auf eine andere T-Zelle zu übertragen.
Dembic lehrt nicht die Verwendung monovalenter targetierter Zellen.
Gross, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86, Nr. 24, 1989, Seiten 10024-10028 lehrt die Erzeugung chimärer Moleküle, die aus Immunglobulin-V-Regionen. für die Antigen-Erkennung und TcR-C-Regionen bestehen. Die chimären Gene wurden in Expressionsvektoren, die von Viren abstammten, kloniert, und zytotoxische T-Zellhybridome wurden mit der Protoplastenfusionstechnik durchtrennt. Die Expression dieses chimären TcR versah die Rezipienten-T-Zelle mit Antikörperspezifität, und es war die Erkennung von Antigenen in einer nicht auf MHC beschränkten Weise möglich.
weder Dembic noch Gross erwähnen jedoch die Probleme, die sich aus der Bildung fehlangepasster Dimer von TcR ergeben, die zu inaktiven Heterodimern führt.
Die Targetzellen umfassen vorzugsweise Tumorzellen, Immunzellen, die zu einer Autoimmunantwort beitragen und/oder Zellen, die mit einem Pathogen infiziert sind (insbesondere virusinfizierte Zellen). In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung umfassen die Targetzellen EIV-infizierte Lymphozyten. Als weitere virale Infektionen sind Hepatitis (z. B. Hepatitis B, C und NANB) und das viral induzierte Burkittsche Lymphosarkom zu nennen.
Die heterologen α- und β-TcR-Polypeptide können chimär sein und zum Beispiel eine variable Immunglobulindomäne oder ein Fragment davon umfassen. Solche chimären TcRs nutzen die starke strukturelle Ähnlichkeit zwischen den konstanten und variablen Regionen der α- und β-Ketten des TcR und der Immunglobulin-V- und -C-Regionen aus. Die Verwendung solcher chimärer α- und β-TcR-Polypeptide kann besonders praktisch sein, wenn ein Immunglobulin verfügbar oder ohne weiteres erhältlich ist, das die erforderliche Spezifität aufweist (zum Beispiel durch Anheben von Antikörpern auf bekannte oder vorhergesagte T-Zellantigene).
In einem anderen Aspekt sieht die Erfindung außerdem ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen targetierten zytotoxischen T-Lymphozyten in Erwägung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Vektors, umfassend DNA (z. B. von einem zytotoxischen Donor-T-Lymphozyten abstammende DNA), die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, die für krankheitsverursachende Targetzellen spezifisch sind, und (b) Transfizieren eines zytotoxischen Rezipienten-T-Lymphozyten mit dem Vektor aus Schritt (a), um einen rekombinanten zytotoxischen T-Lymphozyt mit einer DNA zu produzieren, die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, die für krankheitsverursachende Targetzellen spezifisch sind, wobei. der rekombinante zytotoxische T-Lymphozyt aus Schritt (b) die DNA exprimiert, die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, um dem Lymphozyt auf MHC Klasse I beschränkte Spezifität zu verleihen und ihn somit auf die Targetzellen zu targetieren.
Der Vektor aus Schritt (a) kann durch Klonieren, Zusammensetzen oder Synthetisieren (z. B. durch Festphasen- Oligonucleotidsynthese) von DNA bereitgestellt werden, die αund β-TcR-Polypeptide kodiert, die für krankheitsverursachende Target-Zellen spezifisch ist.
Vorzugsweise wird die DNA, die die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, kloniert durch: (a) Gewinnen einer Probe von Donor-T-Lymphozyten, z. B. von einer Blutbank, Blutprobe oder Tumorbiopsie; (b) Anreichern der Probe von Donor-T-Lymphozyten mit zytotoxischen T-Lymphozyten mit Spezifität für krankheitsverursachende Targetzellen, z. B. durch speziell induzierte Proliferation und/oder spezifische klonale Expansion; (c) Extrahieren von chromosomaler DNA von den zytotoxischen Donor-T-Lymphozyten; und (d) Isolieren von DNA, die die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, z. B. durch Primerspezifische PCR-Amplifikation.
Der Vektor kann mit jedem geeigneten Verfahren in den zytotoxischen Rezipienten-T-Lymphozyt eingeführt werden. Der fachkundigen Person werden viele verschiedene Verfahren bekannt sein, einschließlich die Transfektion durch Elektroporation, Protoplastenfusion oder virale (z. B. retrovirale) Transfektion.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt außerdem einen Vektor zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei der Vektor DNA umfasst, die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, die für eine krankheitsverursachende Zelle spezifisch sind. Die DNA des Vektors kann vorzugsweise mit (einem) Expressionselement oder -elementen funktionell verbunden sein, um die Expression der TcR-Polypeptide auf geeignetem Niveau zu erbringen. Es kann eine große Auswahl von Expressionselementen verwendet werden, und das/die Element(e) kann/können eine beliebige Beschaffenheit haben, solange sie (zumindest unter gewissen Bedingungen) dazu veranlasst werden können, die Expression der Gene, mit denen sie funktionell verbunden sind, zu lenken und/oder zu steuern. Das/die Expressionselement(e) kann/können zum Beispiel Transkriptions- und/oder Translationselemente umfassen und Promotoren, Ribosombindungsstellen, Enhancer, Regulationszentren, einschließlich Aktivator- und Repressor(Operator)-Stellen beinhalten. Die Expressionselemente zur Verwendung in der Erfindung können zum Beispiel aus solchen ausgewählt werden, die mit den α- und/oder β-TcR-Peptidgenen natürlich assoziiert sind.
Geeigneterweise ist der erfindungsgemäße Vektor ein viraler Vektor, der beispielsweise auf Simian-Virus 40, Adenoviren (z. B. humane Adenoviren), Retroviren und dem Papillomavirus basiert.
Der Vektor kann ferner Folgendes umfassen: (a) einen positiven selektierbaren Marker, wobei der Marker beispielsweise ausgewählt ist aus Neomycin-Phosphotransferase, Hygromycin-Phosphotransferase, Xanthinguanin-Phosphoribosyltransferase, der Herpes-simplex-Virus Typ 1 Thymidinkinase, Adenin-Phosphoribosyltransferase und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase und/oder (b) einen negativen selektierbaren Marker, wobei der Marker beispielsweise ausgewählt ist aus Herpes-simplex-Virus Typ 1 Thymidinkinase, Adenin-Phosphoribosyltransferase, Hygromycin-Phosphotransferase und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase.
Durch die Verwendung eines positiven selektierbaren Markers wird die Selektion und/oder Identifikation transfizierter T-Lymphozyten erleichtert, wohingegen die Anwesenheit eines negativen selektierbaren Markers die nachfolgende Eliminierung der transfizierten T-Zellen entweder in vivo oder in vitro ermöglicht (zum Beispiel wenn unerwünschte Nebenwirkungen auftreten).
Die Verfahren der Plasmidpräparation zur Herstellung von Konstrukten, um die Transkription und Translation von z. B. den α- und β-Einheiten in Säugetierzellen und insbesondere in den gentechnisch hergestellten zytotoxischen T-Lymphozyten zu ermöglichen, sind der fachkundigen Person wohl bekannt.
Ein besonders vorteilhafter Vektor exprimiert sowohl die α- als auch die β-Ketten unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors. Besonders bevorzugt werden Promotoren, die für die T-Zell- und/oder T-Zell-Präkursor/Progenitor-Zellexpression spezifisch sind, und die Konstrukte können durch einen Poliovirus getrennt werden, das von einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) abstammt. Die IRES ermöglicht die Expression von zwei separaten genetischen Elementen unter der Kontrolle des gleichen Promotor/Enhancer-Elementes, das sich am 5'-Ende der Sequenz befindet.
Der Vektor kann vorteilhafterweise ein retroviraler Vektor sein. Die retrovirale Transduktion von Säugetierzellen ist sehr effizient und kann zum Transduzieren menschlicher Zellen mit Genen verwendet werden, wie die α- und β-Ketten eines selektierten T-Zell-Rezeptors. Der retrovirale Vektor hat vorzugsweise eine spezifische 3'-LTR-Deletion. Auf die Transduktion mit dem Vektor der gentechnisch herzustellenden Zelle und die Umkehrtranskription des Vektors hin, um provirale DNA für den nachfolgenden Einbau in das Genom des Wirts zu bilden, würde die Aktivität des 5'-LTR-Promotor/Enhancer-Elementes verloren gehen. Dadurch könnte die Expression unter die Kontrolle selektierter Promotoren gestellt werden, so dass eine zytotoxische T-Zell-spezifische Expression möglich wäre (Yu SF et al 1986 PNAS USA 83 3194). Sind Vektorgrößenbeschränkungen in einem solchen retroviralen Vektor zu begrenzt, dann könnten jedoch auch alternative Vektoren wie adenovirale Vektoren in Erwägung gezogen werden.
Die targetierten zytotoxischen T-Lymphozyten und Vektoren der Erfindung finden in verschiedenen Formen der Therapie, insbesondere in der adoptiven Immuntherapie, Anwendung. Die Lymphozyten und Vektoren sind vor allem in der adoptiven Immuntherapie nützlich, die die folgenden Schritte umfasst: (a) Entfernen zytotoxischer T-Lymphozyten aus einem Patienten und bei Bedarf selektiv Expandieren dieser in Gewebekultur, (b) Transfizieren der zytotoxischen T-Lymphozyten, die im Schritt (a) entfernt wurden, mit dem erfindungsgemäßen Vektor, um targetierte zytotoxische T-Lymphozyten zu produzieren, und (c) Wiedereinführen der targetierten zytotoxischen T-Lymphozyten aus Schritt (b) in den Patienten.
In dem oben beschriebenen Verfahren sind die in der adoptiven Immuntherapie verwendeten T-Lymphozyten autolog. Dies ist besonders vorteilhaft, da gewährleistet wird, dass die T-Lymphozyten die passenden Costimulations- und Adhäsionsfaktoren haben, die für eine wirksame Erkennung der Targetzellen nach der Wiedereinführung in den Patienten erforderlich sind.
Die Therapie kann auf Krebspatienten, AIDS-Patienten, Personen, die an einer Autoimmunkrankheit leiden oder immunosupprimierte Personen (z. B. Personen mit einem Organtransplantat), die an einer opportunistischen Infektion leiden, angewendet werden.
Die targetierten zytotoxischen T-Lymphozyten und Vektoren der Erfindung finden außerdem als Impfstoffe Verwendung, z. B. für den prophylaktischen Einsatz in Personen mit hohem Erkrankungsrisiko. Beispiele für solche stark gefährdeten Personen sind Personen, die durch genetische oder umweltbedingte Faktoren für Krankheiten (z. B. Krebs, AIDS oder Hepatitis) empfänglich sind. Die erfindungsgemäßen T-Lymphozyten könnten zum Beispiel. verwendet werden, um Immunität gegen AIDS des Typs bereitzustellen, der von Rowland-Jones et al. (1995), Nature Medecine, Bd. 1 (1), Seiten 59-64, offenbart wird.
Die Erfindung wird nachfolgend ausführlicher unter Bezugnahme auf bestimmte Beispiele vorgeschlagener Protokolle beschrieben, von denen man annimmt, dass sie (mit oder ohne Modifikation) praktisch umsetzbar sind. Diese Beispiele sind in keinster Weise als begrenzend anzusehen.
1. Beispiel: TcR-Klonierung
Das Klonieren von T-Zell-Rezeptoren ist seit jeher auf die Bildung von cDNA-Bibliotheken von der T-Zelle angewiesen, die den Rezeptor von Interesse enthält. Das bedeutet, dass für jeden T-Zell-Rezeptor eine neue cDNA-Bibliothek von der entsprechenden klonalen Zelllinie hergestellt werden muss, was ein zeitaufwändiger Prozess ist.
Zwischen den Genen der beiden Untereinheiten des T-Zell-Rezeptors, α und β, gibt es jedoch Regionen mit Sequenzidentität. Diese sind als konstante Regionen bekannt und in jedem α- und β-Unterheitsgen zu finden. Die Sequenzen für diese Regionen sind in veröffentlichten Daten klonierter T-Zell-Rezeptor-Unterheiten zu finden, und durch ihren Vergleich ist es möglich, konstante Regionen mit Sequenzidentität zu identifizieren. Diese Regionen werden zwar konstante Regionen genannt, doch hat eine Analyse ergeben, dass es zwischen konstanten Regionen, die bisher kloniert wurden, gewisse Abweichungen gibt. Kleine Regionen mit konsistenten Sequenzen können allerdings innerhalb einer Rezeptor-Untereinheit ermittelt werden.
Mit diesen Regionen ist es möglich, die α- und β-Unterheitstranskripte voller Länge mit einem Verfahren zu klonieren, das als inverse Polymeraseketten-Reaktion (PCR) bekannt ist und von Ochman et al (Genetics (1988) 120: 621-623) beschrieben wird. Dieses Verfahren stützt sich auf die Fähigkeit der cDNA, die von mRNA abstammt, zirkularisiert zu werden, und darauf, dass mit PCR-Primern, die anhand der bekannten Sequenz des Transkriptes entwickelt werden, die gesamte cDNA durch Kettenverlängerung über die nicht gekennzeichnete Region der zirkularisierten DNA amplifiziert wird. Die resultierenden PCR-Produkte liefern die Sequenz von Interesse jedoch nicht in der korrekten Ausrichtung, so dass es notwendig ist, die PCR-Produkte zu klonieren, um sie zu sequenzieren. Mit den Sequenzdaten ist es möglich, die Sequenz in der korrekten Ausrichtung zu visualisieren und normale PCR-Primer zu entwickeln, um die cDNA voller Länge in der korrekten Ausrichtung zu amplifizieren. Diese cDNA-Klone können dann in Expressionsvektoren zur weiteren Bearbeitung kloniert werden.
Da die inversen Primer anhand einer konstanten Region entworfen werden, kann/können die gleiche Methodik und die gleichen Primer für verschiedene T-Zellklone verwendet werden. Dadurch wird der Zelldichtebedarf wesentlich reduziert und die Geschwindigkeit und Wirksamkeit der TcR-Klonierung erhöht.
Das Verfahren kann wie folgt zusammengefasst werden (s. 1 bis 3):

1) Die gesamte RNA wird von dem T-Zellklon von Interesse mit Trizol-Reagens isoliert.
2) cDNA wird von der gesamten RNA durch Umkehrtranskription mit einem Oligo dT als Primer zur Transkription produziert.
3) Zweitstrang-Synthese wird durch DNA-Polymerase I in Anwesenheit von RNase H erreicht, um Brüche und Lücken in dem hybridisierten mRNA-Strang zu bilden, wodurch 3'-OH Priming-Stellen zur DNA-Synthese bereitgestellt werden.
4) Eine Zirkularisierung findet mit T4DNA-Ligase in einer verdünnten DNA-Konzentration statt, die die Bildung monomerer Kreise begünstigt.
5) Lineare cDNA wird dann durch eine Behandlung mit Exonuclease III entfernt.
6) Unter Verwendung der resultierenden ringförmigen cDNA werden die Transkripte von Interesse durch inverse PCR amplifiziert. Die inversen Primer werden so gestaltet, dass zuerst die cDNA in entgegengesetzten Richtungen (wie in 1 dargestellt) repliziert wird, so dass lineare Produkte entstehen. Diese Produkte replizieren dann wie erwartet mit normaler PCR-Methodik.
7) Die PCR-Produkte werden auf einem Agarosegel separiert, und mehrere der größten Banden werden von dem Gel exzidiert und gereinigt. Die gereinigten Produkte werden dann in einer weiteren PCR-Reaktion verwendet. Als Kontrolle werden jedoch normale PCR-Primer verwendet, die so gestaltet sind, dass sie ein kurzes Stück der konstanten Region von einer der T-Zell-Rezeptor-Untereinheiten amplifizieren. Da die von der inversen PCR gewonnenen Fragmente konstante Regionen beinhalten, wenn sie wahre T-Zell-Rezeptor-Untereinheitstranskripte sind, amplifiziert die normale PCR unter Verwendung dieser Primer kurze Fragmente, die auf einem Agarosegel visualisiert werden können. Fragmente, die beim Amplifizieren mit den entsprechenden normalen Primern keine normalen PCR-Produkte erbringen, repräsentieren keine interessanten Klone und werden verworfen.
8) Die restlichen Fragmente können in den TA-Vektor (erhältlich von Invitrogen) kloniert werden, der ein Plasmidvektor ist, der auf die 3'-Adenylierungsorte angewiesen ist, die während jeder Replikationsrunde durch Taq-Polymerase gebildet werden, um das PCR-Produkt einzubauen. Kompetente Bakterien werden dann mit den resultierenden Plasmiden transformiert, und Transformanten werden nach Ampicillinresistenz selektiert. Plasmide mit Inserts haben ein gespaltenes lac-Z-Gen und erscheinen daher weiß, wenn sie auf Nähragar mit X-gal plattiert werden.
9) Bestätigende Verdaus werden auf Mini-Preps von Plasmid-DNA von den selektierten Klonen durchgeführt. Selektierte Klone werden dann expandiert und es finden Plasmid-Preps im großtechnischen Maßstab zur automatisierten Sequenzierung statt.
10) Nach dem Gewinnen der Sequenzdaten ist die korrekte Ausrichtung des Transkripts erkennbar, indem das Startcodon ATG identifiziert wird (siehe 2 für weitergehende Erläuterungen). Mit diesen Daten können dann PCR-Primer entwickelt werden, um das gesamte Transkript von der ursprünglichen linearen cDNA- Präparation vom T-Zell-Klon zu amplifizieren. Diese können dann in eine Vielfalt von Vektoren kloniert werden, einschließlich eukaryotischer Expressionsvektoren.

Diese Methodik kann für eine grenzenlose Zahl von T-Zell-Rezeptor-Untereinheiten angewendet werden, vorausgesetzt, die entsprechenden T-Zellklone sind verfügbar, ohne dass neue Primer entwickelt werden müssen (mit Ausnahme der Amplifikation der Transkripte voller Länge am Ende des Verfahrens). Darüber hinaus kann das gesamte Verfahren innerhalb von Tagen durchgeführt werden, was im Gegensatz zur cDNA-Bibliothekenerzeugung steht, für die Wochen benötigt werden.
2. Beispiel: Konstruktion zytotoxischer T-Zellen, die auf das MAGE-1-Melanomantigen targetiert sind
Zytotoxische T-Lymphozyten, die das MAGE-1-Genprodukt MZ2-E erkennen (s. z. B. Chen et al. (1994), PNAS 91, S. 1004-1008; Van den Eynde et al. (1989), Int. J. Cancer, 44, S. 634-640; van der Bruggen et al. (1991), Science, 254, S. 1643-1647; Traversari et al. (1992), Immunogenetics, 35, S. 145-152; Traversari et al. (1992), J. Exp. Med. 176, S. 1453-1457) wurden gesammelt und ihre DNA extrahiert.
Von der extrahierten DNA wurde mit einem Lambda-gtll-Vektor eine komplementäre DNA-Bibliothek konstruiert. Komplementäre DNA-(cDNA)-Klone, die die α- und β-Ketten kodieren, wurden anschließend mit α- und β-Ketten-Konstantregion-Hybridisierungssonden isoliert, die z. B. in Dembic et al. (1985) Nature 314, S. 271-273 und Snodgrass et al. (1985) Nature 315, S. 232-233 beschrieben werden. Das angewendete Verfahren war dem in Dembic et al. (1986) Nature, 320, S. 232-238 ähnlich.
Die Gene für beide α- und β-Ketten wurden dann in einen Cosmid-Vektor in der gleichen Transkriptionsausrichtung kloniert, zusammen mit dem Neomycin-Resistenzgen als positiver Selektionsmarker. Angemessene Expressionselemente wurden funktionell mit den α- und β-Kodierungssequenzen gekoppelt, um eine effiziente Expression zu gewährleisten.
Der Cosmidvektor, der die α- und β-Ketten enthielt, wurde dann durch Protoplastenfusion in ein geeignetes zytolytisches Rezipienten-T-Zell-Hybridom transferiert, um ein rekombinantes T-Zell-Hybridom mit Spezifität für das MAGE-1-Genprodukt zu gewinnen.
Die fachkundige Person wird erkennen, dass das oben beschriebene Verfahren ohne weiteres an Wiedergewinnung und Transfer anderer TcRs angepasst werden kann und mit entsprechenden Modifikationen auf jede beliebige zytotoxische Rezipienten-T-Zellpopulation anwendbar ist.
3. Beispiel: Erzeugung genetisch veränderter humaner T-Lymphozyten, um zytotoxische Aktivität gegen Zellen zu exprimieren die das Influenza-(Grippe)-Virus exprimieren
Humane periphere, mononukleäre Vollblutzellen (PBMC), die von einem Klasse I MCH HLA-A2 Blutspender abstammten, wurden präpariert und in vitro in Standardmedium in Anwesenheit von Grippe-Peptiden kultiviert, die bekanntlich in einer auf HLA-A2 beschränkten weise präsentiert werden. Folglich wurden Antigen-präsentierende Zellen gebildet.
Alternativ können Antigen-präsentierende Zellen durch die Zugabe von Peptid in eine Population von dendritischen Zellen gebildet werden, die von einem HLA-A2-beschränkten Spender isoliert wurden.
Nach einer 24-stündigen Inkubation mit Peptid wurden die PBMCs zu CD4/CD8-Zellen gegeben, die von einem kürzlich Influenza-immunisierten menschlichen Spender abstammten, ebenfalls vom auf HLA-A2 Klasse 1 MHC beschränkten Idiotyp. Die von dem immunisierten Spender abstammende CD4/CD8-Zellpopulation wurde in Grenzwert-Verdünnung (100 bis hinab auf 1 Zelle) in Mikrotiterplatten plattiert und 10-14 Tage lang mit angemessenen Mediumwechseln in Anwesenheit der präsentierenden Zellen belassen. Die Platten wurden dann mit Bezug auf expandierende Kolonien von T-Lymphozyten gescreent, die aktivierte CD4/CD8-Zellen repräsentierten, die die Antigen-präsentierenden Zellen erkennen konnten und eine zytotoxische Wirkung auf sie hatten.
Diese expandierenden Kolonien aktivierter T-Lymphozyten, die Influenza-Antigen erkennen konnten, wenn sie durch Zellen in einer auf Klasse 1 MHC beschränkten Weise präsentiert wurden, wurden dann kloniert und zum Präparieren kompletter T-Zell-Rezeptor-α und β-Kettensequenzen wie im 1. Beispiel beschrieben verwendet. Alternativ können andere Verfahren zur Herstellung und Isolierung der der fachkundigen Person bekannten α-und β-cDNR angewendet werden.
Nach dem Isolieren wurde die cDNA der α- und β-Ketten zur gentechnischen Herstellung von T-Zellen verwendet, die von einem nichtimmunen Klasse 1 MHC HLA-A2-Spender stammten. Dadurch wurde den gentechnisch veränderten T-Zellen die Fähigkeit verliehen, mit Influenza infizierte Zellen in einer auf Klasse 1 beschränkten Weise zu erkennen und Zytotoxizität zu vermitteln, wie anhand des Chromium-Release-Assays bestimmt wird.
4. Beispiel: Erzeugung Gentechnisch veränderter humaner T-Lymphozyten, um zytotoxische Aktivität gegen Zellen zu exprimieren, die ein Mitglied der Ras-Onkogen-Familie exprimieren
Humane periphere, mononukleäre Vollblutzellen (PBMC), die von einem Klasse I MCH HLA-A2 Blutspender abstammten, wurden präpariert und in vitro in Standardmedium in Anwesenheit von Harvey-Ras- oder Kirsten-Ras- oder N-Ras-Onkogen-Peptiden kultiviert, die bekanntlich in einer auf HLA-A2 beschränkten Weise präsentiert werden. Folglich wurden Antigen-präsentierende Zellen. gebildet.
Alternativ können Antigen-präsentierende Zellen durch die Zugabe des/der genannten Peptids/Peptide in eine Population von dendritischen Zellen gebildet werden, die von einem HLA-A2-beschränkten Spender isoliert wurden.
Nach einer 24-stündigen Inkubation mit Peptid wurden die PBMCs zu CD4/CD8-Zellen gegeben, die von einer Reihe menschlicher Spender abstammten, ebenfalls vom auf HLA-A2 KLasse 1 MHC beschränkten Idiotyp. Die von den Spendern abstammenden CD4/CD8-Zellpopulationen wurden in Grenzwert-Verdünnung (100 bis hinunter auf 1 Zelle) in Mikrotiterplatten plattiert und 10-14 Tage lang mit geeigneten Mediumwechseln in Anwesenheit der präsentierenden Zellen belassen. Die Platten wurden dann mit Bezug auf expandierende Kolonien von T-Lymphozyten gescreent, die aktivierte CD4/CD8-Zellen repräsentierten, die die Antigenpräsentierenden Zellen erkennen konnten und eine zytotoxische Wirkung auf sie hatten.
Diese expandierenden Kolonien aktivierter T-Lymphozyten, die Ras-Onkogen-Antigen erkennen konnten, wenn sie durch Zellen in einer auf Klasse 1 MHC beschränkten Weise präsentiert wurden, wurden dann kloniert und zum Präparieren kompletter T-Zell-Rezeptor-α- und β-Kettensequenzen wie zuvor beschrieben verwendet.
Nach dem Isolieren wurde dann die cDNA der α- und β-Ketten in Zusammenhang mit der Erkennung von Harvey-Ras oder Kirsten-Ras von N-Ras-Onkogenpeptiden verwendet, um T-Zellen gentechnisch herzustellen, die von einem nichtimmunen Klasse 1 MHC HLA-A2-Spender stammten. Dadurch wurde den gentechnisch veränderten T-Zellen die Fähigkeit verliehen, Ras-Onkogen-Aktivierung in Zellen in einer auf Klasse 1 beschränkten Weise zu erkennen, und solche Zellen erhielten zellvermittelte Zytotoxizität, die anhand des Chromium-Release-Assays bestimmt wurde.
5. Beispiel – Erzeugung gentechnisch veränderter humaner T-Lymphozyten, um zytotoxische Aktivität gegen Zellen zu exprimieren, die HIV-Peptide exprimieren
Humane periphere, mononukleäre Vollblutzellen (PBMC), die von einem Klasse I MCH HLA-B35 Blutspender abstammten, wurden präpariert und in vitro in Standardmedium in Anwesenheit von HIV-Peptiden kultiviert, die bekanntlich in einer HLA-B35-beschränkten Weise präsentiert werden. Folglich wurden Antigen-präsentierende Zellen gebildet.
Alternativ können Antigen-präsentierende Zellen durch die Peptid-Zugabe in eine Population von dendritischen Zellen gebildet werden, die von einem auf HLA-B35 beschränkten Spender isoliert wurden.
Nach einer 24-stündigen Inkubation mit Peptid wurden die PBMCs zu CD4/CD8-Zellen gegeben, die von einem menschlichen Spender mit potentieller HIV-Immunität abstammten, ebenfalls vom auf HLA-B35 Klasse 1 MHC beschränkten Idiotyp. Die von dem potentiell immunen Spender abstammende CD4/CD8-Zellpopulation wurden in Grenzwert-Verdünnung (100 bis hinunter auf 1 Zelle) in Mikrotiterplatten plattiert und 10-14 Tage lang mit angemessenen Mediumwechseln in Anwesenheit der präsentierenden Zellen belassen. Die Platten wurden dann mit Bezug auf expandierende Kolonien von T-Lymphozyten gescreent, die aktivierte CD4/CD8-Zellen repräsentierten, die die Antigen-präsentierenden Zellen erkennen konnten, und solche mit zytotoxischer Wirkung auf sie.
Diese expandierenden Kolonien aktivierter T-Lymphozyten, die HLA-B35-verarbeitetes HIV-Antigen erkennen konnten, wenn sie durch Zellen in einer auf Klasse 1 MHC beschränkten Weise präsentiert wurden, wurden dann kloniert und zum Präparieren kompletter T-Zell-Rezeptor-α- und β-Kettensequenzen wie zuvor beschrieben oder durch alternative Verfahren zur Herstellung und Isolierung der α- und β-cDNA verwendet, die der fachkundigen Person bekannt sind.
Nach dem Isolieren wurde die cDNA der α und β-Ketten verwendet, um T-Zellen gentechnisch herzustellen, die von einem nichtimmunen Klasse 1 MHC HLA-B35 Spender stammten. Dadurch wurde den gentechnisch veränderten T-Zellen die Fähigkeit verliehen, HIV-infizierte Zellen in einer auf Klasse 1 beschränkten Weise zu erkennen. Die zellvermittelte Zytotoxizität durch diese gentechnisch hergestellten Zellen wurde anhand des Chromium-Release-Assays bestimmt.

Claims

Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt mit einem TcR, umfassend heterologe α- und β-Polypeptide, wobei die heterologen Polypeptide auf den Lymphozyt auf MHC Klasse I beschränkte Spezifität für krankheitsverursachende Targetzellen übertragen, wobei der T-Lymphozyt monovalent ist, mit einer einzelnen TcR-Gattung, die auf MHC Klasse I beschränkte Spezifität für eine einzelne Klasse von Targetzellen überträgt, wobei die heterologen TcR-Polypeptide von der Expression rekombinanter oder völlig synthetischer DNA abgeleitet sind, oder wobei die heterologen TcR-Polypeptide direkt oder indirekt von der DNA eines zytotoxischen Donor-Lymphozyten abgeleitet sind.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach Anspruch 1, der rekombinant ist.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach Anspruch 2, der mit einem viralen Vektor transduziert ist.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Targetzellen Tumorzellen, Immunzellen, die zu einer Autoimmunreaktion beitragen, und/oder mit einem Pathogen infizierte Zellen umfassen.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach Anspruch 4, wobei die Targetzellen humane Melanomzellen umfassen und die heterologen α- und β-Polypeptide Spezifität für (a) das MAGE-1-Tumorantigen, (b) das MAGE-3-Tumorantigen, (c) das MART 1/Aa-Tumorantigen, (d) das gp100-Tumorantigen und/oder (e) das Tyrosinase-Tumorantigen übertragen.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach Anspruch 4, wobei das Pathogen ein Virus ist.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach Anspruch 6, wobei die Targetzellen HIV-infizierte Lymphozyten umfassen.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die heterologen α- und β-TcR-Polypeptide als einzelnes Fusionspolypeptid bereitgestellt werden.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die heterologen α- und β-TcR-Polypeptide chimär sind.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach Anspruch 9, wobei die chimären TcR-Polypeptide eine variable Immunglobulindomäne oder ein Fragment davon umfassen.
Verfahren zur Herstellung des targetierten zytotoxischen T-Lymphozyten nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Vektors, umfassend Nucleinsäure (z. B. von einem zytotoxischen Donor-T-Lymphozyten abstammende DNA), die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, die für krankheitsverursachende Targetzellen spezifisch sind, und (b) Transfizieren eines zytotoxischen Rezipienten-T-Lymphozyten mit dem Vektor aus Schritt (a), um einen rekombinanten zytotoxischen T-Lymphozyt mit einer DNA zu produzieren, die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, die für krankheitsverursachende Targetzellen spezifisch sind, 1. wobei der rekombinante zytotoxische T-Lymphozyt aus Schritt (b) die DNA exprimiert, die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, um dem Lymphozyt auf MHC Klasse 2 beschränkte Spezifität zu verleihen und ihn somit auf die Targetzellen zu targetieren.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Vektor aus Schritt (a) bereitgestellt wird durch Klonieren, Zusammensetzen oder Synthetisieren (z. B. durch Festphasen-Oligonucleotidsynthese) der DNA, die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, die für krankheitsverursachende Targetzellen spezifisch sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die DNA, die die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, kloniert wird durch: (a) Gewinnen einer Probe von Donor-T-Lymphozyten, z. B. von einer Blutbank, Blutprobe oder Tumorbiopsie; (b) Anreichern der Probe von Donor-T-Lymphozyten mit zytotoxischen T-Lymphozyten mit Spezifität für krankheitsverursachende Targetzellen, z. B. durch speziell induzierte Proliferation und/oder spezifische klonale Expansion; (c) Extrahieren von chromosomaler DNA von den zytotoxischen Donor-T-Lymphozyten; und (d) Isolieren von DNA, die die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, z. B. durch Primer-spezifische PCR-Amplifikation.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei der Vektor in den zytotoxischen Rezipienten-T-Lymphozyt durch Elektroporation, Protoplastenfusion oder virale (z. B. retrovirale) Transfektion transfiziert wird.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt, der mit dem Verfahren aus einem der Ansprüche 11 bis 14 produzierbar ist,.
Vektor zur Verwendung in dem Verfahren aus einem der Ansprüche 11 bis 14, umfassend DNA, die α- und β-TcR-Polypeptide kodiert, die für eine krankheitsverursachende Zelle spezifisch sind, wobei die DNA zum Beispiel mit (einem) Expressionselement oder -elementen funktionell verbunden ist, wobei das/die Expressionselement oder -elemente zum Beispiel ausgewählt ist/sind aus Transkriptions- und/oder Translationselementen, Promotoren, Ribosombindungsstellen, Enhancer, Regulationszentren (z. B. Aktivator- und Repressor(Operator)-Stellen) und Expressionselementen, die mit den α- und/oder (3-TcR-Peptidgenen natürlich assoziiert sind.
Vektor nach Anspruch 16, der ein viraler Vektor ist und zum Beispiel auf Simian-Virus-40-Adenoviren (z. B. humane Adenoviren), Retroviren und Papillomvirus basiert.
Vektor nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, ferner umfassend: (a) einen positiven selektierbaren Marken, wobei der Marken beispielsweise ausgewählt ist aus Neomycin-Phosphotransferase, Hygromycin-Phosphotransferase, Xanthinguanin-Phosphoribosyltransferase, der Herpes-simplex-Virus Typ 1 Thymidinkinase, Adenin-Phosphoribosyltransferase und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase und/oder (b) einen negativen selektierbaren Marken, wobei der Marken beispielsweise ausgewählt ist aus Herpes-simplex-Virus Typ 1 Thymidinkinase, Adenin-Phosphoribosyltransferase, Hygromycin-Phosphotransferase und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase.
Targetierter zytotoxischer T-Lymphozyt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 15, mit einem TcR, umfassend heterologe α- und β-Polypeptide, wobei die heterologen Polypeptide auf den Lymphozyt auf MHC Klasse I beschränkte Spezifizität für eine Targetzelle übertragen, zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung von: (a) dem targetierten zytotoxischen T-Lymphozyt nach Anspruch 19, oder (b) dem Vektor aus einem der Ansprüche 16 bis 18, zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung in der adoptiven Immuntherapie.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei der Patient ein Krebspatient, ein AIDS-Patient, eine an einer Autoimmunkrankheit leidende Person oder eine immunosupprimierte Person ist (z. B. eine Person mit einem Organtransplantat), die an einer opportunistischen Infektion leidet.
Verwendung von: (a) dem targetierten zytotoxischen T-Lymphozyt nach Anspruch 19, oder (b) dem Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 18, zur Herstellung eines Impfstoffs zur Verwendung in der Immuntherapie oder Prophylaxe, z. B. zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von AIDS.
Impfstoff, umfassend den targetierten zytotoxischen T-Lymphozyt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 15, beispielsweise ferner umfassend ein pharmazeutisch akzeptables Bindemittel.