DE69838648T2 - Verwendung von multivalenten chimären peptidbeladenen mhc/ig-molekülen zum nachweis, zur aktivierung oder unterdrückung einer antigenspezifischen t-zellabhängigen immunantwort - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Immunsystem stellt ein Abwehrsystem dar, das in seiner höchst entwickelten Form in höheren Vertebraten gefunden wird. Dieser Abwehrmechanismus stellt schnelle und hoch spezifische Antworten bereit, die zum Schutz eines Organismus gegen die Invasion durch pathogene Mikroorganismen verwendet werden. Es ist die Myriade pathogener Mikroorganismen, die in erster Linie die Evolution des Immunsystems in seine gegenwärtige Form veranlasst hat. Es wird angenommen, dass spezifische Immunantworten außer am Schutz gegen infektiöse Agenzien auch an der Überwachung gegen die Tumorentwicklung, die Pathogenese von Autoimmunkrankheiten und die Abstoßung von Transplantatgewebe beteiligt sind.
  • Die T-Zellen stellen die bedeutendsten Regulationszellen des Immunsystems dar. Die Regulationsfunktionen der T-Zellen hängen nicht nur von der Expression eines einzigartigen T-Zellrezeptors, sondern auch von der Expression vieler verschiedener akzessorischer Moleküle und Effektorfunktionen ab, die mit einer individuellen T-Zellantwort (z. B. einer zytotoxischen Antwort versus einer Antwort, gekennzeichnet durch die Sekretion von Effektormolekülen, wie zum Beispiel Lymphokinen) assoziiert sind. Es ist diese häufig bei der Entwicklung von Autoimmunkrankheiten entgleisende Regulationsfunktion, die bei der Abstoßung von Gewebstransplantaten eine große Rolle spielt und bei der Tumorabstoßung wichtig sein kann.
  • Die Spezifität von T-Zellantworten wird durch ein einzigartiges Set von Zelloberflächenrezeptoren verliehen, die auf individuellen Lymphozyten, als klonotypische T-Zellrezeptoren (TCR) bezeichnet, exprimiert werden. Kognate Liganden der klonotypischen TCR stellen Antigen-Hauptkompatibilitäts-Moleküle (Antigen-MHC-Moleküle) dar. T-Zellrezeptoren erkennen Antigene in der Form kleiner antigener Peptide, die von den MHC-Molekülen auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden. Während die Interaktion zwischen einem antigenen Peptid und einer MHC ziemlich stabil ist, wobei sie im Allgemeinen eine hohe Affinität (10–9 M) und folglich eine lange Dissoziationshalbwertzeit aufweist, ist die Interaktion zwischen einem T-Zellrezeptor und einem Peptid/MHC-Komplex – das kritische Erkennungsereignis beim Triggern von T-Zellen – zwischen 10–4–10–6 M von relativ geringer Affinität. Aufgrund dieser geringen Affinität wird die T-Zellantwort durch die Interaktion vieler T-Zellrezeptoren auf der Oberfläche einer individuellen T-Zelle, die mit multiplen antigenen Peptid/MHC-Komplexen auf der Oberfläche der das Antigen präsentierenden Zelle interagiert, angetrieben.
  • Antigen-spezifische T-Zellen spielen bedeutende Rollen in den normalen physiologischen Immunantworten und bei vielen Krankheitszuständen. Die Hyperaktivierung von antigenspezifischen T-Zellen, die auf Selbstantigene targetiert ist, stellt die grundlegende Basis für die Mehrzahl der Autoimmunkrankheiten, einschließlich multipler Sklerose, Arthritis und Diabetes dar. Umgekehrt erlaubt die Inaktivität von tumorantigenspezifischen T-Zellen Tumoren zu wachsen. Folglich stellte die Aktivierung dormanter oder toleranter tumorspezifischer T-Zellen ein wichtiges Ziel der Krebsimmuntherapie dar. Andere wichtige medizinische Phänomene, wie zum Beispiel die Abstoßung transplantierter Organe, hängen von der Aktivität von T-Zellen ab, die für von diesen Organen exprimierte Alloantigene spezifisch sind. Die antigenspezifische Suppression unerwünschter T-Zellantworten könnte potenziell die Abstoßung von Organtransplantaten eliminieren.
  • Die Verwendung von löslichen monovalenten Reagenzien zum Überwachen und Modulieren antigenspezifischer T-Zellen ist durch die Tatsache begrenzt, dass T-Zellrezeptoren mit Peptid/MHC-Komplexen mit relativ geringen Affinitäten interagieren (28–30). Folglich regulieren lösliche monovalente Analoge von entweder T-Zellrezeptoren oder Peptid/MHC-Komplexen Immunantworten nicht wirksam.
  • Lösliche multivalente Analoge von Proteinen, die an Immunantworten beteiligt sind, wurden hergestellt. Solche Analoge schließen CD4/Ig-Chimären (41, 42), CR2/Ig-Chimären (43), und Klasse-I-MHC/Ig-Chimären ein (20). Der Einfluss der Valenz auf die Ligandenaffinität dieser Analoge ist variabel. So weisen zum Beispiel CD4/Ig-Moleküle keine höhere Affinität zu ihrem Liganden als lösliche monovalente CD4-Moleküle auf. Tetravalente Peptide/MHC-Komplexe weisen eine hohe Affinität zu spezifischen T-Zellrezeptoren auf. Bivalente MHC-Analoge weisen jedoch keine genügend hohe Affinität auf, um die Färbung oder Regulierung antigenspezifischer T-Zellen zuzulassen. Folglich besteht im Stand der Technik ein Bedarf an Mitteln, die T-Zellen spezifisch induzieren oder supprimieren, die für Antigene spezifisch sind, die mit Infektionen, Allergien, Tumoren, transplantierten Organen und Autoimmunkrankheiten assoziiert sind.
  • WO 93/10220 offenbart lösliche chimäre Proteine, die eine MHC-Komponente umfassen, die mit einer Komponente einer konstanten Immunglobulinregion verknüpft sind. Die Verwendung der variablen Region im chimären Protein wird zu verhindern versucht, wobei die Komponente der konstanten Schwerkettenregion nur einen Anteil einer variablen Immunglobulinregion, gewöhnlich weniger als zehn Aminosäuren, umfasst.
  • WO 96/04314 offenbart einen MHC-Fusionskomplex von einem MHC-Molekül, das kovalent mit einem antigenen Peptid verknüpft ist, das mit konstanten Regionen eines Immunglobulins kovalent verknüpft sein kann. Die Verwendung der variablen Region des Immunglobulins wird nicht vorgeschlagen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Sets von Reagenzien, die spezifisch und stabil an antigenspezifische T-Zellen binden und diese modulieren. Dies und andere Gegenstände der Erfindung werden durch eine oder mehr der folgenden Ausführungsformen bereitgestellt.
  • Eine erfindungsgemäße Ausführungsform stellt eine Zusammensetzung bereit, die – wie im unabhängigen Anspruch 1 ausgeführt – mindestens zwei chimäre Proteine umfasst. Das chimäre Protein umfasst ein MHC-Molekül und eine Immunglobulinkette. Das chimäre Protein assoziiert zur Bildung molekularer Komplexe, die mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex umfassen. Ein antigenes Peptid ist an jedes MHC-Molekül gebunden. Jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex ist an ein identisches antigenes Peptid gebunden.
  • Es wird auch ein Vektor beschrieben, der für ein chimäres Protein kodiert. Das chimäre Protein umfasst eine Immunglobulin-Schwerkette und ein MHC-Molekül. Das Immunglobulin stellt kein IgG-1 dar. Die Immunglobulin-Schwerkette befindet sich C-terminal zum MHC-Molekül.
  • Es wird auch eine Zusammensetzung beschrieben, umfassend ein chimäres Protein, das ein MHC-Molekül und eine Ig-Kette umfasst. Das chimäre Protein assoziiert zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex. Die Immunglobulinkette stellt keine IgG-Schwerkette dar.
  • Es wird auch eine Zusammensetzung beschrieben, umfassend eine Zelle, in der ein chimäres Protein an die Oberfläche der Zelle gebunden ist. Das chimäre Protein umfasst ein MHC-Molekül und eine Immunglobulinkette. Das chimäre Protein assoziiert zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex. Ein antigenes Peptid ist an jedes MHC-Molekül gebunden. Jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex ist an ein identisches antigenes Peptid gebunden.
  • Es wird auch ein Verfahren zur Behandlung eines an einer Allergie leidenden Patienten beschrieben. Ein chimäres Protein, das ein MHC-Molekül und eine Immunglobulinkette umfasst, wird an einen Patienten in einer Dosis verabreicht, die zur Suppression einer mit einer Allergie des Patienten assoziierten T-Zellantwort ausreichend ist. Das chimäre Protein assoziiert zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex. Ein antigenes Peptid ist an jedes MHC-Molekül gebunden. Jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex ist an ein identisches antigenes Peptid gebunden. Das antigene Peptid stellt ein Antigen dar, gegen das der Patient eine allergische Reaktion aufweist.
  • Es wird auch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten beschrieben, der ein Organtransplantat empfangen hat oder empfangen wird. Ein chimäres Protein, das ein MHC-Molekül und eine Immunglobulinkette umfasst, wird an den Patienten in einer Dosis verabreicht, die zur Suppression einer Immunantwort gegen das transplantierte Organ ausreichend ist. Das chimäre Protein assoziiert zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex. Ein antigenes Peptid ist an jedes MHC-Molekül gebunden. Jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex ist an ein identisches antigenes Peptid gebunden. Das antigene Peptid stellt ein Alloantigen dar.
  • Es wird auch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten beschrieben, der an einer Autoimmunkrankheit leidet. Ein chimäres Protein, das ein MHC-Molekül und eine Immunglobulinkette umfasst, wird an den Patienten in einer Dosis verabreicht, die zur Suppression einer mit der Autoimmunkrankheit assoziierten Immunantwort ausreichend ist. Das chimäre Protein assoziiert zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex. Ein antigenes Peptid ist an jedes MHC-Molekül gebunden. Jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex ist an ein identisches antigenes Peptid gebunden. Das antigene Peptid stellt eines dar, gegen das der Patient eine Autoimmunantwort aufweist.
  • Es wird auch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einem Tumor beschrieben. Ein chimäres Protein, das ein MHC-Molekül und eine Immunglobulinkette umfasst, wird an den Patienten in einer Dosis verabreicht, die zur Induktion oder Förderung einer Immunantwort gegen den Tumor ausreichend ist. Das chimäre Protein assoziiert zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex. Ein antigenes Peptid ist an jedes MHC-Molekül gebunden. Jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex ist an ein identisches antigenes Peptid gebunden. Das antigene Peptid stellt ein Tumor-assoziiertes Peptid dar.
  • Es wird auch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Infektion beschrieben. Ein chimäres Protein, das ein MHC-Molekül und eine Immunglobulinkette umfasst, wird an den Patienten in einer Dosis verabreicht, die zur Induktion oder Förderung einer Immunantwort gegen die Infektion ausreichend ist. Das chimäre Protein assoziiert zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex. Ein antigenes Peptid ist an jedes MHC-Molekül gebunden. Jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex ist an ein identisches antigenes Peptid gebunden. Das antigene Peptid stellt ein mit dem infektiösen Agens assoziiertes Peptid dar.
  • Es wird auch ein Verfahren zur Markierung antigenspezifischer T-Zellen offenbart. Eine Probe, die antigenspezifische T-Zellen umfasst, wird mit einem chimären Protein in Kontakt gebracht. Das chimäre Protein umfasst ein MHC-Molekül und eine Immunglobulinkette. Das chimäre Protein assoziiert zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex. Jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex ist an ein identisches antigenes Peptid gebunden. Das antigene Peptid bindet spezifisch an und markiert die antigenspezifischen T-Zellen.
  • Diese und andere Ausführungsformen stellen für den Stand der Technik Werkzeuge und Verfahren zum Modulieren antigenspezifischer T-Zellimmunantworten bereit.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1. 1A stellt ein schematisches Diagramm von chimären MHC/Ig-Molekülen dar, die in einer konformational intakten Weise an den Enden der Immunglobulin-Schwerketten gebildet werden. 1B stellt ein schematisches Diagramm des pA2/Ig-Plasmids dar, das die Regionen enthält, die für die extrazellulären Domänen (α1–α3) des HLA-A2-Klasse I-MHC-Moleküls kodieren, die genetisch mit der variablen Region eines IgG1-Schwerkettengens verknüpft sind.
  • 2. Mit Peptid beladene Ld/Ig-Moleküle, die spezifisch an T-Zellen binden, die ihren kognaten Liganden exprimieren. Ld/Ig-Moleküle wurden über Nacht mit Peptiden (100 μM) beladen. Zu den verwendeten Peptiden gehörten das 2C-CTL-reaktive Peptid p2Ca, ein für murine CT-26-Zellen spezifisches Tumorpeptid, AH1, und ein anderes Ld-restringiertes Modell-Tumorantigen, das sich von der β-Galactosidase, β-gal, herleitet. Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Peptid/Ld/Ig-Komplexe zum Färben der antigenspezifischen T-Zellen 2C- und anti-CT-26-CTL verwendet. Viable T-Zellen wurden unter Verwendung der Lymphozyten-M-Trennung gereinigt und mit 20 μg/ml des Peptid/Ld/Ig-Komplexes 1 Stunde bei RT zur Reaktion gebracht. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit Ziegen-anti-Maus-PE gefärbt und mittels der Durchflusszytometrie analysiert. Repräsentative Histogramme sind gezeigt. 2A. 2C-CTL waren mit p2CaLd/Ig-Komplexen, aber nicht mit AH1Ld/Ig-Komplexen reaktiv. 2B. CT-26-spezifische T-Zellen waren nur mit Ld/Ig, aber weder mit p2CaLd/Ig- oder β-galLd/Ig-Komplexen reaktiv.
  • 3. Schematisches Diagramm des Kb/IgG-Beladungsschemas.
  • 4. Peptidstripping und -Wiederbeladung fördert die wirksame Beladung von Kb/IgG-Molekülen mit Peptid. Kb/IgG-Moleküle wurden wie beschrieben entweder „passiv" oder „aktiv" mit Peptiden (100 µM) beladen. Die verwendeten Peptide schlossen das 2C-CTL-reaktive Peptid SIY ein. Ein Kontrollpeptid schloss ein anderes Kb-Bindungspeptid, VSV, ein. Verschiedene Verdünnungen von pepMHC/Ig-Komplexen wurden zum Färben 2C-spezifischer T-Zellen verwendet. Viable T-Zellen wurden unter Verwendung der Lymphozyten-M-Trennung gereinigt und mit 20 µg/ml des Peptid/Ld/Ig-Komplexes 1 Stunde bei 4°C zur Reaktion gebracht. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit Ziegen-anti-Maus-PE gefärbt und mittels der Durchflusszytometrie analysiert. Repräsentative Histogramme werden gezeigt.
  • 5. Mit Peptid beladene MHC/Ig-Moleküle binden T-Zellen mit hoher Affinität. Ld/Ig- oder Kb/Ig-Moleküle wurden wie beschrieben mit Peptiden (100 µM) beladen. Zu den verwendeten Peptiden gehörten die 2C-CTL-reaktiven H-2Ld-restringierten Peptide QL9 und p2Ca und das 2C-CTL-reaktive H-2kb-restringierte Peptid SIY. Die Kontrollpeptide schlossen ein anderes Ld-Bindungspeptid MCMV und ein Kb-Bindungspeptid VSV ein. Verschiedene Konzentrationen von Peptid-/MHC/Ig-Komplexen wurden wie zuvor beschrieben zum Färben 2C-spezifischer T-Zellen verwendet. Repräsentative Histogramme wurden analysiert und die Daten werden als Mittelwert der Kanalfluoreszenzwerte vorgelegt.
  • 6. SEC-Analyse von mit Peptid beladenen MHC/Ig-Molekülen. Ca. 50 µg SIYKb/Ig- oder QL9Ld/Ig-Moleküle wurden auf eine Größenausschlusschromatographie-Säule geladen (Superdex 200, Pharmacia Biotech). Die Säule wurde mit einem PBS-Laufpuffer bei 0,4 ml/min auf einem BioLogic-Chromatographiesystem (BioRad, Hercules, CA.) laufen lassen, wobei die Fraktionen alle 0,4 ml gesammelt wurden. Die O. D. bei 280 werden für beide chimären Proteine in einer Kurve aufgetragen.
  • 7. Die Färbung von 2C-CTL ist auf die monomere Fraktion von SIYKb/Ig zurückzuführen. Die Kb/Ig-Moleküle wurden, wie beschrieben, mit SIY-Peptid, 100 µM Endkonzentration, beladen. Viable T-Zellen wurden unter Verwendung der Lymphozyten-M-Trennung gereinigt und mit entweder einer Verdünnung von 1/5 oder 1/50 von jeder Fraktion, die durch eine präparative SEC-Analyse von SIYKb/Ig (500 µg) wie vorstehend beschrieben gesammelt wird, zur Reaktion gebracht. Die Zellen wurden mit jeder von der SEC-Analyse gesammelten Fraktion 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit Ziegen-anti-Maus-PE gefärbt und mittels der Durchflusszytometrie analysiert. Die gezeigten Daten stellen den von repräsentativen Proben erhaltenen Mittelwert der Kanalfluoreszenz dar. Die Experimente wurden mindestens zweimal wiederholt. Repräsentative Daten werden vorgelegt.
  • 8. Nachweis AH1-spezifischer T-Zellen aus der Milz 14 Tage nach der Vakzination mit CT26-GM.
  • 9. pepMHC/Ig-Komplexe, die spezifisch die Peptid-abhängige Lyse von Targetzellen mittels 2C-CTL inhibieren. Mit Chrom markierte T2Kbm3-Targetzellen wurden 2,5 h bei 25°C mit dEV8-Peptid (10 nM) vorinkubiert. 2C-T-Zellen (3 × 104/Well) wurden gleichzeitig mit dem angezeigten Liganden in verschiedenen Konzentrationen 1,5 h in Wells mit V-Boden inkubiert. Nach den Inkubationen wurden den Effektoren/Liganden die ungewaschenen Targets (3 × 103 pro Well) zugefügt, und die Platten wurden anschließend vor dem Ernten und der Zählung 4 h bei 37°C inkubiert. Es wurde der standardmäßige prozentuale Anteil der spezifischen Lyse bestimmt.
  • 10. pepMHC/Ig-Komplexe, die spezifisch die Proliferation von 2C-CTL durch allogene Targetzellen inhibieren. Die 2C-T-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von SIYKb/Ig 2,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Bestrahlte (3000 rad), frisch isolierte BALB/c-Splenozyten (die H-2Ld exprimieren) wurden den Responder-Zellliganden bei 2,5 × 105/Well zugefügt. Im Anschluss an eine 60-stündige Inkubation wurden die Zellen mit [3H]-Thymidin gepulst und weitere 18 h inkubiert, bevor sie geerntet und gezählt wurden.
  • 11. Mit Peptid beladenes HLA-A2/Ig färbt spezifisch HTLV-1 Tax11-19- oder HIVp17 Gag77–85-spezifische T-Zellklone. 11A. Die FACS-Analyse wurde unter Verwendung von A6-Zellen (22), die für das immundominante HLA-A2-restringierte Tax-Epitop Tax11-19 spezifisch ist. Das mit HTLV-1 Tax11-19 beladende HLA-A2/IgG band stabil auf der Zelloberfläche und wurde unter Verwendung von PE-markiertem Ziegen-anti-Maus-Ig nachgewiesen (dicke Linie). Gag-A2/Ig wurde als irrelevante Kontrolle (feine Linie) ebenso wie kein HLA-A2/Ig, nicht beladenes HLA-A2/Ig und mit M1-beladene HLA-A2/Ig (gepunktete und unterbrochene Linien überlappend) nachgewiesen. 11B. Für das HLA-A2-restringierte HIV p17 Gag77–85-Epitop spezifische T-Zellen wurden zum Nachweis der Peptid-Spezifität von Peptid-beladenem HLA-A2/Ig gefärbt. Mit Gag77–85-beladenes HLA-A2/IgG wurde stabil auf der Zelloberfläche gebunden und unter Verwendung von PE-markierten Ziegen-anti-Maus-Ig (dicke Linie) nachgewiesen. Mit HTLV-1 Tax11-19 beladenes HLA-A2/Ig ebenso wie nicht mit Peptid beladenes, M1-beladenes HLA-A2/Ig, und kein HLA-A2/Ig wurden als irrelevante Kontrolle verwendet und färbten sich nahezu identisch an (überlappende dünne, gepunktete und unterbrochene Linien).
  • 12. Mit Peptid beladenes HLA-A2/Ig kann zur Sichtbarmachung von antigenspezifischen CD8+-T-Zellen in peripherem Blut verwendet werden. Die Zweifarben-Durchflusszytometrie wurde unter Verwendung von Tax-A2/Ig oder Gag-A2/Ig und Maus-anti-human-CD8-FITC durchgeführt. PE-markierter Ziegen-anti-Maus-monoklonaler IgG1-Antikörper wurde zum Nachweis des Peptid-A2/Ig-Komplexes verwendet. Gefrorene PBL von einem HAM/TSP-Patienten (Donor H1 siehe Tabelle 1) wurden untersucht. Anti-humane CD8-FITC und Tax-A2/Ig färbten 4,03% der PBL aus dem HAM/TSP-Patienten positiv an. Dies stellt 10,49% aller CD8+-Zellen dar. Unter Verwendung von Gag-A2/Ig wurde kein signifikantes Signal gesehen (< 0,1%). PBL von einer mit HLA-A2+ HIV-I infizierten Person wiesen 3% Gag-A2/Ig-positive CD8+-T-Lymphozyten auf.
  • 13. HAM/TSP-Patienten tragen hohe Zahlen von HTLV-1 Tax11-19-spezifischen CD8+-Zellen in ihrem PBL. Der prozentuale Anteil von HTLV-1 Tax11-19-spezifischen CD8+-T-Zellen aus HLA-A2+-HAM/TSP-Patienten, mit HTLV-1 infizierten HLA-A2+-Trägern, HLA-A2–-HAM/TSP-Patienten und gesunden Personen wird vorgelegt. Zwischen 0,64 und 10,25% der CD8+-Zellen von HAM/TSP-Patienten sind für das HTLV-1 Tax11-19-Peptid spezifisch. Einer der analysierten, mit HTLV-1-infizierten Donoren wies 0,33% Tax-spezifische CD8+-Zellen auf, wohingegen keine signifikanten Zahlen Tax-spezifischer CD8+-Zellen in Nicht-HLA-A2-HAM/TSP-Donoren oder HLA-A2+-gesunden Personen gefunden wurden. Positive Proben wurden mindestens zweimal gefärbt.
  • 14. HTLV-1 Tax11-19-spezifische CD8+-T-Zellen akkumulieren in der Cerebrospinalflüssigkeit. Cerebrospinalflüssigkeit und peripheres Blut wurden von einem HAM/TSP-Patienten (H1) am gleichen Tag gewonnen und unter Verwendung von Tax-A2/Ig analysiert. Am der Cerebrospinalflüssigkeit wurden 9 × 104 Zellen gewonnen und wie in 13 beschrieben unter Verwendung von Tax/A2-Ig und Gag/A2-Ig zusammen mit Maus-anti-human-CD8-FITC gefärbt. Frisch gewonnene mit Ficoll gereinigte PBL wurden parallel analysiert. 14A. Von den CD8+-T-Zellen in der Cerebrospinalflüssigkeit waren 23,7% Tax-spezifisch, wohingegen nur 9,4% der CD8+-T-Zellen aus dem peripheren Blut Tax-spezifisch waren. Unter Verwendung von Gag-A2/Ig wurde kein signifikantes Signal verzeichnet (< 0,1%). 14B. Die CD4/CD8-Analyse zeigte, dass aufgrund einer höheren Anzahl von CD8+-T-Zellen in der CSF das Verhältnis von CD4/CD8 in der CSF 1,1 und im PBL 1,5 betrug.
  • 15. Tax-spezifische CD8+-Zellen von HAM/TSP-Patienten exprimieren den Zelloberflächen-Aktivierungsmarker HLA-DR. Unter Verwendung der Dreifarben-Durchflusszytometrie wurden Tax-spezifische CD8+-Zellen ausgewählt („gated") und unter Verwendung von Maus-anti-human-HLA-DR-FITC (durchgehende Linie) und einer Isotyp-gematchten irrelevanten Maus-IgG2a-FITC-Kontrolle (gepunktete Linie) auf HLA-DR-Expression analysiert. 15A und 15B. In 2 verschiedenen symptomatischen HAM/TSP-Patienten färbten sich 41–50% der Tax-spezifischen CD8+-T-Zellen positiv auf HLA-DR-Expression. 15C. Im Gegensatz dazu ergaben nur 21% der Tax-spezifischen CD8+-T-Zellen von Patient H6, der eine sehr leichte Form der Erkrankung aufweist, eine positive Färbung. 15D zeigt eine nicht stimulierte Färbungskontrolle. 15E zeigt eine Kontrollfärbung von PHA-stimulierten CD8+-PBL von einem gesunden Donor.
  • 16. Tax-spezifische CD8+-Zellen von HAM/TSP-Patienten exprimieren intrazelluläres IFN-γ und TNF-α. Unter Verwendung der Dreifarben-Durchflusszytometrie wurden die Tax-spezifischen CD8+-Zellen ausgewählt („gated") und auf intrazelluläre Cytokin-Expression analysiert. 16A. Unter Verwendung von Maus-anti-human-IFN-γ-PE, Maus-anti-human-TNF-α-PE und einer Isotyp-gematchten irrelevanten Maus-IgG1-PE-Kontrolle exprimierten 28% der Tax-spezifischen CD8+-Zellen aus H1 intrazelluläres IFN-γ und 29% exprimierten TNF-α, 16B. Nur 8% der Tax-spezifischen CD8+-Zellen aus H6 exprimierten intrazelluläres IFN-γ und TNF-α.
  • 17. Im Verlauf der HAM/TSP persistieren hohe Spiegel von HTLV-1 Tax-spezifischen CD8+-T-Lymphozyten. Vom Patienten H1 zwischen 1989 und 1998 gewonnene PBL-Proben wurden auf Tax-spezifische CD8+Zellen analysiert. In den gefrorenen PBL-Proben wurden zwischen 7,24 und 13,87% spezifische CD8+-T-Zellen nachgewiesen.
  • 18. Struktur von mit Tax11-19-Peptid komplexiertem HLA-A2. Es werden zwei Ansichten von der 3-D-Struktur der HLA-A2-Schwerkette (grün), β2M (violett) und Tax11-19-Antigenpeptid (rot) gezeigt. Die carboxylterminale Position 9 des Tax11-19-Peptids und die aminoterminale Position 1 der β2M-Polypeptide sind als raumfüllende Diagramme dargestellt, während der Rest der Ketten als Ribbon-Diagramme gezeigt ist. Die Sauerstoffgruppen in den raumfüllenden Aminosäureresten sind als rote Kugeln dargestellt, während die Stickstoffgruppen als hellblaue zu sehen sind. Es wurde festgestellt, dass der Abstand zwischen dem Aminoterminus des β2M-Moleküls und Position 9 des Peptids 20,49 Ångstrom betrug. Der offene Zugang der Region zwischen den Enden des Peptids und dem β2M-Molekül können am besten auf der Seitenansicht vom Komplex (auf der linken Seite von 18), dem Peptid für den Klasse I-Komplex in der Folge der Modifikation des carboxylterminalen Tax-Peptids, Position 9, gesehen werden. Die Verankerung des Peptids am MHC-Molekül wird teilweise durch Bindungen an den carboxylterminalen Sauerstoff erreicht, die im gebundenen („thethered") Peptid-β2M-Komplex nicht zur Verfügung stehen. Für diese verminderte Affinität kann durch die Stabilisierung mit β2M kompensiert werden.
  • 19. Zur Generierung von an 2M gebundene Peptide verwendetes schematisches Oligo-Design.
  • 20. Mittels der Durchflusszytometrie analysierte spezifische Interaktion von Peptid-gebundenen Tax-β2M HLA-A2/Ig-Komplexen mit HLA-A2 restringierten CTL-Klonen. Der Mittelwert der Kanalfluoreszenz (MCF) von mit Peptid-gebundenen („tethered") Tax-β2M HLA-A2/Ig-Komplexen gefärbten A6-Zellen betrug Ca. 4000, der MCF von mit keinem chimären Protein gefärbten A6-Zellen betrug nur 10 und war fast identisch mit den Färbungskontrollen mit dem Kontroll-Gag-A2/Ig-Komplex, nicht beladenem HLA-A2/Ig. Der Färbungsgrad mit Tax-β2M war dem ähnlich, der mit einem Anti-Vβ13.1 spezifischen mAk erhalten wurde, was darauf hindeutet, dass alle relevanten Orte unter Verwendung von Tax-β2M HLA-A2/Ig gesättigt waren. Folglich stellt das Peptid-Tethering an β2M eine wirksame Weise dar, Peptide im Kontext von MHC/Ig-Molekülen zu präsentieren.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gegenstand der Erfindung sind lösliche, hoch affine, multivalente Analoge von MHC-Molekülen. Diese Reagenzien können als Diagnostika zum Nachweis antigenspezifischer T-Zellen oder für die Therapie, entweder zur Aktivierung oder Suppression antigenspezifischer T-Zellen in vitro und in vivo eingesetzt werden. Deshalb können diese Reagenzien in der selektiven Immuntherapie von Infektionen, Allergien, Autoimmunkrankheiten, Krebs und der Abstoßung von Organtransplantaten angewendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Reagenzien exprimieren einen einzelnen Peptid/MHC-Komplex in einem multivalenten Array. Das multivalente Array wird unter Verwendung eines Immunglobulin-Rückgrats als ein Molekülgerüst für die Präsentation eines antigenen Peptid/Klasse I-Komplexes gebildet. Diese Arrays können durch Produktion chimärer Gene, in denen, wie nachstehend beschrieben, ein MHC-Gen mit dem 5'-Ende einer Immunglobulin-Schwerkette verknüpft ist, hergestellt werden. Wenn diese Konstrukte zum Beispiel im Baculovirus oder in Hybridomzellen exprimiert werden, produzieren sie chimäre Moleküle, die, bezogen auf die Valenz des Molekülgerüsts des Immunglobulinmoleküls multivalent sind.
  • Die chimären MHC/Ig-Moleküle werden auf konformational intakte Weise an den Enden der Immunglobulin-Schwerketten gebildet (siehe 1A für eine schematische Repräsentation). Wenn sie homogen mit antigenen Peptiden beladen werden, weisen die MHC/Ig-Chimären (pepMHC/Ig-Moleküle) eine ausreichend hohe Affinität zur Produktion einer stabilen Bindung auf und können die antigenspezifischen T-Zellen modulieren.
  • Diese Konstrukte weisen eine Anzahl anderer nützlicher Merkmale auf. Sie sind zum Beispiel, basierend auf der von dem Immunglobulin-Rückgrat bereitgestellten Stabilität und Sekretionseffizienz äußerst stabil und leicht zu produzieren. Überdies können durch Veränderung des Fc-Anteils des Immunglobulins verschiedene biologische Funktionen basierend auf den vom Fc-Anteil bereitgestellten biologischen Funktionen an das Molekül bereitgestellt werden. Die Substitution des Fc-Anteils des einen Typs des Immunglobulingens durch einen anderen befindet sich im Stand der Technik.
  • Diese Reagenzienklasse stellt ein neues Werkzeug für das Verständnis einer Reihe verschiedener immunologischer Krankheiten dar. Die Beobachtung, dass ein bivalentes chimäres MHC/Ig-Protein an seinen kognaten T-Zellrezptor stabil bindet, ist überraschend, da sich der monovalente Peptid-MHC-Komplex aus Komplexen mit TCR mit einer Halbwertzeit von weniger als 1 Minute rasch dissoziiert (27) und die Affinität des T-Zellrezeptors zu Peptid-MHC-Komplexen relativ gering ist (ca. 10–5 µM) (28–30). Die stabile Bindung des dinieren HLA-A2/Ig-Komplexes an kognate T-Zellen basiert wahrscheinlich auf zwei auf das Immunglobulin-Gerüst bezogene Merkmale. Die multivalente Beschaffenheit des Komplexes stellt erstens eine Erhöhung der Avidität dar. Zweitens fördert die einzigartige Flexibilität der Immunglobulin-Hinge-Region wahrscheinlich die maximale Aviditätsverstärkung mit unserem bivalenten Konstrukt.
  • Erfindungsgemäße chimäre Proteine umfassen eine Immunglobulin-Schwerkette und ein MHC-Molekül. Die Immunglobulin-Schwerkette kann die Schwerkette eines IgM, IgD, IgG1, IgG3, IgG2β, IgG2α, IgE oder IgA darstellen. Zur Bildung erfindungsgemäßer bivalenter chimärer Proteine wird bevorzugt eine IgG-Schwerkette verwendet. Wenn multivalente chimäre Proteine erwünscht sind, können IgM- oder IgA-Schwerketten zur Bereitstellung von pentavalenten bzw. tetravalenten Chimären verwendet werden. Chimäre Proteine mit anderen Valenzen können unter Verwendung multipler Immunglobulin-Schwerketten auch konstruiert werden.
  • Die Immunglobulin-Schwerkette wird an eine Polypeptidkette eines MHC-Moleküls fusioniert. Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen, durch entweder rekombinante oder kovalente Verknüpfung von zwei Proteinsegmenten, sind gut bekannt. Die Fusionsproteine werden bevorzugt als Produkte von Expressionskonstrukten rekombinant exprimiert. Expressionskonstrukte umfassen ein Polynukleotid oder einen Vektor, das/der für ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kodiert, in dem sich eine Immunglobulin-Schwerkette C-terminal zu einem MHC-Molekül befindet.
  • Die Expressionsvektoren können unter Verwendung von jedwedem im Stand der Technik bekannten Verfahren in Wirtszellen eingeführt werden. Diese Verfahren schließen den Transferrin-Polykation-vermittelten DNA-Transfer, die Transfektion mit nackten oder eingehüllten Nukleinsäuren, die Liposom-vermittelte Zellfusion, den intrazellulären Transport von DNA-beschichteten Latex-Beads, die Protoplastenfusion, die Virusinfektion, die Elektroporation und die Calciumphosphat-vermittelte Transfektion ein.
  • Expressionsvektoren umfassende Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bakteriensysteme zur Expression von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen schließen die ein, die in Chang et al., Nature (1978) 275: 615, Goeddel et al., Nature (1979) 281: 544, Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057, EP 36776 , US 4551433 , deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21–25 und Siebenlist et al., Cell (1980) 20: 269, beschrieben sind.
  • Expressionssysteme in Hefe schließen die in Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153: 163; Kurtz et al., Mol. Cell Biol. (1986) 6: 142; Kurze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Gleeson et al., J. Gen., Microbiol. (1986) 132: 3459, Roggenkamp et al., Mol Gen. Genet. (1986) 202: 302) Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154: 737, Van den Berg et al., Biol. Technology (1990) 8: 135; Kurze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Cregg et al., Mol. Cell Biol. (1985) 5: 3376, US 4837148 , US 4929555 ; Beach und Nurse, Nature (1981) 300: 706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10: 380, Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10: 49, Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112: 284–289; Tilburn et al., Gene (1983) 26: 205–221, Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 1470–1474, Kelly und Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475479; EP 244234 und WO 91/00357 , beschriebenen ein.
  • Die Expression von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen in Insekten kann wie in US 4745051 , Friesen et al. (1986) „The Regulation of Baculovirus Gene Expression" in: The Molecular Biology Of Baculoviruses (W. Doerfler, Hrsg.), EP 127839 , EP 155476 und Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69: 765– 776, Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 177, Carbonell et al., Gene (1988) 73: 409, Maeda et al., Nature (1985) 315: 592–594, Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 8404, Miyajima et al., Gene (1987) 58: 273; und Martin et al., DNA (1988) 7: 99 beschrieben, durchgeführt werden. Zahlreiche Baculovirusstämme und Varianten und entsprechende permissive Insekten-Wirtszellen von Wirten werden in Luckow et al., Biol. Technology (1988) 6: 47–55, Miller et al., in Genetic Engineering (Setlow, J. K. et al. Hrsg.), Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), S. 277–279 und Maeda et al., Nature, (1985) 315: 592–594, beschrieben.
  • Die Expression von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen in Säugerzellen kann wie in Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761, Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79: 6777, Boshart et al., Cell (1985) 41: 521 und US 4399216 beschrieben, erreicht werden. Andere Merkmale der Expression in Säugern können wie in Ham und Wallace, Meth. Enz. (1979) 58: 44, Barnes und Sato, Anal. Biochem. (1980) 102: 255, US 4767704 , US 4657866 , US 4927762 , US 4560655 , WO 90/103430 , WO 87/00195 und US RE 30985 beschrieben, gefördert werden.
  • Jedes MHC-Molekül in einem molekularen Komplex ist an ein identisches antigenes Peptid gebunden. Jedwedes Peptid, das zur Induktion einer Immunantwort fähig ist, kann an das MHC-Molekül, einschließlich Peptiden, die allergische Reaktionen oder Autoimmunantworten hervorrufen, Alloantigene, Tumor-assoziierte Peptide und Peptide von infektiösen Agenzien, wie zum Beispiel Bakterien, Viren oder Pilzen, gebunden werden.
  • Antigene Peptide können an die antigenbindende Stelle des MHC-Moleküls oder an den Amino-Terminus von entweder einer MHC-Klasse II-β-Kette oder einem β2-Mikroglobulin gebunden werden. Die Bindung oder „Beladung" des antigenen Peptids an das chimäre Protein kann, wie in Beispiel 2 nachstehend beschrieben, aktiv oder passiv durchgeführt werden. Das antigene Peptid kann kovalent an das chimäre Protein gebunden werden.
  • Ein Peptid-Tether kann optional zur Verknüpfung eines antigenen Peptids an das β2-Mikroglobulin verwendet werden. Kristallographische Analysen von multiplen Klasse I-MHC-Molekülen deuten darauf hin, dass der Aminoterminus von β2M sehr nahe ist, ca. 20,5 Å vom Carboxylterminus des antigenen Peptids entfernt, das sich in der MHC-Peptid-Bindungsfurche befindet (siehe 18). Folglich kann man unter Verwendung einer relativ kurzen Linker-Sequenz, ca. 13 Aminosäuren lang, ein Peptid an den Aminoterminus von β2M binden. Wenn die Sequenz angemessen ist, wird dieses Peptid an die MHC-Bindungsfurche binden (siehe Beispiel 17, nachstehend).
  • Erfindungsgemäße molekulare Komplexe können diagnostisch zur Markierung antigenspezifischer Zellen in vitro oder in vivo verwendet werden. Eine Probe, umfassend antigenspezifische T-Zellen, kann mit einem molekularen Komplex in Kontakt gebracht werden, in dem jedes MHC-Molekül an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist. Bei der Probe kann es sich zum Beispiel um peripheres Blut, Lymphflüssigkeit, Lymphknoten, Milz, Thymus oder Knochenmark handeln.
  • Das antigene Peptid bindet spezifisch an die antigenspezifischen T-Zellen und markiert sie mit dem antigenen Peptid-beladenen Komplex. Antigene Peptid/MHC-Komplexe können zur Erleichterung des Nachweises, aber müssen nicht, an eine Reporter-Gruppe, wie zum Beispiel eine Radiomarkierung oder Fluoreszenzmarkierung, konjugiert werden. Der molekulare Komplex kann sich in Lösung befinden oder er kann auf einem festen Substrat, wie zum Beispiel einem Glas- oder Kunststoffobjektträger oder einer Gewebekulturplatte oder Latex, Polyvinylchlorid oder Polystyrol-Beads, fixiert sein.
  • Antigenspezifische T-Zellen, die an die antigenen Peptide gebunden sind, können von den nicht gebundenen Zellen getrennt werden. Jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren kann zum Erreichen dieser Trennung, einschließlich Plasmapherese, Durchflusszytometrie oder Differenzialzentrifugation verwendet werden. Antigenspezifische T-Zellen, die aus einem Patienten isoliert wurden, können mit einem Reagenz, wie zum Beispiel einem Cytokin, einem Chemotherapeutikum oder einem Antikörper behandelt und in den Patienten zur Bereitstellung einer therapeutischen Wirkung reinfundiert werden. Die Anzahl der antigenspezifischen T-Zellen, die optional an die antigenen Peptide gebunden werden, können zum Beispiel mittels der Durchflusszytometrie quantifiziert oder gezählt werden.
  • Erfindungsgemäße molekulare Komplexe können auch zur Aktivierung oder Inhibierung antigenspezifischer T-Zellen verwendet werden. Es ist möglich, Toxinmoleküle, wie zum Beispiel Ricin oder Pseudomonas-Toxin, an erfindungsgemäße molekulare Komplexe zu konjugieren. Auf ähnliche Weise können molekulare Komplexe an Moleküle konjugiert werden, die eine Immunantwort stimulieren, wie zum Beispiel Lymphokine oder andere Effektor-Moleküle. Die Dosen des molekularen Komplexes können entweder zum Aktivieren oder Inhibieren antigenspezifischen T-Zellen modifiziert werden.
  • Eine Probe, die antigenspezifische T-Zellen umfasst, kann in vivo oder in vitro mit molekularen Komplexen, in denen jedes MHC-Molekül an ein antigenes Peptid gebunden ist, in Kontakt gebracht werden. Das antigene Peptid bindet spezifisch an und aktiviert oder inhibiert die antigenspezifischen T-Zellen. So kann zum Beispiel die Cytokin-Freisetzung aus spezifischen T-Zell-Subsets stimuliert oder supprimiert werden. Hewitt et al., J. Exp. Med. 175: 1493 (1992); Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 8941 (1989); Kappler et al., Science 244: 811 (1989); Minasi et al., J. Exp. Med. 177: 1451 (1993); Sundstedt et al., Immunology 82: 117 (1994); und White et al., Cell 56: 27 (1989).
  • Erfindungsgemäße molekulare Komplexe können therapeutisch zur Inhibition oder Stimulation von Immunantworten angewendet werden. Zum Beispiel können molekulare Komplexe, die antigene Peptide umfassen, gegen die ein Patient eine allergische Reaktion aufweist, an den Patienten zwecks Behandlung einer Allergie verabreicht werden. Die molekularen Komplexe werden an den Patienten in einer Dosis verabreicht, die zur Suppression oder Reduktion einer mit der Allergie assoziierten T-Zellantwort ausreicht.
  • Auf ähnliche Weise kann ein Patient, der ein Organtransplantat empfangen hat oder empfangen wird, mit erfindungsgemäßen molekularen Komplexen behandelt werden. Molekulare Komplexe, in denen jede Liganden-Bindungsstelle an ein Alloantigen gebunden ist, können an einen Patienten in einer Dosis verabreicht werden, die zur Suppression oder Reduktion einer Immunantwort gegen das Organtransplantat ausreicht. Alloantigene schließen die HLA-Antigene, einschließlich Klasse I- und Klasse II-MHC-Moleküle und Nebenhistokompatibilitätsantigene („minor histocompatibility antigens"), wie zum Beispiel die AB0-Blutgruppenantigene, Autoantigene auf T- und B-Zellen und monozytäre/endotheliale Zellantigene ein.
  • Autoimmunkrankheiten, wie zum Beispiel das Goodpasture-Syndrom, multiple Sklerose, Graves-Krankheit, Myasthenia gravis, systemischer Lupus erythematodes, insulinabhängiger Diabetes mellitus, rheumatoide Arthritis, Pemphigus vulgaris, Addison-Krankheit, Dermatitis herpetiformis, Zöliakie und Hashimoto-Thyreoiditis, können ähnlich behandelt werden. Bin an einer Autoimmunkrankheit leidender Patient kann mit erfindungsgemäßen molekularen Komplexen behandelt werden, wobei jede Liganden-Bindungsstelle an ein antigenes Peptid gebunden ist, gegen das der Patient eine Autoimmunantwort aufweist. Die molekularen Komplexe werden an den Patienten in einer Dosis verabreicht, die zur Suppression oder Reduktion der Autoimmunantwort ausreicht.
  • Die Immunantworten eines Patienten können auch unter Verwendung der erfindungsgemäßen molekularen Komplexe induziert oder verstärkt werden. Molekulare Komplexe, in denen jede Liganden-Bindungsstelle an ein durch einen Tumor exprimiertes Peptid gebunden ist, kann zur Behandlung des Tumors verwendet werden. Das Peptid kann ein Tumor-spezifisches Peptid, wie zum Beispiel EGFRvIII, Ras oder p185HER2 darstellen, oder es kann ein Peptid darstellen, das sowohl vom Tumor als auch vom entsprechenden normalen Gewebe exprimiert wird. Auf ähnliche Weise können molekulare Komplexe, in denen jede Liganden-Bindungsstelle an ein Peptid eines infektiösen Agens, wie zum Beispiel ein Protein eines Bakteriums oder Virus, gebunden ist, zur Behandlung von Infektionen angewendet werden. In jedem Fall werden angemessene molekulare Komplexe in einer Dosis an den Patienten verabreicht, die zur Induktion oder Verstärkung einer Immunantwort gegen den Tumor oder die Infektion ausreichend ist.
  • Erfindungsgemäße molekulare Komplexe können an die Oberfläche einer Zelle, wie zum Beispiel einer dendritischen Zelle, gebunden sein. Eine Population molekularer Komplexe, in denen alle Liganden-Bindungsstellen an identische antigene Peptide gebunden sind, können auch an die Zelle gebunden sein. Die Bindung kann durch Bereitstellen des Fusionsproteins des molekularen Komplexes mit einer Aminosäuresequenz erreicht werden, welche sie, wie im Stand der Technik bekannt ist, an der Zellmembran verankert und das Fusionsprotein in der Zelle exprimiert, oder sie kann chemisch erreicht werden.
  • Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen molekularen Komplexe umfassen, können einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann überall bekannt. Solche Träger schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf große, langsam metabolisierende Makramoleküle, wie zum Beispiel Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere und inaktive Viruspartikel. Pharmazeutisch verträgliche Salze, wie zum Beispiel Mineralsalze, wie zum Beispiel Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate oder Sulfate ebenso wie Salze von organischen Säuren, wie zum Beispiel Acetate, Proprionate, Malonate oder Benzoate, können auch in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können auch Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung, Glycerol und Ethanol, ebenso wie Substanzen, wie zum Beispiel Benetzungsmittel, Emulgatoren oder pH-Puffer, enthalten. Liposome, wie zum Beispiel die in US 5422120 , WO 95/13796 , WO 91/14445 oder EP 524,968 B1 beschriebenen, können auch als ein Träger für eine erfindungsgemäße Zusammensetzung verwendet werden.
  • Die entsprechenden Dosierungen von bivalenten und multivalenten molekularen Komplexen, die für ein bestimmtes Behandlungsverfahren eingesetzt werden, variieren je nach dem zu behandelnden Zustand, der Bindungsaffinität des entsprechenden Reagenzes für sein Target, das Ausmaß der Krankheitsprogression usw. Die Dosierung des molekularen Komplexes fällt jedoch im Allgemeinen in den Bereich von 1 pg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Wenn der Wirkstoff der pharmazeutischen Zusammensetzung ein Polynukleotid darstellt, das für Fusionsproteine von einem molekularen Komplex kodiert, liegt die Dosierung im Allgemeinen im Bereich von 1 nM bis 50 µM pro kg Körpergewicht.
  • Die Mengen von jedem Wirkstoff, der in den hierin beschriebenen Beispielen eingesetzten Zusammensetzungen eingeschlossen ist, stellen allgemeine Leitlinien für den Bereich einer jeden vom Fachmann beim Verfahren zur praktischen Ausführung entweder in vitro oder in vivo zu verwendenden Komponente dar. Darüber hinaus schließen solche Bereiche keineswegs die Verwendung einer höheren oder niedrigeren Menge einer Komponente aus, wie sie in einer bestimmten Applikation gegebenenfalls gerechtfertigt sein könnte. So können zum Beispiel die eigentliche Dosis und das Schema davon abhängig variieren, ob die Zusammensetzungen in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, oder hängen von individuellen Unterschieden hinsichtlich der Pharmakokinetik, der Arzneimitteldisposition und des Arzneimittelmetabolismus ab. Auf ähnliche Weise können die Mengen für in vitro-Applikationen in Abhängigkeit von der entsprechenden verwendeten Zelllinie, wie zum Beispiel der Fähigkeit des zur Replikation in dieser Zelllinie eingesetzten Plasmids variieren. Zum Beispiel wird wahrscheinlich die Menge der pro Zelle oder Behandlung zuzufügenden Nukleinsäure mit der Länge und Stabilität der Nukleinsäure ebenso wie mit der Beschaffenheit der Sequenz variieren und kann aufgrund von Faktoren, die dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht innewohnen, z. B. die mit der Synthese assoziierten Kosten, beispielsweise verändert werden. Ein Fachmann kann ohne weiteres jedwede notwendigen Anpassungen gemäß den Erfordernissen der entsprechenden Situation vornehmen.
  • Eine ausreichende Dosis der Zusammensetzung für eine besondere Anwendung stellt die dar, die in einem Wirt die gewünschte Wirkung hervorruft. Diese Wirkung kann unter Verwendung von mehreren dem Fachmann bekannten Endpunkten überwacht werden. Eine gewünschte Wirkung könnte zum Beispiel den wirksamen Nukleinsäuretransfer an eine Wirtszelle umfassen. Ein derartiger Transfer könnte hinsichtlich einer therapeutischen Wirkung, wie z. B. der Linderung einiger mit der zu behandelnden Krankheit assoziierten Symptome, oder eines weiteren Hinweises auf das transferierte Gen oder die Expression des Gens im Wirt, z. B. mittels der PCR, der Northern- oder Southern-Hybridisierungsverfahren oder Transkriptionsassays zum Nachweis der Nukleinsäure in Wirtszellen, oder mittels der Immunoblot-Analyse, des Antikörper-vermittelten Nachweises oder der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Assays zum Nachweis von Protein oder Polypeptid, das durch die transferierte Nukleinsäure kodiert wird, oder der Auswirkung von Höhe oder Funktion aufgrund eines solchen Transfers, überwacht werden.
  • Die Beispiele beschreiben die Verwendung von erfindungsgemäßen chimären Molekülen, wenn sie mit antigenen Peptiden beim Nachweis und bei der Regulierung von antigenspezifischen T-Zellantworten beladen werden. In diesen Beispielen werden zum Targetieren von CD8-Zellen MHC-Klasse I-Moleküle verwendet. Die MHC-Klasse II/Ig-Chimären können jedoch auch durch Verknüpfung der α- und β-Ketten von MHC-Klasse II-Molekülen an den Enden der Schwer- bzw. Leichtketten des Immunglobulins hergestellt werden.
  • Die Quantifizierung der HTLV-1 Tax11-19-spezifischen T-Zellen im peripheren Blut mit Peptid-beladenem HLA-A2A/Ig weist darauf hin, dass die vorherige Präkursorfrequenz-Analyse von Tax-spezifischen, CD8+, CTL mittels der LDA die eigentliche Zahl Tax-spezifischer T-Zellen signifikant unterschätzt haben könnte (12). Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reagenzien war es möglich, zu zeigen, dass die Anzahl der durch Tax-A2A/Ig-Färbung beurteilten Tax-spezifischen CD8+-T-Zellen ungefähr um das 10- bis 30fache höher waren als zuvor anhand des LDA bestimmt wurde (12). Die Genauigkeit des LDA ist wahrscheinlich durch die Tatsache beeinträchtigt, dass er von der Fähigkeit abhängt, individuelle Zellen in vitro auf Zahlen zu expandieren, die zum Nachweis durch funktionelle Tests, wie zum Beispiel die Chromfreisetzung, groß genug sind (31–34). Die durch direkte Färbung mit Tax-A2/Ig bestimmten Frequenzen sind nicht auf die nicht spezifische Bindung zurückzuführen. Mittels der Tax-A2/Ig positiven Färbung waren die CD8+-Zellen in HTLV-1–-Personen, in HLA-A2–-Patienten mit HAM/TSP und in Kontroll-HLA-A2-Patienten, die mit einem unterschiedlichen Retrovirus, HIV, infiziert waren, wo eine signifikante Anzahl von Zellen für p17 Gag 77–85 spezifisch waren, wenn sie mit p17 Gag 77–85 beladenem A2/Ig gefärbt wurden, nahezu nicht nachweisbar.
  • Außer der Verwendung von mit Peptid beladenen HLA-A2/Ig zum Analysieren antigenspezifischer T-Zellpopulationen stellt das Immunglobulin-Gerüst der HLA-A2/Ig-Chimären viele verschiedene andere Optionen, einschließlich Targeting von antigenspezifischen T-Zellen in vivo bereit. Die Diversität von biologischen Wirkungen in vivo, die durch die verschiedenen Fc-Regionen vermittelt wird, die in dieses Molekül insertiert werden können, ermöglichen seine Applikation beim Targeting antigenspezifischer T-Zellen in vivo, entweder zur Amplifikation antigenspezifischer T-Zellen als ein Vakzin oder zur Elimination pathogener T-Zellen bei Erkrankungen, wie zum Beispiel HAM/TSP ebenso wie klassischen Autoimmunkrankheiten.
  • Die hohe Anzahl der HTLV-1 Tax11-19-spezifischen CD8+-T-Zellen in HLA-A2+ HAM/TSP-Patienten deutet darauf hin, dass das HTLV-1 Tax11-19 bei dieser pathogenen Immunantwort das immundominante Epitop repräsentieren kann. Folglich kann lösliches bivalentes MHC/Ig auch eine therapeutische Applikation beim Targeting und Eliminieren von HTLV-1-spezifischen CD8+-T-Lymphozyten in HAM/TSP aufweisen.
  • In den nachstehend vorgelegten Beispielen sind die Moleküle, bezogen auf ein Molekülgerüst unter Verwendung eines IgG-Moleküls bivalent, könnten aber auch unter Verwendung eines IgM für den Immunglobulinanteil oder unter Verwendung anderer Immunglobulin-Moleküle als ein Rückgrat multivalent hergestellt werden. Die gleichen genetischen Konstrukte können verwendet werden, wobei bekannte Gene, die andere Ig-Moleküle für das nachstehend erläuterte IgG-1 kodieren, substituiert werden. Eine solche Substitution liegt sehr wohl im Bereich der Fähigkeiten eines Fachmanns.
  • Die Beispiele sind lediglich zu Erläuterungszwecken bereitgestellt und sind nicht zur Einschränkung des Umfangs der vorstehend in breiten Zügen beschriebenen Erfindung vorgesehen.
  • BEISPIEL 1
  • Dieses Beispiel erläutert das Farben von antigenspezifischen T-Zellen durch mit Peptid beladene MHC/Ig-Chimären.
  • Die erhöhte Affinitiät von mit Peptid beladenen MHC/Ig-Molekülen ermöglicht eine stabile Bindung an kognate T-Zellen (2). Antigenspezifische T-Zellen werden spezifisch mit MHC Klasse I/IgG-Reagenzien gefärbt, die mit den definierten antigenen Peptiden beladen sind. Unter Verwendung löslicher bivalenter muriner Klasse I-H-2 Ld/Ig, die mit entweder p2Ca, einem mit 2C zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) reaktiven Peptid, oder AH-1, einem Peptid, das für eine den murinen Tumor CT26 erkennende Tumor-CTL-Linie spezifisch ist, kann man antigenspezifische CTL markieren. Wie in 2A ersichtlich ist, waren 2C-CTL mit p2CaLd/Ig-Komplexen, aber nicht mit AH1Ld/Ig-Komplexen reaktiv. CT 26-spezifische T-Zellen waren nur mit AH1Ld/Ig, aber nicht mit p2CaLd/Ig-(nicht gezeigt) oder β-galLd/Ig-Komplexen reaktiv (2B). Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen, wurde zuvor festgestellt, dass tetravalente Peptid/HC-Komplexe zum Färben erforderlich sind, wenn die MHC um Avidin herum koordiniert war.
  • BEISPIEL 2
  • Dieses Beispiel erläutert eine passive versus aktive Beladung der Chimären.
  • Ein kritisches Merkmal dieser chimären Verbindung besteht in der Fähigkeit zur Beladung von jedem der MHC-Anteile mit einem einzelnen gut definierten Peptid, das das Peptidantigen von Interesse darstellt. Um den Einfluss von bivalenter MHC auf antigenspezifische Antworten effektiv zu untersuchen, wurden Parameter für die Peptid-Rekonstitution von bivalenten MHC-Molekülen etabliert. Diese Parameter variieren zwischen den verschiedenen MHC/Ig-Chimären.
  • Es wurden viele verschiedene Ansätze zur Optimierung der Peptidbeladung der chimären MHC/Ig-Moleküle analysiert. Es wurde festgestellt, dass die optimale Beladung von H-2 Kb/Ig das alkalische Stripping, die schnelle Neutralisation und das langsame Umfalten beinhaltet (siehe 3 für eine schematische Darstellung). Auf dieses Protokoll wird hierin als auf „aktives" Beladen von pepMHC/Ig-Komplexen verwiesen. „Passives" Beladen von pepMHC/Ig-Komplexen wird einfach durch Inkubieren der Peptide von Interesse mit dem MHC/Ig-Komplex über 48 Stunden erreicht.
  • Wenn sie als Reagenzien zum Farben spezifischer T-Zellen getestet wurden, waren „aktiv" beladene SIYKb/Ig-Moleküle signifikant besser als „passiv" beladenes SIYKb/Ig. Das Färben von antigenspezifischen T-Zellen wurde in Konzentrationen von so niedrig wie 0,1 nM mit „aktiv" beladenem SIYKb/Ig gesehen, der Mittelwert der Kanalfluoreszenz (MCF) von Zellen, die mit 0,1 nM eines „aktiv" beladenen SIYKb/Ig beladen waren, betrug 53, im Vergleich zu einem MCF von 42 für Kb/Ig, das „aktiv" mit einem Kontrollpeptid, VSV, beladen war.
  • Das Färben antigenspezifischer T-Zellen erforderte ca. 10 nM von „passiv" beladenem SIYKb/Ig. Die halbmaximale Färbung von antigenspezifischen 2C-T-Zellen wurde mit 1 nM von „aktiv" beladenem SIYKb/Ig gesehen, erforderte aber ca. 10 nM von „passiv" beladenem SIYKb/Ig Folglich sind die „aktiv" beladenen pepKb/Ig-Komplexe beim Färben von Peptid-spezifischen T-Zellen um das ca. 10–100fache wirksamer. als der „passiv" beladene pepMHC/Ig-Komplex.
  • BEISPIEL 3
  • Dieses Beispiel erläutert die Empfindlichkeit von pepMHC/Ig-Komplex.
  • Die Nützlichkeit dieser Reagenzien wird nicht lediglich durch ihre Spezifität, sondern auch ihre Sensitivität angezeigt. Niedrige Konzentrationen von weisen antigenspezifische T-Zellen nach. Nanomolare Konzentrationen von mit Peptid beladenen MHC/Ig-Komplexen können zum Färben von 2C-T-Zellen verwendet werden. Bei der Analyse mit entweder Q19Ld/Ig- oder SIYKb/Ig-Komplexen kann eine halbmaximale Stabilisierung bei ca. 1 nM gesehen werden. Im Gegensatz dazu interagieren die mit dem Kontrollpeptid beladenen MHC/Ig-Komplexe, VSVKb/Ig oder MCMVLd/Ig, nicht spezifisch mit T-Zellen.
  • Folglich stellen die mit Peptid beladenen MHC/Ig-Moleküle sehr empfindliche Reagenzien beim Analysieren antigenspezifischer T-Zellen dar.
  • BEISPIEL 4
  • Dieses Beispiel erläutert, dass bivalente MHC/Ig die aktive Fraktion von MHC/Ig enthält.
  • Angesichts der zuvor berichteten Daten, die darauf hinweisen, dass die tetravalente MHC zum Färben von Klasse I restringierten, antigenspezifischen T-Zellen erforderlich war, wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass die T-Zellfärbung mit den MHC/Ig-Komplexen auf das Färben durch aggregierte Fraktionen der pepMHC/Ig-Komplexe zurückzuführen war. Um diese Frage anzusprechen, wurden die pepMHC/Ig-Moleküle durch Größenausschluss-Chromatographie (SEC) fraktioniert und jede Fraktion auf die Fähigkeit zum Färben antigenspezifischer T-Zellen analysiert.
  • Initiale SEC-Experimente deuteten auf eine Reihe verschiedener Protein-Peaks bei den Präparationen von pepMHC/Ig-Molekülen hin (6). Beide mit Peptid beladenen Ld/IgG und Kb/IgG wiesen signifikante Mengen von aggregiertem Material (Peak A) mit einem Molekulargewicht des Proteins von > 6,6 × 105 auf. Interessanterweise wiesen die verschiedenen chimären Proteine verschiedene in den Aggregaten gefundene Proteinmengen auf.
  • Es wurde ein zweiter Peak mit einem Molekulargewicht von 2,6 × 105 Kb gefunden und stellte den monomeren bivalenten pepMHC/Ig-Peak (Peak B) dar. Bei dem bivalenten Ld/Ig-Protein handelte es sich bei diesem um den prominenten Protein-Peak. Dieser Peak stellte eine signifikante, aber kleinere Fraktion von mit SIYKb/Ig assoziiertem Protein dar. Außer den Aggregaten und monomeren Proteinkomplexen wurden in bestimmten pepMHC/Ig-Präparationen zusätzliche Abbauprodukte gefunden. Peak C stellt wahrscheinlich das Abbauprodukt des chimären Moleküls zur IgG-Fraktion dar und D und E stellen kleinere Abbauprodukte dar, die auch in der SIYKb/Ig-Präparation evident waren.
  • Zur Bestimmung, welche Fraktion in den durchflusszytometrischen Assays aktiv war, wurden die MHC/Ig-Komplexe präparativ mittels SEC fraktioniert und auf ihre Fähigkeit zum Binden von CTL getestet. Die dominante T-Zellbindungsaktivität war mit dem monomeren bivalenten MHC/Ig, Protein-Peak B und nicht der aggregierten Proteinfraktion assoziiert (7). Während eine begrenzte Menge von Färbung mit dem aggregierten Material, Protein-Peak A, beobachtet wurde, war diese relativ gering und schnell austitriert. Im Gegensatz zum monomeren Peak, der die mit dem Peptid beladene bivalente MHC/Ig-Fraktion enthielt, enthielt die überwiegende Mehrheit der pepMHC/Ig Moleküle, die für die CTL-Färbung verantwortlich waren (7).
  • Folglich wurde unter Verwendung von Ig als ein Molekülgerüst ein hoch affines bivalentes pepMHC/Ig-Analog generiert, das zum Färben antigenspezifischer T-Zellen verwendet werden kann.
  • BEISPIEL 5
  • Dieses Beispiel erläutert den Nachweis von antigenspezifischen T-Zellen von immunisierten Tieren.
  • Derzeitige Ansätze zur Überwachung antigenspezifischer T-Zellen weisen mit jedem Ansatz assoziierte distinkte Limitationen auf. Die Überwachung von T-Zellen erfordert die Verwendung von breit reaktiven monoklonalen Antikörpern, wie zum Beispiel anti-Vβ-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die Entwicklung eines hoch spezifischen antiklonotypischen monoklonalen Antikörpers oder Verwendung eines indirekt zellbasierten Assays. Obwohl hoch spezifisch, sind antiklonotypische monoklonale Antikörper relativ selten und schwer zu generieren. Während antiklonotypische monoklonale Antikörper außerdem eine antigenspezifische T-Zelle, die einen spezifischen TCR-α/β-Komplex exprimiert, erkennen, erkennen sie keine anderen antigenspezifischen T-Zellen, die unter Verwendung eines unterschiedlichen α/β-TCR den gleichen Antigen/MHC-Komplex sehen. Während sie für T-Zellen, die einen Antigen/MHC-Komplex von Interesse erkennen, spezifisch sind, stellen zellbasierte Assays indirekte Assays dar und sind zur genauen Definition der Anzahl der T-Zellen von Interesse schwer zu verwenden. Folglich besteht ein von den pepMHC/Ig-Komplexen bereitgesteller bedeutender Fortschritt in der Fähigkeit, antigenspezifische T-Zellen bei der Entwicklung einer Immunantwort direkt zu identifizieren.
  • Es wurde die Fähigkeit der Verwendung der MHC/Ig-Komplexe zum Analysieren des T-Zellrepertoires in vivo durch Färben von Milzzellen von Tieren untersucht, die mit einem Modell-Tumorvakzin, CT26-GM, immunisiert wurden. CT26-GM stellt eine murine Kolonkarzinomlinie dar, die mit einem für GM-CSF kodierenden Gen transfiziert wurde. Wenn Tiere mit CT26-GM immunisiert werden, werden sie gegen das Wachstum des parentalen CT26-Tumors resistent. Diese Resistenz ist auf T-Zellen zurückzuführen, die sich in immunisierten Tieren entwickeln und die ein Peptidantigen, AH1, präsentiert im Kontext von H-2Ld-Molekülen, erkennen. AH1-Peptide leiten sich von einem endogenen murinen Retrovirus her, dessen Sequenz zuvor definiert wurde und von dem bekannt ist, dass er wirksam an das H-2Ld-Molekül bindet und T-Zellen zur Entwicklung einer anti-CT26-Immunantwort sensibilisiert.
  • MHC/Ig-Komplexe weisen effizient antigenspezifische T-Zellen in mit CT26-GM immunisierten Tieren nach. Vierzehn Tage nach einer einzelnen Immunisierung mit CT26-GM-Zellen sind ca. 3% aller CD8+-T-Zellen mit AH1Ld/Ig-Komplexen reaktiv. Kontroll-pepMHC/Ig-Komplexe, β-galLd/Ig und MCMVLd/Ig, sind mit ca. um das 10fache weniger Zellen, oder 0,3% aller CD8+-T-Zellen reaktiv. In einem naiven, nicht immunisierten Tier, sind die AH1Ld/Ig-Komplexe nur mit ca. 0,3% aller CD8+-T-Zellen reaktiv. Deshalb führt eine einzelne Immunisierung zu einer ca. um das 10fachen Steigerung der Gesamtzahl von Antigen-reaktiven T-Zellen, die unter Verwendung von MHC/Ig nachgewiesen werden konnten. Folglich kann pepMHC/Ig nach der Immunisierung, Transplantation oder während der Behandlung antigenspezifischer Autoimmunkrankheiten zur Überwachung der T-Zell-Homeostase verwendet werden.
  • Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Reagenzien mit der Durchflusszytometrie verwendet werden können, um spezifisch auf T-Zellen aus Lymphorganen, peripherem Blut oder anderen infiltrierten Geweben, als ein Mittel zur direkten und quantitativen Bestimmung der Zahl antigenspezifischer T-Zellen, zu färben. Die Verwendung dieser Reagenzien in Kombination mit Markern zur Aktivierung stellen eine quantitative Analyse des Aktivierungszustands dieser T-Zellen bereit. Außerdem können unter Verwendung dieser Reagenzien mit einem Zellsortierer gereinigte antigenspezifische T-Zellen sortiert werden. Die gereinigten Populationen können dann in vitro manipuliert werden.
  • BEISPIEL 6
  • Anhand dieses Beispiels wird erläutert, dass mit Peptid beladene Q19Ld/Ig oder SIYKb/Ig spezifisch die Lyse von Targetzellen durch 2C zytotoxische Lymphozyten (CTL) blockiert.
  • Unter Verwendung von Q19Ld/Ig als ein Inhibitor-Komplex wurde die Lyse von Targetzellen von 82% bis hinunter auf 2%, deutlich inhibiert (9A und 9B). Eine halbmaximale Inhibition trat bei ca. 10 nM Q19Ld/Ig auf. Die Kontroll-pepMHC/Ig-Komplexe, MCMVLd/Ig, wiesen keine Auswirkung auf die Lyse von Targetzellen auf. Der antiklonotypische monoklonale Antikörper, 1B2, wurde auch als ein positiver Kontrollantikörper, der die CTL-vermittelte Lyse inhibierte, eingesetzt.
  • SIYKb/Ig inhibierte auch dramatisch die 2C-CTL-vermittelte Lyse von Targetzellen. In diesem Fall senkte die maximale Inhibition die spezifische Lyse von 85% bis hinunter auf 35%. Der Inhibition der CTL-vermittelten Lyse kommt besondere Bedeutung zu, da die lytische Aktivität von CTL eine sehr niedrige Konzentration von Antigen/MHC-Komplexen auf Targetzellen nachweisen kann. Folglich wird die CTL-vermittelte Lyse als sehr schwer zu inhibieren angesehen.
  • Außer der Lyse von Targetzellen sind eine Reihe verschiedener anderer physiologischer Antworten, einschließlich T-Zellproliferation und Lymphokinsekretion, mit der Aktivierung der CDB+-T-Zellaktivierung assoziiert. Peptid-beladene bivalente MHC, SIYKb/IgG, inhibierten auch die T-Zellproliferation von 2C-CTL, die durch allogene Milzzellen stimuliert wurden. Eine maximale Inhibition wurde bei ca. 20 nM SIYKb/IgG gesehen; der Stimulationsindex von unbehandelten Zellen nahm von 100% auf 10% für mit 20 nM SIYKb/IgG behandelte Zellen ab. Eine halbmaximale Inhibition wurde bei ca. 1 nM SIYKb/IgG gesehen.
  • Die Fähigkeit zur selektiven Blockierung antigenspezifischer Immunantworten stellt ein Mittel bereit, über das dieses Reagenz verwendet werden kann, zum Beispiel zum „Abschalten" pathogener Antworten bei der Autoimmunkrankheit oder von Antworten, die zur Abstoßung nach der Organtransplantation führen.
  • Die Modifikation dieser Reagenzien kann auch vorgenommen werden, um den Reagenzien das spezifische Abtöten antigenspezifischer T-Zellen als eine definitivere Weise zur Suppression dieser Immunantworten gegen das Antigen zu ermöglichen. Das Reagenz kann zum Beispiel mit einem Toxinmolekül, wie zum Beispiel Ricin oder der α-Kette des Pseudomonas-Endotoxins, konjugiert werden. Gemäß einer derartigen Ausführungsform wird das Toxin-konjugierte Reagenz entweder in vivo injiziert oder in vitro appliziert. Wenn das Reagenz an T-Zellen, die für den Peptid/MHC-Komplex spezifisch sind, bindet, wird das Reagenz internalisiert. Das Toxinmolekül tötet dann die pathogene T-Zelle von Interesse selektiv ab.
  • BEISPIEL 7
  • Dieses Beispiel erläutert die Aktivierung antigenspezifischer Zellen.
  • Da pepMHC/Ig-Komplexe die Zelloberfläche der T-Zellrezeptoren vernetzen, können die pepMHC/Ig-Komplexe auch zum Stimulieren der T-Zellen verwendet werden. Die Immobilisierung von pepMHC/Ig kann antigenspezifische T-Zellen stimulieren. Diese Reagenzien können folglich zur selektiven Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen entweder in vitro oder in vivo verwendet werden.
  • Die Reagenzien können zur Aktivierung von T-Zellen in vitro, gefolgt vom adoptiven Transfer in einen Patienten verwendet werden. Als Alternative können die Reagenzien in einen Patienten als Mittel zur Aktivierung von tumorantigenspezifischen T-Zellen in vivo injiziert werden. Folglich stellen die erfindungsgemäßen Reagenzien ein potentes therapeutisches, antigenspezifisches Vakzin gegen Krebs dar.
  • Diese Reagenzien können auch als Immuntherapeutika gegen infektiöse Erkrankungen, wie zum Beispiel Pilzerkrankungen, mikrobakterielle Erkrankungen, Viruserkrankungen, wie zum Beispiel HIV, oder intrazelluläre Parasiten zur Aktivierung von T-Zellen, die für gegen diese Pathogene exprimierte Antigene spezifisch sind, verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Reagenzien stellen folglich ein Mittel zum Aktivieren vieler verschiedener antigenspezifischer T-Zellantworten dar.
  • BEISPIEL 8
  • Dieses Beispiel erläutert die kovalente Verknüpfung von Peptiden zur Expression als Teil von Klasse I-MHC/Ig-Chimären.
  • Eine andere Modifikation, die eine stabilere Produktion dieser mit Peptiden von Interesse beladenen multivalenten MHC/Ig-Reagenzien bereitstellt, stellt die kovalente Verknüpfung des Peptids über einen Linker an das MHC-Molekül dar. Für MHC-Klasse I-Moleküle wird dies am leichtesten durch Verknüpfung des Peptids mit dem Aminoterminus von β2-Mikroglobulin erreicht. Für Moleküle der MHC-Klasse II kann das Peptid, wie zuvor beschrieben, über einen Linker an den Aminoterminus der β-Kette der MHC-Klasse II gebunden („tethered") werden. Unter diesen gebundenen («thethered") Peptid-MHC-Konstrukten ist das Peptid von Interesse über das Tether eng mit dem MHC-Molekül Verknüpft. Diese Verknüpfung begünstigt die spezifische Bindung von diesem Peptid gegenüber anderen potenziell interferierenden Peptiden im Serum oder Medium.
  • Zum Tethern eines Peptids an den Aminoterminus von β2M wurde mit dem Tethern eines sich von Tax11-19 an β2M herleitenden Peptid begonnen (19). Der Aminoterminus von β2M wurde durch genetische Verknüpfung von DNA, die für den Linker kodiert, mit einem zweckmäßigen Klonierungsort zur Insertion eines unterschiedlichen Peptids in den Aminoterminus von β2M modifiziert. Eine multiple Runde einer auf der PCR basierenden Mutagenese wurde zur Generierung des an β2M gebundenen Peptids verwendet. Oligonukleotide 1 und 2 wurden zum Generieren eines kleinen PCR-Fragments verwendet, das den humanen β2M-Leader an das Tax11-19-Peptid fusioniert enthält. Dieses PCR-Produkt wurde dann als ein Template für eine andere PCR-Reaktion unter Verwendung von Oligos 1 und 3 verwendet. Das aus dieser zweiten Reaktion generierte PCR-Fragment deckt die gesamte Region, ca. 110 Basenpaare, zwischen den XhoI- und Bsp EI-Klonierungsorten ab.
  • Dieses Fragment wurde verdaut und in das modifizierte humane β2M-Konstrukt kloniert. Unter Verwendung dieses Konstrukts kann man jedwedes Peptid von Interesse am Aminoterminus von β2M ohne weiteres in eine Kassette bringen. Zur Expression des modifizierten humanen β2M wurde cDNA in pcDNA3.1/Zeo(–) kloniert und mit dem chimären HLA-A2/Ig-Konstrukt in J558L-Zellen kotransfiziert. Die sich ergebenden Zellen können sowohl mit G418 als auch Zeocin zur Gewährleistung der Expression von sowohl dem chimären HLA-A2/Ig als auch den β2M-Polypeptiden ausgewählt werden.
  • Das Peptid-gebundene Tax-β2M, das mit HLA-A2/Ig einen Komplex bildete, war in seiner Interaktion mit HLA-A2-restringierten CTL-Klonen, die mittels der Durchflusszytometrie analysiert wurden, spezifisch. Folglich war das Tax-gebundene („tethered") A2/Ig spezifisch mit einem HLA-A2-restringierten, HTLV-1 Tax11-19-spezifischen CTL-Klon, A6, reaktiv (22). Der Mittelwert der Kanalfluoreszenz (MCF) von A6-Zellen, die mit Peptid-gebundenem („tethered") Tax-β2M HLA-A2/Ig-Komplexen gefärbt wurden, betrug ca. 4000, der MCF von gefärbten A6-Zellen unter Verwendung von keinem chimären Protein betrug nur 10 und war im Vergleich zu den Färbungskontrollen mit dem Kontroll-Gag-A2/Ig-Komplex, nicht beladenem HLA-A2/Ig, fast identisch. Der Färbungsgrad mit Tax-β2M war ähnlich dem, der mit einem anti-Vβ13.1-spezifischen mAk erhalten wurde, was darauf hindeutet, dass alle die relevanten Orte unter Verwendung von Tax-β2M HLA-A2/Ig gesättigt waren. Folglich stellt das Peptid-Tethering an β2M eine wirksame Weise zur Präsentation von Peptiden im Kontext von MHC/Ig-Molekülen dar.
  • DIREKTE SICHTBARMACHUNG VON ANTIGEN-SPEZIFISCHEN T-ZELLEN IN DER HTLV-1-ASSOZIIERTEN MYELOPATHIE/TROPISCHEN SPASTISCHEN PARAPARESE
  • Die folgenden Beispiele lassen die Verwendung von erfindungsgemäßen Reagenzien zur Sichtbarmachung direkt antigenspezifischer T-Zellen in Patienten mit HTLV-1-assoziierter Myelopathie/tropischer spastischer Paraparese (HAM/TSP) und HIV-Infektionen erkennen.
  • HAM/TSP wird von einem humanen Retrovirus, dem humanen T-lymphotropen Virus Typ I (HTLV-1) verursacht (2,3). Die klinischen Symptome von HAM/TSP sind gekennzeichnet durch obere Motoneuron-Symptome und einer leichten sensorischen und Sphinkter-Dysfunktion (3). Histopathologisch findet man eine thorakale Rückenmarkatrophie, unter Beteiligung einer perivaskulären Demyelinisierung und axonalen Degeneration (4, 5).
  • Die Pathophysiologie von HAM/TSP wird noch nicht vollständig verstanden (6). Die Serumreaktivität gegen HTLV-1 wurde von Osame und Mitarbeitern 1986 erstmals mit HAM/TSP assoziiert (3). Das immunologische Kennzeichen von Patienten mit HAM/TSP ist die spontane Proliferation von peripheren Blutlymphozyten (PBL) in vitro (7–9).
  • Es wurde zuvor gezeigt, dass zirkulierende zytotoxische CD8+-T-Lymphozyten (CTL) in Patienten mit HAM/TSP gegen HTLV-1-Proteinprodukte reagieren (10), und ein immundominantes HLA-A2-restringiertes Epitop (HTLV-1 Tax11-19) wurde gut charakterisiert (11). Es wurde mittels der limitierenden Verdünnungsanalyse bestimmt, dass die HTLV-1 Tax11-19-spezifische CTL-Präkursorfrequenz im Bereich von 1/75 bis 1/320 CD8+-Lymphozyten (12) im peripheren Blut lag. Die Tax-spezifischen CTL wurden auch in der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) (12,13) gefunden, und die HTLV-1-spezifischen Klone konnten in vitro aus einer Rückenmarkläsion, die von einem Patienten mit HAM/TSP generiert wurden (14), gewonnen werden.
  • Die immunhistochemische Analyse der betroffenen Rückenmarkläsionen im Anfangsstadium der Erkrankung von Patienten mit HAM/TSP zeigt die Anwesenheit von infiltrierenden CD4+- und CD8+-Lymphozyten, in denen die CD8+-Population mit der Dauer der Erkrankung prädominiert (15). Darüber hinaus wurde eine Erhöhung aktivierter Lymphozyten im PBL und der CSF gezeigt (16, 17). Vor kurzem ist der Nachweis gelungen, dass periphere CD8+-T-Lymphozyten in HAM/TSP-Patienten IL-2, IFN-γ und TNF-α produzieren (18). Kollektiv hat dieser Hinweis der Ansicht Unterstützung verliehen, dass die virusspezifischen CD8+-T-Lymphozyten eine kritische Rolle in der Immunpathogenese von HAM/TSP spielen können.
  • Eine bedeutende Limitation in diesen Studien ist die Unfähigkeit die Identifikation HTLV-1-spezifischer CD8+-T-Zellen direkt aus biologischen Proben, ohne in vitro-Amplifikation, nicht nur die faktische Anzahl antigenspezifischer T-Zellen in vivo zu quantifizieren, sondern auch die antigenspezifische Population von T-Lymphozyten weiter zu charakterisieren, gewesen. Um diesen Problemen zu begegnen, wurden bivalente MHC-Klasse I-Konstrukte unter Verwendung von Immunglobulin als ein Gerüst (20) entwickelt, und diese wurden zur Abklärung der Rolle antigenspezifischer CD8+-T-Zellen bei verschiedenen immunologischen Erkrankungen des Menschen, wie zum Beispiel HAM/TSP verwendet.
  • Die nachstehenden Beispiele erläutern die Analyse von HTLV-1 Tax11-19- und p17 Gag77-85-spezifischen, HLA-A2+-restringierten CD8+-T-Lymphozyten direkt aus dem peripheren Blut und der Cerebrospinalflüssigkeit unter Verwendung von mit Peptid beladenen bivalenten HLA-A2/Ig-Chimären.
  • BEISPIEL 9
  • Dieses Beispiel erläutert die verwendeten Materialien und Verfahren zum Analysieren von HLA-A2+-restringierten CD8+-T-Lymphozyten, die für HTLV-1 Tax11-19 oder p17 Gag77-85 direkt aus dem peripheren Blut und der Cerebrospinalflüssigkeit unter Verwendung von mit Peptid beladenen bivalenten HLA-A2/Ig-Chimären spezifisch waren.
  • STUDIENPROBANDEN UND PROBEN
  • Die klinischen Merkmale von Patienten mit HAM/TSP und von asymptomatisch mit HTLV-1 infizierten Personen ebenso wie der HLA-Typ wurden zuvor beschrieben (12) und sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die HTLV-1-Infektion wurde mittels des Western Blots in Serum von HAM/TSP-Patienten und asymptomatischen Trägem bestätigt. Die Diagnose von HAM/TSP wurde gemäß den WHO-Kriterien unter Bezugnahme auf neurologische Symptome und serologisches Testen von HTLV-1 gestellt.
  • Die PBL wurden mithilfe der Ficoll-Hypaque-Zentrifugation hergestellt und bis zum Gebrauch in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Histokompatibilitätstypisierung wurde an PBL oder EBV-transformierten Lymphoblasten-Zelllinien vom Tissue Typing Laboratory am NIH Clinical Center durchgeführt. Einige der gesunden, nicht infizierten HLA-A2-Kontrollen wurden mittels der FACS-Analyse unter Verwendung eines Panels HLA-A2-spezifischer monoklonaler Antikörper: MA2.1, BB7.2 and PA2.1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) auf HLA-A2-Expression getestet.
  • PEPTIDE
  • Die Peptide HTLV-1 Tax11-19 (LLFGYPVYV) (SEQ ID NO: 1), Influenzavirus A M158-66 (GILGFVFTL) (SEQ ID NO: 2) und p17 Gag77-85 (SLYNTVATL) (SEQ ID NO: 3) wurden synthetisiert und mithilfe der HPLC an den Colorado State University Macromolecular Resources gereinigt. Die Identität der Peptide wurde mittels massenspektrometrischer Messungen bestätigt.
  • KLONIEREN DES KONSTRUKTS UND PROTEIN-EXPRESSION
  • Unter Verwendung der Oligonuldeotid-gerichteten PCR wurde ein 5'Mlu I- und ein 3' Not I-Ort (die Orte sind unterstrichen) in die extrazelluläre Domäne (α1-α3) von HLA-A2-cDNA unter Verwendung des folgenden Primer-Paars eingeführt:
    Figure 00220001
    und 5'-CAGTCGATGCGGCCGCCCATCTCAGGGTGAGGGGCT (SEQ ID NO: 5). Nach der PCR-Amplifikation wurde die α1-α3-Region von HLA-A2 sequenziert und direktional im Austausch für H-2Kb in den zuvor beschriebenen pX/Ig-Vektor kloniert (20).
  • Das Konstrukt wurde mit DNA, kodierend für das chimäre HLA-A2/Ig-Protein und das humane β2-Mikroglobulin, durch Elekroporation in J558L-Zellen kotransfiziert. Die Transfektanten wurden auf Sekretion des chimären Proteins mittels ELISA, wie zuvor beschrieben, gescreent (20). Die ELISA-Platten wurden mit BB7.2, einem für Peptid-beladene Konformationen von HLA-A2 spezifischen Antikörper, oder mit einem Ziegen-anti-Maus-IgG-Fc-Antikörper (10 µg/ml) (Cappel, Durham, NC) beschichtet. Hohe Sekretoren wurden ausgewählt und in Hybridom-SFM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) gezüchtet. Die HLA-A2/Ig-Sekretion aus dem transfizierten J558L wurde mittels SDS-PAGE-Elektrophorese bestätigt.
  • Das chimäre Protein wurde aus dem Zellüberstand geerntet und wurde mit Centriflo®-Membranzapfen (Amicon, Beverly, MA) konzentriert. HLA-A2/Ig wurde mit 660fachem molarem Überschuss des Peptids für 10–14 Tage vor der FACS-Analyse beladen. Drei µg des Proteins wurden zum Farben von 1 × 106 Zellen verwendet.
  • DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE
  • Murine monoklonale anti-humane CD8-FITC (Sigma, St. Louis, MO), anti-CD-4PE (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD8-Tri (Caltag Laboratories, Burlingame, CA) und anti-HLA-DR (Pharmingen, San Diego, CA) wurden zum Nachweis von Zelloberflächenmolekülen von Lymphozyten verwendet. PK1.36-FITC wurde als eine Isotyp-gematchte Kontrolle für anti-HLA DR-FITC verwendet. An die Zelloberfläche gebundenes HLA-A2/Ig wurde unter Verwendung von Ziegen-anti-Maus-IgG1-PE oder einem Ziegen-anti-Maus-IgG1-Tri (Caltag) nachgewiesen. Monoklonale anti-TNF-α-FITC-, anti-IFN-γ-FITC- oder Isotyp-gematchte IgG1-FITC-Antikörper (Pharmingen) wurden für die intrazelluläre Cytokin-Färbung verwendet. PBL (1 × 106) wurden mit Peptid beladenem HLA-A2/Ig auf Eis inkubiert, gefolgt von PE- oder Tri-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG1-PE.
  • Die intrazelluläre Färbung wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers mit geringgradigen Modifikationen (21) nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37°C durchgeführt, gefolgt von einer 10-stündigen Inkubation in Anwesenheit von 10 µg/mg Brefeldin A (Sigma). Die Dreifarbenfluorimetrische Analyse wurde an einem FACScan (Becton Dickinson) durchgeführt. Die Lymphozyten wurden auf Vorwärts- und Seitenstreuung ausgewählt („gated"). 1 × 105 (2 × 105 für die Dreifarben-Analyse) ausgewählte („gated") Ereignisse wurden unter Verwendung von CELLQuest-Sofware (Becton Dickinson) analysiert. PBL von allen HLA-A2-positiven Patienten wurden mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen gefärbt.
  • BEISPIEL 10
  • Dieses Beispiel erläutert, dass das mit Peptid beladene HLA A2/Ig spezifisch HLA-A2-restringiertes CTL bindet.
  • Es wurde ein bivalentes HLA-A2/Ig-Molekül unter Verwendung von Immunglobulin als ein Gerüst, das mit verschiedenen Peptiden beladen werden kann, manipuliert. Mit Peptid beladenes HLA-A2/Ig wurde bei seiner Interaktion mit HLA-A2-restringierten CTL-Klonen mittels der Durchflusszytometrie analysiert. Folglich war das Tax-A2/Ig spezifisch reaktiv mit einem HLA-A2-restringierten, HTLV-1 Tax11-19-spezifischen CTL-Klon, A6, (22). Der Mittelwert der Kanalfluoreszenz (MCF) von A6-Zellen, die mit HTLV-1 Tax11-19 beladenen HLA-A2/Ig (Tax-A2/Ig) gefärbt wurden, betrug 426, während der MCF von A6-Zellen, die mit dem Kontroll-Gag-A2/Ig-Komplex gefärbt wurden, nur 13 betrug und mit den Färbungskontrollen unter Verwendung von keinem chimären Protein, unbeladenem HLA-A2/Ig oder M1-beladenem HLA-A2/Ig fast identisch war (11A). In komplementären Experimenten färbten Gag-A2/Ig spezifisch den HIV p17 Gag77-85-spezifischen Klon SL09 (23) (11B), während das Färben mit Tax-A2/Ig mit dem unbeladenen HLA-A2/Ig, M1-beladenen HLA-A2/Ig oder keinem HLA-A2/Ig nahezu identisch war.
  • BEISPIEL 11
  • Dieses Beispiel erläutert die Sichtbarmachung von antigenspezifischen T-Lymphozyten in peripherem Blut von Patienten mit HAM/TSP- und HIV-Infektionen.
  • Die HTLV-1 Tax11-19-spezifische CTL-Aktivität wurde direkt in PBL von HAM/TSP-Patienten nachgewiesen (10). In HLA-A2+-Patienten ist die HTLV-1-spezifische Reaktivität prädominant gegen das HTLV-1 Tax11-19-Epitop gerichtet (11). Vorherige Bestimmungen der Präkursorfrequenzen von HTLV-1 Tax11-19-spezifischen CTL unter Verwendung der limitierenden Verdünnungsanalyse (LDA) ergaben Werte im Bereich von 1/75 bis 1/320 CD8+-T-Zellen.
  • Zum direkten Quantifizieren der HTLV-1 Tax11-19-spezifischen CD8+-Population in peripherem Blut von HAM/TSP-Patienten wurde eine zweidimensionale durchflusszytometrische Analyse von Zellen unter Verwendung von Tax-A2/Ig und anti-CD8+ durchgeführt (12). PBL von Patienten mit HAM/TSP zeigten eine signifikante, hohe Zahl von HTLV-1 Tax11-19-spezifischen CD8+-T-Lymphozyten. Bei einem Patienten war die Frequenz von Tax11-l9-spezifischen Zellen so hoch wie 13,8% (12 und 13 und Tabelle 1). Der prozentuale Anteil von Tax-A2/Ig-spezifischen Zellen lag zwischen 0,64 und 13,87% CD8+-T-Zellen, mit Werten > 2% für 4 der 6 HAM/TSP-Patienten (12). CD8+-T-Zellen, die für p17 Gag77-85 spezifisch sind, konnten auch nachgewiesen werden (12, rechte Panels).
  • Bei einem der sechs HLA-A2-positiven HAM/TSP-Patienten wurden keine Tax-A2/Ig-reaktiven Zellen nachgewiesen. Die PBL dieses gleichen Patienten lysierten jedoch auch nicht Tax-Protein-exprimierende, autologe, EBV-transformierte B-Zellen (nicht veröffentlichte Daten). Darüber hinaus war es auch möglich, Tax-spezifische T-Zellen mit Tax-A2/Ig in jeder Patientenprobe nachzuweisen, die Tax-exprimierende HLA-A2+-Targetzellen lysierte (Tabelle 1).
  • BEISPIEL 12
  • Dieses Beispiel erläutert die Analyse von peripherem Blut aus zwei HLA-A2+-HTLV-1-Trägern.
  • Es wurde auch peripheres Blut aus zwei HLA-A2+-HTLV-1-Trägern analysiert, die nicht an HAM/TSP litten (13 und Tabelle 1). Einer der beiden HTLV-1-Träger wies keine nachweisbaren HTLV-1 Tax11-19-spezifischen T-Zellen auf, während der andere eine niedrige, aber reproduzierbar nachweisbare Zahl von CD8+-T-Zellen aufwies, die sich mit Tax-A2/Ig anfärbten (0,33%).
  • Zur Bestätigung der Spezifität des Färbens von peripheren Blutproben mit diesen Reagenzien und ihre Beziehung zur Erkrankung wurden PBL aus HAM/TSP-Patienten, die das HLA-A2-Allel nicht tragen (Tabelle 1 und 13), nicht infizierter gesunder HLA-A2+-Donoren (Tabelle 1 und 13) und einer mit HIV-1 infizierten HLA-A2+-Person untersucht (12). Weniger als 0,1% CD8+-T-Zellen von allen diesen Proben färbten sich mit dem Tax-A2/Ig positiv an. Eine signifikante Anzahl (3,03%) der CD8+-T-Lymphozyten von der HIV-infizierten Person wurden jedoch unter Verwendung von Gag-A2/Ig gefärbt.
  • Diese Ergebnisse erläutern kollektiv, dass die Anwesenheit hoher Zahlen von Tax-A2/Ig, die CD8+-Zellen färben, für HTLV-1+ HLA-A2+-Personen mit HAM/TSP spezifisch ist.
  • BEISPIEL 13
  • Dieses Beispiel erläutert die Sichtbarmachung von antigenspezifischen T-Lymphozyten in der Cerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit HAM/TSP.
  • Zur Bestätigung der Signifikanz von HTLV-1-spezifischen CTL für die Pathogenese dieser demyelinisierenden Erkrankung wurden Lymphozyten aus der Cerebrospinalflüssigkeit eines Patienten mit HAM/TSP (H1) analysiert und mit den T-Zellen in seinem peripheren Blut vom gleichen Tag verglichen. Tax-A2/Ig-spezifische CD8+-Zellen konstituierten 23,7% der CD8+-Zellpopulation in der Cerebrospinalflüssigkeit. Im Gegensatz dazu wurden 9,4% Tax-A2/Ig-spezifische CD8+-T-Zellen im peripheren Blut nachgewiesen (14A). Die gleiche Anzahl von CD4+-T-Zellen wurden interessanterweise im peripheren Blut und in der Cerebrospinalflüssigkeit (44% im PBL und 48% in der CSF), aber auch eine erhöhte Anzahl an Gesamt-CD8+-T-Zellen in der CSF (42%) im Vergleich zu peripherem Blut (29%) gefunden (14B).
  • BEISPIEL 14
  • Dieses Beispiel erläutert, dass HTLV-1 Tax11-19-spezifische T-Zellen in Patienten mit HAM/TSP aktiviert werden.
  • Die Fähigkeit, HTLV-1 Tax11-19-spezifische T-Lymphozyten direkt zu färben, stellt die Gelegenheit bereit, ihren Aktivierugszustand zu analysieren. Wenn HTLV-1-spezifische CD8+-T-Zellen tatsächlich die Immunpathogenese von HAM/TSP vermitteln, könnte man erwarten, dass ein signifikanter Anteil von ihnen aktiviert wird. Da aktivierte humane T-Zellen erhöhte Mengen von MHC-Klasse II-Molekülen exprimieren, wurden die HTLV-1 Tax11-19-spezifischen T-Zellen aus HAM/TSP-Patienten auf HLA-DR-Expression mittels der Mehrfarben-Durchflusszytometrie weiter charakterisiert.
  • Tax-A2/Ig-reaktive, CD8+-T-Zellen aus den 3 HAM/TSP-Patienten wiesen eine signifikant erhöhte Expression von DR auf (15). In 2 von 3 Patienten war die Höhe der DR-Expression nahezu identisch mit der, die in Kontroll-PHA-stimuliertem PBL gesehen wurde (vergleiche 15A und 15B, Tax-A2/Ig-reaktive spezifische CD8+-T-Zellen aus Patienten, bis 15E, aktivierte humane PBL). Ähnliche Ergebnisse wurden für die IL-2-Rezeptor-Expression erhalten (Daten nicht gezeigt).
  • Von besonderem Interesse ist, dass ein Patient, H6, eine signifikant niedrigere DR+-Population Tax-spezifischer CD8+-Zellen aufwies (15C). Es wurde ursprünglich angenommen, dass diese Person, der Ehepartner eines HAM/TSP-Patienten, ein asymptomatischer Träger ist, da keine neurologischen Symptome berichtet wurden. Bei einer körperlichen Untersuchung wurde(n) jedoch eine Hyperreflexie in den unteren Extremitäten und Plantarreflexe, die indikativ für (eine) Pyramidenbahnläsion(en) sind, beobachtet.
  • BEISPIEL 15
  • Dieses Beispiel erläutert die Expression von Cytokinen durch Tax-spezifische CD8+-Zellen von HAM/TSP-Patienten.
  • Inflammatorische Cytokine werden als kritische Mediatoren der ZNS-Immunpathologie in vielen Autoimmunmodellen erachtet. Erhöhte Spiegel mehrerer proinflammatorischer Cytokine wurden im Serum oder in der Cerebrospinalflüssigkeit von HAM/TSP-Patienten nachgewiesen (16, 17). Deshalb ist die Analyse Tax-spezifischer CD8+-Zellen von HAM/TSP-Patienten auf die Anwesenheit relevanter intrazellulärer Cytokine von besonderem Interesse.
  • Vor kurzem wurde gefunden, dass Bulk-CD8+-T-Zellen von HAM/TSP-Patienten eine signifikante Expression von Cytokinen, wie zum Beispiel TNF-α, IFN-γ und IL-2, aber nicht IL-4 (18) aufwiesen. Tax-spezifische CD8+-T-Zellen von Patienten H1 (16), H5 (Daten nicht gezeigt), und H6 (16) wiesen distinkte Muster der intrazellulären TNF-α und IFN-γ-Expression auf. Während die HAM/TSP-Patienten H1 und H5 einen hohen Anteil Tax-A2/Ig-spezifischer CD8+-Zellen mit intrazellularen TNF-α und IFN-γ (ungefähr 30%) aufwiesen, fand sich bei Patient H6 ein sehr geringer Anteil Tax-spezifischer CD8+-Zellen, die intrazellularen TNF-α und intrazelluläres IFN-γ (2%) exprimierten.
  • Diese Ergebnisse, zusammen mit der HLA-DR-Analyse, deuteten auf eine Dissoziation zwischen der Expansion antigenspezifischer T-Zellen und ihrem Aktivierungszustand hin. Sie deuteten ferner darauf hin, wie die Fähigkeit der Verwendung der Multiparameter-Duchflusszytometrie bei der Analyse des Aktivierungszustands antigenspezifischer T-Zellpopulationen einen weiteren Einblick in die Beziehung zwischen dem Zustand der T-Zellaktivierung und der Krankheitspathogenese gewährt.
  • BEISPIEL 16
  • Dieses Beispiel erläutert, dass Tax-spezifische CD8+-T-Zellen im peripheren Blut von HAM/TSP-Patienten persistieren.
  • Ein wichtiger Aspekt beim Verständnis der Pathogenese der Autoimmunkrankheiten, wie zum Beispiel HAM/TSP besteht darin, dass man die Dynamik antigenspezifischer T-Zellantworten versteht. Deshalb wurden die Zahlen der Tax-spezifischen CD8+-T-Zellen von einem HAM/TSP-Patienten (H1), dem zwischen 1989 und 1998 PBL serienmäßig entnommen wurde, verglichen. Dieser Patient wurde initial im Jahr 1979 diagnostiziert.
  • Dieser Patient wies interessanterweise selbst 10 Jahre nach der Diagnose ca. 10% Tax-spezifische CD8+-T-Zellen auf. Dieser Prozentsatz änderte sich über die nächsten acht Jahre nicht signifikant (17).
  • Bei diesem Patienten werden folglich pathogene Tax-spezifische CD8+-T-Zellen selbst nach 19jähriger aktiver Krankheit in hohen Spiegeln aufrechterhalten.
  • Figure 00270001
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    Figure 00310001
  • Figure 00320001

Claims (38)

  1. Zusammensetzung, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine, worin jedes chimäre Protein aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Immunglobulinkette besteht, worin die mindestens zwei chimären Proteine zur Bildung eines molekularen Komplexes, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziieren, worin ein antigenes Peptid an jedes MHC-Molekül gebunden ist, worin jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin jeder molekulare Komplex in der Zusammensetzung ein identisches antigenes Peptid umfasst.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das antigene Peptid passiv gebunden ist.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das antigene Peptid aktiv gebunden ist.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das antigene Peptid an das MHC-Molekül kovalent gebunden ist.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das antigene Peptid an den Aminoterminus von β2-Mikroglobulin gebunden ist.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das antigene Peptid an den Aminoterminus einer β-Kette der MHC-Klasse II gebunden ist.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das antigene Peptid an den Aminoterminus der β-Kette der MHC-Klasse II mittels eines Peptid-Tethers gebunden ist.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der molekulare Komplex zwei der chimären Proteine umfasst.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der molekulare Komplex an ein Toxin konjugiert ist.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das MHC-Molekül ein MHC-Molekül der Klasse I darstellt.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin das MHC-Molekül der Klasse I ein HLA-Molekül der Klasse I darstellt.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das antigene Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem HTLV-Tax11-19-Peptid, einem p17 Gag77-85-Peptid und einem M158-66-Peptid von Influenza-Virus A.
  14. Zusammensetzung, umfassend ein chimäres Protein, das aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Ig-Kette besteht, worin das chimäre Protein zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziiert, worin die Immunglobulinkette keine IgG-Schwerkette darstellt, und worin das chimäre Protein an ein Toxin konjugiert ist.
  15. Zusammensetzung, umfassend eine Zelle, worin ein chimäres Protein an die Oberfläche der Zelle gebunden ist, worin das chimäre Protein aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Immunglobulinkette besteht; worin das chimäre Protein zur Bildung molekularer Komplexe, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziiert, worin ein antigenes Peptid an jedes MHC-Molekül gebunden ist, worin jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die Zelle eine dendritische Zelle darstellt.
  17. Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin eine Population von Chimären Proteinen an die Zelle gebunden ist, worin jedes MHC-Molekül in der Population der chimären Proteine an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist.
  18. Verwendung von chimären Proteinen, die aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Immunglobulinkette bestehen, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines an Allergie leidenden Patienten, worin die chimären Proteine in molekularen Komplexen, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziiert sind, worin ein Antigen-Peptid an jedes MHC-Molekül gebunden ist, worin jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist, und worin das antigene Peptid ein Antigen darstellt, gegen das der Patient eine allergische Reaktion aufweist.
  19. Verwendung von chimären Proteinen, die aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Immunglobulinkette bestehen, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der ein Organtransplantat empfangen hat oder empfangen wird, worin die chimären Proteine in molekularen Komplexen, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziiert sind, worin ein antigenes Peptid an jedes MHC-Molekül gebunden ist, worin jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist, und worin das antigene Peptid ein Alloantigen darstellt.
  20. Verwendung von chimären Proteinen, die aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Immunglobulinkette bestehen, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der an einer Autoimmunkrankheit leidet, worin die chimären Proteine in molekularen Komplexen, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziiert sind, worin ein antigenes Peptid an jedes MHC-Molekül gebunden ist, worin jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist, und worin das antigene Peptid eines darstellt, gegen das der Patient eine Autoimmunantwort aufweist.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, worin die Autoimmunkrankheit eine HTLV-1-assoziierte Myelopathie/tropische spastische Paraparese (HAM/TSP) darstellt.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, worin das antigene Peptid HTLV-1 Tax11-19 darstellt.
  23. Verwendung von chimären Proteinen, die aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Immunglobulinkette bestehen, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten mit einem Tumor, worin die chimären Proteine in molekularen Komplexen, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziiert sind, worin ein antigenes Peptid an jedes MHC-Molekül gebunden ist, worin jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist, und worin das antigene Peptid ein Tumor-assoziiertes Peptid darstellt.
  24. Verwendung von chimären Proteinen, die aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Immunglobulinkette bestehen, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten mit einer Infektion, die durch ein infektiöses Agens ausgelöst wird, worin die chimären Proteine in molekularen Komplexen, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziiert sind, worin ein antigenes Peptid an jedes MHC-Molekül gebunden ist, worin jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist, und worin das antigene Peptid ein Peptid von einem infektiösen Agens darstellt.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, worin die Infektion eine HIV-Infektion darstellt.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, worin das antigene Peptid p17 Gag77-85 darstellt.
  27. Verwendung nach Anspruch 24, worin die Infektion eine Influenza-Infektion darstellt.
  28. Verwendung nach Anspruch 27, worin das antigene Peptid ein M158-66-Peptid von Influenza-Virus A darstellt.
  29. Verfahren zum Markieren antigenspezifischer T-Zellen in vitro, das Folgendes umfasst: Kontaktieren einer Probe in vitro, die antigenspezifische T-Zellen mit einem chimären Protein umfasst; worin das chimäre Protein aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Immunglobulinkette besteht, worin das chimäre Protein zur Bildung eines molekularen Komplexes, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziiert, und worin jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist, wobei das antigene Peptid spezifisch an die antigenspezifischen T-Zellen bindet, wobei die Zellen mit dem chimären Protein markiert sind.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, das weiter den folgenden Schritt umfasst: Trennen antigenspezifischer T-Zellen, die an die antigenen Peptide gebunden sind, von Zellen, die nicht gebunden sind.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, worin der Trennschritt unter Verwendung der Flowzytometrie durchgeführt wird.
  32. Verfahren nach Anspruch 29, das weiter den folgenden Schritt umfasst: Zählen der Anzahl antigenspezifischer T-Zellen, die an die antigenen Peptide gebunden sind.
  33. Verwendung der chimären Proteine, die aus einem MHC-Molekül und einer eine variable Region umfassenden Immunglobulinkette bestehen, bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Markieren antigenspezifischer T-Zellen, worin die chimären Proteine in molekularen Komplexen, umfassend mindestens zwei chimäre Proteine pro Komplex, assoziiert sind, und worin jedes MHC-Molekül im molekularen Komplex an ein identisches antigenes Peptid gebunden ist.
  34. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 20, 24 oder 33, worin das MHC-Molekül ein MHC-Molekül der Klasse I darstellt.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, worin das MHC-Molekül ein HLA-Molekül der Klasse I darstellt.
  36. Verfahren nach Anspruch 29, worin das antigene Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem HTLV-1 Tax11-19-Peptid, einem p17 Gag77-85-Peptid und einem M158-66-Peptid von Influenza-Virus A.
  37. Verfahren nach Anspruch 29, weiter umfassend den folgenden Schritt: Nachweis eines Markers zur Aktivierung der antigenspezifischen T-Zellen.
  38. Verfahren nach Anspruch 29, worin der Marker zur Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen ein sezerniertes Lymphokin darstellt.
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