MX2014010185A

MX2014010185A - Uso de dominio de señalizacion cd2 en receptores de antigeno quimericos de segunda generacion.

Info

Publication number: MX2014010185A
Application number: MX2014010185A
Authority: MX
Inventors: Carl H June; John Scholler; Avery D Posey
Original assignee: Univ Pennsylvania
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2014-11-14
Also published as: US10501519B2; EP4275699A3; CA2864489C; IN2014DN06522A; US20230242612A1; US20210371495A1; BR112014020502A2; EP2817331B1; JP2015509716A; AU2013222284A1; US20180037625A1; EP2817331A4; EP2817331A1; ES2959443T3; KR20140127829A; US20140370045A1; CA2864489A1; EP4275699A2; IL233993A0; EA201491573A1

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer en un humano. La presente invención se refiere a la administración de una célula T modificada genéticamente que expresa un CAR que tiene un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, un dominio de señalización CD2, y un dominio de señalización CD3 zeta. La presente invención, también incluye la incorporación de CD2 en el CAR para alterar la producción de citocina de las células T CAR en direcciones tanto negativa como positiva.

Description

USO DE DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN CD2 EN RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICOS DE SEGUNDA GENERACIÓN Referencia Cruzada con las Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama prioridad de la Solicitud Norteamericana provisional No. de Serie 61/601,907, presentada el 22 de febrero de 2012, el contenido de la cual está incorporado en su totalidad a la presente descripción como referencia .

Antecedentes de la Invención Los linfocitos T modificados con receptores de antígeno quiméricos (CARs) que portan el dominio de señalización CD3-zeta, exhiben niveles moderados de citólisis de tumor objetivo y cantidades bajas de producción de citocina. La incorporación de dominios de señalización coestimuladores, normalmente aquellos de CD28 o 4-1BB, en CARs de segunda generación, incrementan de manera significativa la eliminación de las células objetivo y la producción de citocina. Se ha mostrado que la unión de la molécula CD2 natural tiene como resultado diferencias cuantitativas y cualitativas en comparación con la transducción de señal de calcio inducida por TCR. Los reportes recientes demostraron que el ligando del receptor CD2 endógeno, incrementa de manera significativa la IL-2 producida a partir de células T CAR de primera generación.

Los datos actuales indican que las células T CAR necesitan injertarse y sobreviven en pacientes que tienen respuestas de tumor clínicamente benéficas (Porter y asociados, 2011, N Engl J Med, 365: páginas 725 a 733). Sin embargo, la muerte de células T inducida por activación, puede ocurrir cuando se alcanza el umbral para demasiada transducción de señal (Viola y asociados, 1996, Science. 273(5271):104-6; Ren-Heiden reich y asociados, 2002, Cáncer Immunol Immunother, 2002: páginas 417 a 423; Bachmann y asociados, 1996, Eur J Immunol, 26(9): páginas 2017-22; Ren-Heidenreich y asociados, 2001, Curr Gene Ther, 1(3): páginas 253 a 255; Borthwick y asociados, 1996, Immunology, (4): páginas 508 a 515).

Por lo tanto, en la materia existe la necesidad urgente de composiciones de CARs que regulen las respuestas de células T para mejorar la supervivencia de la célula T CAR y proporcionen un ambiente benéfico para la actividad antitumor. La presente invención aborda esta necesidad.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde la región de señalización coestimuladora comprende el dominio de señalización CD2.

En una modalidad, el CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.

En una modalidad, el dominio de enlace de antígeno es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo. En una modalidad, el fragmento de enlace de antígeno es un Fab o un scFv. En una modalidad, el dominio de enlace de antígeno enlaza con un antígeno de tumor. En una modalidad, el antígeno de tumor está asociado con una afección hematológica. En una modalidad, el antígeno de tumor está asociado con un tumor sólido. En una modalidad, el antígeno de tumor se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, Glicolípido F77, EGFRvIll, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, la región de señalización coestimuladora comprende adicionalmente el dominio intracelular de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza de manera específica con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

La presente invención también proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) aislado, que comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde la región de señalización coestimuladora comprende el dominio de señalización CD2.

La presente invención también proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde la región de señalización coestimuladora comprende el dominio de señalización CD2.

La presente invención también proporciona una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde el dominio de señalización coestimuladora comprende el dominio de señalización CD2.

En una modalidad, la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula T, una célula asesina natural (NK), un linfocito T citotóxico (CTL) y una célula T reguladora.

En una modalidad, la célula exhibe una inmunidad antitumor cuando el dominio de enlace de antígeno enlaza a su antígeno correspondiente.

La presente invención también proporciona un método para estimular una respuesta inmune transmitida por célula T a una población celular o tejido objetivo en un mamífero, en donde el método comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva de una célula modificada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2 y un dominio de señalización CD3 zeta, y en donde el dominio de enlace de antígeno se selecciona para reconocer de manera específica la población celular o tejido objetivo.

La presente invención proporciona un método para proporcionar una inmunidad antitumor en un mamífero, el método comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una célula modificada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, y una señalización CD3 zeta, proporcionando de esta manera una inmunidad antitumor en el mamífero.

La presente invención proporciona un método para tratamiento de un mamífero que tiene un padecimiento, trastorno o condición asociada con una expresión elevada de antígeno de tumor, el método comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una célula modificada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, y un dominio de señalización CD3 zeta, tratando de esta manera al mamífero.

En una modalidad, la célula es una célula T autóloga. La presente invención proporciona un método para tratamiento de un humano con cáncer, el método comprende la administración al humano de una célula T diseñada para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, y un dominio de señalización CD3 zeta.

En una modalidad, el humano es resistente a por lo menos un agente quimioterapéutico.

La presente invención proporciona un método para generar una población persistente de células T diseñadas genéticamente en un humano diagnosticado con cáncer, el método comprende administrar al humano una célula T diseñada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno de dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde la población persistente de células T diseñadas genéticamente persiste en el humano durante al menos un mes después de la administración.

En una modalidad, la población persistente de células T diseñadas genéticamente, comprende por lo menos una célula seleccionada del grupo que consiste de una célula T que fue administrada al humano, una progenie de una célula T que fue administrada al humano y una combinación de las mismas.

En una modalidad, la población persistente de células T diseñadas genéticamente, comprende una célula T de memoria.

En una modalidad, el cáncer es leucemia linfocítica crónica. En una modalidad, la leucemia linfocítica crónica es leucemia CD19+ refractaria y linfoma.

En una modalidad, la población persistente de células T diseñada genéticamente, persiste en el humano durante por lo menos tres meses después de la administración.

En una modalidad, la población persistente de células T diseñadas genéticamente, persiste en el humano durante por lo menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, dos años o tres años después de la administración.

En una modalidad, el cáncer es tratado.

La presente invención proporciona un método para expandir una población de células T diseñadas genéticamente en un humano diagnosticado con cáncer, el método comprende administrar al humano una célula T diseñada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, en donde la célula T genéticamente diseñada administrada produce una población de progenie de células T en el humano.

En una modalidad, la progenie de células T en el humano comprende una célula T de memoria.

En una modalidad, la célula T es una célula T autóloga. En una modalidad, el humano es resistente a por lo menos un agente quimioterapéutico.

La presente invención incluye un método para modular la cantidad de citocina secretada por una célula T, dicho método comprende el diseño genético de la célula T para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de dominio coestimulador que comprende CD2 y un dominio de señalización CD3 zeta.

En una modalidad, la modulación de la cantidad de citocina secretada por una célula T reduce la proliferación de células T reguladoras.

La presente invención incluye un método para reducir la cantidad de activación inducida por influjo de calcio en una célula T, dicho método comprende el diseño genético de la célula T para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de dominio coestimulador que comprende CD2 y un dominio de señalización CD3 zeta.

En una modalidad, la reducción de la cantidad de influjo de calcio inducida por activación en una célula T evita la muerte celular inducida por activación de la célula T.

Breve Descripción de los Dibujos La siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la presente invención será comprendida mejor cuando sea leída en conjunto con los dibujos anexos. Con el propósito de ilustrar la presente invención, en los dibujos se muestran las modalidades que son las realmente preferidas. Sin embargo, se debe observar que la presente invención no está limitada a los arreglos e instrumentalidades precisas de las modalidades mostradas en los dibujos.

La figura 1, representa la secuencia de nucleótido para el CAR anti CD19-CD2 zeta (SEO. ID NO: 1).

La figura 2, representa los resultados de los experimentos de ejemplo que demuestran que las células T se activan y se proliferan a partir de las señales CD3/CD2. Las células T CD4 y CD8 de donador humano normal fueron estimuladas con cuentas magnéticas recubiertas con anticuerpos aCD2 (T11.1 y T11.2), aCD3 (OKT3), y aCD28 (9.3). La duplicación en número y población celular absoluta demuestra la proliferación celular. El tamaño de la célula representa el estado de la activación celular. La activación mediante señales CD2/CD3 induce de manera suficiente la activación y proliferación celular.

La figura 3, representa los resultados de los experimentos de ejemplo que demuestran que los CARs de CD2 liberan citocinas características de la respuesta inmune efectiva. Las células T de donador humano normal sometidas a electroporación por mARN CAR, fueron cocultivadas durante 24 horas con células de tumor objetivo y se midió la secreción de citocina. IL-2 e IFN-? se incrementan en SS1CD2z, similar a SS128z (superior). Sin embargo, la señal CD2 disminuye la secreción de citocina en SS128CD2z. CAR CD19CD2z produce cantidades similares de IL-2 e IFN-g en comparación con CD19z y CD1928Z.

La figura 4, representa los resultados de los experimentos de ejemplo que demuestran que los CARs con dominio de señalización CD2 son efectivos para eliminar las células de tumor. Las células T de donador humano normal sometidas a electroforesis por mARN CAR fueron cocultivadas con células de tumor objetivo durante 18 horas (izquierda) y 4 horas (derecha) a proporciones de efectorobjetivo variables. Las CARs CD2 eliminan de manera eficiente las células de tumor en ambos ensayos y las CARs se pueden comparar con los dominios de señalización CD3z o CD28Z.

La figura 5, representa los resultados de un experimento de ejemplo que demuestra que el dominio de señalización CD2 mejora la proliferación de célula T cuando las células T de donador humano normal sometidas a electroporesis por CAR fueron cocultivadas con células de tumor objetivo durante 5 días. No existe diferencia significativa en el número de células T CAR CD2 a los 3 días de la estimulación, aunque hubo un incremento de dos dobleces en el número de células T CAR CD2 después de 5 días, lo que sugiere que el dominio de señalización CD2 contribuye a la proliferación incrementada de células T cuando se agrega un CAR.

La figura 6, representa los resultados de un experimento de ejemplo que demuestra la respuesta de flujo de calcio de las células T CAR con los dominios de señalización CD258, CD2, CD137 además del dominio CD3 zeta. Las células T de donador humano normal sometidas a electroforesis de mARN CAR fueron cargadas con indicador de calcio lndo-1 AM y estimuladas con proteína de fusión de mesotelina Fe 30 segundos después del inicio del registro. Se muestran las proporciones de enlace de calcio (lndo-1 violeta) a calcio libre (lndo-1 azul) con el tiempo.

Las adiciones de dominio de señalización CD2 a SS1z incrementan la señal de flujo de calcio, pero no con tanta fuerza como el flujo de calcio SS128z.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer, que incluyen pero no se limitan a afección hematológica y tumores sólidos. La presente invención se refiere a una estrategia de transferencia de célula adoptiva de células T modificadas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR). Las CARs son moléculas que combinan especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno de tumor) con un dominio intracelular que activa el receptor de célula T, para generar una proteína quimérica que exhibe una actividad inmune celular antitumor específica.

La presente invención proporciona la incorporación de CD2 en un CAR con el objeto de alterar la producción de citocina de las células T que son diseñadas para expresar el CAR que comprende CD2. Como se plantea en cualquier otra parte de la presente descripción, la CD2 puede ser incorporada en un CAR para regular, tanto en forma negativa como positiva, la producción de citocina de las células T. Por consiguiente, el uso de CD2 en un CAR puede alterar la supervivencia de célula T CAR y la activación inducida de los umbrales de muerte celular.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para modular la cantidad de citocina secretada por una célula T. El método comprende el diseño genético de las células T para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de dominio coestimulador que comprende CD2 y un dominio de señalización CD3 zeta.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para reducir la cantidad de influjo de calcio inducido por activación en una célula T. El método comprende el diseño genético de las células T para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de dominio coestimulador que comprende CD2 y un dominio de señalización CD3 zeta.

La presente invención se refiere de manera general al uso de células T modificadas genéticamente para expresar de manera estable un CAR deseable. En la presente descripción, las células T que expresan un CAR son denominadas como células T CAR o células T modificadas por CAR. Preferentemente, la célula puede ser modificada genéticamente para expresar de manera estable un dominio de enlace de anticuerpo sobre su superficie, confiriendo una especificidad de antígeno que es independiente de MHC. En algunos casos, la célula T es modificada en forma genética para expresar de manera estable un CAR, que combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con un dominio intracelular de la cadena CD3-zeta o proteína FCYRI en una proteína quimérica única.

En una modalidad, el CAR de la presente invención comprende un dominio extracelular que tiene un dominio de reconocimiento de antígeno, un dominio transmembrana, y un dominio citoplásmico. En una modalidad, se utiliza el dominio transmembrana que está asociado de manera natural con uno de los dominios en el CAR. En otra modalidad, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante la sustitución de aminoácido para evitar el enlace de dichos dominios a los dominios de transmembrana de las mismas proteínas de superficie de membrana, iguales o diferentes, para reducir al mínimo las interacciones con otros elementos del complejo receptor. Preferentemente, el dominio transmembrana es el dominio de articulación CD8a.

Con respecto al dominio citoplásmico, el CAR de la presente invención puede estar diseñado para comprender el dominio de señalización CD2, CD28 y/o 4-1BB por sí mismo, o ser combinado con cualesquiera otros dominios citoplásmicos deseados útiles en el contexto del CAR de la presente invención. En una modalidad, el dominio citoplásmico del CAR puede ser diseñado para comprender adicionalmente el dominio de señalización de CD3-zeta. Por ejemplo, el dominio citoplásmico del CAR puede incluir, pero no se limita a los módulos de señalización CD3-zeta, CD2, 4-1BB y CD28, y las combinaciones de los mismos. Por consiguiente, la presente invención proporciona células T CAR y métodos para su uso para la terapia adoptiva.

En una modalidad, las células T CAR de la presente invención pueden generarse introduciendo un vector lentiviral que comprende el CAR deseado, por ejemplo, un CAR que comprende la unión anti-CD19, CD8a y dominio transmembrana, y dominios de señalización CD2 y CD3-zeta humanos, en las células. En una modalidad, las células T CAR de la presente invención tienen la capacidad de replicarse in vivo, lo que tiene como resultado la persistencia a largo plazo, que puede conducir a control sostenido de tumor.

En otra modalidad, las células T CAR de la presente invención pueden generarse transfectando un ARN que codifica el CAR deseado, por ejemplo, un CAR que comprende en las células un dominio anti-CD19, de articulación CD8a y de transmembrana, y dominios de señalización CD2 y CD3-zeta humanos. En una modalidad, el CAR es expresado en forma transitoria en las células T CAR modificadas genéticamente.

En una modalidad, la presente invención se refiere a la administración de una célula T modificada genéticamente que expresa CAR para el tratamiento de un paciente que tiene cáncer o está en riesgo de tener cáncer, utilizando una infusión de linfocito. Preferentemente, la infusión de linfocito autólogo es la utilizada en el tratamiento. Se recolectan las PBMCs autólogas de un paciente que necesita un tratamiento y las células T son activadas y expandidas utilizando los métodos descritos en la presente descripción y que son conocidos en la materia, y posteriormente se inyectan otra vez en el paciente.

En una modalidad, la presente invención se refiere a células T modificadas genéticamente que expresan un CAR para el tratamiento de un paciente con cáncer. La presente invención se basa en el descubrimiento de que, la inclusión del dominio de señalización CD2 dentro del dominio citoplásmico de un CAR influye de manera significativa en la producción de citocina y señalización de calcio en las células T modificadas con CAR. En una modalidad, la inclusión del dominio de señalización CD2 incrementa la producción de citocina. En otra modalidad, la inclusión del dominio de señalización CD2 reduce la producción de citocina. Por consiguiente, el dominio de señalización CD2 dentro del dominio citoplásmico de un CAR, ya sea solo o en combinación con otros dominios de señalización citoplásmicos, regula en forma positiva y negativa la producción de citocina en el sitio de tumor. En otra modalidad, el dominio de señalización CD2 dentro de un CAR reduce el influjo de calcio, evitando de esta manera la muerte celular inducida por la activación del CAR modificado genéticamente.

Aún en otra modalidad, la presente invención se refiere de manera general al tratamiento de un paciente en riesgo de desarrollar cáncer. La presente invención, también incluye el tratamiento de una afección o una enfermedad autoinmune en la cual, la quimioterapia y/o la inmunoterapia en un paciente tiene como resultado la inmunosupresión significativa en el mismo, incrementando de esta manera su riesgo a desarrollar cáncer.

La presente invención incluye el uso de células T que expresan un CAR anti-CD19, que incluye tanto CD3-zeta como el dominio coestimulador CD2 (también denominado como células T CART19). En una modalidad, las células T CART19 de la presente invención, pueden experimentar una expansión robusta de células T in vivo y pueden establecer células de memoria específicas CD-19 que persisten a niveles altos en la sangre y la médula espinal durante un período de tiempo prolongado. En algunos casos, las células T CART19 de la presente invención al ser inyectadas en un paciente pueden eliminar las células de leucemia in vivo, en pacientes con CLL resistente a la quimioterapia avanzada. Sin embargo, la presente invención no está limitada a las células T CART19. En su lugar, la presente invención incluye cualquier dominio de enlace de antígeno (por ejemplo, antimesotelina) fusionado con uno o más dominios intracelulares seleccionados del grupo de un dominio de señalización CD2, un dominio de señalización CD 137 (4-1BB), un dominio de señalización CD28, un dominio de señalización CD3-zeta y cualquier combinación de los mismos.

Definiciones A menos que sean definidos de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente descripción tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la materia a la cual pertenece la presente invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente descripción puedan utilizarse en la práctica para realizar las pruebas de la presente invención, los métodos y los materiales preferidos son los descritos en la presente descripción. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología.

También se deberá comprender que la terminología utilizada en la presente descripción tiene el propósito de describir únicamente las modalidades particulares y no pretende ser limitante.

Como se utiliza en la presente descripción, los artículos "un" y "uno, una" se refieren a uno o a más de uno, es decir, a por lo menos uno, del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

"Aproximadamente", como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a un valor que se puede medir, tal como una cantidad, una duración de tiempo y los similares, significa que abarca las variaciones del ±20% o el ±10%, más preferentemente el ±5%, todavía más preferentemente el ±1%, y aún más preferentemente el ±0.1% del valor especificado, ya que dichas variaciones son adecuadas para realizar los métodos descritos.

Como se utiliza en la presente descripción, el término "activación" se refiere al estado de una célula T que ha sido estimulada de manera suficiente para inducir la proliferación celular que se puede detectar. La activación también puede asociarse con la producción de citocina inducida, y las funciones efectoras que se pueden detectar.

El término "células T activadas" se refiere, entre otras cosas, a células T que están experimentando una división celular.

El término "anticuerpo", como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se enlaza de manera específica con un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunoreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos, normalmente son tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en una variedad de formas incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, así como también, anticuerpos de cadena única y anticuerpos humanizados (Harlow y asociados, 1999, En: "Uso de Anticuerpos: un Manual de Laboratorio" (Using Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow y asociados, 1989, En: "Anticuerpos: un Manual de Laboratorio" (Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston y asociados, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: páginas 5879 a 5883; Bird y asociados, 1988, Science 242: páginas 423 a 426).

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y hace referencia a la determinación antigénica de regiones variables de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Una "cadena pesada de anticuerpo", como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la más larga de los dos tipos de cadenas de polipéptidos presentes en todas las moléculas de anticuerpos en sus conformaciones de origen natural.

Una "cadena ligera de anticuerpo", como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la más pequeña de los dos tipos de cadenas de polipéptidos presentes en todas las moléculas de anticuerpos en sus conformaciones de origen natural. Las cadenas ligeras K y A se refieren a los dos isotipos principales de cadena ligera de anticuerpo.

Por el término "anticuerpo sintético" como se utiliza en la presente descripción, se entiende un anticuerpo, el cual es generado utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago como el que se describe en la presente descripción. El término también debe ser interpretado con el significado de un anticuerpo, el cual se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácido que especifica el anticuerpo, en donde el ADN o la secuencia de aminoácido se ha obtenido utilizando ADN sintético o la tecnología de secuencia de aminoácido que está disponible y es bien conocida en la materia.

El término "antígeno" o "Ag" como se utiliza en la presente descripción, es definido como una molécula que provoca una respuesta inmune. Esta respuesta inmune puede involucrar, ya sea la producción de anticuerpos o la activación de células competentes inmunológicamente específicas, o ambas. Los expertos en la materia comprenderán que cualquier macromolécula, incluyendo virtualmente todas las proteínas o péptidos, pueden servir como un antígeno. Adicionalmente, los antígenos pueden ser derivados de ADN recombinante o genómico. Un experto en la materia comprenderá que cualquier ADN, el cual comprende una secuencia de nucleótido o una secuencia de nucleótido parcial que codifica una proteína que suscita una respuesta inmune, codifica de esta manera a un "antígeno", como el término que se utiliza en la presente descripción. Adicionalmente, un experto en la materia comprenderá que un antígeno no necesita ser codificado únicamente por una secuencia de nucleótido de longitud completa de un gen. Es evidente que la presente invención incluye, pero no se limita al uso de secuencias de nucleótido parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótido están dispuestas en varias combinaciones para suscitar la respuesta inmune deseada. Además, un experto en la materia comprenderá que un antígeno no necesita ser codificado en absoluto por un "gen". Es fácilmente apreciable que un antígeno puede generarse sintetizado o puede ser derivado de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, aunque no está limitada a una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido biológico.

El término "efecto antitumor" como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un efecto biológico, el cual puede ser manifestado por una disminución en el volumen del tumor, una disminución en el número de células de tumor, una disminución en el número de metástasis, un incremento en la expectativa de vida, o una mejoría en varios de los síntomas fisiológicos asociados con la condición cancerosa. Un "efecto antitumor", también puede manifestarse por la habilidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la presente invención para la prevención del surgimiento de un tumor en el primer lugar.

El término "autoantígeno" significa, de acuerdo con la presente invención, cualquier auto antígeno que es reconocido en forma errónea como extraño por el sistema inmune. Los autoantígenos comprenden, pero no se limita a, proteínas celulares, fosfoproteínas, proteínas de superficie celular, lípidos celulares, ácidos nucleicos, glicoproteínas, que incluyen receptores de superficie de célula.

El término "enfermedad autoinmune", como se utiliza en la presente descripción, es definido como un padecimiento que tiene como resultado una respuesta autoinmune. Una enfermedad autoinmune es el resultado de una respuesta inadecuada o excesiva a un autoantígeno. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limita a, mal de Addison, alopecia greata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotitis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (tipo 1), epidermólisis bulosa distrófica, epididimits, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barr, mal de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pemfigus vulgaris, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma , síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitíligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerativa, entre otras.

Como se utiliza en la presente descripción, el término "autólogo", significa cualquier material derivado del individuo, el cual se introducirá posteriormente otra vez al mismo.

"Alogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal diferente de la misma especie.

"Xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

El término "cáncer" como se utiliza en la presente descripción, es definido como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido y descontrolado de células aberrantes. Las células de cáncer pueden dispersarse de manera local o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Los ejemplos de diversos cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de seno, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer colorectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y los similares.

El "ligando coestimulador", es un término que se utiliza en la presente e incluye una molécula en un antígeno que presenta una célula (por ejemplo, una aAPC, célula dendrítica, célula B, y los similares) que enlaza de manera específica una molécula coestimuladora cognado en una célula T, proporcionando de esta manera una señal en la cual, además de la señal primaria provista, por ejemplo, por el enlace de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, transmite una respuesta de célula T, que incluye pero no se limita a, proliferación, activación, diferenciación y los similares. Un ligando coestimulador puede incluir, aunque no se limita a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador que se puede inducir (ICOS-L), molécula de adhesión intracelular (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor beta de linfotoxina, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, un agonista o anticuerpo que enlaza al receptor de ligando Toll y un ligando que se enlaza de manera específica con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, a un anticuerpo que se enlaza de manera específica con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitarse a CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-I, ICOS, antígeno-l asociado con función de linfocito (LFA-I), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se enlaza de manera específica con CD83.

Una "molécula coestimuladora" se refiere a una parte de enlace cognado en una célula T que enlaza de manera específica a un ligando coestimulador, mediando de esta manera una respuesta coestimuladora mediante la célula T, tal como, pero que no se limita a proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero sin limitarse a una molécula clase I MHC, BTLA y un receptor de ligando Toll.

Una "señal coestimuladora", como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una señal, la cual en combinación con una señal primaria, tal como ligadura TCR/CD3, conduce a la proliferación celular y/o sobreregulación o subregulación de las moléculas clave.

Una "enfermedad" es un estado de salud de un animal, en donde el animal no puede mantener la homeostasis, y en donde si la enfermedad no es mejorada, entonces la salud del animal continúa deteriorándose. En contraste, un "trastorno" en un animal es un estado de salud en el cual, el animal tiene la capacidad de mantener la homeostasis, pero en el cual, el estado de salud del animal es menos favorable del que podría ser en la ausencia del padecimiento. Dejar sin tratamiento un trastorno, no necesariamente produce una disminución adicional en el estado de salud del animal.

El término "cantidad efectiva" como se utiliza en la presente descripción, significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico.

"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de las secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un cADN, o un mARN, para servir como plantilla para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en los procesos biológicos que tiene, ya sea una secuencia definida de nucleótidos (es decir, rARN, tARN y mARN) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas que resultan de las mismas. Por lo tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del mARN que corresponde a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena de codificación, la secuencia de nucleótido de la cual es idéntica a la secuencia de mARN y es provista normalmente en los listados de secuencias, como la cadena de no codificación, utilizada como la plantilla para la transcripción de un gen o cADN, puede denominarse como la codificación de proteína u otro producto de ese gen o cADN.

Como se utiliza en la presente descripción, "endógeno" se refiere a cualquier material de o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.

Como se utiliza en la presente descripción, "exógeno" se refiere a cualquier material introducido a o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

El término "expresión" como se utiliza en la presente descripción, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótido particular impulsada por su promotor.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende las secuencias de control de expresión enlazadas en forma operativa a una secuencia de nucleótido que va a ser expresada. Un vector de expresión comprende elementos de acción cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión, incluyen a todos aquellos conocidos en la materia, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus, y virus adeno-asociados) que incorporan al polinucleótido recombinante.

"Homólogo" se refiere a una similitud de secuencia o identidad de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas, es ocupada por la misma base o subunidad de monómero de aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN es ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de coincidencia o posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias divididas entre el número de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en las dos secuencias son coincidentes u homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas en un 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN ATTGCC y TATGGC comparten el 50% de homología. De manera general, se realiza una comparación cuando dos secuencias están alineadas para dar una homología máxima.

El término "inmunoglobulina" o "Ig", como se utiliza en la presente descripción, es definido como una clase de proteínas, las cuales funcionan como anticuerpos. Los anticuerpos expresados por las células B son denominados, en algunas ocasiones como el BCR (receptor de célula B) o receptor de antígeno. Los cinco miembros incluidos en esta clase de proteínas son gA, IgG, IgM, IgD, e IgE. IgA es el anticuerpo primario que está presente en las secreciones del cuerpo, tales como saliva, lágrimas, leche materna, secreciones gastrointestinales y secreciones de mucosa de los tractos respiratorios y genitourinarios. IgG es el anticuerpo circulante más común. IgM es la inmunoglobulina principal producida en la respuesta inmune primaria en la mayoría de los sujetos. Esta es la inmunoglobulina más eficiente en aglutinación, fijación de complementos y otras respuestas de anticuerpos, y es importante en la defensa contra bacterias y virus. IgD es la inmunoglobulina que no tiene función de anticuerpo conocida, pero puede servir como un receptor de antígeno. IgE es la inmunoglobulina que transmite la hipersensibilidad inmediata, provocando la liberación de los mediadores de los mastocitos y los basófilos a partir de la exposición al alérgeno.

Como se utiliza en la presente descripción, un "material de instrucción" incluye una publicación, un registro, un diagrama o cualquier otro medio de expresión, el cual se puede utilizar para comunicar la utilidad de las composiciones y los métodos de la presente invención. El material de instrucción del equipo de la presente invención puede, por ejemplo, fijarse a un contenedor, el cual contiene ácido nucleico, péptido y/o la composición de la presente invención o ser transportado junto con un contenedor, el cual contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición. De manera alternativa, el material de instrucción se puede transportar separado del contenedor, con la intención de que el material de instrucción y el compuesto serán utilizados en forma cooperativa con el receptor.

"Aislado", significa alterado o removido del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente naturalmente en un animal vivo no está "aislado", aunque el mismo ácido nucleico o péptido separado parcialmente o por completo de los materiales coexistentes de su estado natural esté "aislado". Un ácido nucleico aislado o proteína, puede existir en forma substancialmente purificada, o puede existir en un ambiente no nativo, tal como, por ejemplo, una célula huésped.

En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos que ocurren comúnmente. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina, y "U" se refiere a uridina.

A menos que sea especificado de otra forma, una "secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido", incluye a todas las secuencias de nucleótido que son versiones degeneradas entre si y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótido que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones, hasta el alcance en que la secuencia de nucleótido que codifica la proteína puede, en alguna versión, contener un intrón(es).

Un "lentivirus", como se utiliza en la presente descripción se refiere a la familia de retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus al tener la capacidad de infectar las células de no división; éstos pueden suministrar una cantidad significativa de información genética al ADN de la célula huésped, que es uno de los métodos más eficientes que realiza un vector de suministro de gen. VIH, VIS, y FN son ejemplos de lentivirus. Los vectores derivados de lentivirus ofrecen los medios para lograr niveles significativos de transferencia genética in vivo.

El término "modulación", como se utiliza en la presente descripción, significa transmitir un incremento o disminución que se puede detectar en el nivel de una respuesta en un sujeto, comparado con el nivel de una respuesta en el sujeto en la ausencia de un tratamiento o compuesto, y/o en comparación con el nivel de una respuesta en un sujeto de otra manera idéntico, pero sin tratar. El término abarca perturbar y/o afectar una señal nativa o respuesta, mediante la cual se transmite una respuesta terapéutica benéfica en un sujeto, preferentemente, un humano.

A menos que sea especificado de otra forma, una "secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido" incluye a todas las secuencias de nucleótido que son versiones degeneradas unas de las otras y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótido que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones.

El término, "enlazado en forma operativa" se refiere al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que tiene como resultado la expresión de la última. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico está enlazada en forma operativa con una segunda secuencia de ácido nucleico, cuando la primera secuencia de ácido nucleico está colocada en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está enlazado en forma operativa con una secuencia de codificación, si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. De manera general, las secuencias de ADN enlazadas en forma operativa son contiguas y, en los casos necesarios, unen dos regiones de codificación de proteína en el mismo marco de lectura.

El término antígeno de tumor "sobreexpresado" o "sobreexpresión" del antígeno de tumor, indica un nivel anormal de expresión del antígeno de tumor en una célula desde un área de enfermedad parecida a un tumor sólido dentro de un tejido u órgano específico del paciente, en relación con el nivel de expresión en una célula normal a partir de ese tejido u órgano. Los pacientes que tienen tumores sólidos o una afección hematológica caracterizada por la sobreexpresión del antígeno de tumor, pueden determinarse mediante los ensayos estándar conocidos en la materia.

La administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, por ejemplo, inyección subcutánea (s.c), intravenosa (i v.), intramuscular (i.m.), o intrasternal, o técnicas de infusión.

Los términos "paciente", "sujeto", "individuo" y los similares, se utilizan de manera intercambiable en la presente, y hacen referencia a cualquier animal, o las células del mismo, ya sea in vitro o in situ, sensibles a los métodos descritos en la presente descripción. En ciertas modalidades no limitantes, el paciente, sujeto o individuo es un humano.

El término "polinucleótido" como se utiliza en la presente descripción se define como una cadena de nucleótidos. Adicionalmente, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos y polinucleótidos como se utilizan en la presente descripción, son intercambiables. Un experto en la materia posee el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, los cuales pueden ser hidrolizados en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos pueden ser hidrolizados en nucleósidos. Como se utiliza en la presente descripción, polinucleótidos incluye, pero no se limita a todas las secuencias de ácido nucleico que son obtenidas por cualesquiera medios disponibles en la materia, que incluyen pero no se limitan a, medios recombinantes, es decir, la clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de una librería recombinante o un genoma celular, que utiliza la tecnología de clonación ordinaria y PCRTM y los similares, y a través de medios sintéticos.

Como se utilizan en la presente descripción, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable, y se refieren a un compuesto comprendido por residuos de aminoácido enlazados en forma covalente mediante enlaces de péptido. Una proteína o péptido pueden contener por los menos dos aminoácidos, y no se establece limitación sobre el número máximo de aminoácidos que puede comprender una secuencia de proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces de péptido.

Como se utiliza en la presente descripción, el término se refiere tanto a cadenas cortas, las cuales también son denominadas comúnmente en la materia, por ejemplo, como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, como también a cadenas más largas, las cuales generalmente son denominadas en la materia como proteínas, de las cuales existen muchos tipos. "Polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos substancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterod ímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.

El término "promotor", como se utiliza en la presente descripción es definido como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o la maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótido.

Como se utiliza en la presente descripción, el término "secuencia promotora/reguladora", significa una secuencia de ácido nucleico, la cual es requerida para la expresión de un producto genético enlazado en forma operativa a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia de mejoramiento y otros elementos reguladores, los cuales son requeridos para la expresión del producto genético. La secuencia promotora/reguladora puede, por ejemplo, se aquella que expresa el producto genético en una forma específica de tejido.

Un promotor "constitutivo", es una secuencia de nucleótido, la cual, cuando está enlazada en forma operativa con un polinucleótido, el cual codifica o especifica un producto genético, provoca que el producto genético sea producido en una célula bajo la mayor parte o todas las condiciones fisiológicas de la célula.

Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótido, la cual, cuando está enlazada en forma operativa con un polinucleótido que codifica o especifica un producto genético, provoca que el producto genético sea producido en una célula substancialmente solo cuando un inductor, el cual corresponde al promotor, está presente en la célula.

Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótido, la cual, cuando está enlazada en forma operativa con un polinucleótido que codifica o es especificado por un gen, provoca que el producto genético sea producido en una célula, sólo si la célula es substancialmente una célula del tipo de tejido que corresponde al promotor.

El término "enlaza de manera específica", como se utiliza en la presente descripción con respecto a un anticuerpo, significa un anticuerpo que reconoce un antígeno específico, aunque no reconoce o enlaza de manera sustancial a otras moléculas en una muestra. Por ejemplo, un anticuerpo que enlaza de manera específica a un antígeno de una especie, puede enlazar también a aquel antígeno de una o más especies. No obstante, dicha reactividad de especies cruzadas no altera por sí misma la clasificación de un anticuerpo como específica. En otro ejemplo, un anticuerpo que enlaza de manera específica a un antígeno, también puede enlazar a formas alélicas diferentes del mismo. Sin embargo, por sí misma dicha reactividad cruzada no altera la clasificación de un anticuerpo de manera específica. En algunos casos, los términos "enlace específico" o "que enlaza de manera específica", se pueden utilizar en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, lo cual significa que la interacción es dependiente de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítope) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y enlaza con una estructura de proteína específica en lugar de hacerlo de manera general con las proteínas. Si un anticuerpo es específico para el epítope "A", la presencia de una molécula que contiene el epítope A (o libre, no etiquetado A) en una reacción que contiene la etiqueta "A" y el anticuerpo, reducirá la cantidad de enlace A etiquetado para el anticuerpo.

El término "estimulación" significa una respuesta primaria inducida por el enlace de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) con su ligando cognado, mediando de esta manera un evento de transducción de señal, tal como, pero que no se limita a transducción de señal por medio del complejo TCR/CD3. La estimulación puede transmitir la expresión alterada de ciertas moléculas, tal como la subregulación de TGF-ß y/o reorganización de estructuras citoesq ueléticas y los similares.

El término "molécula estimuladora" como se utiliza en la presente descripción, significa una molécula en una célula T que enlaza de manera específica a un ligando estimulador cognado presente en una célula que presenta un antígeno.

Un "ligando estimulador" como se utiliza en la presente descripción, significa un ligando que, cuando está presente en una célula que presenta un antígeno (por ejemplo, una célula aAPC, una célula dend rítica , una célula B, y los similares) puede enlazarse de manera específica con una parte de enlace cognado (denominado en la presente como una "molécula estimuladora") en una célula T, mediando de esta manera una respuesta primaria de la célula T, que incluye, pero no se limita a la activación, el inicio de una respuesta inmune, proliferación, y los similares. Los ligandos estimuladores son bien conocidos en la materia y abarcan, entre otros a, una molécula Clase I MHC cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo superagonista anti-CD28, y un anticuerpo superagonista anti-CD2.

Como se utiliza en la presente descripción, una célula "substancialmente purificada" es una célula que está esencialmente libre de otros tipos de células. Una célula substancialmente purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos de células, con las cuales está asociada normalmente en su estado de origen natural. En algunos casos, una población de células substancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a la célula que ha sido separada de las células con las cuales, normalmente está asociada en su estado natural. En algunas modalidades, las células son cultivadas in vitro. En otras modalidades, las células no son cultivadas in vitro.

El término "terapéutico", como se utiliza en la presente descripción, significa un tratamiento y/o profilaxis. Un efecto terapéutico se obtiene mediante la supresión, remisión o erradicación de un estado de enfermedad.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto en cuestión que producirá la respuesta biológica o médica en un tejido, sistema o sujeto que el investigador, veterinario, doctor en medicina u otro médico está buscando. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" incluye aquella cantidad de un compuesto que, cuando es administrada, es suficiente para evitar el desarrollo de, o aliviar hasta cierto alcance, una o más de las señales o síntomas del padecimiento o enfermedad que están siendo tratadas. La cantidad terapéuticamente efectiva variará dependiendo del compuesto, la enfermedad o su severidad, la edad, peso, etc., del sujeto a ser tratado.

El término "tratar" una enfermedad, como se utiliza en la presente descripción, significa reducir la frecuencia o severidad de por lo menos un signo o síntoma de una enfermedad o padecimiento experimentado por un sujeto.

El término "transfectado" o "transformado" o "transd ucido" como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un proceso mediante el cual, el ácido nucleico exógeno es trasferido o introducido en la células huésped. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es aquella que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula en cuestión, primaria y su progenie.

La frase "bajo control transcripcional" o "enlazada en forma operativa" como se utiliza en la presente descripción significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con un polinucleótido para controlar el inicio de la transcripción mediante la polimerasa de ARN y la expresión del polinucleótido.

Un "vector" es una composición de materia, que comprende un ácido nucleico aislado, y el cual puede ser utilizado para suministrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, polín ucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, el término "vector" incluye un plásmido de replicación en forma autónoma o un virus. El término también debe ser interpretado por incluir compuestos no plásmidos y no virales, que facilitan la transferencia de ácido nucleico en las células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y los similares. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adeno asociados, vectores retrovirales, y los similares.

Rangos: a través de la presente descripción, diversos aspectos de la presente invención pueden ser presentados en un formato de rangos. Se deberá comprender que la descripción en formato de rango únicamente es por conveniencia y brevedad y no debe ser interpretada como una limitación inflexible para el alcance de la presente invención. Por consiguiente, la descripción de un rango debe ser considerada, por haber descrito de manera específica todos los subrangos posibles, así como también los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, la descripción de un rango tal como desde 1 hasta 6 debe ser considerada por tener subrangos descritos de manera específica, tales como desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 5, desde 2 hasta 4, desde 2 hasta 6, desde 3 hasta 6 etc., así como también los números individuales dentro de ese rango, por ejemplo 1, 2, 2.7, 3,4, 5, 5.3 y 6. Esto aplica independiente a la variedad de los rangos Descripción La presente invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer, así como también de otras enfermedades. El cáncer puede ser una afección hematológica, un tumor sólido, un tumor primario o que hace metástasis. Otras enfermedades que pueden ser tratadas utilizando las composiciones y métodos de la presente invención, incluyen infecciones virales, bacteriales y parasíticas, así como también enfermedades autoinmunes.

En una modalidad, la presente invención proporciona una célula (por ejemplo, célula T) diseñada para expresar un CAR, en donde la célula T CAR exhibe una propiedad antitumor. El CAR de la presente invención, puede ser diseñado para comprender un dominio extracelular que tiene un dominio de enlace de antígeno fusionado con un dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo de receptor de antígeno de célula T (por ejemplo, CD3-zeta). El CAR de la presente invención, cuando es expresado en una célula T, tiene la capacidad de volver dirigir el reconocimiento de antígeno con base en la especificidad de enlace de antígeno. Un antígeno de ejemplo es CD19, debido a que este antígeno es expresado sobre células B cancerosas. Sin embargo, la presente invención no está limitada a seleccionar como objetivo CD19. En su lugar, la presente invención incluye cualquier dominio de enlace de antígeno que, cuando se enlaza a su antígeno cognado, afecta una célula de tumor, de manera que la célula de tumor ya no puede crecer, es estimulada a morir, o de otra manera es afectada, de tal modo que el tumor que afecta a un paciente es disminuido o eliminado.

El dominio de enlace de antígeno, preferentemente está fusionado con un dominio intracelular de una o más de las moléculas coestimuladoras y una cadena zeta. Preferentemente, el dominio de enlace de antígeno es fusionado con uno o más dominios ¡ntracelulares seleccionados del grupo de un dominio de señalización CD2, un dominio de señalización CD137 (4- 1BB), un dominio de señalización CD28, un dominio de señalización CD3-zeta y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, el CAR de la presente invención comprende un dominio de señalización CD2. Esto se debe a que la presente invención se basa parcialmente en el descubrimiento de que las respuestas de célula T transmitidas por CAR pueden ser mejoradas adicionalmente con la adición de dominios coestimuladores. Por ejemplo, la inclusión del dominio de señalización CD2 influye de manera significativa en la producción de citocina en las direcciones tanto positiva como negativa, dependiendo de la presencia e identidad de otros dominios coestimuladores en el CAR expresado. En una modalidad, la presente invención comprende un CAR que comprende los dominios tanto CD2 como CD28. En una modalidad, una célula T modificada que expresa un CAR con los dominios tanto CD2 como CD28, libera de manera significativa menos IL-2 en comparación con las células T que expresan un CAR con CD28 pero no CD2. En una modalidad, una célula T modificada que libera menos IL-2, reduce la proliferación de células Treg inmunosupresoras. Además, la inclusión del dominio de señalización CD2 reduce de manera significativa el influjo de calcio. En una modalidad, la reducción del influjo de calcio mediante la inclusión de CD2 reduce la activación de la muerte inducida de las células T CAR.

En algunas modalidades, la presente invención está dirigida a un vector retroviral o lentiviral que codifica un CAR que está integrado de manera estable en una célula T y es expresado de manera estable en la misma. En otras modalidades, la presente invención está dirigida a un CAR que codifica ARN que es transfectado en una célula T y expresado en forma transitoria en la misma. La expresión de T CAR transitoria, no integradora en una célula, mitiga las cuestiones asociadas con la expresión permanente e integrada de CAR en una célula.

Composiciones La presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio extracelular o intracelular. El dominio extracelular comprende un elemento de enlace específico del objetivo, denominado de otra forma, como un dominio de enlace de antígeno. El dominio intracelular o de otra manera, el dominio citoplásmico, comprende una región de señalización coestimuladora y una porción de cadena zeta. La región de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de superficie celular diferentes de los receptores de antígenos o sus ligandos, que son requeridas para una respuesta eficiente de linfocitos a antígeno.

Entre el dominio extracelular y el dominio transmembrana del CAR, o entre el dominio citoplásmico y el dominio transmembrana del CAR, puede incorporarse un dominio separador. Como se utiliza en la presente descripción, el término "dominio separador", generalmente significa un oligo o polipéptido que funciona para enlazar el dominio transmembrana, ya sea al dominio extracelular o el dominio citoplásmico en la cadena de polipéptido. Un dominio separador puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferentemente de 10 a 100 aminoácidos y más preferentemente de 25 a 50 aminoácidos.

La presente invención incluye construcciones de vector retroviral y lentiviral que expresan un CAR que puede ser transducido directamente en una célula. La presente invención, también incluye una construcción de ARN que puede ser transfectada directamente en una célula. Un método para generar un mARN para utilizar en la transfección , involucra la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores diseñados especialmente, seguido por una adición poliA, para producir una construcción que contiene la secuencia sin traducción ("UTR") 3' y 5', una tapa 5' y/o un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), el gen que va a ser expresado, y una cola poliA, normalmente de 50-2000 bases de longitud. El ARN producido de esta manera, puede transfectar de manera eficiente diferentes clases de células. En una modalidad, la plantilla incluye secuencias para el CAR.

Preferentemente, el CAR comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico. El dominio extracelular y el dominio transmembrana, pueden derivarse de cualquier fuente deseada de dichos dominios.

Dominio de enlace de antígeno El dominio extracelular puede obtenerse de cualquiera entre la variedad amplia de dominios extracelulares o proteínas secretadas asociadas con un enlace de ligando y/o transducción de señal. En una modalidad, el dominio extracelular puede consistir de una cadena Ig pesada, la cual a su vez puede ser asociada de manera covalente con Ig de cadena ligera en virtud de la presencia de CH1 y las regiones de articulación, o puede volverse asociado de manera covalente con otros complejos de cadena Ig pesada/ligera en virtud de la presencia de articulación, dominios CH2 y CH3. En el último caso, el complejo de cadena pesada/ligera que se une a la construcción quimérica, puede constituir un anticuerpo con una especificidad diferente de la especificidad del anticuerpo de la construcción quimérica. Dependiendo de la función del anticuerpo, la estructura deseada y la transducción de señal, se puede utilizar la cadena completa o una cadena truncada, en donde la totalidad o parte de los dominios CH1, CH2 o CH3, puede ser removida o puede removerse la totalidad o parte de la región de articulación.

El dominio extracelular puede ser dirigido a cualquier antígeno deseado. Por ejemplo, cuando se desea un CAR antitumor, el dominio extracelular elegido para incorporarse en el CAR, puede ser un antígeno que está asociado con el tumor. El tumor puede ser cualquier tipo de tumor, siempre que éste tenga un antígeno de superficie celular, el cual es reconocido por el CAR. En otra modalidad, el CAR puede ser uno para un anticuerpo monoclonal específico, el cual existe actualmente o puede generarse en el futuro.

En una modalidad, el CAR de la presente invención comprende un elemento de enlace específico objetivo, denominado de otra forma como un dominio de enlace de antígeno. La elección de la porción depende del tipo y número de ligandos que definen la superficie de la célula objetivo. Por ejemplo, el dominio de enlace de antígeno, puede ser elegido para reconocer un ligando que actúa como un marcador de superficie celular sobre las células objetivo asociadas con un estado de enfermedad particular. Por lo tanto, los ejemplos de los marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos para el dominio de porción de antígeno en el CAR de la presente invención, incluyen a aquellos asociados con infecciones virales, bacteriales y parasíticas, enfermedades autoinmunes y células de cáncer.

En una modalidad, el vector retroviral o lentiviral comprende un CAR diseñado para ser dirigido a un antígeno de interés, por medio del diseño de un antígeno deseado en el CAR. En el contexto de la presente invención, "antígeno de tumor" o "antígeno de trastorno hiperproliferativo" o "antígeno asociado con un trastorno hiperproliferativo" se refiere a antígenos que son comunes para trastornos hiperproliferativos específicos. En ciertos aspectos, los antígenos de trastornos hiperproliferativos de la presente invención se derivan de cánceres que incluyen, pero no se limitan a, melanoma primario o metastático, mesotelioma, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma diferente de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñon y adenocarcinomas, tales como cáncer de seno, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer pancreático y los similares.

En otra modalidad, la plantilla para el CAR ARN es diseñada para ser dirigida a un antígeno de interés, por medio del diseño del dominio de enlace de un antígeno deseado en el CAR. En el contexto de la presente invención, "antígeno de tumor" o "antígeno de trastorno hiperproliferativo" o "antígeno asociado con un trastorno hiperproliferativo", se refiere a antígenos que son comunes en trastornos hiperproliferativos específicos. En ciertos aspectos, los antígenos de trastorno hiperproliferativo de la presente invención se derivan de cánceres que incluyen, pero no se limitan a, melanoma primario o metastático, mesotelioma, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado linfoma diferente de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñon y adenocarcinomas, tales como cáncer de seno, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer pancreático y los similares.

Los antígenos de tumor son proteínas que son producidas por células de tumor que producen una respuesta inmune, particularmente las respuestas inmunes transmitidas por célula T. En una modalidad, el antígeno de tumor de la presente invención, comprende uno o más epítopes de cáncer antigénicos reconocidos en forma inmunológica por los linfocitos de infiltración de tumor (TIL) derivados de un cáncer de tumor de un mamífero. La selección del dominio de enlace de antígeno de la presente invención dependerá del tipo particular de cáncer a ser tratado. Los antígenos de tumor son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, un antígeno asociado con glioma, antígeno carcinoembriónico (CEA), gonadotropina coriónica ß-humana, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva de lectina, tiroglobulina, RAGE-I, MN-CA IX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), esterasa de carboxilo intestinal, mut hsp70-2, -CSF, prostasa, antígeno específico de próstata (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, proteína, PS A, Her2/neu, survivina y telomerasa, antígeno-1 de tumor de carcinoma de próstata (PCTA-1), MAGE, ELF2M, neutrófilo de elastasa, efrinB2, CD22, factor de crecimiento de insulina (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I y mesotelina.

En una modalidad, el antígeno de tumor comprende uno o más epítopes de cáncer antigénico asociados con un tumor maligno. Los tumores malignos expresan un número de proteínas que pueden servir como antígenos objetivo para un ataque inmune. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a, antígenos específicos de tejido tales como MART-1, tirosinasa y GP100 en melanoma y fosfatasa de ácido prostático (PAP) y antígeno específico de próstata (PSA) en cáncer de próstata. Otras moléculas objetivo pertenecen al grupo de moléculas relacionadas con transformación tales como el oncógeno HER-2/Neu/ErbB-2. Todavía otros grupos de antígenos objetivo son antígenos oncofetales tales como el antígeno carcinoembriónicos (CEA). En linfoma de célula B, la inmunoglobulina de idiotipo específico de tumor constituye un antígeno de inmunoglobulina específico de tumor verdadero que es único para el tumor individual. Los antígenos de diferenciación de célula B, tales como CD19, CD20 y CD37, son otros candidatos para los antígenos objetivo en linfoma de célula B. Algunos de estos antígenos (CEA, HER-2, CD19, CD20, idiotipo) se han utilizado, con éxito limitado, como objetivos para la inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales.

El tipo de antígeno de tumor al que hace referencia la presente invención, también puede ser un antígeno específico de tumor (TSA) o un antígeno asociado con tumor (TAA). Un TSA es único para las células de tumor y no ocurre en otras células en el cuerpo. Un TAA de antígeno asociado no es único para una célula de tumor y en su lugar, también es expresado sobre una célula normal bajo condiciones que fallan al inducir un estado de tolerancia inmunológica para el antígeno. La expresión del antígeno sobre el tumor puede ocurrir bajo condiciones que permiten que el sistema inmune responda al antígeno. Los TAAs pueden ser antígenos que son expresados sobre células normales durante el desarrollo fetal, cuando el sistema inmune es inmaduro e incapaz de responder, o pueden ser antígenos que están presentes normalmente a niveles extremadamente bajos en células normales, pero los cuales son expresados en niveles muy superiores en células de tumor.

Los ejemplos no limitantes de antígenos TSA o TAA incluyen los siguientes: antígenos de diferenciación, tales MART-1/ elanA (MART-I) , gp 100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos de linaje múltiple específicos de tumor, tales como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; antígenos embriónicos sobreexpresados tales como CEA; oncógenos sobreexpresados y genes supresores de tumor mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos de tumor únicos que resultan de translocaciones cromosomales; tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; y antígenos virales, tales como los antígenos del virus de Epstein Barr EBVA y antígenos del virus de papiloma humano (HPV) E6 y E7. Otros antígenos basados en proteínas grandes incluyen TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p 15, P 16, 43-9F, 5T4, 79ITgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27-29XBCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, proteína/ciclofilina de enlace TA-90\Mac-2 de proteína asociada C, TAAL6, TAG72, TLP, y TPS.

En una modalidad preferida, la porción de dominio de enlace de antígeno del CAR se dirige a un antígeno que incluye, pero no se limita a, CD19, CD20, CD22, ROR1, esotelina, CD33/IL3Ra, c- et, PSMA, Glicolípido F77, EGFRvlll, GD-2, MYESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, y los similares.

Dependiendo del antígeno deseado a ser seleccionado como objetivo, el CAR de la presente puede ser diseñado para incluir la porción de enlace antígeno adecuado que es específico para el antígeno objetivo deseado. Por ejemplo, si CD19 es el antígeno deseado que será seleccionado como objetivo, se puede utilizar un anticuerpo para CD19 como la porción de enlace de antígeno para la incorporación en el CAR de la presente invención.

Dominio transmembrana Con respecto al dominio transmembrana, el CAR puede ser diseñado para comprender un dominio transmembrana que está fusionado con el dominio extracelular de CAR. En una modalidad, se utiliza el dominio transmembrana que está asociado de manera natural con uno de los dominios en el CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante la sustitución del aminoácido, para evitar el enlace de dichos dominios con los dominios transmembrana de las mismas proteínas de superficie de membrana, igual o diferente, para reducir al mínimo las interacciones con otros elementos del complejo receptor.

El dominio transmembrana puede ser derivado, ya sea de una fuente natural o de una fuente sintética. En donde la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier enlace de membrana o proteína de transmembrana. Las regiones de transmembrana de uso particular en la presente invención, pueden derivarse de (es decir, comprender por lo menos la región(es) de transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de célula T, CD28, CD3 epsilón, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, el dominio transmembrana puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá residuos predominantemente hidrófobos, tales como leucina y valina. Preferentemente, se descubrirá una tripleta de fenilalanina, triptofano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. Opcionalmente, un enlazador de oligo o polipéptido corto, preferentemente con una longitud entre 2 y 10 aminoácidos, puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplásmico del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado.

Dominio citoplásmico El dominio citoplásmico o de otra manera, el dominio de señalización intracelular del CAR de la presente invención, es responsable de la activación de por lo menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en la cual se ha colocado el CAR. El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser de actividad citolítica o un auxiliar de actividad, que incluye la secreción de citocinas. Por lo tanto, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína, la cual transduce la señal de función efectora y dirige a la célula para realizar una función especializada. Aunque normalmente puede emplearse el dominio de señalización intracelular completo, en muchos casos no es necesario utilizar la cadena completa. Hasta el alcance en que se utiliza una porción truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada puede utilizarse en lugar de la cadena intacta, siempre que realice la transducción de la señal de la función efectora. El término dominio de señalización intracelular, de esta manera significa, que incluye cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.

Los ejemplos preferidos de dominios de señalización intracelular para ser utilizados en el CAR de la presente invención, incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de célula T (TCR) y los coreceptores que actúan en combinación para iniciar la transducción de señal que sigue al acoplamiento de receptor de antígeno, así como también, cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

Se reconoce que las señales generadas a través del TCR por sí solo, son insuficientes para la activación completa de la célula T y que también se requiere una señal secundaria o coestimuladora. Por lo tanto, la activación de célula T puede ser aquella transmitida por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplásmica; aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través de las TCR (secuencias de señalización citoplásmica primaria) y aquellas que actúan en una forma independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmica secundaria).

Las secuencias de señalización citoplásmica primaria, regulan la activación primaria del complejo TCR, ya sea en una forma estimuladora, o en una forma inhibidora. Las secuencias de señalización citoplásmica primaria que actúan en una forma estimuladora, pueden contener motivos de señalización, los cuales son conocidos como motivos de activación con base en tirosina de inmunoreceptor o ITAMs.

Los ejemplos de ITAMs que contienen las secuencias de señalización citoplásmicas primarias que son de uso particular en la presente invención, incluyen aquellas derivadas de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilón, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. Es particularmente preferido que la molécula de señalización citoplásmica en el CAR de la presente invención comprenda una secuencia de señalización citoplásmica derivada de CD3 zeta.

En una modalidad preferida, el dominio citoplásmico del CAR puede ser diseñado para comprender el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo o combinado con cualquier otro dominio(s) citoplásmico(s) deseado(s) úti I (es) en el contexto del CAR de la presente invención. Por ejemplo, el dominio citoplásmico del CAR, puede comprender una porción de cadena CD3 zeta y una región de señalización coestimuladora. La región de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular diferente de un receptor de antígeno o sus ligandos, que es requerida para una respuesta eficiente de linfocitos a antígeno. Los ejemplos de dichas moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-I, ICOS, antígeno-1 asociado con función de lifocito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que enlaza de manera específica con CD83 y los similares. Por lo tanto, aunque la presente invención es ejemplificada principalmente con CD2 como el elemento de señalización coestimulador, dentro del alcance de la presente invención están contemplados otros elementos coestimuladores.

Las secuencias de señalización citoplásmicas dentro de la porción de señalización citoplásmica del CAR de la presente invención, pueden enlazarse entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, el enlazador oligo o polipéptido corto, preferentemente con una longitud entre 2 y 10 aminoácidos, puede formar el enlace. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado.

En una modalidad, el dominio citoplásmico está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En otra modalidad, el dominio citoplásmico está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD2. Aún en otra modalidad, el dominio citoplásmico está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28 y CD2. Todavía en otra modalidad, el dominio citoplásmico está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28, CD2 y 4-1BB.

Vectores La presente invención abarca una construcción de ADN que comprende la secuencia de un CAR, en donde la secuencia comprende la secuencia de ácido nucleico de un dominio de enlace de antígeno, enlazada en forma operativa a la secuencia de ácido nucleico de un dominio intracelular. Un dominio intracelular de ejemplo que se puede utilizar en el CAR de la presente invención incluye, pero no se limita al dominio intracelular de CD3-zeta, CD28, 4-1BB, CD2 y los similares. En algunos casos, el CAR puede comprender cualquier combinación de CD3-zeta, CD28, 4-1BB, CD2 y similares.

En una modalidad, el CAR de la presente invención comprende anti-CD19 scFv, articulación CD8 humano y dominio transmembrana y dominios de señalización CD2 y CD3-zeta humano. En una modalidad, el CAR de la presente invención comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, el CAR de la presente invención comprende la secuencia de ácido codificada por el ácido nucleico establecido en la SEQ ID NO: 1.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas, pueden obtenerse utilizando métodos recombinantes conocidos en la materia, tales como, por ejemplo, filtrando las librerías de células que expresan el gen, derivando el gen de un vector conocido por incluir el mismo o aislándose directamente de las células y tejidos que contienen los mismos, utilizando las técnicas estándar. De manera alternativa, el gen de interés puede ser producido en forma sintética, en lugar de ser clonado.

La presente invención, también proporciona vectores en los cuales se inserta un ADN de la presente invención. Los vectores derivados de los retrovirus, tales como el lentivirus, son herramientas adecuadas para lograr la transferencia genética a largo plazo debido a que permiten la integración a largo plazo, estable, de un transgen y su propagación en las células hijas. Los vectores lentivirales tienen ventaja agregada sobre los vectores derivados de los onco-retrovirus, tales como el virus de leucemia múrido en que pueden transducir las células no proliferativas, tales como los hepatocitos. Éstos también tienen la ventaja agregada de inmunogenicidad baja.

En breve, la expresión de los ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican los CARs, normalmente se logra enlazando en forma operativa un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o porciones del mismo a un promotor, y que incorpora la construcción en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para los eucariotes de replicación e integración. Los vectores de clonación típicos que contienen los terminadores de transcripción y traducción, las secuencias de inicio y los promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

Las construcciones de expresión de la presente invención, también se pueden utilizar para la inmunización de ácido nucleico y la terapia genética, utilizando protocolos de suministro de genes estándar. Los métodos para el suministro genético son conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, las patentes Norteamericanas Nos. 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466, incorporadas en su totalidad como referencia en la presente descripción. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de terapia genética.

El ácido nucleico puede ser clonado en una variedad de tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser clonado en un vector que incluye, pero no se limita a un plásmido, un fagémido, un derivado fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de interés particular incluyen a los vectores de expresión, los vectores de replicación, los vectores de generación de sonda y los vectores de secuenciación .

Además, el vector de expresión puede ser provisto a una célula en la forma de un vector viral. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la materia y es descrita, por ejemplo, en la publicación de Sambrook y asociados (ed.) "Clonación Molecular: un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, pero son se limitan a retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus de herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en por lo menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endonucleasa de restricción conveniente y uno o más marcadores que se pueden seleccionar, (por ejemplo, los documentos WO 01/96584; WO 01/29058; y la patente Norteamericana No. 6,326, 193).

Se ha desarrollado una cantidad de sistemas de base viral para la transferencia genética en células de mamífero. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de suministro genético. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y ser empacado en partículas retrovirales que utilizan las técnicas conocidas en la materia. El virus recombinante puede entonces ser asilado y suministrado a las células del sujeto, ya sea in vivo o ex vivo. En la materia, se conoce una variedad de sistemas retrovirales. En algunas modalidades se utilizan los vectores de adenovirus. En la materia, se conoce una variedad de vectores de adenovirus. En una modalidad, se utilizan los vectores de lentivirus.

Los elementos de promotor adicional, por ejemplo, los agentes de mejoramiento, regulan la frecuencia de inicio de transcripción. Normalmente, éstos están localizados en la región 30-110 pb en la corriente ascendente del sitio de partida, aunque recientemente una cantidad de promotores también ha mostrado contener elementos funcionales en la corriente descendente del sitio de partida. La separación entre los elementos de promotor, frecuentemente es flexible, de manera que se conserva la función de promotor cuando los elementos son invertidos o movidos en relación uno con el otro. En el promotor de timidina de cinasa (tk), la separación entre los elementos del promotor puede ser incrementada a 50 pb de separación antes de que la actividad empiece a declinar. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar, ya sea en forma cooperativa o de manera independiente para activar la transcripción.

Un ejemplo de un promotor adecuado, es la secuencia de promotor de citomegalovirus temprano inmediato (CMV). Esta secuencia de promotor es una secuencia de promotor constitutiva fuerte, con la capacidad de conducir niveles altos de expresión de cualquier secuencia de polinucleótido enlazada en forma operativa al mismo. Otro ejemplo de un promotor adecuado es el factor de crecimiento de alargamiento -1a (EF-1a). Sin embargo, también se pueden utilizar otras secuencias promotoras constitutivas, que incluyen, pero no se limitan al promotor temprano de virus de simio 50 (SV40), el virus de tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de repetición terminal largo (LTR) de virus de inmunodeficiencia humano (VIH), Promotor MoMuL V, un promotor de virus de leucemia aviar, un promotor temprano inmediato de virus de Epstein-Barr, un promotor de virus de sarcoma de Rous, así como también promotores genéticos tales como, pero sin limitarse al promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de cinasa de creatina. Adicionalmente, la presente invención no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores que se pueden inducir también están contemplados como parte de la presente invención. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular con la capacidad de encender la expresión de la secuencia de polinucleótido, la cual está enlazada en forma operativa cuando se desea dicha expresión, o extinguir la expresión cuando ésta no se desea. Los ejemplos de promotores que se pueden inducir incluyen, pero no se limitan a un promotor de metalotionina, un promotor glucocorticoide, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina.

Con el objeto de evaluar la expresión de un polipéptido CAR o las porciones del mismo, el vector de expresión que será introducido en una célula, también puede contener, ya sea un gen marcador que se puede seleccionar o un gen reportero, o ambos para facilitar la identificación y selección de células de expresión a partir de la población de células que se busca transfectar o infectar a través de los vectores virales. En otros aspectos, el marcador que se puede seleccionar puede ser portado en una pieza separada de ADN y ser utilizado en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores que se pueden seleccionar como los genes reporteros, pueden ser flanqueados con las secuencias reguladoras adecuadas para permitir la expresión en las células huésped. Los marcadores que se pueden seleccionar útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y los similares.

Los genes reporteros son utilizados para identificar las células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen reportero es un gen que no está presente o no es expresado por el organismo receptor o tejido y que codifica un polipéptido cuya expresión es manifestada por alguna propiedad que se puede detectar fácilmente, por ejemplo, la actividad enzimática. La expresión del gen reportero es ensayada en un tiempo adecuado después de que el ADN se ha introducido en las células receptoras. Los genes reporteros adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloramfenicol acetil transferasa, fosfatase alcalina secretada, o el gen de proteína fluorescente verde (por ejemplo, Ui-Tei y asociados, 2000 FEBS Letters 479: paginas 79 a 82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y pueden ser preparados utilizando las técnicas conocidas o se pueden obtener comercialmente. En general, la construcción con la región de flanqueo 5' mínima que muestra el nivel más alto de expresión del gen reportero es la que se identifica como el promotor. Dichas regiones de promotor pueden ser enlazadas a un gen reportero y ser utilizadas para evaluar los agentes en la búsqueda de su habilidad para modular la transcripción impulsada por el promotor.

Los métodos para introducir y expresar genes en una célula son conocidos en la materia. En el contexto de un vector de expresión, el vector puede ser introducido fácilmente en una célula huésped, por ejemplo, una célula de mamífero, bacteria, levadura o insecto, mediante cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, el vector de expresión puede ser transferido dentro de una célula huésped a través de medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen precipitación de fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y los similares. Los métodos para producir las células que comprenden los vectores y los ácidos nucleicos exógenos, son bien conocidos en la materia. Véase por ejemplo, la publicación de Sambrook y asociados, (2001, "Clonación Molecular: un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Un método preferido para la introducción de un polinucleótido en una célula huésped es la transfección de fosfato de calcio.

Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula huésped incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han vuelto el método utilizado más ampliamente para insertar genes en un mamífero, por ejemplo, células de humano. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus de herpes simplex I, adenovirus y adenovirus asociados y similares. Véanse, por ejemplo, las patentes Norteamericanas Nos. 5,350,674 y 5,585,362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen a los sistemas de dispersión coloidal, tales como los complejos de macromolécula, nanocápsulas, microesferas, lechos, y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. Un sistema coloidal de ejemplo para utilizar como el vehículo de administración ¡n vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial).

En el caso en donde se utiliza el sistema de administración no viral, un vehículo de administración de ejemplo es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones de lípido para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula huésped (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede ser encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, entremezclado dentro de la bicapa de lípido de un liposoma, anexo a un liposoma por medio de una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, hecho complejo con un liposoma, dispersado en una solución que contienen un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o hecho complejo dentro de una micela, o asociado de otra manera con un lípido. Las composiciones asociadas de lípido, lípido/ADN o lípido/vector de expresión no están limitadas a estructura particular alguna en la solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de dos capas, como micelas o con una estructura "colapsada". Éstas también pueden ser entremezcladas en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en tamaño y forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos de origen natural o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotas grasas que ocurren de manera natural en el citoplasma, así como también la clase de compuestos que contienen los hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, alcoholes amino y aldehidos.

Los lípidos adecuados para utilizarse pueden obtenerse de fuentes comerciales. Por ejemplo se puede obtener la dimiristil fosfatidilcolina ("DMPC") de Sigma, San. Luis, MO; el dicetil fosfato ("DCP") puede obtenerse de K & K Laboratories (Plainview, NY)¡ el colesterol ("Choi") puede obtenerse de Calbiochem-Behring; el dimiristil fosfatidolglicerol ("DMPG") y otros lípidos pueden obtenerse de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Las soluciones de reserva de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol pueden ser almacenadas a una temperatura de aproximadamente -20°C. El cloroformo se utiliza como el solvente único, ya que es evaporado más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca una variedad de vehículos de lípido únicos y de láminas múltiples, formadas por la generación de bicapas o agregados de lípidos cubiertos. Los liposomas pueden caracterizarse por tener estructuras vesiculares con una membrana bicapa de fosfolípido y un medio acuoso interior. Los liposomas de láminas múltiples tienen capas de lípidos múltiples separadas por el medio acuoso. Éstos se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos son suspendidos eh un exceso de solución acuosa. Los componentes líquidos experimentan un nuevo arreglo automático antes de la formación de las estructuras cerradas y atrapan el agua y los solutos son disueltos entre las bicapas de lípido (Ghosh y asociados, 1991, Glycobiology 5: páginas 505 a 10). Sin embargo, también están contempladas las composiciones que tienen estructuras diferentes que la estructura vesicular normal en la solución. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura de micela o únicamente existir como agregados no uniformes de moléculas de lípidos. También están contemplados los complejos de lipofectamina-ácido nucleico.

Independientemente del método que se utilice para introducir los ácidos nucleicos exógenos en una célula huésped, o exponer de otra forma una célula al inhibidor de la presente invención, se puede realizar una variedad de ensayos con el objeto de confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula huésped. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, los ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos por los expertos en la materia, tales como manchado Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos "bioquímicos", tales como la detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, a través de medios inmunológicos (ELISAs y manchados Western) o mediante los ensayos descritos en la presente descripción para identificar a los agentes que se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Transfección de ARN En una modalidad, las células T genéticamente modificadas de la presente invención son modificadas a través de la introducción de ARN. En una modalidad, se puede introducir un CAR ARN transcrito in vitro a una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN es producido mediante la transcripción in vitro, utilizando una plantilla generada por la reacción de cadena de polimerasa (PCR). El ADN de interés de cualquier fuente, puede ser convertido directamente por el PCR en una plantilla para una síntesis de mARN in vitro, utilizando los cebadores y la polimerasa de ARN adecuados. La fuente de ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN plásmido, ADN fago, cADN, secuencia de ADN sintética o cualquier otra fuente adecuada de ADN. La plantilla deseada para la transcripción in vitro es el CAR de la presente invención. Por ejemplo, la plantilla para CAR ARN comprende un dominio extracelular que comprende un dominio variable de cadena única de un anticuerpo antitumor; un dominio transmembrana que comprende el dominio de articulación y de transmembrana de CD8a; y un dominio citoplásmico que comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD2.

En una modalidad, el ADN que será utilizado para el PCR, contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede provenir de una secuencia de ADN de origen natural del genoma de un organismo. En una modalidad, el ADN es un gen de longitud completa de interés de una porción de un gen. El gen puede incluir algunas o todas las regiones sin traducir (UTRs) 5' y/o 3'. El gen puede incluir exones e intrones. En una modalidad, el ADN que será utilizado para el PCR es un gen humano. En una modalidad, el ADN que será utilizado para el PCR es un gen humano que incluye los UTRs 5' y 3'. El ADN puede ser, alternativamente, una secuencia de ADN artificial que normalmente no es expresada en forma natural en un organismo. Una secuencia de ADN artificial de ejemplo, es aquella que contiene porciones de genes que están ligadas entre sí para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión. Las porciones de ADN que están ligadas juntas entre sí pueden ser de un organismo único o de más de un organismo.

Los genes que pueden ser utilizados como fuentes de ADN para PCR, incluyen genes que codifican polipéptidos que proporcionan un efecto terapéutico o profiláctico a un organismo o que pueden ser utilizados para diagnosticar una enfermedad o trastorno en un organismo. Los genes preferidos, son genes que son útiles para un tratamiento a corto plazo, o en donde existen inquietudes de seguridad con respecto a la dosificación o el gen expresado. Por ejemplo, para el tratamiento de cáncer, trastornos autoinmunes, infecciones parasíticas, virales, bacteriales, fúngicas u otras infecciones, el transgén(es) que va a ser expresado puede codificar un polipéptido que funciona como un ligando o un receptor para las células del sistema inmune, o puede funcionar para estimular o inhibir el sistema inmune de un organismo. En algunas modalidades, no es deseable prolongar una estimulación continua del sistema inmune, ni necesariamente producir cambios que perduren después del tratamiento exitoso, ya que esto puede producir un problema nuevo. Para el tratamiento de un trastorno autoinmune, puede ser deseable inhibir o suprimir al sistema inmune durante una crisis, aunque a largo plazo, lo cual podría tener como resultado que el paciente se vuelva demasiado sensible a una infección.

El PCR se utiliza para generar una plantilla para la transcripción de mARN in vitro, la cual se utiliza para la transfección . Los métodos para realizar el PCR son bien conocidos en la materia. Los cebadores que se utilizan en PCR están diseñados para tener regiones que son substancialmente complementarias a las regiones del ADN que se va a utilizar como una plantilla para el PCR. "Substancialmente complementario", como se utiliza en la presente descripción, se refiere a las secuencias de nucleótidos, en donde una mayor parte o la totalidad de las bases en la secuencia de cebador son complementarias, o una o más bases no son complementarias o incompatibles. Substancialmente, las secuencias complementarias tienen la capacidad de templarse o hibridarse con el ADN objetivo bajo las condiciones de templado utilizadas para el PCR. Los cebadores pueden ser diseñados para ser substancialmente complementarios a cualquier porción de la plantilla de ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden ser diseñados para amplificar la porción de un gen que normalmente es transcrito en las células (el marco de lectura abierto), que incluye los UTRs 5' y 3'. Los cebadores también pueden ser diseñados para amplificar una porción de un gen que codifica un dominio de interés particular. En una modalidad, los cebadores están diseñados para amplificar la región de codificación de un cADN humano, que incluye la totalidad o porciones de los UTRs 5' y 3'. Los cebadores útiles para el PCR son generados mediante métodos sintéticos que son bien conocidos en la materia. Los "cebadores directos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son substancialmente complementarios a los nucleótidos en la plantilla de ADN que están en corriente ascendente en la secuencia de ADN que será amplificada. El término "corriente ascendente", se utiliza en la presente descripción para hacer referencia a una ubicación 5', en la secuencia de ADN que será amplificada en relación con la cadena de codificación. Los "cebadores inversos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que es substancialmente complementaria a una plantilla de ADN de cadena doble, que se encuentran en la corriente descendente de la secuencia de ADN que será amplificada. El término "corriente descendente" se utiliza en la presente descripción para hacer referencia a una ubicación 3', en la secuencia de ADN que será amplificada en relación con la cadena de codificación.

Cualquier polimerasa de ADN, útil para PCR, puede utilizarse en los métodos descritos en la presente descripción. Los reactivos y la polimerasa están disponibles comercialmente de una serie de fuentes.

También se pueden utilizar estructuras químicas con la capacidad de promover la estabilidad y/o eficiencia de traducción. El ARN, preferentemente tiene UTRs 5' y 3'. En una modalidad, el UTR 5' tiene entre cero y 3000 nucleótidos de longitud. La longitud de las secuencias UTR 5' y 3' que serán suministradas a la región de codificación puede ser alterada a través de diferentes métodos, que incluyen pero no se limitan a la designación de cebadores para PCR que se atemperan en regiones diferentes de los UTRs. Con el uso este método, un experto en la materia puede modificar las longitudes de UTR 5' y 3' requeridas para lograr la eficiencia de traducción óptima después de la transfección del ARN transcrito.

Los UTRs 5' y 3' pueden ser de origen natural, UTRs 5' y 3' endógenos para el gen de interés. De manera alternativa, las secuencias UTR que no son endógenas para el gen de interés, pueden agregarse incorporando las secuencias UTR en los cebadores directo e inverso o mediante cualesquiera otras modificaciones de la plantilla. El uso de las secuencias de UTR que no son endógenas para el gen de interés, puede ser útil para la modificación de la estabilidad y/o eficiencia de traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que los elementos con altos contenido de AU en las secuencias UTR 3', pueden disminuir la estabilidad del mARN. Por lo tanto, los UTRs 3', pueden ser seleccionados o diseñados para incrementar la estabilidad del ARN transcrito con base en las propiedades, bien conocidas en la materia, de los UTRs.

En una modalidad, el UTR 5' puede contener la secuencia Kozak del gen endógeno. De manera alternativa, cuando un UTR 5' que no es endógeno para el gen de interés está siendo suministrado por PCR como se describió anteriormente, se puede diseñar nuevamente una secuencia de consenso Kozak que suministra la secuencia UTR 5'. Las secuencias Kozak pueden incrementar la eficiencia de traducción en algunas transcripciones de ARN, aunque no parecen ser requeridas para que todos los ARNs permitan la traducción eficiente. El requerimiento de las secuencias Kozak para muchos mARNs es conocido en la materia. En otras modalidades, el UTR 5' puede derivarse de un virus de ARN cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras modalidades, en el UTR 3' o 5' se pueden utilizar análogos de nucleótido diferentes para impedir la degradación de exonucleasa del mARN.

Para permitir la síntesis de ARN de una plantilla de ADN sin la necesidad de clonación genética, debe anexarse un promotor de transcripción a la corriente ascendente de la plantilla de ADN de la secuencia que va a ser transcrita. Cuando una secuencia que funciona como un promotor para una polimerasa de ARN se agrega al extremo 5' del cebador directo, el promotor de polimerasa de ARN se incorpora en la corriente ascendente de producto PCR del marco de lectura abierto que va a ser transcrito. En una modalidad preferida, el promotor es un promotor de polimerasa T7, como el que se describe a lo largo de la presente descripción. Otros promotores útiles incluyen, pero no se limitan a promotores de polimerasa T3 y SP6 ARN. Las secuencias de nucleótido de consenso para los promotores T7, T3 y SP6 son conocidas en la materia.

En una modalidad preferida, el mARN tiene tanto una tapa en el extremo 5' como una cola 3' poli(A), que determina el enlace de ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad de mARN en la célula. En una plantilla de ADN circular, por ejemplo, ADN de plásmido, la polimerasa de ARN produce un producto concatamérico largo, el cual no es adecuado para la expresión en células eucarióticas. La transcripción de ADN de plásmido linealizado en el extremo del UTR 3', tiene como resultado un mARN de tamaño normal, el cual no es efectivo en la transfección eucariótica, incluso si es sometido a poliadenilación después de la transcripción.

En una plantilla de ADN lineal, la polimerasa de ARN T7 de fago puede extender el extremo 3' de la transcripción más allá de la última base de la plantilla (Schenbom y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13: páginas 6223 a 6236 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: páginas 1485 a 65 (2003).

El método convencional de integración de poli A/T que se alarga dentro de una plantilla de ADN, es la clonación molecular. Sin embargo, la secuencia poli A/T integrada en el ADN de plásmido, puede producir la inestabilidad del plásmido, que es la razón por la que las plantillas de ADN de plásmido obtenidas de células bacteriales, con frecuencia resultan altamente contaminadas con eliminaciones y otras aberraciones. Esto hace que los procedimientos de clonación, no solo sean laboriosos y lentos, sino que con frecuencia, no sean confiables. Esta es una razón por la cual resulta altamente deseable un método que permita la construcción de plantillas de ADN con poli A/T 3' alargado, sin clonación.

El segmento poli A/T de la plantilla de ADN transcripcional puede ser producido durante el PCR utilizando un cebador inverso que contiene una cola poliT, tal como la cola 100T (el tamaño puede ser de 50 a 5000 T), o después del PCR mediante otro método cualquiera, incluyendo, pero que no se limita a, un ligado de ADN o una recombinación in vitro. Las colas poli(a) también proporcionan estabilidad a los ARNs y reducen su degradación. Generalmente, la longitud de una cola poli(A) se correlaciona en forma positiva con la estabilidad del ARN transcrito. En una modalidad, la cola poli(A) tiene entre 100 y 5000 adenosinas.

Las colas poli(A) de los ARNs pueden ser extendidas adicionalmente después de la transcripción in vitro, mediante el uso de una poli(A) polimerasa, tal como la poliA polimerasa de E. coli (E-PAP). En una modalidad, el incremento de la longitud de la cola poli(A) desde 100 nucleótidos hasta un valor entre 300 y 400 nucleótidos, tiene como resultado un incremento de aproximadamente dos dobleces en la eficiencia de traducción del ARN. Adicionalmente, la unión de grupos químicos diferentes al extremo 3' puede incrementar la estabilidad de mARN. Dicha unión puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos de ATP pueden ser incorporados en la cola poli(A) utilizando la polimerasa poli(A). Los análogos de ATP pueden incrementar adicionalmente la estabilidad del ARN.

Las tapas 5', también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una modalidad preferida, los ARNs producidos mediante los métodos descritos en la presente descripción incluyen una tapa 5'. La tapa 5', es provista utilizando las técnicas conocidas en la materia y descritas en la presente descripción (Cougot, y asociados, Trends in Biochem. Sci., 29: páginas 436 a 444 (2001); Stepinski, y asociados, RNA, 7: páginas 1468 a 1495 (2001); Elango, y asociados, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330: páginas 958 a 966 (2005)).

Los ARNs producidos mediante los métodos descritos en la presente descripción, también pueden contener una secuencia de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). La secuencia IRES puede ser cualquier secuencia viral, cromosómica o diseñada artificialmente, la cual inicia un enlace de ribosoma dependiente de la tapa con mARN y facilita el inicio de la traducción. Para la electroporación celular se pueden incluir cualesquiera solutos adecuados, los cuales puedan contener factores que facilitan la permeabilidad y viabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y tensoactivos.

El ARN puede ser introducido en las células objetivo utilizando cualquier cantidad de métodos diferentes, por ejemplo, los métodos disponibles comercialmente que incluyen, pero no se limitan a, electroporación (Amaxa N ucleofector-l I (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Coló.), Multiporator (Eppendort, Hamburgo, Alemania), de transfección transmitida por liposoma catiónico que utiliza lipofección, encapsulación polimérica, transfección transmitida por péptido, o sistemas de suministro de partículas biolísticas, tales como "disparadores genéticos" (véase, por ejemplo, la publicación de Nishikawa, y asociados, Hum Gene Ther., 12(8): páginas 861 a 870 (2001).

Células T Modificadas Genéticamente En algunas modalidades, las secuencias CAR son suministradas a las células utilizando un vector retroviral o I e n ti vi ra I . Los vectores retrovirales y lentivirales que expresan CAR pueden ser suministrados en diferentes tipos de células eucarióticas, así como también en tejidos y organismos completos utilizando las células transducidas como portadores o mediante el suministro local libre de células o el suministro sistémico de vectores encapsulados, enlazados o puros. El método utilizado puede tener cualquier propósito, en el cual se requiere o es suficiente la expresión estable.

En otras modalidades, las secuencias CAR son suministradas a las células utilizando mA N transcrito in vitro. El CAR mARN transcrito in vitro, puede ser suministrado en diferentes tipos de células eucarióticas, así como también en tejidos y organismos completos, utilizando las células transfectadas como portadores o mediante el suministro local libre de células o sistémico de mARN encapsulado, enlazado o desnudo. El método utilizado puede tener cualquier propósito, en el cual se requiere o es suficiente la expresión transitoria.

Los métodos descritos pueden ser aplicados a la modulación de la actividad de célula T en la investigación y terapia básicas, en los campos de cáncer, células madre, infecciones agudas y crónicas, y enfermedades autoinmunes, que incluyen la evaluación de la habilidad de la célula T modificada genéticamente para matar a una célula cancerígena objetivo.

Los métodos también proporcionan la capacidad de controlar el nivel de expresión durante un intervalo amplio, cambiando, por ejemplo, el promotor o la cantidad de ARN de entrada, haciendo posible regular de manera individual el nivel de expresión. Adicionalmente, la técnica basada en PCR para la producción de mARN facilita en gran medida el diseño de los mARNs de receptor quimérico con estructuras diferentes y combinación de sus dominios. Por ejemplo, variando los dominios efectores/coestimuladores intracelulares diferentes en los receptores quiméricos múltiples en la misma célula, se permite la determinación de la estructura de las combinaciones de receptor que evalúa el nivel más alto de citotoxicidad contra los objetivos multiantigénicos, y al mismo tiempo, la toxicidad más baja hacia las células normales.

Una ventaja de los métodos de transfección de ARN de la presente invención, es que la transfección de ARN es esencialmente transitoria y libre de vector: un transgen de ARN puede ser suministrado a un linfocito y expresado en el mismo después de una breve activación celular in vitro, como un cásete de expresión mínima, sin la necesidad de secuencias virales adicionales. Bajo estas condiciones, es improbable la integración el transgen en el genoma de célula huésped. La clonación de las células no necesariamente se debe a la eficiencia de transfección del ARN y su habilidad para modificar de manera uniforme la población de linfocito completa.

La modificación genética de las células T con un ARN transcrito in vitro (IVT-ARN) utiliza dos estrategias diferentes, las cuales han sido probadas de manera exitosa en varios modelos animales. Las células son transfectadas con ARN transcrito in vitro por medio de la lipofección o electroporación. Preferentemente, es deseable estabilizar el IVT-ARN utilizando varias modificaciones con el objeto de lograr una expresión prolongada del IVT-ARN transferido.

En la literatura se conocen algunos vectores IVT, los cuales son utilizados en forma estandarizada como una plantilla para la transcripción in vitro y los cuales han sido modificados genéticamente de tal manera que se producen las transcripciones de ARN estabilizado. Los protocolos utilizados actualmente en la materia se basan en un vector de plásmido con la siguiente estructura: un promotor de polimerasa ARN 5' que permite la transcripción de ARN, seguido por un gen de interés, el cual es flanqueado, ya sea por 3' y/o 5" por las regiones no traducidas (UTR) y un cásete de poliadenilo 30 que contiene los nucleótidos A 50-70. Antes de la transcripción in vitro, el plásmido circular es linealizado por las enzimas de restricción tipo II (secuencia de reconocimiento que corresponde al sitio de escisión) en la corriente descendente del cásete de poliadenilo. El cásete de poliadenilo corresponde, por consiguiente, a la última secuencia poli(A) en la transcripción. Como resultado de este procedimiento, algunos nucleótidos permanecen como parte del sitio de escisión de enzima después de la linealización y extienden o enmascaran la secuencia poli(A) en el extremo 3'. No está claro si este excedente no fisiológico afecta la cantidad de proteína producida en forma intracelular a partir de dicha construcción.

El ARN tiene varias ventajas sobre los métodos de plásmido o virales más tradicionales. La expresión genética de una fuente de ARN no requiere la transcripción y el producto de proteína es producido rápidamente después de la transfeccion. Además, porque el ARN únicamente tiene que ganar acceso al citoplasma, en lugar del núcleo, y por consiguiente, los métodos de transfeccion típicos tienen como resultado un índice extremadamente alto de transfeccion. Adicionalmente, los métodos basados en plásmido requieren que el promotor que conduce la expresión del gen de interés esté activo en las células bajo estudio.

En otro aspecto, la construcción de ARN puede ser suministrada a las células mediante electroporación . Véanse, por ejemplo, las formulaciones y metodología de electroporación de construcciones de ácidos nucleicos en células de mamíferos como las que se enseñan en los documentos US 2004/0014645, US 2005/0052630A1 , US 2005/0070841 A1 , US 2004/0059285A1 , US 2004/0092907A1. Los diversos parámetros que incluyen la fuerza del campo eléctrico requerido para la electroporación de cualquier tipo celular conocido, generalmente son conocidos en la literatura relevante de investigación, así como también en patentes numerosas y aplicaciones en el campo. Véanse, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,678,556, la patente Norteamericana No. 7,171,264, y la patente Norteamericana No. 7,173,116. El aparato para la aplicación terapéutica de la electroporación está disponible comercialmente, por ejemplo, del Sistema de Terapia de Electroporación de ADN MedPulser™ DNA (Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.), y se describe en la patente Norteamericana No. 6,567,694, la patente Norteamericana No. 6,516,223, la patente Norteamericana No. 5,993,434, la patente Norteamericana No. 6,181,964, la patente Norteamericana No. 6,241,701, y la patente Norteamericana No. 6,233,482; la electroporación, también puede utilizarse para la transfección de células in vitro como las descritas en el documento US20070128708A1. La electroporación también puede ser utilizada para suministrar ácidos nucleicos en las células in vitro. Por consiguiente, la administración transmitida por electroporación en las células de ácidos nucleicos, que incluyen las construcciones de expresión que utilizan cualquiera de los muchos dispositivos disponibles y los sistemas de electroporación conocidos por los expertos en la materia, presentan un medio interesante y nuevo para el suministro del ARN de interés a una célula objetivo.

Fuentes de Células T Antes de la expansión y modificación genética de las células T de la presente invención, se obtiene una fuente de células T de un sujeto. Las células T pueden ser obtenidas de una variedad de fuentes, que incluyen células mononucleares de sangre periférica, médula espinal, tejido de nodo linfático, cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, efusión pleural, tejido del bazo, y tumores. En ciertas modalidades de la presente invención, se puede utilizar cualquier cantidad de líneas de células T disponibles en la materia. En ciertas modalidades de la presente invención, las células T pueden ser obtenidas a partir de una unidad de sangre recolectada de un sujeto, utilizando cualquier cantidad de las técnicas conocidas por los expertos en la materia, tales como separación Ficoll™. En una modalidad preferida, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis. El producto de aféresis, normalmente contiene linfocitos, que incluyen células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una modalidad, las células recolectadas mediante aféresis, pueden ser lavadas para remover la fracción de plasma y colocar las células en un amortiguador o medio adecuado para los pasos de procesamiento subsiguientes. En una modalidad de la presente invención, las células son lavadas con solución salina amortiguada con fosfato (PBS). En una modalidad alternativa, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, o quizá todos, los cationes divalentes. Nuevamente, de manera sorprendente, los pasos de activación iniciales en la ausencia de calcio conducen a la activación magnificada. Aquellos expertos en la materia podrán apreciar fácilmente que puede lograrse un paso de lavado mediante los métodos conocidos por aquellos expertos, tales como utilizando una centrifugadora "de flujo" semiautomatizada (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, El CytoMate Baxter, o el Haemonetics Cell Saver 5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células pueden ser suspendidas nuevamente en una variedad de amortiguadores biocompatibles , tales como, por ejemplo, libre de Ca2 + , PBS libre de Mg2 + , PlasmaLyte A, u otra solución salina con o sin amortiguador. De manera alternativa, los componentes no deseables de la muestra de aféresis, pueden ser removidos y las células pueden ser suspendidas otra vez directamente en el medio de cultivo.

En otra modalidad, las células T son aisladas de linfocitos de sangre periférica mediante el lisado de los glóbulos rojos y el vaciado de los monocitos, por ejemplo, por centrifugado a través de gradiente PERCOLL™ o por decantación centrífuga de contraflujo. Una subpoblación específica de células T, tal como la de células T CD3+, CD28 + , CD4 + , CD8 + , CD45RA+, y CD45RO + , puede aislarse adicionalmente mediante las técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, en una modalidad, las células T son aisladas por incubación con cuentas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (es decir, 3x28), tales como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un período de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. En una modalidad, el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En una modalidad adicional, el período de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más largo y todos lo valores enteros entre éstos. En una modalidad, el período de tiempo es de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas. Aún en otra modalidad preferida, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En una modalidad preferida, el período de tiempo de incubación es de 24 horas. Para el aislamiento de las células T de pacientes con leucemia, el uso de los tiempos de incubación más largos, tales como de 24 horas, puede incrementar la producción celular. Los tiempos de incubación más largos pueden utilizarse para aislar las células T en cualquier situación en donde existen pocas células T, en comparación con otros tipos de células, tales como en el aislamiento de linfocitos de infiltración de tumor (TIL) de tejido de tumor o de individuos con un sistema inmune comprometido. Además, el uso de tiempos de incubación más largos, puede incrementar la eficiencia de la captura de células T CD8 + . Por lo tanto, simplemente, recortando o alargando el tiempo que se deja a las células T para enlazase en las cuentas CD3/CD28 y/o incrementando o disminuyendo la proporción de cuentas de células T (como se describe adicionalmente en la presente descripción), las subpoblaciones pueden seleccionarse, de manera preferente, hacia o contra el inicio del cultivo o en otros puntos de tiempo durante el proceso. Adicionalmente, al incrementar o disminuir la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 sobre los lechos u otra superficie, las subpoblaciones de células T pueden ser seleccionadas, de manera preferente, hacia o en contra del inicio del cultivo o en otros puntos de tiempo deseados. Los expertos en la materia podrían reconocer que también pueden utilizarse rondas múltiples de selección en el contexto de la presente invención. En ciertas modalidades, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y utilizar las células "no seleccionadas" en el proceso de activación y expansión. Las células "no seleccionadas" también pueden someterse a rondas adicionales de selección.

El enriquecimiento de una población de células T mediante la selección negativa puede lograrse con una combinación de anticuerpos dirigidos a los marcadores de superficie únicos para las células seleccionadas negativamente. Un método es la clasificación y/o selección de células por medio de la inmunoadherencia magnética negativa o la citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a los marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas en forma negativa. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4" mediante la selección negativa, un cóctel del anticuerpo monoclonal incluye normalmente anticuerpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, y CD8. En ciertas modalidades, puede ser deseable enriquecer o seleccionar en forma positiva las células T reguladoras, las cuales expresan normalmente CD4 + , CD25 + , CD62Lhi, GITR + , y FoxP3+. De manera alternativa, en ciertas modalidades, las células reguladoras T son reducidas mediante cuentas conjugadas anti-C25 u otro método de selección similar.

Para el aislamiento de una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, se puede variar la concentración de células y la superficie (por ejemplo, las partículas, tales como cuentas). En ciertas modalidades, puede ser deseable disminuir de manera significativa el volumen en el cual se mezclan las cuentas y las células (es decir, incrementar la concentración de células), para asegurar el contacto máximo de las células y las cuentas. Por ejemplo, en una modalidad, se utiliza una concentración de 2 mil millones de células/ml. Por ejemplo, en una modalidad, se utiliza una concentración de mil millones de células/ml. En una modalidad adicional, se utilizan más de 100 millones de células/ml. En una modalidad adicional, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 millones de células/ml. Aún en otra modalidad, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En las modalidades adicionales, se pueden utilizar 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede tener como resultado una producción, activación y expansión incrementadas. Además, el uso de altas concentraciones de células, permite una captura más eficiente de células que pueden expresar débilmente los antígenos objetivo de interés, tales como las células T CD28 negativas, o a partir de muestras en donde están presentes muchas células de tumor (es decir, sangre leucémica, tejido de tumor, etc.). Dichas poblaciones celulares pueden tener valor terapéutico y podría ser deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de altas concentraciones de células permite una selección más eficiente de células T CD28 + , las cuales normalmente tienen una expresión CD28 más débil.

En una modalidad relacionada, puede ser deseable usar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de células T y la superficie (por ejemplo, partículas tales como cuentas), se reducen al mínimo las interacciones entre las partículas y las células. Así se seleccionan células que expresan cantidades altas de los antígenos deseados para enlazarse a las partículas. Por ejemplo, las células T CD4+ expresan niveles más altos de CD28 y son capturadas de manera más eficiente que las células T CD8+ en concentraciones diluidas. En una modalidad, la concentración de células utilizada es de 5X106/ml. En otras modalidades, la concentración utilizada puede ser desde aproximadamente 1X105/ml hasta 1X106/ml, y cualquier valor entero entre éstas.

En otras modalidades, las células pueden ser incubadas en un rotador durante períodos de tiempo variables a velocidades variables, a temperaturas ya sea de 2-10°C o a temperatura ambiente.

Las células T para estimulación, también pueden congelarse después de un paso de lavado. Sin limitarse a la teoría, la congelación y el paso de descongelación subsiguiente, proporcionan un producto más uniforme, que remueve los granulocitos y hasta cierto alcance, los monocitos en la población celular. Después del paso de lavado que remueve el plasma y las plaquetas, las células pueden ser suspendidas en una solución de congelación. Aunque en la materia se conocen muchas soluciones y parámetros de congelación y éstos serán útiles en este contexto, un método involucra el uso de PBS que contiene el 20% de DMSO y el 8% de albúmina de suero humano, o un medio de cultivo que contiene el 10% de Dextrano 40 y el 5% de dextrosa, el 20% de albúmina de suero humano y el 7.5% de DMSO, o el 31.25% de PlasmaLyte A, el 31.25% de Dextrosa al 5% y el 0.45% de NaCI, el 10% de Dextrano 40 y el 5% de Dextrosa, el 20% de albúmina de suero humano, y el 7.5% de DMSO u otro medio de congelación celular adecuado que contiene, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, las células son congeladas posteriormente a una temperatura de -80°C a un índice de 1° por minuto y son almacenadas en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden utilizar otros métodos de congelación controlada, así como también, la congelación no controlada inmediatamente a una temperatura de -20°C o en nitrógeno líquido.

En ciertas modalidades, las células crioconservadas son descongeladas y lavadas, como se describe en la presente descripción, y se les deja reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación utilizando los métodos de la presente invención.

En el contexto de la presente invención, también está contemplada la recolección de muestras de sangre o productos de aféresis de un sujeto en un período de tiempo anterior a cuando las células expandidas, como las descritas en la presente descripción, puedan ser necesarias. Propiamente dicho, la fuente de las células que van a ser expandidas, puede ser recolectada en cualquier punto de tiempo necesario, y las células deseadas, tales como las células T, pueden ser aisladas y congeladas para uso posterior en la terapia de células T para el tratamiento de cualquier cantidad de enfermedades o condiciones que podrían beneficiarse del uso de la terapia de células T, tales como aquellas descritas en la presente descripción. En una modalidad, la muestra de sangre o aféresis, se toma de un sujeto generalmente saludable. En ciertas modalidades, una muestra de sangre o una aféresis se toma de un sujeto generalmente saludable que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado la misma, y las células de interés son aisladas y congeladas para uso posterior. En ciertas modalidades, las células T pueden ser expandidas, congeladas y utilizadas en un momento posterior. En ciertas modalidades, las muestras son recolectadas de un paciente poco tiempo después de haber sido diagnosticado con una enfermedad particular, como las que se describen en la presente descripción, pero antes de cualesquiera tratamientos. En una modalidad adicional, las células son aisladas de una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto antes de cualquier cantidad de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitarse a, tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivirales, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como, ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, y FK506, anticuerpos u otros agentes de inmunoablación, tales como CA PATH, anticuerpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esferoides, FR901228, e irradiación. Estos fármacos inhiben, ya sea la calcineurina de fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina) (Liu y asociados, Cell 66: páginas 807 a 815, 1991; Henderson y asociados, Immun 73: páginas 316 a 321,1991; Bierer y asociados, Curr. Opin. Immun. 5: páginas 763 a 773, 1993). En una modalidad adicional, las células son aisladas de un paciente y congeladas para uso posterior en conjunto con (por ejemplo, antes, en forma simultánea o después) trasplante de médula espinal o células madre, terapia de ablación de células T que utilizan, ya sea agentes quimioterapéuticos como fludarabina, terapia de radiación de rayo externo (XRT), ciclofosfamida , o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otra modalidad, las células son aisladas antes y pueden ser congeladas para usos futuros en el tratamiento posterior a la terapia ablativa de células B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan.

En una modalidad adicional de la presente invención, las células T son obtenidas de un paciente, directamente después del tratamiento. En este sentido, se ha observado que después de ciertos tratamientos de cáncer, en particular tratamientos con fármacos que dañan al sistema inmunológico, poco después del tratamiento, durante el período en que los pacientes normalmente podrían recuperarse del mismo, la calidad de las células T obtenidas puede ser óptima o mejorada por su habilidad para expandirse ex vivo. De igual forma, después de la manipulación ex vivo utilizando los métodos descritos en la presente descripción, estas células pueden encontrarse en un estado preferido para el injerto mejorado y la expansión ¡n vivo. Por lo tanto, dentro del contexto de la presente invención, se contempla la recolección de células sanguíneas, incluyendo células T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en ciertas modalidades, puede utilizarse la movilización (por ejemplo, la movilización con GM-CSF) y los regímenes de acondicionamiento para crear una condición en un sujeto, en donde se favorece la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos celulares particulares, especialmente durante una ventana de tiempo definida después de la terapia. Los tipos ilustrativos de células incluyen a las células T, las células B, las células dendríticas y otras células del sistema inmunológico.

Activación y Expansión de Células T Ya sea antes o después de la modificación genética de las células T para expresar un CAR deseable, las células T pueden ser activadas y expandidas, de manera general, utilizando métodos como los descritos, por ejemplo, en las patentes Norteamericanas Nos. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y la publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20060121005.

Generalmente, las células T de la presente invención son expandidas al ponerlas en contacto con una superficie que tiene anexo a la misma un agente que estimula una señal asociada de complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora sobre la superficie de las células T. En particular, las poblaciones de células T pueden ser estimuladas como se describe en la presente descripción, mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3, o con un fragmento de enlace de antígeno del mismo, o con un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado sobre una superficie, o mediante contacto con un activador C de cinasa de proteína (por ejemplo, briostatina) en conjunto con un yonóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesorio sobre la superficie de las células T, se utiliza un ligando que enlaza la molécula accesorio. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, bajo condiciones adecuadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación, ya sea de las células T CD4+ o las células T CD8 + , éstas se ponen en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y con un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de anticuerpos anti-CD28 que se pueden utilizar incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, Francia), también pueden utilizarse otros métodos comúnmente conocidos en la materia (Berg y asociados, Transplant Proc. 30(8): páginas 3975 a 3977,1998; Haanen y asociados, J. Exp. ed. 190(9): páginas 13191328,1999; Garland y asociados, J. Immunol Meth. 227(1-2): páginas 53 a 63, 1999).

En ciertas modalidades, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para la célula T, pueden ser provistas mediante protocolos diferentes. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o ser acoplados a una superficie. Cuando están acoplados a una superficie, los agentes pueden ser acoplados a la misma superficie (es decir, en formación "cis") o en superficies separadas (es decir, en formación "trans"). De manera alternativa, un agente puede ser acoplado a una superficie y el otro agente en la solución. En una modalidad, el agente que proporciona la señal coestimuladora está enlazado a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en la solución o acoplado a una superficie. En ciertas modalidades, ambos agentes pueden estar en la solución. En otra modalidad, los agentes pueden estar en forma soluble, y posteriormente ser reticulados a una superficie, tal como los receptores Fe de expresión celular o un anticuerpo u otro agente de enlace, el cual se enlazará con los agentes. En este sentido, véanse por ejemplo, las publicaciones de Solicitudes de patentes Norteamericanas Nos. 20040101519 y 20060034810 para células que presentan un antígeno artificial (aAPCs) que están contempladas para ser utilizadas en la activación y expansión de células T de la presente invención.

En una modalidad, los dos agentes son inmovilizados sobre cuentas, ya sea sobre la misma cuenta, es decir "cis" o sobre cuentas separadas, es decir "trans". A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo y el agente que proporciona la señal de coestimulación es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo; y ambos agentes son coinmovilizados en las mismas cuentas en cantidades moleculares equivalentes. En una modalidad, se utiliza una proporción 1:1 de cada anticuerpo que enlaza con las cuentas para la expansión de célula T CD4* y el crecimiento de célula T. En ciertos aspectos de la presente invención, una proporción de anticuerpos anti CD3:CD28 que se enlaza con las cuentas, se utiliza de tal manera que se observa un incremento en la expansión de célula T en comparación con la expansión observada utilizando una proporción de 1:1. En una modalidad particular, se observa un incremento desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 dobleces, en comparación con la expansión observada utilizando una proporción de 1:1. En una modalidad, la proporción de anticuerpo CD3:CD28 de enlace a las cuentas varia desde 100:1 hasta 1:100 y todos los valores enteros entre éstos. En un aspecto de la presente invención, se enlaza más anticuerpo anti-CD28 a las partículas, que anticuerpo anti-CD3, es decir, la proporción de CD3:CD28 es menor de uno. En ciertas modalidades de la presente invención, la proporción de anticuerpo anti-CD28 a anticuerpo anti-CD3 enlazada a las cuentas, es mayor que 2:1. En una modalidad particular, se utiliza una proporción de 1:100 CD3:CD28 de anticuerpo de enlace a las cuentas. En otra modalidad, se utiliza una proporción de 1:75 de CD3:CD28 de enlace de anticuerpos a cuentas. En una modalidad adicional, se utiliza una proporción de 1:50 de CD3:CD28 de enlace de anticuerpos a cuentas. En otra modalidad, se utiliza una proporción de 1:30 de CD3:CD28 de enlace de anticuerpos a cuentas. En una modalidad preferida, se utiliza una proporción de 1:10 de CD3:CD28 de enlace de anticuerpos a cuentas. En otra modalidad, se utiliza una proporción de 1:3 de CD3:CD28 de enlace de anticuerpos a cuentas. Aún en otra modalidad, se utiliza una proporción de 3:1 de CD3:CD28 de enlace de anticuerpos a cuentas.

Se pueden utilizar proporciones de las partículas a células desde 1:500 hasta 500:1 y cualesquiera valores enteros entre éstos, para estimular las células T u otras células objetivo. Como apreciarán fácilmente aquellos expertos en la materia, la proporción de partículas a células puede depender del tamaño de partícula en relación con la célula objetivo. Por ejemplo, las cuentas de tamaño pequeño únicamente pueden enlazar pocas células, mientras que las cuentas más grandes podrían enlazar muchas células. En ciertas modalidades, la proporción de células a partículas varía desde 1:100 hasta 100:1 y cualesquiera valores enteros entre éstas y en las modalidades adicionales, para estimular las células T, también se puede utilizar la proporción que comprende desde 1:9 hasta 9:1 y cualesquiera valores enteros entre éstas. Puede variar la proporción de partículas acopladas por anti-CD3- y anti-CD28 a células T que tiene como resultado la estimulación de células T, como se observó anteriormente, sin embargo, ciertos valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, y 15:1 siendo por lo menos 1:1 la proporción preferida de partículas por célula T. En una modalidad, se utiliza una proporción de partículas a células de 1:1 o menos. En una modalidad particular, una proporción preferida de partícula a célula es de 1:5. En las modalidades adicionales, la proporción de partículas a células puede variar dependiendo del día de estimulación. Por ejemplo, en una modalidad, se utiliza una proporción de partículas a células desde 1:1 hasta 10:1 en el primer día y las partículas adicionales son agregadas a las células todos los días o cualquier otro día después de éste durante un período de hasta 10 días, a proporciones finales desde 1:1 hasta 1:10 (con base en los conteos celulares en el día de la adición). En una modalidad, se utiliza la proporción de partículas a células de 1:1 en el primer día de estimulación y éste es ajustado a 1:5 en el tercer y quinto días de estimulación. En otra modalidad, las partículas son agregadas diariamente o cada día hasta una proporción final de 1:1 en el primer día y de 1:5 en el tercer y quinto días de estimulación. En otra modalidad, la proporción de partículas a células es de 2:1 en el primer día de estimulación y se ajusta hasta 1:10 en el tercer y quinto días de estimulación. En otra modalidad, las partículas son agregadas diariamente o cada día hasta una proporción final de 1 :1 en el primer día, y 1:10 en el tercer y quinto días de estimulación. Un experto en la materia apreciará que, en la presente invención puede ser adecuado el uso de una variedad de otras proporciones. En particular, las proporciones variarán dependiendo del tamaño de partícula y el tamaño y tipo de célula.

En las modalidades adicionales de la presente invención, las células, tales como células T, son combinadas con cuentas recubiertas con agentes, las cuentas y las células son separadas en forma subsiguiente, y posteriormente las células son cultivadas. En una modalidad alternativa, antes del cultivo, las cuentas cubiertas con agentes y las células no están separadas, sino que son cultivadas juntas. En una modalidad adicional, las cuentas y las células son concentradas primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, que tiene como resultado una ligadura incrementada de los marcadores de superficie celular, induciendo de esta manera la estimulación celular.

A modo de ejemplo, las proteínas de superficie celular pueden estar ligadas, lo que permite que los lechos paramagnéticos a los cuales están unidos los anti-CD3 y los anti-CD28 (3x28 lechos) hagan contacto con las células T. En una modalidad, las células (por ejemplo, células T 104 a 109) y los lechos (por ejemplo, los lechos paramagnéticos DYNABEADS® -450 CD3/CD28 T a una proporción de 1:1) son combinados en un amortiguador, preferentemente PBS (sin cationes divalentes, tales como calcio y magnesio). Nuevamente, aquellos expertos en la materia pueden apreciar fácilmente que se puede utilizar cualquier concentración celular. Por ejemplo, la célula objetivo puede ser muy rara en la muestra y comprender únicamente el 0.01% de la muestra o también, la muestra completa (es decir, el 100%) puede comprender la célula objetivo de interés. Por consiguiente, cualquier número celular está dentro del contexto de la presente invención. En ciertas modalidades, puede ser deseable disminuir de manera significativa el volumen en el cual son mezcladas las partículas y las células (es decir, incrementar la concentración de células), para asegurar el contacto máximo de las células y las partículas. Por ejemplo, en una modalidad, se utiliza una concentración de aproximadamente 2 mil millones de células/ml. En otra modalidad adicional, se utilizan más de 100 millones de células/ml. En una modalidad adicional, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 millones de células/ml. Aún en otra modalidad adicional, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95, o 100 millones de células/ml. En las modalidades adicionales, se pueden utilizar 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones altas puede dar como resultado una producción celular, activación celular y expansión celular incrementadas.

Adicionalmente, el uso de concentraciones altas de células, permite una captura más eficiente de las células que pueden expresar débilmente los antígenos objetivo de interés, tales como las células T CD28 negativas. Dichas poblaciones celulares pueden tener un valor terapéutico y, en ciertas modalidades, podría ser deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de altas concentraciones de células permite una selección más eficiente de células T CD 28 + , que normalmente tienen una expresión CD28 más débil.

En una modalidad de la presente invención, la mezcla puede ser cultivada durante un período desde varias horas (aproximadamente 3 horas) hasta aproximadamente 14 días o cualquier valor entero en horas entre éstos. En otra modalidad, la mezcla puede ser cultivada durante 21 días. En una modalidad de la presente invención, las cuentas y las células T son cultivadas juntas durante aproximadamente 8 días. En otra modalidad de la presente invención, las cuentas y las células T son cultivadas juntas durante 2 a 3 días. También pueden desearse varios ciclos de estimulación, de manera que el tiempo de cultivo de las células T puede ser de 60 días o más. Las condiciones adecuadas para el cultivo de células T incluye un medio adecuado (por ejemplo, Minimal Essential Media o RPMI Media 1640 o, X-vivo 15 (Lonza)) que puede contener los factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, que incluyen suero (por ejemplo, suero bobino fetal o humano), interleucinas-2 (IL-2), insulina, IFN-?, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF3, y TNF-a o cualesquiera otros aditivos para el crecimiento de las células conocidos por aquellos expertos en la materia. Otros aditivos para el crecimiento de las células incluyen, pero no se limitan a, tensoactivo, plasmanato y agentes de reducción, tales como N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15, y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos agregados, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea libres de suero o complementadas con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y expansión de células T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, están incluidos únicamente en cultivos experimentales, no en cultivos de células que serán inyectadas a un sujeto. Las células objetivo se mantienen bajo las condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, a una temperatura (por ejemplo, 37°C) y a presión atmosférica (por ejemplo, aire más el 5% de C02) adecuadas.

Las células T que han sido expuestas a tiempos de estimulación variados pueden exhibir características diferentes. Por ejemplo, la sangre típica o los productos de células mononucleares de sangre periférica de aféresis, tienen una población de célula T auxiliar (TH, CD4+) que es mayor que la población de célula T citotóxica o supresora (Tc, CD8 + ). La expansión de células T ex vivo a través de la estimulación de los receptores CD3 y CD28, produce una población de células T, misma que antes de un período de aproximadamente 8-9 días, consiste predominantemente en células TH, mientras que después de aproximadamente 8-9 días, la población de células T comprende una población progresivamente mayor de células Tc. Por consiguiente, dependiendo del propósito del tratamiento, la inyección en un sujeto con una población de células T que comprende predominantemente las células TH puede ser ventajosa. De manera similar, si se ha aislado un subconjunto específico de antígeno de células Tc, puede ser benéfico expandir este subgrupo hasta un grado mayor.

Además de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían de manera significativa, pero en gran parte, de manera que se pueden reproducir durante el curso del proceso de expansión celular. Por lo tanto, dicha capacidad de reproducción habilita la capacidad de ajustar a medida un producto de célula T activado para propósitos específicos.

Aplicación Terapéutica La presente invención abarca una célula (por ejemplo, célula T) modificada para expresar un CAR que combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con un dominio ¡ntracelular de CD3-zeta, CD28, 4-1BB, CD2, o cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, en algunos casos, la célula T modificada puede producir una respuesta de célula T transmitida por CAR.

La presente invención proporciona el uso de un CAR para dirigir nuevamente la especificidad de una célula T primaria a un antígeno de tumor. Por lo tanto, la presente invención, también proporciona un método para estimular una respuesta inmune transmitida por célula T en una población de célula objetivo o tejido en un mamífero que comprende el paso de administrar al mamífero una célula T que expresa un CAR, en donde el CAR comprende una porción de enlace que interactúa de manera específica con un objetivo previamente determinado, una porción de cadena zeta que comprende, por ejemplo, el dominio intracelular de CD3-zeta humano y una región de señalización coestimuladora.

En una modalidad, la presente invención incluye un tipo de terapia celular en donde las células T son modificadas genéticamente para expresar un CAR y la célula T CAR es inyectada en un receptor que la necesita. La célula inyectada tiene la capacidad de matar células de tumor en el receptor. A diferencia de las terapias de anticuerpos, las células T CAR tienen la capacidad de replicarse in vivo, dando como resultado una persistencia a largo plazo que puede conducir al control sostenido del tumor.

En una modalidad, las células T CAR de la presente invención pueden experimentar una expansión robusta de células T in vivo y pueden persistir durante un período de tiempo extendido. En otra modalidad, las células T CAR de la presente invención evolucionan en células T de memoria específica que pueden ser activadas nuevamente para inhibir cualquier formación de tumor o crecimiento adicional del mismo. Por ejemplo, las células T CAR de la presente invención pueden experimentar la expansión robusta de células T in vivo y seguir en niveles altos en la sangre y médula espinal durante una cantidad extendida de tiempo y formar células T de memoria específica. Sin limitarse a teoría alguna en particular, las células T CAR pueden diferenciarse in vivo en un estado similar al de memoria central, al encontrar y, en forma subsiguiente, eliminar las células objetivo que expresan el antígeno sustituto.

Sin el deseo de limitarse a teoría alguna en particular, la respuesta de inmunidad antitumor producida por las células T modificadas por CAR, puede ser una respuesta inmune activa o pasiva. Además, la respuesta inmune transmitida por CAR puede ser parte de un método de inmunoterapia adoptivo en el cual, las células T modificadas por CAR inducen una respuesta inmune específica para el dominio de enlace de antígeno en el CAR. Por ejemplo, una célula CART19 produce una respuesta inmune específica contra las células que expresan CD19.

Aunque los datos descritos en la presente descripción describen de manera específica el mARN que comprende, ya sea anti-CD19 scFv derivado de anticuerpo monoclonal múrido FMC63 o el antimesotelina SS1 scFv, junto con la articulación CD8a humana y el dominio transmembrana y los dominios de señalización CD2 y CD3zeta, se debe interpretar que la presente invención incluye cualquier número de variaciones para cada uno de los componentes de la construcción como los que se describen en cualquier parte de la presente descripción. Es decir, la presente invención incluye el uso de cualquier dominio de enlace de antígeno en el CAR para generar una respuesta de célula T transmitida por CAR específica para el dominio de enlace de antígeno. Por ejemplo, el dominio de enlace de antígeno en el CAR de la presente invención puede seleccionar como objetivo un antígeno de tumor con el propósito de tratar el cáncer.

Los cánceres que pueden ser tratados incluyen tumores que no son vascularizados, o todavía no son sustancialmente vascularizados, así como también tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cánceres a ser tratados con los CARs de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma y ciertas malignidades de leucemia o linfoides, tumores benignos y malignos y malignidades, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. Los tumores/cánceres de adulto y los tumores/cánceres pediátricos, también están incluidos.

Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o la médula espinal. Los ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen leucemias, que incluyen leucemias agudas (tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia) , leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mielógena crónica, y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma que no es de Hodgkin (formas de grado indolente y alto) mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom , enfermedad de cadena pesada, síndrome mielodisplásico, leucemia de célula compleja y mielodisplasia.

Los tumores sólidos son masas anormales de tejido, que normalmente no contienen áreas con quistes o líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos son nombrados por el tipo de célula que los forma (tales como sarcomas, carcinomas o linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma, y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, malignidad linfoide, cáncer pancreático, cáncer de seno, cánceres de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma de glándula sebácea de feocromocitomas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma de ducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma, y tumores CNS (tales como un glioma (tales como un glioma del tronco cerebral y gliomas mezclados), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma del CNS, germinoma, meduloblastoma, craniofariogioma schwannoma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales).

En una modalidad, la porción de enlace de antígeno CAR de la presente invención está diseñada para tratar un cáncer particular. Por ejemplo, el CAR diseñado para dirigir el CD19, se puede utilizar para tratar los cánceres y trastornos que incluyen, pero no se limitan a pre-B ALL (indicación pediátrica), ALL de adulto, celinfoma cubierto, B-celinfoma grande difuso, transplante de médula ósea post alogénico salvaje, y los similares.

En otra modalidad, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a CD22 para tratar el B-celinfoma grande difuso.

En una modalidad, se pueden tratar los cánceres y trastornos, que incluyen pero no se limitan a, pre-B ALL (indicación pediátrica), ALL de adulto, celinfoma cubierto, B-celinfoma grande difuso, transplante de médula ósea post alogénica salvaje, y similares, utilizando una combinación de CARs que se dirigen a CD19, CD20, CD22 y RORI.

En una modalidad, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a mesotelina para tratar mesotelioma, cáncer pancreático, cáncer de ovario y los similares. En otra modalidad, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a CD33/IL3Ra para tratar leucemia mielógena aguda y los similares. En una modalidad adicional, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a c-Met para tratar cáncer de seno negativo triple, cáncer de pulmón de célula no pequeña y los similares.

En una modalidad, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a PSMA para tratar cáncer de próstata y los similares. En una modalidad, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a Glicolípido F77 para tratar cáncer de próstata y los similares. En una modalidad, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a EGFRvIll para gioblastoma y los similares.

En una modalidad, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a GD-2 para tratar neuroblastoma, melanoma y los similares. En una modalidad, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a NY-ESO-1 TCR para tratar mieloma, sarcoma, melanoma y los similares. En una modalidad, el CAR puede ser diseñado para dirigirse a MAGE A3 TCR para tratar mieloma, sarcoma, melanoma y los similares.

Sin embargo, la presente invención no debe interpretarse como limitada únicamente a los objetivos de antígeno y enfermedades descritas en la presente descripción. En su lugar, se debe interpretar que la presente invención incluye cualquier objetivo antigénico que esté asociado con una enfermedad en donde puede utilizarse el CAR para tratar la enfermedad.

Las células T modificadas por CAR de la presente invención, también pueden servir como un tipo de vacuna para inmunización ex vivo y/o terapia in vivo en un mamífero. Preferentemente, el mamífero es un humano.

Con respecto a la inmunización ex vivo, lo menos uno de los siguientes ocurre in vitro por antes de la administración de la célula en el mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAR para las células, y/o iii) crioconservación de las células.

Los procedimientos ex vivo son bien conocidos en la materia y son planteados más completamente a continuación. En breve, las células son aisladas de un mamífero (preferentemente un humano) y modificadas genéticamente (es decir, transducidas o transfectadas in vitro) con un vector que expresa un CAR descrito en la presente descripción. La célula modificada por CAR puede ser administrada a un receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un humano y la célula CAR modificada puede ser autóloga con respecto al receptor. De manera alternativa, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.

El procedimiento para la expansión ex vivo de las células madre y de origen hematopoyéticas que se describe en la patente Norteamericana No. 5,199,942, incorporada en la presente descripción como referencia, puede ser aplicado a las células de la presente invención. Otros métodos adecuados son conocidos en la materia, por lo tanto, la presente invención no está limitada a método alguno en particular en la expansión ex vivo de las células. En breve, el cultivo ex vivo y la expansión de las células T comprende: (i) recolectar células madre y de origen hematopoyéticas CD34+ de un mamífero a partir de explantes de cosecha de sangre periférica o médula espinal; y (2) expandir dichas células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la patente Norteamericana No. 5,199,942, para el cultivo y expansión de las células, se pueden utilizar otros factores, tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit.

Además de utilizar una vacuna basada en células, en términos de inmunización ex vivo, la presente invención también proporciona composiciones y métodos para la inmunización in vivo en un paciente que produzca una respuesta inmune dirigida contra un antígeno.

De manera general, las células activadas y expandidas como las que se describen en la presente descripción pueden ser utilizadas en el tratamiento y prevención de enfermedades que se originan en individuos que están inmunocomprometidos. En particular, las células T modificadas por CAR de la presente invención son utilizadas en el tratamiento del cáncer. En ciertas modalidades, las células de la presente invención son utilizadas en el tratamiento de pacientes con el riesgo de desarrollar cáncer. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento o prevención de cáncer que comprenden la administración a un sujeto que lo necesita, de una cantidad terapéuticamente efectiva de células T modificadas por CAR de la presente invención.

Las células T modificadas por CAR de la presente invención pueden ser administradas ya sea solas, o en la forma de una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares. En breve, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender una población de célula objetivo como la descrita en la presente descripción, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender amortiguadores, tales como solución salina amortiguada neutral, solución salina regulada por fosfato y los similares; carbohidratos tales como glucosa, mañosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes de quelación tales como EDTA o glutationa; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y conservadores. Las composiciones de la presente invención, preferentemente son formuladas para la administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas en forma adecuada para la enfermedad a ser tratada (o evitada). La cantidad y frecuencia de administración serán determinadas mediante factores tales como la condición del paciente, y el tipo y severidad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis adecuadas pueden ser determinadas mediante ensayos clínicos.

Cuando se indica "una cantidad inmunológicamente efectiva", "una cantidad antitumor efectiva", "una cantidad inhibidora de tumor efectiva" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que será administrada puede ser determinada por un médico que tome en consideración las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, alcance de la infección o metástasis y condición del paciente (sujeto). Generalmente, se puede establecer que una composición farmacéutica que comprende las células T descritas en la presente descripción puede ser administrada a una dosificación de 104 a 109 células/kg de peso corporal, preferentemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, que incluye todos los valores enteros entre esos rangos. Las composiciones de célula T también pueden ser administradas en ocasiones múltiples en estas dosificaciones. Las células pueden ser administradas utilizando las técnicas de infusión que son conocidas comúnmente en la inmunoterapia (véase, por ejemplo, la publicación de Rosenberg y asociados, New Eng. J. of Med. 319: página 1676, 1988). El régimen de dosificación y tratamiento óptimo para el paciente particular, puede ser determinado fácilmente por un experto en la materia de la medicina, monitoreando al paciente en busca de signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.

En ciertas modalidades, puede ser deseable administrar las células T activadas a un sujeto, y posteriormente, extraer sangre (o haber realizado una aféresis), activar las células T de la misma de acuerdo con la presente invención, e inyectar nuevamente al paciente con estas células T activadas y expandidas. Este proceso puede realizarse varias veces cada pocas semanas. En ciertas modalidades, las células T pueden ser activadas a partir de extracciones de sangre desde 10 ce hasta 400 ce. En ciertas modalidades, las células T son activadas a partir de extracciones de sangre de 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, o 100cc. Sin limitarse a la teoría, el uso de este protocolo de extracción/reinfusión múltiple de sangre puede servir para seleccionar ciertas poblaciones de células T.

La administración al sujeto de las composiciones, puede realizarse en cualquier forma conveniente, incluyendo por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en la presente descripción pueden administrarse a un paciente en forma subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o en forma intraperitoneal. En una modalidad, las composiciones de célula T de la presente invención son administradas a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En otra modalidad, las composiciones de célula T de la presente invención son administradas, preferentemente, mediante inyección i.v. Las composiciones de células T pueden ser inyectadas directamente en un tumor, nodo linfático o sitio de inyección.

En ciertas modalidades de la presente invención, las células activadas y expandidas utilizando los métodos descritos en la presente descripción u otros métodos conocidos en la materia en donde las células T son expandidas a niveles terapéuticos, son administradas a un paciente en conjunto con (por ejemplo, antes, en forma simultánea o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, pero no se limitan a tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucinas-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento de natalizumab para pacientes MS o tratamiento de efalizumab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes PML. En las modalidades adicionales, las células T de la presente invención pueden ser utilizadas en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes de inmunoablación, tales como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben, ya sea la calcineurina de fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6, que es importante para la señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina) (Liu y asociados, Cell 66: páginas 807 a 815, 1991; Henderson y asociados, Immun 73: páginas 316 a 321,1991; Bierer y asociados, Curr. Opin. Immun. 5: páginas 763 a 773, 1993). En una modalidad adicional, las composiciones de células de la presente invención son administradas a un paciente en conjunto con (por ejemplo antes, en forma simultánea o después) trasplante de médula espinal, terapia de ablación de células T que utiliza, ya sea agentes quimioterapéuticos como fludarabina, terapia de radiación de rayo externo (XRT), ciclofosfamida, o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otra modalidad, las composiciones de células de la presente invención son administradas después de la terapia ablativa de célula B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una modalidad, los sujetos pueden experimentar tratamiento estándar con dosis altas de quimioterapia, seguido por el trasplante de células madre de sangre periférica. En ciertas modalidades, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunes expandidas de la presente invención. En una modalidad adicional, las células expandidas son administradas antes o después de la cirugía.

La dosis de los tratamientos anteriores a ser administrada a un paciente variará con la naturaleza precisa de la condición que está siendo tratada y el receptor del tratamiento. El escalamiento de las dosis para administración en humanos puede realizarse de acuerdo con las prácticas aceptadas en la materia. La dosis para CAMPATH, por ejemplo, generalmente está dentro del rango de 1 hasta aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, normalmente administrado diariamente durante un período entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg por día aunque en algunos casos se pueden utilizar dosis mayores de hasta 40 mg por día, (como se describe en la patente Norteamericana No. 6,120,766).

EJEMPLOS EXPERIMENTALES La presente invención se describe adicionalmente con detalle, haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos son provistos únicamente como ilustración, y no pretenden ser limitantes a menos que sea especificado de otra forma. Por lo tanto, la presente invención en ningún sentido debe ser interpretada como limitada a los siguientes ejemplos, sino que en su lugar, debe interpretarse por abarcar todas y cada una de las variaciones que se vuelven evidentes como resultado de las enseñanzas provistas en la presente descripción.

Sin una descripción adicional, se considera que un experto en la materia puede, utilizando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, elaborar y utilizar los compuestos de la presente invención y practicar los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos de trabajo, por lo tanto, señalan de manera específica las modalidades preferidas de la presente invención, y no serán interpretados como limitantes en sentido alguno de la presente invención.

EJEMPLO 1: USO DE DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN CD2 EN RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICOS DE SEGUNDA GENERACIÓN La incorporación de dominios coestimuladores en receptores de antígeno quimérico, puede incrementar la producción de citocina y matar células objetivo. CD2 es una molécula coestimuladora que puede influir en la señalización transmitida por calcio. En la presente, se examina si la inclusión de dominio intracelular CD2 en CARs influye en el influjo/señalización de calcio y la producción de citocina.

Los materiales y métodos empleados en estos experimentos son descritos ahora.

CARs que contienen CD2 El dominio coestimulador CD2 fue clonado en varios CARs CD19 o específicos de mesotelina. Por ejemplo, la figura 1, despliega la secuencia de nucleótido para el CAR anti CD19-CD2 zeta (SEQ ID NO: 1).

Células T Las muestras de sangre fueron obtenidas de Human Immunology Core de la Universidad de Pensilvania. Las células T de sangre periférica CD4+ y CD8+ fueron aisladas en forma negativa utilizando equipos RosetteSep ("Tecnologías de Células Madre" (Stem Cell Technologies)). Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 complementado con el 10% de FCS, 100 pg/ml de penicilina, 100 g/ml de sulfato de estreptomicina, 10 mM de Hepes en una incubadora a una temperatura de 37°C y 5% de C02. Para la estimulación, las células T CD4+ y CD8+ T fueron cultivadas con una combinación de cuentas magnéticas cubiertas de anticuerpo aCD2(T11.1 y T11.2), aCD3 (OKT3), y/o aCD28 (9.3).

Electroporación de mARN Las células T humanas fueron sometidas a electroporación con mARN para expresar el dominio CD28:CD3-zeta, los dominios CD28:CD2:CD3zeta o CD2:CD3zeta. Adicionalmente, los CARs fueron preparados para expresar únicamente los dominios CD2, CD28 o CD3zeta. Las células T donadoras fueron sometidas a electroporación con mARN CAR mediante los siguientes métodos. En el día 10 de cultivo, las células T activadas por cuentas magnéticas fueron recolectadas y sometidas a electroporación. Se utilizaron dos sistemas de electroporación: BTX CM830 (Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, E.U.A), y Maxcyte (Maxcyte Inc, Rockville, MD, E.U.A). Para la electroporación utilizando BTX EM830, las células T estimuladas, sometidas a electroporación, se lavaron tres veces con OPTI-MEM (Invitrogen) y se suspendieron nuevamente en OPTI-MEM con una concentración final de 1-3x108/ml. De manera subsiguiente, de 0.1 a 0.2 mi de las células se mezclaron con 10 pg/0.1ml de células T de IVT ARN (o como se indicó), y fueron sometidas a electroporación en un tubo de laboratorio de 2 mm (Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, E.U.A.). Para la electroporación utilizando el Maxcyte, se siguió el manual de instrucciones utilizando la cámara de procesamiento OC-400 (Maxcyte Inc, Rockville, MD, E.U.A.) con programas integrados. La expresión de los CARs fue verificada por citometría de flujo. Las células fueron lavadas y suspendidas en amortiguador FACs (PBS más 0.1% de azida de sodio y 0.4% de BSA). Los anticuerpos F(ab)2 antirratón de cabra policlonal etiquetados por biotina (anti-Fab, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) fueron agregados al tubo y las células fueron incubadas a una temperatura de 4°C durante 25 minutos y se lavaron dos veces. Las células fueron entonces manchadas con estreptavidina, etiquetadas por ficoeritrina (BD Pharmingen, San Diego, CA).

Secreción de Citocina Las células objetivo K562 que expresan mesotelina o CD19 fueron lavadas y suspendidas a 106 células/mL en R10. Se agregaron cien mil unidades de cada tipo de células objetivo a cada uno de los 2 depósitos de la placa de fondo redondo de 96 depósitos (Corning). Los cultivos de célula T CAR efectoras fueron lavados y suspendidos a 106 células/mL en R10. Se combinaron cien mil células T efectoras con células objetivo en los depósitos indicados de la placa de 96 depósitos. Además, los depósitos que contienen las células T solas fueron preparados. Las placas fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante un período de 18 a 20 horas. Después de la incubación, se cosechó el sobrenadante y se sometió a un ensayo ELISA para IL2- e IFN-gamma utilizando los métodos estándar (Pierce, Rockford, IL).

Lisis Objetivo Específica Las células T CAR sometidas a electroporación de mARN fueron cocultivadas con diversas líneas celulares de cáncer y fueron analizadas mediante citometría de flujo para lisis objetivo específica.

Medición de Influjo de Calcio Las células T CAR sometidas a electroporación de mARN fueron cargadas con indo-1 y estimuladas con proteína de fusión de mesotelina-Fc. El influjo de calcio en las células se midió después de la estimulación observando la proporción de enlace a calcio libre.

Los resultados de los experimentos se describen ahora.

Resultados Las células T CD4" y CD8+ de donador humano fueron obtenidas y estimuladas con una combinación de lechos magnéticos cubiertos de anticuerpo aCD2(T11.1 y T11.2), aCD3 (OKT3), y/o aCD28 (9.3). Después de la estimulación, se evaluó la proliferación celular observando el número de célula absoluto y duplicando la población, mientras que la activación celular se evaluó midiendo el tamaño celular. La activación mediante las señales CD2/CD3 induce, de manera suficiente, la activación celular y la proliferación celular de las poblaciones de células T tanto CD4 como CD8 (Figura 2).

Las células T humanas fueron sometidas a electroporación con mARN para varias construcciones CAR, ya sea que contienen o no el dominio de señalización de CD2. Las células T sometidas a electroporación de mARN fueron cocultivadas durante 24 horas con células de tumor objetivo después de lo cual se midió la secreción de citocina. La secreción IL-2 e IFN-? se incrementó en SS1-CD2z, similar a aquella que se observó en SS1-28z. Sin embargo, la secreción IL-2 e IFN-Y resulta disminuida en SS1-28CD2z. De manera similar, el anti-CD 19-CD2z produce IL-2 e IFN-? similares, en comparación con anti-CD19-z y anti-CD19-28z, aunque la secreción IL-2 e IFN-? se disminuyó en CARs anti-CD 19-28CD2z (Figure 3). La observación de los dominios de señalización CD2 que permiten que las células T CAR se proliferen, mientras que se disminuye la secreción de citosina, puede ser importante en algunos casos terapéuticos. Por ejemplo, en un caso, un paciente con leucemia tratado con un CAR CD19 que contiene un dominio de señalización CD28 colapso debido a los niveles altos de citocinas (Brentjens y asociados, 2010, Mol Ther, 8(4): páginas 666 a 668). De manera similar, un paciente con cáncer de colon murió poco tiempo después de ser inyectado con células T CAR her2/neu que contenían un dominio de señalización CD28 (Morgan y asociados, 2010, Mol Ther, 18(4): páginas 843 a 851).

Para evaluar la habilidad para matar el tumor de los CARs que contienen la CD2, las células T sometidas a electroporación de mARN fueron cocultivadas con células de tumor objetivo en proporciones variables efector a objetivo. Después de 4 horas de cocultivo, los CARs anti-CD 19-CD2z, eliminaron de manera efectiva las células de tumor K562-CD19, mientras que los CARs SS1-CD2z CARs, eliminaron de manera eficiente las células de meso-tumor K562. Además, después de 18 horas de cocultivo, SS1-CD2z desplegó la muerte efectiva de las células de meso-tumor K562- (Figura 4).

Para las señales de calcio evaluadas, las células T sometidas a electroporación CAR de mARN, fueron cargadas con indicador de calcio lndo-1AM y estimuladas con proteína de fusión de mesotelina-Fc (30 segundos después del registro). La proporción de enlace a calcio libre se registró con el tiempo. La inclusión del dominio de señalización CD2 suprimió el flujo de calcio, como puede observarse mediante la reducción en el influjo de calcio en SS1-28CD2z, en comparación con SS1-28z (sin CD2) (Figura 5). Sin el deseo de limitarse a teoría alguna en particular, la observación de que la señalización CD2 suprime el flujo de calcio, probablemente está relacionada causalmente con la secreción de citocina disminuida. Esto puede ser importante en algunos casos terapéuticos. Por ejemplo, en un caso, un paciente con leucemia tratado con un CAR CD19 que contiene un dominio de señalización CD28, colapso debido a los niveles altos de citocinas (Brentjens y asociados, 2010, Mol Ther, 8(4): páginas 666 a 668). De manera similar, un paciente con cáncer de colon murió poco tiempo después de ser inyectado con células T CAR her2/neu que contenían un dominio de señalización CD28 (Morgan y asociados, 2010, Mol Ther, 18(4): páginas 843 a 851).

Los resultados presentados en la presente descripción muestran que los CARS CD2z que inducen la producción de citocina en equivalencia con CARs 28z, demuestran una ventaja de proliferación sobre los CARs de primera generación (z-solo) y exhiben una respuesta de flujo de calcio intermedia entre lo que se observó para 28z y BBz (figura 6).

En la presente descripción, se reporta que el uso del dominio de señalización CD2 en los CARs de segunda generación influye en la producción de IL-2 e IFN-? de las células T CAR y exhibe lisis celular objetivo similar. Estos resultados demuestran que CD2, puede ser utilizado en las moléculas CAR de segunda generación para alterar la producción de citocina de las células T CAR, en las direcciones tanto negativas como positivas y puede tener implicaciones para la sustentabilidad y efectividad de las células T CAR en microambientes de tumor in vivo, alterando la supervivencia de célula T CAR y los umbrales de muerte celular inducida por activación. Debido a la autoactivación alta del CAR SS-128z, SS1-CD2z puede ser un CAR más tolerable para el ataque de tumor de mesotelina in vivo, y puede disminuir la muerte celular inducida por activación.

Las descripciones de todas y cada una de las patentes, solicitudes de patente y publicaciones citadas en la presente invención, son incorporadas en su totalidad a la misma como referencia. Aunque la presente invención ha sido descrita haciendo referencia a las modalidades específicas, es evidente que otras modalidades y variaciones de la presente invención pueden ser consideradas por otros expertos en la materia sin alejarse de la verdadera esencia y alcance de la presente invención. Se debe interpretar que las reivindicaciones anexas incluyen todas dichas modalidades y variaciones equivalentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde la región de señalización coestimuladora comprende el dominio de señalización CD2.

2. La secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada además porque comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1.

3. La secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada además porque el dominio de enlace de antígeno es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

4. La secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada además porque el dominio de enlace de antígeno se enlaza a un antígeno de tumor.

5. La secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada además porque la región de señalización coestimuladora comprende adicionalmente el dominio intracelular de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza de manera específica con C083, y cualquier combinación de los mismos.

6. Un receptor de antígeno quimérico aislado (CAR), que comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde la región de señalización coestimuladora comprende el dominio de señalización CD2.

7. El CAR aislado de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado además porque el dominio de enlace de antígeno es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

8. El CAR aislado de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado además porque el dominio de enlace de antígeno se enlaza a un antígeno de tumor.

9. El CAR aislado de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado además porque la región de señalización coestimuladora comprende adicionalmente el dominio intracelular de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza de manera específica con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

10. Una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde el dominio de señalización coestimuladora comprende el dominio de señalización CD2.

11. La célula de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada además porque el ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1.

12. La célula de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada además porque el dominio de enlace de antígeno es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

13. La célula de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada además porque el dominio de enlace de antígeno se enlaza a un antígeno de tumor.

14. La célula de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada además porque la región de señalización coestimuladora comprende adicionalmente el dominio intracelular de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD- , ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza de manera específica con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

15. La célula de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada además porque la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula T, una célula asesina natural (NK), un linfocito T citotóxico (CTL), y una célula T reguladora.

16. La célula de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada además porque la célula exhibe una inmunidad antitumor cuando el dominio de enlace de antígeno enlaza con su antígeno correspondiente.

17. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde el dominio de señalización coestimuladora comprende la región de señalización CD2.

18. El vector de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado además porque la secuencia de ácido nucleico aislado que codifica el CAR comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1.

19. El vector de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado además porque el dominio de enlace de antígeno es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

20. El vector de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado además porque el dominio de enlace de antígeno se enlaza a un antígeno de tumor.

21. El vector de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado además porque la región de señalización coestimuladora comprende adicionalmente el dominio intracelular de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza de manera específica con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

22. Un método para estimular una respuesta inmune transmitida por célula T a una población celular objetivo o tejido en un mamífero, en donde el método comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva de una célula modificada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2 y un dominio de señalización CD3 zeta, y en donde el dominio de enlace de antígeno se selecciona para reconocer de manera específica la población de célula objetivo o tejido.

23. Un método para proporcionar una inmunidad antitumor en un mamífero, el método comprende la administración al mamífero de una cantidad efectiva de una célula modificada genéticamente para expresar un CAR, el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, y una señalización CD3 zeta, proporcionando de esta manera una inmunidad antitumor en el mamífero.

24. Un método para el tratamiento de un mamífero que tiene un padecimiento, trastorno o condición asociada con una expresión elevada de antígeno de tumor, el método comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una célula modificada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, y un dominio de señalización CD3 zeta, tratando de esta manera al mamífero.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado además porque la célula es una célula T autóloga.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado además porque el antígeno de tumor se selecciona del grupo que consiste en CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, Glicolípido F77, EGFRvIll, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, y cualquier combinación de los mismos.

27. Un método para el tratamiento de un humano con cáncer, el método comprende la administración al humano de una célula T diseñada para expresar un CAR, el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, y un dominio de señalización CD3 zeta.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado además porque el humano es resistente a por lo menos un agente quimioterapéutico.

29. Un método para generar una población persistente de células T diseñadas genéticamente en un humano diagnosticado con cáncer, el método comprende administrar al humano una célula T diseñada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno de dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, y un dominio de señalización CD3 zeta, en donde la población persistente de células T diseñadas genéticamente persiste en el humano durante el menos un mes después de la administración.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado además porque la población persistente de células T diseñadas genéticamente comprende por lo menos una célula seleccionada del grupo que consiste de una célula T que fue administrada al humano, una progenie de una célula T que fue administrada al humano y una combinación de las mismas.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado además porque la población persistente de células T diseñadas genéticamente comprende una célula T de memoria .

32. El método de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado además porque la población persistente de células T diseñadas genéticamente persiste en el humano durante por lo menos tres meses después de la administración.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado además porque la población persistente de células T diseñadas genéticamente, persiste en el humano durante por lo menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, dos años o tres años después de la administración .

34. El método de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado además porque se trata el cáncer.

35. Un método para expandir una población de células T diseñadas genéticamente en un humano diagnosticado con cáncer, el método comprende administrar al humano una célula T diseñada genéticamente para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de señalización coestimuladora que comprende el dominio de señalización CD2, en donde la célula T genéticamente diseñada administrada produce una población de progenie de células T en el humano.

36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizado además porque la progenie de células T en el humano comprende una célula T de memoria.

37. El método de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizado además porque la célula T es una célula T autóloga.

38. El método de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizado además porque la población de progenie de células T persiste en el humano durante por lo menos tres meses después de la administración.

39. El método de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizado además porque la población de progenie de células T persiste en el humano durante por lo menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, dos años o tres años después de la administración.

40. Un método para modular la cantidad de citocina secretada por una célula T, dicho método comprende el diseño genético de la célula T para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de dominio coestimulador que comprende CD2 y un dominio de señalización CD3 zeta.

41. El método de acuerdo con la reivindicación 40, caracterizado además porque la modulación de la cantidad de citocina secretada por una célula T reduce la proliferación de células T reguladoras.

42. Un método para reducir la cantidad de influjo de calcio inducido por activación en una célula T, dicho método comprende el diseño genético de la célula T para expresar un CAR, en donde el CAR comprende un dominio de enlace de antígeno, un dominio transmembrana, una región de dominio coestimulador que comprende CD2 y un dominio de señalización CD3 zeta.

43. El método de acuerdo con la reivindicación 42, caracterizado además porque la reducción de la cantidad de influjo de calcio inducida por activación en una célula T, evita la muerte celular inducida por activación de la célula T.