BR112020000762A2

BR112020000762A2 - anticorpo de dupla especificidade, moléculas polipeptídicas, ácido nucleico, célula hospedeira, composição farmacêutica e método de tratamento de uma doença ou condição

Info

Publication number: BR112020000762A2
Application number: BR112020000762-5A
Authority: BR
Inventors: Martin Hofmann; Felix Unverdorben; Sebastian Bunk; Dominik Maurer
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2017-07-14
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2020-07-21
Also published as: CN110914308A; PL3652215T3; WO2019012141A1; SG11202000027WA; CA3069842A1; LT3428194T; JP2020530762A; JP2019023184A; MA46299A; DK3428194T3; TW201908340A; CA3069610A1; CN110914307A; PT3652215T; TW202246330A; CY1124835T1; US20190016803A1; AU2018298884A1; SI3428194T1; PE20200614A1

Abstract

A presente invenção se refere a uma molécula polipeptídica biespecífica, que compreende uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica, que fornecem uma região ligante derivada de um receptor de célula T (TCR, T-cell receptor) específica para um epítopo associado ao complexo principal de histocompatibilidade e uma região ligante derivada de um anticorpo capaz de recrutar células imunes efetoras humanas ao se ligar a um antígeno superficial das referidas células, assim como a métodos de produzir a molécula polipeptídica biespecífica e aplicações da mesma.

Description

“ANTICORPO DE DUPLA ESPECIFICIDADE, MOLÉCULAS POLIPEPTÍDICAS, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO”

[001] A presente invenção se refere a uma molécula polipeptídica biespecífica, que compreende uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica, que fornecem uma região ligante derivada de um receptor de célula T (TCR, “T-cell receptor”) específica para um epítopo associado ao complexo principal de histocompatibilidade e uma região ligante derivada de um anticorpo capaz de recrutar células imunes efetoras humanas ao se ligar a um antígeno superficial das referidas células, assim como a métodos de produzir a molécula polipeptídica biespecífica e aplicações da mesma.

ASPECTOS GERAIS DA INVENÇÃO

[002] Com o desenvolvimento de tecnologias de clonagem molecular e o aperfeiçoamento da engenharia de anticorpos, surgiram diversos tipos de anticorpos biespecíficos, que podem ser usados para otimizar a atividade biológica e a aplicação clínica. Para terapia anticâncer, foram desenvolvidos anticorpos biespecíficos projetados para redirecionar a atividade de células efetoras imunes para o sítio tumoral, que se ligam especificamente a um epítopo em células tumorais e a um segundo domínio de ligação específico para um epítopo nas células efetoras imunes. Anticorpos biespecíficos que modificam a especificidade de células imunes efetoras foram desenvolvidos em vários formatos. Alguns deles não possuem a região cristalizável (Fc), e outros são derivados de IgG e possuem estrutura simétrica ou assimétrica. Além de redirecionar células efetoras para o sítio do câncer, os anticorpos biespecíficos possuem outras aplicações bem estabelecidas. Pode-se, por exemplo, desenvolver anticorpos biespecíficos capazes de inibir duas moléculas sinalizadoras relacionadas entre si para sobrepujar a resistência inata ou adquirida e para atuar como inibidores mais eficazes da angiogênese. Também se podem empregar anticorpos biespecíficos como imunoestimulantes para tratamento de várias doenças, incluindo o câncer — uma estratégia terapêutica que vem se mostrando promissora. Anticorpos biespecíficos que simulam a função do fator VIII também podem ser usados para tratar hemofilia A. Outras perspectivas de aplicação de anticorpos biespecíficos são doenças ósseas, infecções e doenças do sistema nervoso central (ver revisão em Yang F. et al., Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies. Int J Mol Sci. 2016 Dec 28;18(1)).

[003] As células T expressam complexos de receptores de células T (TCR, “T-cell receptor”) capazes de induzir respostas imunes específicas para antígenos. A interação do complexo formado pelo peptídeo antigênico e pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC, “major histocompatibility complex”) classe I com a célula-alvo portadora do TCR induz a formação de uma sinapse imune que facilita a sinalização mediada por correceptores do CD3, que são componentes do complexo de sinalização por TCR. A cascata de sinalização direciona a morte celular induzida por células T que expressam o antígeno e atuam liberando e transferindo granzimas e perforina para a célula-alvo.

[004] No passado, a descoberta e a produção de domínios variáveis de cadeia única de anticorpos (scFvs, descritos por Bird et al., 1988) foi importante para o desenvolvimento de anticorpos biespecíficos. Este conceito levou ao desenvolvimento das moléculas BiTE e à validação clínica das mesmas como uma poderosa droga antileucêmica (Baeuerle, P.A.; Reinhardt, C.

Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res. 2009, 69, 4941–4944). No câncer, anticorpos biespecíficos que interagem simultaneamente com a subunidade épsilon do CD3 e com um antígeno superficial tumoral iniciam a morte celular tumoral mediada por célula T e, ao mesmo tempo, contornam a necessidade de interação direta do TCR com o MHC classe I complexado com antígeno. Isso expande o repertório de células T capazes de reconhecer o tumor e de atuar como células efetoras (Baeuerle, P.A.; Reinhardt, C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res. 2009, 69, 4941–4944).

[005] Stieglmaier J., et al. (Utilizing the BiTE (bispecific T-cell engager) platform for immunotherapy of cancer. Expert Opin Biol Ther.

2015;15(8):1093-9) descreveram diversas abordagens à imunoterapia baseada em células T do câncer, que vêm sendo investigadas; dentre elas estão as estruturas de anticorpos do tipo BiTE® (“bispecific T-cell engager”), que possuem desenho e mecanismo de ação únicos. Essas moléculas são construídas por meio de um processo de engenharia genética no qual as menores porções dos domínios ligantes de anticorpos monoclonais suficientes para conferir especificidade contra antígenos associados à superfície tumoral e contra a molécula CD3 associada ao receptor de célula T são ligadas uma à outra de modo a formar uma única cadeia polipeptídica. A interação concomitante com o antígeno da célula-alvo e com o CD3 promove ativação policlonal de células T citotóxicas, o que acarreta lise das células-alvo. O blinatumomabe é um BiTE® que atua contra CD19 e que está sendo investigado em diversas doenças malignas de células B e foi aprovado recentemente pela FDA dos EUA para tratamento de leucemia linfoblástica aguda de células B negativa para o cromossomo Filadélfia recorrente ou refratária com o nome comercial BLINCYTO™. A plataforma BiTE® é uma das mais avançadas para imunoterapia clínica usando células T.

[006] Constatou-se, porém, que moléculas pequenas biespecíficas como as do tipo BiTE® possuem deficiências, tais como baixo rendimento em produção, necessidade de processos de purificação difíceis, propensão a agregação e meia-vida sérica muito reduzida. Para contornar as limitações intrínsecas dessa classe de moléculas, foram desenvolvidas diversas estruturas biespecíficas baseadas em IgG humana a partir de um conceito envolvendo anticorpos semelhantes à imunoglobulina G (IgG) concebido há mais de duas décadas, quando Morrison e colaboradores fundiram peptídeos ligantes flexíveis às cadeias C-terminais de cadeias pesadas de IgG e depois acrescentaram diversos domínios variáveis de cadeia única com diferentes especificidades de ligação (Coloma, M.J. and Morrison, S.L. (1997) Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol. 15, 159– 163). As moléculas podem ser diferenciadas de anticorpos ‘normais’ porque apresentam função dupla. Inicialmente, os anticorpos biespecíficos (bsAb) tiveram seu desenvolvimento restrito a pesquisas nos meios acadêmicos e de biotecnologia em razão de dificuldades técnicas. Contudo, o rápido desenvolvimento tecnológico permitiu a criação, produção e desenvolvimento de derivados de proteínas recombinantes, o que renovou o interesse da indústria farmacêutica e impulsionou o desenvolvimento de pesquisas em bsAb.

Atualmente estão disponíveis diversos formatos diferentes bsAb apropriados para o desenvolvimento de proteínas terapêuticas. (Ver revisões de Gramer, mAbs. 2013;5(6):962-973, Weidle, Cancer Genomics Proteomics. 2013 Nov- Dec;10(6):239-50, Brinkmann, mAbs. 2017 Feb/Mar;9(2):182-212.) Resumidamente, a inclusão de porções de fragmentos cristalizáveis (Fc) formados pelos domínios CH2 e CH3 permitiu aumentar a produtividade, simplificar o processo de purificação e melhorar a estabilidade. A meia-vida sérica de tais drogas à base de IgG também foi prolongada devido ao aumento do tamanho e à interação com a porção Fc do FcRN, o receptor humano de Fc.

[007] Outro fator que promoveu o desenvolvimento de formatos biespecíficos à base de IgG foi a possibilidade de incluir mutações artificiais que facilitam a heterodimerização de dois domínios diferentes de CH3, conectando assim duas cadeias diferentes de polipeptídeos. O conceito básico foi introduzido por Ridgway JB, et al. em “'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21”, que revelou a abordagem de “chave e fechadura”, uma técnica nova e eficaz para criar homodímeros capazes de promover a heterodimerização de cadeias pesadas de anticorpos. Nesta técnica, a “chave” é criada substituindo-se um aminoácido pequeno por outro grande no domínio CH3 da T366Y, uma imunoadesina de CD4 e IgG. A “chave” é projetada para ser introduzida em uma “fechadura” formada pelo domínio CH3 em um anticorpo anti-CD3 humanizado criado por uma substituição específica Y407T, onde um resíduo maior é trocado por outro menor. O híbrido entre anti-CD3/CD4 e IgG corresponde a até 92% do total da proteína A purificada após expressão simultânea dessas duas cadeias pesadas junto com a cadeia leve anti-CD3. Em contraste, apenas 57% dos híbridos anti-CD3/CD4-IgG são recuperados após expressão simultânea em que cadeias pesadas continham domínios CH3 do tipo selvagem. A técnica de chave- e-fechadura permite construir um híbrido de anticorpo e imunoadesina e, provavelmente, outros produtos terapêuticos bifuncionais contendo Fc, incluindo imunoadesinas biespecíficas e anticorpos biespecíficos. Em “Atwell et al., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J Mol Biol, 1997” foi revelada uma mutação que gera uma combinação chave-e-fechadura, onde a chave é gerada por T366W e a fechadura por T366S, L368A e Y407V no domínio CH3 do domínio Fc, o que acarretou melhor heterodimerização. O conceito foi aperfeiçoado ainda mais pela introdução de resíduos de cisteína para formar pontes bissulfeto estáveis entre os domínios heterodiméricos de CH3, conforme descrito em “Merchant et al. An Efficient Route to Human Bispecific IgG, Nature Biotechnology, 1998”.

[008] Outros conceitos de produção de moléculas heterodiméricas foram revelados por Muda et al., 2011, PEDS (“Therapeutic assessment of SEED: a new engineered antibody platform designed to generate mono- and bispecific antibodies”), Gunasekaran et al., 2010, J Biol Chem (“Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG”), Moore et al., 2011, MAbs (“A novel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens”) e Von Kreudenstein et al., 2013, MAbs (“Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability: quality by molecular design”). Esses conceitos foram resumidos e revistos por Ha et al. 2016, Front Immunol (“Immunoglobulin Fc Heterodimer Platform Technology: From Design to Application in Therapeutic Antibodies and Proteins”) e Liu et al., 2017, Front Immunol (“Fc Engineering for Developing Therapeutic Bispecific Antibodies and Novel Scaffolds”).

[009] Quando componentes de Fc como domínios de dobradiça, CH2 e CH3 ou partes dos mesmos foram introduzidos em moléculas biespecíficas, surgiram problemas de imobilização inespecífica dessas moléculas induzida por interações entre Fc e o receptor de Fc-gama (FcgR). O FcgR é formado por diversas moléculas da superfície celular (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIb e FcgRIII), que possuem diferentes afinidades de ligação a epítopos exibidos por componentes Fc de moléculas IgG. Como esse tipo imobilização inespecífica (i.é, que não é induzida por nenhum dos dois domínios ligantes de uma molécula biespecífica) é desfavorável devido à sua influência na farmacocinética da molécula e à ativação de células efetoras imunes longe do alvo, foram identificadas diversas variantes de Fc e mutações que promovem ablação de FcgR.

[0010] Morgan et al., 1995, Immunology (“The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, FcyRI and FcyRIII binding”) revelaram a troca de resíduos nas posições 233 a 236 da IgG1 humana e a sequência correspondente derivada do IgG2 humano, o que eliminou as ligações a FcgRI e ao C1q e diminuiu a ligação ao FcgRIII.

[0011] EP1075496 revela anticorpos e outras moléculas que contêm Fc e variações na região Fc (233P, 234V, 235A, ausência de resíduo ou G em 236, 327G, 330S e 331S), onde o anticorpo recombinante é capaz de se ligar à molécula alvo sem indução significativa de lise dependente do complemento ou destruição do alvo mediada por células.

[0012] Moléculas redirecionadoras com atividade dupla (DART, “dual affinity retargeting“) são usadas a fim de criar, por exemplo, um redirecionamento otimizado de morte celular induzida por células T de linfoma de células B. A tecnologia DART original foi descrita por Moore et al. (Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma, Blood. 2011 Apr 28;117(17):4542-51). Quando foram comparadas com um anticorpo biespecífico de cadeia única com sequências Fv idênticas às de anticorpos anti-CD19 e anti-CD3, as moléculas DART se mostraram mais potentes em direcionar a lise de células B. A tecnologia DART foi aperfeiçoada com a introdução de moléculas DART-Fc, descritas por Root et al., 2016 Antibodies (“Development of PF-06671008, a Highly Potent Anti-P- cadherin/Anti-CD3 Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment of Cancer”). Esta molécula combina a alta potência dos DARTs com a meia-vida sérica prolongada das moléculas à base de Fc, entre outras características positivas.

[0013] O αβTCR (TCR) reconhece peptídeos antigênicos apresentados por MHC e é responsável pela especificidade das células T. As cadeias α e β do TCR ambas possuem domínios variáveis (V) e constantes. Os domínios V participam da ligação de peptídeos antigênicos, e os domínios constantes trespassam a membrana da célula T. A partir da análise da estrutura cristalina do TCR ligado ao complexo de peptídeo com MHC, constatou-se que as regiões determinantes de complementaridade (CDR) tipo 3 das cadeias V α e Vβ interagem preferivelmente com o peptídeo, ao passo que os CDRs 1 e 2 interagem com MHC. Contudo, também foi descrito o reconhecimento do peptídeo pelo CDR 1 e do MHC pelo CDR 3 (Piepenbrink et al., The basis for limited specificity and MHC restriction in a T cell receptor interface, Nat Commun, 2013; 4, 1948). O TCR αβ heterodimérico está intimamente associado com proteínas CD3, CD4 ou CD8 e outras proteínas de adesão ou transdutoras de sinal. A ligação de um peptídeo antigênico à região TCR V inicia a ativação de células T mediada pela transdução de sinais por meio das proteínas citoplasmáticas CD3 e CD4 ou CD8 dos domínios constantes de TCR.

[0014] Os TCRs de cadeia única (scTCRs, “single-chain TCRs”) proporcionam vantagens significativas em relação ao TCR completo para engenharia, expressão de proteínas solúveis e potencial clínico. Da perspectiva da expressão de proteínas solúveis (i.é., fabricação), os scTCRs são produzidos na forma de polipeptídeo único, o que evita a necessidade de produção separada de cada uma das cadeias de TCR e permite produzir quantidades maiores do scTCR montado corretamente, que se liga ao ligante apropriado formado por peptídeo e MHC. Essa característica permite obter a produtividade necessária para aplicações clínicas. Finalmente, também do ponto de vista clínico, os scTCRs formados apenas por regiões V (scTv) podem ser formatados como agentes terapêuticos ou diagnósticos da mesma forma que fragmentos de scFv.

[0015] US 2006-0166875 revela um receptor de célula T de cadeia única (scTCR) que compreende um segmento formado por uma região de cadeia alfa variável de TCR fundida à terminação N da sequência extracelular da região constante da cadeia alfa do TCR, um segmento beta formado por uma região variável de cadeia beta de TCR fundida à terminação N da sequência extracelular de uma região constante de cadeia beta de TCR, uma sequência ligante que liga a terminação C do segmento alfa à terminação N do segmento beta ou vice versa, sendo que as sequências extracelulares da região constante dos segmentos alfa e beta são ligadas por uma fonte bissulfeto, e o comprimento da sequência ligante e a posição da ligação bissulfeto são tais que as sequências da região variável dos segmentos alfa e beta são ambos orientados substancialmente na forma observada em receptores nativos de células T alfa e beta. Também são revelados complexos de dois ou mais dos referidos scTCRs e emprego de scTCRs em diversas aplicações terapêuticas e de triagem. Em contraste com os scTCRs descritos em US 2006-0166875, US 2012-0252742 revela um TCR humano de cadeia única solúvel sem domínios constantes, formado apenas pelos fragmentos variáveis do TCR (scTv), que pode ser usado para diversas finalidades, tais como tratamento do câncer e de doenças virais ou autoimunes.

[0016] McCormack E, et al. (“Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T- cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunol Immunother. 2013 Apr;62(4):773-85”) revelaram que NY-ESO-1 e LAGE-1 são dois antígenos de câncer e testículo cujo perfil é ideal para imunoterapia antitumoral, pois sofrem sobrerregulação em diversos tipos de câncer, apresentam expressão fortemente restrita em tecidos normais e compartilham um epítopo comum com HLA-A*0201 em sua porção 157-165. Os autores apresentaram dados descrevendo a especificidade da atividade antitumoral de um ImmTAC bifuncional formado por um receptor de células T (TCR) solúvel com alta afinidade para NY-ESO-1157-165 fundido a um scFv anti-CD3. O reagente assim formado, denominado ImmTAC-NYE, mostrou-se capaz de matar células de linhagem tumoral positivas para HLA-A2 e células de CPCNP positivas para HLA-A2 e LAGE-1 recém-isoladas. Estudos com imagens ópticas in vivo mostraram a ação in vivo de TCRs de alta afinidade e específicos para NYESO com marcação fluorescente contra tumores positivos para HLA-A2 e NY-ESO- 1157-165 em modelos de xenoenxerto em camundongos. A eficácia in vivo do ImmTAC-NYE foi testada em um modelo tumoral no qual linfócitos humanos foram enxertados simultaneamente de forma estável em camundongos NSG imunodeficientes portadores de xenoenxertos. Foi observada eficácia tanto para prevenção tumoral como em modelos com tumores estabelecidos por meio de uma leitura de fluorescência de GFP. O RT-PCR quantitativo foi utilizado para analisar a expressão de antígenos NY-ESO-1 e LAGE-1 em 15 tecidos normais, 5 linhagens de células cancerosas, 10 amostras de CPCNP e 10 amostras de câncer de ovário. De modo geral, as amostras tumorais expressaram o RNA de LAGE-1 mais frequentemente e em níveis mais elevados que o RNA de NY- ESO-1. Os ImmTACs compreendem um Fv de cadeia única derivado do anticorpo anti-CD3 UCHT-1, que se liga de forma covalente à terminação C ou N da cadeia alfa ou beta do TCR.

[0017] EP1868650 refere-se a moléculas de diacorpos e uso das mesmas no tratamento de diversas doenças e condições, incluindo doenças imunológicas, doenças infecciosas, intoxicação e câncer. As moléculas de diacorpos compreendem duas cadeias polipeptídicas que se associam de modo a formar pelo menos dois sítios de ligação de epítopos, que podem reconhecer epítopos idênticos ou diferentes do mesmo antígeno ou de antígenos diferentes, sendo que tais antígenos podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. As cadeias polipeptídicas de uma molécula de diacorpo podem ser ligadas de forma covalente por meio de ligações covalentes não-peptídicas, incluindo-se, sem limitação, ligações bissulfeto de resíduos de cisteína localizados em ambas as cadeias polipeptídicas. Em algumas configurações específicas, as moléculas de diacorpos possuem também uma região Fc, que é aqui revelada porque permite conferir à molécula propriedades semelhantes às dos anticorpos (p.ex. meia-vida longa). EP1868650 requer a presença de regiões ligantes de domínios variáveis de cadeia leve ou de cadeia pesada de uma imunoglobulina e inclui uma extensa discussão sobre ligantes de receptores de Fc funcionais.

[0018] WO 2016/184592 A1 revela moléculas biespecíficas nas quais uma das especificidades é derivada de um TCR e a outra de um anticorpo direcionado contra um antígeno ou epítopo superficial de linfócitos, mas não revela o arranjo específico dos elementos do TCR e das regiões variáveis de anticorpos conforme aqui revelados.

[0019] EP2258720A1 refere-se a uma proteína de fusão de receptores funcionais de células T (TCR) (TFP) que reconhece e se liga a pelo menos um epítopo apresentado por MHC e contém pelo menos uma sequência de aminoácidos que reconhece um antígeno e se liga ao mesmo.

[0020] É objeto da presente invenção fornecer moléculas biespecíficas aperfeiçoadas capazes de atuar contra complexos de peptídeo com MHC e que sejam fáceis de produzir, apresentem alta estabilidade e possuam alta potência de ligação aos respectivos epítopos antigênicos. Outros objetos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão aparentes após o estudo da descrição a seguir e das configurações específicas da mesma, assim como dos respectivos exemplos.

[0021] Em um primeiro aspecto da invenção, o objeto acima é solucionado fornecendo-se um anticorpo de dupla especificidade selecionado do grupo de moléculas formado por uma primeira cadeia polipeptídica e por uma segunda cadeia polipeptídica, sendo que: a primeira cadeia polipeptídica compreende uma primeira região ligante com domínio variável (VD1) de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno da superfície celular de uma célula efetora imune; e uma primeira região ligante de um domínio variável (VR1) de um TCR que se liga especificamente a um epítopo de um peptídeo associado a MHC; e um primeiro ligante (LINK1) que conecta os referidos domínios; a segunda cadeia polipeptídica compreende uma segunda região ligante de um domínio variável (VR2) de um TCR que se liga especificamente a um epítopo de um peptídeo associado a MHC; e uma segunda região ligante de um domínio variável (VD2) de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno da superfície celular de uma célula efetora imune humana; e um segundo ligante (LINK2) que conecta os referidos domínios; sendo que a primeira região ligante (VD1) e a referida segunda região ligante (VD2) se associam de modo a formar um primeiro sítio de ligação (VD1)(VD2) que se liga ao epítopo da molécula da superfície celular; a referida primeira região ligante (VR1) e a referida segunda região ligante (VR2) se associam de modo a formar um segundo sítio de ligação (VR1)(VR2) que se liga ao referido epítopo peptídico associado ao MHC; onde as duas cadeias polipeptídicas referidas anteriormente são fundidas de modo a formar domínios de dobradiça de IgG humana e/ou domínios de Fc de IgG humana ou porções dimerizantes dos mesmos; e onde as duas cadeias polipeptídicas referidas anteriormente são conectadas uma à outra por ligações covalentes e/ou não-covalentes entre os referidos domínios de dobradiça e/ou os domínios Fc; e onde a referida molécula de polipeptídeo de dupla especificidade é capaz de se ligar simultaneamente à molécula da superfície celular e ao epítopo peptídico associado a MHC; e moléculas polipeptídicas de dupla especificidade, onde a ordem das regiões ligantes das cadeias polipeptídicas é uma dentre VD1-VR1, VD1- VR2, VD2-VR1, VD2-VR2, VR1-VD1, VR1-VD2, VR2-VD1, VR2-VD2 e onde os domínios são conectados um ao outro por LINK1 ou por LINK2.

[0022] Prefere-se uma molécula polipeptídica de dupla especificidade que compreende uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica, onde a primeira cadeia polipeptídica compreende: uma primeira região ligante de um domínio variável (VD1) derivado de um anticorpo capaz de recrutar células imunes efetoras humanas ao se ligar especificamente a um antígeno superficial das referidas células, uma primeira região ligante de um domínio variável (VR1) derivado de um TCR específico para um epítopo peptídico associado a MHC e uma porção ligante inicial (LINK1) que conecta os dois domínios; e a segunda cadeia polipeptídica compreende uma segunda região ligante de um domínio variável (VR2) derivada de um TCR específico para um epítopo peptídico associado a MHC, uma segunda região ligante de um domínio variável (VD2) derivada de um anticorpo capaz de recrutar células imunes efetoras humanas ao se ligar especificamente a um antígeno superficial de tais células e uma segunda porção ligante (LINK2) que conecta os dois domínios; sendo que a referida primeira região ligante (VD1) e a referida segunda região ligante (VD2) se associam de modo a formar um primeiro sítio de ligação (VD1)(VD2) que se liga ao epítopo da molécula da superfície celular, e a referida primeira região ligante (VR1) e a referida segunda região ligante (VR2) se associam de modo a formar um segundo sítio de ligação (VR1)(VR2) que se liga ao referido epítopo associado a MHC; onde pelo menos uma das referidas cadeias polipeptídicas é conectada em sua extremidade C-terminal às regiões de dobradiça, aos domínios CH2 e/ou CH3 ou a partes dos mesmos derivadas de IgG humana e onde a referida molécula polipeptídica de dupla especificidade é capaz de se ligar simultaneamente ao antígeno celular efetor imune e ao epítopo peptídico associado a MHC.

[0023] Preferivelmente, a molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a presente invenção se liga com alta especificidade tanto ao antígeno efetor imune celular como a um epítopo antigênico específico apresentado na forma de complexo de peptídeo com MHC, p.ex., com afinidade de ligação (KD) de cerca de 100 nM ou menos, cerca de 30 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos, cerca de 3 nM ou menos ou cerca de 1 nM ou menos, p.ex., medida por interferometria de biocamada conforme descrito no Exemplo 6 ou conforme determinado por citometria de fluxo.

[0024] As moléculas de polipeptídeo de dupla especificidade de acordo com a presente invenção são aqui exemplificadas por uma molécula polipeptídica de dupla especificidade que compreende uma primeira cadeia polipeptídica que compreende SEQ Nº 16 e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende SEQ Nº 17.

[0025] Em um segundo aspecto da invenção, o objeto apresentado anteriormente é solucionado fornecendo-se um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma primeira cadeia polipeptídica e/ou uma segunda cadeia polipeptídica conforme aqui revelado ou um ou mais vetores de expressão que compreendem tal ácido nucleico. Em um terceiro aspecto da invenção, o objeto apresentado anteriormente é solucionado fornecendo-se uma célula hospedeira que compreende os vetores conforme aqui definidos.

[0026] Em um quarto aspecto da invenção, o objeto apresentado anteriormente é solucionado fornecendo-se uma molécula peptídica de dupla especificidade de acordo com a presente invenção, compreendendo a expressão apropriada dos referidos vetores de expressão, compreendendo os ácidos nucleicos conforme revelados em uma célula hospedeira apropriada e purificação apropriada das moléculas de células e/ou do respectivo meio.

[0027] Em um quinto aspecto da invenção, o objeto apresentado anteriormente é solucionado fornecendo-se uma composição farmacêutica que compreende a molécula peptídica de dupla especificidade de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico ou os vetores de expressão de acordo com a invenção ou a célula de acordo com a invenção, junto com um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0028] Em um sexto aspecto da invenção, a invenção se refere à molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, aos ácidos nucleicos ou aos vetores de expressão de acordo com a invenção, à célula de acordo com a invenção ou à composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso em medicina.

[0029] Em um sétimo aspecto da invenção, a invenção se refere à molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, aos ácidos nucleicos ou aos vetores de expressão de acordo com a invenção, à célula de acordo com a invenção ou à composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio conforme aqui revelado, que pode ser um câncer ou uma doença infecciosa.

[0030] Em um oitavo aspecto da invenção, a invenção se refere a um método de tratamento de uma doença ou distúrbio que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, dos ácidos nucleicos ou dos vetores de expressão de acordo com a invenção, da célula de acordo com a invenção ou da composição farmacêutica de acordo com a invenção.

[0031] Em um nono aspecto da invenção, a invenção se refere a um método de produção de uma resposta imune em um paciente ou sujeito de pesquisa que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção ou da composição farmacêutica de acordo com a invenção.

[0032] Em um décimo aspecto, a invenção se refere a um método de matar células-alvo em um paciente ou sujeito de pesquisa, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de uma molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a presente invenção.

[0033] Conforme mencionado anteriormente, a invenção fornece moléculas polipeptídicas de dupla especificidade novas e aperfeiçoadas. A molécula geralmente compreende uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica, sendo que essas cadeias fornecem, conjuntamente, um domínio variável de um anticorpo específico para um epítopo de um antígeno superficial de uma célula efetora imune e um domínio variável de um TCR específico para um epítopo peptídico associado a MHC, tais como, por exemplo, um epítopo de câncer ou epítopos apresentados em razão de infecção (p.ex. infecções virais como o HIV). Domínios variáveis derivados de anticorpos e de TCR são estabilizados por ligações covalentes entre segmentos Fc ou porções dos mesmos localizados em ambas as cadeias polipeptídicas. A referida molécula de polipeptídeo de dupla especificidade é capaz de se ligar simultaneamente a um receptor da superfície celular e a um epítopo peptídico associado a MHC.

[0034] No contexto da presente invenção, os domínios variáveis (VD1) e (VD2) são derivados de anticorpos capazes de recrutar células efetoras imunes humanas ao se ligarem especificamente a um antígeno superficial das referidas células efetoras. Em uma configuração preferida, os referidos anticorpos se ligam especificamente a epítopos do complexo de TCR com CD3 de células T humanas, que compreende as cadeias peptídicas TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD e CD3 .

[0035] A molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a presente invenção compreende uma primeira cadeia polipeptídica e uma segunda cadeia polipeptídica, que criam uma primeira região ligante (VD1) e uma segunda região ligante (VD2), respectivamente, de um domínio variável derivado de um anticorpo capaz de recrutar células imunes efetoras humanas ao se ligar de forma específica a um antígeno superficial das referidas células. A primeira região ligante (VD1) e a referida segunda região ligante (VD2) se associam de modo a formar um primeiro sítio de ligação (VD1)(VD2) que se liga ao antígeno superficial da célula efetora imune. Outrossim, a primeira e a segunda cadeias polipeptídicas da molécula polipeptídica compreendem uma primeira região ligante (VR1) e uma segunda região ligante (VR2), respectivamente, ambas oriundas de um domínio variável derivado de um TCR específico para um epítopo peptídico associado a MHC. A referida primeira região ligante (VR1) e a referida segunda região ligante (VR2) se associam de modo a formar um segundo sítio de ligação (VR1)(VR2) que se liga ao referido epítopo peptídico associado ao MHC. Em uma configuração da molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, a ordem e a orientação das regiões da primeira cadeia polipeptídica é uma dentre VD1- LINK1-VR1 e VR1-LINK1-VD1; em outra configuração, a ordem e a orientação das regiões da primeira cadeia polipeptídica é uma dentre VD2-LINK2-VR2, and VR2-LINK-VD2, ou seja, pode-se reordenar o arranjo dos sítios de ligação de modo a formar uma molécula “canhota” ou uma molécula “destra” (ver, p.ex., a Figura 5). Outrossim, a configuração das cadeias alfa e beta da porção relacionada ao TCR também pode ser trocada.

[0036] No contexto da presente invenção, a molécula polipeptídica de afinidade dupla de acordo com a invenção é exemplificada por uma estrutura que se liga ao peptídeo SLYNTVATL (SEQ Nº 7) ao ser apresentada na forma de um complexo de peptídeo com MHC. Contudo, o conceito da invenção evidentemente não se restringe a este peptídeo específico e abrange basicamente qualquer epítopo relacionado a uma doença ou distúrbio que se apresente em um contexto envolvendo uma molécula de MHC. A apresentação pode ser relacionada ao MHC classe I ou ao MHC classe II. Todas as células nucleadas possuem moléculas do complexo principal de histocompatibilidade classe I (MHC classe I) em suas superfícies, que também possuem uma grande quantidade de epítopos peptídicos expostos à vigilância do repertório de células T CD8+. As respostas de células T CD8+ são essenciais para o controle e eliminação de infecções virais e para a eliminação de células transformadas ou tumorigênicas. Alguns exemplos de epítopos peptídicos preferidos para reconhecimento são descritos na respectiva literatura e incluem especificamente os peptídeos revelados nas Tabelas 1 a 5 de 2016/170139. Tabelas 1 a 5 de WO 2016/102272; Tabelas 1 e 2 de WO 2016/156202; Tabelas 1 a 4 de WO 2016/146751; Tabela 2 de WO 2011/113819; Tabelas 1 a 4b de WO 2016/156230; Tabelas 1 a 4b de WO 2016/177784; Tabelas 1 a 4 de WO 2016/202963; Tabelas 1 e 2 de WO 2016/207164; Tabelas 1 a 4 de WO 2017/001491; Tabelas 1 a 4 de WO 2017/005733; Tabelas 1 a 8 de WO 2017/021527; Tabelas 1 a 3 de WO 2017/036936; Tabelas 1 a 4 de PCT/EP2016/073416 para tratamento de câncer, Publicação dos EUA 2016-0187351, Publicação dos EUA 2017-0165335, Publicação dos EUA 2017-0035807, Publicação dos EUA 2016-0280759, Publicação dos EUA 2016-0287687, Publicação dos EUA 2016-0346371, Publicação dos EUA 2016-0368965, Publicação dos EUA 2017-0022251, Publicação dos EUA 2017-0002055, Publicação dos EUA 2017-0029486, Publicação dos EUA 2017-0037089, Publicação dos EUA 2017-0136108, Publicação dos EUA 2017-0101473, Publicação dos EUA 2017-0096461, Publicação dos EUA 2017-0165337, Publicação dos EUA 2017-0189505, Publicação dos EUA 2017-0173132, Publicação dos EUA 2017-0296640, Publicação dos EUA 2017-0253633 e Publicação dos EUA 2017-0260249, cujos conteúdos ficam aqui integralmente incorporados por referência. Em outro aspecto, a molécula polipeptídica de afinidade dupla de acordo com a invenção reconhece um peptídeo formado por qualquer um dos peptídeos descritos nos pedidos de patente citados anteriormente.

[0037] Em um aspecto, a molécula polipeptídica de afinidade dupla de acordo com a invenção se liga ou é capaz de reconhecer ou de se ligar especificamente a um ou mais peptídeos com comprimento total de 8 a 100 aminoácidos, de 8 a 30 aminoácidos, de 8 a 16 aminoácidos, preferivelmente de 8 a 14 aminoácidos, especificamente de 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 aminoácidos, no caso de ligação a peptídeos alongados de classe II, o comprimento também pode ser de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 aminoácidos. Em outro aspecto da invenção, a molécula polipeptídica de afinidade dupla de acordo com a invenção se liga ou é capaz de reconhecer ou de se ligar especificamente a um ou mais peptídeos com comprimento total de 8 a 12 aminoácidos, de 8 a 10 aminoácidos, de 9 a 15 aminoácidos, de 9 a 14 aminoácidos, de 9 a 13 aminoácidos, de 9 a 12 aminoácidos, de 9 a 11 aminoácidos, de 10 a 15 aminoácidos, de 10 a 14 aminoácidos, de 10 a 13 aminoácidos ou de 10 a 12 aminoácidos.

[0038] Outros epítopos apropriados podem ser identificados em bancos de dados, tais como, por exemplo, o Immune Epitope Database, disponível em www.iedb.org.

[0039] O termo “célula imune efetora humana” (singular ou plural) refere-se a uma célula do repertório natural de células do sistema imune humano, que podem alterar a viabilidade de uma célula-alvo ao serem ativadas.

No escopo da invenção, o termo “viabilidade da célula-alvo” pode se referir à capacidade da célula alvo de sobreviver, proliferar e/ou interagir com outras células. Tais interações podem ser diretas (p.ex. quando a célula-alvo entra em contato com outra célula) ou indiretas (p.ex. quando a célula alvo secreta substâncias que influenciam o funcionamento de outra célula distante). A célula- alvo pode ser humana ou de outra espécie. Se a célula for de origem humana, é vantajoso que a célula-alvo tenha sido transformada de modo a se tornar uma célula maligna. A célula nativa pode também apresentar modificações patológicas, tais como infecção por um organismo como um vírus, um plasmódio ou uma bactéria. Se a origem da célula não for humana, é vantajoso que a célula- alvo seja de um patógeno invasivo, tal como, por exemplo, uma bactéria invasora ou plasmódio invasor.

[0040] Na molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, é preferível que a primeira e a segunda cadeias polipeptídicas referidas anteriormente compreendam pelo menos um domínio tipo dobradiça e/ou um domínio Fc ou parte de um domínio Fc. Em anticorpos, a “dobradiça” ou

“região da dobradiça” refere-se à porção flexível de uma cadeia pesada localizada entre o domínio CH1 e o domínio CH2, que possui cerca de 25 aminoácidos de comprimento e é dividida em “dobradiça superior”, “dobradiça média” e “dobradiça inferior”. O termo “subdomínio de dobradiça” refere-se à dobradiça superior, à dobradiça média (ou central) e à dobradiça inferior. As sequências de aminoácidos das dobradiças de moléculas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 são (numeração em formato Eu): IgG1: E216PKSCDKTHTCPPCPAPELLG (SEQ Nº 1) IgG2: E216RKCCVECPPCPAPPVAGP (SEQ Nº 2) IgG3: ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE216PKSCDTPPP CPRCPAPELLG (SEQ Nº 3) IgG4: E216SKYGPPCPSCPAPEFLG (SEQ Nº 4).

[0041] A região da dobradiça central normalmente contém uma ponte de cisteína que conecta duas cadeias pesadas. Também é possível introduzir mutações na dobradiça inferior para reduzir a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC, “antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity”), que é uma característica indesejada.

[0042] Prefere-se uma molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a presente invenção que compreenda pelo menos um domínio com fragmento cristalizável (Fc) de IgG, i.é., uma região de fragmento cristalizável (região Fc), que é a região caudal do anticorpo que interage com receptores de Fc e algumas proteínas do sistema complemento.

As regiões de Fc contêm dois ou três domínios constantes de cadeia pesada (domínios CH 2, 3 e 4) em cada cadeia polipeptídica. As regiões de Fc das IgGs também possuem um sítio de N-glicosilação bem conservado. A glicosilação do fragmento Fc é essencial para a atividade mediada pelo receptor de Fc. Devido ao seu tamanho reduzido (cerca de 50 kD), anticorpos biespecíficos dos tipos

BiTE® ou DART são depurados rapidamente e possuem meia-vida curta.

Portanto, o receptor celular scTv (p.ex. CD3) pode ser fundido com um domínio Fc de IhG1 humana para aumentar a massa molecular e melhorar as propriedades farmacocinéticas da molécula polipeptídica de dupla especificidade. Várias mutações localizadas na interface entre os domínios CH2 e CH3 (p.ex. T250Q/M428L e M252Y/S254T/T256E associados a H433K/N434F) mostraram-se capazes de aumentar a capacidade de ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) e a meia-vida da IgG1 in vivo. Dessa forma, foi possível prolongar ainda mais a meia-vida sérica de uma molécula que contém Fc.

[0043] Nas moléculas polipeptídicas de dupla especificidade da invenção, o referido domínio Fc pode compreender um domínio CH2 que compreende pelo menos uma mutação silenciadora da função efetora.

Preferivelmente, essas mutações são introduzidas na sequência ELLGGP (resíduos 233 a 238 de SEQ Nº 50) de IgG1 humana ou em resíduos correspondentes de outros isotipos, que são sabidamente relevantes para as funções efetoras. Em princípio, são introduzidas uma ou mais mutações correspondentes aos resíduos derivados de IgG2 e/ou de IgG4 na Fc de IgG1.

São preferidas as mutações E233P, L234V, L235A e resíduo ausente ou G na posição 236. Outra mutação possível é P331S. EP1075496 revela um anticorpo recombinante que compreende um domínio quimérico derivado de dois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana, sendo que as imunoglobulinas humanas são selecionadas dentre IgG1, IgG2 e IgG4, e onde o domínio quimérico é um domínio de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina humana que possui os blocos de aminoácidos 233P, 234V, 235A, resíduo ausente ou G na posição 236 e 327G, 330S e 331S (numeração EU), e seja pelo menos 98% idêntica a uma sequência CH2 (resíduos 231 a 340) de IgG1, IgG2 ou IgG4 humana com modificações dos mesmos aminoácidos indicados anteriormente.

[0044] Alguns exemplos de sequências parciais de CH2 preferidas que podem ser usadas (total ou parcialmente) são listadas a seguir: 231- APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK- 334 (SEQ Nº 5); e 231- APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK- 334 (SEQ Nº 6), com as mudanças sublinhadas, que possuem um N na posição 297 (variante glicosilada) ou um resíduo selecionado do grupo formado por A, G e Q (variante não glicosilada).

[0045] Nas moléculas polipeptídicas de dupla especificidade da invenção, o referido domínio Fc pode compreender um domínio CH3 que compreende pelo menos uma mutação que facilita a formação de heterodímeros.

Para maximizar o rendimento e simplificar a purificação da proteína Fc heterodimérica de dupla especificidade, podem-se introduzir mutações do tipo chave-e-fechadura no domínio Fc. Com este desenho, os domínios Fc são induzidos a formar heterodímeros em vez dos homodímeros normais por meio da adição de resíduos hidrofóbicos volumosos (“chaves”) em uma cadeia e criação de bolsas hidrofóbicas complementares (“fechaduras”) na outra. Pode- se gerar outra espécie de “chave” substituindo-se um aminoácido pequeno por outro maior a fim de inserir um “buraco” no domínio oposto criado pela substituição de um resíduo grande por outro pequeno (cf. “Ridgway, J.B.B.; Presta, L.G.; Carter, P. “Knobs-into-holes” engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. 1996, 9, 617–621” e

WO 2002/002781).

[0046] Prefere-se uma molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção onde a referida mutação de chave-e- fechadura no domínio CH3 (ver, p.ex., WO 98/50431) consista em T366W como “chave” e T366’S, L368’A e Y407’V como “fechadura”. Esse conjunto de mutações também pode ser expandido pela inclusão das mutações K409A e F405’K, conforme revelado por Wei et al. (“Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production, Oncotarget. 2017”). Outra possibilidade é T366Y como “chave” e Y407’T como “fechadura”.

[0047] As moléculas polipeptídicas de dupla especificidade da invenção também podem compreender pontes de cisteína introduzidas artificialmente entre pelo menos um resíduo de cisteína na primeira cadeia polipeptídica e pelo menos um resíduo de cisteína na segunda cadeia polipeptídica a fim de tornar as moléculas mais estáveis, idealmente sem interferir nas propriedades de ligação e/ou na melhor capacidade de heterodimerização da molécula bivalente. Para melhorar a estabilidade, pode-se introduzir uma ponte bissulfeto adicionando-se uma cisteína no domínio CH3 das cadeias “chave” e “fechadura”. Prefere-se a molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção onde o domínio Fc compreende um domínio CH3 que compreende pelo menos um resíduo de cisteína adicional (p.ex. S354C e/ou Y349C).

[0048] Prefere-se uma molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção onde a referida molécula CD é selecionada do grupo de moléculas CD relacionadas à resposta imune, tais como CD3 (cadeias CD3γ, CD3δ e Cd3ε), CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45RA, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD152, CD163, CD193,

CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FcεRI, TCRα/β, TCRγ/δ e HLA-DR. Dependendo da combinação das duas entidades ligantes de antígenos da molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, podem-se obter vantagens específicas pertinentes à função da molécula, com destaque para aumento da atividade.

[0049] Prefere-se a molécula polipeptídica de dupla especificidade exemplar de acordo com a invenção, onde as regiões da primeira cadeia polipeptídica compreendem SEQ Nº 28 em VD1, SEQ Nº 29 em VR1 e SEQ Nº 30 em LINK1; e as regiões da segunda cadeia polipeptídica compreendem SEQ Nº 31 em VD2, SEQ Nº 32 em VR2 e SEQ Nº 30 em LINK2.

[0050] Mais preferida é a molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, onde a região Fc da primeira cadeia polipeptídica compreende SEQ Nº 26 (Fc1) e a região Fc da segunda cadeia polipeptídica compreende ou SEQ Nº 27 (Fc2).

[0051] Mais preferida é a molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, compreendendo uma primeira cadeia polipeptídica que compreende SEQ Nº 16 (cadeia 1 da molécula complete) e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende SEQ Nº 17 (cadeia 2 da molécula completa).

[0052] Ainda mais preferida é a molécula polipeptídica de dupla especificidade exemplar de acordo com a invenção, onde o referido primeiro sítio de ligação (VD1)(VD2) que se liga ao epítopo do antígeno superficial de células imunes humanas (p.ex. CD3) é humanizado e/ou o referido sítio de ligação (VR1)(VR2) que se liga ao referido epítopo peptídico associado a MHC é maturado por afinidade.

[0053] Anticorpos humanizados são anticorpos ou partes de anticorpos de espécies não humanas cujas sequências proteicas são modificadas a fim de torná-las mais semelhantes a variantes de anticorpos produzidas naturalmente em humanos. O processo de humanização normalmente é aplicado em anticorpos monoclonais desenvolvidos para administração em humanos (p.ex. anticorpos desenvolvidos para uso como drogas anticâncer). Métodos apropriados de humanização são bem conhecidos na literatura, como em, por exemplo, Olimpieri, Pier Paolo, Paolo Marcatili e Anna Tramontano. Tabhu: Tools for Antibody Humanization. Bioinformatics 31.3 (2015): 434–435. PMC; Safdari Y, Farajnia S, Asgharzadeh M, Khalili M.

Antibody humanization methods - a review and update. Biotechnol Genet Eng Rev. 2013;29:175-86 ou Ahmadzadeh V, Farajnia S, Feizi MA, Nejad RA.

Antibody humanization methods for development of therapeutic applications.

Monoclon Antib Immunodiagn Immunother. 2014 Apr;33(2):67-73.

[0054] Em geral, a maturação por afinidade dos TCRs e anticorpos pode ser realizada in vitro de acordo com métodos descritos na literatura, sobretudo aqueles que empregam exibição em leveduras ou fagos (baseados em, p.ex., Holler PD, et al. In vitro evolution of a T cell receptor with high affinity for peptide/MHC. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 May 9; 97(10):5387-92; Boder ET et al., Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 26; 97(20):10701-5; e, como exemplo recente, Zhao Q, et al. Affinity maturation of T-cell receptor-like antibodies for Wilms tumor 1 peptide greatly enhances therapeutic potential.

Leukemia. 2015; 29(11):2238-2247).

[0055] Os sítios de ligação (VD1)(VD2) e (VR1)(VR2) da presente invenção se ligam preferível e especificamente a um antígeno superficial de uma célula imune humana e a um complexo de peptídeo com HLA, respectivamente.

Conforme aqui utilizado em relação aos sítios de ligação da presente descrição, o termo “ligação específica” e variações gramaticais do mesmo são usados para designar um sítio com afinidade de ligação (KD) de até 100 µM para um complexo de HLA com peptídeo e/ou para um epítopo de anticorpo. Os sítios de ligação

(VD1)(VD2) e (VR1)(VR2) da presente descrição se ligam a um epítopo de anticorpo CD ou a um complexo de peptídeo com HLA, respectivamente, com afinidade de ligação (KD) de cerca de 100 µM ou menos, cerca de 50 µM ou menos, cerca de 25 µM ou menos ou cerca de 10 µM ou menos. São mais preferidos sítios de ligação de alta afinidade com afinidades de ligação de cerca de 1 µM ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos, cerca de 25 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos, cerca de 5 nM ou menos, cerca de 2 nM ou menos, cerca de 1 nM ou menos, cerca de 500 pM ou menos, cerca de 200 pM ou menos ou cerca de 100 pM ou menos. São exemplos não limitantes de intervalos de afinidade de ligação preferido para sítios de ligação da presente invenção cerca de 10 pM a cerca de 100 pM, 100 pM a cerca de 1 nM, 1 nM a cerca de 10 nM, cerca de 10 nM a cerca de 20 nM, cerca de 20 nM a cerca de 30 nM, cerca de 30 nM a cerca de 40 nM, cerca de 40 nM a cerca de 50 nM, cerca de 50 nM a cerca de 60 nM, cerca de 60 nM a cerca de 70 nM, cerca de 70 nM a cerca de 80 nM, cerca de 80 nM a cerca de 90 nM ou cerca 90 nM a cerca de 100 nM, medidos, por exemplo, por interferometria de biocamada conforme descrito no Exemplo 6.

[0056] Em um aspecto, a revelação fornece um peptídeo cuja sequência é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica às sequências de aminoácidos aqui descritas, tais como, por exemplo, as sequências de aminoácidos 1 a 58.

Em outro aspecto, a revelação fornece um primeiro ou segundo polipeptídeo cuja sequência é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica às sequências de aminoácidos aqui descritas. Em mais outro aspecto, a revelação fornece uma molécula de polipeptídeo específico duplo cuja sequência é pelo menos 50%, pelo menos

60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma ou mais das sequências de aminoácidos aqui descrita. A revelação fornece também aspectos nos quais o porcentual de identidade de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% se aplica a qualquer uma das sequências das regiões estruturais descritas na Figura 1 (p.ex. VD1, VR1, Link1, VR2, VD2, Link2 ou região da dobradiça) e que são descritas como sendo parte das sequências conforme aqui reveladas.

[0057] Em um aspecto, os polipeptídeos ou polipeptídeos de dupla especificidade aqui descritos podem ser modificados de diversas maneiras, tais como por substituições, deleções, truncagens e inserções de um ou mais aminoácidos. Em outro aspecto, os polipeptídeos ou polipeptídeos de dupla especificidade aqui descritos podem apresentar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Em mais outro aspecto, os polipeptídeos ou polipeptídeos de dupla especificidade aqui descritos podem incluir 1 a 5, 1 a 10, 1 a 20, 2 a 5, 2 a 10, 5 a 20, 5 a 50 ou 10 a 100 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Em um aspecto, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos se aplicam a qualquer uma das regiões estruturais descritas na Figura 1 (p.ex. VD1, VR1, Link1, VR2, VD2, Link2 ou regiões de dobradiça). Esta revelação fornece também aspectos nos quais 1 a 5, 1 a 10, 1 a 20, 2 a 5, 2 a 10, 5 a 20, 5 a 50 ou 10 a 100 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos se aplicam às sequências de quaisquer das regiões estruturais descritas na Figura 1 (p.ex. VD1, VR1, Link1, VR2, VD2, Link2 ou região da dobradiça), sejam estas conforme descritas ou formando parte das sequências aqui reveladas.

[0058] Em um aspecto, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 ou mais aminoácidos podem ser adicionados à porção N- terminal ou C-terminal de um polipeptídeo ou peptídeo de dupla especificidade aqui descrito, tais como, por exemplo, as sequências de aminoácidos 1 a 58.

[0059] Em um aspecto, a região VD1 pode ser pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico às sequências de aminoácidos SEQ Nº 28.

[0060] Em um aspecto, a região VR1 pode ser pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico às sequências de aminoácidos SEQ Nº 29.

[0061] Em um aspecto, as regiões LINK1 ou LINK2 podem ser pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico às sequências de aminoácidos SEQ Nº 30.

[0062] Em um aspecto, a região VD2 pode ser pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico às sequências de aminoácidos SEQ Nº 31.

[0063] Em um aspecto, a região VR2 pode ser pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico às sequências de aminoácidos SEQ Nº 32.

[0064] Em um aspecto, a dobradiça pode ser pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico às sequências de aminoácidos SEQ Nº 1, SEQ Nº 2, SEQ Nº 3 ou SEQ Nº 4. Em um aspecto, o domínio CH2 pode ser pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico às sequências de aminoácidos SEQ Nº 5 ou SEQ Nº 6.

Em um aspecto, a região Fc pode ser pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico às sequências de aminoácidos SEQ Nº 26 ou SEQ Nº 27.

[0065] Em um aspecto, a revelação fornece um peptídeo que é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntico às sequências de aminoácidos SEQ Nº 43, 44, 45 ou

46.

[0066] Em um aspecto, os polipeptídeos ou moléculas peptídicas de dupla especificidade aqui revelados podem ser modificados substituindo-se um ou mais resíduos em sítios diferentes, possivelmente seletivos, da cadeia polipeptídica. Tais substituições podem ser de natureza conservadora, substituindo-se, por exemplo, um aminoácido por outro de estrutura e características semelhantes, como, por exemplo, substituir um aminoácido hidrofóbico por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservador seria substituir aminoácidos de tamanho e natureza química semelhantes ou idênticos, como substituir leucina por isoleucina. Em estudos de variações de sequências em famílias de proteínas homólogas que ocorrem naturalmente, determinadas substituições de aminoácidos são toleradas com muito mais frequência que outras, e estas frequentemente mostram correlação com semelhanças de tamanho, carga, polaridade e hidrofobicidade entre o aminoácido original e seu substituto, sendo esta a base para definição de “substituições conservadoras”.

[0067] Em outra configuração preferida da molécula peptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, a referida molécula possui um agente ativo ou uma porção de tal agente que é acoplada ou conjugada com a molécula. O referido agente ativo pode ser selecionado do grupo formado por um marcador detectável, uma molécula imunoestimulatória e um agente terapêutico.

[0068] O marcador detectável pode ser selecionado do grupo formado por biotina, estreptavidina, uma enzima ou fragmento catalítico da mesma, um radionuclídeo, uma nanopartícula, um íon de metal paramagnético ou uma molécula fluorescente, fosforescente ou quimioluminescente. São exemplos de marcadores detectáveis usados para fins diagnósticos marcadores fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácido nucleico e reagentes de contraste.

[0069] São exemplos de agentes terapêuticos que podem ser associados com as moléculas da invenção os imunomoduladores, compostos radioativos, enzimas (p.ex. perforina), agentes quimioterápicos (p.ex. cisplatina) ou uma toxina. Alguns outros agentes terapêuticos apropriados são agentes citotóxicos de molécula pequena, i.é., compostos capazes de matar células mamíferas e que possuem peso molecular inferior a 700 Daltons. Tais compostos podem também conter metais tóxicos capazes de produzir efeitos citotóxicos. Fica entendido que esses agentes citotóxicos de molécula pequena incluem também pró-drogas, i.é., compostos que sofrem decaimento ou sofrem conversão sob condições fisiológicas de modo a gerar agentes citotóxicos. São exemplos de tais agentes a cisplatina, derivados da maitansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etoposida, gemcitabina, ifosfamida, irinotecana, melfalano, mitoxantrona, porfimer sódico (fotoforina II), temozolomida, topotecana, glucuronato de trimetreato, auristatina E, vincristina, doxorrubicina e citotoxinas peptídicas (i.é. proteínas ou fragmentos de proteínas capazes de matar células mamíferas). Alguns outros exemplos são a ricina, toxina diftérica, exotoxina bacteriana A de pseudomonas, DNase e RNase, radionuclídeos (i.é.

isótopos instáveis de elementos que sofrem decaimento acompanhado de emissão de uma ou mais partículas α ou β ou de raios γ, tais como, por exemplo, iodo 131, rênio 186, índio 111, ítrio 90, bismuto 210 e 213, actínio 225 e astato 213). Podem-se usar agentes quelantes para facilitar a associação desses radionuclídeos a moléculas ou a multímeros de moléculas ou imunoestimulantes (i.é. moléculas efetoras que estimulam a resposta imune). Por exemplo, citoquinas como IL-2 e IFN-γ, quimioquinas como IL-8, fator plaquetário 4, proteína estimuladora do crescimento de melanoma, ativadores de complemento; ou domínios de proteínas xenogênicas, domínios de proteínas alógenas, domínios de proteínas virais ou bacterianas ou peptídeos virais ou bacterianos.

[0070] Outro aspecto da presente invenção que se refere a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia polipeptídica e/ou uma segunda cadeia polipeptídica conforme aqui revelado ou um vetor de expressão que compreende um desses ácidos nucleicos. As moléculas de ácidos nucleicos podem ser DNA, cDNA, PNA, RNA ou uma combinação dos mesmos. A sequência de nucleotídeos que codifica um determinado peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptídeo pode ocorrer naturalmente ou ser construída por meios sintéticos. Em geral, os segmentos de DNA que codificam peptídeos, polipeptídeos e proteínas desta invenção são construídos a partir de fragmentos de cDNA e ligantes oligonucleotídeos curtos ou de uma série de oligonucleotídeos de modo a fornecer um gene sintético capaz de ser expresso em uma unidade de transcrição recombinante que compreende elementos regulatórios derivados de um operon microbiano ou viral. O termo “produto de expressão” significa o polipeptídeo ou proteína que é o produto de tradução natural do gene e de quaisquer sequências de ácidos nucleicos que produzam codificação equivalente resultantes da natureza degenerada do código genético produzindo o(s) mesmo(s) aminoácido(s). O termo “fragmento” significa, quando se refere a uma sequência codificante, uma porção do DNA que compreende menos que a região codificadora completa, cujo produto de expressão retém basicamente a mesma função ou atividade biológica que o produto de expressão da região codificante completa. Dependendo do uso pretendido, o ácido nucleico pode ter seus códons otimizados para expressão em uma célula hospedeira apropriada (p.ex. uma célula microbiana). O código genético é redundante e permite que alguns aminoácidos sejam codificados por mais de um códon, mas alguns códons são menos adequados que outros devido a fatores como, por exemplo, a disponibilidade relativa de tRNAs correspondentes (Gustafsson et al., 2004).

[0071] O ácido nucleico pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos, tanto de fita única como de dupla fita, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeos como, por exemplo, polinucleotídeos com uma cadeia básica de fosforotioato, e pode ou não conter íntrons, contanto que codifique as cadeias polipeptídicas.

[0072] O ácido nucleico (p.ex. DNA) pode então ser encerrado e/ou expresso em um hospedeiro apropriado a fim de produzir um peptídeo que compreende a cadeia polipeptídica da invenção. Pode-se, portanto, usar o ácido nucleico (p.ex. DNA) que codifica a cadeia polipeptídica da invenção ou variante da mesma de acordo com técnicas conhecidas e apropriadamente modificada conforme os ensinamentos aqui apresentados para construir um vetor de expressão, que é então utilizado para transformar uma célula hospedeira apropriada e produzir o polipeptídeo da invenção, como é conhecido na técnica.

O ácido nucleico (p.ex. DNA ou, no caso de vetores retrovirais, RNA) que codifica as cadeias polipeptídicas que constituem o composto da invenção pode ser unido a várias outras sequências de ácidos nucleicos (p.ex. DNA) para introdução em um hospedeiro apropriado. O ácido nucleico acompanhante dependerá da natureza do hospedeiro, do modo como o DNA é introduzido no hospedeiro e em se o desejado é a manutenção epissômica ou a integração. Em geral, o ácido nucleico é inserido em um vetor de expressão como um plasmídio na orientação correta e no “frame” de leitura correto para expressão. Se necessário, o ácido nucleico pode ser ligado às sequências de nucleotídeos de controle regulatório da transcrição e tradução reconhecidas pelo hospedeiro desejado, embora tais controles geralmente estejam disponíveis no vetor de expressão. Em seguida, o vetor é introduzido no hospedeiro por meio de técnicas padrão. Em geral, nem todos os hospedeiros serão transformados pelo vetor. Portanto, é necessário selecionar as células transformadas do hospedeiro. Uma técnica de seleção consiste em incorporar ao vetor de expressão uma sequência de ácido nucleico, junto com os elementos de controle necessários, que codifique uma característica selecionada na célula transformada, como resistência a um antibiótico. Como alternativa, o gene para tal característica selecionável pode estar em outro vetor, que é usado conjuntamente para transformar a célula hospedeira desejada. As células hospedeiras transformadas pelo ácido nucleico recombinante da invenção são então cultivadas por um período de tempo suficiente e sob condições apropriadas, bem conhecidas dos versados na técnica em vista dos ensinamentos aqui revelados, para permitir a expressão do polipeptídeo, que poderá então ser recuperado.

[0073] Muitos sistemas de expressão são conhecidos, incluindo bactérias (p.ex. E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (p.ex. Saccharomyces cerevisiae), fungos filamentosos (p.ex. Aspergillus sp.), células vegetais, células animais e células de insetos. Preferivelmente, o sistema pode consistir em células mamíferas como células CHO disponibilizadas pela ATCC Cell Biology Collection.

[0074] Em uma configuração, a descrição fornece um método de produção de uma molécula conforme aqui descrito, sendo que o método compreende cultivar células hospedeiras capazes de expressar as cadeias polipeptídicas em condições apropriadas para promover a expressão das mesmas.

[0075] Em um aspecto, realiza-se a clonagem de ácidos nucleicos que codificam cadeias polipeptídicas que compreendem domínios ligantes de TCR alfa e/ou TCR beta da presente descrição, que são então clonados em vetores de expressão (p.ex. retrovírus gama ou lentivírus) para gerar células T que expressem moléculas da presente descrição. Em outro aspecto, RNAs são sintetizados por meio de procedimentos conhecidos na técnica (p.ex. sistemas de transcrição in vitro), para se obter moléculas que expressam células da presente descrição. Em seguida, os RNAs sintetizados in vitro são introduzidos em células apropriadas por eletroporação a fim de expressar cadeias polipeptídicas.

[0076] Para aumentar a expressão, os ácidos nucleicos que codificam cadeias da presente descrição podem ser ligados operacionalmente a promotores fortes, tais como repetições terminais longas (LTRs) em retrovírus, citomegalovírus (CMV), vírus de células tronco murinas (MSCV) U3, fosfoglicerato quinase (PGK), β-actina, ubiquitina e um promotor composto de vírus símio 40 (SV40)/CD43, fator de alongamento (EF)-1a e o promotor do vírus formador de foco esplênico (SFFV). Em uma configuração preferida, o promotor é heterólogo em relação ao ácido nucleico expresso. Além dos promotores fortes, os cassetes de expressão da presente descrição podem conter outros elementos que podem incentivar a expressão de transgenes, tais como um trato central de polipurina (cPPT), que promove a translocação central de estruturas lentivirais (Follenzi et al., 2000), e o elemento regulatório pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (wPRE), que aumenta os níveis da expressão do transgene ao melhorar a estabilidade do RNA (Zufferey et al., 1999).

[0077] As cadeias alfa e beta do domínio ligante de uma molécula da presente invenção podem ser codificadas por ácidos nucleicos localizados em vetores separados ou por polinucleotídeos localizados no mesmo vetor.

[0078] Em uma configuração, uma célula hospedeira é modificada para expressar uma molécula da presente descrição. As células hospedeiras da presente descrição podem ser alogênicas ou autólogas em relação ao paciente a ser tratado.

[0079] Ainda outro aspecto invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende a molécula peptídica de dupla especificidade de acordo com a presente invenção, os ácidos nucleicos ou os vetores de expressão de acordo com a presente invenção ou a célula de acordo com a presente invenção, junto com um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As composições da invenção incluem composições de drogas a granel úteis para fabricação de composições farmacêuticas (p.ex. composições impuras ou não-estéreis) e composições farmacêuticas (i.é. composições apropriadas para administração em um paciente ou sujeito de pesquisa), que podem ser usadas na preparação de formas adequadas para doses individuais. Tais composições compreendem uma quantidade eficaz para profilaxia ou tratamento da molécula polipeptídica de dupla especificidade (agente) aqui revelada ou uma combinação do agente e de um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, as composições da invenção compreendem uma quantidade eficaz para profilaxia ou tratamento de uma ou mais moléculas da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0080] As composições farmacêuticas compreendem, preferivelmente, moléculas em forma livre ou em forma de sal. Preferivelmente, tais sais são sais farmaceuticamente aceitáveis de moléculas como, por exemplo, sais de cloreto ou acetato (trifluoracetato). Cabe notar que os sais das moléculas de acordo com a presente invenção diferem substancialmente das moléculas em seu estado in vivo, pois essas moléculas não se apresentam como sais in vivo.

[0081] Uma configuração da presente invenção refere-se, portanto, a uma molécula de acordo com a invenção que não ocorre naturalmente e é produzida por meios sintéticos (sintetizada) na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Os métodos de produção sintética de peptídeos e/ou polipeptídeos são bem conhecidos na técnica. Os sais das moléculas de acordo com a presente invenção diferem substancialmente das moléculas em seu estado in vivo, pois essas moléculas não se apresentam como sais ao serem geradas in vivo. Preferivelmente, os sais são sais farmaceuticamente aceitáveis das moléculas. Os referidos sais de acordo com a invenção incluem sais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como os sais da série de Hofmeister, que compreendem os ânions PO43-, SO42-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN- e os cátions NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ e Ba2+.

Selecionam-se em particular sais dentre (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2 Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4), Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2e Ba(SCN)2. São particularmente preferidos os acetatos de NH, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl e CaCl2, tais como, por exemplo, sais cloreto ou acetato (trifluoracetato).

[0082] Em um aspecto, um polipeptídeo aqui descrito possui a forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Em outro aspecto, um polipeptídeo na forma de um sal farmacêutico possui forma cristalina.

[0083] Em um aspecto, um dos sais farmaceuticamente aceitáveis aqui descritos refere-se a sais que possuem perfis de toxicidade dentro de um intervalo aceitável para aplicações farmacêuticas.

[0084] Conforme aqui utilizado, “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a um derivado dos peptídeos revelados onde o peptídeo é modificado elaborando-se sais ácidos ou básicos do agente. Por exemplo, os sais ácidos são preparados a partir da base livre (geralmente onde a forma neutra da droga possui um grupamento NH2 neutro) envolvendo reação com um ácido apropriado. Entre os ácidos apropriados para preparar sais ácidos estão tanto ácidos orgânicos (p.ex. ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e assemelhados) como ácidos inorgânicos (p.ex. ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e assemelhados). Por outro lado, sais básicos de grupamentos ácidos que podem estar presentes em um peptídeo são preparados usando-se uma base farmaceuticamente aceitável como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônia, hidróxido de cálcio, trimetilamina ou assemelhados.

[0085] Em um aspecto, os sais farmaceuticamente aceitáveis podem aumentar a solubilidade e/ou a estabilidade dos peptídeos aqui descritos.

Em outro aspecto, os sais farmaceuticamente aceitáveis aqui descritos podem ser preparados por meios convencionais a partir do peptídeo ou complexo transportador correspondente reagindo-se, por exemplo, o ácido ou base apropriado com peptídeos ou complexos conforme aqui descrito. Em outro aspecto, os sais farmaceuticamente aceitáveis estão em forma cristalina ou semicristalina. Em mais outro aspecto, os sais farmaceuticamente aceitáveis podem incluir, por exemplo, aqueles descritos em Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use por P. H. Stahl and C. G. Wermuth (Wiley- VCH 2002) e em L. D. Bighley, S. M. Berge, D. C. Monkhouse em “Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”. Eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, Vol. 13, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong 1995, pp. 453-499, duas referências que ficam aqui integralmente incorporadas por referência.

[0086] A invenção compreende também composições farmacêuticas que compreendem uma molécula polipeptídica de dupla especificidade da invenção, um anticorpo terapêutico (p.ex. um anticorpo monoclonal específico para tumores) específico para um determinado antígeno de câncer e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0087] Em uma configuração específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência regulatória de um governo federal ou estadual, constante da Farmacopeia dos EUA ou outras farmacopeias geralmente reconhecidas para uso em animais e, mais particularmente, em humanos. O termo “veículo” se refere a um diluente, excipiente adjuvante ou veículo usado para administrar um tratamento. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, incluindo água e óleos; podem ser de origem animal, vegetal, sintética ou de petróleo; e podem incluir óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e assemelhados.

Para composições farmacêuticas administradas por via intravenosa, o veículo preferido é a água. Soluções salinas ou de dextrose em água ou de glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, sobretudo para soluções injetáveis. São excipientes farmacêuticos apropriados amido, glicose, lactose, sucrose, gelatina, malte, arroz, farinha, calcário, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, fosfato de sódio, acetato de sódio, L-histidina, leite em pó desnatado, glicerol, propileno glicol, água, etanol e assemelhados. Se desejado, a composição pode incluir também pequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsificantes ou tampões de pH. Tais composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação prolongada e assemelhados. Geralmente, os ingredientes das composições da invenção são fornecidos separadamente ou misturados em formas apropriadas para doses individuais, tais como, por exemplo, pó seco liofilizado ou concentrado desidratado em um recipiente selado hermeticamente, tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade do agente ativo. Quando a composição destina-se a ser administrada por infusão, pode-se dispensá-la usando um frasco de infusão contendo água ou solução salina estéril de qualidade farmacêutica. Quando a composição destina-se a ser administrada por injeção, pode-se fornecer uma ampola de água estéril ou solução salina para injeção a fim de misturar os ingredientes antes da administração.

[0088] Outro aspecto da presente invenção refere-se à molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, aos ácidos nucleicos ou aos vetores de expressão de acordo com a invenção, à célula de acordo com a invenção ou à composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso em medicina. Em geral, o uso da molécula polipeptídica de dupla especificidade depende do contexto médico do antígeno peptídico reconhecido pela referida molécula, como é descrito mais pormenorizadamente a seguir.

[0089] Prefere-se a molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a invenção, a célula de acordo com a invenção ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio selecionado do conjunto formado por doenças imunológicas, doenças infecciosas, intoxicação e cânceres, incluindo tratamento de diversos cânceres ou outras doenças envolvendo proliferação anormal, incluindo-se, entre outras, carcinoma (incluindo carcinomas de bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estômago, próstata, colo do útero, tireoide e pele), incluindo carcinoma de células escamosas, tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide (incluindo leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T e linfoma de Burkitt), tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide (incluindo leucemia mieloide aguda ou crônica e leucemia promielocítica), tumores de origem mesenquimal (incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma) e outros tumores (incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma),

tumores do sistema nervoso central e periférico (incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, schwannoma e osteossarcoma) e outros tumores (incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireoide e teratocarcinoma). Sem limitação dos precedentes, podem-se incluir outros cânceres como linfomas foliculares, carcinomas com p53 mutante, tumores hormoniodependentes de mama, próstata e ovário, e lesões pré-malignas como polipose adenomatosa familiar e síndromes mielodisplásicas. Em configurações específicas, alterações malignas ou distúrbios de proliferação (p.ex. metaplasia e displasia) ou doenças hiperproliferativas são tratadas ou prevenidas por meio de métodos e composições da invenção no ovário, bexiga, mama, cólon, pulmão, pele, pâncreas ou útero. Em outras configurações específicas, o sarcoma, melanoma ou leucemia são tratados ou prevenidos por métodos e composições da invenção.

[0090] A invenção se refere a métodos de produção de uma resposta imune em um paciente ou sujeito de pesquisa que compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção ou da composição farmacêutica de acordo com a invenção. Em um aspecto, uma população de molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção é administrada a um paciente ou sujeito de pesquisa que necessite da mesma.

[0091] A invenção refere-se também a um método de matar células alvo em um paciente ou sujeito de pesquisa, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de uma molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a presente invenção.

[0092] A invenção também fornece métodos para prevenir, tratar ou manejar um ou mais sintomas associados com uma doença inflamatória em um indivíduo, empregando para tal fim a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz para tratamento ou profilaxia de um ou mais agentes anti- inflamatórios de acordo com a invenção. A invenção também fornece métodos para prevenir, tratar ou manejar um ou mais sintomas associados com uma doença autoimune, empregando para tal fim a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz para tratamento ou profilaxia de um ou mais agentes imunomoduladores de acordo com a invenção. As doenças infecciosas que podem ser tratadas ou prevenidas por moléculas da invenção são causadas por agentes infecciosos como vírus, bactérias, fungos, protozoários, vírus, entre outros. As doenças virais que podem ser tratadas ou prevenidas usando-se as moléculas da invenção conjuntamente com os métodos da presente invenção incluem, sem limitação, aquelas causadas pelo vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, influenza, varicela, adenovírus, herpesvírus simplex tipo 2 (HSV 1), herpesvírus simplex tipo 2 (HSV 2), peste suína, rinovírus, ecovírus, rotavírus, vírus sincicial respiratório, papilomavírus, papovavírus, citomegalovírus, equinovírus, arbovírus, hantavírus, vírus Coxsackie, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus da rubéola, poliovírus, vírus da varíola, vírus Epstein-Barr, vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV 1), vírus da imunodeficiência humana tipo 2 (HIV 2) e agentes de doenças virais como a meningite viral, encefalite, dengue ou varíola.

[0093] Algumas doenças bacterianas que podem ser tratadas ou prevenidas por meio do uso das moléculas da invenção conjuntamente com os métodos da presente invenção incluem, sem limitação, micobactérias, riquétsias, micoplasmas, Neisseria, S. pneumoniae, Borrelia burgdorferi (doença de Lyme), Bacillus anthracis (antraz), tétano, estreptococose, estafilococos, micobactérias, tétano, coqueluche, cólera, peste, difteria, clamídia, S. aureus e legionela.

[0094] Algumas doenças causadas por protozoários que podem ser tratadas ou prevenidas por meio do uso das moléculas da invenção conjuntamente com os métodos da presente invenção são a leishmaniose, coccidiodose, tripanossomíase e malária. Algumas doenças parasitárias que podem ser tratadas ou prevenidas por meio do uso das moléculas da invenção conjuntamente com os métodos da presente invenção são a clamidiose e a riquetsiose, sem limitação.

[0095] São exemplos não-limitantes de agentes e doenças infecciosas as bactérias (p.ex. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans e Pseudomonas aeruginosa), os patógenos (p.ex. papovavírus linfotrópico B (LPV), Bordetella pertussis, vírus da doença de Borna (BDV), coronavírus bovino, vírus da coriomeningite, vírus da dengue, adenovírus de E. coli, ebola, ecovírus 1, ecovírus 11 (EV), endotoxina (LPS), bactérias entéricas, vírus entérico órfão, enterovírus, vírus da leucemia felina, vírus da doença de pé-e-boca e vírus da leucemia em gibões (GALV)), bactérias Gram-negativas, Helicobacter pylorii, vírus da hepatite B (HBV), herpesvírus simplex, HIV 1, citomegalovírus, coronavírus humano, influenza A, B e C, legionela, Leishmania mexicana, Listeria monocytogenes, vírus do sarampo, meningococo, morbilivírus, vírus da hepatite murina, vírus da leucemia murina, herpesvírus gama murino, retrovírus murino, coronavírus murino, vírus da hepatite em camundongo, Mycobacterium avium tipo M; Neisseria gonorrhoeae, vírus da doença de Newcastle, parvovírus B 19, Plasmodium falciparum, poxvírus, pseudomonas, rotavírus, Salmonella typhiurium, Shigella, estreptococos, vírus linfotrópico de célula T tipo 1 e vírus da vacínia).

[0096] Em mais outro aspecto da invenção, a invenção se refere a um método de tratamento de uma doença ou distúrbio que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com a invenção, dos ácidos nucleicos ou dos vetores de expressão de acordo com a invenção, da célula de acordo com a invenção ou da composição farmacêutica de acordo com a invenção.

[0097] A molécula polipeptídica de dupla especificidade da invenção pode ser usada em um método de prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio que pode ser aliviada pela administração da molécula polipeptídica de dupla especificidade. Tais tratamentos podem ser fornecidos em uma composição farmacêutica junto com um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As moléculas polipeptídicas de dupla especificidade geralmente são fornecidas como parte de uma composição farmacêutica estéril, o que normalmente inclui um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica estéril pode estar em qualquer formato apropriado, dependendo do método desejado de administração ao paciente.

Pode-se fornecê-la em forma de doses individuais, que geralmente são acondicionadas em recipientes selados e podem ser fornecidas como parte de um kit. Tal kit normalmente (porém não necessariamente) inclui instruções de uso e pode conter uma pluralidade das referidas unidades de dose individual. A composição farmacêutica pode ser adaptada para administração por qualquer via apropriada, tal como a via parenteral (p.ex. subcutânea, intramuscular ou intravenosa). Tais composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica farmacêutica, tal como, por exemplo, a mistura do ingrediente ativo com os veículos ou excipientes sob condições estéreis.

[0098] Em um aspecto, os peptídeos e outras moléculas aqui descritas podem ser combinadas em um veículo aquoso. Em um aspecto, o veículo aquoso é selecionado entre trocadores iônicos, alumina, estearato de alumínio, estearato de magnésio, lecitina, proteínas séricas (como a albumina sérica humana), substâncias tamponantes (como os fosfatos), glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeos de ácidos graxos vegetais saturados, sais ou eletrólitos (como o sulfato de protamina), fosfato ácido de sódio, fosfato dicálcico, fosfato ácido de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, acetato de polivinil pirrolidona, substâncias à base de celulose (p.ex. celulose microcristalina, hidroxipropil metilcelulose, acetosuccinato de hidroxipropil metilcelulose, ftalato de hidroxipropil metilcelulose), amido, lactose monoidratada, manitol, lauril sulfato de trealose sódica e croscarmelose sódica, polietileno glicol, carboximetilcelulose sódica, poliacrilatos, polimetacrilato, ceras, polímeros de bloco polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e gordura de lã.

[0099] Em um aspecto, o veículo aquoso contém vários componentes (p.ex. água) junto com um componente que é um veículo não- aquoso, tais como os compostos aqui descritos. Em outro aspecto, o veículo aquoso é capaz de imprimir melhores propriedades quando combinado com um peptídeo ou outra molécula aqui descrita, tais como, por exemplo, melhor solubilidade, eficácia e/ou melhor imunoterapia. A composição também pode conter excipientes, tais como tampões, agentes de ligação, agentes abrasivos, diluentes, sabores e lubrificantes, entre outros. “Diluente farmaceuticamente aceitável” pode incluir, por exemplo, solventes, agentes volumizantes, agentes estabilizantes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e assemelhados que sejam fisiologicamente compatíveis. São exemplos de diluentes farmaceuticamente aceitáveis um ou mais dentre solução salina, solução salina com tampão fosfato, dextrose, glicerol, etanol e assemelhados, assim como combinações dos mesmos. Em muitos casos, pode ser preferível incluir na composição um ou mais agentes isotônicos, tais como, por exemplo, açúcares como a trealose e a sucrose, polialcoóis como o manitol e sorbitol ou cloreto de sódio. Também são incluídos no escopo da presente invenção substâncias farmaceuticamente aceitáveis como agentes umectantes ou pequenas quantidades de substâncias ancilares como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões. A composição também pode conter excipientes como tampões, agentes de ligação, agentes abrasivos, diluentes, sabores e lubrificantes.

[00100] As doses das moléculas polipeptídicas de dupla especificidade da presente invenção variam dentro de limites vastíssimos, dependendo da doença ou condição a ser tratada, da idade e do estado clínico do indivíduo a ser tratado, entre outros fatores. Por exemplo, uma dose apropriada de uma molécula polipeptídica de dupla especificidade pode variar de 25 ng/kg a 50 μg/kg. As doses apropriadas definitivas deverão ser determinadas por um médico.

[00101] As composições farmacêuticas, vetores, ácidos nucleicos e células da invenção podem ser fornecidos de forma substancialmente pura, p.ex., pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% pura.

[00102] As características preferidas de cada aspecto da invenção são as mesmas para cada um dos outros aspectos, mutatis mutandis.

Os documentos de técnica prévia aqui citados ficam incorporados na máxima extensão permitida por lei. Embora a presente invenção e suas vantagens tenham sido descritas detalhadamente, fica entendido que diversas mudanças, substituições e alterações podem ser efetuadas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção, conforme definida nas reivindicações em anexo. A presente invenção será mais bem ilustrada nos Exemplos a seguir, que são apresentados com finalidade meramente ilustrativa e não pretendem limitar a invenção de nenhuma maneira.

[00103] A Figura 1 mostra uma visão esquemática de uma configuração preferida da presente invenção: a molécula polipeptídica de dupla especificidade contendo Fc de IgG1 humana. VD1, VD2 = domínios variáveis derivados de anticorpos; VR1, VR2 = domínios variáveis derivados de TCR; Link1, Link2 = ligantes; Cis-Cis = pontes de cisteína.

[00104] A Figura 2 mostra uma visão esquemática de quatro estruturas de Fc de IgG contendo moléculas peptídicas de dupla especificidade, conforme testadas no contexto da presente invenção. preto = domínios variáveis derivados de TCR; cinza-claro = domínios variáveis derivados de anticorpos; branco = domínios variáveis derivados de IgG humana. As mutações buraco-e- fechadura são indicadas por cilindros. As moléculas de diacorpos IA-ID estão de acordo com a invenção.

[00105] A Figura 3 mostra uma análise por HPLC-SEC de várias moléculas biespecíficas de TCR/mAb desenhadas de acordo com as estruturas exibidas na Figura 2, que foram purificadas por meio de um processo de purificação em duas colunas. O conteúdo monomérico das várias moléculas foi determinado da seguinte maneira: II: 93,84%; III: 96,54%; IV: 98,49%; IA_1: 95,48%; IA_3: 98,45%; ID_1: 95,75%; IC_4: 95,22%; IC_5: 92,76%; ID_4: 99,31%; ID_5: 99,44%.

[00106] A Figura 4 mostra os resultados de ensaios de potência com diversas estruturas TCR/mAb biespecíficas à base de IgG4 como as mostradas na Figura 2. Células Jurkat_NFATRE_luc2 foram incubadas junto com células T2 carregadas com o peptídeo de HIV SLYNTVATL (SEQ Nº 7) na presença de concentrações crescentes de moléculas de TCR biespecíficas (bssTCR). As moléculas de diacorpos biespecíficos TCR/mAb IA-IgG4 se mostraram mais potentes que duas moléculas diferentes com especificidade para TCR e mAb.

[00107] A Figura 5 mostra os resultados de ensaios de potência com diversas estruturas TCR/mAb biespecíficas à base de IgG4 como as mostradas na Figura 2. Células Jurkat_NFATRE_luc2 foram incubadas junto com células T2 carregadas com o peptídeo de HIV SLYNTVATL (SEQ Nº 7) na presença de concentrações crescentes de moléculas de TCR biespecíficas (bssTCR). As moléculas de diacorpos biespecíficos ID_1, IA_3 e IA1 se mostraram muito mais potentes que três moléculas diferentes com especificidade para TCR e mAb.

[00108] A Figura 6 mostra os resultados dos ensaios de potência realizados com várias estruturas à base de IgG1 biespecíficas para TCR e mAb (ver Figura 2), nas quais foram usados diversos domínios variáveis de anticorpos que atuam sobre o complexo TCR-CD3. A estrutura ID_1 compreende os domínios variáveis do anticorpo UCHT1(V9) que atuam contra CD3, e as estruturas ID_4 e ID_5 compreendem domínios variáveis do anticorpo BMA031, que é específico para TCR alfa e beta. Células Jurkat_NFATRE_luc2 foram incubadas junto com células T2 carregadas com o peptídeo de HIV SLYNTVATL (SEQ Nº 7) na presença de concentrações crescentes de moléculas de TCR biespecíficas (bssTCR).

[00109] A Figura 7 apresenta de forma esquemática as possíveis orientações dos domínios VD e VR das moléculas da presente invenção. VH: domínio VH derivado de anticorpo, VL: domínio VL derivado de anticorpo; Vα: Valfa derivado de TCR; Vβ: Vbeta derivado de TCR.

[00110] A Figura 8 mostra os resultados da análise por HPLC- SEC dos agregados de alto peso molecular dentro de moléculas biespecíficas de TCR/mAb baseadas em IgG1. Os agregados foram analisados após purificação e depois de as moléculas serem armazenadas a 40°C por 1 semana e 2 semanas, respectivamente.

[00111] A Figura 9 mostra os resultados do ensaio de potência realizado com várias moléculas de TCR/mAb biespecíficas baseadas em IgG1.

A potência foi analisada após purificação e depois de as moléculas serem armazenadas a 40°C por 1 semana e 2 semanas, respectivamente. O armazenamento sob condições extenuantes a 40°C não acarretou perda significativa da potência das moléculas, e sim um aumento drástico da ativação inespecífica (independente de alvos) de células T Jurkat, que foi detectada para moléculas III e IV.

[00112] A Figura 10 mostra os resultados de ensaios de liberação de LDH com diversas estruturas TCR/mAb biespecíficas à base de IgG1 como as mostradas na Figura 2. CMSP isoladas de um doador saudável foram incubadas junto com células T2 carregadas com o peptídeo de HIV SLYNTVATL (SEQ Nº 7) na presença de concentrações crescentes de moléculas de TCR biespecíficas (bssTCR). As moléculas de diacorpos biespecíficos baseadas em TCR/mAb IA_3 e ID_1 induziram lise muito mais acentuada de células-alvo que as três moléculas de TCR/mAb com dupla especificidade. Conforme mostrado no lado direito do gráfico, nenhuma das estruturas biespecíficas de TCR/mAb testadas induziu lise detectável de células T2 carregadas com um peptídeo irrelevante (SEQ Nº 49).

[00113] A Figura 11 mostra os resultados de um ensaio de liberação de LDH com a estrutura de diacorpo TCR/mAb biespecífico IA_5, que atua contra o peptídeo associado a tumor PRAME-004 (SEQ Nº 49), apresentado em HLA-A*02. Células T positivas para CD8 de doadores saudáveis foram incubadas junto com linhagens de células cancerosas UACC- 257, SW982 e U2OS que apresentavam quantidades diferentes de complexos PRAME-004:HLA-A*02-1 em suas superfícies (cerca de 1100, cerca de 770 e cerca de 240 cópias por célula, respectivamente, conforme determinado por análises de M/S) com proporção efetor:alvo de 5:1 na presença de concentrações crescentes de moléculas de diacorpos TCR/mAb. Depois de 48 horas de cultura conjunta, a lise celular foi quantificada por meio de ensaios de liberação de LDH de acordo com as instruções do fabricante (Promega).

[00114] A Figura 12 mostra os resultados de um ensaio de liberação de LDH com as estruturas de diacorpos TCR/mAb biespecíficos IA_5 e IA_6, que utilizam um TCR maturado por estabilidade e afinidade e uma versão aperfeiçoada do mesmo, respectivamente, contra o peptídeo associado a tumor PRAME-004 (SEQ Nº 49) apresentado em HLA-A*02. Células T positivas para CD8 isoladas de doadores saudáveis foram incubadas junto com a linhagem de células cancerosas U2OS, que apresentava cerca de 240 cópias por célula de complexos PRAME-004:HLA-A*02-1 ou células T2 não carregadas (proporção efetor:alvo de 5:1) na presença de concentrações crescentes de moléculas de diacorpo TCR/mAb. Depois de 48 horas de cultura conjunta, a lise celular foi quantificada por meio de ensaios de liberação de LDH de acordo com as instruções do fabricante (Promega).

[00115] A Figura 13 mostra os resultados de um ensaio de estabilidade sob estresse térmico das estruturas de diacorpos TCR/mAb biespecíficos IA_5 e IA_6, que utilizam um TCR maturado por estabilidade e afinidade e uma versão aperfeiçoada do mesmo, respectivamente, contra o peptídeo associado a tumor PRAME-004 (SEQ Nº 49) apresentado em HLA- A*02. Para isso, as proteínas foram formuladas em PBS a uma concentração de 1 mg/mL e depois armazenadas a 40ºC por duas semanas. A integridade e a recuperação das proteínas foram avaliadas por HPLC-SEC. Portanto, a quantidade de componentes de alto peso molecular foi determinada de acordo com o porcentual da área de pico eluída antes do pico principal. A recuperação de proteína monomérica foi calculada comparando-se as áreas dos maiores picos de amostras submetidas ou não a estresse.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 - DESENHO DE DIACORPOS CONTENDO FC BIESPECÍFICOS PARA TCR E

MAB

[00116] Diacorpos TCR/mAb biespecíficos contendo Fc e moléculas de controle (mostradas na Figura 2) foram projetadas para se ligarem especificamente ao complexo TCR-CD3 humano e ao complexo peptídeo:MHC que compreende o peptídeo derivado de HIV SLYNTVATL (SEQ Nº 7) que se liga ao HLA-A2*01. Para seleção do alvo do complexo TCR-CD3, foram usados domínios VH e VL derivados do anticorpo humanizado específico para CD3 hUCHT1(V9) descrito por Zhu et al. (“Identification of heavy chain residues in a humanized anti-CD3 antibody important for efficient antigen binding and T cell activation. J Immunol, 1995, 155, 1903–1910”) ou domínios VH e VL derivados do anticorpo BMA031 específico para TCR alfa e beta descrito em Shearman et al. (“Construction, expression and characterization of humanized antibodies directed against the human alpha/beta T cell receptor. J Immunol, 1991, 147, 4366-73”) e empregados na versão humanizada da variante 10 (dados gerados internamente). Para criar especificidade contra o alvo do complexo peptídeo:MHC, foram usados domínios Valfa e Vbeta do 868Z11, um receptor humano de células T de cadeia única maturado por estabilidade e afinidade revelado por Aggen et al. (“Identification and engineering of human variable regions that allow expression of stable single-chain T cell receptors. PEDS, 2011, 24, 361-372”).

[00117] No caso de diacorpos TCR/mAb biespecíficos contendo Fc, sequências de DNA que codificam diversas combinações de VH e VL (correspondentes a VD1 e VD2, respectivamente) e Va e Vb (correspondentes a VR1 e VR2, respectivamente), assim como a codificação dos ligantes Link1 e Link2, foram obtidas por síntese gênica. As sequências de DNA resultantes foram clonadas em seus respectivos “frames” de modo a criar vetores de expressão que codificam a região da dobradiça e domínios CH2 e CH3 derivados de IgG4 humana [sequência nº K01316] e IgG1 [sequência nº P01857], respectivamente, e foram submetidas a manipulações subsequentes.

Foram realizadas manipulações para incluir mutações do tipo chave-e-fechadura em domínios CH3, com e sem estabilização adicional da ligação bissulfeto entre as cadeias, para remover um sítio de N-glicosilação em CH2 (p.ex. mutação N297Q), para introduzir mutações silenciadoras de Fc, para introduzir melhor estabilização da ponte bissulfeto em VL e VH, respectivamente, tudo de acordo com os métodos descritos por Reiter et al. (“Stabilization of the Fv Fragments in Recombinant Immunotoxins by Disulfide Bonds Engineered into Conserved Framework Regions. Biochemistry, 1994, 33, 5451-5459”). A Tabela 1 apresenta uma visão geral dos diacorpos biespecíficos para TCR/mAb, as variantes e as sequências correspondentes do mesmo.

[00118] Tabela 1: Apresentação de todos os diacorpos biespecíficos TCR/mAb contendo Fc gerados e avaliados.

[00119] C&F: Chave-e-fechadura; K/O: Fc silenciado; C&F- ds: Chave-e-fechadura estabilizado por ligação bissulfeto criada artificialmente que conecta CH3:CH3’; ds-hUCHT1(V9): domínios variáveis estabilizados por ligação bissulfeto hUCHT1(V9); Link1: Ligante conectando VR1 e VD1. Molécula TCR mAb SEQ Nº modificações IA-IgG4 868Z11 hUCHT1(V9) SEQ ID No. 8 IgG4 (KiH) SEQ ID No. 9 IA_1 868Z11 hUCHT1(V9) SEQ ID No. 10 IgG1 (K/O, KiH) SEQ ID No. 11 IA_2 868Z11 hUCHT1(V9) SEQ ID No. 12 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 13 IA_3 868Z11 ds-hUCHT1(V9) SEQ ID No. 14 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 15 ID_1 868Z11 ds-hUCHT1(V9) SEQ ID No. 16 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 17 IC_4 868Z11 hBMA031(var10) SEQ ID No. 18 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 19 IC_5 868Z11 hBMA031(var10) SEQ ID No. 20 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 21 extended Link1 ID_4 868Z11 hBMA031(var10) SEQ ID No. 22 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 23 ID_5 868Z11 hBMA031(var10) SEQ ID No. 24 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 25 extended Link1 IA_5 R16P1C10I hUCHT1(Var17) SEQ ID No. 43 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 44 IA_6 R16P1C10I#6 hUCHT1(Var17) SEQ_ID No. 45 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 46

[00120] Foram construídas várias moléculas de controle que apresentam as mesmas especificidades (Tabela 2) usando os mesmos domínios VH, VL, Valfa e Vbeta em combinação com domínios constantes derivados de IgG1 ou IgG4 compreendendo características introduzidas por engenharia genética, conforme descrito anteriormente.

[00121] Tabela 2: Apresentação de todas as moléculas de controle biespecíficas contendo Fc geradas e avaliadas.

[00122] KiH: Chave-e-fechadura; K/O: Fc silenciado. Molécula TCR mAb SEQ Nº modificações III-IgG4 868Z11 hUCHT1(V9) SEQ ID No. 38 IgG4 (KiH) SEQ ID No. 39 IV-IgG4 868Z11 hUCHT1(V9) SEQ ID No. 40 IgG4 SEQ ID No. 41 II 868Z11 hUCHT1(V9) SEQ ID No. 33 IgG1 (K/O, KiH) SEQ ID No. 34 III 868Z11 hUCHT1(V9) SEQ ID No. 35 IgG1 (K/O, KiH) SEQ ID No. 36 IV 868Z11 hUCHT1(V9) SEQ ID No. 37 IgG1 (K/O) SEQ ID No. 42 EXEMPLO 2 - PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DIACORPOS TCR/MAB BIESPECÍFICOS

QUE CONTÊM FC

[00123] Foram projetados vetores de expressão de proteínas recombinantes monocistrônicos controlados por elementos promotores derivados de HCMV (derivados de pUC19). O DNA de plasmídio foi amplificado em E. coli de acordo com métodos de cultura padrão e depois purificado por kits disponíveis comercialmente (Macherey e Nagel). O DNA plasmídico purificado foi usado para transfecção transitória de células CHO-S de acordo com as instruções do fabricante (sistema ExpiCHO™; Thermo Fisher Scientific). As células CHO transfectadas foram cultivadas por 6 a 14 dias entre 32°C e 37°C e depois expostas uma ou duas vezes à solução ExpiCHO™ Feed.

[00124] O sobrenadante das células condicionadas foi colhido por centrifugação (4000 x g; 30 minutos) e depurado por ultrafiltração (0,22 µm).

As moléculas biespecíficas foram purificadas usando-se um sistema Äkta Pure 25 L de FPLC (GE Lifesciences) equipado para realizar cromatografia em linha de afinidade e de exclusão por tamanho. A cromatografia de afinidade foi realizada em colunas de proteína A (GE Lifesciences) de acordo com protocolos padronizados de cromatografia de afinidade. A cromatografia de exclusão por tamanho foi realizada diretamente após eluição (pH 2,8) da coluna de afinidade de modo a obter proteína monomérica de alta pureza usando-se colunas Superdex 200 pg 16/600 (GE Lifesciences) de acordo com protocolos padronizados. As concentrações de proteína foram determinadas por um sistema NanoDrop (Thermo Scientific) usando coeficientes de extinção calculados de acordo com as sequências proteicas previstas. A concentração (quando necessário) e a troca de tampões foram realizadas por equipamentos Vivaspin (Sartorius). Finalmente, as moléculas purificadas foram armazenadas em solução salina com tampão fosfato em concentrações de cerca de 1 mg/mL e temperaturas de 2ºC a 8°C.

[00125] Como toda proteína terapêutica precisa apresentar alguma estabilidade ao ser exposta ao ácido a fim de que possam ser usados processos robustos para purificação em escala industrial, foi medido o porcentual de proteína monomérica eluído da coluna de captura de proteína A (Tabela 3).

Ficou evidente que a introdução de mutações estabilizadoras em moléculas e a seleção de orientações diferentes de domínios ligantes afetou bastante a estabilidade durante a exposição ao ácido.

[00126] Tabela 3: Fracionamento da proteína monomérica em coluna de captura após eluição em ácido: Molécula Monômero eluído da coluna de captura (% da área total do pico) IA-IgG4 (VH-beta) n.d. IA_1 (VH-beta) 49 IA_2 (VH-beta) 54 IA_3 (dsVH-beta) 63

ID_1 (alfa-dsVH) 46 IC_4 (VH-alfa) 62 IC_5 (VH-alfa) 67 ID_4 (alfa-VH) 65 ID_5 (alfa-VH) 69 II 39 III 51 IV 76

[00127] Após cromatografia de exclusão por tamanho, as moléculas biespecíficas purificadas mostraram alta pureza (>93% de proteína monomérica), constatada por HPLC-SEC em colunas MabPac SEC-1 (5 µm, 7,8 × 300 mm) em fosfato de sódio 50 mM a pH 6,8 com NaCl 300 mM em um sistema Agilent 1100 (ver Figura 3). Géis SDS‐PAGE redutores e não-redutores confirmaram a pureza e o tamanho esperado das várias moléculas de TCR/mAb de dupla especificidade (dados não mostrados).

EXEMPLO 3 - ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T ESPECÍFICA E DEPENDENTE DE CÉLULAS- ALVO INDUZIDA POR DIACORPOS TCR/MAB CONTENDO FC

[00128] A potência dos diacorpos TCR/mAb que contêm Fc para ativação de células T foi avaliada em um bioensaio de ativação de células T (Promega). O ensaio usou uma linhagem de células Jurkat com genoma modificado para expressar um gene repórter de luciferase acionado por um elemento de resposta ao NFAT. Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, células T2 foram carregadas com o peptídeo específico para o HIV SLYNTVATL (SEQ Nº 7) ou deixadas sem carregar (controle sem carga) e depois cultivadas junto com células Jurkat modificadas fornecidas pela Promega na presença de concentrações crescentes de moléculas TCR/mAb biespecíficas. A ativação de células T Jurkat com gene repórter foi analisada depois de 16 a 20 horas por mensuração da intensidade da luminescência.

[00129] São mostrados ensaios de potência representativos para moléculas de TCR/mAb à base de IgG4 (Figure 4) e de IgG1 (Figura 5),

respectivamente. Os dados indicam que, independentemente do isotipo de IgG ou dos domínios constantes usados, as estruturas diacorpo TCR/mAb contendo Fc IA e ID foram melhores em ativar as células T que outras estruturas de TCR/mAb 2, 3I e 4 conforme medido pela magnitude da ativação e/ou dos respectivos valores de EC50. Outrossim, a ativação de células T inespecífica de diacorpos TCR/mAb contendo Fc induzida contra células T2 sem carga foi reduzida ou pelo menos igual ao nível de ativação inespecífica observada com outras estruturas biespecíficas do tipo TCR/mAb. De acordo com os resultados acima, os diacorpos TCR/mAb de dupla especificidade são as moléculas preferidas para intervenção terapêutica, pois induzem ativação do efetor T de forma altamente específica para o alvo.

[00130] Outrossim, o ensaio de liberação de LDH (Promega) foi usado para quantificar a lise mediada por CMSP de células T2 carregadas com o peptídeo SLYNTVATL (SEQ Nº 7) induzida por várias moléculas biespecíficas de TCR/mAb (Figura 10). De forma congruente com os resultados descritos anteriormente para o bioensaio de ativação de células T, as estruturas de diacorpos TCR/mAb contendo Fc IA e ID mostraram-se superiores às estruturas 2, 3 e 5 de diacorpos TCR/mAb biespecíficos, o que foi indicado pelo aumento do nível absoluto de lise de células-alvo e diminuição da concentração de TCR biespecífico necessária para atingir metade da morte máxima (EC50) de células alvo. Quanto às estruturas de TCR/mAb 2, 3 e 4, os diacorpos TCR/mAb com estrutura IA e ID não induziram lise de células T2 carregadas com um peptídeo não relevante (SEQ Nº 49), o que demonstra a especificidade da lise celular para células T2.

EXEMPLO 4 - DESENVOLVIMENTO DE DIACORPOS BIESPECÍFICOS TCR/MAB

CONTENDO FC COMO PLATAFORMA MOLECULAR

[00131] As estruturas de diacorpos TCR/mAb biespecíficos contendo Fc foram projetadas para servirem como plataformas moleculares e fornecer suporte para domínios variáveis derivados de TCR e mAb que atuam contra vários complexos peptídeo/MHC e antígenos superficiais de células efetoras, respectivamente. Para avaliar se a plataforma era adequada, os domínios variáveis derivados de mAb foram trocados em um primeiro conjunto de moléculas. Os domínios variáveis do anticorpo anti-CD3 hUCHT1(V9) (estrutura ID_1) foram substituídos pelos domínios do anticorpo anti-TCR hBMA031(var10) com orientação de domínios idêntica (estruturas ID_4 e ID_5) ou diferente (IC_4, IC_5) (ver detalhes na Tabela 1 e na Figura 7). A expressão, a purificação e a caracterização dessas moléculas foram realizadas conforme descrito anteriormente. Segundo as análises HPLC-SEC, a pureza e a integridade dos preparados finais foram superiores a 92%.

[00132] O ensaio de potência revelou ativação de células T repórter do tipo Jurkat e atividade inespecífica mínima contra células T2 não carregadas, tanto para domínios variáveis de anticorpos hUCHT1 (estrutura ID_1) e hBMA031 (estrutura ID_4 e ID_5), o que fundamenta a estabilidade da plataforma das estruturas de diacorpos TCR/mAb de dupla especificidade (Figura 6). Cabe assinalar que, quando os domínios de TCR variável e mAb das estruturas ID_4 e ID_5 foram trocados nas duas cadeias polipeptídicas, foram criadas estruturas IC_4 e IC_5 que não induziam ativação de células T (dados não mostrados). Este último achado indica que, embora se possam usar diacorpos TCR/mAb biespecíficos como estrutura de plataforma para incorporar diversos domínios variáveis TCR e mAb, é preciso otimizar cuidadosamente a orientação dos domínios para se obter a atividade molecular ideal.

EXEMPLO 5 - ESTABILIDADE DE DIACORPOS TCR/MAB BIESPECÍFICOS QUE CONTÊM

FC

[00133] A estabilidade de moléculas biespecíficas de TCR/mAb foi avaliada inicialmente pelo Protein Thermal Shift Assay (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante e usando um sistema 7500 de PCR em tempo real (Applied Biosciences). Resumidamente, as moléculas purificadas foram misturadas com tampão PTS e corante PTS e sujeitas a um gradiente de temperatura crescente para monitorar constantemente a fluorescência das amostras. Os sinais de fluorescência registrados foram analisados pelo software PTS (Thermo Fisher Scientific), e os pontos de fusão (TF) foram calculados pelo método da derivada.

[00134] Estudos de estabilidade sob estresse foram realizados armazenando-se moléculas purificadas dissolvidas em PBS a 40°C por até 2 semanas. Foram analisadas amostras para avaliar a integridade de proteínas por meio de HPLC-SEC e ensaios de potência usando o ensaio de ativação de células T (Promega), conforme descrito anteriormente.

[00135] Conforme esperado, o armazenamento a 40°C induziu a formação de agregados e componentes com alto peso molecular, conforme demonstrado por ensaios de HPLC-SEC (ver Figura 8). Os resultados dos ensaios de potência de moléculas à base de IgG1 após purificação e incubação a 40ºC são mostrados na Figura 9. Embora nenhuma das moléculas testadas tenha apresentado redução significativa da potência após armazenamento a 40°C, observou-se que as moléculas 3 e 4 expostas ao estresse induziram quantidade significativa de ativação inespecífica (independente do alvo) de células T Jurkat. Em contraste, os diacorpos TCR/mAb biespecíficos mantiveram sua potência dependente do alvo, embora a HPLC-SEC tenha evidenciado alguns agregados.

EXEMPLO 6: GERAÇÃO DE MOLÉCULAS DE DIACORPOS TCR/MAB BIESPECÍFICAS

COM AÇÃO ANTICÂNCER

[00136] Para validar melhor as capacidades de plataforma de estruturas de diacorpos TCR/mAb biespecíficas, os domínios variáveis derivados de TCR foram trocados por domínios variáveis de um TCR, que foi maturado para melhorar a estabilidade e afinidade por meio de exposição em leveduras de acordo com um método descrito anteriormente (Smith et al, 2015, “T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform. Methods Mol Biol. 1319:95-141”). Os domínios variáveis do TCR, que se ligam especificamente ao peptídeo derivado do HIV SLYNTVATL (SEQ Nº 7) no contexto de HLA-A*02, foram trocados por domínios variáveis de TCR que se ligam especificamente ao peptídeo associado a tumores PRAME-004 (SEQ Nº 49) ligado ao HLA-A*02. Outrossim, os domínios variáveis do anticorpo humanizado recrutador de células T hUCHT1(V9) foram trocados por domínios variáveis de hUCHT1(Var17), uma versão humanizada do anticorpo UCHT1, criando assim um diacorpo TCR/mAb anti-PRAME denominado IA_5, formado por SEQ Nº 43 e SEQ Nº 44. A expressão, a purificação e a caracterização dessa molécula foram realizadas conforme descrito no Exemplo 2. Segundo a análise HPLC-SEC, a pureza e a integridade dos preparados finais foram superiores a 96%.

[00137] As afinidades de ligação ao diacorpo TCR/mAb biespecífico para o PRAME-004:HLA-A*02 foram determinadas por interferometria de biocamada. As mensurações foram realizadas em um equipamento Octet RED384 seguindo-se as configurações recomendadas pelo fabricante. Resumidamente, moléculas de diacorpo biespecífico TCR/mAb foram purificadas e carregadas em biossensores (AHC) antes de serem analisadas diluições seriadas de HLA-A*02/PRAME-004.

[00138] A capacidade de indução de lise celular tumoral da estrutura de diacorpo TCR/mAb com atividade anti-PRAME-004 foi avaliada medindo-se, por meio de um ensaio de liberação de LDH, a lise das linhagens celulares de câncer humano UACC-257, SW982 e U2OS, cujas superfícies celulares apresentam níveis variáveis de cópias do peptídeo PRAME-004 associado ao HLA-A*02 (cerca de 1100 em UACC-257, cerca de 770 em SW982 e cerca de 240 U2OS cópias de PRAME-004 por célula, conforme determinado por análise de M/S quantitativa).

[00139] Conforme mostrado na Figura 11, a estrutura do diacorpo TCR/mAb anti-PRAME-004 IA_5 induziu lise de linhagens de células tumorais PRAME-004 de forma dependente da concentração. Até células tumorais U2OS, que expressavam apenas 240 cópias de PRAME-004 por célula, foram lisadas de forma eficiente pela molécula do diacorpo TCR/mAb. Esses resultados corroboram o fato de que o diacorpo TCR/mAb se aplica à plataforma molecular, permitindo a introdução de domínios variáveis de vários TCRs e de domínios variáveis de vários anticorpos recrutadores de células T.

EXEMPLO 7: EXEQUIBILIDADE DA CRIAÇÃO DE ESTRUTURAS DE DIACORPOS TCR/MAB

[00140] Os domínios variáveis de TCR usados na estrutura IA_5 foram aperfeiçoados ainda mais em relação à sua afinidade para PRAME- 004 e estabilidade do TCR e depois usados para confecção de um suporte para um diacorpo TCR/mAb, o que levou à construção da estrutura IA_6, que compreende SEQ Nº 45 e SEQ Nº 46). A expressão, purificação e caracterização das moléculas de diacorpo TCR/mAb IA_5 e IA_6 foram realizadas conforme descrito no Exemplo 2. Segundo a análise HPLC-SEC, a pureza e a integridade dos preparados finais foram superiores a 97%.

[00141] A variante IA-6 do diacorpo TCR/mAb anti-PRAME- 004 teve sua potência, estabilidade e afinidade avaliadas em experimentos de citotoxicidade nos quais a linhagem celular tumoral U2OS (que apresenta pequenas quantidades de PRAME-004:HLA-A*02) ou células T2 não carregadas foram usadas como células-alvo e células T CD8 humanas foram usadas como células efetoras.

[00142] Conforme mostrado na Figura 12, os inventores observaram aumento da potência citotóxica da molécula de diacorpo TCR/Ab IA_6, que compreende os domínios variáveis da variante de TCR com estabilidade e afinidade aumentadas em relação à estrutura precursora IA_5. A lise dependente de PRAME-004 foi confirmada em ambas as estruturas (IA_5 e IA_6), uma vez que não se detectou citólise de células T2, que eram negativas para o alvo.

[00143] As estruturas proteicas foram submetidas novamente a estresse térmico a 40°C por até duas semanas para analisar a estabilidade das variantes IA_5 e IA_6 de diacorpos TCR/mAb específicos para PRAME-004. As análises por HPLC-SEC após o estresse térmico revelaram melhora significativa da variante IA_6 em comparação com a estrutura precursora IA_5 (ver Figura 13). O aumento de espécies de alto peso molecular induzido pela temperatura (i.é. eluição antes do pico principal) das estruturas foi menos acentuado com IA_6 que com IA_5. De forma congruente com esse resultado, a recuperação de proteína monomérica intacta após o estresse térmico foi de 87% e 92% para IA_5 e IA_6, respectivamente.

[00144] Esses dados de engenharia exemplares demonstram que estruturas de diacorpos TCR/mAb estáveis e de alta potência podem ser aperfeiçoadas incorporando-se domínios variáveis de TCR que promovem a estabilidade e a afinidade, o que resulta em proteínas terapêuticas com melhores características.

EXEMPLO 8: EXEMPLOS DE ESTRUTURAS PREFERIDAS

[00145] Além da estrutura de TCR biespecífica e específica para o HIV aqui descrita (SEQ Nº 16 e SEQ Nº 17, na orientação D), a invenção fornece também várias outras estruturas exemplares de HIV, que foram testadas.

Essas estruturas baseiam-se em versões humanizadas aperfeiçoadas do anticorpo anti-CD3 subjacente (UCHT1), que foram fundidas com o TCR 868 específico para o HIV, conforme aqui revelado, em todas as quatro orientações possíveis (SEQ Nº 51 a SEQ Nº 58, nas orientações A a D).

[00146] A humanização do UCHT1 foi realizada usando-se

VH-1-46 e VK1-018 como suportes aceitadores (“frameworks”) para CDRs de cadeia pesada e leve, respectivamente. Os segmentos J selecionados foram JK1 e JH4 para cadeias leves e pesadas, respectivamente.

[00147] Os resultados obtidos são mostrados a seguir na Tabela 4: V9 (Zhu et al., 1995) Presente invenção Escore DRB1 1232 ~1190 Título [mg/L] 0,75 3 Tm de F(ab) [°C] 83,0 86,4 EC50 da ativação de células efetoras 63 8 [pM]

[00148] Os dados na Tabela 4 mostram que a humanização da invenção oferece menos potencial imunogênico (escore DRB1 mais baixo) e que as moléculas são mais estáveis (ponto de fusão 3ºC maior) e mais potentes (EC50 cerca de 8 vezes menor) que o padrão (V9). (Ver ensaio no Exemplo 3).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. UM ANTICORPO DE DUPLA ESPECIFICIDADE selecionado do grupo de moléculas formado por uma primeira cadeia polipeptídica e por uma segunda cadeia polipeptídica, sendo que: a primeira cadeia polipeptídica compreende uma primeira região ligante com domínio variável (VD1) de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno da superfície celular de uma célula efetora imune; e uma primeira região ligante de um domínio variável (VR1) de um TCR que se liga especificamente a um epítopo de um peptídeo associado a MHC; e um primeiro ligante (LINK1) que conecta os referidos domínios; a segunda cadeia polipeptídica compreende uma segunda região ligante de um domínio variável (VR2) de um TCR que se liga especificamente a um epítopo de um peptídeo associado a MHC; e uma segunda região ligante de um domínio variável (VD2) de um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno da superfície celular de uma célula efetora imune humana; e um segundo ligante (LINK2) que conecta os referidos domínios; sendo que a primeira região ligante (VD1) e a referida segunda região ligante (VD2) se associam de modo a formar um primeiro sítio de ligação (VD1)(VD2) que se liga a um antígeno da superfície celular de uma célula imune efetora humana; a referida primeira região ligante (VR1) e a referida segunda região ligante (VR2) se associam de modo a formar um segundo sítio de ligação (VR1)(VR2) que se liga ao referido epítopo peptídico associado ao MHC; onde as duas cadeias polipeptídicas referidas anteriormente são fundidas de modo a formar domínios de dobradiça de IgG humana e/ou domínios de Fc de IgG humana ou porções dimerizantes dos mesmos; e onde as duas cadeias polipeptídicas referidas anteriormente são conectadas uma à outra por ligações covalentes e/ou não-covalentes entre os referidos domínios de dobradiça e/ou os domínios Fc; e onde a referida molécula de polipeptídeo de dupla especificidade é capaz de se ligar simultaneamente à molécula da superfície celular e ao epítopo peptídico associado a MHC; e molécula polipeptídica de dupla especificidade, caracterizada pela ordem das regiões ligantes das duas cadeias polipeptídicas é uma dentre VD1- VR1 e VR2-VD2 ou VD1-VR2 e VR1-VD2, ou VD2-VR1 e VR2-VD1 ou VD2-VR2 e VR1-VD1 e onde os domínios são conectados um ao outro por LINK1 ou LINK2.

2. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela ordem das regiões ligantes das cadeias polipeptídicas é uma dentre VD1-VR1 e VD2-VR2; e onde os domínios são conectados por LINK1 ou LINK2, respectivamente.

3. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelas sequências ligantes LINK1 e/ou LINK2 contêm pelo menos um motivo de sequência selecionado dentre GGGS, GGGGS, TVLRT, TVSSAS e TVLSSAS.

4. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela primeira e a segunda cadeias polipeptídicas referidas compreendem também pelo menos um domínio tipo dobradiça e um domínio Fc ou porções dos mesmos derivados de IgG1, IgG2 ou IgG4 humanas.

5. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo domínio Fc compreender pelo menos uma mutação silenciadora da função efetora em um resíduo selecionado entre as posições 233, 234, 235, 236, 297 e 331, onde, preferivelmente, a referida mutação silenciadora da função efetora é gerada substituindo-se pelo menos um resíduo nas posições 233, 234, 235, 236 e 331 pelo resíduo correspondente derivado de IgG2 ou IgG4.

6. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada pelo domínio Fc compreender um domínio CH3 que compreende pelo menos uma mutação facilitadora da formação de heterodímeros.

7. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelas mutações se encontrarem em qualquer uma das posições entre 366, 368, 405 e 407, onde, preferivelmente, as referidas mutações compreendem as mutações do tipo chave-e-fechadura T366W e T366’S ou L368A’ e Y407’V.

8. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizada pelo referido domínio Fc compreende um ou mais domínios CH2 e CH3 que compreendem pelo menos dois resíduos a mais de cisteína, tais como, por exemplo, S354C e Y349C ou L242C e K334C.

9. AS MOLÉCULAS POLIPEPTÍDICAS de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizadas pelos domínios derivados de anticorpos VD1 e VD2 descritos anteriormente apresentam uma ponte bissulfeto artificial que introduz uma ligação covalente entre VD1 e VD2 e onde as referidas cisteínas são introduzidas na região estrutural (“framework”) (FR) 4 no caso VL na região estrutural (“framework”) no caso VH.

10. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pela molécula da superfície celular é sabidamente capaz de induzir ativação de células imunes ou, pelo menos, tenha sido selecionada do grupo formado por moléculas relacionadas à resposta imune, tais como CD3 (cadeias CD3γ, CD3δ e CD3ε), CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45RA, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD152, CD163, CD193, CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FcεRI, TCRα/β, TCRγ/δ e HLA-DR.

11. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelas regiões da primeira cadeia polipeptídica compreendem SEQ Nº 28 em VD1, SEQ Nº 29 em VR1 e SEQ Nº 30 em LINK1; e as regiões da segunda cadeia polipeptídica compreendem SEQ Nº 31 em VD2, SEQ Nº 32 em VR2 e SEQ Nº 30 em LINK2.

12. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, caracterizada pela região Fc da primeira cadeia polipeptídica compreende SEQ Nº 26 ou SEQ Nº 47 (Fc1) e a região Fc da segunda cadeia polipeptídica compreende SEQ Nº 27 ou SEQ Nº 48 (Fc2).

13. UMA MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA caracterizada pela dupla especificidade, que compreende SEQ Nº 16 ou SEQ Nº 43 ou SEQ Nº 45 ou SEQ Nº 51, 53, 55 ou 57, e uma segunda cadeia polipeptídica que compreende SEQ Nº 17 ou SEQ Nº 44 ou SEQ Nº 46 ou SEQ Nº 52, 54, 56 ou 58.

14. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pela referida molécula transportar um marcador detectável.

15. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo referido primeiro sítio de ligação (VD1)(VD2) que se liga a um antígeno da superfície celular das referidas células imunes é humanizado, e/ou o referido segundo sítio de ligação (VR1)(VR2) que se liga ao referido epítopo peptídeo associado ao

MHC é maturado de forma a proporcionar mais afinidade e/ou estabilidade.

16. UM ÁCIDO NUCLEICO caracterizado por codificar a primeira cadeia polipeptídica e/ou a segunda cadeia polipeptídica de acordo com as reivindicações 1 a 15 ou um vetor de expressão que compreende pelo menos um dos referidos ácidos nucleicos.

17. UMA CÉLULA HOSPEDEIRA caracterizada por compreender e, opcionalmente, expressar um vetor conforme definido na reivindicação 16.

18. UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por ser composta de uma molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16, ou a célula de acordo com a reivindicação 17, juntamente com um ou mais vetores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

19. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA caracterizada pela dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16, a célula de acordo com a reivindicação 17 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18 para uso em medicina.

20. A MOLÉCULA POLIPEPTÍDICA caracterizada pela dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16, a célula de acordo com a reivindicação 17 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18 para uso na prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio selecionada do grupo formado por câncer, doenças infecciosas e distúrbios imunológicos.

21. UM MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula polipeptídica de dupla especificidade de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16, a célula de acordo com a reivindicação 17 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação

18.