JP2001515726A - 抗原特異的ｔ細胞依存性免疫応答を検出、活性化又は抑制するための多価キメラペプチド負荷ｍｈｃ／ｉｇ分子の使用 - Google Patents

抗原特異的ｔ細胞依存性免疫応答を検出、活性化又は抑制するための多価キメラペプチド負荷ｍｈｃ／ｉｇ分子の使用

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ザ・ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティ・スクール・オブ・メディシン
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Abstract

(57)【要約】 ペプチド／ＭＨＣ分子の可溶性類似体のそのコグネイトリガンドに対する有効な親和性を高めるために、２価のペプチド／ＭＨＣ複合体を構築した。組換えＤＮＡ戦略を使用して、ＭＨＣクラスＩをコードするＤＮＡをマウスＩｇのＨ鎖をコードするＤＮＡに連結した。このＭＨＣ／Ｉｇ複合体を利用して、関心対象のペプチドに均質に負荷した。フローサイトメトリーの結果は、pepＭＨＣ／Ｉｇ複合体がそのコグネイト受容体を担う細胞に高い親和性で特異的に結合することを示した。pepＭＨＣ／Ｉｇ複合体は、抗原特異的Ｔ細胞のエフェクター機能をモジュレートすることにも有用である。これらpepＭＨＣ／Ｉｇ複合体は、ＴＣＲ／ＭＨＣ相互作用を研究すること及びリンパ球トラッキングに有用であり、免疫応答の特異的な調節剤としての使用を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は１９９７年３月２８日出願の米国特許出願第０８／８２８，７１２号
の一部継続出願であり、参照により本明細書に組込まれている、現在審議中の米
国特許出願第６０／０５８，５７３号（１９９７年９月１１日出願）及び米国特
許出願第６０／０８２，５３８号（１９９８年４月２１日出願）の利益を特許請
求する。 発明の背景 免疫系は、高等脊椎動物において最も進歩した形態で見出される防御システム
である。この防御メカニズムは、病原微生物による侵襲から生物を守るために用
いられる迅速かつ高度に特異的な応答をもたらす。免疫系の進化を今日の形態へ
主に導いたのは、無数の病原微生物である。特定の免疫応答は、感染因子に対す
る防御だけでなく、腫瘍発生に対する監視、自己免疫疾患の病理発生及び移植組
織の拒絶に関わると考えられている。
【０００２】 免疫系の主たる調節細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞の調節機能は、特有のＴ細胞
受容体の発現だけでなく、個々のＴ細胞応答に関連する様々なアクセサリー分子
及びエフェクター機能の発現に依存する（つまり、細胞毒性的な応答、並びにリ
ンホカインのようなエフェクター分子の分泌によって特徴づけられる応答)。自 己免疫疾患の発達においてしばしば失敗し、組織移植片の拒絶に重要な役割を果
たし、腫瘍の拒絶において重要であり得るのは、この調節機能である。
【０００３】 Ｔ細胞応答の特異性をもたらしているのは、個々のリンパ球上に発現される、
クロノタイプＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる細胞表面受容体の特有なセット
である。クロノタイプＴＣＲのコグネイトリガンドは、抗原となる主要組織適合
複合体（ＭＨＣ）分子である。Ｔ細胞受容体は、抗原提示細胞表面上のＭＨＣ分
子によって提示される低分子抗原ペプチドの形態をした抗原を認識する。この抗
原ペプチドとＭＨＣとの相互作用がきわめて安定で、一般に高い親和性（１０-9 Ｍ）とそれによる長い解離半減期を示すのに対し、Ｔ細胞受容体とペプチド／Ｍ
ＨＣ複合体の相互作用（Ｔ細胞誘発におけるきわめて重要な認識反応）は相対的
に親和性が低い（１０-4Ｍ〜１０-6Ｍ）。この低親和性のために、Ｔ細胞の応答
は、抗原提示細胞の表面にある多重抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体と相互作用して
いる各Ｔ細胞の表面における多くのＴ細胞受容体の相互作用により促進される。
【０００４】 抗原特異的Ｔ細胞は正常な生理学的免疫応答及び多くの病態において主要な役
割を果たす。自己抗原を標的にする抗原特異的Ｔ細胞の過剰活性化は、多発性硬
化症、関節炎及び糖尿病を包含する大部分の自己免疫疾患の根本原因となる。逆
に、腫瘍抗原特異的なＴ細胞の不活性は腫瘍を増殖させる。従って、休眠又は寛
容の腫瘍特異Ｔ細胞の活性化は、癌免疫療法の主要目標となってきた。移植臓器
の拒絶のような他の重要な医学的現象は、これら臓器によって発現される同種抗
原に特異的なＴ細胞の活性に依存する。所望されないＴ細胞応答を抗原特異的に
抑制することにより、臓器移植片拒絶をなくせる可能性がある。
【０００５】 可溶性の単価試薬を使用して抗原特異的Ｔ細胞を監視及びモジュレートするこ
とに限界があるのは、Ｔ細胞受容体が相対的に低い親和性でペプチド／ＭＨＣ複
合体と相互作用するという事実による（２８〜３０）。従って、Ｔ細胞受容体又
はペプチド／ＭＨＣ複合体のいずれかの可溶性単価類似体は、免疫応答を効果的
には調節しない。
【０００６】 免疫応答に関わるタンパク質の可溶性多価類似体がつくられている。そのよう
な類似体は、ＣＤ４／Ｉｇキメラ（４１，４２）、ＣＲ２／Ｉｇキメラ（４３）
及びクラスＩ・ＭＨＣ／Ｉｇキメラ（２０）を包含する。これら類似体のリガン
ド親和性に対する結合価の影響は様々である。例えば、ＣＤ４／Ｉｇ分子は可溶
性単価ＣＤ４分子よりもそのリガンド親和性が高くない。４価のペプチド／ＭＨ
Ｃ複合体は特定のＴ細胞受容体に対して高い親和性を有する。しかしながら、２
価ＭＨＣ類似体は抗原特異的Ｔ細胞を染色又は調節し得るほどに高い親和性を有
さない。従って、感染症、アレルギー、腫瘍、移植臓器及び自己免疫疾患に関連
した抗原に特異的なＴ細胞を特異的に誘発又は抑制し得る薬剤が当技術分野で求
められている。 発明の要約 本発明の目的は、抗原特異的Ｔ細胞に特異的かつ安定的に結合してそれをモジ
ュレートする１組の試薬を提供することである。本発明のこの目的及び他の目的
は、以下の態様の１つ又はそれ以上によって提供される。
【０００７】 本発明の１つの態様は、キメラタンパク質を含んでなる組成物を提供する。こ
のキメラタンパク質はＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含む。キメラタンパク
質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタンパク質を含んでなる分子
複合体を形成する。抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合している。分子複合体内
部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合している。
【０００８】 本発明のさらにもう１つの態様は、キメラタンパク質をコードするベクターを
提供する。このキメラタンパク質は免疫グロブリンのＨ鎖及びＭＨＣ分子を含む
。この免疫グロブリンはＩｇＧ−１ではない。免疫グロブリンのＨ鎖はＭＨＣ分
子のＣ末端である。
【０００９】 本発明のさらにもう１つの態様は、ＭＨＣ分子及びＩｇＧ鎖を含むキメラタン
パク質を含んでなる組成物を提供する。キメラタンパク質は会合して複合体あた
り少なくとも２つのキメラタンパク質を含んでなる分子複合体を形成する。免疫
グロブリン鎖はＩｇＧ−１ではない。
【００１０】 本発明のもう１つの態様は、表面にキメラタンパク質が結合している細胞を含
んでなる組成物を提供する。このキメラタンパク質はＭＨＣ分子及び免疫グロブ
リン鎖を含む。キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメ
ラタンパク質を含んでなる分子複合体を形成する。抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子
に結合している。分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合して
いる。
【００１１】 本発明のさらにもう１つの態様は、アレルギーに罹患している患者を処置する
方法を提供する。ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質が、
患者のアレルギーに関連したＴ細胞応答を抑制するのに十分な用量で患者に投与
される。キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタン
パク質を含んでなる分子複合体を形成する。抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合
している。分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合している。
この抗原ペプチドは、患者がアレルギー反応を示す抗原である。
【００１２】 本発明のさらにもう１つの態様は、臓器移植を受けたか又は受ける予定である
患者を処置する方法を提供する。ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラ
タンパク質が、移植臓器に対する免疫応答を抑制するのに十分な用量で患者に投
与される。キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタ
ンパク質を含んでなる分子複合体を形成する。抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結
合している。分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合している
。この抗原ペプチドは、同種抗原である。
【００１３】 本発明のさらにもう１つの態様は、自己免疫疾患に罹患している患者を処置す
る方法を提供する。ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質が
、自己免疫疾患に関連した免疫応答を抑制するのに十分な用量で患者に投与され
る。キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタンパク
質を含んでなる分子複合体を形成する。抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合して
いる。分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合している。この
抗原ペプチドは、患者が自己免疫応答を示すものである。
【００１４】 本発明のさらにもう１つの態様は、腫瘍を有する患者を処置する方法を提供す
る。ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質が、腫瘍に対する
免疫応答を誘導又は増強するのに十分な用量で患者に投与される。キメラタンパ
ク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタンパク質を含んでなる分
子複合体を形成する。抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合している。分子複合体
内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合している。この抗原ペプチドは、
腫瘍関連ペプチドである。
【００１５】 本発明のさらにもう１つの態様は、感染症を有する患者を処置する方法を提供
する。ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質が、感染症に対
する免疫応答を誘導又は増強するのに十分な用量で患者に投与される。キメラタ
ンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタンパク質を含んでな
る分子複合体を形成する。抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合している。分子複
合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合している。この抗原ペプチド
は、感染病原体に関連したペプチドである。
【００１６】 本発明のさらにもう１つの態様は、抗原特異的Ｔ細胞を標識する方法を提供す
る。抗原特異的Ｔ細胞を含んでなるサンプルをキメラタンパク質と接触させる。
キメラタンパク質はＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含む。キメラタンパク質
は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタンパク質を含んでなる分子複
合体を形成する。分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合して
いる。この抗原ペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞に結合してそれを標識する。
【００１７】 本発明の上記及び他の態様は、抗原特異的Ｔ細胞の免疫応答をモジュレートす
る手段及び方法を当技術分野へ提供する。 発明の詳細な説明 本発明は、ＭＨＣ分子の可溶性、高親和性、多価類似体を提供する。これらの
試薬は、抗原特異的Ｔ細胞を検出する診断薬として、又は抗原特異的Ｔ細胞をｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで活性化するか又は抑制する治療のために使
用され得る。従って、これら試薬は、感染症、アレルギー、自己免疫疾患、癌及
び臓器移植拒絶に対する選択的な免疫をベースとする治療において使用され得る
。
【００１８】 本発明の試薬は、多価アレイにおいて単一のペプチド／ＭＨＣ複合体を発現す
る。この多価アレイは、抗原ペプチド／クラスＩ複合体を表出させる分子骨格と
して免疫グロブリン骨格を使用して形成される。これらアレイは、以下に示すよ
うに、免疫グロブリンＨ鎖の５’末端にＭＨＣ遺伝子が連結しているキメラ遺伝
子を産生することによって作られ得る。これら構築体が、例えばバキュロウイル
ス又はハイブリドーマ細胞で発現すると、それらは分子骨格の結合価に基づけば
多価の免疫グロブリン分子であるキメラ分子を産生する。
【００１９】 キメラＭＨＣ／Ｉｇ分子は、免疫グロブリンＨ鎖の末端においてインタクトな
配座形式で形成される（図１Ａの概略図を参照）。抗原ペプチドで均質に負荷さ
れると、ＭＨＣ／Ｉｇキメラ（pepＭＨＣ／Ｉｇ分子）は、安定結合をもたらす のに十分高い親和性を有し、抗原特異的Ｔ細胞をモジュレートし得る。
【００２０】 上記の構築体は、数多くの他の有用な特徴を有する。例えば、免疫グロブリン
骨格により賦与される安定性及び分泌効率により、きわめて安定で、生産しやす
い。さらに、免疫グロブリンのＦｃ部分を換えることによって、このＦｃ部分に
よりもたらされる生物学的機能に基づいて、この分子に対して様々な生物学的機
能が提供され得る。あるタイプの免疫グロブリン遺伝子のＦｃ部分を他のものに
置換することは当技術分野の範囲内にある。
【００２１】 このクラスの試薬は、様々な免疫疾患を理解するための新しい手段を示す。２
価ＭＨＣ／Ｉｇキメラタンパク質がそのコグネイトＴ細胞受容体に安定的に結合
するという観察事実が驚くべきなのは、１価ペプチド−ＭＨＣ複合体がＴＣＲ複
合体から１分未満の半減期ですぐに解離し（２７）、ペプチド−ＭＨＣ複合体に
対するＴ細胞受容体の親和性が比較的低い（〜１０-5μＭ）からである（２８−
３０）。ダイマーＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ複合体のコグネイトＴ細胞に対する安定結
合は、免疫グロブリン骨格に関連した２つの特徴に基づいている。第一は、この
複合体の多価性によりアビディティーが増加すること。第二は、免疫グロブリン
ヒンジ領域特有の柔軟性により、我々の２価構築体のアビディティーが最大に高
められている可能性があること。
【００２２】 本発明のキメラタンパク質は、免疫グロブリンＨ鎖及びＭＨＣ分子を含む。免
疫グロブリンＨ鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２β、Ｉｇ
Ｇ２α、ＩｇＥ又はＩｇＡのＨ鎖であり得る。好ましくは、本発明の２価キメラ
タンパク質を形成するにはＩｇＧのＨ鎖が使用される。多価キメラタンパク質が
所望されるならば、５価又は４価キメラを提供するために、それぞれＩｇＭ又は
ＩｇＡのＨ鎖が使用され得る。多価免疫グロブリンＨ鎖を使用すれば、他の結合
価のキメラタンパク質も構築し得る。
【００２３】 免疫グロブリンＨ鎖はＭＨＣ分子のポリペプチド鎖に融合する。組換え的にか
又は２種のタンパク質セグメントを共有結合させることによって融合タンパク質
を作る方法は、よく知られている。好ましくは、融合タンパク質は、発現構築体
の生成物として組換え的に発現される。本発明の発現構築体は、免疫グロブリン
Ｈ鎖がＭＨＣ分子のＣ末端である本発明の融合タンパク質をコードするポリヌク
レオチド又はベクターを含む。
【００２４】 本発明の発現ベクターは、当技術分野で知られている任意の技術を使用して宿
主細胞へ導入し得る。これらの技術は、トランスフェリン−ポリカチオン介在性
ＤＮＡ導入、裸の又は被包化した核酸によるトランスフェクション、リポソーム
介在性の細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト
融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション及びリン酸カルシウム介在性トラ
ンスフェクションを包含する。
【００２５】 本発明の発現ベクターを含む宿主細胞は、原核又は真核であり得る。本発明の
融合タンパク質を発現する細菌のシステムは、Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１
９７８）２７５：６１５，Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８１
：５４４，Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８
０）８：４０５７，ＥＰ３６，７７６、Ｕ．Ｓ．４，５５１，４３３，ｄｅＢｏ
ｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２
１−２５及びＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ（１９８０）２０：２６９に記
載されるものを包含する。
【００２６】 酵母の発現システムは、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９，Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．（１９８３）１５３：１６３，Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
（１９８６）６：１４２，Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．（１９８５）２５：１４１，Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．（１９８６）１３２：３４５９，Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０２：３０２，Ｄａｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．（１９８４）１５８：１１６５，Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５４：７３７，Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５，Ｋｕｎｚｅら、Ｊ
．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１，Ｃｒｅｇｇら
、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３３７６，Ｕ．Ｓ．４，８３
７，１４８，Ｕ．Ｓ．４，９２９，５５５，Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ，
Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）３００：７０６，Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅ
ｎｅｔ．（１９８５）１０：３８０，Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅ
ｎｅｔ．（１９８５）１０：４９，Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３）１１２：２４８−２８９，Ｔ
ｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２２１，Ｙｅｌｔｏｎら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０
−１４７４，Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４
：４７５４７９，ＥＰ２４４，２３４及びＷＯ９１／００３５７に記載されるも
のを包含する。
【００２７】 本発明の融合タンパク質の昆虫における発現は、Ｕ．Ｓ．４，７４５，０５１
，Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）［バキュロウイルス遺伝子発現の調節］／「バ
キュロウイルスの分子生物学」（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編），ＥＰ１２７，８４
９，ＥＰ１５５，４７６及びＶｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８
）６９：７６５−７７６，Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．（１９８８）４２：１７７，Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ（１９８８）
７３：４０９，Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−５９
４，Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１
９８８）８：３１２９，Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ（１９８５）８２：８４０４，Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ（１９８
７）５８：２７３及びＭａｒｔｉｎら、ＤＮＡ（１９８８）７：９９に記載され
るようにして実施し得る。数多くのバキュロウイルス株及び変異体、及び宿主由
来の対応する昆虫の許容宿主細胞については、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５，Ｍｉｌｌｅｒら、「遺伝子工学」
（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編）Ｖｏｌ．８（プレナムパブリッシング、１９８
６）ｐｐ２７７−２７９及びＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：
５９２−５９４に記載されている。
【００２８】 哺乳動物の細胞における本発明の融合タンパク質の発現は、Ｄｉｊｋｅｍａら
、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１，Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７，Ｂｏｓｈａｒｔ
ら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１及びＵ．Ｓ．４，３９９，２１６に記載
されるようにして達成し得る。哺乳動物の発現に関する他の特性は、Ｈａｍ ａ
ｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．（１９７９）５８：４４，Ｂａｒｎ
ｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０２：２
５５，Ｕ．Ｓ．４，７６７，７０４，Ｕ．Ｓ．４，６５７，８６６，Ｕ．Ｓ．４
，９２７，７６２，Ｕ．Ｓ．４，５６０，６５５，ＷＯ９０／１０３４３０，Ｗ
Ｏ８７／００１９５及びＵ．Ｓ．ＲＥ３０，９８５に記載されるようにして促進
され得る。
【００２９】 分子複合体内の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合している。アレルギー
又は自己免疫応答、同種抗原、腫瘍関連ペプチド及び、細菌、ウイルス又は真菌
のような感染病原体のペプチドを包含する、免疫応答を誘導し得る任意のペプチ
ドがＭＨＣ分子に結合し得る。
【００３０】 抗原ペプチドは、ＭＨＣ分子の抗原結合部位又は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖又は
β2ミクログロブリンのいずれかのアミノ末端に結合し得る。抗原ペプチドのキ メラタンパク質に対する結合又は「負荷」は、以下の実施例２に記載されるよう
に、能動的又は受動的に実施され得る。抗原ペプチドはキメラタンパク質に共有
結合され得る。
【００３１】 所望により、抗原ペプチドをβ2ミクログロブリンに連結させるためにペプチ ドつなぎ（ｔｅｔｈｅｒ）が使用され得る。多数のクラスＩＭＨＣ分子の結晶学
的分析は、β２Ｍのアミノ末端が、ＭＨＣペプチドの結合溝内に存在する抗原ペ
プチドのカルボキシル末端から非常に近く、約２０．５Ａ（オングストローム）
離れたところにあることを示している（図１８参照）。従って、比較的短いリン
カー配列、長さ約１３アミノ酸を使用すれば、β２Ｍのアミノ末端へペプチドを
つなぐことができる。配列が適切であれば、そのペプチドはＭＨＣの結合溝に結
合するはずである（以下の実施例１７を参照）。
【００３２】 本発明の分子複合体は、抗原特異的な細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉ
ｖｏで標識する、診断薬として使用し得る。抗原特異的Ｔ細胞を含むサンプルを
、各ＭＨＣ分子が同一抗原ペプチドに結合している分子複合体に接触し得る。こ
のサンプルは、例えば、末梢血、リンパ液、リンパ節、脾臓、胸腺又は骨髄であ
り得る。
【００３３】 抗原ペプチドは抗原特異的Ｔ細胞に特異的に結合し、抗原ペプチド負荷複合体
でそれらを標識する。抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体は、検出を促進するために放
射標識又は蛍光ラベルのようなレポーター基と結合し得るが、結合しなければな
らないわけではない。この分子複合体は溶液内にあり得るか又はガラス、プラス
チックスライド又は組織培養プレート又はラテックス、ポリ塩化ビニル又はポリ
スチレンビーズのような固体の基質に固定され得る。
【００３４】 抗原ペプチドに結合している抗原特異的Ｔ細胞は、結合していない細胞から分
離し得る。プラズマフェレーシス、フローサイトメトリー又は示差遠心分離を包
含する，当技術分野で知られている任意の方法がこの分離を達成するために使用
され得る。患者から単離された抗原特異的Ｔ細胞は、サイトカイン、化学療法剤
又は抗体のような試薬で処理され、治療効果を提供するために患者へ再注入され
得る。所望により、抗原ペプチドに結合している抗原特異的Ｔ細胞の数は、例え
ばフローサイトメトリーにより定量化又は計数され得る。
【００３５】 本発明の分子複合体は、抗原特異的Ｔ細胞を活性化又は阻害するためにも使用
され得る。リシン又はシュウドモナス毒素のような毒素の分子を本発明の分子複
合体に結合することが可能である。同様に、分子複合体は、リンホカインのよう
な免疫応答を刺激する分子又は他のエフェクター分子に結合し得る。分子複合体
の用量は、抗原特異的Ｔ細胞を活性化するか又は阻害するように修飾され得る。
【００３６】 抗原特異的Ｔ細胞を含むサンプルは、各ＭＨＣ分子が抗原ペプチドに結合して
いる分子複合体と、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで接触され得る。抗原
ペプチドは抗原特異的Ｔ細胞に特異的に結合してそれを活性化するか又は阻害す
る。例えば、特定のＴ細胞サブセットからのサイトカインの放出が刺激されるか
又は抑制され得る。Ｈｅｗｉｔｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１４９３（
１９９２）；Ｃｈｏｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：８９
４１（１９８９）；Ｋａｐｐｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：８１１（１９
８９）；Ｍｉｎａｓｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１４５１（１９９３）
；Ｓｕｎｄｓｔｅｄｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８２：１１７（１９９４）；
及びＷｈｉｔｅら、Ｃｅｌｌ ５６：２７（１９８９）。
【００３７】 本発明の分子複合体は、免疫応答を阻害するか又は刺激するために、治療的に
使用され得る。例えば、アレルギーを処置するために、患者がアレルギー反応を
有する抗原ペプチドを含んでなる分子複合体が患者へ投与され得る。この分子複
合体は、アレルギーに関連したＴ細胞の応答を抑制又は減少させるに十分な用量
で患者へ投与される。
【００３８】 同様に、臓器移植を受けたか又は受ける予定である患者が本発明の分子複合体
で処置され得る。各リガンド結合部位が同種抗原に結合している分子複合体を、
臓器移植に対する免疫応答を抑制又は減少させるに十分な用量で患者へ投与し得
る。同種抗原は、クラスＩ及びクラスＩＩ・ＭＨＣ分子を包含するＨＬＡ抗原、
及びＡＢＯ血液型抗原のような副組織適応性抗原、Ｔ及びＢ細胞上の自己抗原及
び単球／内皮細胞抗原を包含する。
【００３９】 グッドパスチャー症候群、多発性硬化症、グレイヴス病、重症筋無力症、全身
性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、尋常性天疱
瘡、アジソン病、疱疹状皮膚炎、小児脂肪便症、橋本甲状腺炎のような自己免疫
疾患も同様に処置され得る。自己免疫疾患に罹っている患者は、患者が自己免疫
応答を発現する抗原ペプチドに各リガンド結合部位が結合している本発明の分子
複合体で処置され得る。分子複合体は、自己免疫応答を抑制又は減少させるに十
分な用量で患者へ投与し得る。
【００４０】 患者の免疫応答はまた本発明の分子複合体を使用して誘導又は増強され得る。
腫瘍によって発現されるペプチドに各リガンド結合部位が結合している分子複合
体が、腫瘍を処置するために使用され得る。このペプチドは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ
、Ｒａｓ又はｐ１８５HER2のような腫瘍特異的ペプチドであり得るか又は腫瘍と
対応する正常組織の両方によって発現されるペプチドであり得る。同様に、細菌
又はウイルスのような感染病原体のペプチドに各リガンド結合部位が結合してい
る分子複合体が、感染症を処置するために使用され得る。いずれの場合でも、適
切な分子複合体が、腫瘍又は感染に対する免疫応答を誘導又は増強させるに十分
な用量で患者へ投与される。
【００４１】 本発明の分子複合体は、樹状細胞のような細胞の表面に結合され得る。全リガ
ンド結合部位が同一抗原ペプチドに結合している分子複合体の集団も細胞に結合
され得る。結合は、当技術分野で知られているように、分子複合体の融合タンパ
ク質を細胞膜の表面に固定するアミノ酸配列をそれに供給して細胞内で融合タン
パク質を発現させることによって達成され得るか、又は化学的に達成され得る。
【００４２】 本発明の分子複合体を含んでなる組成物は、製剤的に許容される担体を含み得
る。製剤的に許容される担体は当業者によく知られている。そのような担体は、
限定しないが、タンパク質、多糖類、ポリアクチン（ａｃｔｉｎｉｃ）酸、ポリ
グリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子
のような、大型でゆっくりと代謝される高分子を包含する。製剤的に許容される
塩もまた本発明の組成物に使用され得る。例えば、塩酸塩、臭酸塩、リン酸塩又
は硫酸塩のような無機塩、並びに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩又は安息
香酸塩のような有機酸塩である。本発明の組成物はまた、水、生理食塩水、グリ
セロール及びエタノールのような液体、並びに加湿剤、乳化剤又はｐＨ緩衝剤の
ような物質を含有し得る。Ｕ．Ｓ．５，４２２，１２０、ＷＯ９５／１３７９６
、ＷＯ９１／１４４４５又はＥＰ５２４，９６８Ｂ１に記載されるようなリポソ
ームも本発明の組成物の担体として使用され得る。
【００４３】 特定の処置法のために利用される２価及び多価分子複合体の特定の用量は、処
置される条件、標的に対する特定試薬の結合親和性、疾患進行の程度等により異
なるものである。しかしながら、分子複合体の用量は、一般に１日あたり１ｐｇ
〜１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲に入る。医薬組成物の活性成分が分子複合体の融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである場合、用量は一般に１ｎＭ〜
５０μＭ／体重ｋｇの範囲に入る。
【００４４】 本明細書の実施例に利用された組成物に包含される各活性薬剤の量は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかの実地において本発明の方法を最適化
する際に実施者によって利用され得る各成分の量についての一般ガイドラインを
提供する。さらに、そのような範囲は、ある特定の応用において保証されるよう
な、ある成分のより高いか又は低い量の使用を決して除外しない。例えば、実際
の用量及びスケジュールは、組成物が他の医薬組成物と複合して投与されるかど
うか、又は薬物動態、薬物素因及び代謝における各人の違いによって変化し得る
。同様に、用量は、利用される特定の細胞系に依存したｉｎ ｖｉｔｒｏ応用、
例えばその細胞系において複製させるために利用されるプラスミドの能力によっ
て、変化し得る。例えば、細胞又は処置に関して加えられる核酸の量は、その核
酸の長さ及び安定性、並びに配列の特質に応じて変化し得るし、本発明の方法に
内在しない要因、例えば合成に関わるコストにより変更され得る。当業者は、特
定の状況の必要性に準じて必要な調整を容易になし得る。
【００４５】 特定の使用のために十分な組成物の用量は、宿主に所望の効果をもたらす用量
である。この効果は当業者に知られているいくつかのエンドポイントを使用して
モニターし得る。例えば、１つの所望される効果は、宿主細胞への有効な核酸導
入を含み得る。そのような導入は、治療効果（例、処置される疾患に関連した症
状の軽減）又は宿主内の導入遺伝子又はその遺伝子の発現のさらなる証拠（例、
ＰＣＲ、ノーザン又はサザンハイブリダイゼーション技術の使用）又は宿主細胞
内の核酸を検出する転写アッセイによって、又は導入された核酸によってコード
されるタンパク質又はポリペプチド、又はそのような導入によるレベル又は機能
の影響を検出するためにイムノブロット分析、抗体介在性の検出又は以下の実施
例に記載されるアッセイを使用することによってモニターされ得る。
【００４６】 実施例は、抗原ペプチドを負荷した本発明のキメラ分子の、抗原特異的Ｔ細胞
応答の検出及び調節における使用を記載する。これらの例では、ＭＨＣクラスＩ
分子がＣＤ８細胞を標的にするために使用される。しかしながら、ＭＨＣクラス
ＩＩ／Ｉｇキメラもまた、ＭＨＣクラスＩＩ分子のα鎖及びβ鎖をそれぞれ免疫
グロブリンのＨ鎖及びＬ鎖に連結することによって産生され得る。
【００４７】 ペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇを用いた末梢血ＨＴＬＶ−１Ｔａｘ１１−１
９特異的Ｔ細胞の定量は、かつてのＬＤＡによるＴａｘ特異的ＣＤ８+、ＣＴＬ の前駆体頻度分析（１２）がＴａｘ特異的Ｔ細胞の実際数をかなり過少評価した
可能性があることを示す。本発明の試薬を使用して、我々は、Ｔａｘ−Ａ２／Ｉ
ｇ染色により評価されるＴａｘ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の数がＬＤＡによりかつて 算定されたもの（１２）より約１０〜３０倍高いことを示すことができた。おそ
らくＬＤＡの正確性が損なわれるのは、それがクロミウム放出のような機能試験
によって検出されるに十分な数まで個々のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞を拡張し得る能
力に依存するためである（３１〜３４）。Ｔａｘ−Ａ２／Ｉｇを用いた直接染色
により定量される頻度は非特異的な結合によるものではない。Ｔａｘ−Ａ２／Ｉ
ｇでポジティブに染色するＣＤ８+Ｔ細胞は、ＨＴＬＶ−１-の被検者、ＨＡＭ／
ＴＳＰを有するＨＬＡ−Ａ２-患者及び異なるレトロウイルス、ＨＩＶに感染し ている対照ＨＬＡ−Ａ２患者ではほとんど検出されなかったが、ｐ１７Ｇａｇ７
７−８５負荷Ａ２／Ｉｇで染色したときは有意数の細胞がｐ１７Ｇａｇ７７−８
５に特異的であった。
【００４８】 抗原特異的Ｔ細胞の集団を分析するためにペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇを
使用することに加えて、ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇキメラの免疫グロブリン骨格は、抗
原特異的Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ標的化を包含する、他の様々なオプションを提
供する。この分子に挿入され得る種々のＦｃ領域によって仲介され得るｉｎ ｖ
ｉｖｏ生物学的効果の多様性は、抗原特異的Ｔ細胞をワクチンとして増幅するこ
と又は典型的な自己免疫疾患並びにＨＡＭ／ＴＳＰのような疾患における病原性
Ｔ細胞を消滅させることのいずれかのために、抗原特異的Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖ
ｏで標的にする応用を考慮する。
【００４９】 ＨＬＡ−Ａ２+ＨＡＭ／ＴＳＰ患者にＨＴＬＶ−１Ｔａｘ１１−１９特異的Ｃ Ｄ８+Ｔ細胞が多数あるのは、この病原性の免疫応答において免疫優性エピトー プが存在する可能性を示す。従って、可溶性の２価ＭＨＣ／Ｉｇはまた、ＨＡＭ
／ＴＳＰにおけるＨＴＬＶ−１特異的ＣＤ８+Ｔリンパ球を標的にして消滅させ る治療応用を有し得る。
【００５０】 以下に示す実施例では、ＩｇＧ分子を使用する分子骨格に基づいて分子は２価
であるが、ＩｇＭを免疫グロブリン部分に使用するか又は他の免疫グロブリン分
子を骨格として使用することにより多価にもなし得る。他のＩｇ分子をコードす
る既知の遺伝子を以下に示すＩｇＧ−１に置換することにより、同一の遺伝子構
築体を使用し得る。そのような置換は当技術分野の範囲内にある。
【００５１】 以下の実施例は説明目的のためだけに提供されるものであり、上記の広い用語
で記載される本発明の特許請求範囲を制限することを意図しない。
【００５２】
【実施例】
実施例１ 本実施例は、ペプチドを負荷するＭＨＣ／Ｉｇキメラによる抗原特異的Ｔ細胞
の染色について説明する。
【００５３】 ペプチド負荷ＭＨＣ／Ｉｇ分子の親和性の向上により、同族のＴ細胞への結合
が安定する（図２）。抗原特異的Ｔ細胞を既定の抗原ペプチドを負荷するＭＨＣ
クラスＩ／ＩｇＧ試薬で特異的に染色する。可溶性の二価のマウス・クラスＩ、
Ｈ−２ Ｌd／Ｉｇで、ｐ２Ｃａ（２Ｃ細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に反応 するペプチド）またはＡＨ−１（マウス腫瘍ＣＴ２６を認識する腫瘍ＣＴＬ系に
特異的なペプチド）のいずれかを負荷するものを使用して、抗原特異的ＣＴＬを
標識することができる。図２Ａに示すように、２Ｃ ＣＴＬはp2CaＬd／Ｉｇ複 合体との反応性を示したが、AH1Ｌd／Ｉｇ複合体とは反応しなかった。ＣＴ２６
特異的Ｔ細胞はAH1Ｌd／Ｉｇとのみ反応性を示し、p2CaＬd／Ｉｇ（データは示 していない）またはβ-galＬd／Ｉｇ複合体（図２Ｂ）のいずれとも反応しなか った。これらの結果と対照的に、ＭＨＣがアビジンの周辺に配位する場合、四価
のペプチド／ＭＨＣ複合体が染色に必要なことが既に見出されている。
【００５４】 実施例２ 本実施例は、キメラの受動的負荷と能動的負荷を対比して説明する。 これらのキメラ化合物の決定的な特徴は、それぞれのＭＨＣ部分に１つの十分
に限定されたペプチド（興味のペプチド抗原を示す）を負荷する能力である。二
価のＭＨＣの抗原特異的反応に対する影響を効果的に試験するために、二価のＭ
ＨＣ分子のペプチド再構成のパラメーターを確立した。これらのパラメーターは
異なるＭＨＣ／Ｉｇキメラ間で多様である。
【００５５】 種々の異なる方法を検討して、キメラＭＨＣ／Ｉｇ分子のペプチドの負荷を最
適化した。最適なＨ−２Ｋb／Ｉｇ負荷にはアルカリ逆抽出、迅速な中和、およ び緩慢な再生（refolding）が必要である（図式的には図３を参照されたい）。 このプロトコールをここではpepＭＨＣ／Ｉｇ複合体の“能動的”負荷と呼ぶ。p ep ＭＨＣ／Ｉｇ複合体の“受動的”負荷は、単に興味のあるペプチドをＭＨＣ／
Ｉｇ複合体と共に４８時間にわたってインキュベートすることによって達成され
る。
【００５６】 特定のＴ細胞を染色するための試薬として試験したところ、“能動的”に負荷
されたSIYＫb／Ｉｇ分子は、“受動的”に負荷されたSIYＫb／Ｉｇより有意に好
適であった。抗原特異的Ｔ細胞の染色は、“能動的”に負荷されたSIYＫb／Ｉｇ
では０．１ｎＭという低濃度で観察され、０．１ｎＭの“能動的”負荷SIYＫb／
Ｉｇで染色された細胞の平均チャンネル蛍光（ＭＣＦ）は５３であり、一方、コ
ントロールのペプチド、ＶＳＶを“能動的”に負荷したＫb／ＩｇのＭＣＦは４ ２であった。
【００５７】 抗原特異的Ｔ細胞の染色には約１０ｎＭの“受動的”に負荷したSIYＫb／Ｉｇ
が必要であった。抗原特異的２Ｃ Ｔ細胞の半量染色（half maximal staining ）は１ｎＭの“能動的”負荷SIYＫb／Ｉｇで観察されたが、“受動的”負荷SIY Ｋb／Ｉｇでは約１０ｎＭが必要であった。従って、“能動的”負荷pepＫb／Ｉ ｇ複合体は“受動的”負荷pepＭＨＣ／Ｉｇ複合体より、ペプチド特異的Ｔ細胞 の染色において約１０−１００倍効果的である。
【００５８】 実施例３ 本実施例は、pepＭＨＣ／Ｉｇ複合体の感度について説明する。 これらの試薬の有用性を示すにはその特異性のみではなく、その感度も必要であ
る。低濃度のpepＭＨＣ／Ｉｇ複合体で抗原特異的Ｔ細胞が検出される。ナノモ ル濃度のペプチド負荷ＭＨＣ／Ｉｇ複合体を使用して２Ｃ Ｔ細胞を染色できる
。QL9Ｌd／ＩｇまたはSIYＫb／Ｉｇ複合体のいずれかで分析する場合、半量安定
化は約１ｎＭで観察される。一方、コントロールのペプチドを負荷するＭＨＣ／
Ｉｇ複合体、VSVＫb／ＩｇまたはMCMVＬd／ＩｇはＴ細胞と特異的な相互作用を しない。
【００５９】 従って、ペプチド負荷ＭＨＣ／Ｉｇ分子は、抗原特異的Ｔ細胞の分析において
非常に感度が高い試薬である。 実施例４ 本実施例は、二価のＭＨＣ／ＩｇがＭＨＣ／Ｉｇの活性画分を含有することを
説明する。
【００６０】 既に報告されているデータが示すように、四価のＭＨＣがクラスＩに限定され
た抗原特異的Ｔ細胞の染色に必要であることを考慮して、出願人はpepＭＨＣ／ Ｉｇ複合体でのＴ細胞染色がpepＭＨＣ／Ｉｇ複合体の凝集画分での染色による 可能性があると考えた。この問題を処理するために、pepＭＨＣ／Ｉｇ分子をサ イズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分画し、各々の画分を抗原特異的Ｔ細
胞を染色する能力について分析した。
【００６１】 最初のＳＥＣ試験から、種々のタンパク質のピークがpepＭＨＣ／Ｉｇ分子の 調製品中に観察された（図６）。ペプチド負荷Ｌd／ＩｇＧおよびＫb／ＩｇＧは
いずれも、有意な量の凝集物質（ピークＡ）を分子量＞６．６ｘ１０5のタンパ ク質と共に負荷していた。興味深いことに、異なるキメラタンパク質では異なる
量のタンパク質が凝集物中に見られた。
【００６２】 分子量２．６ｘ１０5Ｋbの第二のピークが観察され、これは単量体の二価pep ＭＨＣ／Ｉｇのピークに相当した（ピークＢ）。二価のＬd／Ｉｇタンパク質で は、これは顕著なタンパク質ピークであった。このピークはSIYＫb／Ｉｇと会合
するタンパク質の有意ではあるがより小さな画分であった。凝集物および単量体
タンパク質複合体に加え、更なる分解産物がある種のpepＭＨＣ／Ｉｇ調製品中 に観察された。ピークＣはおそらくはキメラ分子のＩｇＧ画分への分解を示し、
またＤおよびＥはより小さな分解産物であって、これはSIYＫｂ／Ｉｇ調製品に も認められた。
【００６３】 どの画分がフローサイトメトリー・アッセイで活性かを確認するために、pep ＭＨＣ／Ｉｇ複合体を予備的にＳＥＣで分画し、ＣＴＬを結合させる能力につい
て試験した。顕著なＴ細胞結合活性は単量体の二価ＭＨＣ／Ｉｇタンパク質ピー
クＢに伴っていたが、凝集タンパク質画分には伴わなかった（図７）。わずかな
染色が凝集物質、タンパク質ピークＡで観察されたが、これは相対的に極少量で
あり、迅速に消失した。一方、ペプチド負荷二価ＭＨＣ／Ｉｇ画分を含有する単
量体ピークは圧倒的多数のpepＭＨＣ／Ｉｇ分子（ＣＴＬ染色の原因である）を 含有した（図７）。
【００６４】 従って、Ｉｇを分子骨格として使用して、出願人は高親和性二価pepＭＨＣ／ Ｉｇ類似体を生成したが、これを使用して抗原特異的Ｔ細胞を染色することがで
きる。
【００６５】 実施例５ 本実施例は、免疫化した動物からの抗原特異的Ｔ細胞の検出について説明する
。
【００６６】 抗原特異的Ｔ細胞をモニタリングするための現在のアプローチは、それぞれの
アプローチに関連する明らかな制限を伴う。Ｔ細胞のモニタリングには、広範な
反応性を有するモノクローナル抗体（抗Ｖβ特異的モノクローナル抗体のような
）の使用、高特異的抗クロノタイプ（clonotypic）モノクローナル抗体の開発、
または間接的な細胞を使用したアッセイの使用が必要とされる。しかし、高特異
的抗クロノタイプモノクローナル抗体は比較的まれであり、生成するのが困難で
ある。更に、抗クロノタイプモノクローナル抗体は特定のＴＣＲ∝／β複合体を
発現する抗原特異的Ｔ細胞を認識するが、異なる∝／β ＴＣＲを使用して同一
の抗原／ＭＨＣ複合体を見る他の抗原特異的Ｔ細胞は認識しない。細胞を使用す
るアッセイは興味のある抗原／ＭＨＣ複合体を認識するＴ細胞に特異的であるが
、間接的なアッセイであり、これを使用して興味のＴ細胞の数を正確に定めるの
は困難である。従って、pepＭＨＣ／Ｉｇ複合体が提供する主要な進歩は、免疫 応答の発生における抗原特異的Ｔ細胞を直接同定する能力である。
【００６７】 出願人は、pepＭＨＣ／Ｉｇ複合体を使用して、モデル腫瘍ワクチンＣＴ２６ −ＧＭで免疫化した動物由来の脾臓細胞の染色によってｉｎ ｖｉｖｏにおいて
Ｔ細胞レパートリーを分析できるかどうかを検討した。ＣＴ２６−ＧＭは、ＧＭ
−ＣＳＦをコードする遺伝子でトランスフェクトしたマウス結腸癌系である。動
物をＣＴ２６−ＧＭで免疫化すると、親のＣＴ２６腫瘍の増殖に対して耐性とな
る。この耐性はＴ細胞によるものであるが、これは免疫化した動物において生成
され、Ｈ−２Ｌd分子の状況で存在するペプチド抗原ＡＨ１を認識する。ＡＨ１ ペプチドは内因性マウス・レトロウィルスに由来するが、その配列は出願人によ
って既に確認されており、Ｈ−２Ｌd分子に有効に結合し、Ｔ細胞を感作して抗 −ＣＴ２６免疫応答を起こすことが知られている。
【００６８】 pepＭＨＣ／Ｉｇ複合体は、ＣＴ２６−ＧＭで免疫化した動物の抗原特異的Ｔ 細胞を有効に検出する。ＣＴ２６−ＧＭ細胞を一回接種した１４日後、全ＣＤ８ + Ｔ細胞の約３％がAH1Ｌd／Ｉｇ複合体と反応する。コントロールのpepＭＨＣ／
Ｉｇ複合体、β-galＬd／ＩｇおよびMCMVＬd／Ｉｇは約１０倍少ない細胞、ある
いは全ＣＤ８+Ｔ細胞の０．３％と反応する。未処理の非免疫化動物では、AH1Ｌ d ／Ｉｇ複合体は全ＣＤ８+Ｔ細胞の約０．３％としか反応しない。従って、１回
接種により、pepＭＨＣ／Ｉｇを使用して検出できうる抗原反応性Ｔ細胞の総数 が約１０倍増加する。このように、pepＭＨＣ／Ｉｇを使用して、接種後、移植 後、または抗原特異的自己免疫疾患の治療の際のＴ細胞のホメオスタシスをモニ
タリングすることができる。
【００６９】 これらの結果が示すところによれば、これらの試薬をフローサイトメトリーと
共に使用してリンパ器官、末梢血、または他の浸潤組織由来のＴ細胞の特異的染
色をし、抗原特異的Ｔ細胞の数を評価する直接的かつ定量的方法とすることがで
きる。これらの試薬を活性化のためのマーカーと併用することにより、これらの
Ｔ細胞の活性化状態を定量的に分析することができる。更に、これらの試薬をセ
ルソーターと併用することにより、精製された抗原特異的Ｔ細胞の集団を識別で
きる。その後、精製集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで操作することができる。
【００７０】 実施例６ 本実施例は、ペプチド負荷QL9Ｌd／ＩｇまたはSIYＫb／Ｉｇが２Ｃ細胞障害性
リンパ球（ＣＴＬ）による標的細胞の溶解を特異的に阻害することを説明する。
【００７１】 QL9Ｌd／Ｉｇを阻害複合体として使用して、標的細胞の溶解が８２％から２％
にまで顕著に阻害された（図９Ａおよび９Ｂ）。半量阻害は約１０ｎＭのQL9Ｌd ／Ｉｇで起こった。コントロールのpepＭＨＣ／Ｉｇ複合体、MCMVＬd／Ｉｇは標
的細胞の溶解に対する効果がなかった。また、抗clonotypicモノクローナル抗体
１Ｂ２も、ＣＴＬ介在型溶解を阻害するポジティブ・コントロール抗体として使
用した。
【００７２】 SIYＫb／Ｉｇも標的細胞の２Ｃ ＣＴＬ介在型溶解を劇的に阻害した。この場
合、最大阻害により特異的溶解は８５％から３５％まで低下した。ＣＴＬ介在型
溶解の阻害は特に重要であり、これはＣＴＬ溶解活性が非常に低濃度の抗原／Ｍ
ＨＣ複合体を標的細胞上で検出できるからである。従って、ＣＴＬ−介在型溶解
は阻害するのが非常に難しいと考えられる。
【００７３】 標的細胞の溶解に加え、種々の他の生理学的反応（Ｔ細胞の増殖およびリンホ
カイン分泌を含む）はＣＤ８+Ｔ細胞の活性化と関連する。ペプチド負荷二価Ｍ ＨＣ、SIYＫb／ＩｇＧもまた、同種の脾細胞によって刺激された２Ｃ ＣＴＬの
Ｔ細胞の増殖を阻害した。最大阻害は約２０ｎＭのSIYＫb／ＩｇＧで観察された
；未処理の細胞の刺激指数の１００％から、２０ｎＭのSIYＫb／ＩｇＧで処理し
た細胞では１０％まで低下した。半量阻害は約１ｎＭのSIYＫb／ＩｇＧで観察さ
れた。
【００７４】 抗原特異的免疫応答を選択的に阻害する能力により、この試薬を使用して例え
ば自己免疫疾患における病原性の応答または臓器移植後の拒絶反応を引き起こす
応答を停止できる方法が提供される。
【００７５】 これらの試薬を修飾して、抗原特異的Ｔ細胞を特異的に死滅させる、より正確
にはこれらの抗原免疫応答を抑制するようにすることもできる。例えば、試薬を
毒素分子（リシンまたはシュードモナス・エンドトキシンの∝鎖のような）と結
合させることができる。そのような態様では、毒素が結合した試薬をｉｎ ｖｉ
ｖｏで注射するか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで適用する。試薬がペプチド／ＭＨ
Ｃ複合体に特異的なＴ細胞に結合する際、試薬は内部移行される。次いで毒素分
子が興味の病原性Ｔ細胞を選択的に死滅させる。
【００７６】 実施例７ 本実施例は、抗原特異的細胞の活性化について説明する。 pepＭＨＣ／Ｉｇ複合体は細胞表面のＴ細胞レセプターと架橋結合するので、p ep ＭＨＣ／Ｉｇ複合体を使用してＴ細胞を刺激することもできる。pepＭＨＣ／ Ｉｇの固定化によって抗原特異的Ｔ細胞を刺激できる。従って、これらの試薬を
使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで抗原特異的Ｔ細胞
を選択的に活性化することができる。
【００７７】 試薬を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を活性化し、次いで患者に養子移入
することができる。あるいはまた、試薬を患者に注射して、ｉｎ ｖｉｖｏで腫
瘍抗原特異的Ｔ細胞を活性化する手段とすることができる。従って、本発明の試
薬は癌に対する有効な抗原特異的治療ワクチンに相当する。
【００７８】 また、これらの試薬を感染症（真菌性疾患、細菌性疾患、ＨＩＶのようなウィ
ルス性疾患、または細胞内寄生体のような）に対する免疫療法薬として使用し、
これらの病原体に表現される抗原に特異的なＴ細胞を活性化することができる。
【００７９】 従って、本発明の試薬は種々の抗原特異的Ｔ細胞応答を活性化する方法に相当
する。 実施例８ 本実施例は、クラスＩ ＭＨＣ／Ｉｇキメラの一部として発現させるためのペ
プチドの共有結合について説明する。
【００８０】 興味のペプチドを負荷するこれらの多価ＭＨＣ／Ｉｇ試薬をより安定して生成
させる別の修飾は、リンカーを介したペプチドのＭＨＣ分子への共有結合である
。ＭＨＣクラスＩ分子では、これを最も簡易に行うためにはペプチドをβ２ミク
ログロブリンのアミノ末端へ結合させる。ＭＨＣクラスＩＩでは、ペプチドを、
リンカーを介してＭＨＣクラスＩＩのβ鎖のアミノ末端に連結させることができ
るが、これは前に記載した通りである。これらの連結させたペプチドＭＨＣコン
ストラクトを使用して、つなぎ（tether）を介して興味のペプチドをＭＨＣ分子
に近接して結合させる。この結合は血清または媒質中において、他の干渉する可
能性のあるペプチドよりも、そのペプチドの特異的結合に有利である。
【００８１】 ペプチドをβ２Ｍのアミノ末端に連結させるために、まずｔａｘ１１−１９由
来のペプチドをβ２Ｍに連結させることから開始した（図１９）。β２Ｍのアミ
ノ末端の修飾は、リンカーをコードするＤＮＡを好適なクローニング部位と遺伝
的に結合させ、異なるペプチドをβ２Ｍのアミノ末端に挿入して行った。マルチ
プル・ラウンドＰＣＲを用いた変異誘発を使用してβ２Ｍに連結したペプチドを
生成した。オリゴヌクレオチド１および２を使用して、ｔａｘ１１−１９ペプチ
ドに融合したヒトβ２Ｍリーダーを含有する小さいＰＣＲフラグメントを生成し
た。次いでこのＰＣＲ産物を、オリゴ１および３を使用した別のＰＣＲ反応のテ
ンプレートとして使用した。この第二の反応から得られるＰＣＲフラグメントは
、ＸｈｏＩとＢｓｐＥＩクローニング部位の間の約１１０塩基対の全領域をカバ
ーする。
【００８２】 このフラグメントを消化し、修飾したヒトβ２Ｍコンストラクトにクローニン
グした。このコンストラクトを使用して、興味のあるいずれのペプチドでも、β
２Ｍのアミノ末端に容易にカセット化することができる。発現には、修飾したヒ
トβ２Ｍ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−にクローニングし、キメラの
ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇコンストラクトと共にＪ５５８Ｌ細胞に共トランスフェクト
した。得られた細胞をＧ４１８およびゼオシン（Zeocin）の両方で選別し、キメ
ラのＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇおよびβ２Ｍポリペプチドの両方の発現を確実にするこ
とができる。
【００８３】 ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇと複合体をなすペプチド連結ｔａｘ−β２Ｍは、フローサ
イトメトリーによって分析したところ、ＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬクローンとのそ
の相互作用において特異的であった。従って、ｔａｘが連結したＡ２／Ｉｇは、
ＨＬＡ−Ａ２制限、ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９特異的ＣＴＬクローン、Ａ
６と特異的に反応した（２２）。ペプチド連結ｔａｘ β２Ｍ ＨＬＡ−Ａ２／
Ｉｇ複合体で染色されたＡ６細胞の平均チャンネル蛍光（ＭＣＦ）は約４０００
であった、キメラタンパク質を使用しないで染色したＡ６細胞のＭＣＦはわずか
１０であり、コントロールＧａｇ−Ａ２／Ｉｇ複合体、未負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉ
ｇを用いた染色コントロールとほぼ同じであった。ｔａｘ−ｂ２Ｍでの染色の程
度は抗−Ｖβ１３．１特異的ｍＡｂで得られるのと同様であり、全ての関連する
部位がｔａｘ−β２Ｍ ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇを用いて飽和されていることを示し
ていた。従って、β２Ｍに連結するペプチドは、ＭＨＣ／Ｉｇ分子の状況で存在
するペプチドとして最も有効である。 ＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパシー／熱帯性痙性不全対麻痺における抗原特異的Ｔ細
胞の直接的可視化 以下の実施例は、本発明の試薬を使用したＨＴＬＶ−Ｉ関連ミエロパシー／熱
帯性痙性不全対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ）およびＨＩＶ感染症に罹患した患者にお
ける抗原特異的Ｔ細胞の直接的可視化について説明する。
【００８４】 ＨＡＭ／ＴＳＰはヒトのレトロウィルス、ヒトＴリンパ向性ウィルス・タイプ
Ｉ（ＨＴＬＶ−１）によって引き起こされる（２、３）。ＨＡＭ／ＴＳＰの症状
は上位運動ニューロンの徴候と、軽度の知覚および括約筋の機能不全を特徴とす
る（３）。組織病理学的に胸髄萎縮が観察されるが、これは血管周囲の脱髄およ
び軸索の変性に関与するものである（４、５）。
【００８５】 ＨＡＭ／ＴＳＰの病態生理学はまだ完全に理解されていない（６）。ＨＴＬＶ
−１に対する血清の反応性はOsameらによって1986年に初めてＨＡＭ／ＴＳＰと 関連づけられた（３）。ＨＡＭ／ＴＳＰを有する患者の免疫学的特徴は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおける末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の自発的増殖である（７−９）。
【００８６】 既に証明されているように、ＨＡＭ／ＴＳＰを有する患者における循環ＣＤ８ + 細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）はＨＴＬＶ−１タンパク質産物に対して反応 し（１０）、免疫優性ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ（ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１
−１９）は十分性状決定されている（１１）。ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９
特異的ＣＴＬ前駆体の頻度の算定は、末梢血中の１／７５から１／３２０ ＣＤ
８+リンパ球の範囲の限界希釈法（１２）によって行われる。Ｔａｘ特異的ＣＴ Ｌは脳脊髄液（ＣＳＦ）でも見られ（１２、１３）、ＨＴＬＶ−１特異的クロー
ンはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者から得た脊髄病変から生成
されうる（１４）。
【００８７】 ＨＡＭ／ＴＳＰを有する患者由来の、疾病の初期段階における罹患した脊髄病
変の免疫組織化学的分析により、浸潤性ＣＤ４+およびＣＤ８+リンパ球の存在が
明らかとなり、ここではＣＤ８+細胞群が疾病の存続中、優勢であった（１５） 。さらに、活性化されたリンパ球の増加がＰＢＬおよびＣＳＦで観察された（１
６、１７）。最近、出願人は、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者において末梢ＣＤ８+Ｔリン パ球がＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αを生成することを証明できた。
考え合わせると、この証拠は、ウィルス特異的ＣＤ８+Ｔリンパ球がＨＡＭ／Ｔ ＳＰの免疫病因論において重要な役割を果たしうるという見解を支持するもので
ある。
【００８８】 これらの研究における主な制限は、生体サンプルから直接得たＨＴＬＶ−１特
異的ＣＤ８+Ｔ細胞を同定してｉｎ ｖｉｖｏでの抗原特異的Ｔ細胞の実際の数 を定量するだけでなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増幅をせずにＴリンパ球の抗原特
異的集団をさらにキャラクタライズする、ということができないことである。こ
の問題を解決するために、出願人はイムノグロブリンを骨格として使用した二価
のＭＨＣクラスＩコンストラクトを開発し（２０）、これらを使用して種々のヒ
ト免疫疾患（ＨＡＭ／ＴＳＰのような）における抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の役 割を明らかにした。
【００８９】 以下の実施例で示すのは、ペプチド負荷二価ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇキメラを使用
して末梢血および脳脊髄液から直接得たＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９−およ
びｐ１７ Ｇａｇ７７−８５−特異的ＨＬＡ−Ａ２+−制限ＣＤ８+Ｔリンパ球の
分析である。
【００９０】 実施例９ 本実施例は、ペプチド負荷二価ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇキメラを使用して、末梢血
および脳脊髄液から直接得たＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９またはｐ１７ Ｇ
ａｇ７７−８５に特異的なＨＬＡ−Ａ２+−制限ＣＤ８+Ｔリンパ球を分析するた
めに使用される物質および方法について説明する。
【００９１】 被験体および標本。ＨＡＭ／ＴＳＰ患者および無症状のＨＴＬＶ−１に感染し
た個体の臨床的特徴、並びにＨＬＡタイプについては既に報告されており（１２
）、概要を表１に示す。ＨＴＬＶ−１感染の確認を、ウェスタンブロットでＨＡ
Ｍ／ＴＳＰ患者および無症状のキャリアーの血清について行った。ＨＡＭ／ＴＳ
Ｐの診断はＷＨＯの基準に従い、神経症状およびＨＴＬＶ−１の血清検査を参考
にして行った。
【００９２】 ＰＢＬをフィコール−ハイパック遠心法によって調製し、液体窒素中で使用時
まで保存した。組織適合性タイピングをＰＢＬまたはＥＢＶ−トランスフォーム
型リンパ芽球細胞系について、ＮＩＨ臨床センターの組織タイピング研究室で行
った。正常なＨＬＡ−Ａ２未感染コントロールをＨＬＡ−Ａ２の発現について試
験したが、これはＦＡＣＳ分析により、一群のＨＬＡ−Ａ２−特異的モノクロー
ナル抗体：ＭＡ２．１、ＢＢ７．２、およびＰＡ２．１を使用して行った（Amer
ican Type Culture Collection, Rockville, MD）。
【００９３】 ペプチド。ペプチドＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、インフルエンザウィルスＡ Ｍ１５８−６６（Ｇ
ＩＬＧＦＶＦＴＬ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、およびｐ１７ Ｇａｇ７７−
８５（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の合成およびＨＰＬＣ
精製を、コロラド州立大学高分子リソース（Colorado State University Macrom
olecular Resources）で実施した。ペプチドの同一性は質量分析測定で確認した
。
【００９４】 コンストラクトのクローニングおよびタンパク質の発現。オリゴヌクレオチド
に関するＰＣＲを使用して、５’Ｍｌｕおよび３’Ｎｏｔ Ｉ部位（下線を付し
た部位）をＨＬＡ−Ａ２ ｃＤＮＡの細胞外ドメイン（α１−α３）に導入した
が、これには以下のプライマー・ペアを使用した：５’−ＧＡＴＡＣＧＣＧＴＴ
ＧＧＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）および５’
−ＣＡＧＴＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣ
Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。ＰＣＲ増幅の後、ＨＬＡ−Ａ２のａ１−ａ３領
域をシーケンシングし、Ｈ−２Ｋbを既に報告されているｐＸ／Ｉｇベクター（ ２０）に替えて指向的にクローニングした。 コンストラクトをキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇタンパク質およびヒトβ2−ミクロ グロブリンをコードするＤＮＡでエレクトロポレーションを用いてＪ５５８Ｌ細
胞に共トランスフェクトした。既に報告されているように（２０）ＥＬＩＳＡに
よって、トランスフェクト産物をキメラタンパク質の分泌についてスクリーニン
グした。ＥＬＩＳＡのプレートをＢＢ７．２（ＨＬＡ−Ａ２のペプチド負荷コン
フォメーションに特異的な抗体）またはヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体（１０μ
ｇ／ｍｌ）（Cappel, Durham, NC）で被覆した。高分泌型を選択し、ハイブリド
ーマ−ＳＦＭ（Gibco-BRL, Gaitherburg, MD）で培養した。トランスフェクトし
たＪ５５８ＬからのＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ分泌をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で確認
した。
【００９５】 キメラタンパク質を細胞上清から回収し、CentrifloR−メンブラン・コーン（
Amicon, Beverly, MA）で濃縮した。ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇに６６０倍モルの過剰 のペプチドを１０−１４日間負荷した後、ＦＡＣＳ分析を行った。３μｇのタン
パク質を使用して１ｘ１０6の細胞を染色した。
【００９６】 フローサイトメトリー分析。マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ（
Sigma, St. Louis, MO）、抗ＣＤ−４ＰＥ（Becton Dickinson, San Jose, CA）
、抗ＣＤ８−Ｔｒｉ（Caltag Laboratories, Burlingame, CA）、および抗ＨＬ Ａ−ＤＲ（Pharmingen, San Diego, CA）を使用してリンパ球の細胞表面分子を 検出した。ＰＫ１．３６−ＦＩＴＣを抗ＨＬＡ ＤＲ−ＦＩＴＣのイソ型一致コ
ントロールとして使用した。細胞表面に結合したＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇを、ヤギ抗
マウスＩｇＧ１−ＰＥまたはヤギ抗マウスＩｇＧ１−Ｔｒｉ（Caltag）を使用し
て検出した。モノクローナル抗ＴＮＦ−α−ＦＩＴＣ、抗ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ
、またはイソ型一致ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体（Pharmingen）を使用して細胞内サ
イトカインを染色した。ＰＢＬ（１ｘ１０6）をペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉ ｇと共に氷上でインキュベートし、次いでＰＥまたはＴｒｉ−結合ヤギ抗マウス
ＩｇＧ１−ＰＥと共にインキュベートした。
【００９７】 細胞内染色は製造者の取扱説明書をわずかに変更して（２１）実施し、３７℃
で４時間のインキュベーション後、１０μｇ／ｍｌブレフェルジン（brefeldin ）Ａ（Sigma）の存在下で１０時間インキュベートした。３色蛍光定量分析をＦ ＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）で実施した。リンパ球を前方および側方散乱
光でゲーティングした。１ｘ１０5（３色分析では２ｘ１０5）個のゲーティング
された事象ををＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を使用し
て分析した。全てのＨＬＡ−Ａ２陽性患者由来のＰＢＬを少なくとも２回同様の
結果がでるまで染色した。
【００９８】 実施例１０ 本実施例は、ペプチド負荷ＨＬＡ Ａ２／ＩｇがＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬに特
異的に結合することを説明する。
【００９９】 出願人は二価のＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ分子を操作し、これにはイムノグロブリン
を骨格として使用したが、これに種々のペプチドを負荷することができる。ペプ
チド負荷ＨＬＡ−Ａ２／ＩｇはそのＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬクローンとの相互作
用に特異的であることがフローサイトメトリーで分析された。従ってＴａｘ−Ａ
２／ＩｇはＨＬＡ−Ａ２制限ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９特異的ＣＴＬクロ
ーン、Ａ６と特異的に反応した（２２）。ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９負荷
ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ（Ｔａｘ−Ａ２／Ｉｇ）で染色したＡ６細胞の平均チャンネ
ル蛍光（ＭＣＦ）は４２６であったが、一方コントロールＧａｇ−Ａ２／Ｉｇ複
合体で染色したＡ６細胞のＭＣＦはわずか１３であり、キメラタンパク質を使用
しないで、あるいは未負荷ＨＬＡ−Ａ２／ＩｇまたはＭ１負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉ
ｇを使用して染色したコントロールとほとんど同程度であった（図１１Ａ）。相
補性試験で、Ｇａｇ−Ａ２／ＩｇはＨＩＶ ｐ１７ Ｇａｇ ７７−８５特異的
クローンＳＬ０９を特異的に染色し（図１１Ｂ）、他方、Ｔａｘ−Ａ２／Ｉｇで
の染色は未負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ、Ｍ１負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ、またはＨＬ
Ａ−Ａ２／Ｉｇなしと実質的に同じであった。
【０１００】 実施例１１ 本実施例は、ＨＡＭ／ＴＳＰおよびＨＩＶ感染を有する患者の末梢血における
抗原特異的Ｔリンパ球の可視化について説明する。
【０１０１】 ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９特異的ＣＴＬ活性が、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者由
来のＰＢＬ中で直接観察されている（１０）。ＨＬＡ−Ａ２+患者において、Ｈ ＴＬＶ−１特異的反応性は明らかにＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９エピトープ
に対するものであった（１１）。既に推定されている、限界希釈法（ＬＤＡ）を
使用したＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９特異的ＣＴＬの前駆体頻度は１／７５
から１／３２０ＣＤ８+Ｔ細胞の範囲であった。
【０１０２】 ＨＡＭ／ＴＳＰ患者の末梢血においてＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９特異的
ＣＤ８+集団を直接定量するために、Ｔａｘ−Ａ２／Ｉｇおよび抗ＣＤ８+を使用
して細胞の２次元フローサイトメトリー分析を実施した（図１２）。ＨＡＭ／Ｔ
ＳＰ患者由来のＰＢＬは有意に多数のＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９特異的Ｃ
Ｄ８+Ｔリンパ球を示した。ある患者では、Ｔａｘ１１−１９特異的細胞の頻度 は１３．８％という高さであった（図１２および１３と表１）。Ｔａｘ−Ａ２／
Ｉｇ特異的細胞のパーセンテージは０．６４および１３．８７％のＣＤ８+Ｔ細 胞の間の範囲であり、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者６人中４人で＞２％の値であった（図
１２）。ｐ１７ Ｇａｇ７７−８５に特異的なＣＤ８+Ｔ細胞も検出することが できた（図１２、右のパネル）。
【０１０３】 ６人のＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＡＭ／ＴＳＰ患者のうち１人では、Ｔａｘ−Ａ２／
Ｉｇ反応性細胞は検出されなかった。しかしながら、この同じ患者のＰＢＬも、
Ｔａｘタンパク質を発現する自己由来のＥＢＶで形質転換したＢ細胞を溶解しな
かった（データは未発表）。更に、いずれの患者のサンプル中にも、Ｔａｘ−Ａ
２／ＩｇでＴａｘ特異的Ｔ細胞を検出できたが、これはＴａｘを発現するＨＬＡ
−Ａ２+標的細胞を分解するものである（表１）。
【０１０４】 実施例１２ 本実施例は、２人のＨＬＡ−Ａ２+ ＨＴＬＶ−１キャリアー由来の末梢血の 分析について説明する。
【０１０５】 ＨＬＡ−Ａ２+ ＨＴＬＶ−１キャリアーでＨＡＭ／ＴＳＰを有しない２人の 末梢血も分析した（図１３および表１）。２人のＨＴＬＶ−１キャリアーのうち
１人は検出可能なＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９特異的Ｔ細胞が見られず、も
う１人は低いが再現的に検出可能な数のＴａｘ−Ａ２／Ｉｇで染色されたＣＤ８ + Ｔ細胞を含有した（０．３３％）。
【０１０６】 これらの試薬での末梢血サンプルの染色の特異性およびその疾病との関係を確
認するために、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子を保有しないＨＡＭ／ＴＳＰ患者（表１
および図１３）、未感染の健常なＨＬＡ−Ａ２+ドナー（表１および図１３）、 およびＨＩＶ−１に感染したＨＬＡ−Ａ２+個体（図１２）から得たＰＢＬを分 析した。これらのサンプル全てから得たＣＤ８+Ｔ細胞の０．１％未満がＴａｘ −Ａ２／Ｉｇでの染色に対して陽性であった。しかしながら、ＨＩＶに感染した
個体由来のＣＤ８+Ｔリンパ球の有意数（３．０３％）がＧａｇ−Ａ２／Ｉｇで 染色された。
【０１０７】 考え合わせると、これらの結果は、多数のＴａｘ−Ａ２／Ｉｇ染色ＣＤ８+細 胞の存在はＨＡＭ／ＴＳＰを有するＨＴＬＶ−１+ＨＬＡ−Ａ２+個体に特異的で
あることを示している。
【０１０８】 実施例１３ 本実施例は、ＨＡＭ／ＴＳＰを有する患者の脳脊髄液中の抗原特異的Ｔリンパ
球の可視化について説明する。 ＨＴＬＶ−１特異的ＣＴＬがこの脱髄性疾患の病因に重要であるという確証を得
るために、ＨＡＭ／ＴＳＰを有する患者（Ｈ１）の脳脊髄液由来のリンパ球を分
析し、これらを同じ日に採取したこの患者の末梢血中のＴ細胞と比較した。Ｔａ
ｘ−Ａ２／Ｉｇ特異的ＣＤ８+細胞は、脳脊髄液中のＣＤ８+細胞集団の２３．７
％であった。対照的に、末梢血中では９．４％のＴａｘ−Ａ２／Ｉｇ特異的ＣＤ
８+Ｔ細胞が検出された（図１４Ａ）。興味深いことに、同数のＣＤ４+Ｔ細胞が
末梢血および脳脊髄液で観察されたが（ＰＢＬで４４％、ＣＳＦで４８％）、Ｃ
ＳＦ中の総ＣＤ８+Ｔ細胞（４２％）は末梢血（２９％）に比較して多かった（ 図１４Ｂ）。
【０１０９】 実施例１４ 本実施例は、ＨＡＭ／ＴＳＰを有する患者においてＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１
−１９特異的Ｔ細胞が活性化されることを説明する。
【０１１０】 ＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ１１−１９特異的Ｔリンパ球を染色する能力により、そ
の活性化状態を分析する機会が得られる。ＨＴＬＶ−１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞が 実際にＨＡＭ／ＴＳＰの免疫病因に介在しているとすれば、その有意な割合が活
性化されると予期される。活性化されたヒトＴ細胞はより高いレベルのＭＨＣク
ラスＩＩ分子を発現するので、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来のＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ
１１−１９特異的Ｔ細胞を、マルチカラー・フローサイトメトリーによってＨＬ
Ａ−ＤＲ発現について更に性状決定した。
【０１１１】 ３人のＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来のＴａｘ−Ａ２／Ｉｇ反応性ＣＤ８+Ｔ細胞は ＤＲの発現が有意に増加していた（図１５）。３人の患者のうち２人では、ＤＲ
発現のレベルはコントロールのＰＨＡで刺激したＰＢＬで観察されたのと実質的
に同一であった（図１５Ａおよび１５Ｂの患者由来のＴａｘ−Ａ２／Ｉｇ反応性
特異的ＣＤ８+Ｔ細胞と、図１５Ｅの活性化ヒトＰＢＬを比較されたい）。同様 の結果がＩＬ−２レセプター発現で得られた（データは示していない）。
【０１１２】 特に興味深いことに、１人の患者（Ｈ６）はＤＲ+、Ｔａｘ特異的ＣＤ８+細胞
集団が有意に低かった（図１５Ｃ）。この個体はＨＡＭ／ＴＳＰ患者の配偶者で
あり、無症状のキャリアーであると当初は考えられていたが、これは神経症状が
報告されていなかったためである。しかしながら、身体検査では下肢における反
射亢進および足底伸筋反応が観察され、皮質脊髄路の病変を示していた。
【０１１３】 実施例１５ 本実施例は、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来のＴａｘ特異的ＣＤ８+細胞によるサイ トカインの発現について説明する。
【０１１４】 炎症性サイトカインは、多くの自己免疫モデルにおいてＣＮＳの免疫病理学の
重要な媒介物質であると考えられている。いくつかの前炎症性サイトカインのレ
ベルの上昇が、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者の血清または脳脊髄液中に検出されている（
１６、１７）。従って、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来のＴａｘ特異的ＣＤ８+細胞を 、関連する細胞内サイトカインの存在について分析するのは特に興味深いことで
ある。
【０１１５】 最近、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来のバルクのＣＤ８+Ｔ細胞がサイトカイン（例 えばＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−２。しかしＩＬ−４はそうではない
）を有意に発現することが見出された（１８）。患者Ｈ１（図１６）、Ｈ５（デ
ータは示していない）、およびＨ６（図１６）由来のＴａｘ特異的ＣＤ８+Ｔ細 胞は、細胞内ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ発現の異なるパターンを示した。ＨＡ
Ｍ／ＴＳＰ患者Ｈ１およびＨ５は細胞内ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを伴うＴａ
ｘ−Ａ２／Ｉｇ特異的ＣＤ８+細胞を高い割合で示し（おおよそ３０％）、患者 Ｈ６はＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを発現するＴａｘ特異的ＣＤ８+細胞の割合 が非常に低かった（２％）。
【０１１６】 これらの結果は、ＨＬＡ−ＤＲ分析と共に、抗原特異的Ｔ細胞の拡大とその活
性化状態の間には関係がないことを示している。これらは更に、マルチパラメー
ター・フローサイトメトリーを使用して抗原特異的Ｔ細胞集団の活性化状態を分
析する能力により、Ｔ細胞の活性化状態と疾病の病因の間の関係への更なる洞察
が得られることを示す。
【０１１７】 実施例１６ 本実施例は、Ｔａｘ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞がＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来の末梢血 中に残存することについて説明する。
【０１１８】 自己免疫疾患（ＨＡＭ／ＴＳＰのような）の病因を理解するために重要な観点
は、抗原特異的Ｔ細胞の応答の動態を理解することである。そのため、ＨＡＭ／
ＴＳＰ患者（Ｈ１）から１９８９年から１９９８年の間に連続的にＰＢＬを採取
し、Ｔａｘ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の数を比較した。この患者は１９７９年に最初 に診断された。
【０１１９】 興味深いことに、診断から１０年後でも、この患者は約１０％のＴａｘ特異的
ＣＤ８+Ｔ細胞を有していた。このパーセンテージは続く８年間にわたって、有 意な変化を見せなかった（図１７）。
【０１２０】 従って、この患者では、病原性Ｔａｘ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞は、活動性疾患の １９年後でも高レベルを保持する。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】1 キャリアーは、ＨＴＬＶ−１に感染した、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者の配偶者から同 定した。2 ＣＴＬ活性は末梢血からあらかじめ測定したが、これには、標的（１０、１２ ）としてＴａｘ遺伝子を発現するワクシニアに感染させたエプステイン・バー・
ウィルスを不滅化したＢ細胞を使用して行ったが、データは未確立である。3 ＣＤ８+発現およびＨＴＬＶ−１ Ｔａｘ−Ａ２／Ｉｇについて陽性に染色され
た細胞のパーセント4 ＣＤ８+発現、および無関係なＭ１ペプチドを負荷したＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇにつ
いて陽性に染色された細胞のパーセント5 Ｔａｘ−Ａ２／Ｉｇについて陽性に染色されたＣＤ８+細胞のパーセント（ＭＬ
−ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇを使用したバックグラウンド染色を控除した）。全てのＨ
ＴＬＶ−１感染個体は少なくとも２回染色した。6 １９８９年から１９９８年の間のサンプルを試験した（図１８参照）。 参考文献 以下の文献を本明細書中に援用する。 1. Uchiyama, T., Yodoi, J., Sagawa, K., Takatsuki, K. & Uchino, H. (1
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【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａは、免疫グロブリンＨ鎖の末端においてインタクトな配座形式で形成さ
れたキメラＭＨＣ／Ｉｇ分子の概略図である。図１Ｂは、ＩｇＧ１−Ｈ鎖遺伝子
の可変領域に遺伝子レベルで連結したＨＬＡ−Ａ２クラスＩ−ＭＨＣ分子の細胞
外ドメイン（α１−α３）のコード領域を含有するｐＡ２／Ｉｇプラスミドの概
略図である。
【図２】 図２は、ペプチド負荷Ｌd／Ｉｇ分子がそのコグネイトリガンドを発現するＴ 細胞と特異的に結合することを示す。Ｌd／Ｉｇ分子は一晩かけてペプチド（１ ００μＭ）に負荷した。使用ペプチドは、２Ｃ ＣＴＬ反応ペプチドであるｐ２
Ｃａ、マウスＣＴ２６細胞に特異的な腫瘍ペプチドであるＡＨ１、及びβ−ガラ
クトシダーゼ由来のもう１つのＬd−制限モデル腫瘍抗原であるβ−ｇａｌを包 含した。一晩インキュベーションした後、ペプチド／Ｌd／Ｉｇ複合体を使用し て抗原特異的Ｔ細胞２Ｃ及び抗ＣＴ２６ＣＴＬを染色した。リンパ球−Ｍ分離法
を使用して生存し得るＴ細胞を精製し、室温で１時間、２０μｇ／ｍｌのペプチ
ド／Ｌd／Ｉｇ複合体と反応させた。次いで細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥで 染色し、フローサイトメトリーで分析した。代表的なヒストグラムを示す。図２
Ａ：２Ｃ ＣＴＬはp2CaＬd／Ｉｇ複合体に反応したが、AH1Ｌd／Ｉｇ複合体と は反応しなかった。図２Ｂ：ＣＴ２６特異的Ｔ細胞はAH1Ｌd／Ｉｇとは反応した
が、p2CaＬd／Ｉｇ又はβ-galＬd／Ｉｇ複合体とは反応しなかった。
【図３】 図３は、Ｋｂ／ＩｇＧ負荷方法の概略図である。
【図４】 図４は、ペプチドの脱離及び再負荷が、Ｋb／Ｉｇ分子の有効なペプチド負荷 を増強することを示す。記載のようにＫb／Ｉｇ分子をペプチド（１００μＭ） で「受動的」又は「能動的」に負荷した。使用ペプチドは、２Ｃ ＣＴＬ反応性
のペプチドであるＳＩＹを包含した。対照ペプチドはもう１つのＫb結合ペプチ ド、ＶＳＶを包含した。様々な希釈溶液のpepＭＨＣ／Ｉｇ複合体を使用して２ Ｃ特異的なＴ細胞を染色した。リンパ球−Ｍ分離法を使用して生存し得るＴ細胞
を精製し、４℃で１時間、２０μｇ／ｍｌのペプチド／Ｌd／Ｉｇ複合体と反応 させた。次いで細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥで染色し、フローサイトメトリ
ーで分析した。代表的なヒストグラムを示す。
【図５】 図５は、ペプチド負荷ＭＨＣ／Ｉｇ分子が高い親和性でＴ細胞と結合すること
を示す。記載のように、Ｌd／Ｉｇ又はＫb／Ｉｇ分子をペプチド（１００μＭ）
で負荷した。使用ペプチドは、２Ｃ ＣＴＬ反応性のＨ−２Ｌd−制限ペプチド であるＱＬ９、及びｐ２ＣＡ、及び２Ｃ ＣＴＬ反応性のＨ−２Ｋb−制限ペプ チドであるＳＩＹを包含した。対照ペプチドはもう１つのＬd結合ペプチド、Ｍ ＣＭＶ及びＫb結合ペプチド、ＶＳＶを包含した。様々な濃度のペプチド／ＭＨ Ｃ／Ｉｇ複合体を使用して、記載されたようにして、２Ｃ特異的Ｔ細胞を染色し
た。代表的なヒストグラムを分析した。データは平均チャネル蛍光値である。
【図６】 図６は、ペプチド負荷ＭＨＣ／Ｉｇ分子のＳＥＣ分析である。約５０μｇのSI Y Ｋb／Ｉｇ又はQL9Ｌd／Ｉｇ分子をサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕ
ｐｅｒｄｅｘ ２００、ファルマシアバイオテク）にかけた。ＢｉｏＬｏｇｉｃ
クロマトグラフィーシステム（バイオラド、ヘラクレス、ＣＡ）にて、ＰＢＳを
流動緩衝液（０．４ｍｌ／分）を用いて、０．４ｍｌごとに分画を回収した。２
つのキメラタンパク質についてＯ．Ｄ．２８０をプロットする。
【図７】 図７は、２Ｃ ＣＴＬの染色がSIYＫb／Ｉｇのモノマー分画によることを示す
。記載のように、Ｋb／Ｉｇ分子を最終濃度１００μＭのＳＩＹペプチドで負荷 した。リンパ球−Ｍ分離法を使用して生存し得るＴ細胞を精製し、上記のように
、SIYＫb／Ｉｇ（５００μｇ）の調製ＳＥＣ分析によって回収された各分画の１
／５又は１／５０希釈液のいずれかと反応させた。ＳＥＣ分析から回収された各
分画とともに細胞を、４℃で１時間、インキュベートした。次いで細胞を洗浄し
、ヤギ抗マウスＰＥで染色し、フローサイトメトリーで分析した。示したデータ
は、代表的なサンプルから得られた平均チャネル蛍光値である。この実験は少な
くとも２回繰り返した。代表的なデータを示す。
【図８】 図８は、ＣＴ２６−ＧＭでワクチン接種して１４日後の脾臓からＡＨ１−特異
的Ｔ細胞が検出されたことを示す。
【図９】 図９は、２Ｃ ＣＴＬによる標的細胞のペプチド依存的な溶解を、pepＭＨＣ ／Ｉｇ複合体が特異的に阻害することを示す。クロミウム標識Ｔ２Ｋhm3標的細 胞をｄＥＶ８ペプチド（１０ｎＭ）と２５℃で２．５時間プレインキュベートし
た。同時に、２Ｃ Ｔ細胞（３ｘ１０4／穴）を、示されたリガンドと様々な濃 度で、Ｖ底穴において１．５時間インキュベートした。インキュベーションの後
、未洗浄の標的（３ｘ１０3／穴）をエフェクター／リガンドに加え、次いでプ レートを３７℃で４時間インキュベートしてから採取し、カウントした。標準特
異溶解率を定量した。
【図１０】 図１０は、同種標的細胞による２Ｃ ＣＴＬの増殖を、pepＭＨＣ／Ｉｇ複合 体が特異的に阻害することを示す。２Ｃ Ｔ細胞を、示されたリガンドと様々な
濃度のSIYＫb／Ｉｇとともに、３７℃で２．５時間インキュベートした。照射（
３０００ｒａｄ）され、新たに単離されたＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（Ｈ−２Ｌdを発 現している）を２．５ｘ１０5個／穴で応答細胞のリガンドへ加えた。６０時間 インキュベーションした後、細胞を［3Ｈ］チミジンでパルスし、さらに１８時 間インキュベートしてから採取し、カウントした。
【図１１】 図１１は、ペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２／ＩｇがＨＴＬＶ−１・Ｔａｘ１１−１
９又はＨＩＶｐ１７Ｇａｇ７７−８５特異的Ｔ細胞クローンを特異的に染色する
ことを示す。図１１Ａ：免疫優性のＨＬＡ−Ａ２制限Ｔａｘエピトープ、Ｔａｘ
１１−１９に特異的なＡ６細胞（２２）を使用して、ＦＡＣＳ分析を実施した。
ＨＴＬＶ−１・Ｔａｘ１１−１９負荷ＨＬＡ−Ａ２／ＩｇＧは細胞表面で安定的
に結合し、ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇ（太線）を使用して検出された。ＨＬＡ−
Ａ２／Ｉｇなし、非負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ及びＭ１負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ（
重なっている点線及び細線）と同様に、Ｇａｇ−Ａ２／Ｉｇを無関係な対照（薄
線）として使用した。図１１Ｂ：ＨＬＡ−Ａ２制限ＨＩＶｐ１７Ｇａｇ７７−８
５エピトープに特異的なＴ細胞を染色し、ペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇのペ
プチド特異性を示した。Ｇａｇ７７−８５負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇは細胞表面で
安定的に結合し、ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇ（太線）を使用して検出された。ペ
プチド負荷なし、Ｍ１負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ及びＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇなしと同
様に、ＨＴＬＶ−１・Ｔａｘ１１−１９負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇを無関係な対照
として使用し、ほとんど同様に染色された（重なっている薄線、点線及び細線）
。
【図１２】 図１２は、ペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇが、末梢血の抗原特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞を視覚化するために使用し得ることを示す。Ｔａｘ−Ａ２／Ｉｇ又はＧａ
ｇ−Ａ２／Ｉｇ及びマウス抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣを使用して、２色フローサイ
トメトリーを実施した。ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体を使
用してペプチド−Ａ２／Ｉｇ複合体を検出した。ＨＡＭ／ＴＳＰ患者（Ｈ１ドナ
ー、表１参照）からの凍結ＰＢＬを試験した。抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ及びＴａ
ｘ−Ａ２／Ｉｇは、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来ＰＢＬの４．０３％をポジティブに
染色した。これは全ＣＤ８+細胞の１０．４９％を表す。Ｇａｇ−Ａ２／Ｉｇを 使用しても有意なシグナルは見られなかった（＜０．１％）。ＨＬＡ−Ａ２+Ｈ ＩＶ−１感染者由来のＰＢＬは、３％のＧａｇ−Ａ２／ＩｇポジティブＣＤ８+ Ｔリンパ球を示した。
【図１３】 図１３は、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者がそのＰＢＬに多数のＨＴＬＶ−１・Ｔａｘ１
１−１９特異的ＣＤ８+細胞を担うことを示す。ＨＬＡ−Ａ２+ＨＡＭ／ＴＳＰ患
者、ＨＴＬＶ−１感染ＨＬＡ−Ａ２+キャリアー、ＨＬＡ−Ａ２-ＨＡＭ／ＴＳＰ
患者及び健常人からのＨＴＬＶ−１・Ｔａｘ１１−１９特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の 比率が示されている。ＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来ＣＤ８+細胞の０．６４〜１０． ２５％がＨＴＬＶ−１・Ｔａｘ１１−１９ペプチドに特異的である。分析したＨ
ＴＬＶ−１感染ドナーの１人が０．３３％のＴａｘ特異的ＣＤ８+細胞を有して いたのに対し、非ＨＬＡ−Ａ２-ＨＡＭ／ＴＳＰドナー又はＨＬＡ−Ａ２+健常人
ではＴａｘ特異的ＣＤ８+細胞の有意な数は認められなかった。陽性サンプルに ついては少なくとも２回染色した。
【図１４】 図１４は、ＨＴＬＶ−１・Ｔａｘ１１−１９特異的ＣＤ８+Ｔ細胞が脳脊髄液 に蓄積することを示す。ＨＡＭ／ＴＳＰ患者（Ｈ１）から脳脊髄液及び末梢血を
得て、同日、Ｔａｘ−Ａ２／Ｉｇを使用して分析した。脳脊髄液から９ｘ１０4 個の細胞を採取し、図１３に記載のように、マウス抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣとと
もにＴａｘ／Ａ２−Ｉｇ及びＧａｇ／Ａ２−Ｉｇを使用して染色した。新鮮に得
て、フィコールで精製したＰＢＬを併行して分析した。図１４Ａ：脳脊髄液のＣ
Ｄ８+Ｔ細胞のうち、２３．７％がＴａｘ特異的であって、末梢血由来のＣＤ８+ Ｔ細胞のうち、９．４％だけがＴａｘ特異的であった。Ｇａｇ−Ａ２／Ｉｇを使
用しても有意なシグナルは見られなかった（＜０．１％）。図１４Ｂ：ＣＤ４／
ＣＤ８分析は、ＣＤ４／ＣＤ８の比がＣＳＦで１．１、ＰＢＬで１．５であるこ
とを示したが、これはＣＳＦでＣＤ８+Ｔ細胞の数がより大きいためである。
【図１５】 図１５は、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来のＴａｘ特異的ＣＤ８+細胞が細胞表面活 性化マーカーであるＨＬＡ−ＤＲを発現することを示す。３色フローサイトメト
リーにより、マウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ（実線）及びアイソタイプ適
合非関連マウスＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ対照（点線）を使用して、Ｔａｘ特異的Ｃ
Ｄ８+細胞を制御してＨＬＡ−ＤＲの発現について分析した。図１５Ａ及び１５ Ｂ：２人の異なる症候性ＨＡＭ／ＴＳＰ患者では、ＨＬＡ−ＤＲ発現について、
Ｔａｘ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の４１〜５９％がポジティブに染色された。図１５ Ｃ：対照的に、この疾患の症状がごく軽い患者Ｈ６由来のＴａｘ特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞は２１％しかポジティブ染色しなかった。図１５Ｄは、刺激されない染色
対照を示す。図１５Ｅは、健常ドナー由来のＰＨＡ刺激ＣＤ８+ＰＢＬからの対 照染色を示す。
【図１６】 図１６は、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者由来のＴａｘ特異的ＣＤ８+細胞が細胞内ＩＦ Ｎ−γ及びＴＮＦ−αを発現することを示す。３色フローサイトメトリーを使用
して、Ｔａｘ特異的ＣＤ８+細胞を制御して細胞内サイトカインの発現について 分析した。図１６Ａ：マウス抗ヒトＩＦＮ−γ−ＰＥ、マウス抗ヒトＴＮＦ−α
−ＰＥ及びアイソタイプ適合非関連マウスＩｇＧ１−ＰＥ対照を使用すると、Ｈ
１由来のＴａｘ特異的ＣＤ８+細胞の２８％が細胞内ＩＦＮ−γを発現し、２９ ％がＴＮＦ−αを発現した。図１６Ｂ：Ｈ６由来のＴａｘ特異的ＣＤ８+細胞は ８％しか細胞内ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを発現しなかった。
【図１７】 図１７は、高レベルのＨＴＬＶ−１・Ｔａｘ特異的ＣＤ８+Ｔリンパ球がＨＡ Ｍ／ＴＳＰで存続することを示す。１９８９〜１９９８年に患者Ｈ１から得たＰ
ＢＬサンプルを、Ｔａｘ特異的ＣＤ８+細胞について分析した。凍結ＰＢＬサン プルにおいて、７．２４〜１３．８７％の特異的ＣＤ８+Ｔ細胞が検出された。
【図１８】 図１８は、Ｔａｘ１１−１９ペプチドと複合したＨＬＡ−Ａ２の構造を示す。
ＨＬＡ−Ａ２のＨ鎖（緑）、β２Ｍ（紫）及びｔａｘ１１−１９抗原ペプチド（
赤）の３次元構造の２図面を示す。ｔａｘ１１−１９のカルボニル末端９位及び
β２Ｍポリペプチドのアミノ末端１位を隙間を満たす図式で表し、残りはリボン
状の図式として示す。隙間の満ちたアミノ酸残基の酸素群を赤丸で表し、窒素群
は水色で表される。β２Ｍ分子のアミノ末端とペプチドの９位との間隔は２０．
４９オングストロームであることがわかった。ペプチドとβ２Ｍ分子の両端間の
領域のオープンアクセスは、複合体側面図（図１８の左面）にあるカルボニル末
端のｔａｘペプチド、９位の修飾に従うクラスＩ複合体のペプチドで最もよく見
える。ペプチドをＭＨＣ分子につなげることは、結合したペプチド−β２Ｍ複合
体では供与されないカルボキシル末端の酸素への結合を介して部分的に達成され
る。この親和性の低下は、β２Ｍとの安定化によって償われる可能性がある。
【図１９】 図１９は、β２Ｍへつなぐペプチドを産生するために使用されるオリゴ設計の
概略図である。
【図２０】 図２０は、フローサイトメトリーで分析した、ペプチドでつないだｔａｘ−β
２Ｍ・ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ複合体のＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬクローンとの特異的
な相互作用を示す。ペプチドでつないだｔａｘ−β２Ｍ・ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ複
合体で染色したＡ６細胞の平均チャネル蛍光値（ＭＣＦ）が約４０００であった
のに対し、キメラタンパク質を使用せずに染色されたＡ６細胞のＭＣＦは１０に
すぎず、ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇを負荷しない対照Ｇａｇ−Ａ２／Ｉｇ複合体の染色
対照とほとんど同一であった。ｔａｘ−β２Ｍでの染色レベルは抗Ｖβ１３．１
特異的ｍＡｂで得たレベルと同等であり、ｔａｘ−β２Ｍ・ＨＬＡ−Ａ２／Ｉｇ
を使用して関連部位がすべて飽和されたことを示す。従って、β２Ｍにペプチド
をつなぐことは、ＭＨＣ／Ｉｇ分子のコンテクストにおいてペプチドを提示する
ための効率的な方法である。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月８日（２０００．１２．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 47/48 45/00 Ａ６１Ｐ 31/00 47/48 35/00 Ａ６１Ｐ 31/00 37/02 35/00 43/00 １１１ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/11 43/00 １１１ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/11 19/00 14/705 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 19/00 (Ａ６１Ｋ 39/395 Ｇ０１Ｎ 33/53 39:21） //(Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 39:21） Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 パードール，ドルー アメリカ合衆国メリーランド州21205，ボ ルティモア，イースト・モニュメント・ス トリート 2024，スイート ２−100 (72)発明者 オーヘリン，ショーン・エム アメリカ合衆国メリーランド州21205，ボ ルティモア，イースト・モニュメント・ス トリート 2024，スイート ２−100 (72)発明者 スランスキー，ジル アメリカ合衆国メリーランド州21205，ボ ルティモア，イースト・モニュメント・ス トリート 2024，スイート ２−100 (72)発明者 グレテン，ティム アメリカ合衆国メリーランド州21205，ボ ルティモア，イースト・モニュメント・ス トリート 2024，スイート ２−100

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質（
    ここで、キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタン
    パク質を含んでなる分子複合体を形成し、抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合し
    、分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合している）を含んで
    なる組成物。
  2. 【請求項２】 組成物内の各ＭＨＣ分子が同一抗原ペプチドに結合している
    、請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 抗原ペプチドが受動的に結合している、請求項１に記載の組
    成物。
  4. 【請求項４】 抗原ペプチドが能動的に結合している、請求項１に記載の組
    成物。
  5. 【請求項５】 抗原ペプチドがＭＨＣ分子に共有結合している、請求項１に
    記載の組成物。
  6. 【請求項６】 抗原ペプチドがβ２ミクログロブリンのアミノ末端に結合し
    ている、請求項１に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ末端に結合し
    ている、請求項１に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩＩβ鎖のアミノ末端にペプチ
    ドつなぎによって結合している、請求項７に記載の組成物。
  9. 【請求項９】 分子複合体が前記キメラタンパク質の２つを含む、請求項１
    に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 分子複合体が毒素に結合している、請求項１に記載の組成
    物。
  11. 【請求項１１】 ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である、請求項１に記載
    の組成物。
  12. 【請求項１２】 ＭＨＣクラス１分子がＨＬＡクラスＩ分子である、請求項
    １１に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ２分子である、請求項１２に記載
    の組成物。
  14. 【請求項１４】 抗原ペプチドが、ＨＴＬＶ−Ｔａｘ１１−１９ペプチド、
    ｐ１７Ｇａｇ７７−８５ペプチド及びインフルエンザウイルスＡＭ１５８−６６
    ペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 免疫グロブリンＨ鎖及びＭＨＣ分子（ここで、免疫グロブ
    リンはＩｇＧ−１ではなく、免疫グロブリンＨ鎖はＭＨＣ分子のＣ末端である）
    を含んでなるキメラタンパク質をコードするベクター。
  16. 【請求項１６】 ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である、請求項１５に記
    載のベクター。
  17. 【請求項１７】 ＭＨＣクラス１分子がＨＬＡクラスＩ分子である、請求項
    １６に記載のベクター。
  18. 【請求項１８】 ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ２分子である、請求項１
    ７に記載の組成物。
  19. 【請求項１９】 ＭＨＣ分子及びＩｇ鎖を含むキメラタンパク質（ここで、
    キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタンパク質を
    含んでなる分子複合体を形成し、免疫グロブリン鎖はＩｇＧのＨ鎖ではない）を
    含んでなる組成物。
  20. 【請求項２０】 キメラタンパク質が毒素に結合している、請求項１９に記
    載の組成物。
  21. 【請求項２１】 キメラタンパク質がその表面に結合している細胞（ここで
    、キメラタンパク質はＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含み、キメラタンパク
    質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタンパク質を含んでなる分子
    複合体を形成し、抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合し、分子複合体内部の各Ｍ
    ＨＣ分子が同一抗原ペプチドに結合している）を含んでなる組成物。
  22. 【請求項２２】 細胞が樹状細胞である、請求項２１に記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 前記キメラタンパク質の集団が細胞に結合し、前記キメラ
    タンパク質の集団内の各ＭＨＣ分子が同一抗原ペプチドに結合している、請求項
    ２１に記載の組成物。
  24. 【請求項２４】 ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質
    （ここで、キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタ
    ンパク質を含んでなる分子複合体を形成し、抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合
    し、分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合し、抗原ペプチド
    はアレルギーに罹患している患者がアレルギー反応を示す抗原である）を、前記
    患者のアレルギーに関連したＴ細胞の応答を抑制するに十分な用量で前記患者に
    投与すること、を含んでなる前記患者を処置する方法。
  25. 【請求項２５】 ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質
    （ここで、キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタ
    ンパク質を含んでなる分子複合体を形成し、抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合
    し、分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合し、抗原ペプチド
    は同種抗原である）を、移植臓器に対する免疫応答を抑制するに十分な用量で臓
    器移植を受けたか又は受ける予定である患者に投与すること、を含んでなる前記
    患者を処置する方法。
  26. 【請求項２６】 ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質
    （ここで、キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタ
    ンパク質を含んでなる分子複合体を形成し、抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合
    し、分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合し、抗原ペプチド
    は自己免疫疾患に罹患している患者が自己免疫応答を発現するものである）を、
    自己免疫疾患に関連した免疫応答を抑制するに十分な用量で前記患者に投与する
    こと、を含んでなる前記患者を処置する方法。
  27. 【請求項２７】 自己免疫疾患がＨＴＬＶ−１関連性ミエロパチー／熱帯性
    痙性対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ）である、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である、請求項２６に記
    載の方法。
  29. 【請求項２９】 ＭＨＣクラス１分子がＨＬＡクラスＩ分子である、請求項
    ２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ２分子である、請求項２
    ９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 抗原ペプチドがＨＴＬＶ−１Ｔａｘ１１−１９である、請
    求項２７に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質
    （ここで、キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタ
    ンパク質を含んでなる分子複合体を形成し、抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合
    し、分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合し、抗原ペプチド
    は腫瘍関連ペプチドである）を、腫瘍に対する免疫応答を誘導又は増強するのに
    十分な用量で腫瘍を有する患者に投与すること、を含んでなる前記患者を処置す
    る方法。
  33. 【請求項３３】 ＭＨＣ分子及び免疫グロブリン鎖を含むキメラタンパク質
    （ここで、キメラタンパク質は会合して複合体あたり少なくとも２つのキメラタ
    ンパク質を含んでなる分子複合体を形成し、抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合
    し、分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一抗原ペプチドに結合し、抗原ペプチド
    は感染病原体のペプチドである）を、感染症に対する免疫応答を誘導又は増強す
    るのに十分な用量で感染病原体によって引き起こされた感染症を有する患者に投
    与すること、を含んでなる前記患者を処置する方法。
  34. 【請求項３４】 感染症がＨＩＶ感染である、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 抗原ペプチドがｐ１７Ｇａｇ７７−８５である、請求項３
    ４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である、請求項３３に記
    載の方法。
  37. 【請求項３７】 ＭＨＣクラス１分子がＨＬＡクラスＩ分子である、請求項
    ３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ２分子である、請求項３
    ７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 感染症がインフルエンザ感染症である、請求項３３に記載
    の方法。
  40. 【請求項４０】 抗原ペプチドがインフルエンザウイルスＡＭ１５８−６６
    ペプチドである、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 抗原特異的Ｔ細胞を含むサンプルを、ＭＨＣ分子及び免疫
    グロブリン鎖を含むキメラタンパク質（ここで、キメラタンパク質は会合して複
    合体あたり少なくとも２つのキメラタンパク質を含んでなる分子複合体を形成し
    、抗原ペプチドは各ＭＨＣ分子に結合し、分子複合体内部の各ＭＨＣ分子は同一
    抗原ペプチドに結合し、それにより抗原ペプチドは抗原特異的Ｔ細胞に特異的に
    結合する）に接触させ、細胞をキメラタンパク質で標識することを含んでなる、
    抗原特異的Ｔ細胞を標識する方法。
  42. 【請求項４２】 抗原ペプチドに結合している抗原特異的Ｔ細胞をそれに結
    合していない細胞から分離する工程をさらに含んでなる、請求項４１に記載の方
    法。
  43. 【請求項４３】 分離する工程がフローサイトメトリーを使用して実施され
    る、請求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 抗原ペプチドに結合している抗原特異的Ｔ細胞の数を数え
    る工程をさらに含んでなる、請求項４１に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記接触させる工程がｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請
    求項４１に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記接触させる工程がｉｎ ｖｉｖｏで実施される、請求
    項４１に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩ分子である、請求項４１に記
    載の方法。
  48. 【請求項４８】 ＭＨＣ分子がＨＬＡクラスＩ分子である、請求項４７に記
    載の方法。
  49. 【請求項４９】 ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ２分子である、請求項４
    ８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 抗原ペプチドが、ＨＴＬＶ−１Ｔａｘ１１−１９ペプチド
    、ｐ１７Ｇａｇ７７−８５ペプチド及びインフルエンザウイルスＡＭ１５８−６
    ６ペプチドからなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
  51. 【請求項５１】 抗原特異的Ｔ細胞の活性化マーカーを検出する工程をさら
    に含んでなる、請求項４１に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 抗原特異的Ｔ細胞の活性化マーカーが分泌されたリンホカ
    インである、請求項５１に記載の方法。
JP2000510880A 1997-09-11 1998-09-11 抗原特異的ｔ細胞依存性免疫応答を検出、活性化又は抑制するための多価キメラペプチド負荷ｍｈｃ／ｉｇ分子の使用 Pending JP2001515726A (ja)

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US5857397P 1997-09-11 1997-09-11
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