CN115803339A - 特异性结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与来源于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)烯酰ACP还原酶的HLA‑E限制性肽RLPAKAPLL(SEQ ID NO:1)结合的特异性结合分子。所述特异性结合分子可以包含嵌入框架序列内的CDR序列。CDR和框架序列可对应于T细胞受体(TCR)可变结构域，并且可以进一步包含相对于天然TCR可变结构域的非天然突变。本发明的特异性结合分子特别适合用作用于治疗感染性疾病的新型免疫治疗剂。

Description

特异性结合分子
本发明涉及与来源于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)烯酰ACP还原酶的HLA-E限制性肽RLPAKAPLL(SEQ ID NO:1)结合的特异性结合分子。所述特异性结合分子可以包含嵌入框架序列内的CDR序列。CDR和框架序列可对应于T细胞受体(TCR)可变结构域，并且可以进一步包含相对于天然TCR可变结构域的非天然突变。本发明的特异性结合分子特别适合用作用于治疗感染性疾病的新型免疫治疗剂。
背景技术
结核病(TB)仍是全世界感染致死的主要原因。针对结核分枝杆菌(Mtb)感染的免疫应答很复杂，并且该细菌已经进化出复杂的免疫逃避机制，使其成为一种难以用当前疗法治疗的病原体。因此，迫切需要新的治疗干预措施。
HLA-E属于非经典MHC 1b类分子家族，已知其向NK细胞和T细胞呈递有限数量的肽(Braud等，Eur J Immunol 27,1164-1169(1997)；Sullivan等，Tissue antigens 72,415-424(2008))。在稳态条件下，HLA-E可以将来自其他HLA分子的前导序列肽呈递给NK细胞作为免疫监视的方法，缺少前导序列呈递会导致NK细胞进行靶向杀伤。然而，在细胞应激后，如感染期间，HLA-E也可以呈递多种病原体或自身衍生的肽，随后这些肽可以被特定的T细胞识别。HLA-E呈递的肽作为治疗靶点特别有吸引力，因为HLA-E基因在人类中几乎是非多态性的，这提高了在整个人类群体中靶向这些感染的可能性，并避免了靶向高度多态性的经典HLA分子所固有的挑战。
CD8+T细胞靶向HLA-E呈递的Mtb衍生肽，包括肽RLPAKAPLL，这已被描述并且已证明对Mtb或牛分枝杆菌感染的巨噬细胞具有细胞溶解活性(Caccamo等，Eur J Immunol 45,1069-1081(2015)；Joosten等，PLoS Pathog 6,e1000782(2010)；Prezzemolo等，Eur JImmunol 48,293-305(2018)；van Meijgaarden等，PLoS Pathog11,e1004671(2015))。
发明内容
在第一个方面中，本发明提供了一种特异性结合分子，其具有结合于与HLA-E复合的RLPAKAPLL(SEQ ID NO:1)的特性。
本发明人发现，RLPAKAPLL HLA-E为基于T细胞受体(TCR)的免疫治疗干预提供了理想的靶点，以解决慢性疾病。本发明首次提供了与RLPAKAPLL HLA-E复合物结合的特异性结合分子，其包含TCR CDR和框架区。所述特异性结合分子对于治疗TB具有特别理想的治疗特性。
肽RLPAKAPLL对应于由inhA基因(有序基因座名称，Rv1484；Uniprot编号P9WGR1)编码的Mtb蛋白NADH依赖性烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶[NADH]的氨基酸53-61。与之复合的HLA-E分子可以是HLA-E*01:01或HLA-E*01-03。
本发明的特异性结合分子可以包含TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域，所述TCRα链可变结构域和/或所述TCRβ链可变结构域各自包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR是框架区和CDR是互补性决定区。
特异性结合分子或其结合片段可以包含TCR可变结构域，其可对应于来自天然TCR的那些，或更优选TCR可变结构域可被工程化。天然TCR可变结构域也可以称为野生型、天然的、亲本、未突变或支架结构域。特异性结合分子或结合片段可用于产生具有理想治疗特性的分子，例如对靶标的超生理亲和力、长结合半衰期、对靶标的高特异性和良好的稳定性。本发明还包括整合了特异性结合分子或其结合片段和T细胞重定向部分的双特异性或双功能或融合分子。这些分子可以通过重定向和激活T细胞来介导针对TB感染细胞的有效和特异性应答。此外，使用具有超生理亲和力的特异性结合分子有助于识别和清除呈递低水平肽-HLA的细菌感染细胞。或者，特异性结合分子或结合片段可以与其他治疗剂和/或诊断剂融合，和/或掺入工程化的T细胞中用于过继疗法。
TCR结构域序列可以参考IMGT命名法来定义，该命名法对于TCR领域的技术人员而言广为人知且可以获得。例如，参见：LeFranc和LeFranc,(2001).“T cell ReceptorFactsbook”,Academic Press；Lefranc,(2011),Cold Spring Harb Protoc 2011(6):595-603；Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix 1:Appendix 100；和Lefranc,(2003),Leukemia 17(1):260-266。简而言之，αβTCR由两条以二硫键连接的链组成。通常认为每条链(α和β)具有两个结构域，即可变结构域和恒定结构域。短连接区连接可变结构域和恒定结构域，并且通常被认为是α可变区的一部分。另外，β链通常包含在连接区旁的短的多变区，该多变区通常也被认为是β可变区的一部分。每条链的可变结构域位于N端，并包含嵌入框架序列(FR)的三个互补性决定区(CDR)。CDR包含肽-MHC结合的识别位点。存在若干个编码α链可变(Vα)区的基因和若干个编码β链可变(Vβ)区的基因，其区别在于它们的框架、CDR1和CDR2序列，以及部分定义的CDR3序列。在IMGT命名法中，Vα和Vβ基因分别用前缀TRAV和TRBV来表示(Folch和Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet17(1):42-54；Scaviner和Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(2):83-96；LeFranc和LeFranc,(2001),“T cell Receptor Factsbook”,Academic Press)。同样地，α链和β链各有若干连接基因或J基因，分别被称为TRAJ或TRBJ，而β链有被称为TRBD的多变基因或D基因(Folch和Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(2):107-114；Scaviner和Lefranc,(2000),Exp Clin Immunogenet 17(2):97-106；LeFranc和LeFranc,(2001),“T cell ReceptorFactsbook”,Academic Press)。T细胞受体链的巨大多变性源于多种V、J和D基因之间的组合重排，包括等位基因变体和连接多变性(Arstila,等，(1999),Science 286(5441):958-961；Robins等，(2009),Blood 114(19):4099-4107.)。TCRα和β链的恒定区或C区分别称为TRAC和TRBC(Lefranc,(2001),Curr Protoc Immunol Appendix 1:Appendix 10)。
如本文所用，术语“特异性结合分子”是指能够与靶抗原结合的分子。此类分子可采用如本文所讨论的多种不同形式。此外，还设想了本发明的特异性结合分子的片段。片段是指特异性结合分子的保留与靶抗原结合的部分。
术语“突变”涵盖了取代、插入和缺失。对天然(也称为亲本、天然的、未突变的、野生型或支架)特异性结合分子的突变可以赋予有益的治疗特性，如高亲和力、高特异性和高效力；例如，突变可以包括增加特异性结合分子与RLPAKAPLL HLA-E复合物的结合亲和力(kD)和/或结合半衰期(t1/2)的那些。
本发明提供了一种第一特异性结合分子，其具有结合于与HLA-E复合的RLPAKAPLL(SEQ ID NO:1)的特性，并且包含TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域，所述TCRα链可变结构域和/或所述TCRβ链可变结构域各自包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR是框架区和CDR是互补性决定区，其中
(a)所述α链CDR具有以下序列：
CDR1–DSAIYN，
CDR2–IQSSQRE，
CDR3–CAVTNQAGTALIF，
其中任选地具有一个或多个突变，
和/或
(b)所述β链CDR具有以下序列：
CDR1–MNHEY，
CDR2–SVGAGI，
CDR3–CASSYSIRGSRGEQFF，
其中任选地具有一个或多个突变。
在第一特异性结合分子中，所述α链可变结构域框架区可包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:2的氨基酸1-26，
FR2–SEQ ID NO:2的氨基酸33-49，
FR3–SEQ ID NO:2的氨基酸57-89，
FR4–SEQ ID NO:2的氨基酸103-112，
或者与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的相应序列，和/或
所述β链可变结构域框架区可包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:3的氨基酸1-26，
FR2–SEQ ID NO:3的氨基酸32-48，
FR3–SEQ ID NO:3的氨基酸55-90，
FR4–SEQ ID NO:3的氨基酸107-115，
或者与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的相应序列。
在第一特异性结合分子中，α链框架区FR1、FR2和FR3可以包含对应于TRAV21*01链的氨基酸序列和/或β链框架区FR1、FR2和FR3可以包含对应于TRBV6-5*01链的那些的氨基酸序列。
FR4区可以包含α和β可变链的连接区(分别为TRAJ和TRBJ)。TRAJ区可以包含对应于TRAJ15*01的那些的氨基酸序列。TRBJ区可以包含对应于TRBJ2-1*01的那些的氨基酸序列。
在第一特异性结合分子中，在TCRα链可变区中可能存在至少一个突变。在α链CDR中可能有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个突变(即，所有三个CDR总计)。例如，在α链CDR中可能有10个突变。所述突变中的一个或多个可以选自以下突变，参照SEQ ID NO:2的编号：
在残基26和27之间的PDG插入、S28Q、Q54K、N94G、Q95E、A96S、T98V、A99Y、L100W、I101V
因此，可能存在上面列出的任何或所有突变，任选地与其他突变组合。
α链CDR1可以包含序列PDGDQAIYN，α链CDR2可以包含序列IQSSKRE，和/或α链CDR3可以包含序列CAVTGESGVYWVF。
在一个优选α链中，CDR1是PDGDQAIYN，CDR2是IQSSKRE和CDR3是CAVTGESGVYWVF。
突变的α链可以与任何β链配对。
在第一特异性结合分子中，在TCRβ链可变区中可能存在至少一个突变。在β链CDR中可能有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个突变(即，所有三个CDR总计)。例如，在β链CDR中可能有6个突变。所述突变中的一个或多个可以选自以下突变，参照SEQ ID NO:3的编号
N28K、Y31F、V50L、A52V、G53D、Q104L
β链CDR1可以包含序列MKHEF，β链CDR2可以包含序列SLGVDI，和/或β链CDR3可以包含序列CASSYSIRGSRGELFF。
在一个优选β链中，CDR1是MKHEF，CDR2是SLGVDI和CDR3是CASSYSIRGSRGELFF。
突变的β链可以与任何α链配对。
在一个优选的TCR可变区中，α链CDR1是PDGDQAIYN，CDR2是IQSSKRE和CDR3是CAVTGESGVYWVF，和β链CDR1是MKHEF，CDR2是SLGVDI和CDR3是CASSYSIRGSRGELFF。
或者，本发明提供了一种第二特异性结合分子，其具有结合于与HLA-E复合的RLPAKAPLL(SEQ ID NO:1)的特性，并且包含TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域，所述TCRα链可变结构域和/或所述TCRβ链可变结构域各自包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR是框架区和CDR是互补性决定区，其中
(a)所述α链CDR具有以下序列：
CDR1–DRGSQS，
CDR2–IYSNGD，
CDR3–CAVMDSSYKLIF，
其中任选地具有一个或多个突变，
和/或
(b)所述β链CDR具有以下序列：
CDR1–SEHNR，
CDR2–FQNEAQ，
CDR3–CASSLATNEQFF，
其中任选地具有一个或多个突变。
在第二特异性结合分子中，所述α链可变结构域框架区可包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:4的氨基酸1-26
FR2–SEQ ID NO:4的氨基酸33-49
FR3–SEQ ID NO:4的氨基酸56-88
FR4–SEQ ID NO:4的氨基酸101-110，
或者与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的相应序列，和/或
所述β链可变结构域框架区可包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:5的氨基酸1-26
FR2–SEQ ID NO:5的氨基酸32-48
FR3–SEQ ID NO:5的氨基酸55-91
FR4–SEQ ID NO:5的氨基酸104-112，
或者与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的相应序列。
在第二特异性结合分子中，α链框架区FR1、FR2和FR3可以包含对应于TRAV12-2*02链的氨基酸序列和/或β链框架区FR1、FR2和FR3可以包含对应于TRBV7-9*01链的那些的氨基酸序列。
FR4区可以包含α和β可变链的连接区(分别为TRAJ和TRBJ)。TRAJ区可以包含对应于TRAJ12*01的那些的氨基酸序列。TRBJ区可以包含对应于TRBJ2-1*01的那些的氨基酸序列。
在第二特异性结合分子中，在TCRα链可变区中可能存在至少一个突变。在α链CDR中可能有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个突变(即，所有三个CDR总计)。例如，在α链CDR中可能有7个突变。所述突变中的一个或多个可以选自以下突变，参照SEQ IDNO:4的编号：
G29R、Q31R、S94R、S95E、K97E、L98I、I99S。
因此，可能存在上面列出的任何或所有突变，任选地与其他突变组合。
α链CDR1可以包含序列DRRSRS，α链CDR2可以包含序列IYSNGD，和/或α链CDR3可以包含序列CAVMDREYEISF。
在一个优选的α链中，CDR1是DRRSRS，CDR2是IYSNGD和CDR3是CAVMDREYEISF。
突变的α链可以与任何β链配对。
在第二特异性结合分子中，在TCRβ链可变区中可能存在至少一个突变。在β链CDR中可能有一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变(即，所有三个CDR总计)。例如，在β链CDR中可能有5个突变。所述突变中的一个或多个可以选自以下突变，参照SEQ ID NO:5的编号：
E28D、N51S、A97G、T98P、F102L。
β链CDR1可以包含序列SDHNR，β链CDR2可以包含序列FQSEAQ，和/或β链CDR3可以包含序列CASSLGPNEQLF。
在一个优选的β链中，CDR1是SDHNR，CDR2是FQSEAQ和CDR3是CASSLGPNEQLF。
突变的β链可以与任何α链配对。
在一个优选的TCR可变区中，α链CDR1是DRRSRS，CDR2是IYSNGD和CDR3是CAVMDREYEISF，和β链CDR1是SDHNR，CDR2是FQSEAQ和CDR3是CASSLGPNEQLF。
CDR内的一个或多个突变优选地提高特异性结合分子对RLPAKAPLL HLA-E复合物的结合亲和力或特异性，但是可以另外地或替代地赋予其他优点，如当融合至免疫效应物时改善分离形式的稳定性或改善效力。一个或多个位置的突变可以另外地或替代地影响相邻位置与同源pMHC复合物的相互作用，例如通过提供更有利的相互作用角度。突变可以包括导致非特异性结合减少的突变，即，相对于RLPAKAPLL HLA-E减少与替代性抗原的结合。突变可以包括提高折叠效率和/或稳定性和/或可制造性的突变。一些突变可能有利于这些特征中的每一个；另一些可能有利于例如亲和力而非特异性，或者有利于特异性而非亲和力等。
通常，总共需要至少5个、至少10个、至少15个或更多个CDR突变以获得对靶抗原具有pM亲和力的特异性结合分子。可能需要总共至少5个、至少10个或至少15个CDR突变来获得对靶抗原具有pM亲和力的特异性结合分子。对靶抗原具有pM亲和力的特异性结合分子尤其适用于可溶性治疗剂。用于过继性治疗应用的特异性结合分子对靶抗原可具有较低的亲和力，因此可具有较少的CDR突变，例如，总共至多1个、至多2个、至多5个或更多个CDR突变。在一些情况下，天然的(也称为未突变的)特异性结合分子可能对靶抗原具有足够高的亲和力，而不需要突变。已经注意到，本发明的天然形式的特异性结合分子有利地具有高亲和力和特异性。不希望受到任何特定理论的约束，本发明人认为这种更高的亲和力可能是由于肽RLPAKAPLL源自细菌，即非自身来源的事实。
突变可以另外地或替代地在框架区内的CDR之外进行；这样的突变可以导致特异性结合分子治疗特性改善，如改善的结合、和/或特异性、和/或稳定性、和/或纯化的可溶性形式的收率。例如，另外地或替代地，相对于给定TRAV和TRBV链的标准框架序列，本发明的特异性结合分子的两条链中的一条可以在FR1的N端包含一个或多个突变。这种突变可以提高N-末端甲硫氨酸裂解的效率。去除N-末端起始甲硫氨酸通常对蛋白的功能和稳定性至关重要。切割效率低可能对治疗不利，因为其可能导致异质蛋白产物，或者起始甲硫氨酸的存在可能对人类具有免疫原性。在一些情况下，起始甲硫氨酸可存在于本发明的特异性结合分子中。
本发明的第一特异性结合分子的α链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:2的第1-26位、第33-49位、第57-89位、第103-112位框架氨基酸残基具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的各框架氨基酸序列。本发明的特异性结合分子的β链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:3的第1-26位、第32-48位、第55-90位、第107-115位框架氨基酸残基具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的各框架氨基酸序列。或者，当作为一个整体考虑时，所述同一性百分比可能超过框架序列。
本发明的第二特异性结合分子的α链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:4的第1-26位、第33-49位、第56-88位、第101-110位框架氨基酸残基具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的各框架氨基酸序列。本发明的特异性结合分子的β链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:5的第1-26位、第32-48位、第55-91位、第104-112位框架氨基酸残基具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的各框架氨基酸序列。或者，当作为一个整体考虑时，所述同一性百分比可能超过框架序列。
α链可变结构域可以包含SEQ ID NO:6-7的任一氨基酸序列(如图2a中所示)和β链可变结构域可以包含SEQ ID NO:8-9的任一氨基酸序列(如图2b中所示)。
例如，特异性结合分子可以包含SEQ ID No 6和SEQ ID No 8，或者SEQ ID No 7和SEQ ID No 9。
本文公开的本发明的任何特异性结合分子的表型沉默变体属于本发明的范围内。如本文所用，术语“表型沉默变体”应理解为是指具有整合了除了上述那些之外的一个或多个其他氨基酸变化(包括取代、插入和缺失)的TCR可变结构域的特异性结合分子，该特异性结合分子具有与相应的不含所述一个或多个变化的特异性结合分子相似的表型。出于本申请的目的，特异性结合分子表型包含结合亲和力(KD和/或结合半衰期)和特异性。优选地，除了结合亲和力和特异性之外，与免疫效应物缔合的可溶性特异性结合分子的表型包括免疫激活效力和纯化产率。此外，优选的表型还可以包括将肽HLA-E复合物稳定于细胞表面上的能力。当在相同的条件下(例如在25℃下和/或在相同的SPR芯片上)测量时，表型沉默变体对RLPAKAPLL HLA-E复合物的KD和/或结合半衰期可以为不含所述一个或多个变化的相应特异性结合分子的所测得的KD和/或结合半衰期的50％以内，或更优选为30％以内、25％以内或20％以内。在实施例3和实施例4中进一步提供了适宜的条件。
此外，表型沉默变体在与RLPAKAPLL HLA-E复合物结合和与一种或多种替代性肽HLA复合物结合之间可以保持相同或持续相同的治疗窗。表型沉默变体可以在响应于呈递RLPAKAPLL HLA-E复合物的细胞与呈递一种或多种替代性脱靶肽HLA复合物的细胞的免疫细胞激活效力之间保持相同或持续相同的治疗窗。治疗窗可以基于对正常细胞和指示相关细胞系观察到的最低有效浓度(“LOEL”)来计算。治疗窗可以是至少10倍的差异；至少100倍的差异、至少1000倍的差异或者更大。表型变体可以共享相同或基本相同的识别基序，如下文进一步讨论的顺序诱变技术所确定的。
如本领域技术人员所知晓的，能产生特异性结合分子，所述特异性结合分子与上文详述的那些相比在其可变结构域中并入变化，而不改变与RLPAKAPLL HLA-E复合物的相互作用的亲和力和/或其他功能特征。特别地，此类沉默突变可以并入已知不直接参与抗原结合的序列部分中(例如，框架区和/或CDR的不接触抗原的部分)。此类变体包括在本发明的范围内。
对本领域技术人员将显而易见的是，可以将在特异性结合分子的C端和/或N端提供的序列截短或延伸1、2、3、4、5个或更多个残基，而基本上不影响其功能性特征。可以将在C端和/或N端提供的序列截短或延伸1、2、3、4或5个残基。所有这些变体涵盖在本发明中。
表型沉默变体可以包含一个或多个保守取代和/或一个或多个耐受取代(tolerated substitution)。耐受取代意指不落入如下所提供的保守取代的定义但仍然是表型沉默的那些取代。技术人员知晓若不同的氨基酸具有相似的特性则因此是“保守的”。蛋白质、多肽或肽的一种或多种这样的氨基酸通常可以被一种或多种其他这样的氨基酸取代，而不会消除该蛋白质、多肽或肽的所需活性。
因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(具有脂肪族侧链的氨基酸)通常可以互相取代。在这些可能的取代中，优选使用甘氨酸和丙氨酸来互相取代(因为它们具有相对短的侧链)，以及使用缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸来互相取代(因为它们具有较大的疏水脂肪族侧链)。通常可以互相取代的其他氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。应当理解，本发明范围内的氨基酸取代可以使用天然存在的或非天然存在的氨基酸来进行。例如，本文构思可以用乙基基团取代丙氨酸上的甲基基团，和/或可以对肽骨架进行微小的改变。无论是使用天然氨基酸还是合成氨基酸，优选仅存在L-氨基酸。
这种性质的取代通常被称为“保守”或“半保守”氨基酸取代。因此，本发明延伸至包含上述任意氨基酸序列的特异性结合分子的用途，但在该氨基酸序列中具有一个或多个保守取代和/或一个或多个耐受取代，使得该特异性结合分子的氨基酸序列与包含SEQIDNO:2、6的氨基酸1-112和/或SEQ ID NO:3、8的氨基酸1-115和/或SEQ ID NO:4、7的氨基酸1-110和/或SEQ ID NO:5、9的氨基酸1-112的特异性结合分子具有至少90％的同一性，例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
如本领域已知的，“同一性”是通过比较序列所确定的两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，同一性也意指多肽或多核苷酸序列(视情况而定)之间的序列相关程度，如通过这种序列的串之间的匹配所确定。虽然存在许多测量两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的同一性的方法，但通常用于确定同一性的方法是在计算机程序中编码的。
用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序包括但不限于GCG程序包(Devereux,等，Nucleic Acids Research,12,387(1984)，BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul等，J.Molec.Biol.215,403(1990))SIM-蛋白序列比对工具(Xiaoquin Huang和WebbMiller:"ATime-Efficient,Linear-Space Local Similarity Algorithm"Advances inApplied Mathematics,vol.12(1991),pp.337-357)。
可以使用程序(例如CLUSTAL程序)来比较氨基酸序列。该程序比较氨基酸序列，并通过视情况而定在任一序列中插入间隔来找到最优对齐。可以针对最优对齐来计算氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸类型的保守性)。像BLASTx这样的程序会对齐相似序列的最长延伸，并为拟合赋值。因此，可以在发现若干相似区，每个区具有不同的分数的情况下获得比较。本发明中考虑了两种类型的同一性分析。
通过出于最优比较目的对序列进行对齐(例如，可以在第一序列中引入空位以与序列进行最佳对齐)并且比较相应位置处的氨基酸残基或核苷酸，来确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性。“最佳对齐”是获得最高的百分比同一性的两个序列的对齐。百分比同一性由所比较序列中的相同氨基酸残基或核苷酸的数量来确定的(即，同一性％＝相同位置数/位置总数×100)。
可以使用本领域技术人员已知的数学算法来完成两个序列之间的百分比同一性的确定。用于比较两个序列的数学算法的示例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，该算法在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中进行了改进。Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序已经整合了这种算法。可以用BLASTn程序来进行两个核苷酸序列之间的同一性百分比的确定。可以用BLASTp程序来进行两个蛋白质序列之间的同一性百分比的确定。为了获得用于比较目的的加空位对齐(gappedalignment)，可以使用Gapped BLAST，如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述。或者，可以使用PSI-Blast来执行迭代搜索，检测分子之间的距离关系(Id.)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如，BLASTp和BLASTp)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。默认的常规参数可以包括，例如，字体大小＝3，期望阈值＝10。可以选择参数以自动调整为短输入序列。用于序列比较的数学算法的另一示例是Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法。作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(版本2.0)已经合并了这种算法。本领域已知的用于序列分析的其他算法包括如Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.,10:3-5中所述的ADVANCE和ADAM；以及Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-8中所述的FASTA。在FASTA中，ktup是设置搜索的灵敏度和速度的控制选项。出于评估本发明中的百分比同一性的目的，使用BLASTp以及默认参数作为比较方法。另外，当所列举的同一性百分比提供氨基酸的非整数值(即，具有90％序列同一性的25个氨基酸的序列提供的值为“22.5”时，则将所得值向下舍入到下一个整数，即“22”)。因此，在提供的示例中，在25个氨基酸中具有22个匹配的序列在90％序列同一性内。
可以使用任何适当的方法将突变(包括保守和耐受取代、插入和缺失)引入所提供的序列中，所述方法包括但不限于基于聚合酶链反应(PCR)、基于限制酶的克隆或不依赖于连接的克隆(LIC)步骤的方法。这些方法在许多标准分子生物学文本中都有详细描述。有关聚合酶链反应(PCR)和基于限制酶的克隆的更多细节，参见Sambrook&Russell,(2001)Molecular Cloning–A Laboratory Manual(第3版)CSHL Press。有关不依赖于连接的克隆(LIC)步骤的更多信息可以在Rashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6中找到。本发明提供的TCR序列可以从固态合成或本领域已知的任何其他合适的方法获得。
本发明的特异性结合分子具有结合RLPAKAPLL HLA-E复合物的特性。本发明的特异性结合分子显示出对RLPAKAPLL HLA-E复合物的高度特异性，并因此特别适合于治疗用途。在本发明的特异性结合分子的背景下，特异性涉及其识别抗原阳性靶细胞的能力，同时具有识别抗原阴性靶细胞的最小能力。本发明的特异性结合分子可结合靶肽与HLA-E*01:01或HLA-E*01-03的复合物。
特异性可以在体外测量，例如在细胞试验(比如实施例6-8中描述的细胞试验)中测量。为了测试特异性，特异性结合分子可以是可溶性形式并且与免疫效应物缔合，和/或可以在细胞(如T细胞)表面上表达。可以通过测量在如上文所定义的抗原阳性和抗原阴性靶细胞存在的情况下的T细胞活化水平来确定特异性。抗原阴性靶细胞的最小识别被定义为在相同条件下和在治疗相关的TCR浓度下测量时低于存在抗原阳性靶细胞时产生的水平的20％、优选低于10％、优选低于5％、并且更优选低于1％的T细胞活化水平。对于与免疫效应物缔合的可溶性TCR，治疗相关浓度可以定义为10-9M或更低的浓度，和/或大于相应EC50或IC50值高达100倍、优选高达1000倍的浓度。优选地，对于与免疫效应物缔合的可溶性特异性结合分子，相对于抗原阴性细胞，针对抗原阳性细胞的T细胞活化在EC50或IC50值方面存在至少10倍、至少100倍、至少1000倍、至少10000倍的差异——该差异可称为治疗窗。另外地或替代地，可以基于对正常细胞和感染细胞观察到的最低有效浓度(“LOEL”)来计算治疗窗。抗原阳性细胞可以通过使用合适的肽浓度的肽脉冲来获得，以获得与wt肽呈递相当的抗原呈递水平，或者，其可以天然地呈递所述肽。优选地，抗原阳性和抗原阴性细胞都是人细胞。
另外地或替代地，特异性可能与特异性结合分子结合RLPAKAPLL HLA-E复合物而非一组替代性肽HLA复合物的能力有关。这可以通过例如实施例3和实施例4的Biacore方法来确定。所述组可包括已知由HLA-E呈递的自身引导肽、与HLA-A*02复合的RLPAKAPLL肽或由HLA-E同源物Mamu-E呈递的RLPAKAPLL肽。所述组可含有至少5种，优选至少10种替代性肽-HLA复合物。替代性肽可以与SEQ ID NO:1具有低水平的序列同一性，并且可以是天然或人工呈递的。替代性肽优选衍生自通常表达的蛋白和/或在健康人体组织中表达的蛋白。特异性结合分子与RLPAKAPLL HLA-E复合物的结合可以比与其他天然或人工呈递的肽HLA复合物的结合高至少2倍、更优选高至少10倍、或至少50倍或至少100倍，甚至更优选高至少1000倍。RLPAKAPLL肽的天然变体可以从替代性肽HLA复合物的定义中排除。
确定特异性结合分子的特异性的替代的或另外的方法可以是使用靶肽的顺序诱变(例如丙氨酸扫描)来鉴定特异性结合分子的肽识别基序。形成结合基序的部分的残基是不允许取代的残基。不允许取代可以定义为如下肽位置：相对于非突变肽的结合亲和力，特异性结合分子的结合亲和力降低至少50％或优选至少80％。在Cameron等，(2013),SciTransl Med.2013Aug 7；5(197):197ra103和WO2014096803中进一步描述了与TCR相关的这种方法，但应理解此类方法也可应用于本发明的特异性结合分子。在这种情况下，特异性结合分子的特异性可以通过鉴定含有替代基序的肽，特别是在人蛋白质组中含有替代基序的肽，并测试这些肽与特异性结合分子的结合来确定。特异性结合分子与一种或多种替代性肽的结合可表明缺乏特异性。在这种情况下，可能需要通过细胞试验进一步测试特异性结合分子的特异性。肽中心部分中(丙氨酸)取代的低耐受性表明，TCR具有高特异性并因此表现出低的与替代性肽发生交叉反应的风险。
本发明的特异性结合分子可具有用作治疗剂的理想的安全性特性。在这种情况下，特异性结合分子可以是可溶性形式，并且可以优选地与免疫效应物融合。适宜的免疫效应物包括但不限于细胞因子(如IL-2和IFN-γ)；超级抗原及其突变体；趋化因子(如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白)；抗体和抗体样支架，包括与免疫细胞如T细胞或NK细胞(例如，抗CD3、抗CD28或抗CD16)上的抗原结合的片段、衍生物和变体；和Fc受体或补体活化剂。理想的安全性特性意味着除了显示良好的特异性外，本发明的特异性结合分子还可以通过进一步的临床前安全性测试。这种测试的示例包括：全血测定，以确认在存在全血的情况下最小化细胞因子释放，并因此降低在体内引起潜在细胞因子释放综合征的风险；以及同种异体反应性测试，以确认识别替代性HLA类型的低可能性。
本发明的特异性结合分子可以适于高产率纯化，特别是可溶性形式的特异性结合分子。产率可以基于在纯化过程结束时获得的正确折叠物质相对于原始培养物体积的量来确定。高产率通常指大于1mg/L，或大于2mg/L，或更优选大于3mg/L，或大于4mg/L，或大于5mg/L，或更高的产率。
本发明的某些特异性结合分子优选针对RLPAKAPLL HLA-E复合物具有大于(即，强于)天然TCR(也称为非突变的，或支架TCR)的KD，例如在1pM至1μM范围内。在一个方面中，本发明的特异性结合分子针对复合物的KD为从约(即，+/-10％)1pM至约400nM、从约1pM至约1000pM、从约1pM至约500pM。另外地或可替代地，所述特异性结合分子对复合物的结合半衰期(T1/2)可以在约1分钟至约60小时、约20分钟至约50小时、或约20分钟至约25小时范围内。优选地，本发明的特异性结合分子针对RLPAKAPLL HLA-E复合物具有从约1pM至约500pM的KD和/或从约20min至约25h的结合半衰期。当与治疗剂和/或可检测标记物缔合时，这种高亲和力对于可溶性形式的特异性结合分子是优选的。
包含天然TCR的本发明的特异性结合分子可具有约1μM至约200μM、或约1μM至约100μM的针对复合物的KD和/或约3秒至约10分钟的针对复合物的结合半衰期。
在另一个方面中，包含天然TCR的本发明的特异性结合分子可具有约50nM至约200μM、或约100nM至约2μM的针对复合物的KD和/或约3秒至约12分钟的针对复合物的结合半衰期。这种特异性结合分子对于过继治疗应用可能是优选的。
确定结合亲和力(与平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)的方法是本领域技术人员已知的。在一个优选的实施方式中，结合亲和力和结合半衰期分别使用表面等离子体共振(SPR)或生物层干涉法(BLI)来确定，例如分别使用BIAcore仪器或Octet仪器来确定。实施例3和实施例4中提供了优选的方法。将意识到的是，特异性结合分子的亲和力加倍导致KD减半。按照ln2除以解离率(koff)计算T1/2。因此，T1/2加倍导致koff减半。TCR的KD和koff值通常是对可溶性形式的TCR进行测量的，即被截短以去除细胞质和跨膜结构域残基的那些形式(包括单链TCR和/或包含非天然二硫键或其他二聚结构域的TCR)。为了考虑独立测量之间的变化，尤其是解离时间超过20小时下的相互作用，可以使用相同的测定方案测量给定特异性结合分子的结合亲和力和/或结合半衰期数次(例如，3次或更多次)，并取结果的平均值。为了比较两个样品(即两个不同的特异性结合分子和/或同一特异性结合分子的两种制剂)之间的结合数据，优选使用相同的测定条件(例如，温度)进行测量，例如实施例3和实施例4中所述的那些条件。
本发明的某些优选的特异性结合分子对RLPAKAPLL HLA-E复合物的结合亲和力和/或结合半衰期显著高于天然TCR。增加天然TCR的结合亲和力会降低TCR对其肽-MHC配体的特异性，这在Zhao等，(2007)J.Immunol,179:9,5845-5854中得到证实。然而，尽管本发明的这种特异性结合分子具有比天然TCR显著更高的结合亲和力，其仍显示对RLPAKAPLLHLA-E复合物的特异性。
某些优选的特异性结合分子能够在体外产生针对抗原阳性细胞的高效T细胞应答，特别是针对呈递低水平抗原的那些细胞(即，约5-100)。这种特异性结合分子可以是可溶性形式，并连接至免疫效应物，如抗CD3抗体。测量的T细胞应答可以是T细胞活化标志物(如干扰素γ或颗粒酶B)的释放、或靶细胞杀伤(包括杀伤感染Mtb的原代细胞)、或T细胞活化的其他量度，如T细胞增殖。优选地，高效应答是EC50值在pM范围(即，1000pM或更低)内的应答。
本发明的特异性结合分子可以包含TCR可变结构域。优选地，TCR可变结构域包含α链和β链的异二聚体。或者，TCR可变结构域可以包含γ链和δ链的异二聚体。在一些情况下，本发明的特异性结合分子可以包含TCR可变结构域的同源二聚体，如αα或ββ同源二聚体(或者γγ或δδ同源二聚体)。
在本发明的特异性结合分子中，可变结构域和恒定结构域(当存在时)和/或任何其他结构域可以任何适宜的形式/排布来组织。这种排布的实例在抗体领域中是众所周知的。技术人员知道抗体和TCR之间的相似性，并且能够将这种排布应用于TCR可变和恒定结构域(Brinkman等，MAbs.2017Feb-Mar；9(2):182–212)。例如，可变结构域可以以单克隆TCR形式排布，其中两条链通过二硫键连接(在恒定结构域或可变结构域内)，或者其中可变结构域与一个或多个二聚结构域融合。可替代地，可变结构域可以在存在或不存在一个或多个恒定结构域的情况下以单链形式排布，或者可变结构域可以双体(diabody)形式排布。
本发明的特异性结合分子可以包含至少一个TCR恒定结构域或其片段，例如α链TRAC恒定结构域和/或β链TRBC1或TRBC2恒定结构域。如本领域技术人员将意识到的是，术语TRAC和TRBC1/2还涵盖天然多态性变体，例如在TRAC的位置4处的N变为K(Bragado等，International immunology.1994Feb；6(2):223-30)。
当存在时，恒定结构域的一个或两个可以包含相对于天然恒定结构域序列的突变、取代或缺失。恒定结构域可以被截短，即，没有跨膜或胞质结构域。或者，恒定结构域可以是全长的，这意味着胞外、跨膜和胞质结构域都存在。可通过截短或取代使TRAC的外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键缺失来修饰TRAC和TRBC结构域序列。α和/或β链恒定结构域序列可以在各恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，例如在WO03/020763中所描述的。优选地，可以通过用半胱氨酸残基取代TRAC的Thr48位和TRBC1或TRBC2的Ser57位来修饰α和β恒定结构域，所述半胱氨酸在TCR的α和β恒定结构域之间形成非天然二硫键。TRBC1或TRBC2可另外包括恒定结构域第75位的半胱氨酸至丙氨酸突变和恒定结构域第89位的天冬酰胺至天冬氨酸突变。在本发明的αβ异二聚体中存在的胞外恒定结构域中的一个或两个可以在一个或多个C端进一步截短，例如截短至多15个、或至多10个、或至多8个或更少的氨基酸。在本发明的αβ异二聚体中存在的胞外恒定结构域中的一个或两个可以在一个或多个C端截短例如至多15个、或至多10个或至多8个氨基酸。α链胞外恒定结构域的C端可以截短8个氨基酸。
或者，可以没有TCR恒定结构域，而不是没有全长或截短的恒定结构域。照此，本发明的特异性结合分子可以由TCRα和β链的可变结构域构成，任选地具有如本文所述的其他结构域。其他结构域包括但不限于免疫效应物结构域(如抗体结构域)、Fc结构域或白蛋白结合结构域、治疗剂或可检测标记。
单链形式包括但不限于Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ或Vα-Cα-L-Vβ-Cβ型的αβTCR多肽，其中Vα和Vβ分别是TCRα和TCRβ可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和TCRβ恒定区，并且L是接头序列(Weidanz等，(1998)J Immunol Methods.Dec1；221(1-2):59-76；Epel等，(2002),Cancer Immunol Immunother.Nov；51(10):565-73；WO 2004/033685；WO9918129)。接头序列通常是柔性的，它们主要由诸如不具有可能限制柔性的庞大侧链的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸构成。或者，具有更大刚性的接头可能是期望的。可以容易地确定可用的接头序列或接头序列的最佳长度。接头序列的长度通常小于约12个氨基酸，如小于10个氨基酸，或为2-10个氨基酸。接头的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。可用于本发明的多结构域结合分子的适宜接头的实例包括但不限于：GGGGS(SEQ ID No:15)、GGGSG(SEQ ID No:16)、GGSGG(SEQ ID No:17)、GSGGG(SEQ ID No:18)、GSGGGP(SEQ ID No:19)、GGEPS(SEQ ID No:20)、GGEGGGP(SEQ ID No:21)和GGEGGGSEGGGS(SEQ ID No:22)(如在WO2010/133828中所描述的)和GGGSGGGG(SEQ ID NO:23)。其他的接头可以包括具有以下序列基序中的一个或多个的序列：GGGS(SEQ ID NO:24)、TVLRT(SEQ ID NO:25)、TVSSAS(SEQID NO:26)和TVLSSAS(SEQ ID NO:27)。在存在的情况下，恒定结构域中的一个或两个可以是全长的，或者它们可以如上所述被截短和/或含有突变。优选地，单链TCR是可溶的。在某些实施方式中，本发明的单链TCR可以在各恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，如在WO 2004/033685中描述的。WO2004/033685；WO98/39482；WO01/62908；Weidanz等，(1998)JImmunol Methods 221(1-2):59-76；Hoo等，(1992)Proc Natl Acad Sci U S A 89(10):4759-4763；Schodin(1996)Mol Immunol 33(9):819-829中进一步描述了单链TCR。
TCR可变结构域可以按双体形式排布。在双体形式中，两个单链片段以头尾方向二聚化，形成分子质量类似于串联scFv的紧凑分子(～50kDa)。
本发明还包括显示本发明的特异性结合分子的颗粒，以及将所述颗粒包含在颗粒文库中。此类颗粒包括但不限于噬菌体、酵母细胞、核糖体或哺乳动物细胞。产生此类颗粒和文库的方法是本领域公知的(例如参见WO2004/044004；WO01/48145，Chervin等，(2008)J.Immuno.Methods 339.2:175-184)。
本发明的特异性结合分子可用于将可检测的标记或治疗剂递送至抗原呈递细胞和含有抗原呈递细胞的组织。因此，其可以与可检测标记(用于诊断目的，其中特异性结合分子用于检测呈递同源抗原的细胞的存在)和/或治疗剂，包括免疫效应物；和/或药代动力学(PK)修饰部分缔合(共价或以其他方式)。
PK修饰部分的实例包括但不限于PEG(Dozier等，(2015)Int JMol Sci.Oct 28；16(10):25831-64和Jevsevar等，(2010)Biotechnol J.Jan；5(1):113-28)、PASylation(Schlapschy等，(2013)Protein Eng Des Sel.Aug；26(8):489-501)、白蛋白、和白蛋白结合结构域(Dennis等，(2002)J Biol Chem.Sep 20；277(38):35035-43)、和/或非结构化的多肽(Schellenberger等，(2009)Nat Biotechnol.Dec；27(12):1186-90)。其他PK修饰部分包括抗体Fc片段。PK修饰部分可用于延长本发明的特异性结合分子的体内半衰期。
当使用免疫球蛋白Fc结构域时，它可以是任何抗体Fc区。Fc区是抗体的尾部区域，该区域与细胞表面Fc受体和补体系统的一些蛋白质相互作用。Fc区通常包含两条均具有两个或三个重链恒定结构域(称为CH2、CH3和CH4)的多肽链和以及铰链区。这两条链通过铰链区内的二硫键连接。来自免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2和IgG4的Fc结构域结合FcRn并经历FcRn介导的再循环，这赋予了长的循环半衰期(3周至4周)。IgG与FcRn的相互作用已定位于覆盖CH2和CH3结构域的部分的Fc区。用于本发明的优选免疫球蛋白Fc包括但不限于来自IgG1或IgG4的Fc结构域。优选地，Fc结构域来源于人序列。Fc区还可以优选地包括促进二聚化的KiH突变，以及防止与活化受体(即功能沉默分子)相互作用的突变。免疫球蛋白Fc结构域可以按任何合适的顺序或构型与其他结构域(即，TCR可变结构域和/或TCR恒定结构域和/或免疫效应物结构域)的C端或N端融合。免疫球蛋白Fc可以通过接头与一个或多个其他结构域(即，TCR可变结构域和/或TCR恒定结构域和/或免疫效应物结构域)融合。接头序列通常是柔性的，它们主要由诸如不具有可能限制柔性的庞大侧链的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸构成。或者，具有更大刚性的接头可能是期望的。可以容易地确定可用的接头序列或接头序列的最佳长度。通常，接头序列的长度将小于约12个氨基酸，如小于10或为2至10个氨基酸。接头的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。可用于本发明的多结构域结合分子的适宜接头的实例包括但不限于：GGGGS(SEQ ID No:15)、GGGSG(SEQ ID No:16)、GGSGG(SEQ IDNo:17)、GSGGG(SEQ ID No:18)、GSGGGP(SEQ IDNo:19)、GGEPS(SEQ ID No:20)、GGEGGGP(SEQ ID No:21)和GGEGGGSEGGGS(SEQ ID No:22)(如在WO2010/133828中所描述的)和GGGSGGGG(SEQ ID NO:23)。其他的接头可以包括具有以下序列基序中的一个或多个的序列：GGGS(SEQ ID NO:24)、TVLRT(SEQ ID NO:25)、TVSSAS(SEQ ID NO:26)和TVLSSAS(SEQID NO:27)。当免疫球蛋白Fc与TCR融合时，它可以通过接头或不通过接头而与α链或β链融合。此外，Fc的各个链可以与TCR的各个链融合。
优选地，Fc区可以源自IgG1或IgG4亚类。这两条链可以包含CH2和CH3恒定结构域以及全部或部分铰链区。铰链区可以基本上或部分对应于来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区。铰链可以包括全部或部分核心铰链结构域和全部或部分下铰链区。优选地，铰链区包含至少一个连接两条链的二硫键。
Fc区可以包含相对于WT序列的突变。突变包括取代、插入和缺失。可以为了引入期望的治疗特性而进行此类突变。例如，为了促进异源二聚化，可以将杵臼结构(KiH)突变工程化改造到CH3结构域中。在这种情况下，将一条链工程化改造为包含庞大的悬突残基(即杵)，例如Y，而将另一条链工程化改造为包含一个互补的口袋(即臼)。KiH突变的合适位置是本领域已知的。另外地或可替代地，可以引入消除或减少与Fcy受体的结合和/或增加与FcRn的结合、和/或阻止Fab臂交换或去除蛋白酶位点的突变。另外地或可替代地，突变提高可制造性，例如去除或改变糖基化位点。
PK修饰部分也可以是白蛋白结合结构域，其也可以起到延长半衰期的作用。如本领域中已知的，白蛋白具有19天的长循环半衰期，部分原因在于其大小高于肾阈值以及由于其特异性相互作用和经由FcRn的再循环。与白蛋白连接是一种众所周知的改善治疗分子体内循环半衰期的策略。白蛋白可以通过使用特定的白蛋白结合结构域以非共价方式连接，或通过缀合或直接基因融合以共价方式连接。Sleep等，Biochim BiophysActa.2013Dec；1830(12):5526-34中给出了利用与白蛋白的连接来改善半衰期的治疗分子的示例。
白蛋白结合结构域可以是能够与白蛋白结合的任何部分，包括任何已知的白蛋白结合部分。白蛋白结合结构域可以选自特异性结合白蛋白的内源性或外源性配体、有机小分子、脂肪酸、肽和蛋白质。优选的白蛋白结合结构域的示例包括：短肽，如Dennis等，JBiol Chem.2002Sep 20；277(38):35035-43中描述的(例如肽QRLMEDICLPRWGCLWEDDF)；经工程化改造以结合白蛋白的蛋白，如抗体、抗体片段和抗体样支架，例如由GSK商品化提供的
Figure BDA0004039763640000241
(O'Connor-Semmes等，Clin Pharmacol Ther.2014Dec；96(6):704-12)和由Ablynx商品化提供的
Figure BDA0004039763640000242
(Van Roy等，Arthritis Res Ther.2015年5月20日；17:135)以及基于在自然界中发现的白蛋白结合结构域(如链球菌蛋白G蛋白)的蛋白(Stork等,Eng Des Sel.2007Nov；20(11):569-76)，例如由Affibody商品化提供的
Figure BDA0004039763640000243
优选地，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。白蛋白结合结构域对人白蛋白的亲和力可以在皮摩尔至微摩尔的范围内。鉴于人血清中白蛋白的浓度极高(35-50mg/ml，大约0.6mM)，据计算，基本上所有的白蛋白结合结构域在体内都将与白蛋白结合。
白蛋白结合部分可以按任何合适的顺序或构型连接至其他结构域(即，TCR可变结构域和/或TCR恒定结构域和/或免疫效应物结构域)的C端或N端。白蛋白结合部分可以通过接头融合至一个或多个其他结构域(即，TCR可变结构域和/或TCR恒定结构域和/或免疫效应物结构域)。接头序列通常是柔性的，它们主要由诸如不具有可能限制柔性的庞大侧链的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸构成。或者，具有更大刚性的接头可能是期望的。可以容易地确定可用的接头序列或接头序列的最佳长度。通常，接头序列的长度将小于约12个氨基酸，如小于10或为2至10个氨基酸。接头的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。可用于本发明的多结构域结合分子的适宜接头的实例包括但不限于：GGGGS(SEQ ID No:15)、GGGSG(SEQ IDNo:16)、GGSGG(SEQ ID No:17)、GSGGG(SEQ ID No:18)、GSGGGP(SEQ ID No:19)、GGEPS(SEQID No:20)、GGEGGGP(SEQ ID No:21)和GGEGGGSEGGGS(SEQ ID No:22)(如在WO2010/133828中所描述的)和GGGSGGGG(SEQ ID NO:23)。其他的接头可以包括具有以下序列基序中的一个或多个的序列：GGGS(SEQ ID NO:24)、TVLRT(SEQ ID NO:25)、TVSSAS(SEQ ID NO:26)和TVLSSAS(SEQ ID NO:27)。当白蛋白结合部分与TCR融合时，它可以通过接头或不通过接头而与α链或β链连接。
用于诊断目的的可检测标记包括：例如，荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。
出于某些目的，本发明的特异性结合分子可以聚集成包含若干个特异性结合分子的复合物，以形成多价特异性结合分子复合物。有许多人蛋白质含有可用于产生多价特异性结合分子复合物的多聚化结构域。例如已用于产生scFv抗体片段四聚体的p53的四聚化结构域，与单体scFv片段相比，其表现出增加的血清持久性和显著降低的解离速率(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白也具有可用于这种应用的四聚化结构域。与本发明的非多聚天然(也称为亲代、天然的、未突变、野生型或支架)T细胞受体异二聚体相比，本发明的多价特异性结合分子复合物可以具有增强的复合物结合能力。因此，本发明的特异性结合分子的多价复合物也包括在本发明内。根据本发明的这种多价特异性结合分子复合物特别适用于在体外或体内跟踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还可用作产生具有这种用途的其他多价特异性结合分子复合物的中间体。
可以与本发明的特异性结合分子缔合的治疗剂包括免疫调节剂和效应物、放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化疗剂(例如顺铂)。为了确保在期望的位置发挥治疗效果，治疗剂可以位于与特异性结合分子连接的脂质体或其他纳米粒子结构内，从而使化合物缓慢释放。这将防止在体内运输过程中的损害性影响，并确保该治疗剂在特异性结合分子与相关抗原呈递细胞结合后具有最大效果。
适宜治疗剂的实例包括但不限于：
·抗体或其片段，包括抗T细胞或NK细胞决定簇抗体(例如，抗CD3、抗CD28或抗CD16)；
·具有抗体样结合特征的替代性蛋白支架(例如，DARPins)；
·免疫刺激剂，即，刺激免疫应答的免疫效应分子。例如，细胞因子，如IL-2和IFN-γ；
·趋化因子，如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；·补体途径或Fc受体激活剂；
·检查点抑制剂，如靶向PD1或PD-L1的那些；
·小分子细胞毒性剂，即具有杀伤哺乳动物细胞的能力的分子量小于700道尔顿的化合物。这种化合物还可以含有能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒性剂还包括前药，即在生理条件下衰变或转化以释放细胞毒性剂的化合物。这种药剂的实例包括顺铂、美登素衍生物、雷卡霉素、卡奇霉素、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、卟吩姆钠光敏素II、替莫唑胺、拓扑替康、trimetreate arbourate、奥瑞斯他汀E、长春新碱和多柔比星；
·肽细胞毒素，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的蛋白质或其片段。例如，蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶；
·放射性核素，即随着α或β粒子或γ射线中的一种或多种的同时发射而衰变的元素的不稳定同位素。例如，碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；可以使用螯合剂来促进这些放射性核素与TCR或其多聚体的缔合；
·超级抗原及其突变体；
·肽-HLA复合物，其中所述肽来源于常见人病原体，如爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)；
·异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。
优选的是与免疫效应物缔合的本发明的可溶性特异性结合分子(通常通过以任何合适的构型融合到α链或β链的N端或C端，或两者)。TCR的N端可以连接至免疫效应物多肽的C端。
特别优选的免疫效应物是抗CD3抗体或功能性片段或者所述抗CD3抗体的变体。如本文所用，术语“抗体”涵盖这种片段和变体。抗CD3抗体的实例包括但不限于OKT3、UCHT-1、BMA-031和12F6。适用于本文所述的组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括微型抗体、双体、Fab片段、F(ab’)2片段、dsFv和scFv片段。在术语抗体中涵盖的其他实例包括NanobodiesTM(这些构建体由Ablynx(Belgium)销售，其包含衍生自骆驼科动物(例如，骆驼或美洲驼)抗体的合成的单一免疫球蛋白重链可变结构域)；域抗体(Domantis,Belgium)，其包含亲和力成熟的单一免疫球蛋白重链可变结构域或免疫球蛋白轻链可变结构域；以及表现出抗体样结合特性的替代蛋白支架，如Affibody(Affibody,Sweden)，其包含工程化蛋白A支架，或Anticalin(Pieris,Germany)，其包含工程化anticalin，或者DARPin(Molecular Partners,Switzerland)，其包含设计的锚蛋白重复蛋白。
融合分子的优选排布的实例包括在WO2010133828、WO2019012138和WO2019012141中描述的那些。
本发明的特异性结合分子可以包含：
第一多肽链，其包含所述α链可变结构域和抗体的可变结构域的第一结合区；和
第二多肽链，其包含所述β链可变结构域和所述抗体的可变结构域的第二结合区，
其中相应多肽链缔合，以使得所述特异性结合分子能够同时结合RLPAKAPLL HLA-E复合物和所述抗体的抗原。
本文还提供了一种双特异性多肽分子，其选自包括第一多肽链和第二多肽链的分子的组，其中：所述第一多肽链包含特异性结合人免疫效应细胞的细胞表面抗原的抗体的可变结构域的第一结合区(VD1)，和
特异性结合MHC缔合肽表位的TCR的可变结构域的第一结合区(VR1)，和
连接所述结构域的第一接头(LINK1)；
所述第二多肽链包含特异性结合MHC缔合肽表位的TCR的可变结构域的第二结合区(VR2)，和
特异性结合人免疫效应细胞的细胞表面抗原的抗体的可变结构域的第二结合区(VD2)，和
连接所述结构域的第二接头(LINK2)；
其中所述第一结合区(VD1)和所述第二结合区(VD2)缔合以形成结合人免疫效应细胞的细胞表面抗原的第一结合位点(VD1)(VD2)；
所述第一结合区(VR1)和所述第二结合区(VR2)缔合以形成结合所述MHC缔合肽表位的第二结合位点(VR1)(VR2)；
其中所述两条多肽链与人IgG铰链结构域和/或人IgG Fc结构域或其二聚体部分融合；和
其中所述两条多肽链通过所述铰链结构域和/或Fc结构域之间的共价和/或非共价键连接；和
其中所述双特异性多肽分子能够同时结合细胞表面分子和MHC缔合肽表位，以及双特异性多肽分子，其中在两条多肽链中结合区的顺序选自VD1-VR1和VR2-VD2或VD1-VR2和VR1-VD2，或者VD2-VR1和VR2-VD1或VD2-VR2和VR1-VD1，和其中所述结构域通过LINK1或LINK2连接，其中MHC缔合肽表位是RLPAKAPLL和MHC是HLA-E*01。
特异性结合分子和抗CD3抗体的连接可以通过共价或非共价连接进行。共价连接可以是直接的，或通过接头序列间接的。接头序列通常是柔性的，它们主要由诸如不具有可能限制柔性的庞大侧链的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸构成。或者，具有更大刚性的接头可能是期望的。可以容易地确定可用的接头序列或接头序列的最佳长度。通常，接头序列的长度将小于约12个氨基酸，如小于10或为2至10个氨基酸。可用于本发明的多结构域结合分子的适宜接头的实例包括但不限于：GGGGS(SEQ ID No:15)、GGGSG(SEQ ID No:16)、GGSGG(SEQ ID No:17)、GSGGG(SEQ ID No:18)、GSGGGP(SEQ ID No:19)、GGEPS(SEQ ID No:20)、GGEGGGP(SEQ ID No:21)和GGEGGGSEGGGS(SEQ ID No:22)(如在WO2010/133828中所描述的)和GGGSGGGG(SEQ ID NO:23)。其他的接头可以包括具有以下序列基序中的一个或多个的序列：GGGS(SEQ ID NO:24)、TVLRT(SEQ ID NO:25)、TVSSAS(SEQ ID NO:26)和TVLSSAS(SEQ ID NO:27)。
本发明的抗CD3特异性结合分子融合构建体的具体实施方式包括那些α链和β链对，其中α链由包含SEQ ID NO:6-7的氨基酸序列的TCR可变结构域构成，和/或β链由包含SEQ ID NO:8-9的氨基酸序列的TCR可变结构域构成。所述α链和β链还可以包含恒定区，其包含非天然二硫键。α链的恒定结构域可以截短8个氨基酸。α链和/或β链的N端或C端可以通过接头融合至抗CD3 scFv抗体片段，所述接头选自SEQ ID NO:15-27。下表4中提供了此类抗CD3特异性结合分子融合构建体的某些优选实施方式：
α链 β链
SEQ ID No： SEQ ID No：
10 11
10 12
13 14
连接至抗CD3的优选特异性结合分子包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。
在本发明的范围内还包括所述抗CD3-TCR融合构建体的功能性变体(也称为表型沉默变体)。所述功能性变体优选与参考序列具有至少90％的同一性，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，但在功能上是等同的。
在一个进一步的方面中，本发明提供了编码本发明的特异性结合分子或特异性结合分子抗CD3融合物的核酸。在一些实施方式中，核酸是cDNA。在一些实施方式中，核酸可以是mRNA，例如，mRNA编码的双特异性分子(Stadler等，Nat Med.2017Jul；23(7):815-817)。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明的TCR的α链可变结构域的序列的核酸。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明特异性结合分子的β链可变结构域的序列的核酸。核酸可以是非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的。核酸序列可以根据所使用的表达系统进行密码子优化。如本领域技术人员所知，表达系统可以包括细菌细胞，如大肠杆菌、或酵母细胞、或哺乳动物细胞或昆虫细胞，或者其可以是无细胞表达系统。在一些实施方式中，分子可以是mRNA编码的双特异性抗体。
在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核酸的载体。优选地，载体是TCR表达载体。适宜的TCR表达载体包括例如γ-逆转录病毒载体，或者更优选地，慢病毒载体。更多详情可以参见Zhang2012及其参考文献(Zhang等，Adv Drug Deliv Rev.2012Jun 1；64(8):756–762)。
本发明还提供了携带本发明的载体(优选TCR表达载体)的细胞。适宜的细胞包括哺乳动物细胞，优选免疫细胞，甚至更优选T细胞。载体可包含在单个开放阅读框或两个不同的开放阅读框内进行编码的本发明核酸，分别编码α链和β链。另一个方面提供了携带第一表达载体和第二表达载体的细胞，所述第一表达载体包含编码本发明的特异性结合分子的α链的核酸，所述第二表达载体包含编码本发明的特异性结合分子的β链的核酸。此类细胞在过继治疗中特别有用。本发明的细胞可以是分离的和/或重组的和/或非天然存在的和/或工程化的。
由于本发明的特异性结合分子可用于过继性治疗，因此本发明包括非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞，特别是呈递本发明的特异性结合分子的T细胞。本发明还提供了呈递本发明的特异性结合分子的T细胞扩增群。存在许多适于用编码本发明的特异性结合分子的核酸(如DNA、cDNA或RNA)转染T细胞的方法(参见例如Robbins等，(2008)JImmunol.180:6116-6131)。表达本发明的特异性结合分子的T细胞将适用于基于过继性治疗的TB感染的治疗。如本领域技术人员将知晓的，有许多合适方法可以用于进行过继性治疗(参见例如Rosenberg等，(2008)Nat Rev Cancer 8(4))。
如本领域所熟知的，包括包含本发明特异性结合分子的蛋白在内的蛋白的体内产生可导致翻译后修饰。糖基化就是这样一种修饰，其包括寡糖部分与多肽链中限定的氨基酸的共价连接。例如，天冬酰胺残基或丝氨酸/苏氨酸残基是熟知的寡糖连接位置。特定蛋白质的糖基化状态取决于许多因素，包括蛋白质序列、蛋白质构象和某些酶的可用性。此外，糖基化状态(即，寡糖类型、共价键和连接总数)会影响蛋白功能。因此，当产生重组蛋白时，通常需要控制糖基化。受控糖基化已被用于改善基于抗体的治疗剂(Jefferis等，(2009)Nat Rev Drug Discov Mar；8(3):226-34.)。对于本发明的特异性结合分子，可以通过例如使用特定细胞系(包括但不限于哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)细胞)或通过化学修饰来控制糖基化。这种修饰可能是期望的，因为糖基化可以改善药代动力学、降低免疫原性并且更接近地模拟天然人蛋白(Sinclair和Elliott,(2005)Pharm Sci.Aug；94(8):1626-35)。在一些情况下，可以引入突变以控制和/或改善翻译后修饰。
为了向患者施用，本发明的特异性结合分子(优选与可检测标记或治疗剂相缔合或在转染的T细胞上表达)、本发明的特异性结合分子抗CD3融合分子、核酸、表达载体或细胞可以作为无菌药物组合物的一部分与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂一起提供。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用于患者的所需方法)。其可以以单位剂型提供，通常在密封容器中提供，并且可以作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒通常(但并非必需)将包括使用说明书。它可以包括多个所述单位剂型。
药物组合物可以适于通过任何适当途径施用，例如肠胃外(包括皮下、肌内、囊内或静脉内)、肠内(包括口服或直肠)、吸入或鼻内途径。这种组合物可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载体或赋形剂混合来制备。
本发明的物质的剂量可以在宽限度内变化，这取决于待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和状况等，特异性结合分子-抗CD3融合分子的合适剂量范围可以在25ng/kg至50μg/kg或1μg至1g的范围内。医师将最终确定所使用的适当剂量。在WO2017208018中提供了适宜的剂量方案的实例。
本发明的特异性结合分子、特异性结合分子-抗CD3融合分子、药物组合物、载体、核酸和细胞可以基本纯的形式提供，例如纯度为至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
本发明还提供：
·本发明的特异性结合分子、特异性结合分子-抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞，用于医学用途，特别是在治疗TB感染的方法中使用，
·本发明的特异性结合分子、特异性结合分子-抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞在制备用于治疗TB感染的药物中的用途，
·治疗TB感染的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的特异性结合分子-抗CD3融合分子，
·用于向人受试者施用的可注射制剂，其包含本发明的特异性结合分子、特异性结合分子-抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞。
本发明的特异性结合分子、特异性结合分子-抗CD3融合分子、核酸、药物组合物或细胞可以通过注射施用，如静脉内、皮下或直接瘤内注射。
治疗方法还可以包括单独、组合或顺序地施用一种或多种另外的抗细菌剂，包括适于治疗TB感染的那些。
本发明的每个方面的优选特征在细节上作必要修改后用于每个其他方面。本文提到的现有技术文件在法律允许的最大范围内援引并入本文。
附图说明
图1提供了与RLPAKAPLL HLA-E复合物结合的野生型可溶性TCR的α链和β链的氨基酸序列。CDR序列带有下划线。
图2显示了识别RLPAKAPLL HLA-E复合物的野生型可溶性TCR的Biacore结合数据。
图3提供了(A)突变的TCRα和(B)β可变结构域的示例性氨基酸序列。CDR带有下划线，与野生型序列相关的突变用粗体表示。
图4提供了引入突变的TCR可变结构域的TCR-抗CD3融合蛋白的示例性氨基酸序列。
图5显示了在用RLPAKAPLL肽脉冲和存在TCR-抗CD3融合蛋白的情况下，K562细胞上HLA-E的表面水平随时间的变化。
图6显示了在TCR-抗CD3融合蛋白存在下，(A)经RLPAKAPLL肽脉冲的THP1-KO细胞或(B)用inhA基因转导的细胞通过干扰素γ释放测定的T细胞的有效活化。
图7显示了在存在TCR-抗CD3融合蛋白的情况下，(A)用来自不同HLA等位基因的前导肽、一系列同源肽和来自其他微生物的已知HLA-E肽脉冲的细胞，或(B)一组表达不同HLA类型的抗原阴性癌细胞系通过干扰素γ释放测定的T细胞激活缺乏。
图8显示了(A)通过胱天蛋白酶(Caspase)3/7释放测定的抗原转导的HEK293T细胞，或(B)通过腺苷酸激酶释放测定的Mtb感染的单核细胞(显示为相对发光)在TCR-抗CD3融合蛋白存在下被T细胞特异性杀伤。
以下非限制性实施例进一步描述了本发明。
实施例
实施例1：用全inhA基因转导的细胞直接鉴定和定量RLPAKAPLLHLA-E复合物
来自分枝杆菌蛋白烯醇还原酶(inhA)的肽RLPAKAPLL在整个Mtb基因组中与HLA-E具有最强的预测结合亲和力。这种肽先前已显示在潜伏Mtb感染供体中引发T细胞应答(Joosten等，PLoS Pathog6，e1000782(2010))和靶向该肽的T细胞克隆已显示杀死Mtb感染的细胞(Prezzemolo等，Eur J Immunol 48，293-305(2018)；van Meijgaarden等，PLoSPathog 11，e1004671(2015))。为了研究RLPAKAPLL是否可以在细胞内加工并装载在HLA-E上，使完整的inhA基因在两个组成性表达HLA-E的淋巴细胞系中异位表达。
方法
使用netMHCpan4.0肽HLA结合预测算法评估肽结合亲和力(Jurtz等，J Immunol199，3360-3368(2017))。为了进行免疫纯化和定量，使用慢病毒转导，HLA-A*02：01/β2M(A2B2M)和inhA在组成性表达HLA-E的THP1和U937细胞中异位表达(U937-HLA-E杂合；THP-1-HLA-E*01：03纯合)。在分析之前，根据供应商的说明书培养细胞，收获和贮存在-80℃。使用顺序抗HLA-E抗体通过免疫亲和纯化HLA复合物。简言之，在含有非离子去垢剂NP-40的缓冲液中裂解细胞，通过离心去除细胞碎片，并使上清液穿过含有固定在蛋白A(A*02)或蛋白(E)-琼脂糖上的HLA-A*02特异性和HLA-E特异性抗体的树脂。洗涤柱，在0.5％三氟乙酸(TFA)中洗脱复合物。在0.1％TFA、5％乙腈中重构之前，通过真空离心使免疫纯化材料脱盐并减少体积，并通过LC-PRM-MS进行分析。将肽上样到Acclaim PepMap 100trap柱(100μm x20mm，ThermoFisher)上，并使用Easyspray柱(75μm x 500mm，ThermoFisher)分离。使用以下设置在Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪(ThermoFisher)上采集数据。四极分离(200-1200m/z范围)后，以120K分辨率(AGC 3E5，50ms)记录完整的MS1扫描。通过tMS(靶向MS)为MS2选择靶肽的前体离子。将四极分离设置为1.2Da，HCD片段为28NCE，MS2光谱记录在Orbitrap中，分辨率为60K(AGC 1E6，120ms)。开始/结束时间包括在方法中，在预期肽洗脱时间周围设置15分钟的窗口。紧接在分析之前，将稳定同位素标记(SIL)肽(JPTtechnologies)以100飞摩尔的精确摩尔量引入每个样品中。使用Thermo Freestyle软件分析数据。对于靶肽的定量估计，以10ppm的质量耐受性提取来自天然和SIL肽物质的3个片段离子的LC区域。使用以下设置启用峰值积分：基线窗口150、区域噪声因子1、峰值噪声因子1。使用SIL和天然肽之间的面积比计算每个片段离子的天然肽的摩尔量。对3个片段离子的摩尔量进行平均，并在考虑细胞数量后计算拷贝数。
结果
定量蛋白质组学显示，RLPAKAPLL HLA-E*01复合物以每个细胞20至50个拷贝的拷贝数在两个细胞系的表面呈递，几乎没有证据表明RLPAKAPLL在HLA-A*02：01等位基因上呈递。两种细胞系中一系列HLA前导序列的同时定量显示，RLPAKAPLL的呈递水平与这些已知的HLA-E配体相当。数据总结在下表中。
Figure BDA0004039763640000361
这些数据证实了异位表达的inhA蛋白的细胞处理产生了RLPAKAPLL HLA-E*01复合物，因此代表了由用Mtb抗原转导的细胞对HLA-E上呈递的Mtb衍生肽的首次直接鉴定和定量。这些数据表明RLPAKAPLL肽在细胞内产生，并由HLA-E分子以可检测的拷贝数呈递。因此，肽HLA-E复合物是通用的基于TCR的免疫治疗的一个有前途的靶点。
实施例2：结合至RLPAKAPLL HLA-E复合物的野生型TCR的鉴定
从用可溶性RLPAKAPLL HLA-E复合物淘选的TCR噬菌体文库中鉴定出两种野生型TCR，并随后制备为可溶性TCR。
方法
如前所述制备和淘选TCR噬菌体文库(参见例如WO2015136072)。αTCR和βTCR序列随后被克隆并制备为可溶性α-β异二聚体，如前所述(Boulter等，Protein Eng 16，707-711(2003)和WO03/020763)。简言之，使用标准方法将编码可溶性TCR的α和β胞外区的DNA序列分别克隆到表达质粒中，并分别转化到大肠杆菌菌株Rosetta(BL21pLysS)中。为了表达，细胞在添加1％甘油(+氨苄青霉素100μg/ml和34μg/ml氯霉素)的自诱导培养基中在37℃下生长2小时，然后将温度降至30℃并孵育过夜。用Triton裂解缓冲蛋白提取试剂(MerckMillipore)裂解收获的细胞球团。通过离心回收内含体球团，在Triton缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.1，0.5％Triton-X100，100mM NaCl，10mM NaEDTA)中洗涤两次，最后再混悬在无去垢剂的缓冲液中(50mM-Tris-HCl pH8.1，100mM-NaCl，10m NaEDTA)。对于重折叠，首先将内含体混合并稀释到溶解/变性缓冲液(6M盐酸胍、50mM Tris-HCl pH 8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、20mM DTT)中，然后在37℃下孵育30min。通过进一步稀释到重折叠缓冲液(100mM Tris pH 8.1、800或400mM L-精氨酸HCL、2mM EDTA、4M尿素、6.5mM半胱胺盐酸盐和1.9mM胱胺二酸盐)中开始重折叠。然后在5℃±3℃下，将重折叠的混合物用10L H2O/L重折叠透析18-20小时。在此之后，用10mM Tris pH 8.1(10L)两次更换透析缓冲液，并继续透析15小时。然后将透析后的混合物通过0.45μm纤维素过滤器过滤。然后将样品应用于
Figure BDA0004039763640000371
50HQ阴离子交换柱，并用0-500mM NaCl在20mM Tris pH 8.1中的梯度在6个柱体积上洗脱结合蛋白。在混合和浓缩之前，通过SDS PAGE鉴定峰级分。然后将浓缩样品应用于在Dulbecco的PBS缓冲液中预平衡的
Figure BDA0004039763640000372
200Increase10/300GL凝胶过滤柱(GEHealthcare)。混合和浓缩峰级分。
结果
可溶性WT TCR的氨基酸序列由SEQ ID NO 2和3(分别为TCR1α链和β链)以及SEQID NO 4和5(分别为TCP2α链和β链)给出(图1)。
实施例3：可溶性WT TCR的生物物理特征和特异性
使用表面等离子体共振(SPR)评估包含上述序列的可溶性WT TCR与RLPAKAPLLHLA-E复合物以及各种替代性pMHC复合物的结合。
方法
首先，制备可溶性HLA-E*01：01和HLA-E*01：03肽复合物。简言之，HLA-E重链(不含跨膜结构域，并含有C端生物素化标签AviTagTM序列GLNDIFEAQKIEWHE)和β2m作为内含体分别在大肠杆菌中表达，随后变性。在重折叠缓冲液(400mM L-Arg，100mM Tris-HCl pH 8.1，2mM EDTA，3.1mM胱胺，7.2mM半胱胺)中以30：5：2的重链：β2m：靶肽(Peptide ProteinResearch Ltd)的最终摩尔比将重链、β2m和肽进行重折叠。然后使用阴离子交换纯化可溶性的重折叠pHLA，随后如前所述进行体积排阻色谱(SEC)(Garboczi，Proc Natl Acad SciU S A 89，3429-3433(1992))。对于生物素化复合物，在阴离子交换后和SEC之前，根据生产厂商的说明书(Avidity BirA-500试剂盒)，用生物素蛋白连接酶(BirA)对复合物的3’生物素标签(GLNDIFEAQKIEWHE)进行生物素化，如在(O′Callaghan C等，Analyticalbiochemistry 266，9-15(1999))中所描述的。以类似的方式制备替代性pMHC复合物。使用BIAcoreTM T200通过表面等离子体共振(SPR)进行纯化的可溶性WT TCR与pHLA复合物的结合分析。简言之，将生物素化的同源pHLA固定在链霉亲和素偶联的CM5传感器芯片上。使用单独的游离生物素加载流动池1作为对照表面。所有测量均在25℃的Dulbecco PBS缓冲液(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)中进行，该缓冲液含有P20表面活性剂(0.005％)，流速为10-30μL/min，适用于T200。使用稳态亲和力分析确定结合特性。TCR以20-50μM的最高浓度进样，然后使用连续2倍稀释液进样7次或11次。假设Langmuir结合，计算KD值，并使用1：1结合模型分析数据(GraphPad Prism v8.3.0，用于稳态亲和力分析)
结果
可溶性WT TCR与RLPAKAPLL HLA-E*01：03复合物相互作用的结合特性列于下表。
K<sub>D</sub>(μM) k<sub>on</sub>(ka)(1/Ms) k<sub>off</sub>(kd) t<sub>1/2</sub>(sec)
TCR1 3.33 1.95E+05 0.49 1.41
TCR2 57 n/d n/d n/d
TCR2显示与RLPAKAPLL HLA-E*01：01相当的结合。TCR1和TCR2均未显示出对替代性pMHC复合物的识别，包括>15个通常呈递的HLA-A*02肽、由HLA-E*01呈递的各种前导肽、与HLA-A*02复合的RLPAKAPLL肽或与HLA-E同源物Mamu-E复合的RLPAKAPLL的混合物。图2显示了针对TCR2的代表性结合数据。
这些数据表明，这两种野生型TCR与靶pMHC复合物强烈特异性结合，因此对治疗开发特别有用。
实施例4：与RLPAKAPLL HLA-E复合物结合的高亲和力可溶性TCR和TCR抗CD3融合蛋白的产生
将上述实施例中描述的可溶性野生型TCR用作模板，以识别导致靶肽HLA-E复合物结合亲和力增加的突变，同时保持特异性。随后将可溶性高亲和力TCR制备为双特异性融合蛋白，其包含与抗CD3 scFv片段融合的可溶性TCR。
方法
使用定向分子进化和噬菌体展示选择产生高亲和力TCR(Li等，Nat Biotechnol23，349-354(2005))。如前所述制备双特异性融合蛋白(Liddy等，Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing.Nat Med18，980-987(2012))。高亲和力TCRβ链通过柔性接头与人源化CD3特异性scFv融合。所得融合蛋白的α链和β链作为内含体在大肠杆菌中表达，如前所述进行重折叠和纯化(Boulter等，Protein Eng 16，707-711(2003))。
使用BIAcoreTM 8K系统通过表面等离子体共振(SPR)对纯化的高亲和力TCR和融合蛋白进行结合分析。简言之，将生物素化的同源pHLA固定在链霉亲和素偶联的CM5传感器芯片上。使用单独的游离生物素加载流动池1作为对照表面。所有测量均在25℃的DulbeccoPBS缓冲液(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)中进行，缓冲液含有P20表面活性剂(0.005％)，流速为50-60μL/min，适用于8K。使用单循环动力学分析确定结合特性。对于单循环动力学，以100-1000nM的最高浓度进样可溶性高亲和力TCR或融合分子，然后使用连续2倍稀释进行四次进样。假设Langmuir结合，计算KD值，并使用1：1结合模型(BiacoreInsight Evaluation v2.0.15.12933)分析数据。解离阶段适合于单指数衰变方程，从而能够计算半衰期。根据koff/kon计算平衡常数KD。
结果
高亲和力TCR可变结构域的氨基酸序列分别在SEQ ID No 6&7和8&9中提供(图3)。TCR-抗CD3融合蛋白的氨基酸序列在SEQ ID No 10-14中提供(图4)。TCR-抗CD3融合蛋白与RLPAKAPLL HLA-E*01：03复合物之间相互作用的结合特性列于下表。
Figure BDA0004039763640000401
TCR-抗CD3融合蛋白中的每一个都显示出比与HLA-E结合的前导肽弱至少1000倍的KD。
这些数据表明，TCR-抗CD3融合蛋白对RLPAKAPLL HLA-E复合物具有亚纳摩尔亲和力和数小时的结合半衰期，并保持高水平的特异性。
实施例5：TCR-抗CD3融合蛋白稳定细胞表面RLPAKAPLL HLA-E复合物
TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)在脉冲追踪实验中因其结合和稳定细胞表面RLPAKAPLL HLA-E复合物的能力而受到挑战。
方法
稳定表达HLA-E*01：03的K562细胞在26℃下培养24h，然后在26℃用10μg/mLRLPAKAPLL脉冲16h。然后将细胞在37℃下孵育2h，之后将其重新悬浮在R10中，加入或不加入0.09μM TCR-抗CD3融合蛋白，并返回37℃。所有培养步骤均在5％CO2下进行。以15min、2h和4h间隔采集样品，立即洗涤一次，并在4℃下用抗人HLA-E-PE(3D12；BioLegend，SanDiego，CA，USA)或抗小鼠IgcG1 PE(MOPC-21；BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)染色30min。将样品洗涤两次，然后立即使用Sony SH800S(Sony Biotechnology，California，USA)进行分析，并使用FlowJo软件(FlowJoLLC，Ashland，OR，USA)分析细胞仪文件。
结果
随着时间的推移，用inhA53-61肽脉冲后对K562细胞表面HLA-E的监测显示，在所有评估的时间点在存在TCR-抗CD3融合蛋白时，HLA-E水平较高(图5)。
这些数据表明，细胞表面RLPAKAPLL HLA-E复合物在结合TCR-抗CD3融合蛋白后半衰期增加，因此表明这些TCR-抗CD3融合蛋白不仅有在细胞表面结合其靶标的潜力，而且有维持其持续性更长时间的潜力，这可导致杀伤增加。
实施例6：TCR-抗CD3融合蛋白介导针对靶细胞的有效T细胞活化
在用单链HLA-E二聚体转导的靶肽脉冲THP1-KO细胞(CRISPR缺失的B2M和CTIIA)存在下，测试TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U和a50b41)特异性激活T细胞(PBMC)的能力。将干扰素γ用作T细胞活化的指标。
方法
根据生产厂商的推荐(BD Biosciences)进行IFNγELISpot测定。简言之，将靶细胞以5×104个细胞/孔接种(三复孔)，并以5×104个细胞/孔与PBMC孵育。对于肽脉冲实验，靶细胞与不同浓度的肽(Peptide Protein Research Ltd)孵育2小时，并在用TCR-抗CD3融合分子铺板之前进行广泛洗涤。将板在37℃/5％CO2下孵育过夜，随后通过IFNγ检测，并使用BD ELISpot酶标仪(Immunospot Series5Analyzer，Cellular Technology Ltd，ShakerHeights，OH，USA)对斑点进行定量。
结果
对表达任一等位基因的THP-1-E细胞观察到IFNγ应答，E*01：01的EC50值低于1nM，E*01：03的EC50低于20pM(图6a)，即使在非常低的肽剂量下也是如此。针对a50b41也观察到了类似的应答。还检测到针对转导了inhA基因(+)的THP-1-E、U937、HEK293T和A549细胞的应答，表明TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)将T细胞重定向为趋向与HLA-E复合的内源性呈递的RLPAKAPLL肽(图6b)。相反，非转导细胞(-)无法支持融合蛋白介导的T细胞重定向。将非结合(NB)TCR-抗CD3融合蛋白用作阴性对照。
这些数据表明，TCR-抗CD3融合蛋白可以介导针对表达肽的靶细胞的有效T细胞活化。
实施例7：TCR-抗CD3融合蛋白介导特异性T细胞活化
测试TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)介导T细胞活化的能力，以对抗用来自所有HLA等位基因的前导肽、一系列同源肽和来自其他微生物的已知HLA-E肽脉冲的细胞。此外，还针对一组表达不同HLA类型的抗原阴性癌细胞系评估了T细胞活化。
方法
如上所述进行IFNγ ELISpot测定。
结果
所有测试的替代性肽HLA复合物均未能引发IFNy释放，进一步证明了TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)对RLPAKAPLL的特异性(图7a)。此外，TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)未诱导PBMC(与一组表达不同HLA类型的抗原阴性癌细胞系共培养)的IFNγ释放(图7b)。
总之，这些数据表明TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)特异性识别呈递与HLA-E复合的RLPAKAPLL肽的细胞。
实施例8：TCR-抗CD3融合蛋白介导抗原表达和Mtb感染的原代细胞的杀伤
TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)在抗原转导细胞或Mtb感染的原代人单核细胞和自体PBMC的共培养物中通过使用胱天蛋白酶或腺苷酸激酶释放测定测量细胞死亡来测试其效力。
方法
使用IncuCyte S3活细胞分析系统(Essen Bioscience，Newark，UK)对来自健康供体的inhA+HEK293T靶和PBMC进行杀伤测定。简言之，用CellTracker Deep Red Dye(Invitrogen，Carlsb ad，CA，USA)对靶细胞进行染色，并以10：1的效应物与靶点比(E：T)将其与PBMC一起接种在平底96孔板中，其中TCR-抗CD3融合蛋白浓度渐增。在使用泛T和NK细胞的实验中，这些效应物分别以5：1和1：1的E：T添加。加入IncuCyte胱天蛋白酶3/7绿色细胞凋亡测定试剂(Essen Bioscience)以追踪细胞凋亡，并在37℃/5％CO2下培养板，每3h拍摄一次图像。使用来自胱天蛋白酶-3/7绿色试剂的图像分析掩模识别信号来测量细胞凋亡，该信号与用于标记靶细胞群的CellTracker深红色探针重叠，以计算凋亡事件的数量/mm2。分析掩模包括尺寸和离心率过滤器，以从分析中排除效应细胞。对于ToxiLight测定(测量腺苷酸激酶释放)，在96孔圆形底板中与PBMC效应细胞和THP-1KO scHLA-E*01：03靶细胞建立共培养物，效应细胞与靶细胞的比例为4：1。在TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)或相应的单克隆TCR存在下，用PBMC培养不同比例的inhA阳性和inhA阴性靶细胞。48h后，使用ToxiLight非破坏性细胞毒性生物测定试剂盒(Lonza，Switzerland)分析上清液，以根据生产厂商的方案检测腺苷酸激酶。为了计算裂解百分比，添加ToxiLightTM 100％裂解试剂后测量100％裂解对照。从健康供体PBMC中分离出原代单核细胞，并以0.1的感染复数感染Mtb菌株H37Rv。将细胞与细菌孵育48小时，洗涤，并与自体PBMC建立共培养物，添加或不添加TCR-抗CD3融合蛋白。如上所述，在感染后24或48小时对上清液进行ToxiLight。
结果
HLA-E特异性TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)以剂量依赖性方式重定向健康供体PBMC以裂解抗原转导的HEK293T细胞，具有融合蛋白浓度降至0.03nM观察到的抗原阳性细胞的特异性杀伤(图8a)。从共培养12hr开始观察到杀伤，即使使用最高浓度的TCR-抗CD3融合蛋白，也没有检测到抗原阴性细胞的细胞溶解。对于Mtb感染的单核细胞，共培养物中检测到腺苷酸激酶的释放显著增加(图8b)，这归因于TCR-抗CD3融合蛋白(a42b20U)诱导的针对感染细胞的细胞溶解应答。在用含有非结合抗CD3结构域的修饰TCR-抗CD3融合蛋白处理的相同共培养物中没有特异性细胞死亡，证实了T细胞在观察到的TCR-抗CD3融合蛋白介导的细胞毒性活性中的主要作用。
这些数据表明，TCR-抗CD3融合蛋白可以介导免疫应答，诱导杀伤抗原转导的和Mtb感染的细胞。
Figure IDA0004039763700000011
Figure IDA0004039763700000021
Figure IDA0004039763700000031
Figure IDA0004039763700000041
Figure IDA0004039763700000051
Figure IDA0004039763700000061
Figure IDA0004039763700000071
Figure IDA0004039763700000081
Figure IDA0004039763700000091
Figure IDA0004039763700000101
Figure IDA0004039763700000111
Figure IDA0004039763700000121
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Figure IDA0004039763700000141
Figure IDA0004039763700000151
Figure IDA0004039763700000161
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Figure IDA0004039763700000181
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Figure IDA0004039763700000201
Figure IDA0004039763700000211
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Figure IDA0004039763700000321
Figure IDA0004039763700000331
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Figure IDA0004039763700000361

Claims (32)

1.一种特异性结合分子，其具有结合于与HLA-E复合的RLPAKAPLL(SEQ ID NO:1)的特性。
2.根据权利要求1所述的特异性结合分子，其包含TCRα链可变结构域和/或TCRβ链可变结构域，所述TCRα链可变结构域和/或所述TCRβ链可变结构域各自包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR是框架区和CDR是互补性决定区。
3.根据权利要求2所述的特异性结合分子，其中
(a)所述α链CDR具有以下序列：
CDR1–DSAIYN，
CDR2–IQSSQRE，
CDR3–CAVTNQAGTALIF，
其中任选地具有一个或多个突变，
和/或
(b)所述β链CDR具有以下序列：
CDR1–MNHEY，
CDR2–SVGAGI，
CDR3–CASSYSIRGSRGEQFF，
其中任选地具有一个或多个突变。
4.根据权利要求3所述的特异性结合分子，其中所述α链可变结构域框架区包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:2的氨基酸1-26，
FR2–SEQ ID NO:2的氨基酸33-49，
FR3–SEQ ID NO:2的氨基酸57-89，
FR4–SEQ ID NO:2的氨基酸103-112，
或者与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的相应序列，和/或
所述β链可变结构域框架区包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:3的氨基酸1-26，
FR2–SEQ ID NO:3的氨基酸32-48，
FR3–SEQ ID NO:3的氨基酸55-90，
FR4–SEQ ID NO:3的氨基酸107-115，
或者与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的相应序列。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的特异性结合分子，其中在所述α链CDR中的所述突变的一个或多个选自：在残基26和27之间的PDG插入、S28Q、Q54K、N94G、Q95E、A96S、T98V、A99Y、L100W、I101V，参照SEQ ID NO:2的编号，
和/或
在所述β链CDR中的所述突变的一个或多个选自：N28K、Y31F、V50L、A52V、G53D、Q104L，参照SEQ ID NO:3的编号。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的特异性结合分子，其中所述α链CDR1、CDR2和CDR3序列选自：
CDR1 PDGDQAIYN，或
CDR2 IQSSKRE
CDR3 CAVTGESGVYWVF，
和/或
所述β链CDR1、CDR2和CDR3序列选自
CDR1 MKHEF
CDR2 SLGVDI
CDR3 CASSYSIRGSRGELFF。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的特异性结合分子，其中
在所述α链中，CDR1是PDGDQAIYN，CDR2是IQSSKRE和CDR3是CAVTGESGVYWVF，和在所述β链中，CDR1是MKHEF，CDR2是SLGVDI和CDR3是CASSYSIRGSRGELFF。
8.根据前述任一项权利要求所述的特异性结合分子，其中所述α链可变结构域包含SEQID NO:6的氨基酸序列和所述β链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
9.根据权利要求2所述的特异性结合分子，其中
(a)所述α链CDR具有以下序列：
CDR1–DRGSQS，
CDR2–IYSNGD，
CDR3–CAVMDSSYKLIF，
其中任选地具有一个或多个突变，
和/或
(b)所述β链CDR具有以下序列：
CDR1–SEHNR，
CDR2–FQNEAQ，
CDR3–CASSLATNEQFF，
其中任选地具有一个或多个突变。
10.根据权利要求9所述的特异性结合分子，其中所述α链可变结构域框架区包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:4的氨基酸1-26
FR2–SEQ ID NO:4的氨基酸33-49
FR3–SEQ ID NO:4的氨基酸56-88
FR4–SEQ ID NO:4的氨基酸101-110，
或者与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的相应序列，和/或
所述β链可变结构域框架区包含以下序列：
FR1–SEQ ID NO:5的氨基酸1-26
FR2–SEQ ID NO:5的氨基酸32-48
FR3–SEQ ID NO:5的氨基酸55-91
FR4–SEQ ID NO:5的氨基酸104-112，
或者与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的相应序列。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的特异性结合分子，其中在所述α链CDR中的所述突变的一个或多个选自G29R、Q31R、S94R、S95E、K97E、L98I、I99S，参照SEQ ID NO:4的编号，
和/或
在所述β链CDR中的所述突变的一个或多个选自E28D、N51S、A97G、T98P、F102L，参照SEQID NO:5的编号。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的特异性结合分子，其中所述α链CDR1、CDR2和CDR3序列选自：
CDR1 DRRSRS，或
CDR2 IYSNGD
CDR3 CAVMDREYEISF，
和/或
所述β链CDR1、CDR2和CDR3序列选自
CDR1 SDHNR
CDR2 FQSEAQ
CDR3 CASSLGPNEQLF。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的特异性结合分子，其中
在所述α链中，CDR1是DRRSRS，CDR2是IYSNGD和CDR3是CAVMDREYEISF，和在所述β链中，CDR1是SDHNR，CDR2是FQSEAQ和CDR3是CASSLGPNEQLF。
14.根据权利要求1-2和权利要求9-13中任一项所述的特异性结合分子，其中所述α链可变结构域包含SEQ ID NO:7的任一氨基酸序列和所述β链可变结构域包含SEQ ID NO:9的任一氨基酸序列。
15.根据前述任一项权利要求所述的特异性结合分子，其是α-β异二聚体，具有α链TRAC恒定结构域序列和β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列。
16.根据权利要求15所述的特异性结合分子，其中非天然共价二硫键将所述α链的恒定结构域的残基与所述β链的恒定结构域的残基连接。
17.根据权利要求1至14中任一项所述的特异性结合分子，其是Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ型的单链形式，其中Vα和Vβ分别是TCRα和β可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和β恒定区，以及L是接头序列。
18.根据权利要求1至14中任一项所述的特异性结合分子，其包含
第一多肽链，其包含所述α链可变结构域和抗体的可变结构域的第一结合区；和
第二多肽链，其包含所述β链可变结构域和所述抗体的可变结构域的第二结合区，
其中相应多肽链缔合，以使得所述特异性结合分子能够同时结合RLPAKAPLL(SEQ IDNO:1)HLA-E复合物和所述抗体的抗原。
19.根据前述任一项权利要求所述的特异性结合分子，其与可检测标记、和/或治疗剂、和/或PK修饰部分结合。
20.根据权利要求19所述的特异性结合分子，其中抗CD3抗体共价连接至所述TCR的所述α链或β链的C端或N端，任选地通过接头序列连接。
21.一种特异性结合分子-抗CD3融合分子，其中所述α链可变结构域包含选自SEQ IDNO:6-7的氨基酸序列和所述β链可变结构域包含选自SEQ ID NO:8-9的氨基酸序列，和其中所述抗CD3抗体通过选自SEQ ID NO:15-27的接头序列共价连接至所述TCRβ链的N端或C端。
22.根据权利要求21所述的特异性结合分子-抗CD3融合分子，其包含
如在SEQ ID NO:10或13中所示的α链氨基酸序列，或者与在SEQ ID NO:10或13中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的α链氨基酸序列，如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，
和如在SEQ ID NO:11、或12、或14中所示的β链氨基酸序列，或者与在SEQ ID NO:11、或12、或14中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的β链氨基酸序列，如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
23.根据权利要求22所述的特异性结合分子-抗CD3融合分子，其包含
(a)对应于SEQ ID NO:10的α链氨基酸序列和对应于SEQ IDNO:11的β链氨基酸序列；
(b)对应于SEQ ID NO:10的α链氨基酸序列和对应于SEQ IDNO:12的β链氨基酸序列；或
(c)对应于SEQ ID NO:13的α链氨基酸序列和对应于SEQ IDNO:14的β链氨基酸序列。
24.一种编码根据前述任一项权利要求所述的TCRα链和/或TCRβ链的核酸。
25.一种包含权利要求24所述的核酸的表达载体。
26.一种细胞，其携带
(a)根据权利要求25所述的表达载体，所述表达载体在单个开放阅读框或两个不同的开放阅读框中编码根据权利要求1至23中任一项所述的TCRα和β可变链；或者
(b)第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码根据权利要求1至23中任一项所述的TCR的α可变链的核酸，和所述第二表达载体包含编码根据权利要求1至23中任一项所述的TCR的β可变链的核酸。
27.一种非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞，尤其是T细胞，其呈递根据权利要求1至23中任一项所述的特异性结合分子。
28.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的特异性结合分子、或根据权利要求21至23中任一项所述的特异性结合分子-抗CD3融合分子、根据权利要求24所述的核酸、根据权利要求25所述的表达载体、和/或根据权利要求26或权利要求27所述的细胞，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
29.权利要求1至20中任一项所述的特异性结合分子、权利要求21至23中任一项所述的特异性结合分子-抗CD3融合分子、权利要求24所述的核酸、权利要求26或权利要求27所述的细胞和/或权利要求28所述的药物组合物，其在医药中、优选在人受试者中使用。
30.权利要求1至20中任一项所述的特异性结合分子、或权利要求21至23中任一项所述的特异性结合分子-抗CD3融合分子、权利要求24所述的核酸、权利要求25所述的表达载体、权利要求26或权利要求27所述的细胞和/或权利要求28所述的药物组合物，其在用于治疗TB的方法中、优选在人受试者中使用。
31.一种产生根据权利要求1至20中任一项所述的特异性结合分子、或者根据权利要求21-23中任一项所述的特异性结合分子-抗CD3融合分子的方法，所述方法包括a)将根据权利要求26或27所述的细胞维持在表达所述特异性结合分子链的最佳条件下，和b)分离所述特异性结合分子链。
32.一种治疗TB的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的特异性结合分子或者根据权利要求21-23中任一项所述的特异性结合分子-抗CD3融合分子。
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