KR20170074243A - 변형된 t 세포의 생성 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20170074243A
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antigen
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tcr
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KR1020177014658A
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양빙 자오
샤오준 리우
칼 에이치. 준
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산, 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산, 친화성 분자 키메릭 수용체, 이중특이성 친화성 분자, 또는 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 갖는 변형된 세포의 생성을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 하나의 태양은 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함한다. 또한, 입양 요법 및 자가면역 질병과 같은 병증을 치료하기 위한 상기 변형된 T 세포를 포함하는 방법 및 약학 조성물을 포함한다.

Description

변형된 T 세포의 생성 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFIED T CELLS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에서 모두 2014년 10월 31일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제 62/073,144 호, 제 62/073,343 호, 제 62/073,467 호, 제 62/073,540 호 및 제 62/073,681 호에 대한 우선권의 권리가 있으며, 이들은 내용 전체가 본 발명에서 참고로 인용된다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원에 의해 부여된 CA120409 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
키메릭 항원 수용체(CAR) 변형된 T 세포를 사용하는 입양 세포 전달 요법(ACT)은 암 치료에 유망한 전략인 것으로 나타났다(Louis et al., 2011, Blood 118:6050-6056; Kochenderfer et al., 2010, Blood 116:3875-3886 and Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-733).
렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하는 통합 관련된 안전성 우려는 ACT에 사용되는 세포의 변형에 주요 관심사이다. 표적-상 또는 표적-외 불필요한 부작용, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 또는 CAR RNA 전기천공 (electroporation)에 의한 T 세포의 RNA 형질감염 (transfection)을 피하기 위한 일부 진보가 이루어지고 있는 중이다(Zhao, 2006, Mol Ther 13:151-159; Mitchell et al., Smits et al., 2004, Leukemia 18:1898-1902). 상기와 같은 방법은 RNA 및 T 세포 모두의 투여량을 최소화시킴으로써, 다수 유전자의 도입을 효율적으로 허용한다. 그러나, CAR의 일시 발현에 대한 주된 제약은 RNA 형질감염된 T 세포의 최적에 못 미치는 효과기 활성 및 기능성이다. 다수의 T 세포 주입 및/또는 저용량 화학요법의 유의수준의 사용이 기능을 개선시키기 위해 사용되어 왔다(Barrett et al., 2013, Hum Gene Ther 24(8):717-27).
복합 요법 및 추가적인 치료를 피하면서 효과기 활성 및 기능성을 개선시키기 위한 다양한 시도들이 수행되었다. 형질감염 과정 동안 RNA의 증가는 특히 생체내 항-종양 활성에 있어서 T 세포 기능에 부정적인 영향을 미쳤다(Barrett et al., 2011, Hum Gene Ther 22:1575-1586). 추가로, 항-CD3 항원 항체 단편을 항-종양 항원 항체 단편에 융합시키는 대안의 구조물이 암 치료를 위한 임상 시험에서 또한 시험되었다(Bargou et al., 2008, Science 321:974-977; Klinger et al., 2012, Blood 119:6226-6233). 불행하게도, 상기 구조물은 짧은 반감기, 표적 세포 부위에의 불충분한 접근성, 및 적절한 장기적인 신호전달 기능의 결여에 의해 기능성이 심하게 제한되었다.
따라서, T 세포 기반 입양 면역요법을 위해 생체내에서 최대의 효과기 활성 및 기능성을 갖는 T 세포를 생성시키면서, T 세포를 변형시키는 보다 안전한 방법이 필요하다.
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 본 발명은 T 세포의 변형을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 외인성 핵산 및 이중특이성 항체를 암호화하는 전기천공된 (electroporated) RNA를 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 T 세포의 표면상에 상기 TCR 및 이중특이성 항체를 발현한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 T 세포에 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산 및 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산을 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함하며, 여기에서 상기 전기천공된 T 세포는 상기 TCR 및 이중특이성 항체를 발현할 수 있다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에서의 본 명세서에 기재된 T 세포의 용도를 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA 및 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA로의 전기천공을 포함하는 변형된 T 세포의 유효량을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응의 자극 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 상기 변형된 TCR 및 이중특이성 항체를 발현한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법 (adoptive cell transfer therapy)이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 (adverse to) 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는 상기 입양 세포 전달 요법 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA 및 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 증진된 면역 (enhanced immunity)과 관련된 질병 또는 병증의 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 상기 질병 또는 병증의 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA 및 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다.
여전히 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 제1항의 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 명세서에 묘사된 발명의 상기 태양 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 상기 TCR은 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 적어도 하나의 쥐 (murine) 불변 영역을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 TCR은 야생형 TCR보다 표적 세포 항원에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 TCR은 TCR 알파 및 베타 쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 상기 쇄 중 적어도 하나의 쇄의 C' 말단에 보조-자극 (co-stimulatory) 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB 보조-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 베타 쇄는 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 알파 쇄는 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 이중특이성 항원 결합 도메인을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항원 결합 도메인은 제1 및 제2 단쇄 가변 단편(scFv) 분자를 포함한다, 예를 들어 상기 제1 scFv 분자는 표적 세포상의 적어도 하나의 항원에 특이적이고 상기 제2 scFv 분자는 활성화 T 세포상의 항원에 특이적이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 활성화 T 세포 항원은 CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, TCR, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 T 세포는 보조자극 분자를 암호화하는 전기천공된 핵산을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포는 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단, 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 보조-자극 분자는 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 CD3를 암호화하는 RNA를 상기 T 세포에 전기천공시킴을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 CD3 RNA를 상기 TCR 핵산과 동시-전기천공시킨다.
또 다른 실시태양에서, 상기 핵산은 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 TCR을 암호화하는 핵산은 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 암호화하는 핵산을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 핵산을 도입시키는 단계는 상기 TCR 알파쇄를 암호화하는 RNA 및 상기 TCR 베타쇄를 암호화하는 별도의 RNA를 동시-전기천공시킴을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 T 세포를 증대시킴 (expanding)을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고 상기 전기천공된 T 세포, 예를 들어 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 막 단백질을 배양시킴을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 T 세포를 냉동보존 (cryopreserving)함을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 핵산을 상기 T 세포에 도입시키기 전에 상기 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 TCR 핵산을 도입시킨 후에 상기 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 이중특이성 항체를 막 단백질로서 발현시킴을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 이중특이성 항체 도입된 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 표적 세포 또는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 유도된 용해는 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 자가면역 질병, 예를 들어 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 자가면역 질병이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암 (cervical cancer), 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 암이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원 및 상기 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산 및 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 이중특이성 항체 및 CLEAR을 발현한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 기재된 T 세포의 용도를 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산 및 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산을 T 세포에 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 이중특이성 항체 및 CLEAR을 발현할 수 있다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산 및 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 상기 CLEAR에 대한 이중특이성을 갖는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포의 유효량을 투여함을 포함하며, 여기에서 변형된 T 세포는 CLEAR 및 이중특이성 항체를 발현하고, 상기 피험자에서 상기 표적 세포 또는 조직에 대한 T-세포 매개된 면역 반응을 자극하는 방법을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는 입양 세포 전달 요법 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산 및 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 상기 CLEAR에 대한 이중특이성을 갖는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하는 상기 피험자의 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산 및 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 상기 CLEAR에 대한 이중특이성을 갖는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 명세서에 묘사된 발명의 상기 태양 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 상기 CLEAR은 세포내 활성화 도메인 및 세포외 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포내 활성화 도메인은 CD3 제타의 세포내 활성화 도메인의 일부를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 항체의 항원 결합 도메인, 수용체의 리간드 결합 도메인, 항원, 및 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 CD27, CD28, CD70, CD80, PD1, 및 PD-L1로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 종양 항원에 결합할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 CLEAR은 보조-자극 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 보조-자극 도메인은 CD4, CD8 및 4-1BB로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 이중특이성 항원 결합 도메인을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항원 결합 도메인은 제1 및 제2 단쇄 가변 단편(scFv) 분자를 포함한다, 예를 들어 상기 제1 scFv 분자는 표적 세포상의 적어도 하나의 항원에 특이적이고 상기 제2 scFv 분자는 T 세포상의 항원에 특이적이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 상기 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 CLEAR에 대한 이중특이성을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 T 세포는 보조자극 분자, 예를 들어 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 보조-자극 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 핵산 중 적어도 하나를, 상기 T 세포의 형질도입 (transduction), 상기 T 세포의 형질감염, 및 상기 T 세포의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 도입시킨다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 핵산 중 적어도 하나는 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 T 세포를 증대시킴을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 키메릭 막 단백질, 예를 들어 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고, 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 핵산을 상기 T 세포에 도입시키기 전에 상기 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 CLEAR 핵산을 도입시킨 후에 상기 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 막 단백질로서 이중특이성 항체를 발현시킴을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 이중특이성 항체 도입된 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 표적 세포 또는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 유도된 용해는 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 자가면역 질병, 예를 들어 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 자가면역 질병이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 암이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 발현한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 세포를 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 세포는 상기 이중특이성 친화성 분자를 발현한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 T 세포의 집단에 도입시킴을 포함하는, 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 발현할 수 있다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 세포의 집단에 도입시킴을 포함하는 변형된 세포의 생성 방법을 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 세포는 상기 이중특이성 친화성 분자를 발현한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포 또는 본 명세서에 기재된 변형된 세포의 용도를 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는 입양 세포 전달 요법 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는 입양 세포 전달 요법 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 세포는 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료가 필요한 피험자에게 변형된 세포의 집단을 투여함을 포함하는 상기 피험자의 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 세포는 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포 또는 본 명세서에 기재된 변형된 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 변형된 T 세포를 투여함을 포함하는 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극하는 방법을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 변형된 세포를 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응의 자극 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 세포는 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포 또는 본 명세서에 기재된 변형된 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포 또는 본 명세서에 기재된 변형된 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 명세서에서 묘사된 발명의 상기 태양 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 상기 소분자 세포외 도메인은 디설파이드 가교가 없는 나선 구조를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 소분자 세포외 도메인은 약 10 kDa 미만이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 보조-자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB 보조-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 막관통 도메인, 예를 들어 CD8 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 TCR 가변 도메인, 및 TCR 불변 도메인을 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 T 세포는 보조자극 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하며, 예를 들어 보조-자극 분자는 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 상기 CD3은 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄, 예를 들어 CD3 제타 및 CD3 입실론 쇄를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인은 상기 소분자 항원 결합 도메인, 및 항체의 항원 결합 도메인으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인은 상기 소분자 항원 결합 도메인, 및 항체의 항원 결합 도메인으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 소분자 항원 결합 도메인은 디설파이드 가교가 없는 나선 구조를 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 소분자 항원 결합 도메인은 각각 약 10 kDa 미만이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 종양 관련 항원(TAA), 세균 항원, 기생충 항원, 바이러스 항원 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 활성화 T 세포 항원은 CD3, CD4, CD8, T 세포 수용체(TCR), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 보조-자극 분자이다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 T 세포를 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료 방법에 사용한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 세포를 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료 방법에 사용한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 핵산을 T 세포 집단의 형질도입, T 세포 집단의 형질감염, 및 T 세포 집단의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 도입시킨다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 핵산의 도입은 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 RNA를 전기천공시킴을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 핵산을 세포의 형질도입, 세포의 형질감염, 및 세포의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 도입시킨다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 핵산의 도입은 상기 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 RNA를 전기천공시킴을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 세포는 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 및 항원 제시 세포로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포를 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단, 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 CD3을 암호화하는 RNA를 상기 T 세포에 전기천공시킴을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 CD3 RNA를 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산과 동시-전기천공시킨다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 친화성 분자 키메릭 수용체 핵산을 도입시킨 후에 상기 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 친화성 분자 키메릭 수용체 핵산을 상기 T 세포에 도입시키기 전에 상기 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 T 세포를 증대시킴을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고(예를 들어 키메릭 막 단백질은 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다), 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 활성화 T 세포 및 상기 표적 세포를 상기 이중특이성 친화성 분자와 결합시킴을 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 자가면역 질병, 예를 들어 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 자가면역 질병이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 암이다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 표적 세포 또는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 유도된 용해는 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 이중특이성 T-세포 인게이저(engager) (BiTE) 분자를 암호화하는 전기천공된 RNA를 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 BiTE 분자는 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 T 세포 집단을 증대시키고 상기 증대된 T 세포를 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA로 전기천공시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함하며, 여기에서 상기 전기천공된 T 세포는 상기 이중특이성 항체를 발현할 수 있다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 전기천공된 RNA를 포함하는 변형된 T 세포의 유효량을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극하는 방법을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는 입양 세포 전달 요법 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 증대되었고 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하는 상기 피험자의 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 증대되었고 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제145항의 변형된 T 세포의 용도를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 명세서에 묘사된 발명의 상기 태양 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 이중특이성 항원 결합 도메인을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항원 결합 도메인은 제1 및 제2 단쇄 가변 단편(scFv) 분자를 포함한다, 예를 들어 상기 제1 scFv 분자는 표적 세포상의 적어도 하나의 항원에 특이적이고 상기 제2 scFv 분자는 T 세포상의 항원에 특이적이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포는 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단, 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 RNA는 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 키메릭 막 단백질(예를 들어 키메릭 막 단백질은 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다)을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 증대된 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA로 전기천공시키기 위해서 상기 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 막 단백질로서 상기 이중특이성 항체를 발현시킴을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 이중특이성 항체 전기천공된 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 표적 세포 또는 상기 표적 세포를 포함하는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 유도된 용해는 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 자가면역 질병, 예를 들어 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 자가면역 질병이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 암이다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 외인성 핵산; 및 보조자극 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 TCR 및 상기 보조-자극 분자를 발현한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 T 세포에 도입시키고, 보조-자극 분자를 암호화하는 핵산을 상기 T 세포에 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 TCR 및 상기 보조-자극 분자를 발현할 수 있다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제173항의 변형된 T 세포의 용도를 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 변형된 T 세포를 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T-세포 매개된 면역 반응을 자극하는 방법을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 증대되었고 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는 입양 세포 전달 요법 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 증대되었고 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하는 상기 피험자의 치료 방법을 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포는 증대되었고 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 명세서에 묘사된 발명의 상기 태양 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 상기 TCR은 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 적어도 하나의 쥐 불변 영역을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 TCR은 야생형 TCR보다 표적 세포 항원에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 TCR은 TCR 알파 및 베타 쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 상기 쇄 중 적어도 하나의 쇄의 C' 말단에 보조-자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB 보조-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 베타 쇄는 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 알파 쇄는 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 보조자극 분자를 암호화하는 핵산을 상기 T 세포내에 전기천공시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 보조-자극 분자는 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 상기 CD3은 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 상이한 CD3 쇄는 CD3 제타 및 입실론 쇄이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 핵산 중 적어도 하나를, 상기 T 세포의 형질도입, 상기 T 세포의 형질감염, 및 상기 T 세포의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 도입시킨다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 핵산 중 적어도 하나는 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포를 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 T 세포를 증대시킴을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 증대는 상기 T 세포를 키메릭 막 단백질(예를 들어 키메릭 막 단백질은 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다)을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고, 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 TCR을 암호화하는 핵산을 상기 T 세포에 도입시키기 전에 상기 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 TCR 핵산을 도입시킨 후에 상기 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 TCR을 암호화하는 핵산은 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 암호화하는 핵산을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 핵산의 도입은 상기 TCR 알파쇄를 암호화하는 RNA 및 상기 TCR 베타쇄를 암호화하는 별도의 RNA를 동시-전기천공시킴을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 보조-자극 분자를 암호화하는 핵산의 도입은 CD3을 암호화하는 RNA를 상기 T 세포에 전기천공시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 CDR3 RNA를 상기 TCR 핵산과 동시-전기천공시킨다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 표적 세포 또는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 유도된 용해는 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 자가면역 질병, 예를 들어 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 자가면역 질병이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 암이다.
본 발명의 바람직한 실시태양의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독시 보다 양호하게 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위해서, 현재 바람직한 도면 실시태양에 나타낸다. 그러나, 본 발명이 도면에 나타낸 실시태양들의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않음은 물론이다.
도 1은 TCR 및 BiTE로 동시-전기천공된 T 세포에서의 트랜스유전자 발현을 나타내는 그래프 패널이다. T 세포를 CD19.CD3(상부 패널) 또는 4D5.CD3(ErbB2)(중간 패널) BiTE로, CD3제타 및 입실론의 존재 또는 부재하에서 동시-전기천공시켰다. 전기천공 후 18시간 째에, T 세포를 TCR vb13.1 및 mIgG Fab(또는 Her2-Fc)에 대해 염색하였다. 하부 패널은 전기천공 후 3일째에 TCR(vb13.1) 발현을 나타낸다.
도 2는 종양으로 자극된 T 세포에서 상향-조절된 CD107a를 나타내는 그래프 패널이다. T 세포를 나타낸 바와 같이 RNA로 동시-전기천공시키고 CD19 및 NY-ESO-1(ESO)에 대해 단일 또는 이중 양성을 갖는 종양 세포주로 자극하였다. CD107a 상향-조절을 4시간 후에 평가하였다.
도 3은 종양으로 자극된 T 세포에서 상향-조절된 CD107a를 나타내는 그래프 패널이다. T 세포를 나타낸 바와 같이 RNA로 동시-전기천공시키고 CD19 및 NY-ESO-1(ESO)에 대해 단일 또는 이중 양성을 갖는 종양 세포주로 자극하였다. CD107a 상향-조절을 4시간 후에 평가하였다.
도 4는 종양 세포주로 자극된 RNA 전기천공된 T 세포에서 IFN-감마 생성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 종양 세포주로 자극된 RNA 전기천공된 T 세포에서 IL-2 생성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 NY-ESO-1 TCR(1G4) 및 메소텔린 BiTE(ss1.CD3)를 발현하고 종양 세포에 의해 자극된 T 세포에서 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다.
도 7은 Nam16-ESO-CBG 세포(2x106 세포)가 정맥내 주사된 마우스에서 종양 성장을 나타내는 상들의 패널이다. 종양 세포 주사 후 5일째에, 마우스를 지시된 바와 같이(5 마우스/그룹) RNA 전기천공된 T 세포로 처리하였다. 종양 성장을 생물발광 영상화로 영상화하였다.
도 8은 증진된 T 세포 기능을 갖는 종양-관련 항원을 표적화하는 이중특이성 RNA를 발현하는 T 세포를 나타내는 그래프이다.
도 9는 T 세포에서 이중특이성 항체를 병용함으로써 HLA 제한 없이 동족 및 MHC/펩티드 및 표면 종양 항원을 모두 인식하는 T 세포상의 TCR을 나타내는 그래프 패널이다.
도 10(도 10A 및 10B 포함)은 T 세포내로 전기천공된 이중특이성 항체 RNA 및 TCR RNA의 구조물 목록을 나타낸다.
도 11은 변형된 NY-ESO-1 TCR 및 이중특이성 항체에 의해 동족 항원(HLA-A2/NY-ESO-1) 및 CD19 또는 Her2 모두를 인식한 T 세포를 나타내는 그래프 패널이다.
도 12는 T 세포 및 표적 종양 세포와 동일한 표적 종양 세포에 관여 (engagement)하는 또 다른 T 세포상의 이중특이성 항체간의 증진된 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)의 관여를 예시하는 다이어그램이다.
도 13(도 13A 및 13B 포함)은 본 발명에서 생성된 CLEAR 및 이중특이성 항체의 구조물 목록이다.
도 14는 CD27-BBZ 또는 CD27-Z CLEAR RNA로 전기천공(상부 패널) 및 세포주에서 CD70 발현(하부 패널) 후 18시간째에 T 세포 또는 K562 세포에서 CD27 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 15는 CD70 양성 종양 세포주로 자극된 CD27 CLEAR RNA 전기천공된 T 세포에서 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다.
도 16은 PD1 CLEAR RNA 전기천공된 T 세포(상부 패널)에서 PD1 발현 및 PD-L1 양성 종양 세포, Nalm6-PD-L1으로 자극 후 T 세포에서 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다.
도 17은 PD-L1 양성 종양 세포, Nalm6-PD-L1으로 자극된 PD1 CLEAR RNA 전기천공된 T 세포에서 시토카인 생성을 나타내는 그래프이다.
도 18은 PD1-Z 및 aPD-ameso 이중-특이성 항체 RNA로 동시-전기천공된 T 세포에서 트랜스유전자 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 19는 MESO 양성 종양 세포(K562-meso, SK-OV3 및 PC3), 또는 MESO/PD-L1 이중 양성 종양 세포(PC3-PDL1)로 자극된 PD1-Z 및 aPD-ameso 이중-특이성 항체 RNA로 동시-전기천공된 T 세포에서 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다.
도 20은 MESO 양성 종양 세포(K562-meso 및 SK-OV3)로 자극된 PD1-Z 및 aPD-ameso 이중-특이성 항체 RNA로 동시-전기천공된 T 세포의 시토카인 생성을 나타내는 그래프 패널이다.
도 21은 CD27-Z 및 aCD27-aErbB2 이중-특이성 RNA(상부 패널) 또는 CD19 이중-특이성 항체 RNA(하부 패널)로 동시-전기천공된 T 세포에서 트랜스유전자 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 22는 CD70 및/또는 ErbB2를 발현하는 종양 세포주로 자극된 CD27-Z 및 aCD27-aErbB2 이중-특이성 항체 RNA로 동시-전기천공된 T 세포의 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다.
도 23은 CD70 및/또는 CD19를 발현하는 종양 세포주로 자극된 CD27-Z 및 aCD27-aCD19 이중-특이성 항체 RNA로 동시-전기천공된 T 세포의 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다.
도 24는 지시하는 바와 같은, PD1-Z 및 항-PD1/항-ErbB2 이중-특이성 항체에 대한 RNA로 전기천공된 T 세포를 나타내는 그래프 패널이다. 18시간 후에, 상기 전기천공된 T 세포를 항-PD1 및 항-mIgG Fab로 염색하였다.
도 25는 종양 세포주(상부 패널) 및 ErbB2 또는 Pd-L1 RNA 전기천공된 K562 세포(하부 패널, 전기천공 후 18시간째)를 나타내는 그래프 패널이다. 세포를 PD-L1 및 ErbB2 발현에 대해 염색하였다.
도 26은 4시간 동안 종양 세포주로 자극된 전기천공된 T 세포를 나타내는 그래프 패널이다. CD107a 상향-조절을 유식 세포측정에 의해 검출하였다.
도 27은 4시간 동안 종양 세포주로 자극된 전기천공된 T 세포를 나타내는 그래프 패널이다. CD107a 상향-조절을 유식 세포측정에 의해 검출하였다.
도 28은 친화성 항체 유사물질 구조물의 예시를 나타내는 상이다.
도 29는 항-His 항체에 의한 염색에 의해 친화성 항체 유사물질 재지시된 T 세포(ART)의 발현을 나타내는 그래프 패널이다. EGFR(955.BBZ, 1853.BBZ 또는 1970.BBZ) 또는 ErbB2 (342.BBZ, 432-15.BBZ, 342-14.BBZ 또는 342-4.BBZ)에 대한 ART를 암호화하는 RNA 10 마이크로그램을 T 세포에 전기천공시키고 R10에서 밤새 배양하였다. 100 마이크로리터의 전기천공된 T 세포를 ART 발현의 유식 세포측정 검출을 위해 항-His 태그 항체에 의해 염색하였으며(하부 패널) 상기 ART RNA 모두로 전기천공된 T 세포는, 전기천공되지 않은(No EP) T 세포에 비해, 양으로 염색되는 것으로 나타났다.
도 30은 EGFR 및 ErbB2 ART의 특이적인 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다. 도 29에 나타낸 바와 같이 전기천공된 T 세포를, 각각의 종양 명칭 아래에 나타낸 바와 같은, EGFR 및/또는 ErbB2를 발현하는 4개의 상이한 종양 세포주로 자극하였다. 4시간 인큐베이션 후에, CD107a 상향조절을, 상기 세포를 CD107a-PE, CD3-APC 및 CD8-FITC로 염색하여 측정하였다. 도 29에 나타낸 바와 같이, 상기 EGFR ART는 모두 EGFR 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MDA468)에 대해 유일하게 강하게 반응성이나, EGFR 음성 종양 MCF7에 대해서는 그렇지 않았다. 모든 ErbB2 ART가 ErbB2 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MCF7)에 대해 강하게 반응성이나, ErbB2 음성 종양 MDA468에 대해서는 그렇지 않았다. 4D5.BBZ 및 2224.BBZ는 각각 ErbB2 및 EGFR에 대한 CAR이었다.
도 31은 EGFR 및 ErbB2 ART의 특이적인 IFN-감마 생성을 나타내는 그래프이다. 도 29에 나타낸 바와 같이 전기천공된 T 세포를, 각각의 종양 명칭 아래에 나타낸 바와 같은, EGFR 및/또는 ErbB2를 발현하는 4개의 상이한 종양 세포주로 자극하였다. 밤새 인큐베이션 후에, 상등액을 사용하여 ELISA에 의해 INF-감마 생성을 측정하였다. 도면에 나타낸 바와 같이, IFN-감마는 EGFR 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MDA468)에 의해 자극된 모든 EGFR ART에 대해서 상이한 수준으로 검출될 수 있었지만, EGFR 음성 종양 MCF7에 대해서는 그렇지 않았다. 모든 ErbB2 ART가 ErbB2 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MCF7)에 대해 강하게 반응성이나, ErbB2 음성 종양 MDA468에 대해서는 그렇지 않았다. 4D5.BBZ 및 2224.BBZ는 각각 ErbB2 및 EGFR에 대한 CAR이었다.
도 32는 EGFR 및 ErbB2 ART의 특이적인 IL-2 생성을 나타내는 그래프이다. 도 29에 나타낸 바와 같이 전기천공된 T 세포를, 각각의 종양 명칭 아래에 나타낸 바와 같은, EGFR 및/또는 ErbB2를 발현하는 4개의 상이한 종양 세포주로 자극하였다. 밤새 인큐베이션 후에, 상등액을 사용하여 ELISA에 의해 IL-2 생성을 측정하였다. 도면에 나타낸 바와 같이, IL-2는 EGFR 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MDA468)에 의해 자극된 모든 EGFR ART에 대해서 상이한 수준으로 검출될 수 있었지만, EGFR 음성 종양 MCF7에 대해서는 그렇지 않았다. 모든 ErbB2 ART가 ErbB2 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MCF7)에 대해 강하게 반응성이나, ErbB2 음성 종양 MDA468에 대해서는 그렇지 않았다. 4D5.BBZ 및 2224.BBZ는 각각 ErbB2 및 EGFR에 대한 CAR이었다.
도 33은 EGFR 및 ErbB2 ART의 특이적인 용해 활성을 나타내는 그래프이다. 2개의 EGFR 및 2개의 ErbB2 ART의 살해 능력을 시험하기 위한 별도의 실험에서, EGFR 및 ErbB2 모두에 대해 양성인 종양 세포주 SK-OV3에 대해 이들의 관련된 CAR들을 비교하였다. 도면에 나타낸 바와 같이, ART T 세포는 상기 종양 세포를 관련된 CAR T 세포만큼 효율적으로 살해하였다.
도 34(도 34A-34C 포함)는 친화성 항체 유사물질 변형된 TCR을 나타내는 상들의 패널이다. 도 34A는 친화성 항체 유사물질 및 His-태그 서열을 TCR의 알파 또는 베타 쇄의 N'에 부가함에 의한 친화성 항체 유사물질 변형된 TCR(Affi-TCR)의 도식적 스케치이다. 도 34B는 친화성 항체 유사물질 재지시된 TCR(Affi-TCR) RNA 전기천공된 T 세포의 Vb13.1 TCR 및 His-태그 검출을 나타내는 그래프 패널이다. T 세포를 NY-ESO-1(1G4) TCR 알파(a) 및 베타(b), 또는 이들의 ErbB2 친화성 항체 유사물질(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형으로 동시-전기천공시켰다. 밤새 후에, vb13.1 및 His-태그를 유식 세포측정에 의해 검출하였다. 도 34C는 ErbB2 친화성 항체 유사물질 서열을 나타낸다.
도 35는 Affi-TCR RNA 전기천공된 T 세포의 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다. CD107a 분석을 위해서, T 세포를 도 34B에서 지시하는 바와 같이 TCR 알파(a) 또는 베타(b), 또는 이들의 ErbB2 친화성 항체 유사물질(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형으로 동시-전기천공시키고 종양 세포주 Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-), A549-ESO (NY-eso-1+, ErbB2+), SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+), A549 (NY-eso-1-, ErbB2+), 또는 Nalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-)로 자극하였다. 결과는 ErbB2 Affi-TCR을 갖는 T 세포가 Ny-ESO-1 및 ErbB2 양성 종양 모두를 특이적으로 인식할 수 있었음을 나타낸다.
도 36(도 36A-36C 포함)은 친화성 항체 유사물질 변형된 CD3 입실론을 나타내는 상들의 패널이다. 도 36A는 친화성 항체 유사물질 및 G4S 링커를 어느 한 CD3 입실론의 N'에 부가함에 의한 친화성 항체 유사물질 변형된 CD3 입실론의 도식적 스케치이다. 도 36B는 T 세포의 전기천공을 나타내는 표이다. T 세포를 NY-ESO-1(1G4) TCR 알파(a) 및 베타(b), 또는 ErbB2 친화성 항체 유사물질(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형된 CD3 입실론(e)과 함께 동시-전기천공시켰다. 도 36C는 TCR 발현의 유지 및 친화성 항체 유사물질 변형된 CD3 입실론의 동시-전달에 의한 이중 표적화를 나타내는 그래프 패널이다. 도 36B의 T 세포의 밤새 후에, vb13.1 발현을 유식 세포측정에 의해 검출하였다.
도 37은 Affi-TCR RNA 전기천공된 T 세포의 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다. CD107a 분석을 위해서, T 세포를 도 36B에서 지시하는 바와 같이 NY-ESO-1-(1G4) TCR 알파(a) 및 베타(b), 또는 ErbB2 친화성 항체 유사물질(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형된 CD3 입실론(e)과 함께 동시-전기천공시키고 종양 세포주 Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-), Nalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-), SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+) 또는 MDA231 (NY-eso-1-, ErbB2+)로 자극하였다.
도 38(도 38A-38C 포함)은 이중-특이성 항체가 T 세포내로 전기천공된 이중특이성 항체(Bis-RNA)를 암호화하는 RNA에 의해 분비될 수 있음을 설명한다. T 세포를 CD19 CAR(CAR RNA), 블리나투모맵 Bis-RNA(Bis-RNA), GFP를 암호화하는 RNA로 전기천공시키거나 또는 CD19 CAR 및 블리나투모맵 Bis-RNA(CAR RNA/Bis-RNA) 모두로 동시-전기천공시켰다. 전기천공 후 18시간째에, 상기 T 세포를 염소 항-마우스 IgG Fab(mIgG Fab)로 염색하여 상기 T 세포상에서 발현된 CD19 CAR 또는 CD3에의 결합을 통해 상기 T 세포 표면상에 관여된 이중-특이성 항체를 검출하였다(도 38A, 상부 패널은 상기 전기천공된 T 세포의 mIgG Fab 염색 및 GFP 발현을 모두 나타낸다). 전기천공 직후에, CAR RNA 또는 Bis-RNA를 갖는 상기 T 세포의 분액들을 같은 수의 GFP RNA T 세포와 혼합하고 18시간 동안 동시-배양하였다. 이어서 mIgG Fab 및 GFP(도 38A, 중간 패널)를 평가하였다. 전기천공 후 18시간째에, CAR RNA 또는 Bis-RNA를 갖는 상기 T 세포의 분액들을 같은 수의 GFP RNA T 세포와 혼합하고 mIgG Fab 및 GFP(도 38A, 하부 패널)의 검출을 위해 염색을 수행하였다. 전기천공 후 18시간째에, 상이한 RNA로 전기천공된 T 세포, 또는 CAR RNA 또는 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 18h(GFP T, 18h) 또는 0h(GFP T, 0h) 동안 GFP RNA 전기천공된 T 세포와 혼합하고 이어서 CD19 음성인 K562 세포 또는 CD19(Nalm6, K562-CD19 및 라지(Raji))를 발현하는 세포주로 자극하였다. 이어서 상기 혼합물들을 CD107a 염색에 대해 평가하였다(도 38B). 전기천공 후 18시간째에, CD19 CAR RNA(CAR RNA) 또는 Bis-RNA 단독으로 전기천공된 T 세포 또는 같은 수의 GFP RNA 전기천공된 T 세포(GFP-T)와 혼합된 T 세포를 5:1의 효과기:표적 비로 4시간 플로우 기반 세포독성 T 림프구 분석 후에 용해 활성에 대해 분석하였다(도 38C).
도 39(도 39A-39D 포함)는 T 세포 활성화의 증가 및 Bis-RNA 전기천공된 T 세포의 종양 살해 능력을 강조한다. T 세포를 지시된 바와 같은 상이한 양(㎍ RNA/0.1 ㎖ T 세포)의 블리나투모맵 Bis-RNA(Bis-RNA) 또는 CD19 CAR RNA(CAR RNA)로 전기천공시켰다. 전기천공 후 18시간째에, 상기 Bis-RNA 또는 CAR RNA를 갖는 T 세포를 같은 수의 GFP RNA 전기천공된 T 세포(GFP-T)의 첨가와 함께 또는 상기 첨가 없이 CD19 양성 세포주로 자극하고 CD107a 발현에 대해 평가하였다(도 39A). 상술한 T 세포의 전기천공 후 18시간째에, 상기 전기천공된 T 세포에 IFN-감마 및 그랜자임 B의 세포내 염색을 가하였다(도 39B). IFN-감마에 대한 ELISA를, CD19 양성 세포(Nalm6, K562-CD19 및 라지) 또는 CD19 음성(K562) 세포주로 상기 T 세포를 밤새 자극 후에 수행하였다(도 39C). T 세포를 블리나투모맵 Bis-RNA(Bis-RNA) 또는 CD19bbz CAR RNA(1, 5 또는 10 ㎍/0.1 ㎖ T 세포의 RNA 용량의 CAR RNA)로 전기천공시키거나, 또는 5 ㎍의 각각의 Bis-RNA 및 CAR RNA(Bis-RNA + CAR RNA)로 동시-전기천공시켰다. 전기천공 후 18시간째에, 용해 활성을 지시된 효과기:표적 비에서 4시간 플로우 기반 세포독성 T 림프구 분석으로 평가하였다(도 39D).
도 40(도 40A-40D 포함)은 Bis-RNA 전기천공된 T 세포의 연장된 종양 반응성 및 CAR RNA T 세포 및 Bis-RNA T 세포의 민감성을 설명한다. T 세포를 1, 5 및 10 ㎍/0.1 ㎖ T 세포의 상이한 양의 블리마투모맵 Bis-RNA로 전기천공시키고 10 ㎍의 RNA 용량에서 CD19BBZ CAR RNA로 전기천공시킨 T 세포와 비교하였다. CD107a 염색을 전기천공 후 상이한 날들에 수행하고 결과를 3, 8 및 12일째에 CD107a/CD8 발현(도 40A), 평균 형광 강도(MFI) 값(도 40B, 상부 패널), 또는 전기천공 후 날들에 CD107a 발현 세포의 비율(도 40B, 하부 패널)에 대한 점 플롯으로서 플롯팅하였다. 5 또는 10 ㎍의 CD19BBZ(19BBZ) 또는 블리나투모맵(Blina) RNA로 전기천공된 T 세포를 K562 세포로 자극하고 감소하는 양의 CD19 mRNA로 전기천공시켰다. 상기 세포들을 18시간 동안 동시-배양하고 상등액에 IFN-감마 ELISA를 수행하였다(도 40C). 10 ㎍ 4D5BBZ 또는 4D5-CD3 RNA로 전기천공된 T 세포를 K562 세포로 자극하고 감소하는 양의 ErbB2(Her2) mRNA로 전기천공시켰다. 상기 세포들을 18시간 동안 동시-배양하고 상등액에 IFN-감마 ELISA를 수행하였다(도 40D).
도 41(도 41A-41D 포함)은 보조-자극 및 증진된 분열 및 증식에 대한 Bis-RNA 전기천공된 T 세포 감소된 의존성을 강조한다. CFSE 표지된 휴지 CD4+ T 세포를 상이한 RNA 용량에서 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ RNA(CAR RNA)로 전기천공시키고 조사된 K562-CD19 세포(K562-CD86 세포에 대한 대조군으로서 동등한 수의 조사된 K562 세포와 혼합된) 또는 조사된 K562-CD19 세포(동등한 수의 조사된 K562-CD86 세포와 혼합된)로 자극하였다. 6일째의 CFSE 염색(도 41A) 및 자극 후 상이한 날들에 T 세포의 수(도 41B)를 모니터하였다. CFSE 표지된 CD45RO+(기억 세포) 또는 CD45RO-(나이브 세포) 휴지 CD4 T 세포를 상이한 RNA 용량에서 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ RNA(CAR RNA)로 전기천공시키고 조사된 K562-CD19 세포(K562-CD86 세포에 대한 대조군으로서 동등한 수의 조사된 K562 세포와 혼합된) 또는 조사된 K562-CD19 세포(동등한 수의 조사된 K562-CD86 세포와 혼합된)로 자극하였다. 6일째의 CFSE 염색(도 41C) 및 자극 후 상이한 날들에 T 세포의 수(도 41D)를 모니터하였다.
도 42(42A-42E 포함)는 Nalm-6 이종이식편 모델에서 Bis-RNA T 세포의 증진된 항-종양 활성을 나타낸다. 백혈병을 NOD/scid/yc(-/-)(NSG) 마우스(n=5)에서 Nalm6 세포(1x106, i.v.)의 정맥내 주사 후 확립시켰다. 종양 세포 주사 후 7일째에, 마우스를 무작위 분류하고 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ RNA 전기천공된 T 세포로 처리하였다. 항-메소텔린 RNA CAR T 세포(ss1BBZ)로 처리된 마우스를 대조군으로서 제공하였다. T 세포를 26e6(1X)의 단일 주사로 정맥내 주사하거나, 또는 첫 번째 주사의 경우 3주 동안(3X) 1주일에 1회 20e6, 및 두 번째 및 세 번째의 경우 5e6의 투여량으로 주사하였다. 동물을 주사 후 지시된 시점들에서 영상화하였다(도 42A). 상기 실험에 대한 BLI 데이터를 y-축상에 나타낸 총 광자속-SE로 플롯팅하며; 1e5 p/sec/cm2/sr은 루시페라제-함유 세포가 없는 마우스를 나타낸다(도 42B). 상술한 바와 같이 확립된 백혈병이 있는 NGS 마우스 또는 백혈병이 없는 NSG 마우스에게 CD19BBZ 또는 Bis-RNA, 또는 대조군 ss1BBZ RNA로 전기천공된 20e6 T 세포를 주사하였다. 골수 세포 및 비장세포를 T 세포 주사 후 1, 3 및 7일째에 각 그룹의 두 마리 마우스로부터 수거하였다. T 세포를, 혼주 (pooled) 골수 세포 및 비장세포로부터 마우스 세포를 고갈시킴으로써 각 마우스로부터 정제하였다. T 세포 기능을 각각 18시간(CD137 및 IFN-감마 분비) 및 4시간(CD107a) 동안 CD19 양성 세포주, K562-CD19로 자극 후 CD137 발현(*는 p<0.05를 가리킨다)(도 42C), 시토카인 생성(ELISA를 통해서)(도 42D), 및 CD107a 발현(도 42E)을 통해 평가하였다.
도 43(43A-43E 포함)은 상이한 종양 항원들에 대한 상이한 Bis-RNA를 예시한다. T 세포를 각각 완전 인간 항-CD19(21D4) 항체 및 완전 인간 항-CD3 scFv(28F11) 항체로부터 단쇄 가변 단편(scFv)을 사용하여 완전인간 CD19-CD3을 암호화하는 Bis-RNA에 대한 7개의 상이한 구조물들 중 하나로 전기천공시켰다. 상기 전기천공된 T 세포를 4시간 동안 CD19 양성 세포주, K562-CD19에 의해 자극시킨 후 CD107a 상향-조절을 유식 세포측정에 의해 모니터하였다(도 43A). IFN-감마 생성을, 상기 전기천공된 T 세포를 CD19 양성 세포주, Nalm6, K562-CD19 및 라지에 의해 18시간 동안 자극 후 ELISA에 의해 검출하였다. CD19BBZ CAR RNA(CAR RNA), 블리나투모맵 Bis-RNA(Blina-Bis-RNA) 및 전기천공 없는(No EP) 경우를 대조군으로서 사용하였다(도 43B). 도 43C는 항-마우스 IgG Fab 항체(메소텔린 및 GD2에 대한 scFv의 경우) 또는 항-인간 IgG Fab(cMet 및 PSCA에 대한)를 사용하여 메소텔린, cMet, PSCA 및 GD2에 대한 Bis-RNA 또는 CAR RNA로 전기천공된 T 세포상의 scFv의 검출을 나타낸다. 메소텔린, cMet, PSCA 및 GD2 Bis-RNA 또는 CAR RNA(CAR)에 대한 Bis-RNA 또는 CAR RNA로 전기천공된 T 세포를 4시간 동안 메소텔린(K562-meso, SK-OV3)), PSCA(K562-PSCA), cMet(SK-OV3) 또는 GD2(LY5Y)를 발현하는 세포주로 자극하고 CD107a 상향-조절을 유식 세포측정에 의해 모니터하였다(도 43D). NSG 마우스(n=6)에 1e6 Nalm6-CBG(i.v.)를 주사하고, 7일 후에 CD19BBZ 또는 D4F11을 렌티바이러스에 의해 형질도입시킨 5e6 T 세포 또는 CD19BBZ 또는 D4F11 RNA로 전기천공시킨 20e6 T 세포를 주사하였다. ss1BBZ CAR RNA로 전기천공시킨 T 세포로 처리한 마우스를 대조군으로서 제공하였다. 종양 주사 후 16일 및 20일째에, 상기 RNA 전기천공된 T 세포를 주사한 마우스에게 사이톡산을 복강내 투여하였다(40 ㎎/㎏, I.P.). 다음 날, 상기 마우스에게 기재된 바와 같이 RNA로 전기천공된 5e6 T 세포를 주사하였다. T 세포 주사 하루 전 및 각각의 후속 주사 후 2일째에, 생물발광을 도 42에 대해 기재된 바와 같이 측정하였다(도 43E).
도 44(44A-44D 포함)는 Bis-RNA 전기천공된 T 세포가 프로그램화된 세포사 1(PD1) 및 조절성 T 세포(Treg) 유도된 억제에 더 내성임을 나타낸다. T 세포를 상이한 양의 CD19BBZ RNA, 또는 CD19-CD3 Bis-RNA로 동시-전기천공시키고, 5 ug 또는 10 ug의 PD1 RNA를 CD19 양성 세포주, K652-CD19 또는 라지로 자극하였다. CD107a 발현을 유식 세포측정에 의해 측정하고(도 44A) IFN-감마 생성 생성을 ELISA에 의해 검출하였다(도 44B). 새로운 휴지 CD4 T 세포로부터 정제된 Treg를 상이한 T 효과기:Treg 비에서 CFSE 표지된 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ RNA(19BBZ) 전기천공된 휴지 CD4+ T 세포에 가하고 K562-CD19 세포로 자극하였다. 상기 자극 후 6일째에, 상기 세포를 항-CD3으로 염색하였다. CFSE 염색을 유식 세포측정에 의해 모니터하였다(도 44C-D).
도 45(도 45A-45B 포함)는 Bis-RNA 전기천공된 T 세포로부터의 상등액으로 펄스화된 T 세포의 발현을 나타낸다. T 세포를 CD19BBZ RNA(CAR RNA) 또는 블리나투모맵에 대한 Bis-RNA(Blina-Bis-RNA) 또는 D4F11 RNA(D4F11-Bis-RNA)로 전기천공시켰다. 전기천공 후 18시간 째에, 상등액을 Bis-RNA 전기천공된 T 세포로부터 수거하고 희석된(지시된 바와 같이 10X 또는 100X) 상등액을 CD19 양성 세포주, Nalm6, K562-CD19 또는 라지와 동시-배양된 전기천공되지 않은 T 세포에 가하였다. CAR RNA 또는 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포는 대조군이었다. CD107a 상향-조절을 4시간 자극 후 모니터하였다.
도 46은 Bis-RNA 전기천공된 T 세포가 현저하게 증진된 용해 활성을 가짐을 나타내는 그래프이다. T 세포를 1, 5 또는 10 ㎍/0.1 ㎖ T 세포의 RNA 용량에서 블리나투모맵 Bis-RNA(Bis-RNA) 또는 CD19bbz CAR RNA로 전기천공시켰다. 18시간 후에, 용해 활성을 30:1 T 효과기:표적 비로 4시간 플로우 기반 세포독성 T 림프구 분석을 사용하여 측정하였다.
도 47은 Bis-RNA 전기천공된 T 세포에서 CD107a 상향조절을 나타내는 그래프 패널이다. T 세포를 10 ㎍ 4D5BBZ 또는 4D5-CD3 RNA로 전기천공시키고 지시되는 바와 같이 감소하는 양의 ErbB2(Her2) mRNA로 전기천공시킨 K562 세포주로, 이들을 4시간 동안 동시-배양시킴으로써 자극하였다. CD107a 상향조절을 유식 세포측정에 의해 검출하였다.
도 48(도 48A-48H 포함)은 Bis-RNA 전기천공된 T 세포를 나타낸다. 도 48A는 상이한 RNA 용량에서 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ RNA(CAR RNA)로 전기천공되고 조사된 K562-CD19 세포(K562-CD86 세포에 대한 대조군으로서 동등한 수의 조사된 K562 세포와 혼합된)(W/O CD86) 또는 조사된 K562-CD19 세포(동등한 수의 조사된 K562-CD86 세포와 혼합된)(W/ CD86)로 자극된 휴지 CD4+ T 세포의 CFSE 표지화를 나타내는 그래프 패널이다. 6일째의 CFSE 희석을 나타내었다. 좌측 패널은 CFSE 표지화에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다(보다 높은 MFI는 보다 적은 T 세포 분열 및 증식을 가리킨다). 우측 패널은 1 ㎍ Bis-RNA로 전기천공시킨 T 세포의 CFSE 희석의 상대적인 비율을 나타낸다. CD3/CD28 비드 자극된 T 세포 및 전기천공 없는 T 세포를 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 48B는 상이한 RNA 용량에서 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ RNA(CAR RNA)로 전기천공되고 조사된 K562-CD19 세포(K562-CD86 세포에 대한 대조군으로서 동등한 수의 조사된 K562 세포와 혼합된)(K562-CD19/K562) 또는 조사된 K562-CD19 세포(동등한 수의 조사된 K562-CD86 세포와 혼합된)(K562-CD19/K562-CD86)로 자극된 휴지 CD4+ T 세포의 CFSE 표지화를 나타내는 그래프이다. 3일째에 출발하는 상대적인 CFSE 희석을 나타내었다(1 ㎍ Bis-RNA로 전기천공되고 6일째에 K562-CD19/K562 세포로 자극된 T 세포를 50%로서 설정하였다). 도 48C는 상이한 RNA 용량에서 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ RNA(CAR RNA)로 전기천공되고 조사된 K562-CD19 세포(K562-CD86 세포에 대한 대조군으로서 동등한 수의 조사된 K562 세포와 혼합된)(K562-CD19/K562) 또는 조사된 K562-CD19 세포(동등한 수의 조사된 K562-CD86 세포와 혼합된)(K562-CD19/K562-CD86)로 자극된 CD45RO+(기억 세포) 또는 CD45RO-(나이브 세포) 휴지 CD4+ T 세포의 CFSE 표지화를 나타내는 그래프의 패널이다. 3일째에 출발하는 CFSE 희석을 CFSE의 MFI 또는 상대적인 CFSE 희석(1 ㎍ Bis-RNA로 전기천공되고 6일째에 K562-CD19/K562 세포로 자극된 CD45RO+ T 세포를 50%로서 설정하였다)으로서 나타내었다. 도 48D는 상이한 RNA 용량에서 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ RNA(CAR RNA)로 전기천공되고 조사된 K562-CD19 세포(K562-CD86 세포에 대한 대조군으로서 동등한 수의 조사된 K562 세포와 혼합된)(K19/K562) 또는 조사된 K562-CD19 세포(동등한 수의 조사된 K562-CD86 세포와 혼합된)(K19/K86)로 자극된 휴지 CD4+ T 세포의 CFSE 표지화를 나타내는 그래프 패널이다. 자극 후 8일째에, 상기 배양물로부터의 상등액에 IFN-감마 및 IL-2 검출을 위해 ELISA를 수행하였다. 도 48E는 상이한 RNA 용량에서 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ RNA(CAR RNA)로 전기천공되고 18시간 동안 라지(CD19+) 또는 K562(Cd19-) 세포로 자극된 CD45RO+(기억 세포) 또는 CD45RO-(나이브 세포) 휴지 CD4 T 세포의 CFSE 표지화를 나타내는 그래프이다. IL-2 분비를 ELISA에 의해 분석하였다. 도 48F는 CFSE 표지되고 1 또는 5 ㎍ CD19BBZ(19BBZ) 또는 CD19-28Z(19-28Z) 또는 블리나투모맵(Blina) RNA로 전기천공되고 조사된 K562, 또는 K562와 K562-CD19의 1:1 혼합물 또는 K562-CD19와 K562-CD86의 1:1 혼합물로 자극된 T 세포를 나타내는 그래프이다. 6일 후에, 상기 T 세포에 CFSE 희석을 위해 유식 세포측정 분석을 수행하였다. 도 48G는 5 ㎍ CD19BBZ(19BBZ) 또는 CD19-28Z(19-28Z) 또는 블리나투모맵(Blina) RNA로 전기천공되고 K562 세포와 K562-CD19 세포의 1:1 혼합물 또는 K562-CD19 세포와 K562-CD86 세포의 1:1 혼합물로 자극된, 5x105 T 세포의 6일째 총 생육력을 나타내는 그래프이다. 도 48H는 5 ㎍ CD19BBZ(19BBZ) 또는 CD19-28Z(19-28Z) 또는 블리나투모맵(Blina) RNA로 전기천공되고 플로우 기반 4시간 세포독성 T 림프구 분석으로 분석된 T 세포를 나타내는 그래프이다.
도 49(도 49A-49H 포함)는 Bis-RNA의 다양한 구조물로 전기천공된 T 세포의 발현 수준을 나타낸다. 도 49A는 각각 완전인간 항-CD19 항체(21D4) 및 완전인간 항-CD3 scFv 항체(28F11)로부터의 scFv를 사용하여 완전인간 CD19-CD3을 암호화하는 7개의 상이한 Bis-RNA 구조물 중 하나로 전기천공시킨 T 세포를 나타내는 그래프이다. IL-2 생성을, 상기 전기천공된 T 세포를 18시간 동안 CD19 양성 세포주, Nalm6, K562-CD19 및 라지로 자극 후에 ELISA에 의해 검출하였다. CD19BBZ CAR RNA(CAR RNA), 블리나투모맵 Bis RNA(Blina-Bis-RNA) 및 전기천공 부재(No EP)를 대조군으로서 사용하였다. 도 49B는 CD19BBZ RNA(CAR RNA) 또는 블리나투모맵 Bis-RNA(Blina-Bis-RNA) 또는 완전인간 CD19-CD3 Bis-RNA(D4F11)로 전기천공된 T 세포를 나타내는 그래프이다. 전기천공 후 4시간째에, 상기 T 세포를 18시간 동안 K562-CD19로 자극하고 상등액을 다중 시토카인/케모킨 검출을 위해 루미넥스(Luminex)에 가하였다. 데이터를, CAR RNA T 세포를 100%로 설정함으로써 표준화하였다. 도 49C는 1 ug 또는 10 ug의 RNA 용량에서 CD19BBZ, 블리나투모맵 Bis-RNA, D4BBZ 또는 D4F11 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 나타내는 그래프이다. 상기 세포를 CD19 양성 세포주, K562-CD19 또는 라지로 자극하고, 시토카인 생성(IFN-감마 및 IL-2)을 ELISA에 의해 검출하였다. 도 49D는 1, 5 또는 10 ug의 RNA 용량에서 CD19BBZ, 블리나투모맵 Bis-RNA, D4BBZ 또는 D4F11 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 나타내는 그래프이다. 상기 세포들을 CD19 양성 세포주, K562-CD19, 라지 또는 Nalm6, 및 대조군으로서 CD19 음성 세포주 K562-meso로 자극하였다. CD107a 발현을 유식 세포측정에 의해 검출하였다. 도 49E는 EGFRviii CAR(MR1-BBZ 또는 139-BBZ) 또는 EGFRviii Bis-RNA(MR1-Bis-RNA 또는 139-Bis-RNA)을 암호화하는 RNA로 전기천공되고 EGFRviii RNA 전기천공된 K562 세포 또는 K562 세포로 자극된 T 세포의 CD107a 상향조절을 나타내는 그래프이다. 도 49F는 CD19 CAR(CD19BBZ) 또는 ErBB2 CAR(4D5-BBZ) 또는 ErBB2 Bis-RNA(4D5-OKT3)를 암호화하는 RNA로 전기천공된 T 세포의 CD107a 상향조절을 나타내는 그래프이다. 상부 패널은 전기천공 후 18시간 째에 ErBB2 융합 단백질(Her2-Fc)에 의한 T 세포의 염색을 나타낸다. 하부 패널은 ErBB2 양성/CD19 음성 종양 세포주, (SK-OV3) 또는 CD19 양성/ErBB2 음성 종양 세포주(Nalm6)로 자극된 T 세포의 CD107a 염색을 나타낸다. 도 49G는 ErBB2 융합 단백질(Her2-Fc) 발현을 나타내는 그래프 패널이다. 도 49H는 CD8+ 세포에서 CD107a 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 50은 상이한 양의 CD19BBZ RNA 또는 CD19-CD3 Bis-RNA 및 5 ug 또는 10 ug의 PD1 RNA로 동시-전기천공된 T 세포를 나타내는 그래프이다. 상기 세포를 CD19 양성 세포주 라지로 자극하고, IFN-감마 분비를 ELISA에 의해 검출하였다. 데이터를 PD1의 동시-도입 없이 세포에 대한 T 세포의 시토카인 생성 비율로서 플롯팅하였다.
도 51(도 51A-51D 포함)은 동시-전기천공된 T 세포를 특성화하는 그래프 패널이다. 도 51A는 T 세포 활성화의 증가 및 Bis-RNA 전기천공된 T 세포의 종양 살해 능력을 나타내는 흐름 그래프 패널이다. T 세포를 지시된 대로, 상이한 양(㎍ RNA/0.1 ㎖ T 세포)의 블리나투모맵 Bis-RNA(Bis-RNA) 또는 CD19 CAR RNA(CAR RNA)로 전기천공시켰다. 전기천공 후 18시간 째에, Bis-RNA 또는 CAR RNA를 갖는 T 세포를, 동등한 수의 GFP RNA 전기천공된 T 세포(GFP-T)를 첨가하거나 첨가하지 않고 CD19 양성 세포주로 자극하고 CD107a 발현에 대해 평가하였다. 도 51B는 Bis-RNA 전기천공 후 IFN-감마 및 그랜자임 B 발현을 나타내는 그래프 패널이다. 상술한 T 세포의 전기천공 후 18시간 째에, 상기 전기천공된 T 세포에 IFN-감마 및 그랜자임 B의 세포내 염색을 수행하였다(도 2B). 도 51C는 IFN-감마의 ELISA 검출을 나타내는 그래프이다. IFN-감마에 대한 ELISA를 CD19 양성 세포(Nalm6, K562-CD19 및 라지) 또는 CD19 음성(K562) 세포주로 상기 T 세포를 밤새 자극한 후에 수행하였다. 도 51D는 Bis-RNA의 전기천공 및 발현 후 T 세포의 특이성을 나타내는 그래프이다. T 세포를 블리나투모맵 Bis-RNA(Bis-RNA) 또는 CD19bbz CAR RNA(1,5 또는 10 ㎍/0.1 ㎖의 T 세포의 RNA 용량에서 CAR RNA)로 전기천공시키거나, 또는 5 ㎍의 각각의 Bis-RNA 및 CAR RNA(Bis-RNA+CAR RNA)로 동시-전기천공시켰다. 전기천공 후 18시간째에, 용해 활성을 지시된 효과기:표적 비에서 4시간 플로우-기반 세포독성 T 림프구 분석으로 평가하였다.
도 52는 T 세포내에 전기천공된 용해성 융합-단백질 RNA를 나열하는 표이다.
도 53은 항-PD-L1 및 항-CD28 scFv를 사용하는 이중-특이성 항체의 구성을 나타내는 예시이다.
도 54(도 54A-54B 포함)는 전기천공된 T 세포에서 시토카인 생성을 나타내는 그래프 패널이다. 도 54A는 상이한 RNA로 전기천공되고 종양 세포와의 인큐베이션에 의해 활성화된 T 세포에 의한 IL-2 생성을 나타내는 그래프이다. 도 54B는 상이한 RNA로 전기천공되고 종양 세포와의 인큐베이션에 의해 활성화된 T 세포에 의한 IFN-감마 생성을 나타내는 그래프이다.
도 55는 항-TGFb 수용체 II 및 항-CD28 scFv를 사용하는 이중-특이성 항체의 구성을 나타내는 예시이다.
도 56(도 56A-56B 포함)은 전기천공된 T 세포의 반응성을 나타내는 그래프 패널이다. 도 56A는 4D5-CD3 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 반응성임을 나타내는 그래프이다. ErbB2 CAR 또는 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 높은 수준의 ErbB2, SK-OV3 및 N87, 또는 낮은 수준의 MFC-7, MDA-231, PC3 및 A549를 발현하는 종양 세포주들로 자극하였다. CD107a 분석은 4D5-6.CD3을 발현하는 T 세포가 ErbB 과발현 종양 세포에 유일하게 반응성임을 나타내었다. 도 56B는 도 56A의 실험의 반복 결과를 나타내는 그래프 패널이다.
도 57은 ErbB2 과발현 종양 세포에 대한, 4D5-CD3 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포의 용해 활성을 나타내는 그래프 패널이다. ErbB2 CAR 또는 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 ErbB2 과발현 종양 세포, SK-OV3-CBG, 또는 ErbB2 저발현 종양 세포, mel624(624-CBG)에 대한 그들의 용해 활성에 대해 시험하였다. 루시페라제 기반 CTL 분석은, 친화성 조정된 BebB2 CAR, 4D5-5.BBZ 및 4D5-3.BBZ처럼, 4D5-6.CD3을 발현하는 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포, SK-OV3에 유일하게 반응성임을 나타내었다.
도 58은 4D5-CD3 Bis-RNA로 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 반응성임을 나타내는 그래프 패널이다. ErbB2 CAR 또는 Bis-RNA로 형질도입된 T 세포를 높은 수준의 ErbB2, SK-OV3 및 N87, 또는 낮은 수준의 MDA-231, PC3 및 A549를 발현하는 종양 세포주로 자극하였다. CD107a 분석은 4D5-CD3를 발현하는 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 유일하게 반응성임을 나타내었다.
도 59는 4D5-CD3 Bis-RNA로 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 반응성임을 나타내는 그래프 패널이다. 지시된 바와 같이 ErbB2 CAR 또는 Bis-RNA로 형질도입된 T 세포를 높은 수준의 ErbB2, SK-OV3 및 N87, 또는 낮은 수준의 MDA-231, PC3 및 A549를 발현하는 종양 세포주로 자극하였다. ELISA에 의해 분석된 바와 같은 시토카인 생성은 T4D5-CD3를 발현하는 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 유일하게 반응성임을 가리킨다.
도 60(도 60A 및 60C 포함)은 T 세포 처리된 마우스에서, 진행된 혈관 분포된 종양의 역행을 나타내는 상들의 패널이다. 도 60A는 친화성-조정된 ErbB2 BiTE 세포가 마우스에서 치료 지수를 증가시키고 진행된 혈관 분포된 종양의 역행을 유도함을 나타내는 상들의 패널이다. 렌티바이러스 형질도입에 의해 상이한 친화성 ErbB2 CAR 또는 BiTE로 변형시킨 T 세포를 이중-종양 이식된 NSG 마우스에서 시험하였다. 마우스(n=4-5)에 0일째에 우측 옆구리에 PC3-CBG 종양 세포(1x106 세포/마우스, s.c.)를 이식하였다. 5일째에, 같은 마우스에게 좌측 옆구리에 SK-OV3-CBG 종양 세포(5x106 세포/마우스, s.c.)를 제공하였다. 상기 마우스를 PC3 종양 접종 후 23일째에 T 세포로 처리하였다(i.v.). T 세포를 1x107/마우스의 단일 주사로서 투여하였다. 형질도입되지 않은 T 세포(No TD)로 처리된 마우스를 대조군으로서 제공하였다. 동물을 PC3 종양 접종 후 지시된 시간에 영상화하였다. 도 60B는 이중-종양 이식된 NSG 마우스 모델에서 SK-OV3 종양 크기를 나타내는 그래프이다. 종양 크기를 측정하고, 상기 종양 부피를 계산하고 플롯팅하였다. 도 60C는 이중-종양 이식된 NSG 마우스 모델에서 PC3 종양 크기를 나타내는 그래프이다. 종양 크기를 측정하고, 종양 부피를 계산하고 플롯팅하였다.
도 61(도 61A-61B 포함)은 PD1-CD28 변환 수용체 (switch receptor)를 나타내는 상들의 패널이다. 도 61A는 PD1-CD28 변환 수용체 및 친화성 조정된 T4D5-6.CD3 BiTE를 동시-발현하기 위한 구조물의 예시이다. 도 61B는 PD1-CD28 및 T4D5-CD3 동시-발현 벡터로 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포의 PD1-CD28 변환 수용체의 검출을 나타내는 그래프 패널이다.
도 62(도 62A-62M 포함)는 상들의 패널이다. 도 62A는 PD1-CD28 변환 수용체 및 T4D5-6.CD3 친화성 조정된 BiTE 모두를 동시-발현하는 T 세포의 증가된 용해 활성을 나타내는 그래프이다. 도 62B-62G는 고속 증대 프로토콜(REP)에 의해 생성된 Bis-RNA 전기천공된 T 세포가 생체내 백혈병 억제 활성을 더욱 개선시켰음을 나타내는 상들의 패널이다. REP 또는 항-CD3/항-CD28 비드(Beads)에 의해 증대된 T 세포의 표현형을 평가하였다(도 62B). REP T 세포 또는 항-CD3/항-CD28 비드 T 세포를 상이한 양의 CAR RNA 또는 Bis-RNA로 전기천공시키고 상이한 세포주로 18시간 동안 자극하였다. CD137 상향-조절을 유식 세포측정(CD3+ T 세포상에서 게이트 처리됨)에 의해 분석하였다(도 62C). 용해 활성을 상이한 양의 CAR RNA 또는 블리나투모맵 Bis-RNA로 전기천공된 REP T 세포(도 62D, 좌측 패널) 또는 항-CD3/항-CD28 비드 T 세포(도 62D, 우측 패널)에서 측정하였다. NSG 마우스를 1x106 Nalm6-CBG로 정맥내 주사하고 5일 후에 1차 처리를 위해 30x106 CAR RNA 또는 블리나투모맵 Bis-RNA(Blina) T 세포로 처리한 다음, Nalm6-CBG 주사 후 8일째에 시작하여 3주 동안 매주 2회, 각각 5x106으로 처리하였다. 생물발광 영상화(BLI)를 지시된 시간에 수행하고(도 62E) BLI 및 생존의 결과를 각각 도 62F 및 도 62G에 플롯팅하였다. 도 62H-62I는 막 결합된 OKT3을 발현하는 K562 기재 인공 항원 제시 세포(aAPC)의 생성을 나타내는 상들의 패널이다. CD8 힌지 및 막관통(OKT3.8) 또는 CD8 힌지 및 CD28 막관통(OKT3.8.28)을 갖는 OKT3의 막 형태에 대한 키메릭 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터(pLENS)를 도 62H에 예시한다. K562 기재 aAPC, K562-CD86-CD137L(KT) 또는 K562-CD137L(2D11) 세포주를 렌티바이러스 OKT3.8 또는 OKT3.8.28로 형질도입시키고 막 결합된 OKT3의 발현을 쥐 IgG Fab에 대한 항체를 사용하여 검출하였다(도 62I). 도 62J는 막 결합된 OKT3 형질도입된 K562 aAPC 클론의 특성화를 나타내는 상들의 패널이다. 제한 희석에 의한 상기 클론의 선택은 OKT3.8.28 형질도입된 KT aAPC로부터의 막 밴드 OKT3의 발현에 근거하였다. 도 62K-62M은 K562 기재 인공 aAPC에 의한 REP를 나타내는 그래프 패널이다. 도 62K는 OKT3 로딩된 K562-CD86-CD137L(KT) 또는 K562-CD137L(2D11), 또는 막 결합된 OKT3를 발현하는 KT(KT.OKT)가 조사되었고 1일(D1) 또는 2일(D2) 동안 배양한 후에 1:250의 T 세포:aAPC 비로 자극된 T 세포에 사용되었음을 나타내는 그래프이다. 도 62L은 REP에서 독립적으로 증대되고, CD62L 및 CD28에 대해 염색된, 증대된 T 세포를 나타내는 그래프 패널이다. 도 62M은 KT 세포와 비교된, REP 실험에서 상이한 B 세포주를 나타내는 그래프이다.
도 63은 1x106 Naml6-CBG 세포의 정맥내 주사에 의해 확립된 백혈병을 갖는 NSG 마우스를 나타내는 그래프이다. 7일 후에, 상기 마우스를 20x106 RNA 전기천공된 T 세포로 처리하였다. 13일 및 27일째에, 상기 마우스를 RNA로 전기천공된 5x106 T 세포 주사 24시간 전에 60 ㎎/㎏ 사이톡산으로 복강내로 처리하였다. 동물들을 주사 후 지시된 시점들에서 영상화하였으며, 총 광자속을 Y-축상에 나타내었다(n=5).
도 64는 1x106 Naml6-CBG 세포의 정맥내 주사에 의해 확립된 백혈병을 갖는 NSG 마우스를 나타내는 그래프이다. 7일 후에, 상기 마우스를 20x106 RNA 전기천공된 T 세포로 처리하였다. 13일 및 27일째에, 상기 마우스를 RNA로 전기천공된 5x106 T 세포 주사 24시간 전에 60 ㎎/㎏ 사이톡산으로 복강내로 처리하였다. 동물들을 주사 후 지시된 시점들에서 영상화하였으며, 총 광자속을 Y-축상에 나타내었다(n=5).
도 65는 TCR RNA 전기천공된 T 세포가 렌티-형질도입된 T 세포보다 종양 성장을 더 양호하게 제어함을(controlled) 나타내는 그래프이다. 2.5x106 A549-ESO/A2 종양 세포를 0일째에 정맥내 주사하였다. 처리는 5일째에 시작하였다. 렌티-T 세포를 5일째에 10x106의 단일 용량으로 투여하고 RNA 전기천공된 T 세포를 5일째에 출발하여, 1주일에 2회, 30x106, 10x106, 10x106 및 10x106의 4개 용량으로 주사하였다.
도 66은 TCR RNA 전기천공된 T 세포가 종양 세포 성장을 제어함을 나타내는 상들의 패널이다.
도 67은 렌티-형질도입된 T 세포가 TCR RNA 전기천공된 T 세포만큼 효율적으로 종양 성장을 제어하지 못함을 나타내는 상들의 패널이다.
도 68은 렌티-형질도입된 T 세포보다 더 효율적으로 종양 모델에서 종양 성장을 제어함을 나타내는 그래프이다.
도 69는 CD3 구조물의 예시를 나타내는 상들 및 TCR 및 CD3 RNA 전기천공된 T 세포에서 TCR 및 CD3 발현을 나타내는 그래프의 패널이다.
도 70은 TCR(vb13.1), CD3 및 TCR(vb13.1)/CD3의 발현 수준이 전기천공된 T 세포에서 발현됨을 나타내는 그래프이다.
도 71은 T 세포에서 전기천공된 TCR RNA의 발현 그래프 패널이다.
도 72는 1G4 야생형(1G4wt) 및 고 친화성(1G4.LY95a)NY-ESO-1 TCR에 대한 렌티-바이러스 벡터의 역가를 나타내는 표이다.
도 73은 1G4 야생형(1G4wt) 및 고 친화성(1G4.LY95a)NY-ESO-1 TCR에 대한 상이한 렌티-바이러스 벡터들의 역가를 나타내는 표이다.
도 74는 T 세포의 바이러스 감염 효율을 나타내는 표이다.
도 75는 TCR 및 CD3으로 동시-전기천공된 T 세포에서 트랜스유전자 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 76은 TCR 및 CD3 RNA로 전기천공된 T 세포에서 트랜스유전자 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 77은 TCR 및 CD3으로 동시-전기천공된 T 세포 또는 TCR로 전기천공되고 CD3 비드로 자극된 T 세포에서 트랜스유전자 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 78은 CD3의 존재 또는 부재하에서 TCR RNA(y-축)로 전기천공되고 Naml6 종양 세포(x-축)와 인큐베이션된 T 세포를 나타내는 흐름도의 패널이다.
도 79는 CD3의 존재 또는 부재하에서 TCR RNA(y-축)로 전기천공되고 OKT 발현 Naml6 종양 세포(x-축)와 인큐베이션된 T 세포를 나타내는 흐름도의 패널이다.
도 80은 CD3의 존재 또는 부재하에서 TCR RNA(y-축)로 전기천공되고 ND340 발현 Naml6 종양 세포(x-축)와 인큐베이션된 T 세포를 나타내는 흐름도의 패널이다.
도 81은 NY-ESO-1 TCR(1G4) 알파 및 베타 쇄 RNA와 함께, CD3 델타, 감마, 입실론 및 제타 모두(4개의 서브유닛) 또는 적은(3개의 서브유닛, 2개의 서브유닛 또는 1개의 서브유닛) 서브유닛으로 전기천공된 T 세포에서 TCR 및 CD3 발현을 나타내는 흐름 그래프 패널이다. CD3 및 TCR(vb13.1)을 전기천공 후 18시간 째에 유식 세포측정에 의해 검출하였다.
도 82는 CD3 RNA를 293 세포주내에 전기천공시킨 후의 CD3 및 TCR 발현의 평균 형광 강도(MFI)를 나타내는 막대 그래프이다.
도 83은 종양 세포로 자극된 TCR RNA 및 CD3 RNA 동시-전기천공된 T 세포에서 CD107a 상향-조절을 나타내는 흐름 그래프 패널이다.
도 84는 상이한 종양 세포주들과 인큐베이션된 RNA 전기천공된 T 세포에서 IFN-감마 발현을 나타내는 그래프 패널이다. T 세포를 CD3 RNA의 상이한 조합들과 함께 NY-ESO-1 TCR 알파 및 베타 RNA로 전기천공시켰다. 상기 세포를 YN-ESO-1/HLA-A2 양성인 Naml6-ESO 또는 624mel 종양 세포와 동시-배양하였다. IFN-감마 생성 수준을 18시간 후에 측정하였다.
도 85는 종양 세포주와 인큐베이션된 상이한 RNA 전기천공된 T 세포의 IFN-감마 발현을 나타내는 그래프이다.
도 86은 상이한 종양 세포주들과 인큐베이션된 RNA 전기천공된 T 세포에서 IL-2 발현을 나타내는 그래프 패널이다. T 세포를 CD3 RNA의 상이한 조합들과 함께 NY-ESO-1 TCR 알파 및 베타 RNA로 전기천공시켰다. 상기 세포를 YN-ESO-1/HLA-A2 양성인 Naml6-ESO 또는 624mel 종양 세포와 동시-배양하였다. IL2 생성 수준을 18시간 후에 측정하였다.
도 87은 TCR이 TCR 또는 CD3 RNA 구조물을 함유하는 4-1BB로 전기천공된 T 세포에 의해 발현됨을 나타내는 그래프 패널이다. T 세포를 1G4 TCR 알파(또는 알파.BB) 및 베타(알파/베타 또는 알파.BB/베타), 또는 4-1BB와 함께 또는 상기 없이 CD3 제타 또는 입실론과 알파/베타(제타, 제타.BB, 입실론 또는 입실론.BB)로 동시-전기천공시켰다. 18시간 후에, CD3 및 vb13.1을 유식 세포측정에 의해 측정하였다.
도 88은 상이한 종양 세포주들과 인큐베이션된 RNA 전기천공된 T 세포가 다수의 종양 세포주들에 대해 영향을 미침을 나타내는 그래프 패널이다. 상기 TCR 또는 CD3의 C 말단에 대한 보조-자극 신호의 제공은 T 세포 기능을 유지시켰으며 잠재적으로 직접적인 보조-자극 신호를 T 세포에 제공하였다. T 세포를 1G4 TCR 알파(또는 알파.BB) 및 베타(알파/베타 또는 알파.BB/베타), 또는 4-1BB와 함께 또는 상기 없이 CD3 제타 또는 입실론과 알파/베타(제타, 제타.BB, 입실론 또는 입실론.BB)로 동시-전기천공시켰다. 18시간 후에, T 세포를 종양 세포주, Naml6-ESO(HLA-A2+/NY-ESO-1+), A549ENA(HLA-A2+/NY-ESO-1+), 624mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+), 526mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+), 또는 888mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+)에 의해 자극하고, CD107a 생성을 측정하였다.
도 89는 CD3 쇄의 존재 또는 부재하에서 Nam16 종양 세포(x-축) 및 상이한 TCR 쇄를 암호화하는 RNA로 전기천공된 T 세포(y-축)를 나타내는 흐름도 패널이다.
도 90은 CD3 쇄의 존재 또는 부재하에서 624 종양 세포(x-축) 및 상이한 TCR 쇄를 암호화하는 RNA로 전기천공된 T 세포(y-축)를 나타내는 흐름도 패널이다.
도 91은 CD3 쇄의 존재 또는 부재하에서 526 종양 세포(x-축) 및 상이한 TCR 쇄를 암호화하는 RNA로 전기천공된 T 세포(y-축)를 나타내는 흐름도 패널이다.
도 92는 CD3 쇄의 존재 또는 부재하에서 888 종양 세포(x-축) 및 상이한 TCR 쇄를 암호화하는 RNA로 전기천공된 T 세포(y-축)를 나타내는 흐름도 패널이다.
도 93(도 93A-93D 포함)은 성취된 최대 트랜스유전자 발현(도 93A), 및 디설파이드 결합 및 N-탈글리코실화를 모두 갖는 베타쇄 및 디설파이드 결합을 갖는 TCR을 사용하는 전기천공된 T 세포의 기능을 나타내는 그래프 패널이다. 상기 TCR 알파쇄의 N-탈글리코실화는 전기천공된 T 세포의 기능을 손상시켰다(도 93A-93D).
도 94는 NOD/SCID 마우스내로 정맥내 주사 후 NY-ESO-1 및 GFP 모두를 발현하는 10x106 Naml6-CBG-ESO-GFP(녹색 방아벌레) 세포의 발현을 나타내는 그래프이다. 종양 접종 5일 후에, 첫 번째 CBR(적색 방아벌레) 형질도입되고 RNA 전기천공된 T 세포를 가리킨 바와 같이 정맥내로 주사하였다(n=5). Wt1G4:야생형 1G4 TCR, m1G4: 두 번째 디설파이드 결합 알파/두 번째 디설파이드 결합 알파 및 N-탈글리코실화 베타, CD19:CD19BBZ CAR, meso:ss1BBZ CAR 및 염수.
도 95는 상기 TCR 알파쇄의 N-탈글리코실화가 RNA 전기천공된 T 세포의 기능을 손상시킴을 나타내는 상들의 패널이다.
도 96은 쥐 불변 영역을 함유하는 하이브리드 TCR을 암호화하는 RNA로 전기천공된 T 세포의 트랜스유전자 발현 및 기능성을 나타내는 상들의 패널이다.
도 97은 시간에 걸쳐 마우스 모델에서 주사된 종양 및 하이브리드 TCR T 세포의 형광을 나타내는 상들의 패널이다.
도 98(도 98A-98D 포함)은 상기 TCR 또는 하이브리드 TCR에 대한 디설파이드 결합 부가와 비교된, 전기천공된 T 세포의 상기 TCR 증진된 트랜스유전자 발현 및 기능에 대한, 알파 및 베타 쇄에 대한 디설파이드 결합의 부가, 또는 베타쇄의 N-탈글리코실화를 나타내는 상들의 패널이다.
도 99는 TCR 또는 CD3을 함유하는 4-1BB로 전기천공된 T 세포에 의해 발현된 TCR을 나타내는 상들의 패널이다. T 세포를 1G4 TCR 알파(또는 알파.BB) 및 베타(a/b 또는 a.BB/b), 또는 4-1BB와 함께 또는 상기 없이 CD3 제타 또는 입실론과 a/b(z, z.BB, e 또는 e.BB)로 동시-전기천공시켰다. 18시간 후에, CD3 및 vb13.1을 유식 세포측정에 의해 측정하였다.
도 100은 1G4 TCR 알파(또는 알파.BB) 및 베타(a/b 또는 a.BB/b), 또는 4-1BB와 함께 또는 상기 없이 CD3 제타 또는 입실론과 a/b(z, z.BB, e 또는 e.BB)로 동시-전기천공된 T 세포를 나타내는 상들의 패널이다. 18시간 후에, T 세포를 종양 세포주, Naml6-ESO(HLA-A2+/NY-ESO-1+), A549ENA(HLA-A2+/NY-ESO-1+), 624mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+), 526mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+), 또는 888mel(HLA-A2+/NY-ESO-1+)에 의해 자극하고, CD107a 분석에서 평가하였다.
도 101은 1G4 TCR 알파 및 베타, 또는 CD27(또는 CD28)과 함께 또는 상기 없이 CD3 입실론(E) 및/또는 제타(Z)와 a/b로 동시-전기천공된 T 세포를 나타내는 상들의 패널이다. 18시간 후에, T 세포를 종양 세포주, Nalm6-ESO (HLA-A2+/NY-ESO-1+), 624mel (HLA-A2+/NY-ESO-1+), U266 (HLA-A2+/NY-ESO-1+), 또는 888mel (HLA-A2-/NY-ESO-1-)에 의해 자극하고, CD107a 분석에서 평가하였다.
도 102는 PD1 구조물 및 CD27과 함께 또는 상기 없이 PD1-CD28 변환 수용체 및 1G4 TCR로 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포에서 PD1 및 vb13.1의 검출을 나타내는 상들의 패널이다.
도 103은 5E6 A549-ESO(HLA-A2 및 NY-ESO-1 형질도입된 A549)를 0일째에 피하 주사함을 나타내는 그래프이다. 1x106 형질도입된 T 세포를 14일째에 주사하고 종양 크기를 측정하였다. 예비 결과는 TCR 단독은 효과가 없는 반면(1G4), CD27 보조-자극 신호(1G4.CD27) 또는 PD1-CD28 변환 수용체(PD1-CD28.1G4), 또는 CD27 보조-자극 신호 및 PD1-CD28 변환 수용체(PD1-CD28.1G4.CD27) 모두의 경우 종양 성장이 지연됨을 가리켰다.
도 104는 기능성 동족 항원 인식과 함께 비-MHC 제한된 종양 항원 인식이 가능한 변형된 TCR의 도식적 도면이다.
도 105는 동시-전기천공된 T 세포의 트랜스유전자 발현을 나타내는 상들의 패널이다. 7개의 아미노산 flu(HA1) 펩티드 서열을 상기 TCR 알파쇄 또는 CD3 제타 또는 입실론쇄의 N'-말단에 가하여 HA1.알파 (HA1.a), HA1.제타 (HA1.z) 및 HA1.입실론 (HA1.e)을 생성시켰다. T 세포를 Flu, HA1(17-9 또는 26-9) 및 종양 항원(CD19 또는 Her2(4D5))에 대한 이중-특이성 항체를 암호화하는 RNA와 함께 변형된 TCR로 동시-전기천공시켰다. 전기천공 후 18시간째에, 트랜스제닉 TCR(vb13.1) 발현을 유식 세포측정에 의해 검사하였다.
도 106은 CD19 또는 Her2와 함께 변형된 NY-ESO-1 TCR 인식된 동족 항원(HLA-A2/NY-ESO-1)을 갖는 T 세포를 나타내는 상들의 패널이다.
도 107은 bis-RNA와 동시-도입된 변형된 TCR과 함께 전달된 T 세포의 IFN-감마 분비를 나타내는 그래프이다.
도 108은 bis-RNA와 동시-도입된 변형된 TCR과 함께 전달된 T 세포의 IL-2 분비를 나타내는 그래프이다.
도 109는 종양 함유 마우스에게 투여된 변형된 TCR 및 bis-RNA를 갖는 T 세포의 항-종양 활성을 나타내는 상들의 패널이다. 마우스에게 Nalm6-ESO(i.v.)를 주사하고 상기 마우스를 지시된 바와 같이 RNA로 전기천공된 T 세포로 처리하였다.
도 110(도 110A-110B 포함)은 변형된 TCR을 갖는 T 세포를 나타내는 상들의 패널이다. 도 110A는 상기 TCR의 알파 또는 베타쇄의 N' 말단에 소분자 및 His-태그 서열을 부가함에 의한 소분자(애피바디(AFFIBODY)®) 변형된 TCR(Affi-TCR)의 도식적 스케치이다. 도 110B는 NY-ESO-1(1G4) TCR 알파(a) 및 베타(b), 또는 이들의 ErbB2 소분자(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형으로 동시-전기천공된 T 세포를 나타내는 상들의 패널이다. 밤새 후, vb13.1 및 His-태그를 유식 세포측정에 의해 검출하였다.
도 111은 Affi-TCR RNA 전기천공된 T 세포의 CD107 상향-조절을 나타내는 상들의 패널이다.
도 112(도 112A-112C 포함)는 TCR 발현 및 소분자 변형된 CD3 입실론의 동시-전달에 의한 이중 표적화를 나타내는 상들의 패널이다. 도 112A는 어느 한 CD3 입실론 쇄의 N' 말단에 소분자 및 G4S 링커를 부가함에 의한 소분자 변형된 CD3 입실론의 도식적 스케치이다. 도 112B는 NY-ESO-1(1G4) TCR 알파(a) 및 베타(b), 또는 ErbB2 소분자(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형된 CD3 입실론(e)과 함께 동시-전기천공된 T 세포를 나타내는 표이다. 도 112C는 밤새 인큐베이션 후 유식 세포측정에 의해 검출된 vb13.1의 발현을 나타내는 상들의 패널이다.
도 113은 Affi-TCR RNA 전기천공된 T 세포의 CD107a 상향-조절을 나타내는 상들의 패널이다. T 세포를 도 101에 지시된 바와 같이 NY-ESO-1(1G4) TCR 알파(a) 및 베타(b), 또는 ErbB2 소분자(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형된 CD3 입실론(e)과 함께 동시-전기천공시키고, 종양 세포, Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-), Nalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-), SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+) 또는 MDA231 (NY-eso-1-, ErbB2+)로 자극하고, CD107a 발현에 대해 평가하였다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용되는 모든 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 개시된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법을 본 명세서에 기재한다. 본 발명의 기재 및 청구에서, 하기의 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정한 실시태양을 기재하기 위한 것이며, 제한을 의도하지 않음을 또한 알아야 한다.
"하나의"라는 관사는 본 명세서에서 상기 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나보다 많은(즉 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나보다 많은 요소를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "약"은 양, 시간적 지속 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 명시된 값의 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 훨씬 더 바람직하게는 ±1%, 및 더욱 더 바람직하게는 ±0.1%의 변화를 포함함을 의미하며, 상기와 같은 변화는 개시된 방법을 수행하기에 적합하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하기에 충분히 자극된 T 세포의 병증을 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 시토카인 생성, 및 검출 가능한 효과기 기능과 관련될 수 있다. "활성화된 T 세포"란 용어는 특히, 세포 분열을 겪고 있는 T 세포를 지칭한다.
"친화성 분자 키메릭 수용체"란 어구는 표적 단백질 또는 펩티드에 높은 친화성으로 결합하는 친화성 분자, 예를 들어 소분자, 항체 유사물질, 애피바디™, 또는 이들의 임의의 단편을 포함하는 재조합 수용체를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 일부 다른 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 T 세포 수용체 도메인, 예를 들어 불변 및 가변 도메인을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 수득된 완전한 면역글로불린일 수 있으며 완전한 면역글로불린의 면역반응성 부분들일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 사량체는 천연이거나 또는 단쇄 항체 또는 항체 단편으로부터 재구성될 수 있다. 항체는 또한 천연이거나 단쇄 항체 또는 항체 단편으로부터 재구성될 수 있는 이량체를 포함한다. 본 발명에서 항체는 다양한 형태들, 예를 들어 다클론 항체, 단클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab')2뿐만 아니라 단쇄 항체(scFv), 인간화된 항체, 및 인간 항체로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
"항체 단편"이란 용어는 완전 항체의 한 영역을 지칭하며 완전 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 단일-도메인 항체, 예를 들어 표적에 대해 충분한 친화성을 나타내는 VL 또는 VH 도메인으로 구성된 카멜리드 항체(Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다. 상기 항체 단편은 또한 인간 항체 또는 인간화된 항체 또는 그의 인간 항체 또는 인간화된 항체의 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항체 중쇄"는 천연 입체형태로 모든 항체 분자 중에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2가지 유형 중 보다 큰 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항체 경쇄"는 천연 입체형태로 모든 항체 분자 중에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2가지 유형 중 보다 작은 것을 지칭한다. α 및 β 경쇄는 2가지 주요 항체 경쇄 아이소타입들을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "이중특이성 항체"는 적어도 2개의 상이한 항원 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 에피토프는 동일 항원으로부터의 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 에피토프는 2개의 상이한 항원으로부터의 것이다. 이중특이성 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체를 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시-발현을 사용하여 재조합적으로 생성시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39]을 참조하시오. 한편으로, 이중특이성 항체를 화학 결합을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어 문헌[Brennan et al. (1985) Science 229:81]을 참조하시오. 이중특이성 항체는 이중특이성 항체 단편을 포함한다. 예를 들어 문헌[Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48, Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368]을 참조하시오.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "합성 항체"란 용어는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 항체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 박테리오파지에 의해 발현된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한, 항체를 암호화하고 항체 단백질을 발현하는 DNA 분자 또는 상기 항체를 명시하는 아미노산 서열의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기에서 상기 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 분야에서 입수할 수 있고 주지되어 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항원" 또는 "Ag"란 용어는 면역 반응을 일으키는 분자로서 정의된다. 상기 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정한 면역학적으로-적격인 세포의 활성화, 또는 이 둘 모두를 포함할 수 있다. 숙련가는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 알 것이다. 더욱 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 생성될 수 있다. 따라서 숙련가는 면역 반응을 이끌어내는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항원"을 암호화함을 알 것이다. 더욱 또한, 당해 분야의 숙련가는 항원이 오직 유전자의 전장 핵산 서열에 의해서만 암호화될 필요는 없음을 알 것이다. 본 발명이 비제한적으로 하나 초과의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 용도 및 이들 뉴클레오티드 서열을 목적하는 면역 반응을 이끌어내기 위해서 다양한 조합들로 배열함을 포함함은 쉽게 자명하다. 더욱이, 숙련가는 항원이 전혀 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 없음을 알 것이다. 항원이 생물학적 샘플로부터 생성되거나, 합성되거나 기원할 수 있음은 쉽게 자명하다. 상기와 같은 생물학적 샘플은 비제한적으로 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항-종양 효과"란 용어는 종양 부피의 감소, 종양 세포수의 감소, 전이수의 감소, 기대수명의 증가, 또는 암성 병증과 관련된 다양한 생리학적 증상들의 개선에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항-종양 효과"는 또한 애초에 종양 발생의 예방에서 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
"자가-항원"이란 용어는 본 발명에 따라, 외래의 것으로서 면역계에 의해 인식되는 임의의 자기-항원을 의미한다. 자가-항원은 비제한적으로 세포 단백질, 인단백질, 세포 표면 단백질, 세포 지질, 핵산, 당단백질(모든 표면 수용체 포함)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "자가면역 질병"이란 용어는 자가면역 반응으로부터 생성되는 질환으로서 정의된다. 자가면역 질병은 자기-항원에 대한 부적합하고 과도한 반응의 결과이다. 자가면역 질병의 예는 특히, 비제한적으로 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 자가면역 간염, 자가면역 이하선염, 크론병, 당뇨병(I형), 수포성 표피 박리증, 부고환염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 건선, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성 빈혈, 궤양성 대장염을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "자기유래"란 용어는 동일한 개체로부터 기원하여 나중에 다시 상기 개체로 재-도입되는 임의의 물질을 지칭하고자 한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
"이종발생성"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
"이중특이성 친화성 분자"란 어구는 2개의 상이한 결합 특이성을 포함하는 분자를 지칭하며 따라서 2개의 표적, 분자, 또는 항원에 동시에 결합할 수 있다. 상기 이중특이성 친화성 분자는 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인이며, 소분자, 항체 유사물질, 애피바디™, 또는 이들의 임의의 단편을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "이중특이성"은 적어도 2개의 상이한 결합 에피토프에 대한 결합 특이성들을 갖는 분자를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 에피토프는 동일한 결합 파트너로부터의 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 에피토프는 2개의 상이한 결합 파트너로부터의 것이다. 상이한 에피토프들에 대한 이중특이성을 갖는 분자는 이중특이성 항체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "암"이란 용어는 빠르고 통제되지 않는 이상 세포의 성장을 특징으로 하는 질병으로서 정의된다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예는 비제한적으로 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 갑상선암 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "키메릭 항원 수용체" 또는 "CAR"이란 용어는 면역 효과기 세포상에서 발현되도록 조작되고 항원에 특이적으로 결합하는 인공 T 세포 수용체를 지칭한다. CAR은 입양 세포 전달 요법에 의한 요법으로서 사용될 수 있다. T 세포를 환자로부터 제거하고 특정한 형태의 항원에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 CAR은 예를 들어 종양 관련 항원에 대해 특이적으로 발현되었다. CAR은 또한 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 일부 태양에서, CAR은 CD3-제타 막관통 및 세포내 도메인에 융합된, 단쇄 가변 단편(scFv) 유래된 단클론 항체의 융합물을 포함한다. CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드(예를 들어 펩티드)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시태양에서, CAR은 종양 관련 항원에 특이적인 CAR을 발현하는 T 세포의 특이성을 재지시함으로써 암을 표적화할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체" 또는 "CLEAR"은 적어도 리간드 인식을 위한 세포외 도메인 및 T 세포내 활성화 신호 도입을 위한 세포내 도메인으로 구성된 조작된 수용체를 지칭한다. 상기 CLEAR을 종양 또는 바이러스 항원 또는 다른 분자에 결합하는 세포외 도메인을 포함하도록 조작할 수 있는 반면, 상기 세포내 도메인은 상기 수용체의 세포외 도메인에 리간드 또는 항원의 결합 후 상기 T 세포내에 활성화 신호를 제공한다.
"키메릭 막 단백질"이란 용어는 하나 이상의 신호전달 및/또는 수용체 분자로부터 유래하거나 상기를 활성화할 수 있는 세포외 도메인 및 세포내 도메인을 갖는 조작된 막 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메릭 막 단백질은 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "보존적 서열 변형"이란 용어는 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 현저하게 영향을 미치거나 상기 특징을 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하고자 한다. 상기와 같은 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형을 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위-지향된 변이도입 및 PCR-매개된 변이도입에 의해 본 발명의 항체에 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 계열이 당해 분야에서 정의되었다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산들을 포함한다. 따라서, 항체의 CDR 영역내의 하나 이상의 아미노산 잔기들을 동일한 측쇄 계열로부터의 다른 아미노산 잔기들로 치환시킬 수 있으며 상기 변경된 항체를 본 명세서에 기재된 기능 분석을 사용하여 항원에 결합하는 능력에 대해 시험할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어로서 "보조-자극 리간드"는 T 세포상의 동족 보조-자극 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들어 TCR/CD3 복합체와 펩티드가 부하된 MHC 분자와의 결합에 의해 제공된 1차 신호 외에, T 세포 반응, 예를 들어 비제한적으로 증식, 활성화, 분화 등을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포(예를 들어 APC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 보조-자극 리간드는 비제한적으로 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 보조자극 리간드(ICOS-L), 세포내 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프독소 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드 수용체에 결합하는 작용물질 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있다. 보조-자극 리간드는 또한 특히, T 세포상에 존재하는 보조-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 비제한적으로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
"보조-자극 분자"는 보조-자극 리간드와 특이적으로 결합하여, T 세포에 의한 보조-자극 반응, 예를 들어 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 보조-자극 분자는 비제한적으로 MHC I 부류 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "보조-자극 신호"는 TCR/CD3 결찰과 같은 1차 신호와 함께, T 세포 증식 및/또는 핵심 분자의 상향조절 또는 하향조절을 유도하는 신호를 지칭한다.
"로부터 유래된"이란 용어는 특정 공급원으로부터 생성되거나, 합성되거나 기원함을 지칭하며, 따라서 유래된 물질은 공급원과 관련된다. 상기 유래된 물질은 상기 특정한 공급원과 일치할 필요는 없다. 하나의 실시태양에서, 항원은 단백질로부터 유래된다. 또 다른 실시태양에서, 단쇄 가변 단편은 단클론 항체로부터 유래된다.
"질병"은, 동물이 항상성을 유지할 수 없고 상기 질병이 개선되지 않는다면 상기 동물의 건강이 계속해서 나빠지는 상기 동물의 건강 상태이다. 대조적으로, "질환"은 동물이 항성성을 유지할 수 있지만, 상기 질환이 없는 경우보다는 덜 유리한 상기 동물의 건강 상태이다. 치료되지 않고 방치되는 경우, 질환은 상기 동물의 건강 상태의 추가적인 감소를 반드시 야기하지는 않는다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 특정한 생물학적 결과를 성취하거나 치료학적 또는 예방학적 이득을 제공하기에 유효한 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 상기와 같은 결과는 비제한적으로 당해 분야에 적합한 임의의 수단에 의해 측정될 수 있는 항-종양 활성을 포함할 수 있다.
"암호화"는 뉴클레오티드(즉 rRNA, tRNA 및 mRNA)의 한정된 서열 또는 아미노산의 한정된 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하기 위한, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 유전자, cDNA, 또는 mRNA 중의 뉴클레오티드의 특정 서열의 본래적인 성질 및 상기로부터 생성되는 생물학적 성질을 지칭한다. 따라서, 유전자는 상기 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생성시키는 경우 상기 단백질을 암호화한다. 암호화 가닥(그의 뉴클레오티드 서열은 mRNA 서열에 일치하고 대개는 서열 목록에 제공된다), 및 유전자 또는 cDNA의 전사에 대한 주형으로서 사용되는 비-암호화 가닥을 모두 상기 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로서 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 계 내부로부터 또는 상기 내부에서 생성되는 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 계로부터 도입되거나 또는 상기 밖에서 생성되는 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "증대"란 용어는 T 세포수의 증가에서와 같은 수의 증가를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 생체외에서 증대되는 상기 T 세포는 배양물 중에 원래 존재하는 수에 비해 수가 증가한다. 또 다른 실시태양에서, 생체외에서 증대되는 상기 T 세포는 배양물 중의 다른 세포 유형에 비해 수가 증가한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "생체외"란 용어는 살아있는 유기체(예를 들어 인간)로부터 제거되고 상기 유기체 밖에서(예를 들어 배양 접시, 시험관 또는 생물반응기에서) 번식된 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "발현"이란 용어는 그의 프로모터에 의해 구동된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
"발현 벡터"는 발현시키고자 하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하며; 다른 발현 요소들은 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당해 분야에 공지된 모든 것들, 예를 들어 코스미드, 플라스미드(예를 들어 네이키드 또는 리포솜 중에 함유된) 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스(예를 들어 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
비-인간(예를 들어 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열들)이다. 대개, 인간화된 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱 또한, 인간화된 항체는 상기 수용자 항체 중에서도 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열 중에서도 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 수행성능을 더욱 다듬고 최적화하기 위해 수행된다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 여기에서 상기 CDR 영역 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하고 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 영역들이다. 상기 인간화된 항체는 또한 최적으로, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986]; 문헌[Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988]; 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참조하시오.
"완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원이거나 또는 항체의 인간형과 일치하는 아미노산 서열로 이루어지는 면역글로불린, 예를 들어 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "일치성 (identity)"은 2개의 중합체성 분자, 특히 2개의 아미노산 분자, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 분자간의 서브유닛 서열 일치성을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열이 동일한 위치에서 동일한 잔기를 갖는 경우; 예를 들어 2개의 폴리펩티드 분자 각각 중 하나의 위치가 아르기닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 상기 위치에서 일치한다. 2개의 아미노산 서열이 하나의 정렬에서 동일한 위치에서 동일한 잔기를 갖는 일치성 또는 정도를 종종 비율로서 나타낸다. 2개 아미노산 서열간의 일치성은 합치 또는 일치하는 위치 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어 2개 서열 중 위치들의 절반(예를 들어 10 아미노산 길이 중합체 중 5개 위치)이 일치하는 경우, 상기 두 서열은 50% 일치하며; 상기 위치 중 90%(예를 들어 10 중 9)가 합치되거나 일치하는 경우, 상기 두 아미노산 서열은 90% 일치한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "면역글로불린" 또는 "Ig"란 용어는 항체로서 기능하는 단백질 부류로서 정의된다. B 세포에 의해 발현된 항체를 때때로 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체라 칭한다. 상기 단백질 부류에 포함되는 5개 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다. IgA는 체 분비물, 예를 들어 타액, 눈물, 젖, 위장 분비물 및 호흡 및 비뇨생식관의 점액 분비물 중에 존재하는 1차 항체이다. IgG는 가장 통상적인 순환 항체이다. IgM은 대부분의 피험자에서 1차 면역 반응으로 생성되는 주요 면역글로불린이다. 상기는 응집반응, 보체 결합, 및 다른 항체 반응에 가장 효율적인 면역글로불린이며, 세균 및 바이러스에 대한 방어에 중요하다. IgD는 공지된 항체 기능은 없지만, 항원 수용체로서 작용할 수 있는 면역글로불린이다. IgE는 알레르겐에 노출시 비만 세포 및 호염기성 세포로부터 매개체의 방출을 야기함으로써 즉각적인 과민증을 매개하는 면역글로불린이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "면역 반응"이란 용어는, 림프구가 항원 분자를 이물질로서 확인하고 항체의 형성을 유도하고/하거나 림프구를 활성화시켜 상기 항원을 제거하는 경우 발생하는 항원에 대한 세포 반응으로서 정의된다.
"면역학적 유효량", "항-면역 반응 유효량", "면역 반응-억제 유효량", 또는 "치료량"이란 어구는 피험자(환자)에서 목적하는 결과를 수득하도록 의사에 의해, 임의로 과학자와의 상담에서, 연령, 체중, 면역 반응, 질병/병증의 유형, 및 상기 피험자(환자)의 건강의 개인적인 차이를 고려하여 피험자에게 투여되는 본 발명의 조성물의 양을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "교재"는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 연통하는데 사용될 수 있는 간행물, 기록물, 도해, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교재를 예를 들어 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 부착시키거나 또는 상기 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 발송할 수 있다. 한편으로, 상기 교재를, 상기 교재 및 화합물을 수령자가 협력하여 사용하도록 상기 용기와 별도로 발송할 수도 있다.
"단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물 중에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니고, 그의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드가 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재하거나, 또는 비-천연 환경, 예를 들어 숙주 세포 중에 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "렌티바이러스"는 레트로비리다에 과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있음에 있어서 레트로바이러스 중 독특하며; 상당량의 유전 정보를 상기 숙주 세포의 DNA내로 전달할 수 있고, 따라서 이는 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV가 렌티바이러스의 모든 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체내에서 상당한 수준의 유전자 전달을 성취하는 수단을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "변형된"이란 용어는 본 발명의 분자 또는 세포의 변화된 병증 또는 구조를 의미한다. 분자를 다수의 방식으로, 예를 들어 화학적으로, 구조적으로 및 기능적으로 변형시킬 수 있다. 세포를 핵산의 도입을 통해 변형시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "조절"이란 용어는 치료 또는 화합물 부재하에서의 피험자의 반응 수준에 비해, 및/또는 달리 동일하지만 치료되지는 않은 피험자에서의 반응 수준에 비해, 상기 피험자에서 반응 수준의 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개함을 의미한다. 상기 용어는 고유 신호 또는 반응을 동요시키고/시키거나 영향을 미침으로써 피험자, 바람직하게는 인간에서 이로운 치료 반응을 매개함을 포함한다.
본 발명과 관련하여, 하기의 통상적으로 존재하는 핵산 염기에 대한 약어들이 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 유리딘을 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열들을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이란 어구는 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 추가로 포함할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열들을 포함한다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"작동적으로 연결된"이란 용어는 이종핵산 서열의 발현을 생성시키는 조절 서열과 상기 이종 핵산 서열간의 기능적 결합을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은, 상기 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 놓일 때 상기 제2 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 프로모터는, 상기 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 상기 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, 작동적으로 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 필요한 경우 동일한 판독 프레임 중의 2개의 단백질 암호화 영역에 결합된다.
"과발현된" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과발현"이란 용어는 특정한 조직 또는 기관으로부터의 정상 세포에서의 발현에 비해 환자의 상기 조직 또는 기관내의 고형 종양과 같은 질병 영역으로부터의 세포에서의 종양 항원의 비정상적인 발현 수준을 가리키고자 한다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액암을 갖는 환자는 당해 분야에 공지된 표준 분석에 의해 판정될 수 있다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는 예를 들어 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.) 또는 흉골내 주사, 또는 주입 기법을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오티드"란 용어는 뉴클레오티드의 쇄로서 정의된다. 더욱 또한, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 호환 가능하다. 당해 분야의 숙련가는 핵산이 폴리뉴클레오티드이고, 이는 단량체성 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있다는 일반적인 지식을 갖는다. 상기 단량체성 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 당해 분야에서 입수할 수 있는 임의의 수단, 예를 들어 비제한적으로 재조합 수단, 즉 통상적인 클로닝 기술 및 PCR™ 등을 사용하여 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열의 클로닝에 의해, 및 합성 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어들은 호환 가능하게 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 결합된 아미노산 잔기들로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대수에 대한 제한은 없다. 폴리펩티드는 서로 펩티드 결합에 의해 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 단쇄(또한 당해 분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머라 통상적으로 지칭된다) 및 보다 긴 쇄(일반적으로 당해 분야에서 단백질이라 지칭되며, 다수의 유형이 존재한다) 모두를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히 예를 들어 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 동종 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "프로모터"란 용어는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정한 전사를 개시시키는데 필요한 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프로모터/조절 서열"이란 용어는 상기 프로모터/조절 서열에 작동적으로 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 예에서, 상기 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있으며, 다른 예에서 상기 서열은 또한 인헨서 서열 및 상기 유전자 산물의 발현에 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적인 방식으로 상기 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
"구성" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 상기 유전자 산물이 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건하에서 상기 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"유도성" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 상기 유전자 산물이, 실질적으로 오직 상기 프로모터에 상응하는 유도물질이 세포 중에 존재하는 경우에만 상기 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직-특이성" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 상기 유전자 산물이, 실질적으로 오직 세포가 상기 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 상기 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"신호변환 경로 (signal transduction)"는 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 신호의 전달에 한 역할을 하는 다양한 신호변환 분자들간의 생화학적 관계를 지칭한다. "세포 표면 수용체"란 어구는 신호를 받아 세포의 원형질막을 가로질러 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자들의 복합체를 포함한다. "세포 표면 수용체"의 일례는 인간 FSHR이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "유사성"은 2개의 중합체성 분자들간, 예를 들어 2개의 핵산 분자들, 예를 들어 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자들간, 또는 2개의 폴리펩티드 분자들간의 서브유닛 서열 일치성을 지칭한다. 상기 2개 분자 모두 중의 서브유닛 위치가 동일한 단량체성 서브유닛에 의해 점유되는 경우, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각 중 하나의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 상기 위치에서 유사하다. 2개 서열간의 유사성은 합치 또는 유사한 위치 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어 2개 서열 중 위치들의 절반(예를 들어 10 서브유닛 길이 중합체 중 5개 위치)이 유사한 경우, 상기 두 서열은 50% 유사하며; 상기 위치 중 90%(예를 들어 10 중 9)가 합치되거나 유사한 경우, 상기 두 서브유닛 서열은 90% 유사하다.
"단쇄 항체"는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 단편을 조작된 아미노산의 스팬을 통해 Fv 영역에 연결시키는 재조합 DNA 기법에 의해 형성되는 항체를 지칭한다. 단쇄 항체의 다양한 생성 방법은 공지되어 있다, 예를 들어 미국특허 제 4,694,778 호; 문헌[Bird (1988) Science 242:423-442]; 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 문헌[Ward et al. (1989) Nature 334:54454]; 문헌[Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041]에 기재되어 있다.
"소분자"란 용어는 표적, 예를 들어 분자 또는 항원에 결합하는 능력을 갖는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 아미노산을 갖는 펩티드를 지칭한다. 상기 소분자는 낮은 몰질량, 예를 들어 약 12 kD, 11 kD, 10 kD, 9 kD, 8 kD, 7 kD, 6 kD, 5 kD, 또는 이들 사이 또는 그 이하의 임의의 몰 질량을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 소분자는 친화성 분자 키메릭 수용체의 소분자 세포외 도메인이다. 일부 실시태양에서, 상기 소분자는 이중특이성 친화성 분자의 소분자 결합 도메인이다. 소분자는 표적 및 그의 구조에 결합하는 능력을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 소분자는 적어도 하나의 나선, 예를 들어 알파-나선, 또는 2개의 나선, 3개의 나선 또는 그 이상의 나선을 포함한다. 상기 소분자는 또한 화학적으로 불활성이며 고온, 예를 들어 85 ℃ 이상을 견딜 수 있다.
항체에 관하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "특이적으로 결합하는"이란 용어는, 특정한 항원을 인식하지만 샘플 중 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 하나의 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종으로부터의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 종간 반응성은 그 자체가 항체의 분류를 특이적인 것으로서 변경시키지 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 교차 반응성은 그 자체가 항체의 분류를 특이적인 것으로서 변경시키지 않는다. 일부 예에서, "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 항체, 단백질 또는 펩티드의 제2 화학 종과의 상호작용과 관련하여, 상기 상호작용이 화학 종상의 특정한 구조(예를 들어 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 따라 변함을 의미하는데 사용될 수 있다; 예를 들어 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정한 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리, 표지되지 않은 A)를 함유하는 분자의 존재는 상기 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
"자극"이란 용어는 그의 동족 리간드와 자극 분자(예를 들어 TCR/CD3 복합체)의 결합(이에 의해 신호변환 사건, 예를 들어 비제한적으로 TCR/CD3 복합체를 통한 신호변환을 매개한다)에 의해 유도되는 1차 반응을 의미한다. 자극은 몇몇 분자의 변경된 발현, 예를 들어 TGF-베타의 하향조절, 및/또는 세포골격 구조의 재구성 등을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "자극 분자"란 용어는 항원 제시 세포상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포상의 분자를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "자극 리간드"는 항원 제시 세포(예를 들어 aAPC, 수지상 세포, B-세포 등)상에 존재할 때 T 세포상의 동족 결합 파트너(본 명세서에서 "자극 분자"라 칭함)와 특이적으로 결합하여, 상기 T 세포에 의한 1차 반응, 예를 들어 비제한적으로 면역 반응의 활성화, 개시, 증식 등을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 당해 분야에 주지되어 있으며, 특히 펩티드, 항-CD3 항체, 과작용물질 항-CD28 항체, 및 과작용물질 항-CD2 항체가 부하된 MHC I 부류 분자를 포함한다.
"피험자"란 용어는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어 포유동물)를 포함하고자 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "피험자" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 비-인간 포유동물은 예를 들어 가축 및 애완동물, 예를 들어 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 쥐과 포유동물들을 포함한다. 바람직하게, 상기 피험자는 인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형이 필수적으로 없는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연 상태에서 통상적으로 관련되는 다른 세포 유형들로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 예에서, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 세포의 균일 집단을 지칭한다. 다른 예에서, 상기 용어는 단순히 자연 상태에서 자연적으로 관련되는 다른 세포 유형들로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합이 발생하기에 충분한 조건하에서 결합 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 영역을 한정하는 게놈 핵산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"이란 용어는 항원의 제시에 반응하여 T 세포의 활성화에 관여하는 막 단백질의 복합체를 지칭한다. 상기 TCR은 주조직적합성 복합체 분자에 결합된 항원의 인식을 담당한다. TCR은 알파(α) 및 베타(β) 쇄의 이종이량체로 구성되지만, 일부 세포에서 상기 TCR은 감마 및 델타(γ/δ)쇄로 이루어진다. TCR은 알파/베타 및 감마/델타 형태로 존재할 수 있으며, 이들 형태는 구조적으로 유사하나 별개의 해부학적 위치 및 기능을 갖는다. 각각의 쇄는 2개의 세포외 도메인, 가변 및 불변 도메인으로 구성된다. 일부 실시태양에서, 상기 TCR은 TCR을 포함하는 임의의 세포, 예를 들어 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 천연 킬러 T 세포, 및 감마 델타 T 세포상에서 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료학적"이란 용어는 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질병 상태의 억제, 경감, 또는 근절에 의해 수득된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"이란 용어는 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 것이다. 상기 세포는 1차 피험자 세포 및 그의 자손을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 질병을 "치료하다"란 용어는 피험자가 겪는 질병 또는 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시킴을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "전사 조절하에서" 또는 "작동적으로 연결된"이란 어구는 프로모터가 폴리뉴클레오티드와 관련하여 정확한 위치 및 배향으로 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시 및 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절함을 의미한다.
"벡터"는, 단리된 핵산을 포함하고 상기 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 다수의 벡터들, 예를 들어 비제한적으로 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친성 화합물과 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스가 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, "벡터"란 용어는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 핵산의 세포내로의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 비제한적으로 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함한다.
범위: 본 명세서 전체를 통해, 본 발명의 다양한 태양들을 범위 포맷으로 제공할 수 있다. 범위 포맷의 기재는 단지 편의성 및 간략성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 완고한 제한으로서 해석해서는 안 됨은 물론이다. 상응하게, 범위에 대한 기재는 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 수치들을 구체적으로 개시하는 것으로 간주해야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 구체적으로 개시된 하위범위뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이를 상기 범위의 폭과 관계없이 적용한다.
설명
본 발명은 이중특이성 항체를 발현할 수 있는 변형된 T 세포를 생성시키기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 변형된 T 세포를 생성시키기 위한 방법을 포함한다. 다른 실시태양은 변형된 T 세포 또는 변형된 T 세포의 집단을 포함한다. 상기 이중특이성 항체는 표적 세포상의 항원 및 활성화 T 세포상의 항원, 예를 들어 CD3, CD4, CD8 및 TCR에 대한 이중특이성을 포함한다.
T 세포 수용체
본 발명은 외인성 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포를 포함한다. 하나의 태양에서, 본 발명은 T 세포의 집단을 증대시키고, 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 상기 증대된 T 세포내로 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함한다. 상기 실시태양에서, 상기 T 세포는 상기 변형된 TCR을 발현할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 T 세포의 집단을 증대시키고, 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 상기 증대된 T 세포내로 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함한다. 상기 실시태양에서, 상기 T 세포는 상기 변형된 TCR을 발현할 수 있다.
T 세포 수용체는 항원의 제시에 반응하여 T 세포의 활성화에 관여하는 막 단백질의 복합체이다. 상기 TCR의 자극은, 상기 T 세포에 항원 펩티드를 제공하고 상기 TCR 복합체에 결합하여 일련의 세포내 신호전달 캐스케이드를 유도하는 항원 제시 세포상의 주조직적합성 복합체 분자(MHC)에 의해 촉발된다.
상기 TCR은 일반적으로 리간드 인식을 맡고 있는 TCR 이종이량체를 형성하는 6개의 상이한 막 결합된 쇄들로 구성된다. TCR은 알파/베타 및 감마/델타형으로 존재하며, 이들은 구조적으로 유사하나 별개의 해부학적 위치 및 기능을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 TCR 알파 및 베타쇄를 포함한다, 예를 들어 상기 TCR을 암호화하는 핵산은 TCR 알파 및 TCR 베타쇄를 암호화하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 알파 또는 베타쇄 또는 이둘 모두는 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함한다.
각각의 쇄는 2개의 세포외 도메인, 가변 및 불변 도메인으로 구성된다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 적어도 하나의 쥐 불변 영역을 포함한다. 상기 불변 도메인은 세포막에 이어서 막관통 도메인 및 짧은 세포질 꼬리에 인접한다. 하나의 실시태양에서, 상기 보조-자극 신호전달 도메인은 4-1BB 보조-자극 신호전달 도메인이다. 상기 가변 도메인은 상기 TCR이 결합 특이성을 갖는 특정한 항원 및 MHC 분자의 결정에 기여한다. 차례로, 독특한 항원-MHC 복합체에 대한 T 세포의 특이성은 상기 T 세포에 의해 발현된 특정한 TCR 중에 존재한다.
상기 불변 및 가변 도메인은 각각 쇄-내 디설파이드 결합을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, TCR은 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함한다. 상기 가변 도메인은 항체의 상보성 결정 영역(CDR)에 유사한 고도의 다형태성 루프를 포함한다. TCR 서열의 다양성은 연결된 가변(V), 다양성(D), 결합(J) 및 불변 유전자의 체세포 재배열을 통해 생성된다.
기능적 알파 및 감마쇄 폴리펩티드는 재배열된 V-J-C 영역에 의해 형성되는 반면, 베타 및 델타쇄는 V-D-J-C 영역으로 이루어진다. 상기 세포외 불변 도메인은 막 근위 영역 및 면역글로불린 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 야생형 TCR, 고 친화성 TCR, 및 키메릭 TCR을 포함한다. 상기 TCR이 변형되는 경우, 상기는 야생형 TCR보다 표적 세포 항원에 대해 더 높은 친화성을 가질 수 있다. 상기 TCR이 키메릭 TCR인 실시태양에서, 상기 TCR은 키메릭 도메인을 포함할 수 있다, 예를 들어 상기 TCR은 상기 쇄들 중 적어도 하나의 C' 말단에서 보조-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 TCR은 변형된 쇄, 예를 들어 변형된 알파 또는 베타쇄를 포함할 수 있다. 상기와 같은 변형은 비제한적으로 N-탈글리코실화, 변경된 도메인(예를 들어 특정한 항원을 표적화하거나 친화성을 증가시키도록 조작된 가변 영역), 하나 이상의 디설파이드 결합의 부가, 상이한 종들로부터 유래된 쇄 전체 또는 그의 단편, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표적 세포 관련된 항원의 예는 본 명세서의 다른 어딘가에 기재되어 있으며, 이들은 모두 본 발명의 TCR에 의해 표적화될 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 전기천공된 RNA를 포함하는 변형된 T 세포의 집단을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포의 집단은 상기 TCR RNA로 전기천공 전에 증대되었다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 외인성 핵산; 및 보조자극 분자를 암호화하는 전기천공된 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 TCR 및 보조-자극 분자를 발현한다. 상기 보조-자극 분자는 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 외인성 핵산; 및 보조자극 분자를 암호화하는 전기천공된 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 TCR 및 보조-자극 분자를 발현한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 전기천공된 RNA를 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포 수용체(TCR)는 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하고 상기 T 세포는 상기 TCR RNA로 전기천공 전에 증대되었다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 전기천공된 RNA를 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 변형된 T 세포 수용체(TCR)는 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하고 상기 T 세포는 상기 TCR RNA로 전기천공 전에 증대되었다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 증대된 T 세포내에 도입시킴을 포함한다. 상기 실시태양에서, 상기 T 세포는 상기 변형된 TCR을 발현할 수 있다.
T 세포 수용체를 조작하고 발현시키기 위한 기법들은 비제한적으로, 각각의 서브유닛들을 연결하는 고유 디설파이드 가교를 포함하는 TCR 이종이량체의 생성을 포함한다(Garboczi, et al., (1996), Nature 384(6605): 134-41; Garboczi, et al., (1996), J Immunol 157(12): 5403-10; Chang et al., (1994), PNAS USA 91: 11408-11412; Davodeau et al., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460; Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; 미국특허 제 6,080,840 호).
하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 표적 세포 항원에 대한 특이성을 포함한다. 상기 표적 세포 항원은 표적 세포와 관련된 임의의 유형의 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 세포 항원은 상기 표적 세포의 특정 질병 상태를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서 상기 TCR의 항원 결합 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역 질병 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 임의의 종양 관련 항원(TAA) 및 바이러스 항원, 또는 이들의 임의의 단편을 포함한다.
상기 표적 세포 항원은 주조직적합성 복합체에 의해 가공되고 제공될 수 있는 임의의 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 항원은 특정한 질병 상태와 관련될 수 있다. 따라서, 상기 TCR의 표적으로서 작용할 수 있는 세포 마커의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역 질병 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 표적 항원은 임의의 종양 관련 항원(TAA) 및 바이러스 항원, 또는 이들의 임의의 단편을 포함한다.
이중특이성 항체
본 발명은 이중특이성 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는 2개의 상이한 결합 특이성을 포함하며 따라서 2개의 상이한 항원에 결합한다. 하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 제1 및 제2 단쇄 가변 단편(scFv) 분자를 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 제1 및 제2 scFv는 표적 세포상의 항원 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 제1 scFv 분자는 표적 세포상의 적어도 하나의 항원에 특이적이고 상기 제2 scFv 분자는 활성화 T 세포상의 항원에 특이적이다. 예를 들어, 상기 활성화 T 세포 항원은 CD3, CD4, CD8 또는 TCR에 결합할 수 있다. 이들 예에서, 상기 이중특이성 항체는 T 세포 항원을 인식하며 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE)라 지칭된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 제1 및 제2 scFv는 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 항원에 결합한다. 예를 들어 상기 T 세포 항원은 CLEAR, CD3, CD4, CD8 또는 TCR을 포함할 수 있다. 이들 예에서, 상기 이중특이성 항체는 T 세포 항원, 예를 들어 CD3, CD4, CD8 또는 TCR을 인식하며 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE)라 지칭된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 상기 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 CLEAR에 대한 이중특이성을 포함한다.
그러나, 본 발명은 임의의 특정한 이중특이성 항체의 사용에 의해 제한되지 않는다. 오히려, 임의의 이중특이성 항체 또는 BiTE를 사용할 수 있다. 상기 이중특이성 항체 또는 BiTE 분자는 또한 적어도 하나의 표적 세포 관련 항원에 대한 특이성으로 막 단백질로서 발현될 수 있다. 표적 세포 관련 항원의 예는 본 명세서의 달리 어딘가에 기재되어 있으며, 이들은 모두 본 발명의 이중특이성 항체에 의해 표적화될 수 있다. 인간 및 인간화된 항체의 제조 기법도 또한 본 명세서의 달리 어딘가에 기재되어 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체 또는 BiTE 분자는 이중특이성 항원 결합 도메인을 포함한다. 상기 실시태양에서, 상기 이중특이성 항원 결합 도메인은 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산, 예를 들어 RNA를 포함하는 변형된 T 세포의 집단을 포함한다. 상기 T 세포의 집단을 상기 핵산의 도입 전에 증대시킨다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원 및 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 항체를 암호화하는 전기천공된 mRNA를 포함하는 변형된 T 세포의 집단을 포함한다. 상기 T 세포의 집단을 상기 BiTE 전기천공 전에 증대시켰다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 전기천공된 mRNA를 포함하는 변형된 T 세포를 포함한다. 상기 실시태양에서, 상기 BiTE 분자는 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산, 예를 들어 RNA를 포함하는 변형된 T 세포의 집단을 포함한다. 상기 T 세포의 집단을 상기 핵산의 도입 전에 증대시켰다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 이중특이성 항체를 암호화하는 전기천공된 RNA를 포함하는 변형된 T 세포를 포함한다. 상기 이중특이성 항체는 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함한다. 상기 실시태양은 또한 상기 T 세포를 상기 이중특이성 항체 mRNA로 전기천공 전에 증대시킴을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산, 예를 들어 RNA를 포함하는 변형된 T 세포를 포함한다. 상기 이중특이성 항체는 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 항원, 예를 들어 CLEAR에 대한 이중특이성을 포함한다. 상기 실시태양은 또한 상기 T 세포를 상기 이중특이성 항체 RNA로 전기천공 전에 증대시킴을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 이중특이성 항체, 예를 들어 BiTE 분자를 암호화하는 mRNA로 상기 증대된 T 세포를 전기천공시킴을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 이중특이성 항체, 예를 들어 BiTE 분자를 암호화하는 핵산을 갖는 상기 증대된 T 세포를 도입시킴을 포함한다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 T 세포는 상기 이중특이성 항체를 발현할 수 있다. 이중특이성 항체의 조작 및 발현 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)]을 참조하시오), 및 "구멍에 손잡이" 공학(예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호를 참조하시오)을 포함한다. 다중-특이성 항체를 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위한 정전기적 스티어링 효과의 공학(WO 2009/089004A1); 2개 이상 항체 또는 단편의 가교결합(예를 들어 미국특허 제 4,676,980 호, 및 문헌[Brennan et al., Science 229:81 (1985)]을 참조하시오); 이중특이성 항체를 생성시키기 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들어 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]을 참조하시오); 이중특이성 항체 단편의 제조를 위한 "2가 항체 절편" 기술의 사용(예를 들어 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]을 참조하시오); 및 단쇄 Fv(scFv) 이량체의 사용(예를 들어 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조하시오); 및 예를 들어 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이성 항체의 제조에 의해 제조할 수 있다. 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체("옥토퍼스 항체" 포함)가 또한 본 명세서에 포함된다(예를 들어 US2006/0025576A1을 참조하시오). 이중특이성 항체를, 2개의 상이한 항체 또는 그의 부분들을 연결시킴으로써 구성할 수 있다. 예를 들어 이중특이성 항체는 2개의 상이한 항체로부터의 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 sdAb를 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체 및/또는 BiTE 분자는 제1 및 제2 단쇄 가변 단편(scFv) 분자를 포함하는 이중특이성 항원 결합 도메인을 포함한다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 이중특이성 항원 결합 도메인은 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함할 수 있다, 예를 들어 상기 제1 scFv 분자는 표적 세포상의 적어도 하나의 항원에 대해 특이적이고 상기 제2 scFv 분자는 T 세포상의 적어도 항원에 특이적이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항원 결합 도메인은 표적 세포상의 항원 및 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함할 수 있다, 예를 들어 상기 제1 scFv 분자는 표적 세포상의 적어도 하나의 항원에 특이적이고 상기 제2 scFv 분자는 활성화 T 세포상의 적어도 하나의 항원에 특이적이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 막 단백질로서 발현된다.
하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 표적 세포 항원에 대한 특이성을 포함한다. 상기 표적 세포 항원은 상기 T 세포 수용체가 결합하는 동일한 표적 세포 항원을 포함하거나 상이한 표적 세포 항원을 포함할 수 있다. 상기 표적 세포 항원은 상기 표적 세포를 한정하는 임의의 유형의 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 세포 항원은 특정한 질병 상태와 관련된 표적 세포상의 세포 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서 BiTE 분자 중의 항원 부분 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 마커의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역 질병 및 암세포와 관련된 것들을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 임의의 종양 관련 항원(TAA) 및 바이러스 항원, 또는 그의 임의의 단편을 포함한다. 상기 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체 및/또는 BiTE 분자는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 상기 활성화 T 세포 항원의 예는 종양 항원, 바이러스 항원, 및 그의 단편을 포함할 수 있다. 상기 표적 세포 항원의 예는 종양 항원, 바이러스 항원 및 그의 단편을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체 및/또는 BiTE 분자는 활성화 T 세포상의 적어도 하나의 항원에 대한 특이성을 포함한다. 상기 활성화 T 세포 항원은 또 다른 세포를 활성화시킬 수 있는 T 세포의 표면상에 발견된 항원들을 포함한다. 상기 활성화 T 세포 항원은 보조-자극 분자를 포함할 수 있다. 보조자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 상기와 같은 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 다른 보조자극 요소들이 또한 본 발명의 범위내에 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 활성화 T 세포 항원은 CD3, CD4, CD8, T 세포 수용체(TCR), 또는 이들의 임의의 단편이다. 상기 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체 및/또는 BiTE 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 상기 활성화 T 세포 항원의 예는 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-TCR, 및 이들의 단편을 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체 및/또는 BiTE 분자는 상기 T 세포상의 적어도 하나의 항원에 대한 특이성을 포함한다. 상기 T 세포 항원은 상기 T 세포의 표면상에 발견된 항원, 예를 들어 CLEAR을 포함한다. 상기 T 세포 항원은 보조자극 신호 또는 도메인을 포함할 수 있다. 보조자극 신호 또는 도메인은 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자로부터의 것이다. 상기와 같은 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 다른 보조자극 요소들이 또한 본 발명의 범위내에 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체는 상기 표적 세포상의 항원 및 상기 T 세포상의 CLEAR에 대한 이중특이성을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포 항원은 CD3, CD4, CD8, T 세포 수용체(TCR), 또는 이들의 임의의 단편이다. 상기 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체 및/또는 BiTE 분자는 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 상기 활성화 T 세포 항원의 예는 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-TCR, 및 이들의 단편을 포함할 수 있다.
친화성 분자 키메릭 수용체
본 발명은 친화성 분자 키메릭 수용체를 갖는 변형된 T 세포를 포함한다. 하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 T 세포의 집단에 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 발현할 수 있다.
상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 일반적으로 항원 인식을 위한 소분자 세포외 도메인, 예를 들어 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 세포외 도메인으로 구성된다. 일부 실시태양에서, 상기 소분자 세포외 도메인은 항체 유사물질로부터의 것이다. 상기 이중특이성 친화성 분자의 소분자 세포외 도메인은 일반적으로 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 아미노산을 갖는 펩티드이다. 상기 소분자 세포외 도메인의 몰 질량은 단일-도메인 항체 미만, 예를 들어 약 10 kD 미만일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 약 10 kD 미만의 소분자 세포외 도메인을 포함한다. 상기 소분자 세포외 도메인의 몰 질량은 약 12 kD, 11 kD, 10 kD, 9 kD, 8 kD, 7 kD, 6 kD, 5 kD 미만, 또는 이들 사이 또는 그 이하의 임의의 몰 질량일 수 있다. 상기 소분자 세포외 도메인은 또한 디설파이드 가교가 없는 나선 구조를 추가로 포함할 수 있다. 일부 소분자 세포외 도메인은 적어도 하나의 알파-나선, 2개의 알파-나선, 3개의 알파-나선 또는 그 이상의 나선을 포함한다. 상기 소분자 세포외 도메인은 또한 화학적으로 불활성일 수 있으며 고온, 예를 들어 85 ℃ 이상을 견딜 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 신호전달 도메인; 막관통 도메인, 예를 들어 CD8 막관통 도메인; 및 보조-자극 도메인, 예를 들어 4-1BB 보조-자극 도메인을 추가로 포함한다.
상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 또한 T 세포 수용체(TCR)를 기본으로 할 수 있다. 상기 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체는 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인, TCR 가변 도메인, 및 TCR 불변 도메인을 포함한다. 상기 TCR 가변 도메인은 알파 또는 베타쇄, 또는 이 두 쇄의 키메릭으로부터 유래될 수 있다. 마찬가지로, 상기 TCR 불변 도메인은 알파 또는 베타쇄, 또는 이 두 쇄의 키메릭으로부터 유래될 수 있다. 상기 불변 및 가변 도메인은 각각 쇄-내 디설파이드 결합을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, TCR은 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함한다. 상기 가변 도메인은 항체의 상보성 결정 영역(CDR)에 상동성인 고도의 다형태성 루프를 포함한다. 상기 TCR 서열의 다양성은 결합된 가변(V), 다양성(D), 결합(J) 및 불변 유전자의 체세포 재배열을 통해 생성된다.
표적 세포 관련 항원의 예는 본 명세서의 다른 어딘가에 기재되어 있으며, 이들은 모두 본 발명의 친화성 분자 키메릭 수용체에 의해 표적화될 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포의 집단을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포의 집단은 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 발현한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 발현한다.
하나의 실시태양에서, 상기 소분자 세포외 도메인은 표적 세포 항원에 대한 특이성을 포함한다. 상기 표적 세포 항원은 표적 세포와 관련된 임의의 유형의 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 세포 항원은 상기 표적 세포의 특정 질병 상태를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서 항원에 대한 소분자 세포외 도메인에 결합하는 작용을 할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역 질병 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 임의의 종양 관련 항원(TAA) 및 바이러스 항원, 또는 이들의 임의의 단편을 포함한다.
상기 표적 세포 항원은 주조직적합성 복합체에 의해 가공되고 제공될 수 있는 임의의 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 항원은 특정한 질병 상태와 관련될 수 있다. 따라서, 상기 TCR의 표적으로서 작용할 수 있는 세포 마커의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역 질병 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 임의의 종양 관련 항원(TAA) 및 바이러스 항원, 또는 이들의 임의의 단편을 포함한다.
이중특이성 친화성 분자
본 발명은 또한 이중특이성 친화성 분자를 포함한다. 이중특이성 친화성 분자는 2개의 상이한 결합 특이성을 포함하며 따라서 2개의 표적, 분자, 또는 항원에 결합할 수 있다. 하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 세포를 포함한다. 상기 실시태양에서, 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 세포는 상기 이중특이성 친화성 분자를 발현한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 활성화 T 세포 및 표적 세포는 상기 이중특이성 친화성 분자와 결합한다.
상기 이중특이성 친화성 분자의 어느 한 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 따라서 상기 소분자 항원 결합 도메인은 상기 표적 세포 항원 또는 상기 활성화 T 세포 항원에 대한 친화성을 가질 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인은 상기 소분자 항원 결합 도메인, 및 항체의 항원 결합 도메인으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인은 상기 소분자 항원 결합 도메인, 및 항체의 항원 결합 도메인으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 친화성 분자는 상기 표적 세포 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 항원 결합 도메인, 및 상기 활성화 T 세포 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 항원 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 친화성 분자는 상기 표적 세포 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 항원 결합 도메인, 및 상기 활성화 T 세포 항원에 대한 친화성을 갖는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 친화성 분자는 상기 표적 세포 항원에 대한 친화성을 갖는 항체의 항원 결합 도메인, 및 상기 활성화 T 세포 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 이중특이성 친화성 분자의 소분자 항원 결합 도메인은 항체 유사물질 또는 그의 단편을 포함한다. 상기 이중특이성 친화성 분자의 소분자 항원 결합 도메인은 일반적으로 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 아미노산을 갖는 펩티드이다. 상기 소분자의 몰 질량은 단일-도메인 항체 미만, 예를 들어 약 10 kD 미만일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 친화성 분자는 약 10 kD 미만의 소분자 항원 결합 도메인을 포함한다.
상기 친화성 도메인이 소분자 항원 결합 도메인인 경우, 상기 소분자는 약 12 kD, 11 kD, 10 kD, 9 kD, 8 kD, 7 kD, 6 kD, 5 kD 미만의 몰 질량, 또는 이들 사이 또는 그 이하의 임의의 몰 질량을 가질 수 있다. 상기 표적 세포 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 항원 결합 도메인의 몰 질량은 상기 활성화 T 세포 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 항원 결합 도메인의 몰 질량보다 크거나 작을 수 있다. 상기 소분자 항원 결합 도메인은 또한 디설파이드 가교가 없는 나선 구조를 포함할 수 있다. 일부 소분자 항원 결합 도메인은 적어도 하나의 알파-나선, 2개의 알파-나선, 3개의 알파-나선 또는 그 이상의 나선을 포함한다. 상기 소분자 항원 결합 도메인은 또한 화학적으로 불활성일 수 있으며 고온, 예를 들어 85 ℃ 이상을 견딜 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산은 상기 친화성 도메인들 사이에 링커 또는 이격자 (spacer)를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "링커" 또는 "이격자"란 용어는 일반적으로 하나의 친화성 도메인을 또 다른 도메인에, 상기 소분자 항원 결합 도메인을 또 다른 소분자 항원 결합 도메인에, 또는 상기 소분자 항원 결합 도메인을 상기 항체 항원 결합 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이격자 또는 링커는 300 아미노산 이하, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산, 및 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명은 단지 특정한 친화성 도메인의 사용에 의해 제한되지 않는다. 오히려, 임의의 친화성 도메인을 사용할 수 있다. 상기 이중특이성 친화성 분자는 또한 적어도 하나의 표적 세포 항원에 대한 특이성으로 막 단백질로서 발현될 수 있다. 표적 세포 관련 항원의 예는 본 명세서의 달리 어딘가에 기재되어 있으며, 이들은 모두 본 발명의 이중특이성 친화성 분자에 의해 표적화될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 친화성 분자는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 인간 및 인간화된 항체 또는 그의 단편의 제조 기법도 또한 본 명세서의 달리 어딘가에 기재되어 있다. 상기 실시태양에서, 상기 항체 항원 결합 도메인은 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 세포의 집단을 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 세포의 집단은 상기 이중특이성 친화성 분자를 발현한다. 상기 변형된 세포의 집단은 림프구, 예를 들어 T 세포, B 세포, 또는 천연 킬러 세포; 항원 제시 세포, 또는 비-림프구를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포의 집단은 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 또는 항원 제시 세포를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 세포를 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 세포는 상기 이중특이성 친화성 분자를 발현한다. 상기 변형된 세포는 림프구, 예를 들어 T 세포, B 세포, 또는 천연 킬러 세포; 항원 제시 세포, 또는 비-림프구 중에서 선택될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포는 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 또는 항원 제시 세포이다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 세포의 집단에 도입시킴을 포함하는 변형된 세포의 생성 방법을 포함한다. 상기 실시태양에서, 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 세포는 상기 이중특이성 친화성 분자를 발현한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포의 집단은 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 또는 항원 제시 세포를 포함한다. 이중특이성 친화성 분자의 조작 및 발현 기법은 비제한적으로 애피바디™ 분자의 공학(문헌[Lofblom et. al., FEBS Letters 584: 2670 (2010)]; 문헌[Feldwisch et. al., J Mol Biol, 398(2): 232 (2010)]; 미국특허 제 8,501,909 호, 미국특허 제 8,426,557 호, 미국특허 제 8,247,375 호, 및 미국특허 제 7,993,650 호; 및 미국 공보 제 2014/0295521 호를 참조하시오), 및 "구멍에 손잡이" 공학(예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호를 참조하시오)을 포함한다. 다중-특이성 항체를 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위한 정전기적 스티어링 효과의 공학(WO 2009/089004A1); 2개 이상 항체 또는 단편의 가교결합(예를 들어 미국특허 제 4,676,980 호, 및 문헌[Brennan et al., Science 229:81 (1985)]을 참조하시오); 이중특이성 항체를 생성시키기 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들어 문헌[Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]을 참조하시오); 이중특이성 항체 단편의 제조를 위한 "2가 항체 절편" 기술의 사용(예를 들어 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]을 참조하시오); 및 단쇄 Fv(scFv) 이량체의 사용(예를 들어 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조하시오); 및 예를 들어 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이성 항체의 제조에 의해 제조할 수 있다. 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체("옥토퍼스 항체" 포함)가 또한 본 명세서에 포함된다(예를 들어 US2006/0025576A1을 참조하시오). 이중특이성 항체를, 2개의 상이한 항체 또는 그의 부분들을 연결시킴으로써 구성할 수 있다. 예를 들어 이중특이성 친화성 분자의 친화성 도메인 중 하나는 항체로부터의 Fab, F(ab')2, Fab', scFv 및 sdAb를 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 친화성 분자는 표적 세포 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함한다. 상기 표적 세포 항원은 상기 표적 세포를 한정하는 임의의 유형의 리간드 또는 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 세포 항원은 특정한 질병 상태와 관련되고 표적 세포상의 세포 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서 표적 세포 항원의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 병든 상태, 자가면역 질병 및 암세포와 관련된 것들을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 표적 세포 항원은 임의의 종양 관련 항원(TAA), 세균 항원, 기생충 항원, 바이러스 항원, 또는 그의 임의의 단편을 포함한다. 상기 친화성 도메인이 항체의 항원 결합 도메인인 경우, 항체의 항원 결합 도메인은 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 친화성 분자는 활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함한다. 상기 활성화 T 세포 항원은 또 다른 세포를 활성화시킬 수 있는 T 세포의 표면상에 발견된 항원들을 포함한다. 상기 활성화 T 세포 항원은 보조-자극 분자를 포함할 수 있다. 보조자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 상기와 같은 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 다른 보조자극 요소들이 또한 본 발명의 범위내에 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 활성화 T 세포 항원은 CD3, CD4, CD8, T 세포 수용체(TCR), 또는 이들의 임의의 단편이다. 상기 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체 및/또는 BiTE 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 상기 활성화 T 세포 항원의 예는 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-TCR, 및 이들의 단편을 포함할 수 있다.
키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체
본 발명은 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체를 갖는 T 세포를 포함한다. 하나의 태양에서, 본 발명은 T 세포의 집단을 증대시키고, 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산을 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함한다. 상기 실시태양에서, 상기 T 세포는 상기 CLEAR을 발현할 수 있다.
상기 CLEAR은 일반적으로 리간드 인식을 위한 세포외 도메인 및 활성화 신호전달을 위한 세포내 도메인으로 구성된다. 하나의 실시태양에서, 상기 CLEAR은 세포내 활성화 도메인 및 세포외 도메인을 포함한다.
상기 세포외 도메인은 항체, 수용체, 리간드, 또는 다른 결합 분자에 의한 인식을 위해 조작될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 종양 항원 또는 분자에 특이적으로 결합하나, 통상적으로는 건강한 세포 또는 조직에 의해서는 발현되지 않는다. 종양 항원 또는 비정상 분자의 예는 비제한적으로 바이러스, 세균 및 기생충 항원, 종양 관련 항원(TAA), 또는 이들의 임의의 단편을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 항체의 항원 결합 도메인, 수용체의 리간드 결합 도메인, 항원 또는 리간드 중에서 선택된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 CD27, CD28, CD70, CD80, PD1, 또는 PD-L1 중에서 선택된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 종양 항원에 결합할 수 있다.
상기 세포내 도메인을 상기 T 세포내에 활성화 신호를 제공하도록 조작할 수 있다. 세포내 도메인의 예는 비제한적으로 CD3, 보조-자극 신호가 있거나 없는 CD3제타, CD28, CD4, CD8, 4-1BB, TCR 알파 및/또는 베타쇄로부터의 세포내 도메인, 또는 이들 세포내 도메인 중 어느 하나의 단편을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포내 활성화 도메인은 CD3 제타의 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포내에 제공된 활성화 신호는 상기 T 세포의 생육, 시토카인 생성, 용해 활성, 및 다른 활성들을 유도하는 양성 신호일 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포내에 제공된 활성화 신호는 상기 T 세포내의 활성을 정지시키는, 예를 들어 생육을 억제하고, 노화 및/또는 아네르기를 유도하고, 시토카인 생성을 억제하고, 상기 T 세포의 다른 활성들을 정지시키는 음성 신호일 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 CLEAR은 보조-자극 도메인을 포함한다. 분자로부터의 보조-자극 도메인은 비제한적으로 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 다른 보조자극 요소들이 또한 본 발명의 범위내에 있다.
보조-자극 분자
하나의 실시태양에서, 본 발명의 변형된 T 세포는 보조-자극 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하며, 따라서 상기 변형된 T 세포는 상기 보조-자극 분자를 발현한다. 상기 핵산을, 상기 T 세포의 형질도입, 상기 T 세포의 형질감염, 또는 상기 T 세포의 전기천공에 의해 상기 T 세포내에 도입시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 보조-자극 분자는 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L 중에서 선택된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 보조-자극 분자는 CD3이고, CD3은 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄, 예를 들어 CD3 제타 및 CD3 입실론쇄를 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 상기 보조-자극 분자, 예를 들어 CD3을 암호화하는 RNA를 상기 T 세포 또는 세포내에 전기천공시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 보조자극 분자를 암호화하는 핵산, 예를 들어 CD3 RNA를 또 다른 핵산, 예를 들어 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산 또는 RNA로 동시-전기천공시킨다.
또 다른 실시태양에서, 상기 TCR은 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로부터의 적어도 하나의 도메인 중에서 선택된 보조-자극 도메인을 포함하도록 변형된다.
핵산의 도입
핵산을 세포내에 도입시키는 방법은 물리적, 생물학적 및 화학적 방법을 포함한다. 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 RNA를 숙주 세포내에 도입시키는 물리적 방법은 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션, 유전자총, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. RNA를 전기천공(아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector)-II(아막사 바이오시스템스(Amaxa Biosystems), 독일 쾰른 소재)), (ECM 830 (BTX) (하바드 인스트루먼츠(Harvard Instruments) 미국 매사추세츠주 보스톤 소재) 또는 진 펄서(Gene Pulser) II(바이오래드(BioRad), 미국 콜로라도주 덴버 소재), 멀티포레이터(Multiporator)(에펜도르프(Eppendort), 독일 함부르크 소재)을 포함하는 상업적으로 입수할 수 있는 방법들을 사용하여 표적 세포내에 도입시킬 수 있다. RNA를 또한 리포펙션을 사용하는 양이온성 리포솜 매개된 형질감염을 사용하거나, 중합체 캡슐화를 사용하거나, 펩티드 매개된 형질감염을 사용하거나, 또는 유전자총법 입자 전달 시스템, 예를 들어 "유전자 총"을 사용하여 세포에 도입시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)]을 참조하시오).
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내에 도입시키기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터가 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되고 있다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 단순 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,350,674 호 및 미국특허 제 5,585,362 호를 참조하시오.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내에 도입시키기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예를 들어 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중 유적형 유화액, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜(예를 들어 인공 멤브레인 소낭)이다.
사용에 적합한 지질을 상업적인 출처로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")을 시그마(Sigma)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")를 K&K 레보라토리즈(미국 뉴욕주 플레인뷰 소재)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤("Choi")을 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질들을 아반티 폴라 리피즈 인코포레이티드(Avanti Polar Lipids, Inc.)(미국 알라바마주 버밍햄 소재)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 모액을 약 -20 ℃에서 보관할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발되기 때문에 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸고 있는 지질 2층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단층 및 다층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 2층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소낭 구조를 가짐을 특징으로 할 수 있다. 다층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질층을 갖는다. 상기는 인지질이 과잉의 수용액 중에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 상기 지질 성분은 폐쇄된 구조의 형성 전에 자기-재배열을 겪고 상기 지질 2층 사이에 물 및 용해된 용질을 포집한다(Ghosh et al, 1991 Glycobiology 5:505-10). 그러나, 통상적인 소낭 구조보다 용액 중에 상이한 구조를 갖는 조성이 추가로 포함된다. 예를 들어, 상기 지질은 미셀 구조를 띠거나 또는 단지 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재한다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산의 숙주 세포내로의 도입 또는 달리 본 발명의 억제제에의 세포의 노출에 사용되는 방법과 관계 없이, 상기 숙주 세포 중의 핵산의 존재를 확인하기 위해서, 다양한 분석들을 수행할 수 있다. 상기와 같은 분석은 예를 들어 당해 분야의 숙련가들에게 주지된 "분자 생물학적" 분석, 예를 들어 서던 및 노던 블럿팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 분석, 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블럿)에 의한 또는 본 발명의 범위내에 속하는 작용제들을 확인하기 위해 본 명세서에 기재된 분석들에 의한 특정 펩티드의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 상기 T 세포내에 도입시킨다. 상기 핵산을 임의의 수단, 예를 들어 상기 증대된 T 세포의 형질도입, 상기 증대된 T 세포의 형질감염, 및 상기 증대된 T 세포의 전기천공에 의해 도입시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 친화성 분자 키메릭 수용체 또는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 세포 집단의 형질도입, 세포 집단의 형질감염, 및 세포 집단의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 도입시킨다.
또 다른 실시태양에서, 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을, 세포 집단의 형질도입, 세포 집단의 형질감염, 및 세포 집단의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 세포의 집단내에.
더욱 또 다른 실시태양에서, 이중특이성 항체, 예를 들어 BiTE 분자를 암호화하는 핵산을 상기 T 세포내에 도입시킨다. 상기 핵산을 임의의 수단, 예를 들어 증대된 T 세포의 형질도입, 증대된 T 세포의 형질감염, 및 증대된 T 세포의 전기천공에 의해 도입시킬 수 있다.
RNA
하나의 실시태양에서, 상기 T 세포내에 도입된 핵산은 RNA이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 RNA는 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 mRNA이다. 상기 RNA를, 폴리머라제 쇄 반응(PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성시킨다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA를 적합한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 사용하여 PCR에 의해 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 전환시킬 수 있다. 상기 DNA의 공급원은 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적합한 공급원일 수 있다. 시험관내 전사에 바람직한 주형은 키메릭 막 단백질이다. 예로서, 상기 주형은 항체, 항체의 단편 또는 항체의 일부를 암호화한다. 또 다른 예로서, 상기 주형은 항체의 단쇄 가변 도메인, 예를 들어 항-CD3을 포함하는 세포외 도메인, 및 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 RNA 키메릭 막 단백질에 대한 주형은 보조-자극 분자에 대한 항체로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 일부로부터 유래된 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 막 단백질을 암호화한다.
PCR을 사용하여 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성시키고, 이어서 상기를 세포내에 도입시킨다. PCR을 수행하는 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머를, 상기 PCR을 위한 주형으로서 사용되는 상기 DNA의 영역들에 실질적으로 상보성인 영역들을 갖도록 설계한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 상보성"은 상기 프라이머 서열 중 염기의 대부분 또는 전부가 상보성이거나, 또는 하나 이상의 염기가 비-상보성이거나, 또는 오합치되는 경우의 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보성인 서열은 PCR에 사용되는 어닐링 조건하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링하거나 하이브리드화할 수 있다. 상기 프라이머를, 상기 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보성이도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 상기 프라이머를 5' 및 3' UTR을 포함하여, 세포에서 통상적으로 전사되는 유전자 부분(개방 판독 프레임)을 증폭시키도록 설계할 수 있다. 상기 프라이머를 또한 특정한 관심 도메인을 암호화하는 유전자의 일부를 증폭시키도록 설계할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하여, 인간 cDNA의 암호화 영역을 증폭시키도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당해 분야에 주지된 합성 방법에 의해 생성된다. "순방향 프라이머"는 증폭시키고자 하는 DNA 서열의 상류인 상기 DNA 주형상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 본 명세서에서 암호화 가닥에 비해 증폭되는 DNA 서열에 대한 5 위치를 지칭하는데 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭시키고자 하는 DNA 서열의 하류인 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 본 명세서에서 암호화 가닥에 비해 증폭되는 DNA 서열에 대한 3' 위치를 지칭하는데 사용된다.
상기 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증진시키는 능력을 갖는 화학적 구조들을 또한 사용할 수 있다. 상기 RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 5' UTR은 길이가 0 내지 3000 뉴클레오티드이다. 상기 암호화 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이를 상이한 방법들, 예를 들어 비제한적으로 상기 UTR의 상이한 영역들에 어닐링하는 PCR용 프라이머의 설계에 의해 변경시킬 수 있다. 상기 접근법을 사용하여, 당해 분야의 통상적인 숙련가는 상기 전사된 RNA의 형질감염에 따른 최적의 번역 효율을 성취하는데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
상기 5' 및 3' UTR은 관심 유전자에 대한 천연의 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 한편으로, 상기 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열을 상기 순방향 및 역방향 프라이머내에 통합시키거나 또는 상기 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가할 수 있다. 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용이 상기 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키기에 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열 중의 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR을 당해 분야에 주지된 UTR의 성질에 기반하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택하거나 설계할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 5' UTR은 상기 내인성 유전자의 코작 서열을 함유할 수 있다. 한편으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR을 상술한 바와 같이 PCR에 의해 부가하는 경우, 공통 코작 서열을 상기 5' UTR 서열의 부가에 의해 재설계할 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사물의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 모든 RNA가 필요한 것 같지는 않다. 다수 mRNA에 대한 코작 서열의 요구는 당해 분야에 공지되어 있다. 다른 실시태양에서 상기 5' UTR은 세포에서 안정한 RNA 게놈을 갖는 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 실시태양에서 다양한 뉴클레오티드 유사체들을 상기 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해서 상기 3' 또는 5' UTR에 사용할 수 있다.
유전자 클로닝의 필요 없이 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해서, 전사 프로모터를 전사시킬 서열의 DNA 주형 상류에 부착시켜야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열을 순방향 프라이머의 5' 단부에 부가하는 경우, 상기 RNA 폴리머라제 프로모터는 전사시키고자 하는 개방 판독 프레임의 PCR 산물 상류에 통합되게 된다. 하나의 실시태양에서, 상기 프로모터는 본 명세서의 달리 어딘가에 기재된 바와 같은 T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 비제한적으로 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오티드 서열들이 당해 분야에 공지되어 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 mRNA는 리보솜 결합, 번역의 개시 및 세포에서 mRNA 안정성을 결정하는 5' 단부 및 3' 폴리(A) 꼬리상의 캡을 모두 갖는다. 환상 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA상에서, RNA 폴리머라제는 진핵생물 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 연쇄체성 생성물을 생성시킨다. 상기 3' UTR의 단부에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 통상적인 크기의 mRNA를 생성시키며, 이는 전사후 폴리아데닐화된다 하더라도 진핵생물 형질감염에 유효하지 않다.
선형 DNA 주형상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 전사물의 3' 단부를 상기 주형의 마지막 염기 이상으로 연장시킬 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).
DNA 주형내로 폴리A/T 신장부의 통상적인 통합 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 야기할 수 있으며, 이는 세균 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 다른 이상으로 매우 오염되는 이유이다. 이는 클로닝 과정을 힘들고 시간 소모적이게 할 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 한다. 이것이 클로닝 없이 폴리A/T 3' 신장부를 갖는 DNA 주형의 구성을 허용하는 방법이 매우 바람직한 이유이다.
상기 전사 DNA 주형의 폴리A/T 분절을, 폴리T 꼬리, 예를 들어 100T 꼬리(크기는 50-5000 T일 수 있다)를 함유하는 역 프라이머를 사용함으로써 PCR 도중에, 또는 임의의 다른 방법, 예를 들어 비제한적으로 DNA 결찰 또는 시험관내 재조합에 의해 PCR 후에 생성시킬 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하며 그의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 폴리(A) 꼬리는 100 내지 5000 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리를 폴리(A) 폴리머라제, 예를 들어 이 콜라이 폴리A 폴리머라제(E-PAP)의 사용으로 시험관내 전사에 따라 추가로 연장시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100 뉴클레오티드에서 300 내지 400 뉴클레오티드로 증가시키는 것은 상기 RNA의 번역 효율을 약 2배 증가시킨다. 추가로, 상기 3' 단부에 대한 상이한 화학 그룹들의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기와 같은 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 앱타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체를 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 상기 폴리(A) 꼬리에 통합시킬 수 있다. APT 유사체가 상기 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 명세서 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 상기 5' 캡은 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 기법들을 사용하여 제공된다(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 함유할 수 있다. 상기 IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-독립적인 리보솜 결합을 개시시키고 번역의 개시를 촉진하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공 설계된 서열일 수 있다. 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질(세포 투과성 및 생육성을 촉진하는 인자들을 함유할 수 있다), 예를 들어 당, 펩티드, 지질, 단백질, 산화방지제, 및 계면활성제를 포함시킬 수 있다.
상기 개시된 방법들을 표적 암세포를 살해하는 유전자 변형된 T 세포의 능력의 평가를 포함하여, 기본적인 연구 및 치료법, 암, 줄기세포, 급성 및 만성 감염, 및 자가면역 질병의 분야에서 T 세포 활성의 조절에 적용할 수 있다.
상기 방법들은 또한 예를 들어 프로모터 또는 투입 RNA의 양을 변화시켜 발현 수준을 개별적으로 조절할 수 있게 함으로써 상기 발현 수준을 광범위하게 조절하는 능력을 제공한다. 더욱 또한, PCR-기반 mRNA 생성 기법은 상이한 구조 및 도메인들의 조합을 갖는 키메릭 수용체 mRNA의 설계를 매우 용이하게 한다. 예를 들어, 동일한 세포 중의 다수 키메릭 수용체상의 상이한 세포내 효과기/보조자극제 도메인의 다양성은, 다중-항원 표적에 대한 세포독성의 최고 수준, 및 동시에 정상 세포에 대한 최저 세포독성을 평가하는 수용체 조합들의 구조를 결정할 수 있게 한다.
본 발명의 RNA 전사 방법의 한 가지 장점은 RNA 형질감염이 필수적으로 일시적이고 무-벡터라는 것이다. RNA 트랜스유전자는 림프구로 전달되어 거기에서 임의의 추가적인 바이러스 서열의 필요 없이 최소 발현 카세트로서 간단한 시험관내 세포 활성화에 따라 발현될 수 있다. 이러한 조건하에서, 상기 트랜스유전자의 숙주세포 게놈내로의 통합은 일어나지 않을 듯하다. 세포의 클로닝은, 상기 RNA의 형질감염 효율 및 전체 림프구 집단을 균일하게 변형시키는 그의 능력으로 인해 필요하지 않다.
시험관내-전사된 RNA(IVT-RNA)에 의한 T 세포의 유전자 변형은 2가지 상이한 전략을 사용할 수 있게 하는데, 이들 전략은 모두 다양한 동물 모델에서 성공적으로 시험되었다. 세포를 리포펙션 또는 전기천공에 의해 시험관내-전사된 RNA로 형질감염시킨다. 전달된 IVT-RNA의 연장된 발현을 성취하기 위해서 IVT-RNA를 다양한 변형을 사용하여 안정화시키는 것이 바람직할 수 있다.
시험관내 전사를 위한 주형으로서 표준화된 방식으로 사용되고 안정화된 RNA 전사물을 생성시키는 방식으로 유전자 변형된 일부 IVT 벡터들이 문헌에 공지되어 있다. 당해 분야에 사용되는 현행 프로토콜들은 하기의 구조를 갖는 플라스미드 벡터를 기본으로 한다: RNA 전사를 가능하게 하는 5' RNA 폴리머라제 프로모터에 이어서, 번역되지 않은 영역(UTR)이 3' 및/또는 5'에 인접한 관심 유전자, 및 50-70 A 뉴클레오티드를 함유하는 3' 폴리아데닐 카세트. 시험관내 전사에 앞서, 상기 환상 플라스미드는 II형 제한 효소(인식 서열은 절단 부위에 상응한다)에 의해 상기 폴리아데닐 카세트의 하류에서 선형화된다. 따라서 상기 폴리아데닐 카세트는 상기 전사물 중의 나중의 폴리(A) 서열에 상응한다. 상기 과정의 결과로서, 일부 뉴클레오티드는 선형화 후 상기 효소 절단 부위의 부분으로서 남아있고 상기 3' 단부에서 폴리(A) 서열을 연장시키거나 가린다. 상기 비생리학적 오버행이 상기와 같은 구조물로부터 세포내적으로 생성되는 단백질의 양에 영향을 미치는지의 여부는 명확하지 않다.
RNA는 보다 전통적인 플라스미드 또는 바이러스 접근법보다 다수의 장점들을 갖는다. mRNA 공급원으로부터의 유전자 발현은 전사를 필요로하지 않으며 단백질 생성물이 형질감염 후 빠르게 생성된다. 더욱이, 상기 RNA는 핵보다는 단지 세포질에 대한 통로를 수득해야 하기 때문에, 전형적인 형질감염 방법들은 매우 높은 형질감염 속도를 생성시킨다. 또한, 플라스미드 기반 접근법은 관심 유전자의 발현을 구동하는 프로모터가 연구 중인 세포에서 활성일 것을 요한다.
또 다른 태양에서, 상기 RNA 구조물을 전기천공에 의해 세포내로 전달한다. 예를 들어 US 2004/0014645, US 2005/0052630A1, US 2005/0070841A1, US 2004/0059285A1, US 2004/0092907A1에 교시된 바와 같이 포유동물 세포내로의 핵산 구조물의 전기천공 제형 및 방법을 참조하시오. 임의의 공지된 세포 유형의 전기천공에 필요한 전장 강도를 포함한 다양한 매개변수들이 관련 연구 문헌뿐만 아니라 당해 분야의 다수의 특허 및 출원들에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어 미국특허 제 6,678,556 호, 미국특허 제 7,171,264 호, 및 미국특허 제 7,173,116 호를 참조하시오. 전기천공의 치료학적 적용을 위한 기구들은 상업적으로 입수할 수 있으며(예를 들어 MedPulser™ DNA 전기천공 쎄라피 시스템(Electroporation Therapy System)(이노비오/제네트로닉스(Inovio/Genetronics), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 미국특허 제 6,567,694 호; 미국특허 제 6,516,223 호, 미국특허 제 5,993,434 호, 미국특허 제 6,181,964 호, 미국특허 제 6,241,701 호, 및 미국특허 제 6,233,482 호와 같은 특허들에 기재되어 있고; 전기천공을 또한 US20070128708A1에 기재된 바와 같이 시험관내에서 세포의 형질감염에 사용할 수 있다. 전기천공을 또한 시험관내에서 세포내에 핵산을 전달하는데 사용할 수 있다. 상응하게, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다수의 이용 가능한 장치 및 전기천공 시스템 중 어느 하나를 사용하는, 발현 구조물을 포함하는 핵산의 세포내로의 전기천공-매개된 투여는 관심 RNA의 표적 세포로의 전달에 흥분되는 새로운 수단을 제공한다.
일부 실시태양에서, TCR을 암호화하는 RNA를 세포에 전기천공시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR을 암호화하는 RNA는 시험관내 전사된 RNA이다. 일부 실시태양에서, 이중특이성 항체를 암호화하는 mRNA를 세포에 전기천공시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체를 암호화하는 mRNA는 시험관내 전사된 mRNA이다.
일부 실시태양에서, 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA를 세포에 전기천공시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA는 시험관내 전사된 RNA이다.
일부 실시태양에서, 친화성 분자 키메릭 수용체 또는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 RNA를 세포에 전기천공시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체 또는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 RNA는 시험관내 전사된 RNA이다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 TCR 알파 및 베타쇄를 암호화하는 RNA를 전기천공시킴을 포함한다. 상기 TCR 알파 및 베타쇄는 동일한 또는 별도의 RNA상에서 암호화될 수 있다, 예를 들어 상기 TCR 알파쇄를 암호화하는 RNA 및 상기 TCR 베타쇄를 암호화하는 별도의 RNA를 동시-전기천공시킬 수 있다. 상기 알파 및 베타가 별도의 RNA에 의해 암호화되는 경우, 상기 RNA는 동시-전기천공될 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 이중특이성 항체 또는 BiTE 분자를 암호화하는 핵산을 전기천공시킴을 추가로 포함한다. 상기 이중특이성 항체 핵산을 상기 TCR RNA와 동시-전기천공시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 보조자극 분자를 암호화하는 핵산을 전기천공시킴을 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조자극 분자 핵산을 상기 TCR RNA와 동시-전기천공시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 RNA를 전기천공시킴을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 CD3과 같은 보조-자극 분자를 암호화하는 RNA를 전기천공시킴을 추가로 포함한다. 상기 친화성 분자 키메릭 수용체 및 보조-자극 분자를 동일하거나 별도의 RNA상에서 암호화시킬 수 있다. 상기 친화성 분자 키메릭 수용체 및 보조-자극 분자가 별도의 RNA에 의해 암호화되는 경우, 상기 RNA를 동시-전기천공시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 전기천공시킴을 포함한다. 상기 보조자극 분자 핵산을 또한 상기 이중특이성 친화성 분자 핵산과 동시-전기천공시킬 수 있다.
키메릭 막 단백질
하나의 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포를 상기 핵산의 도입 전에 증대시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포를 상기 TCR 또는 이중특이성 항체 또는 BiTE 분자를 암호화하는 RNA로 전기천공 전에 증대시킨다. 상기 T 세포의 증대는 상기 T 세포를 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고, 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함할 수 있다. 본 발명의 키메릭 막 단백질은 세포외 및 세포내 도메인을 포함한다. 상기 세포외 도메인은 표적-특이성 결합 요소, 예를 들어 항체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 키메릭 막 단백질의 세포외 도메인은 비제한적으로 TCR, CD3, CD28 등을 포함하는 T 세포상의 분자를 표적화한다.
세포외 도메인
본 발명은 T 세포상의 분자에 대한 항체 또는 그의 단편을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 상기 분자는 T 세포를 보조-자극하는 임의의 분자, 예를 들어 비제한적으로 TCR, CD3, CD28 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 항-CD3 항체, 항-TCR 항체, 항-CD28 항체, 또는 이들의 조합의 CD3 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 비제한적으로 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 가변 단편, 및 이들의 단편의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원에 결합하는 항체의 임의의 단편을 포함할 수 있다. 일부의 예에서, 상기 세포외 도메인은 상기 키메릭 막 단백질이 최종적으로 사용되는 동일한 종으로부터 유래되는 것이 이롭다. 예를 들어 인간에서의 사용을 위해, 상기 키메릭 막 단백질의 세포외 도메인은 인간 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것이 이로울 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 인간 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 항체는 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 가변 단편, 및 이들의 항원-결합 단편이다.
세포내 도메인
상기 세포내 도메인 또는 세포질 도메인은 보조자극 신호전달 영역을 포함한다. 상기 보조자극 신호전달 영역은 보조자극 분자의 세포내 도메인을 지칭한다. 보조자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 외의 세포 표면 분자이다.
상기 키메릭 막 단백질의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 상기 T 세포의 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. "효과기 기능"이란 용어는 세포의 특수 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은 예를 들어 시토카인의 분비를 포함한 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서 "세포내 신호전달 도메인"이란 용어는 상기 효과기 기능 신호를 전달하고 상기 세포를 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 대개는 전체 세포내 신호전달 도메인을 사용할 수 있지만, 다수의 경우 상기 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 상기 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분을 사용하는 한, 상기와 같은 절두된 부분은 상기가 효과기 기능 신호를 전달하는 한 완전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서 세포내 신호전달 도메인이란 용어는 상기 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함함을 의미한다.
상기 키메릭 막 단백질에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 비제한적인 예는 CD28, 4-1BB, T 세포 수용체(TCR)의 세포내 도메인의 임의의 단편, 보조-자극 분자, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체, 동일한 기능상 능력을 갖는 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
키메릭 막 단백질의 다른 도메인
상기 키메릭 막 단백질의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이, 또는 상기 키메릭 막 단백질의 세포질 도메인과 막관통 도메인 사이에 이격자 도메인이 통합될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이격자 도메인"이란 용어는 일반적으로 폴리펩티드 쇄 중의 세포외 도메인 또는 세포질 도메인에 막관통 도메인을 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이격자 도메인은 300 아미노산 이하, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산 및 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 키메릭 막 단백질은 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 키메릭 막 단백질은 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 키메릭 막 단백질을 암호화하는 mRNA는 막관통 및 힌지 도메인, 예를 들어 CD28 막관통 도메인 및 CD8-알파 힌지 도메인을 추가로 포함한다.
인간 항체
인간에서 항체의 생체내 용도를 위해서, 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 완전 인간 항체는 인간 피험자의 치료학적 치료에 특히 바람직하다. 인간 항체를 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하여 당해 분야에 공지된 다양한 방법들(이들 기법에 대한 개선 포함)에 의해 제조할 수 있다. 또한, 미국특허 제 4,444,887 호 및 미국특허 제 4,716,111 호; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조하시오; 이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다. 인간 항체는 또한, 중쇄 및 경쇄가 인간 DNA의 하나 이상의 공급원으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 항체일 수 있다.
인간 항체를 또한, 기능성 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 마우스 배아 줄기 세포내에 무작위로 또는 상동성 재조합에 의해 도입시킬 수 있다. 한편으로, 상기 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역을 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 외에 마우스 배아 줄기 세포내에 도입시킬 수 있다. 상기 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 상기 도입과 동시에 비-기능성으로 될 수 있다. 예를 들어, 키메릭 및 생식세포 계열 돌연변이 마우스 중의 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동종접합 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 발생시킴이 개시되었다. 상기 변형된 배아 줄기 세포를 증대시키고 배반포에 미세주입하여 키메릭 마우스를 생성시킨다. 이어서 상기 키메릭 마우스를 번식시켜 인간 항체를 발현하는 동종접합 새끼를 생성시킨다. 상기 트랜스제닉 마우스를 선택된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부로 통상적인 방식으로 면역시킨다. 선택 표적에 대한 항체를 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역된, 트랜스제닉 마우스로부터 수득할 수 있다. 상기 트랜스제닉 마우스가 갖는 인간 면역글로불린 트랜스유전자는 B 세포 분화 중에 재배열하고, 후속으로 부류 변환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 상기와 같은 기법을 사용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체(비제한적으로 IgG1(감마1) 및 IgG3을 포함한다)를 생성시킬 수 있다. 인간 항체의 상기 생성 기법에 대한 개관에 대해서, 문헌[Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)]을 참조하시오. 인간 항체 및 인간 단클론 항체의 상기 생성 기법 및 상기와 같은 항체의 생성 프로토콜에 대한 상세한 논의에 대해서, 예를 들어 PCT 공보 WO 98/24893, WO 96/34096, 및 WO 96/33735; 및 미국특허 제 5,413,923 호; 미국특허 제 5,625,126 호; 미국특허 제 5,633,425 호; 미국특허 제 5,569,825 호; 미국특허 제 5,661,016 호; 미국특허 제 5,545,806 호; 미국특허 제 5,814,318 호; 및 미국특허 제 5,939,598 호(이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 또한, 아브제닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc.)(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재) 및 젠팜(Genpharm)(미국 캘리포니아 산호세 소재)과 같은 회사들이 상술한 바와 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하는데 참여할 수 있다. 항원 공격시 인간 항체를 생성시키는 생식세포 계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달에 대한 구체적인 논의에 대해서, 예를 들어 하기 문헌들을 참조하시오: Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); 및 Duchosal et al., Nature, 355:258 (1992).
인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996)). 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990))을 사용하여 시험관내에서 면역되지 않은 공여체로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼터리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 생성시킬 수 있다. 상기 기법에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 섬유성 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주 또는 부 외피 단백질 유전자내로 인-프레임 클로닝시키며, 상기 유전자는 파지 입자의 표면상에 기능성 항체 단편으로서 나타난다. 상기 섬유성 입자는 상기 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 사본을 함유하기 때문에, 상기 항체의 기능성 성질에 근거한 선택은 또한 상기 성질을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자를 선택하게 한다. 따라서, 상기 파지는 상기 B 세포의 성질들 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이를 다양한 포맷으로 수행할 수 있다; 그의 재고찰을 위해서 예를 들어 문헌[Johnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조하시오. V-유전자 분절의 다수의 공급원들을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 클락슨(Clackson) 등(Nature, 352:624-628 (1991))은 면역되지 않은 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리하였다. 면역되지 않은 인간 공여체로부터 V 유전자의 레퍼토리를 구성하고 항원(자기-항원 포함)의 다양한 배열에 대한 항체들을 필수적으로 하기 문헌에 기재된 기법에 따라 단리할 수 있다: Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993). 또한 미국특허 제 5,565,332 호 및 미국특허 제 5,573,905 호(이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)를 참조하시오.
인간 항체를 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성시킬 수 있다(미국특허 제 5,567,610 호 및 미국특허 제 5,229,275 호(이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)를 참조하시오). 인간 항체를 또한 하이브리도마 기법, 예를 들어 비제한적으로 문헌[Roder et al., Methods Enzymol., 121:140-167 (1986)]에 기재된 기법을 사용하여 시험관내에서 생성시킬 수 있다.
인간화된 항체
한편으로, 일부 실시태양에서, 비-인간 항체를 인간화시키며, 이때 상기 항체의 특정한 서열 또는 영역들을, 인간에서 자연적으로 생성된 항체에 대한 유사성을 증가시키기 위해 변형시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 도메인을 인간화시킨다.
"인간화된" 항체는 원래 항체와 유사한 항원 특이성을 유지한다. 그러나, 몇몇 인간화 방법을 사용하는 경우, 인간 CD3 항원에 대한 항체의 결합 친화성 및/또는 특이성을 문헌[Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151 (1999)](이의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이, "방향 진화 (directed evolution)" 방법을 사용하여 증가시킬 수 있다.
인간화된 항체는 비인간 공급원으로부터 상기 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기를 종종 "수입" 잔기라 칭하며, 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취한다. 따라서, 인간화된 항체는 비인간 면역글로불린 분자로부터의 하나 이상의 CDR 및 인간으로부터의 프레임워크 영역을 포함한다. 항체의 인간화는 당해 분야에 주지되어 있으며 필수적으로, 윈터(Winter)와 동료의 방법에 따라(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), 인간 항체의 상응하는 서열 대신 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환시킴으로써, 즉 CDR-이식에 의해(EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 및 미국특허 제 4,816,567 호; 미국특허 제 6,331,415 호; 미국특허 제 5,225,539 호; 미국특허 제 5,530,101 호; 미국특허 제 5,585,089 호; 미국특허 제 6,548,640 호(내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)) 수행될 수 있다. 상기와 같은 인간화된 키메릭 항체에서, 실질적으로 완전 미만의 인간 가변 도메인을 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환시켰다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 중의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 항체의 인간화를 또한 베니어링(veneering) 또는 리설피싱(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) 또는 쇄 셔플링(미국특허 제 5,565,332 호)(이들 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 의해 성취할 수 있다.
인간화된 항체의 제조에 사용되는 인간 가변 도메인(경쇄 및 중쇄 모두)의 선택은 항원성을 감소시키기 위한 것이다. 소위 "최적합 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 선별한다. 이어서 상기 설치류의 서열에 가장 가까운 인간 서열을 상기 인간화된 항체의 인간 프레임워크(FR)로서 수용한다(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))(내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 같은 프레임워크를 다수의 상이한 인간화된 항체에 사용할 수도 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993))(내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다).
항체를 표적 항원의 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 성질의 유지와 함께 인간화시킬 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에 따라, 인간화된 항체를, 모 서열 및 인간화된 서열의 3-차원 모델을 사용하여 상기 모 서열 및 다양한 개념상의 인간화된 생성물의 분석 과정에 의해 제조한다. 3-차원 면역글로불린 모델을 통상적으로 입수할 수 있으며 이는 당해 분야의 숙련가들에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 있음직한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이의 검사는 상기 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 있음직한 역할의 분석, 즉 후보 항원에 결합하는 상기 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기들의 분석을 허용한다. 이렇게 하여, FR 잔기를 선택하고 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원에 대한 증가된 친화성이 성취되도록 수용 및 유입 서열로부터 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
T 세포의 공급원
증대에 앞서, T 세포의 공급원을 피험자로부터 수득한다. 피험자의 비제한적인 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그들의 트랜스제닉 종을 포함한다. 바람직하게, 상기 피험자는 인간이다. T 세포를 다수의 공급원, 예를 들어 말초 혈액 단핵세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 탯줄, 및 종양으로부터 수득할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 당해 분야에서 입수할 수 있는 임의의 수의 T 세포를 사용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, T 세포를 숙련가에게 공지된 임의의 수의 기법, 예를 들어 피콜 분리를 사용하여 피험자로부터 수집된 혈액의 단위로부터 수득할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 개인의 순환 혈액으로부터의 세포를 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득한다. 상기 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포를 포함한 림프구, 단핵세포, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 상기 성분채집술에 의해 수집된 세포를 후속 가공 단계를 위해서, 세척하여 혈장 분획을 제거하고 상기 세포를 적합한 완충제 또는 매질, 예를 들어 포스페이트 완충 염수(PBS), 또는 칼슘이 없고 마그네슘이 없거나 다수(전부는 아니더라도)의 2가 양이온이 없을 수도 있는 세척액 중에 넣을 수 있다. 세척 후에, 상기 세포를 다양한 생체적합성 완충제, 예를 들어 무-Ca, 무-Mg PBS 중에 재현탁시킬 수 있다. 한편으로, 상기 성분채집 샘플의 바람직하지 못한 성분들을 제거하고 상기 세포를 직접 배양 배지에 재현탁시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, T 세포를, 적혈구를 용해시키고 단핵세포를 고갈시킴으로써, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액으로부터 단리시킨다. 한편으로, T 세포를 탯줄로부터 단리할 수 있다. 어쨌든, T 세포의 특정한 하위집단을 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리할 수 있다.
그렇게 단리된 제대혈 단핵세포에서 몇몇 항원, 예를 들어 비제한적으로 CD34, CD8, CD14, CD19 및 CD56을 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 상기 세포의 고갈은 단리된 항체, 항체를 포함하는 생물학적 샘플, 예를 들어 복수, 물리적 지지체에 결합된 항체, 및 세포 결합된 항체를 사용하여 수행될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축을 상기 음성적으로 선택된 세포 특유의 표면 마커에 대한 항체들의 조합을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 방법은 상기 음성적으로 선택된 세포상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체들의 칵테일을 사용하는 유식 세포측정 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해서, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
양성 또는 음성 선택에 의한 목적하는 세포 집단의 단리를 위해서, 세포 및 표면(예를 들어 비드와 같은 입자)의 농도를 변화시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 비드 및 세포를 함께 혼합시키는 부피를 현저하게 감소시켜(즉 세포의 농도를 증가시켜) 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서 20억 세포/㎖의 농도가 사용된다. 하나의 실시형태에서 10억 세포/㎖의 농도가 사용된다. 추가의 실시태양에서, 100x106 세포/㎖ 초과가 사용된다. 추가의 실시태양에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50x106 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100x106 세포/㎖의 농도가 사용된다. 추가의 실시태양에서, 125 또는 150x106 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 고농도의 사용은 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증대를 증가시킬 수 있다.
T 세포를 또한 상기 세척 단계 후에 동결시킬 수 있으며, 이는 단핵세포-제거 단계를 필요로 하지 않는다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 동결 및 후속의 해동 단계는 과립구 및 어느 정도는 단핵구를 상기 세포 집단에서 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 상기 세척 단계 후에, 상기 세포를 동결 용액 중에 현탁시킬 수 있다. 다수의 동결 용액 및 매개변수들이 당해 분야에 공지되어 있으며 상기 상황에 유용할 것이지만, 비-제한적인 예에서 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 매질을 수반한다. 이어서 상기 세포를 -80 ℃까지 분당 1°의 속도로 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기상 중에 보관한다. 다른 조절된 동결 방법뿐만 아니라 -20 ℃ 또는 액체 질소 중에서 즉각적인 조절되지 않은 동결을 사용할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 T 세포의 집단은 말초혈액 단핵세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단, 및 T 세포주와 같은 세포내에 포함된다. 또 다른 실시태양에서, 말초 혈액 단핵 세포는 상기 T 세포의 집단을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 정제된 T 세포는 상기 T 세포의 집단을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포를 말초혈액 단핵세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단, 및 T 세포주와 같은 세포로부터 단리시킨다. 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단, 또는 T 세포주로부터의 T 세포의 집단을 단리시킴을 추가로 포함한다.
T 세포의 증대
하나의 실시태양에서, 상기 T 세포의 증대는 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 전기천공시키고 증대시키고자 하는 T 세포의 공급원은 말초 혈액 단핵세포이다.
일반적으로, T 세포를 상기에 부착된 표면과 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 상기 T 세포의 표면상의 보조-자극 분자를 자극하는 리간드를 접촉시킴으로써 증대시킨다. 본 발명은 상기 전기천공된 집단을 배양시킴을 포함하는 전기천공된 T 세포 집단을 증대시키는 신규의 방법을 포함하며, 여기에서 상기 집단내 전기천공된 T 세포는 적어도 10배 증대된다. 상기 키메릭 막 단백질의 발현은 상기 집단 중의 다른 세포와 상호작용을 허용하여 상기 전기천공된 T 세포의 증대를 자극하고 활성화시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포 집단 중 적어도 하나의 세포는 CD3을 발현한다. 임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, CD3을 발현하는 세포를 상기 전기천공된 세포의 표면상에서 발현되는 키메릭 막 단백질과 접촉시키고 결합시킬 수 있다. 상기 키메릭 막 단백질을 발현하는 적어도 하나의 세포는 CD3을 발현하는 또 다른 세포와 상호작용할 수 있다. 이러한 상호작용은 상기 전기천공된 T 세포의 증대를 자극할 수 있다.
한편으로, 상기 세포를 미국특허 제 5,199,942 호(본 명세서에 참고로 인용된다)에 기재된 방법을 사용하여 생체외에서 증대시킬 수 있다. 미국특허 제 5,199,942 호에 기재된 바와 같은 증대는 본 명세서에 기재된 다른 증대 방법들에 대한 대안이거나 추가일 수 있다. 간단히, T 세포의 생체외 배양 및 증대는 세포 성장 인자, 예를 들어 미국특허 제 5,199,942 호에 기재된 것들, 또는 다른 인자, 예를 들어 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드, 예를 들어 고속 증대 프로토콜(REP)을 위한 문헌[Dudley et al., J. Immunol., 26(4):332-342, 2003]에 기재된 것들에 대한 부가를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 T 세포 증대는 상기 T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함한다.
본 명세서에 개시된 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 방법들에 의한 상기 전기천공된 T 세포의 증대는 약 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 2000 배, 3000 배, 4000 배, 5000 배, 6000 배, 7000 배, 8000 배, 9000 배, 10,000 배, 100,000 배, 1,000,000 배, 10,000,000 배, 또는 그 이상 및 이들 사이의 모든 전체 또는 부분 정수배까지 크게 증가될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 T 세포는 약 20배 내지 약 50배의 범위로 증대된다.
배양에 이어서, 상기 T 세포를 일정 기간 동안 또는 상기 세포가, 상기 세포를 또 다른 배양 기구로 옮기기 전에 최적의 계대 배양을 위해 융합 또는 높은 세포 밀도에 도달할 때까지 배양 기구 중의 배양 배지에서 인큐베이션시킬 수 있다. 상기 배양 기구는 시험관내에서 세포의 배양에 통상적으로 사용되는 임의의 배양 기구일 수 있다. 배양 기간은 시험관내에서 세포의 배양에 적합한 임의의 시간일 수 있다. 상기 T 세포 매질을 상기 T 세포의 배양 기간 중 언제라도 교체할 수 있다. 바람직하게, 상기 T 세포 배지를 대략 2 내지 3일마다 교체한다. 이어서 상기 T 세포를 상기 배양 기구로부터 수거하며, 그 결과 상기 T 세포를 즉시 사용하거나 또는 나중의 사용을 위해 보관하기 위해 냉동보존할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 상기 증대된 T 세포를 냉동보존함을 포함한다. 이어서 상기 냉동보존된, 증대된 T 세포를 RNA로 전기천공 전에 해동시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 냉동보존된 T 세포를, 핵산을 상기 T 세포내에 도입시키기 전에 해동시킨다.
하나의 태양에서, 상기 T 세포의 증대 방법은 상기 T 세포를 단리하고 후속 전기천공에 이어서 배양시킴을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 증대된 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 냉동보존된 T 세포를 이중특이성 항체 또는 BiTE 분자를 암호화하는 RNA로 전기천공을 위해 해동시킨다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 냉동보존된 T 세포를 친화성 분자 키메릭 수용체 또는 이중특이성 친화성 분자 핵산과의 도입을 위해 해동시킨다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 냉동보존된 T 세포를 상기 TCR을 암호화하는 RNA로 전기천공을 위해 해동시킨다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 배양 단계(본 명세서에 기재된 바와 같은 작용제와의 접촉)는 매우 짧을 수 있다, 예를 들어 24시간 미만, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간일 수 있다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같은 배양 단계(본 명세서에 기재된 바와 같은 작용제와의 접촉)는 보다 길 수 있다, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상일 수 있다.
다양한 용어들이 배양물 중의 세포를 기재하는데 사용된다. 세포 배양물은 일반적으로 살아있는 유기체로부터 채취하고 조절된 조건하에서 생육시킨 세포를 지칭한다. 1차 세포 배양물은 유기체로부터 직접 채취하고 1차 계대배양 전인 세포, 조직 또는 기관의 배양물이다. 세포는 상기가 세포 생육 및/또는 분열을 촉진하여 보다 큰 상기 세포의 집단을 생성시키는 조건하에서 생육 배지에 놓일 때 배양물 중에서 증대된다. 세포를 배양물 중에서 증대시킬 때, 세포 증식 속도는 전형적으로는 상기 세포의 수가 2배로 되는데 필요한 시간의 양(달리 배가시간으로서 공지됨)에 의해 측정된다.
각 계대배양의 라운드를 계대라 칭한다. 세포를 계대배양시킬 때, 이를 계대되었다라고 한다. 특정한 세포 집단 또는 세포주는 때때로 상기가 계대된 횟수로 지칭되거나 또는 상기를 특징으로 한다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단을 P10 배양물이라 칭할 수 있다. 1차 배양물, 즉 조직으로부터 세포의 단리에 따른 1차 배양물은 P0으로 표시한다. 상기 1차 계대배양 다음에, 상기 세포를 2차 배양물(P1 또는 계대 1)로서 기재한다. 상기 2차 계대배양 후에, 상기 세포는 3차 배양물(P2 또는 계대 2) 등으로 된다. 당해 분야의 숙련가들은 계대 기간 동안 다수의 집단 배가가 있을 수 있음을 알 것이다; 따라서 배양물의 집단 배가 수는 계대수보다 크다. 계대 사이의 기간 동안 세포의 증대(즉 집단 배가의 수)는 다수의 인자들, 예를 들어 비제한적으로 시딩 밀도, 기질, 배지, 및 계대 사이의 시간에 따라 변한다.
하나의 실시태양에서, 상기 세포를 수시간(약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 정수값의 시간 동안 배양할 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 증식 및 생육성에 필요한 인자들, 예를 들어 혈청(예를 들어 소태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-감마, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF-베타, 및 TNF-α, 또는 숙련가에게 공지된 세포 생육을 위한 임의의 다른 첨가제를 함유할 수 있는 적합한 배지(예를 들어 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-비보(vivo) 15, 론자(Lonza))를 포함한다. 상기 세포 생육을 위한 다른 첨가제는 비제한적으로 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예를 들어 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함한다. 배지는 아미노산, 나트륨 피루베이트, 및 비타민이 첨가되고, 무혈청이거나 또는 적합한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 한정된 호르몬 세트, 및/또는 T 세포의 생육 및 증대에 충분한 양의 시토카인(들)이 보충된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-비보 15, 및 X-비보 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신을, 피험자에게 주입해야 하는 세포의 배양물이 아닌, 실험 배양물에만 포함시킨다. 상기 표적 세포를 생육을 지지하는데 필요하는 조건, 예를 들어 적합한 온도(예를 들어 37 ℃) 및 분위기(예를 들어 공기+5% CO2)하에서 유지시킨다.
상기 T 세포를 배양하는데 필요한 배지는 상기 T 세포를 보조-자극할 수 있는 작용제를 포함할 수 있다. 예를 들어, CD3을 자극할 수 이는 작용제는 CD3에 대한 항체이고, CD28을 자극할 수 있는 작용제는 CD28에 대한 항체이다. 이는, 본 명세서에 개시된 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 단리된 세포가 대략적으로 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 2000 배, 3000 배, 4000 배, 5000 배, 6000 배, 7000 배, 8000 배, 9000 배, 10,000 배, 100,000 배, 1,000,000 배, 10,000,000 배 이상 증대될 수 있기 때문이다. 하나의 실시태양에서, 상기 T 세포는 상기 전기천공된 집단을 배양시킴으로써 약 20 배 내지 약 50 배 이상의 범위로 증대된다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 증대된 T 세포내에 도입시키고, 보조-자극 분자를 암호화하는 RNA를 상기 T 세포내로 전기천공시킴을 포함하며, 여기에서 상기 일렉트포로레이션된 T 세포는 상기 TCR 및 보조-자극 분자를 발현할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 증대된 T 세포를 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 보조-자극 분자로 자극함을 추가로 포함한다. 상기 자극은 상기 보조-자극 분자를 암호화하는 RNA에 의한 동시-전기천공을 포함할 수 있다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 증대된 T 세포를 CD3을 암호화하는 RNA로 추가로 전기천공시키거나 또는 동시-전기천공시킨다. 상기 CD3은 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄, 예를 들어 CD3 제타 및 CD3 입실론쇄를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포의 증대 방법은 추가의 용도를 위해 상기 증대된 T 세포를 단리함을 추가로 포함할 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 증대 방법은 상기 증대된 T 세포의 후속적인 전기천공에 이은 배양을 추가로 포함한다. 상기 후속적인 전기천공은 작용제, 예를 들어 이중특이성 항체 또는 BiTE 분자를 암호화하는 RNA를 상기 T 세포의 증대된 집단내에 전기천공시킴을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 작용제는 상기 T 세포를 추가로 자극한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 후속적인 전기천공은 작용제를 암호화하는 핵산을 상기 증대된 T 세포 집단에 도입시킴, 예를 들어 상기 증대된 T 세포를 형질도입시키거나, 상기 증대된 T 세포를 형질감염시키거나, 또는 상기 증대된 T 세포를 TCR을 암호화하는 핵산으로 전기천공시킴을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 작용제는 상기 T 세포를 또한 자극한다.
상기 작용제는 상기 T 세포를, 예를 들어 추가적인 증대, 효과기 기능 또는 또 다른 T 세포 기능을 자극함으로써 자극할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 작용제 핵산을 상기 키메릭 막 단백질 RNA와 동시-전기천공시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 작용제 핵산, 예를 들어 이중특이성 항체 또는 BiTE 분자 RNA 또는 TCR RNA를 상기 전기천공된 집단의 배양 후에 전기천공시킨다.
추가의 실시태양에서, 상기 작용제 RNA, 예를 들어 이중특이성 항체 또는 BiTE 분자 RNA를 냉동보존된 증대된 T 세포내로 전기천공시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 작용제 핵산, 예를 들어 TCR RNA를, 상기 전기천공된 집단의 배양 후에 전기천공시킨다. 추가의 실시태양에서, 상기 작용제 핵산, 예를 들어 TCR RNA를, 냉동보존된 증대된 T 세포내로 전기천공시킨다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포를, 상기 이중특이성 항체 또는 BiTE 분자를 암호화하는 RNA로 전기천공 후 냉동보존한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포를, 상기 TCR을 암호화하는 핵산의 도입 후 냉동보존한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포를, 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산의 도입 후 냉동보존한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포를, 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산의 도입 후 냉동보존한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포를, 상기 이중특이성 친화성 항체를 암호화하는 핵산의 도입 후 냉동보존한다.
치료법
본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 치료용 조성물에 포함시킬 수 있다. 상기 조성물은 약학 조성물을 포함할 수 있으며 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 치료 유효량의 상기 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여할 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 변형된 T 세포를 투여함을 포함하는 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극하는 방법을 포함한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는, 상기 입양 세포 전달 요법 치료 방법을 포함한다. 더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하는 상기 피험자에서의 상기 치료 방법을 포함한다.
상기 태양 중 하나의 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포는 증대되었고 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포는 증대되었고 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA 및 이중특이성 항체, 예를 들어 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원 및 표적 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포는 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시태야에서, 상기 변형된 세포는 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 친화성 도메인은 소분자 항원 결합 도메인을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포는 증대되었고 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산 및 상기 표적 세포상의 항원 및 상기 T 세포상의 CLEAR에 대한 이중특이성을 갖는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산이 도입되었다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포는 증대되었고 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원 및 표적 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 RNA로 전기천공되었다.
상기 변형된 T 세포를 투여하여 표적 세포 또는 조직의 용해를 유도할 수 있으며, 예를 들어 이때 상기 유도된 용해는 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 변형된 T 세포는 T 세포 기능을 갖는다. 더욱이, 상기 변형된 T 세포를 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하여 면역 반응, 예를 들어 자가면역 질병, 예를 들어 당뇨병, 건선, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, GVHD, 증진성 동종이식편 내성 유도, 이식편 거부 등을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포를, 감소되거나 또는 달리 억제된 면역 반응, 특히 세포-매개된 면역 반응이 질병의 치료 또는 경감에 바람직할 수 있는 임의의 병증의 치료에 사용할 수 있다. 하나의 태양에서, 본 발명은 피험자에게 치료 유효량의 변형된 T 세포 집단을 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 자가면역 질병과 같은 병증을 치료함을 포함한다.
자가면역 질병의 예는 비제한적으로 후천성 면역결핍 증후군(AIDS, 이는 자가면역 성분을 갖는 바이러스성 질병이다), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 및 베게너 육아종증을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 변형된 T 세포를 또한 염증 질환의 치료를 위해 증대시켜 사용할 수 있다. 염증 질환의 예는 비제한적으로 만성 및 급성 염증 질환을 포함한다. 염증 질환의 예는 알쯔하이머병, 천식, 아토피성 알러지, 알러지, 죽상동맥경화증, 기관지 천식, 습진, 사구체신염, 이식편 대 숙주병, 용혈성 빈혈, 골관절염, 패혈증, 뇌졸중, 조직 및 기관 이식, 혈관염, 당뇨성 망막병증 및 인공호흡기 유발된 폐 손상을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 T 세포를 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 면역 반응의 치료를 위한 약제의 제조에 사용할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 면역 반응의 치료 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 변형된 세포를 포함한다.
본 발명의 세포를 동물, 바람직하게는 포유동물, 훨씬 더 바람직하게는 인간에게 투여하여 암을 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포를 암과 관련된 임의의 병증, 특히 종양 세포(들)에 대한 세포-매개된 면역 반응(이때 상기 질병을 치료하거나 경감시키는 것이 바람직할 수 있다)의 치료에 사용할 수 있다. 암의 예로는 비제한적으로 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 갑상선암 등을 포함한다.
본 발명의 세포를 적합한 전-임상 및 임상 실험 및 시험에서 측정하고자 하는 투여량 및 경로 및 시간에 투여할 수 있다. 세포 조성물을 이들 범위내의 투여량으로 수회 투여할 수 있다. 본 발명의 세포의 투여를 당해 분야의 숙련가들에 의해 결정되는 바와 같은 목적하는 질병 또는 병증의 치료에 유용한 다른 방법들과 병행할 수 있다.
투여하고자 하는 본 발명의 세포는 치료 중인 피험자에 대해서 자가유래, 동종이계 또는 이종발생성일 수 있다.
본 발명의 세포의 투여를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 통상적인 방식으로 수행할 수 있다. 본 발명의 세포를 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 및 이식에 의해 피험자에게 투여할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물을 환자에게 경동맥, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 척수내, 근육내, 정맥(i.v.) 주사에 의해 또는 복강내로 투여할 수 있다. 다른 경우에, 본 발명의 세포를 상기 피험자의 염증 부위, 상기 피험자의 국소 질병 부위, 림프절, 기관, 종양 등에 직접 주사한다.
본 명세서에 기재된 세포를 또한 임의의 수의 매트릭스를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명은 전형적으로 T 세포의 조절을 통해, 면역계를 지지하거나, 유지하거나 조절하기 위해 인공 림프 기관으로서 작용하는 새로운 환경내에서 상기와 같은 매트릭스를 사용한다. 상응하게, 본 발명은 조직 공학에 유용성이 입증된 상기 매트릭스 조성물 및 제형을 사용할 수 있다. 상응하게, 본 발명의 조성물, 장치 및 방법에 사용될 수 있는 매트릭스의 유형은 실질적으로 제한이 없으며 생물학적 및 합성 매트릭스를 모두 포함할 수 있다. 하나의 특정한 예에서, 미국특허 제 5,980,889 호; 미국특허 제 5,913,998 호; 미국특허 제 5,902,745 호; 미국특허 제 5,843,069 호; 미국특허 제 5,787,900 호; 또는 미국특허 제 5,626,561 호(이들 특허는 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 제시된 조성물 및 장치가 사용된다. 매트릭스는 포유동물 숙주에 투여시 생체적합성임과 통상적으로 관련되는 특징들을 포함한다. 매트릭스는 천연 및/또는 합성 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 매트릭스는 동물의 체내에서 영구적인 구조물 또는 제거 가능한 구조물을 남기는 것이 바람직한 경우에 비-생분해성, 예를 들어 임플란트; 또는 생분해성일 수 있다. 상기 매트릭스는 스펀지, 임플란트, 튜브, 텔파 패드, 섬유, 중공 섬유, 동결건조된 성분, 젤, 분말, 다공성 조성물 또는 나노입자의 형태를 취할 수 있다. 또한, 매트릭스를 시딩된 세포 또는 생성된 시토카인 또는 다른 활성 작용제의 지속적인 방출을 허용하도록 설계할 수도 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 매트릭스는 가요성이고 탄성이며, 무기염, 수성 유체 및 산소를 포함한 용해된 기체상 작용제와 같은 물질에 투과성인 반고체 스캐폴드로서 기재될 수 있다.
매트릭스를 본 명세서에서는 생체적합성 물질의 일례로서 사용한다. 그러나, 본 발명은 매트릭스로 제한되지 않으며, 따라서 매트릭스 또는 매트릭스들이란 용어가 존재하는 어디에서나 이들 용어를, 세포 유지 또는 세포 순회를 허용하고, 생체적합성이며, 자체가 반-투과성이거나 또는 특정한 반-투과성 물질과 함께 사용되는 물질을 통해서 직접 거대분자의 순회를 허용할 수 있는 다른 물질 및 장치를 포함하는 것으로 판독해야 한다.
약학 조성물
본 발명의 약학 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포 집단을 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다. 상기와 같은 조성물은 완충제, 예를 들어 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어 글리신; 산화방지제; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 또는 글루타치온; 항원보강제(예를 들어 수산화 알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 바람직하게는 정맥내 투여용으로 제형화한다.
본 발명의 약학 조성물을 치료하고자 하는(또는 예방하고자 하는) 질병에 적합한 방식으로 투여할 수 있다. 상기 투여량 및 투여 빈도는 환자의 조건, 및 환자의 질병의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이지만, 적합한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수도 있다.
본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 104 내지 109 세포/㎏ 체중, 바람직하게는 105 내지 106 세포/㎏ 체중(이들 범위내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여할 수 있다. T 세포 조성물을 또한 상기 투여량에서 수회 투여할 수 있다. 상기 세포를 면역요법에 통상적으로 공지된 주입 기법을 사용하여 투여할 수 있다(예를 들어 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988]을 참조하시오). 특정 환자에 최적인 투여량 및 치료 섭생을, 상기 환자를 질병의 징후에 대해 모니터하고 치료를 상응하게 조절함으로써 의학 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 활성화된 T 세포를 피험자에게 투여하고 이어서 후속으로 혈액을 다시채혈하고(또는 성분채집술을 수행하고), 본 발명에 따라 상기로부터 T 세포를 활성화시키고, 상기 환자에게 상기 활성화되고 증대된 T 세포를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 과정을 수주마다 수회 수행할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, T 세포를 10 ㎖ 내지 400 ㎖의 채혈된 혈액으로부터 활성화시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, T 세포를 20 ㎖, 30 ㎖, 40 ㎖, 50 ㎖, 60 ㎖, 70 ㎖, 80 ㎖, 90 ㎖ 또는 100 ㎖의 채혈된 혈액으로부터 활성화시킨다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 수회의 채혈/수회의 재주입 프로토콜을 사용하여 T 세포의 일정한 집단을 선택할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법 또는 T 세포를 치료 수준으로 증대시키는 당해 분야에 공지된 다른 방법들을 사용하여 증대되고 변형된 세포를 환자에게 임의의 수의 관련 치료 양상, 예를 들어 비제한적으로 항바이러스 요법, 시도포비어 및 인터류킨-2, 시타라빈(또한 ARA-C로서 공지됨)과 같은 작용제에 의한 치료 또는 MS 환자용 나탈리주맵 치료 또는 건선 환자용 에팔리주맵 치료 또는 PML 환자용 다른 치료와 함께(예를 들어 상기 치료 전, 상기 치료와 동시에, 또는 상기 치료에 이어서) 투여한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 T 세포를 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들어 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예를 들어 CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 시토카인, 및 조사와 함께 사용할 수 있다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제(라파마이신)를 억제한다. (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가의 실시태양에서, 본 발명의 세포 조성물을 환자에게 골수 이식, 화학요법제, 예를 들어 플루다라빈, 외부-광선 조사 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 항체, 예를 들어 OKT3 또는 CAMPATH를 사용하는 T 세포 제거 요법과 함께(예를 들어 상기 전에, 상기와 동시에 또는 상기에 이어서) 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 세포 조성물을 B-세포 제거 요법, 예를 들어 CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어 리툭산에 이어서 투여한다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 피험자는 고용량 화학요법에 의한 표준 치료에 이어서, 말초 혈액 줄기세포 이식을 겪을 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 이식에 이어서, 피험자는 본 발명의 증대된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가의 실시태양에서, 증대된 세포를 수술 전 또는 수술에 이어서 투여한다.
환자에게 투여하고자 하는 상기 치료의 투여량은 치료되는 병증의 정확한 성질 및 치료 수용자에 따라 변할 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 크기조정을 당해 분야-승인된 실행에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어 CAMPATH에 대한 용량은 일반적으로 성인 환자의 경우 1 내지 약 100 ㎎의 범위로, 대개는 1 내지 30일의 기간 동안 매일 투여될 것이다. 바람직한 1일 용량은 하루에 1 내지 10 ㎎이나, 일부의 경우 하루에 40 ㎎ 이하의 보다 큰 용량이 사용될 수도 있다(미국특허 제 6,120,766 호에 기재됨).
본 발명에 유용할 수 있는 방법 및 조성물은 실시예들에 제시된 특정한 제형들로 제한되지 않음은 물론이다. 하기의 실시예들을, 본 발명의 세포, 증대 및 배양 방법 및 치료 방법의 제조 및 사용에 대한 완전한 개시 및 기재와 함께 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 제공하기 위해 제시하며, 이는 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 범위를 제한하고자 하지 않는다.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법들을 사용하며, 이들은 충분히 숙련가의 이해 범위내에 있다. 상기와 같은 기법들은 예를 들어 하기 문헌에 충분히 설명되어 있다: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", fourth edition (Sambrook, 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002); "Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002). 이들 기법을 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생성에 적용할 수 있으며, 그 자체가 본 발명의 수행 및 실시에 고려될 수 있다. 특정한 실시태양들에 특히 유용한 기법들은 하기 섹션에서 논의될 것이다.
실험 실시예
본 발명을 하기의 실험 실시예를 참조하여 상세히 추가로 기재한다. 이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공되며 달리 명시되지 않는 한 제한을 의도하지 않는다. 따라서, 본 발명을 결코 하기의 실시예들로 제한되는 것으로서 해석해서는 안 되며, 오히려 여기에 제공된 교시의 결과로서 자명해지는 모든 변화들을 포함하는 것으로 해석해야 한다.
추가의 기재 없이, 당해 분야의 통상적인 숙련가는 선행 기재 및 하기의 예시적인 실시예들을 사용하여 본 발명의 화합물을 제조 및 사용하고 특허청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 여긴다. 따라서 하기의 실행 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양들을 구체적으로 지적하며 나머지 개시를 어떠한 제한으로서도 해석하지 않는다.
이제 실시예 1의 실험에 사용되는 물질 및 방법을 기재한다.
1차 인간 림프구.
1차 림프구를 기재된 바와 같이(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586) CD3 및 CD28 자극 항체(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재, 카탈로그)로 코팅된 미세비드로 자극하였다. T 세포를 10일째에 90% 송아지 태아 혈청 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)의 용액 중에서 1 x 108 세포/바이알로 냉동보존하였다.
mRNA 전기천공 및 렌티바이러스 형질도입을 위한 TCR 구조물의 생성.
상이한 돌연변이들을 갖는 1G4 NY-ESO-1 TCR을 관련 간행물(The Journal of experimental medicine 2005, 201(8):1243-1255; J Immunol 2008, 180(9):6116-6131)에 의해 제공된 서열분석 정보를 근거로 합성하고/하거나, PCR에 의해 증폭시키고, pGEM.64A RNA 기재 벡터 또는 pTRPE 렌티바이러스 벡터내에 서브클로닝하였다.
mRNA 시험관내 전사 및 T 세포 전기천공.
T7 mscript 시스템 키트(셀스크립트(CellScript))를 사용하여 시험관내 전사된(IVT) RNA를 생성시켰다. CD3/CD28 비드 자극된 T 세포를 앞서 기재된 바와 같이(Cancer research 2010, 70(22):9053-9061) BTX EM830(하바드 어패러투스(Harvard Apparatus) BTX)을 사용하여 IVT RNA로 전기천공시켰다. 간단히, T 세포를 3회 세척하고 OPTI-MEM(인비트로젠(Invitrogen))에 1-3x108 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다. 후속으로, 0.1 ㎖의 세포를 10 ug IVT RNA(또는 지시된 대로)와 혼합하고 2 ㎜ 큐벳에서 전기천공시켰다.
ELISA 분석.
CD19를 발현하는 상이한 종양 세포주들인 표적 세포들을 세척하고 R10 배지(10% 송아지 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640; 인비트로젠)에 1x106 세포/㎖로 현탁시켰다. 100 ul의 각 표적 세포 유형을 96 웰 환저 플레이트(코닝(Corning))에 중복해서 가하였다. 효과기 T 세포를 세척하고, R10 배지에 1x106 세포/㎖로 재현탁시키고, 이어서 100 ul의 T 세포를 상기 지시된 웰에서 상기 표적 세포와 합하였다. 또한, T 세포만을 함유하는 웰을 대조군으로서 제조하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 18 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후에, 상등액을 수거하고 ELISA 분석을 수행하였다(eBioscience, 88-7316-77; 88-7025-77).
CD107a 염색
세포를 96 웰 플레이트 중의 160 ㎕의 완전 RPMI 배지에 1:1의 효과기 세포:T 세포 비(1x105 효과기 대 1x105 표적)로 도말하였다. 20 ㎕의 피코에리트린-표지된 항-CD107a 항체(BD 바이오사이언시즈(Biosciences), 555801)를 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 골지 스탑(Golgi Stop)(3 ㎖ RPMI 배지 중의 2 ul 골지 스탑, 20 ul/웰; BD 바이오사이언시즈, 51-2092KZ)을 가하고 상기 플레이트를 추가로 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 5 ㎕ FITC-항-CD8 및 5 ul APC-항-CD3을 가하고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 상기 샘플을 FACS 완충제로 세척하고 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
루시페라제 기재 CTL 분석.
Naml6-CBG 종양 세포를 생성시키고 루시페라제 기재 세포독성 T 림프구 분석의 변형된 버전에 사용하였다. 간단히, 녹색 방아벌레 루시페라제(CBG)를 pELNS 벡터에 클로닝시키고, 렌티바이러스내에 패키지하고, Naml6 종양 세포에 형질도입시키고 CBG 발현에 대해서 분류하였다. 생성되는 Naml6-CBG 세포를 세척하고 R10 배지에 1x105 세포/㎖로 재현탁시키고, 100 ul의 CBG-표지된 세포를 37 ℃에서 밤새 상이한 비의 T 세포(예를 들어 30:1, 15:1 등)와 인큐베이션하였다. 100 ul의 상기 혼합물을 96 웰 백색 광도계 플레이트로 옮겼다. 100 ul의 기질을 상기 세포에 가하고 발광을 즉시 측정하였다.
마우스 이종이식 연구
연구를 몇몇 변형과 함께 앞서 개시된 바와 같이 수행하였다(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009, 106(9):3360-3365). 간단히, 6 내지 10주된 NOD/SCID 감마(NSG) 마우스에, 0일째에 우측 옆구리에 1x106 PC3-CBG 종양 세포를 피하 주사하고 같은 마우스에, 5일째에 좌측 옆구리에 SK-OV3-CBG 종양 세포(5x106 세포/마우스, 피하)를 제공하였다. 상기 마우스를 PC3-CBG 종양 접종 후 23일째에 꼬리 정맥을 통해 T 세포로 처리하였으며, 따라서 상기 두 종양은 부피가 대략 200 ㎣이었다. 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포를 1x107 세포/마우스(10M) 또는 3x106 세포/마우스(3M)로 제공하였다.
이제 실시예 2의 실험에 사용된 물질 및 방법을 기재한다.
CAR에 대한 시험관내 전사(IVT) mRNA 및 렌티바이러스 벡터의 구성.
모든 유전자를 공개적으로 입수할 수 있는 서열 정보를 사용하여 PCR에 의해 합성하고/하거나 증폭시키고 조립하였다. 상기 PCR 산물을 공개적으로 입수할 수 있는 서열 정보에 근거하여 pGEM-GFP.64A의 GFP를 치환시켜 pGEM.64A 기재 IVT 벡터를 생성시킴으로써 pGEM.64A 기재 벡터내에 서브클로닝시켰다.
RNA 시험관내 전사(IVT).
mRNA를 합성하기 위한 시험관내 전사를 키트, 예를 들어 mMESSAGE mMACHINE® T7 울트라(앰비온 인코포레이티드(Ambion, Inc.))로 수행하여 항-역 캡 유사체(ARCA, 7-메틸(3'-O메틸)GpppG)m7G(5')ppp(5')G)를 갖는 IVT RNA를 생성시켰다. 상기 IVT RNA 생성물을 RNeasy 미니 키트(퀴아겐 인코포레이티드(Qiagen, Inc.), 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 정제시키고 정제된 RNA를 무-RNase 수 중에서 1 내지 2 ㎎/㎖로 용출시켰다.
T 세포의 RNA 일렉트포레이션.
정제된 휴지 T 세포 또는 CD3/CD28 비드-자극된 T 세포를 BTX EM830(하바드 어패러투스 BTX, 미국 매사추세츠주 홀리스톤 소재)을 사용하여 전기천공시켰다. 상기 전기천공된 T 세포를 OPTI-MEM(인비트로젠)으로 3회 세척하고 1-3x108/㎖의 최종 농도로 OPTI-MEM에 재현탁시켰다. 후속으로, 0.1 ㎖의 상기 세포를 10 ug IVT RNA(또는 지시된 대로)와 혼합하고 기재된 바와 같이 2-㎜ 큐벳에서 전기천공시켰다(Zhao et al., 2010, Cancer Res 70:9053-9061).
전기천공된 T 세포상에서 CLEAR 검출.
세포를 세척하고 유동 활성화된 세포 분류(FAC) 완충제(PBS + 0.1% 나트륨 아지드 및 0.4% BSA) 중에 현탁하였다. 항-PD1(APC) 및 항-CD27(PE)를 각각 PD1 또는 CD27 기재 CLEAR 검출에 사용하였다. 비오틴-표지된 다클론 염소 항-마우스 F(ab)2 항체(쥐 scFv의 경우) 또는 항-인간 항-F(ab)2(인간 scFv의 경우)(잭슨 임뮤노리써치(Jackson Immunoresearch), 미국 펜실배니아주 웨스트그로부 소재)를 상기 세포에 가하고 상기 세포를 4 ℃에서 25분 동안 인큐베이션하고 2회 세척하였다. 이어서 상기 세포를 피코에리트린-표지된 스트렙트아비딘(BD 파밍겐(Pharmingen), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로 염색하였다.
ELISA 및 루미넥스 분석.
표적 세포를 세척하고 R10 중에 106 세포/㎖로 현탁시켰다. 1x105 개의 각 표적 세포 유형의 세포를 96 웰 환저 플레이트(코닝)의 각각 2개 웰에 가하였다. 효과기 T 세포 배양물을 세척하고 R10에 106 세포/㎖로 현탁시켰다. 1x105 개의 효과기 T 세포를 상기 96 웰 플레이트의 지시된 웰 중의 표적 세포와 합하였다. 또한, T 세포만을 함유하는 웰들을 제조하였다. 상기 플레이트들을 18 내지 20시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후에, 상등액을 수거하고 표준 방법(피어스(Pierce), 미국 일리노이주 록포드 소재)을 사용하여 ELISA를 수행하였다.
CD107a 염색.
세포를 96 웰 플레이트 중의 160 ㎕의 완전 RPMI 배지에 1:1의 E:T(105 효과기:105 표적)로 도말하였다. 20 ㎕의 피코에리트린-표지된 항-CD107a 항체(BD 파밍겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 골지 스탑을 가하고 추가로 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 2.5시간 후에 10 ㎕ FITC-항-CD8 및 APC-항-CD3을 가하고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후에, 상기 샘플을 FACS 완충제로 1회 세척하였다. 유식 세포측정 포착을 BD 팩스칼리버(FacsCalibur)(BD 바이오사이언시즈)로 수행하고, 분석을 플로우조(FlowJo)(트리스타 인코포레이티드(Treestar Inc), 미국 오리건주 애쉬랜드 소재)로 수행하였다.
이제 실시예 3의 실험에 사용된 물질 및 방법을 기재한다.
1차 인간 림프구.
1차 림프구를 앞서 기재된 바와 같이(Barrett, et al., Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586) CD3 및 CD28 자극 항체(라이프 테크놀로지스, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재, 카탈로그)로 코팅된 미세비드로 자극하였다. T 세포를 10일째에 90% 송아지 태아 혈청 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)의 용액 중에서 1x108 세포/바이알로 냉동보존하였다.
mRNA 전기천공을 위한 ART 구조물의 생성.
EGFRF(Friedman et al., Journal of molecular biology 2008, 376(5):1388-1402; and Friedman et al., Protein engineering , design & selection : PEDS 2007, 20(4):189-199) 또는 ErbB2(Fedwisch et al., Journal of molecular biology 2010, 398(2):232-247)에 대한 하기의 친화성 항체 유사물질 재지시된 T 세포(ART) 서열들을 사용하여 ART를 생성시켰다.
EGFR의 경우:
서열번호 1,
ZEGFR955:VDNKFNKELEKAYNEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
서열번호 2, ZEGFR942:
VDNKFNKEMLIAMEEIGSLPNLNWGQEQAFILSLWDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
서열번호 3, ZEGFR1853:
VDNKFNKEFWWASDEIRNLPNLNGWQMTAFIASLADDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
서열번호 4, ZEGFR1907:
VDNKFNKEMWAAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
ErbB2의 경우:
서열번호 5,
ZHER2-342VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
서열번호 6, ZHER2-342-15
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYKDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
서열번호 7, ZHER2-342-14
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYADPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
서열번호 8, ZHER2-342-4
VDNKFEKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
친화성 항체 유사물질들의 친화성
ART Kd
ZEGFR955 185 nM
ZEGFR942 130 nM
ZEGFR1853 9.2 nM
ZEGFR1907 5.4nM
ZHER2.342 22 pM
ZHER2.342-15 180 pM
ZHER2.342-14 76 pM
ZHER2.342-4 44 pM
3가지 상이한 종류의 ART를 도 28에 도시된 바와 같이 구성하였다.
첫 번째는 CAR 기반 ART(도 28, 상부 패널)이다: 상기는 인간 CD8 알파로부터의 신호 펩티드(SP), 친화성 항체 유사물질, 6X His 태그(His-Tag), 인간 CD8 알파 힌지 및 막관통(CD8 Hinge&TM), 4-1BB 세포질 도메인(4-1BB Cyto) 및 CD3 제타 세포질 도메인(zeta Cyto)으로 구성된다. 두 번째는 TCR 기재 ART(도 28 하부 패널)이다: 상기는 잠재적으로 다수의 종양 항원들을 동시에 표적화할 수 있으며, 인간 CD8 알파로부터의 신호 펩티드(SP), ErbB2 친화성 항체 유사물질(ZHER2.342, ZHER2.342-15, ZHER2.342-14 또는 ZHER2.342-4) 및 전장 1G4 NY-ESO-1 TCR 알파 또는 베타쇄로 구성된다. 세 번째는 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 기재 ART이다: 상기는 인간 CD8 알파로부터의 신호 펩티드(SP), ErbB2 친화성 항체 유사물질(ZHER2.342, ZHER2.342-15, ZHER2.342-14 or ZHER2.342-4), GS 링커(또는 EGFR 친화성 항체 유사물질 및 GS 링커) 및 CD3 친화성 항체 유사물질(또는 scFv)로 구성된다.
모든 (하기) 친화성 항체 유사물질 DNA 서열들을 UpGene(DNA 코돈 최적화 연산의 어플리케이션)에 의해 생성시켰으며, 상기를 사용하여 상기 단백질 서열 정보에 근거한 PCR 프라이머 서열을 생성시켜 pGEM.64A 기재 RNA 시험관내 전사(IVT) 벡터 중의 ART 구조물들(오버랩핑 PCR을 통해)을 합성하였다(Zhao, et al., Cancer research 2010, 70(22):9053-9061).
Figure pct00001
Figure pct00002
mRNA 시험관내 전사 및 T 세포 전기천공.
mMESSAGE mMACHINE® T7 ULTRA 전사 키트(인비트로젠)를 사용하여 IVT RNA를 생성시켰다. CD3/CD28 비드 자극된 T 세포를 앞서 기재된 바와 같이(Zhao et al., Cancer Research 2010, 70(22):9053-9061) BTX EM830(하바드 어패러투스 BTX)을 사용하여 IVT RNA로 전기천공시켰다. 간단히, T 세포를 3회 세척하고 1-3x108/㎖의 최종 농도로 OPTI-MEM(인비트로젠)에 재현탁시켰다. 후속으로, 0.1 ㎖의 세포를 10 ug IVT RNA(또는 지시된 대로)와 혼합하고 2-㎜ 큐벳에서 전기천공시켰다.
ELISA 분석.
표적 세포를 세척하고 R10 배지(10% 송아지 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640; 인비트로젠)에 1x106 세포/㎖로 현탁시켰다. 100 ul의 각 표적 세포 유형을 96 웰 환저 플레이트(코닝)에 중복해서 가하였다. 효과기 T 세포를 세척하고, R10 배지에 1x106 세포/㎖로 재현탁시키고, 이어서 100 ul의 T 세포를 상기 지시된 웰에서 상기 표적 세포와 합하였다. 또한, T 세포만을 함유하는 웰을 대조군으로서 제조하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 18 내지 20시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후에, 상등액을 수거하고 ELISA 분석을 수행하였다(eBioscience, 88-7316-77; 88-7025-77).
CD107a 염색.
세포를 96 웰 플레이트 중의 160 ㎕의 완전 RPMI 배지에 1:1의 E:T(1x105 효과기:1x105 표적)로 도말하였다. 20 ㎕의 피코에리트린-표지된 항-CD107a 항체(BD 바이오사이언시즈, 555801)를 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 골지 스탑(3 ㎖ RPMI 배지 중의 2 ul 골지 스탑, 20 ul/웰; BD 바이오사이언시즈, 51-2092KZ)을 가하고 추가로 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 5 ㎕ FITC-항-CD8 및 5 ul APC-항-CD3을 가하고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 상기 샘플을 FACS 완충제로 세척하고 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
루시페라제 기재 CTL 분석.
SK-OV3-CBG 종양 세포를 하기와 같이 생성시키고 루시페라제 기재 CTL 분석의 변형된 버전에 사용하였다: 녹색 방아벌레 루시페라제(CBG)를 pELNS 벡터에 클로닝시키고, 렌티바이러스내에 패키지하고, SK-OV3 종양 세포에 형질도입시키고 CBG 발현에 대해서 분류하였다. 생성되는 SK-OV3-CBG 세포를 세척하고 R10 배지에 1x105 세포/㎖로 재현탁시키고, 100 ul의 CBG-표지된 세포를 37 ℃에서 8h 동안 상이한 비의 T 세포(예를 들어 30:1, 15:1 등)와 인큐베이션하였다. 100 ul의 상기 혼합물을 96 웰 백색 광도계 플레이트로 옮겼다. 100 ul의 기질을 가하고 발광을 즉시 측정하였다.
이제 실시예 4의 실험에 사용된 물질 및 방법을 기재한다.
CAR에 대한 시험관내 전사(IVT) mRNA 및 렌티바이러스 벡터의 구성.
모든 CAR(CD19, 메소텔린, cMet, GD2, PSCA, EGFRviii 및 ErBB2) 및 동일 분자에 대한 이중특이성 항체(Bis-RNA)를 암호화하는 RNA를 PCR에 의해 합성하고/하거나 증폭시키고 조립하였다. 상기 PCR 산물을 pGEM-GFP.64A의 GFP를 치환시켜(Zhao et al., 2003, Blood 102:4137-4142) pGEM.64A 기재 CAR을 생성시킴으로써 pGEM.64A 기재 벡터내에 또는 Bis-RNA 벡터내에 서브클로닝시켰다. 블리나투모맵을 암호화하는 DNA 및 완전인간 CD19 CAR(21D4-BBZ) 및 Bis-RNA(21D4-F11)를 공개 특허 제 US2013/050275 호로부터 제공된 서열분석 정보를 근거로 PCR에 의해 합성하고 조립하였다.
RNA 시험관내 전사(IVT).
mRNA를 합성하기 위한 시험관내 전사를 키트, 예를 들어 mMESSAGE mMACHINE® T7 울트라(앰비온 인코포레이티드)로 수행하여 항-역 캡 유사체(ARCA, 7-메틸(3'-O메틸)GpppG)m7G(5')ppp(5')G)를 갖는 IVT RNA를 생성시켰다. 상기 IVT RNA 생성물을 RNeasy 미니 키트(퀴아겐 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 정제시키고 정제된 RNA를 무-RNase 수 중에서 1 내지 2 ㎎/㎖로 용출시켰다.
T 세포의 RNA 일렉트포레이션.
정제된 휴지 T 세포 또는 CD3/CD28 비드-자극된 T 세포를 BTX EM830(하바드 어패러투스 BTX, 미국 매사추세츠주 홀리스톤 소재)을 사용하여 전기천공시켰다. 상기 전기천공된 T 세포를 OPTI-MEM(인비트로젠)으로 3회 세척하고 1-3x108/㎖의 최종 농도로 OPTI-MEM에 재현탁시켰다. 후속으로, 0.1 ㎖의 상기 세포를 10 ug IVT RNA(또는 지시된 대로)와 혼합하고 기재된 바와 같이 2-㎜ 큐벳에서 전기천공시켰다(Zhao et al., 2010, Cancer Res 70:9053-9061).
전기천공된 T 세포상에서 CAR 검출.
세포를 세척하고 유동 활성화된 세포 분류(FAC) 완충제(PBS + 0.1% 나트륨 아지드 및 0.4% BSA) 중에 현탁하였다. 비오틴-표지된 다클론 염소 항-마우스 F(ab)2 항체(쥐 scFv의 경우) 또는 항-인간 항-F(ab)2(인간 scFv의 경우)(잭슨 임뮤노리써치, 미국 펜실배니아주 웨스트그로부 소재)를 상기 세포에 가하고 상기 세포를 4 ℃에서 25분 동안 인큐베이션하고 2회 세척하였다. 이어서 상기 세포를 피코에리트린-표지된 스트렙트아비딘(BD 파밍겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로 염색하였다.
ELISA 및 루미넥스 분석.
표적 세포를 세척하고 R10 중에 106 세포/㎖로 현탁시켰다. 1x105 개의 각 표적 세포 유형의 세포를 96 웰 환저 플레이트(코닝)의 각각 2개 웰에 가하였다. 효과기 T 세포 배양물을 세척하고 R10에 106 세포/㎖로 현탁시켰다. 1x105 개의 효과기 T 세포를 상기 96 웰 플레이트의 지시된 웰 중의 표적 세포와 합하였다. 또한, T 세포만을 함유하는 웰들을 제조하였다. 상기 플레이트들을 18 내지 20시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후에, 상등액을 수거하고 표준 방법(피어스, 미국 일리노이주 록포드 소재)을 사용하여 ELISA를 수행하였다.
CD107a 염색.
세포를 96 웰 플레이트 중의 160 ㎕의 완전 RPMI 배지에 1:1의 E:T(105 효과기:105 표적)로 도말하였다. 20 ㎕의 피코에리트린-표지된 항-CD107a 항체(BD 파밍겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 골지 스탑을 가하고 추가로 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 2.5시간 후에 10 ㎕ FITC-항-CD8 및 APC-항-CD3을 가하고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 상기 샘플을 FACS 완충제로 1회 세척하였다. 유식 세포측정 포착을 BD 팩스칼리버(BD 바이오사이언시즈)로 수행하고, 분석을 플로우조(트리스타 인코포레이티드, 미국 오리건주 애쉬랜드 소재)로 수행하였다.
CFSE 기재 T 세포 증식 분석.
PBS 중의 10x106/㎖ 농도의 T 세포를 CFSE로 3 μM로 실온에서 3분 30초 동안 표지하였다. 상기 표지화를 5% FBS(PBS 중의)로 정지시키고 R10으로 2회 세척하고 10 IU/㎖ IL-2가 있는 R10에서 배양하였다. 밤새 배양 후에, 상기 CFSE 표지된 T 세포를 전기천공시켰다. 전기천공 2 내지 4시간 후에, 상기 T 세포를 1:1의 T:자극제로, 조사된 종양 또는 K562 세포주로 자극하였다. CFSE 희석을 유식 세포측정에 의해 검사하고 세포수를 지시된 바와 같은 시간에 카운트하였다.
유식 CTL.
유식 세포측정 세포독성 분석의 약간 변형된 버전을 앞서 기재된 바와 같이 사용하였다(Zhao et al., 2010, Cancer Res 70:9053-9061, Hermans et al., 2004, J Immunol Methods 285:25-40). 녹색 방아벌레 루시페라제(CBG) 종양 세포를 생성시키고 하기와 같이 루시페라제 기재 CTL 분석에 사용하였다: CBG를 pELNS 벡터에 클로닝시키고, 렌티바이러스내에 패키지하고, 종양 세포에 형질도입시켰다. CBG 종양 세포를 CBG 발현에 대해서 분류하였다. 생성되는 CGB 종양 세포를 세척하고 R10 배지에 1x105 세포/㎖로 재현탁시키고, 100 ul의 CBG-표지된 세포를 37 ℃에서 밤새 상이한 비의 T 세포(예를 들어 30:1, 15:1 등)와 배양하였다. 100 ul의 상기 혼합물을 96 웰 백색 광도계 플레이트로 옮겼다. 100 ul의 기질을 각 웰에 가하고 발광을 즉시 측정하였다.
마우스 이종이식 연구
연구를 몇몇 변형과 함께 앞서 개시된 바와 같이 수행하였다(Barrett et al., Hum Gene Ther 22:1575-1586). 간단히, 6 내지 10주된 NOD-SCID-?c-/-(NSG) 마우스를 잭슨 레보라토리(미국 메인주 바하버 소재)로부터 수득하거나 승인된 연구 동물 보호 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜하에서 사내 사육하고 무균 상태에서 유지시켰다. CD19+ 인간 ALL 세포주, Nalm-6에 CBG(Nalm6-CBG)를 형질도입시키고 이를 멸균 PBS 0.2 ㎖ 중에서 100만개 세포의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. T 세포를 Nalm-6-CBG의 주사 후 7일째에 꼬리 정맥을 통해 주사하였다.
생물발광 영상화(BLI).
종양 성장을 BLI에 의해 모니터하였다. 마취된 마우스를 제노젠 스펙트럼 시스템 앤드 리빙 이미지(Xenogen Spectrum system and Living Image) v3.2 소프트웨어를 사용하여 영상화하였다. D-루시페린(캘리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences), 미국 매세추세츠주 홉킨톤 소재)을 15 ㎎/㎖의 농도(100 ㎕ 루시페린 용액/10 g 마우스 체중)로 멸균 PBS에 재현탁시키고 복강내(IP) 주사를 통해 150 ㎎/㎏ 체중의 비로 상기 마우스에게 투여하였다. M108-Luc의 선행 적정은 대략 5분째에 광자 방출의 피크 시간을 가리켰으며, 피크 방출은 약 6 내지 10분간 지속되었다. 각각의 동물을 단독으로(광자 정량분석을 위해) 또는 5마리 이하의 마우스 그룹(디스플레이를 목적으로)으로 루시페린 주사 후 동일한 비교 시점에서(6분) 전-후 복와위로 영상화하였다. 데이터를 직선 척도의 중간 범위에 도달하거나(600 내지 60000 카운트) 또는 최대 노출 설정에 도달할 때까지(f/stop 1, 큰 비닝 및 1-2초) 수집하고, 이어서 광자/초/cm2/스테라디안으로 전환시켜 노출 시간, f/stop, 비닝 및 동물 크기에 대해 각 상을 표준화하였다. 해부학적 위치측정을 위해서, 광 강도를 나타내는 의사색상 지도를 그레이스케일 체-표면 참조 상 위에 겹쳐놓았다. 데이터 디스플레이를 위해서, 루시페라제 함유 세포가 없는 마우스를 최대 설정에서 영상화하고 3.6x105 p/s/cm2/sr의 평균 값을 수득하였다.
이제 실시예 5의 실험에 사용된 물질 및 방법을 기재한다.
1차 인간 림프구.
1차 림프구를 앞서 기재된 바와 같이(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586) CD3 및 CD28 자극 항체(라이프 테크놀로지스, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재, 카탈로그)로 코팅된 미세비드로 자극하였다. T 세포를 10일째에 90% 송아지 태아 혈청 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)의 용액 중에서 1x108 세포/바이알로 냉동보존하였다.
mRNA 전기천공 및 렌티바이러스 형질도입을 위한 구조물의 생성.
상이한 돌연변이를 갖는 1G4 NY-ESO-1 TCR을 관련된 간행물에 의해 제공된 서열분석 정보(The Journal of experimental medicine 2005, 201(8):1243-1255; J Immunol 2008, 180(9):6116-6131)에 근거하여 합성하고/하거나 PCR에 의해 증폭시키고 pGEM.64A RNA 기재 벡터 또는 pTRPE 렌티바이러스 벡터에 서브클로닝하였다.
ErbB2 애피바디 서열:
서열번호 5, ZHER2-342 (342)
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
서열번호 6, ZHER2-342-15 (342-15)
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYKDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
서열번호 7, ZHER2-342-14 (342-14)
VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYADPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
서열번호 8, ZHER2-342-4 (342-4)
VDNKFEKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
mRNA 시험관내 전사 및 T 세포 전기천공.
T7 mscript 시스템 키트(셀스크립트)를 사용하여 시험관내 전사된(IVT) RNA를 생성시켰다. CD3/CD28 비드 자극된 T 세포를 앞서 기재된 바와 같이(Cancer research 2010, 70(22):9053-9061) BTX EM830(하바드 어패러투스 BTX)을 사용하여 IVT RNA로 전기천공시켰다. 간단히, T 세포를 3회 세척하고 OPTI-MEM(인비트로젠)에 1-3x108 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다. 후속으로, 0.1 ㎖의 세포를 10 ug IVT RNA(또는 지시된 대로)와 혼합하고 2 ㎜ 큐벳에서 전기천공시켰다.
ELISA 분석.
CD19를 발현하는 상이한 종양 세포주들인 표적 세포들을 세척하고 R10 배지(10% 송아지 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640; 인비트로젠)에 1x106 세포/㎖로 현탁시켰다. 100 ul의 각 표적 세포 유형을 96 웰 환저 플레이트(코닝)에 중복해서 가하였다. 효과기 T 세포를 세척하고, R10 배지에 1x106 세포/㎖로 재현탁시키고, 이어서 100 ul의 T 세포를 상기 지시된 웰에서 상기 표적 세포와 합하였다. 또한, T 세포만을 함유하는 웰을 대조군으로서 제조하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 18 내지 20시간 동안 배양하였다. 상기 인큐베이션 후에, 상등액을 수거하고 ELISA 분석을 수행하였다(eBioscience, 88-7316-77; 88-7025-77).
CD107a 염색
세포를 96 웰 플레이트 중의 160 ㎕의 완전 RPMI 배지에 1:1의 효과기 세포:T 세포 비(1x105 효과기 대 1x105 표적)로 도말하였다. 20 ㎕의 피코에리트린-표지된 항-CD107a 항체(BD 바이오사이언시즈, 555801)를 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 골지 스탑(3 ㎖ RPMI 배지 중의 2 ul 골지 스탑, 20 ul/웰; BD 바이오사이언시즈, 51-2092KZ)을 가하고 상기 플레이트를 추가로 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 5 ㎕ FITC-항-CD8 및 5 ul APC-항-CD3을 가하고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 상기 샘플을 FACS 완충제로 세척하고 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
루시페라제 기재 CTL 분석.
Naml6-CBG 종양 세포를 생성시키고 루시페라제 기재 세포독성 T 림프구 분석의 변형된 버전에 사용하였다. 간단히, 녹색 방아벌레 루시페라제(CBG)를 pELNS 벡터에 클로닝시키고, 렌티바이러스내에 패키지하고, Naml6 종양 세포에 형질도입시키고 CBG 발현에 대해서 분류하였다. 생성되는 Naml6-CBG 세포를 세척하고 R10 배지에 1x105 세포/㎖로 재현탁시키고, 100 ul의 CBG-표지된 세포를 37 ℃에서 밤새 상이한 비의 T 세포(예를 들어 30:1, 15:1 등)와 배양하였다. 100 ul의 상기 혼합물을 96 웰 백색 광도계 플레이트로 옮겼다. 100 ul의 기질을 상기 세포에 가하고 발광을 즉시 측정하였다.
마우스 이종이식 연구
연구를 몇몇 변형과 함께 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009, 106(9):3360-3365). 간단히, 6 내지 10주된 NOD/SCID 감마(NSG) 마우스에, 0일째에 우측 옆구리에 1x106 PC3-CBG 종양 세포를 피하 주사하고 같은 마우스에, 5일째에 좌측 옆구리에 SK-OV3-CBG 종양 세포(5x106 세포/마우스, 피하)를 제공하였다. 상기 마우스를 PC3-CBG 종양 접종 후 23일째에 꼬리 정맥을 통해 T 세포로 처리하였으며, 따라서 상기 두 종양은 부피가 대략 200 ㎣이었다. 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포를 1x107 세포/마우스(10M) 또는 3x106 세포/마우스(3M)로 제공하였다.
이제 상기 실험들의 결과를 기재한다.
실시예 1: TCR 및 이중특이성 항체를 발현하는 T 세포
렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터에 의해 항-종양 항원 TCR 재-지시된 T 림프구로 처리된 암 환자는 유망한 결과를 보인다. 이 연구에서, RNA를 T 세포에 전기천공시켜, 암 입양 면역요법에 대한 효율적인 치료가 발휘될 수 있는지의 여부를 판정하였다. 상기 T 세포들을, Naml6 백혈병 및 A549 폐암 마우스 모델에서 외인성 TCR 및 이중특이성 항체를 발현한 T 림프구의 생체내 효능을 평가하기 위해 비교하였다.
TCR 재지시된 T 세포 입양 면역요법을 개선시키기 위해서, T 세포를 TCR RNA 및 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE)로 전기천공시켰다. 도 1은 TCR 및 BiTE로 동시-전기천공된 T 세포에서의 트랜스유전자 발현을 나타낸다. T 세포를 CD19.CD3(상부 패널) 또는 4D5.CD3(ErbB2)(중간 패널) BiTE로, CD3제타 및 입실론의 존재 또는 부재하에서 동시-전기천공시켰다. 전기천공 후 18시간 째에, T 세포를 TCR vb13.1 및 mIgG Fab(또는 Her2-Fc)에 대해 염색하였다. 하부 패널은 전기천공 후 3일째에 TCR(vb13.1) 발현을 나타낸다.
기능성이 상기 동시-전기천공된 T 세포에서 개선되었다. 도 2 및 3은 CD107a가 종양 세포로 자극 후 T 세포에서 상향-조절되었음을 예시한다. 상기 T 세포를 TCR RNA 및 BiTE RNA로 동시-전기천공시키고, 이어서 CD19 및 NY-ESO-1(ESO)에 대해 단일 또는 이중 양성을 갖는 종양 세포주로 자극하였다. IFN-감마 및 IL-2 생성이 모두 동시-전기천공된 T 세포에서 증가하였다(도 4 및 5). 더욱이, CD107a는 NY-ESO-1 TCR(1G4) 및 메소텔린 BiTE(ssl.CD3)를 발현하는 종양 자극된 T 세포에서 상향-조절되었다(도 6).
상기 TCR 및 BiTE를 동시-발현하는 세포를 백혈병 마우스 모델에 주사하였다. NOD/SCID(NSG) 마우스 모델에서, NY-EOS-1 야생형 TCR 및 CD19.CD3 BiTE를 발현하는 RNA 전기천공된 T 세포를 종양 세포 주사 후 5일째에 주사하였다(도 7). NY-EOS-1 야생형 TCR RNA 및 CD19.CD3 BiTE로 전기천공된 T 세포는 효능 있는 항-종양 활성을 나타낸 반면, NY-ESO-1 TCR을 갖는 T 세포는 훨씬 덜 효능이 있는 것으로 밝혀졌다(도 8).
변형된 TCR을 발현하는 T 세포는 또한 상기 T 세포 중의 이중특이성 항체와 병용시 HLA 제한 없이 동족 및 MHC/펩티드 및 표면 종양 항원을 모두 인식하였다(도 9). T 세포내로 전기천공된 이중특이성 항체 RNA 및 TCR RNA의 구조물 목록을 도 10A 및 10B에 나타낸다. 상기 변형된 NY-ESO-1 TCR 및 이중특이성 항체를 발현하는 T 세포는 동족 항원(HLA-A2/NY-ESO-1) 및 CD19 또는 Her2를 모두 인식하였다(도 11).
실시예 2: 이중특이성 항체 및 CLEAR로 변형된 T 세포
키메릭 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR) 변형된 T 세포를 사용하는 암의 입양 면역요법은 암 치료에 유망한 전략임이 입증되었다. 암, 특히 고형 종양의 이종성으로 인해, 암을 치료하기 위해 단일 종양 항원을 표적화하는 것은 상기 표적화된 항원에 대해 음성이거나 상기 표적화된 항원을 하향-조절하는 종양 세포의 면역 회피를 유도하는 듯하다. 따라서, 다수 종양 항원을 동시에 표적화하는 것은 치료를 증진시킬 가능성을 갖는다. 구조적 유사성으로 인해 서로 잠재적으로 방해하는 다수의 단쇄 가변 단편(scFv) CAR을 모으는 대신에, 2개 분자의 동시-도입에 의해 다수 종양 항원을 표적화하는 신규 방법이 개발되었다. 상기 신규 분자를 "키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)"(표적-1)라 명명하였으며 이는 세포내 T 세포 활성화 신호전달 도메인, 예를 들어 보조-자극 신호가 있거나 없는 CD3 제타, 및 세포외 도메인으로 구성되었다. 상기 세포외 도메인은 1) 항체 또는 특이적인 수용체/리간드를 인식하고, 2) 종양 항원 또는 건강한 조직상에서는 발현되지 않는 다른 분자에 특이적으로 결합하도록 선택되었다. 상기 세포를 또한 이중특이성 항체를 발현하도록 조작하거나 또는 융합 단백질이 한쪽 면 상의 종양 항원(표적 2) 및 다른 쪽 면상의 CLEAR의 세포외 도메인에 결합하도록 조작하였다. 이는 제2 종양 발현 표적의 T 세포 인식을 가능하게 하였다(도 12).
이들 2개 분자가 T 림프구내에 도입된 후에, 상기 CLEAR은 표적-1을 표적화하였으며 동시에 상기 분비된 이중특이성 항체(또는 융합 단백질)에 결합하였다. 상기 T 세포는 표적-1의 직접적인 인식에 의해 및/또는 종양 세포 및 분비된 이중특이성 항체(또는 융합 단백질)상의 표적-2에서 CLEAR과 동시에 맞물림으로써 촉발되었다.
개념 증명으로서, 암의 면역요법에 중요한 표적인 2개 수용체/리간드 표적 PD1/PD-L1 및 CD27/CD70을 PD1 또는 CD27 CLEAR을 생성하도록 선택하였다. 메소텔린, ErbB2 및 CD19를 표적 2 항원으로서 사용하였다. PD1(2D3, 4A11 및 4H1)(5) 또는 CD27(C2177, M709 및 M708)(6)에 대해 상이한 친화성을 갖는 3개의 scFv를 선택하고 상기 언급한 모든 표적-2 리간드에 대한 scFv를 갖는 이중특이성 구조물을 제조하였다.
상이한 보조-자극 또는 보조-수용체 신호전달 도메인을 갖는 PD1 CLEAR을 또한 구성하였다. CD27 CLEAR을 CD27(CD27-Z)(7) 또는 CD27-4-1BB(CD27-BBZ) 신호전달 도메인을 사용하여 구성하였다(도 13A 및 13B). 상기 구조물을 모두 시험관내 전사(IVT) 벡터를 통해 RNA로 제조하고 CD3/CD28 비드 자극된 T 세포를 전기천공시키기 위해 IVT RNA를 제조하고 사용하였다.
PDL1 또는 CD70 양성 종양을 표적화하는 PD1 또는 CD27 CLEAR 재지시된 T 세포.
CD27 또는 PD1 CLEAR을 단독으로 발현하는 T 세포의 기능을 시험하였다. CD27 CLEAR은 세포 표면상에서 발현될 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 14). 상기 T 세포가 CD70을 발현하는 종양 세포주로 자극되었을 때, 상기 T 세포는 특이적으로 활성화되었으며, 이는 CD107a 발현의 현저한 상향-조절에 의해 입증되었다(도 15).
T 세포가 상이한 보조-자극(CD28 또는 4-1BB) 또는 보조-수용체(CD4 또는 CD8) 분자를 사용함으로써 기능하는지를 시험하기 위해서, 5개의 PD1 CLEAR을 T 세포상의 그들의 발현에 의해 시험하였으며(도 16) 및 PDL1 양성 세포주 Nalm6-PD-L1에 대한 그들의 반응성을 측정하였다. 모든 PD1 CLEAR을 갖는 T 세포는 약 50% 내지 약 70% CD107a 상향-조절 및 시토카인 생성에 의해 입증된 바와 같이 PD-L1 양성 종양에 대해 강하게 반응하였다. 흥미롭게, CD4 또는 CD8 보조-수용체 신호전달을 갖는 T 세포 PD1 CLEAR은 다른 PD1 CLEAR들: CD28 또는 4-1BB와 함께 또는 어떠한 동시-신호전달도 없이(제타 단독, PD1-Z) 필적하는 CD107a 발현을 나타내었다. IFN-감마 및 IL-2 분비는 모두 현저하게 낮았으며(도 17), 이는 CD4 또는 CD8 동시-신호전달을 갖는 PD1 CLEAR T 세포가 다른 것들과 상이하게 반응함을 가리키며, 이는 시토카인 폭풍으로 인해 적은 독성과 함께 치료에 이로울 수 있다.
이중특이성 항체와 PD1 CLEAR을 겸비하는 eCLEAR에 의한 다중 종양 항원 표적화.
PD1 eCLEAR을 갖는 T 세포를, PD1 CLEAR(PD1-Z)에 대한 RNA 및 PD1 및 메소텔린(2D3-ss1, 4A11-ss1 및 4H1-ss1)에 대한 이중특이성 항체에 대한 RNA를 T 세포에 동시-전기천공시킴으로써 시험하였다. 유식 세포측정 염색은 상기 CLEAR 및 이중특이성 항체가 모두 검출될 수 있음을 보였다(도 18). 보다 중요하게, 상기 T 세포가 단일 또는 이중 표적 항원을 발현하는 상이한 세포주로 자극되었을 때, 상기는 항원 특이적인 방식으로 단일 항원 양성 종양 세포주 또는 이중 양성 종양 세포주를 인식하였다.
상기 CARc ss1.BBZ와의 비교로, CLEAR(PD1Z&4A11.ss1)을 갖는 T 세포는 CD107a 상향-조절 분석에서 메소텔린 단일 양성 세포주, K562-meso에 대해 필적하는 용해 능력을 나타내었다. 그러나, PD-L1에 의해 렌티-바이러스 형질도입되고 메소텔린에 대해 약하게 양성인 종양 세포주, PC3-PDL1의 경우, eCLEAR을 갖는 T 세포는 ss1.bbz CAR을 갖는 T 세포보다 훨씬 더 높은 CD107a 상향-조절을 가졌다(도 19).
상기 자극된 T 세포의 시토카인 생성(IFN-감마 및 IL-2)을 ELISA에 의해 시험하였다. CLEAR RNA가 전달된 T 세포는 ss1.BBZ CAR 전달된 T 세포만큼 높거나 또는 훨씬 더 높은 시토카인 생성을 나타내었지만, 단일 양성 또는 이중 양성 표적 세포주로 자극된 CLEAR 전달된 T 세포의 경우 IL-2 및 IFN-감마 모두에 대한 검출 가능한 시토카인은 거의 없었다. 대조적으로, ss1.bbz CAR이 전달된 T 세포는 높은 수준의 IL-2 및 IFN-감마 모두를 분비하였다(도 20). 낮은 시토카인 생성과 함께 높은 용해 능력의 성질은, 불리한 시토카인 폭풍의 발생 기회를 줄일 수 있기 때문에, 암 환자의 치료에 이점을 가질 수 있다.
CLEAR이 메소텔린 이외의 종양 항원을 효율적으로 표적화할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해서, ErbB2(4D5), 또는 CD19, 또는 PSCA(2B3)를 갖는 PD1에 대한 이중특이성 항체 구조물을 생성시켰다. 신규의 이중특이성 항체들에 대한 RNA를 T 세포내에 동시-전기천공시키고, 이들의 관련된 CAR(4D5.BBZ, 19.BBZ 또는 2B3.BBZ)과 비교하였다. CD107a 발현을, 이들 T 세포를 종양 세포주로 자극한 후에 검사하였으며 결과는 PD1/CD19 CLEAR(PD1-Z/2D3-CD19, PD1-Z/4A11-CD19)이 CD19 단일 양성 종양 세포, Nalm6을 CD19 CAR(19.BBZ)만큼 효율적으로 인식할 수 있음을 입증하였다. CD19 CAR T 세포는 CD19/PDL1 이중 양성 Nalm6-PDL1 세포에 대한 그의 반응성을 감소시켰다(CD107a+/CD8+에 대한 52.2% 대 56.6%). CD107a는 또한 PD1/CD19 CLEAR T 세포의 경우 약간 증가되었다. 상기 결과는 또한, PD1/4D5 및 PD1/2B3 CLEAR 모두에 대해서, 상기 T 세포를 이중 양성 종양으로 자극했을 때, CD107a가, 관련된 CAR보다 CLEAR을 갖는 T 세포에서 더 높게 발현됨을 보였다(도 21).
2개의 종양 항원, ErbB2 및 CD19에 대한 CD27 CLEAR을 또한 시험하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, CD27 및 mIgG Fab에 대한 표면 염색(ErbB2 표적을 갖는 CD27-z의 경우 상부 패널 및 CD19 표적을 갖는 CD27-z의 경우 하부 패널)은 상이한 수준으로 상기 T 세포에 결합된 분비된 이중특이성 항체 및 CD27 모두의 트랜스유전자 발현을 나타내었다. 상기 T 세포가 CD70 및 ErbB2에 대해 단일 또는 이중 양성인 종양 세포주로 자극되었을 때, 항원 특이성 T 세포 활성화가 관찰되었다. 특히, CD70-/ErbB2+ 종양 MDA231, CD27-Z/M708-4D5는 약 3%의 배경 수준에 비해, 약 33.2%의, 현저하게 증가된 CD107a 발현을 나타내었다(도 23). CD27/D19 CLEAR을 갖는 T 세포를 CD70 및 CD19에 대해 단일 또는 이중 양성인 세포주로 자극하였을 때(도 24), CD27/ErbB2에 대해 나타난 바와 동일하게, 항원 특이성 T 세포 활성화가 관찰되었으며 CD27/CD17 CLEAR은 CD27/CD19 이중 양성 세포 모두, 또는 CD70 또는 CD19 단일 양성 세포에 대해 명백한 항-종양 활성을 나타내었다. PD1/메소텔린 eCLEAR로부터의 결과와 함께, 본 명세서에 나타낸 데이터는 종양 항원이 CLEAR 및 이중특이성 항체를 사용하여 간접적으로 표적화될 수 있음을 가리킨다. 따라서, 2개의 종양 항원을 서로 방해 없이 동시에 표적화할 수 있다.
PD1 CLEAR 및 이중특이성 Ab가 병용된 eCLEAR을 갖는 친화성 감소된 항-ErbB2 scFv(4D5-5, 4D5-4, 4D4-3 및 4D5-2)를 사용하는 ErbB2 표적화.
항-ErbB2 4D5는 T 세포 기반 암 치료에 사용되지 않는 높은 친화성 scFv이다. PD1 eCLEAR을 갖는 T 세포를 PD1 CLEAR(PD1-Z) 및 PD1(2D3, 4A11 또는 4H1) 및 ErbB2(4D5, 4D5-2, 4D5-3, 4D5-4 또는 4D5-5)에 대한 이중특이성 항체 모두에 대한 RNA 동시-전기천공에 의해 시험하였다. 유식 세포측정 염색은 PD1 CLEAR 및 이중-특이성 항체가 모두 상기 동시-전기천공된 T 세포의 대부분에서 검출될 수 있음을 입증하였다(도 24).
이어서 T 세포를 단일 또는 이중 표적 항원을 발현하는 상이한 종양 세포주 또는 ErbB2 및/또는 PD-L1 RNA로 전기천공된 K562 세포로 자극하였다(도 25). 도 26 및 27에 나타낸 바와 같이, PD1 CLEAR 및 항-PD1/항-ErbB2 이중특이성 항체 모두로 동시-전기천공된 T 세포는 ErbB2 고 발현 세포주, SK-OV3 및 ErbB2 RNA 전기천공된 K562에 대한 친화성 관련된 T 세포 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 4H1-4D5, 4H1-4D5-4 및 4D5-2는 결론적으로 불충분하게 친화성인 것으로 밝혀졌다.
ErbB2 scFv(4D5), 2D3-4D5 및 4A11-4D5에 대해 높은 친화성을 갖는 PD1 CLEAR 및 이중특이성 항체로 동시-전기천공된 T 세포는 PD1 음성 및 낮은 수준의 ErbB2 발현 종양 세포주, MCF7에 대해 반응성을 나타내었다. ErbB2 scFv(4D5), 4D5-5, 4D5-4 및 4D5-3에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는 PD1 CLEAR 및 이중특이성 항체로 동시-전기천공된 T 세포는 PD1 음성 및 낮은 수준의 ErbB2 발현 종양 세포주, MCF7에 대해 완전히 반응성을 나타내지는 않았다. 이는 상기 CLEAR 및 이중특이성 항체가 ErbB2 과발현 종양을 갖는 암 환자의 치료에 안전하게 사용될 수 있음을 암시하였다.
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실시예 3: 친화성 분자 키메릭 수용체 또는 이중특이성 항체를 발현하는 T 세포
도 29는 항-His 항체에 의한 염색에 의해 친화성 항체 유사물질 재지시된 T 세포(ART)의 발현을 나타내는 그래프 패널이다. EGFR(955.BBZ, 1853.BBZ 또는 1970.BBZ) 또는 ErbB2 (342.BBZ, 432-15.BBZ, 342-14.BBZ 또는 342-4.BBZ)에 대한 ART를 암호화하는 RNA 10 마이크로그램을 T 세포에 전기천공시키고 R10에서 밤새 배양하였다. 100 마이크로리터의 전기천공된 T 세포를 ART 발현의 유식 세포측정 검출을 위해 항-His 태그 항체에 의해 염색하였으며(하부 패널) 상기 ART RNA 모두로 전기천공된 T 세포는, 전기천공되지 않은(No EP) T 세포에 비해, 양으로 염색되는 것으로 나타났다.
도 30은 EGFR 및 ErbB2 ART의 특이적인 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다. 도 29에 나타낸 바와 같이 전기천공된 T 세포를, 각각의 종양 명칭 아래에 나타낸 바와 같은, EGFR 및/또는 ErbB2를 발현하는 4개의 상이한 종양 세포주로 자극하였다. 4시간 인큐베이션 후에, CD107a 상향조절을, 상기 세포를 CD107a-PE, CD3-APC 및 CD8-FITC로 염색하여 측정하였다. 도 29에 나타낸 바와 같이, 상기 EGFR ART는 모두 EGFR 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MDA468)에 대해 유일하게 강하게 반응성이나, EGFR 음성 종양 MCF7에 대해서는 그렇지 않았다. 모든 ErbB2 ART가 ErbB2 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MCF7)에 대해 강하게 반응성이나, ErbB2 음성 종양 MDA468에 대해서는 그렇지 않았다. 4D5.BBZ 및 2224.BBZ는 각각 ErbB2 및 EGFR에 대한 CAR이었다.
도 31은 EGFR 및 ErbB2 ART의 특이적인 IFN-감마 생성을 나타내는 그래프이다. 도 29에 나타낸 바와 같이 전기천공된 T 세포를, 각각의 종양 명칭 아래에 나타낸 바와 같은, EGFR 및/또는 ErbB2를 발현하는 4개의 상이한 종양 세포주로 자극하였다. 밤새 인큐베이션 후에, 상등액을 사용하여 ELISA에 의해 INF-감마 생성을 측정하였다. IFN-감마는 EGFR 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MDA468)에 의해 자극된 모든 EGFR ART에 대해서 상이한 수준으로 검출될 수 있었지만, EGFR 음성 종양 MCF7에 대해서는 그렇지 않았다. 모든 ErbB2 ART가 ErbB2 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MCF7)에 대해 강하게 반응성이나, ErbB2 음성 종양 MDA468에 대해서는 그렇지 않았다. 4D5.BBZ 및 2224.BBZ는 각각 ErbB2 및 EGFR에 대한 CAR이었다.
도 32는 EGFR 및 ErbB2 ART의 특이적인 IL-2 생성을 나타내는 그래프이다. 도 29에 나타낸 바와 같이 전기천공된 T 세포를, 각각의 종양 명칭 아래에 나타낸 바와 같은, EGFR 및/또는 ErbB2를 발현하는 4개의 상이한 종양 세포주로 자극하였다. 밤새 인큐베이션 후에, 상등액을 사용하여 ELISA에 의해 IL-2 생성을 측정하였다. IL-2는 EGFR 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MDA468)에 의해 자극된 모든 EGFR ART에 대해서 상이한 수준으로 검출될 수 있었지만, EGFR 음성 종양 MCF7에 대해서는 그렇지 않았다. 모든 ErbB2 ART가 ErbB2 양성인 종양 세포주(SK-OV3, MDA231 및 MCF7)에 대해 강하게 반응성이나, ErbB2 음성 종양 MDA468에 대해서는 그렇지 않았다. 4D5.BBZ 및 2224.BBZ는 각각 ErbB2 및 EGFR에 대한 CAR이었다.
도 33은 EGFR 및 ErbB2 ART의 특이적인 용해 활성을 나타내는 그래프이다. 2개의 EGFR 및 2개의 ErbB2 ART의 살해 능력을 시험하기 위한 별도의 실험에서, EGFR 및 ErbB2 모두에 대해 양성인 종양 세포주 SK-OV3에 대해 이들의 관련된 CAR들을 비교하였다. ART T 세포는 상기 종양 세포를 관련된 CAR T 세포만큼 효율적으로 살해하였다.
도 34A는 친화성 항체 유사물질 및 His-태그 서열을 TCR의 알파 또는 베타 쇄의 N'에 첨가함에 의한 친화성 항체 유사물질 변형된 TCR(Affi-TCR)의 도식적 스케치이다.
도 34B는 친화성 항체 유사물질 재지시된 TCR(Affi-TCR) RNA 전기천공된 T 세포의 Vb13.1 TCR 및 His-태그 검출을 나타내는 그래프 패널이다. T 세포를 NY-ESO-1(1G4) TCR 알파(a) 및 베타(b), 또는 이들의 ErbB2 친화성 항체 유사물질(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형으로 동시-전기천공시켰다. 밤새 후에, vb13.1 및 His-태그를 유식 세포측정에 의해 검출하였다.
도 34C는 ErbB2 친화성 항체 유사물질 서열을 나타낸다.
도 35는 Affi-TCR RNA 전기천공된 T 세포의 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다. CD107a 분석을 위해서, T 세포를 도 34B에서 지시하는 바와 같이 TCR 알파(a) 또는 베타(b), 또는 이들의 ErbB2 친화성 항체 유사물질(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형으로 동시-전기천공시키고 종양 세포주 Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-), A549-ESO (NY-eso-1+, ErbB2+), SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+), A549 (NY-eso-1-, ErbB2+), 또는 Nalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-)로 자극하였다. 결과는 ErbB2 Affi-TCR을 갖는 T 세포가 Ny-ESO-1 및 ErbB2 양성 종양 모두를 특이적으로 인식할 수 있었음을 나타낸다.
도 36A는 친화성 항체 유사물질 및 G4S 링커를 어느 한 CD3 입실론의 N'에 부가함에 의한 친화성 항체 유사물질 변형된 CD3 입실론의 도식적 스케치이다.
도 36B는 T 세포의 전기천공을 나타내는 표이다. T 세포를 NY-ESO-1(1G4) TCR 알파(a) 및 베타(b), 또는 ErbB2 친화성 항체 유사물질(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형된 CD3 입실론(e)과 함께 동시-전기천공시켰다.
도 36C는 TCR 발현의 유지 및 친화성 항체 유사물질 변형된 CD3 입실론의 동시-전달에 의한 이중 표적화를 나타내는 그래프 패널이다. 도 36B의 T 세포의 밤새 후에, vb13.1 발현을 유식 세포측정에 의해 검출하였다.
결과는 CD3 입실론에 대한 친화성 항체 유사물질의 부가가, 친화성 항체 유사물질 변형된 TCR(EP2)의 경우 44.5%임에 비해, 모든 Affi-입실론 동시-전기천공된 T 세포(EP3 내지 EP6)에 대해 76.5% 내지 82.9% CD8/vb13.1 이중 양성으로 나타난 바와 같이, NY-ESO-1 TCR 발현에 최소로 영향을 미침을 나타낸다.
도 37은 Affi-TCR RNA 전기천공된 T 세포의 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다. CD107a 분석을 위해서, T 세포를 도 36B에서 지시하는 바와 같이 NY-ESO-1-(1G4) TCR 알파(a) 또는 베타(b), 또는 ErbB2 친화성 항체 유사물질(342, 342.15, 342 또는 342.4) 변형된 CD3 입실론(e)과 함께 동시-전기천공시키고 종양 세포주 Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-), Nalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-), SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+) 또는 MDA231 (NY-eso-1-, ErbB2+)로 자극하였다.
결과는 CD3 입실론에 대한 친화성 항체 유사물질의 부가가, 친화성 항체 유사물질 변형된 TCR(EP2)의 경우 33.1%임에 비해, 모든 Affi-입실론 동시-전기천공된 T 세포(EP3 내지 EP6)에 대해 약 49.5% 내지 53.3% CD8/CD107a 이중 양성으로 나타난 바와 같이, NY-ESO-1 단일 양성 종양 Nalm6-ESO를 인식하는 NY-ESO-1 TCR 기능에 최소로 영향을 미침을 나타낸다. 더욱이, 상기 Affi-입실론 동시-전기천공된 T 세포(EP3 내지 EP6)는 ErbB2 양성 종양, SK-OV3 및 MDA231 세포에 대해 친화성 항체 유사물질 변형된 TCR(EP2)보다 더 높은 항종양 활성을 입증하였다.
실시예 4: 이중특이성 T 세포 인게이저 ( BiTE ), 이중특이성 항체를 갖는 변형된 T 세포
기능성 BiTE는 Bis-RNA 전기천공된 T 세포로부터 분비될 수 있고 특이적인 종양 반응성으로 T 세포에 관여할 수 있다.
Bis-RNA가 전달된 T 세포(Bis-RNA T)를 기능성 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE)를 분비하는 그의 능력에 대해 시험하였으며, Bis-RNA 전기천공된 및 비-Bis-RNA 전기천공된 T 세포에 관여하는 상기 BiTE의 역할을 확인하였다. 또한, T 세포 항-종양 활성의 잠재적인 증가를 CAR RNA 및 Bis-RNA의 동시-도입시 평가하였다.
먼저, 상기 T 세포의 표면 염색을 쥐 기원 Fab(mIgGFab)를 검출할 수 있는 항체로 수행하였다. 양성 염색은 CAR(CAR RNA) 또는 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포에 대해 발견되었다(도 38A, 상부 패널). 상기 Bis-RNA T에 의해 분비된 블리나투모맵이 또한 다른 T 세포에 로딩될 수 있는지를 시험하기 위해서, GFP RNA 전기천공된 T 세포(GFP T 세포)를, 전기천공 직후(도 38A, 중간 패널) 또는 염색 전(도 38A, 하부 패널)에 Bis-RNA T 또는 CAR-RNA T와 혼합하였다. GFP-RNA T 세포는, 상기가 Bis-RNA T 세포와(CAR19-RNA T는 아닌) 동시-인큐베이션되는 한, mIgGFab에 대해 양성으로 염색될 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 Bis-RNA T로부터 분비된 블리나투모맵이 Bis-RNA T 세포에 관여할 뿐만 아니라 다른 T 세포에도 관여할 수 있음을 암시한다.
상기 Bis-RNA T 세포, 또는 Bis-RNA T 세포와 동시-인큐베이션된 GFP T 세포의 기능을, 상기 T 세포를 CD19 양성 종양 세포주(Nalm6, K562-CD19 및 라지)로 자극함으로써 4시간 CD107a 분석에서 시험하였다. 도 38B에 나타낸 바와 같이, 상기 Bis-RNA T 세포에 대한 항원 특이성 CD107a 상향-조절은 CAR-RNA T 세포만큼 효율적이었다. 더욱이, 유사한 수준의 CAR-RNA T 세포 및 Bis-RNA T 세포에서, 현저한 항원 특이성 CD107a 상향-조절이 또한, Bis-RNA-T와(CAR-RNA T 세포는 아닌) 동시-인큐베이션된 세포에 대해서 GFP-RNA T 세포에 대해 입증되었다.
4시간 세포독성 T 림프구 살해 분석에서, Bis-RNA T 세포는 종양을 CAR19-RNA T 세포(CD19)만큼 효율적으로 살해하는 것으로 밝혀졌다(도 38C). 그러나, 이들 T 세포를 동량의 비-종양 반응성 GFP-RNA T 세포와 혼합시, GFP-RNA T 세포와 혼합된 Bis-RNA T 세포(Bis-RNA/GFP-T 세포)는 GFP RNA T 세포와 혼합된 CAR19-RNA T 세포(CD19/GFP-T 세포)에 비해 현저하게 더 높은 용해 능력을 나타내었다. 이는 CAR19-RNA T 세포를 GFP-RNA T 세포와 혼합시 감소된 E:T 비에 기인할 수 있었다. Bis-RNA T 세포를 GFP-RNA T 세포와 혼합하는 동안, 이들을 Bis-RNA T 세포로부터 분비된 블리나투모맵과 관여시킴으로써 상기 GFP-RNA T 세포 특이성 종양 반응성을 가능하게 하여 상기 E:T 비를 유지시켰다. 상기 블리나투모맵 Bis-RNA T 세포가 CD19 양성 세포주, 예를 들어 K562-CD19, Nalm6 및 라지(CD19 음성 세포주 K562는 아닌)에 의해 자극되었을 때만 활성화된 것은 주목할만하다. 이는 Bis-RNA의 형태로 도입된 BiTE가 유일하게 항원 특이적인 방식으로 T 세포를 활성화시킴을 가리켰다.
BiTE가 Bis-RNA 전기천공된 T 세포에 의해 생성될 수 있었음을 추가로 확인하기 위해서, 상기 전기천공된 T 세포로부터 수거된 10 또는 100배 희석된 상등액을 전기천공되지 않은 T 세포에 가하고 CD107a 분석을 위해 종양과 혼합하였다. 상기 전기천공되지 않은 비-종양 반응성 T 세포는 상기 Bis-RNA T 세포로부터 수집된 상등액을 가함으로써 매우 종양 반응성으로 되는 것으로 밝혀졌다(도 45A 및 45B).
Bis-RNA 전기천공된 T 세포의 증가된 특이성 T 세포 활성화 민감성 및 종양 살해 능력 및 연장된 종양 반응성.
종양 인식에 대한 Bis-RNA T 세포의 민감성을 시험하기 위해서, T 세포를 상이한 용량의 Bis-RNA로 전기천공시키고 CD19 CAR RNA와 비교하였다. 유사한 결과가 CD107a 상향-조절로부터 수득되었다(도 39A).
IFN-감마/그랜자임 B 세포내 염색(도 39B) 및 ELISA에 의해 분석된 IFN-감마 생성(도 39C)의 실험에서, 0.5 ㎍ 정도로 낮은 Bis-RNA가 사용되었을 때 현저한 T 세포 활성화가 관찰되었다. 그러나, 1 내지 2 ㎍의 Bis-RNA는 5 내지 10 ㎍ CD19 CAR RNA에 필적하게 남아있었다. 상기 Bis-RNA가 낮은 용량인 0.5 ㎍임에도 불구하고, Bis-RNA T 세포 및 동시-인큐베이션된 GFP-RNA T 세포는 여전히 효율적인 항-종양 활성을 나타내었다.
4시간 세포독성 T 림프구 분석에서, 1, 5 및 10 ㎍의 블리나투모맵 Bis-RNA 또는 CD19BBZ CAR RNA의 용량에서 상이한 양의 RNA를 갖는 T 세포의 용해 능력을 비교하였다. 도 39D에 나타낸 바와 같이, T 세포의 살해 능력은 Bis-RNA 및 CAR RNA 모두에 대해 RNA 용량과 상관성을 나타내었다. 그러나, 1 ㎍의 Bis-RNA를 갖는 T 세포는 1:1 내지 30:1의 효과기 대 표적 비에서 10 ㎍ CD19BBZ CAR RNA를 갖는 T 세포와 유사한 수준으로 종양을 살해하였다(도 46).
블리나투모맵 RNA로 전기천공된 T 세포의 기능 지속성을 시험하기 위해서, CD19 CAR RNA와 비교하여, 증가하는 용량의 RNA를 상기 T 세포내에 전기천공시켰다. T 세포를 전기천공 후 상이한 시간에 CD19+ 종양 세포주에 의해 자극시킴으로써 항원 특이성 T 세포를 재활성화시킨 다음 CD107a 상향-조절 수준을 조사하였다. 전기천공 후 1일 동안 도 39A에 이미 나타낸 바와 같이, 상기 RNA가 1 ㎍을 초과하는 한, Bis-RNA T 세포를 5 내지 10 ㎍ CD19-CAR-T 세포만큼 효율적으로 활성화시킬 수 있었다.
전기천공 후 3일째에 출발하여 일렉트포로레이션 후 14일까지 상기 T 세포 기능 지속성을 추적하기 위한 새로운 실험을 설정하였다(도 40A 및 40B). 전기천공 후 3일째에, 5 및 10 ㎍ RNA를 갖는 Bis-RNA T 세포는 높은 CD107a 상향조절에 의해 입증된 바와 같이 여전히 매우 강한 항-종양 반웅성을 나타내는 반면, 10 ㎍ CAR19-RNA T 세포의 항-종양 반응성은 1 ㎍ Bis-RNA T 세포 수준으로 감소하는 것으로 밝혀졌다. 8일째에, 10 ㎍ CAR19-RNA T 세포의 종양 반응성은 1 ㎍ Bis-RNA T 세포보다 훨씬 더 낮았으며 거의 음의 수준으로 감소한 반면, 상기 종양 반응성은 5 및 10 ㎍ RNA를 갖는 Bis-RNA T 세포의 경우 여전히 높은 수준에서 남아있었다. 가장 현저하게, 전기천공 후 12일째에, 상당량의 CD107a가 5 및 10 ㎍ RNA 용량에서 Bis-RNA T 세포에 대해 검출 가능하게 남아있었다. 상기 결과는 BiTE가 낮은 턴오버 속도로 T 세포상에 안정하게 로딩될 수 있고 RNA 전기천공에 의해 도입된 T 세포상에서 발현된 기능성 CAR에 비해, 비교적 보다 긴 시간 동안 T 세포 종양 반응성을 유지할 수 있었음을 암시한다.
Bis-RNA를 통해 상기 T 세포에 제공된 BiTE의 인식 민감성을 시험하기 위해서, 상이한 수준으로 CD19를 발현하는 K562 세포주를 사용하여, 각각 5 ㎍ 또는 10 ㎍의 CAR RNA 또는 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 자극하였다. 도 40C에 나타낸 바와 같이, T 세포는 CAR RNA 및 Bis-RNA 모두에 대해서 0.001 ㎍의 동일한 수준에서 CD19를 인식하였다. 상이한 수준으로 ErbB2를 발현하는 K562 세포주를 또한 4D5BBZ CAR RNA 또는 4D5-CD3 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 자극하는데 사용하였다. CD19 항원 시험에 대해 발견된 것과 유사하게, ErbB2(4D5) CAR RNA 및 Bis-RNA는 모두 IFN-감마 분비(도 40D) 및 CD107a 상향-조절(도 47) 모두에 의해 입증되는 바와 같이, 0.1 ug 수준에서 상기 항원을 인식할 수 있었다.
Bis-RNA 전기천공된 T 세포의 보다 적은 보조-자극 의존성 분열 및 증식.
상기 T 세포 분열 및 증식을, 블리나투모맵 Bis-RNA T 세포 또는 CD19 CAR-RNA T 세포를, CD19를 발현하는 K562 및 K562(K562-CD19/K562) 또는 K562-CD19 및 CD86을 발현하는 K562(K562-CD19/K562-CD86)로 자극함으로써 시험하였다. 상기 T 세포를 보조-자극 없이 K562-CD19로 자극한 경우, Bis-RNA T 세포는 1 ㎍ 정도로 낮은 RNA 용량에서조차 효율적으로 분열할 수 있었다. 상반되게, CAR-RNA T 세포의 분열은 훨씬 적은 효율로 남아있었는데, 이는 1 ㎍의 RNA 용량에서 T 세포 분열의 검출이 거의 없었다는 사실에 의해 입증되었다. 10 ㎍의 RNA 용량에서조차, 상기 CAR-RNA T 세포는 1 ㎍의 RNA 용량에서의 Bis-RNA T 세포만큼 효율적으로 분열하지 않았다(도 41A 및 48A).
Bis-RNA T 세포의 T 세포 분열 정도는 세포 증식 및 증대와 상관되었으며, 이는 T 세포 분열 및 생존 모두에 의존한다. 도 41B, 좌측 패널에 나타낸 바와 같이, 오직 Bis-RNA T 세포만이 1 ㎍ RNA 용량에서조차 T 세포 증대를 나타내었다. CAR-RNA T 세포는 모든 RNA 용량에서 T 세포 증대를 나타내지는 않았다. 5 및 10 ㎍ RNA 용량에서 CAR-RNA T 세포는 현저한 CFSE 희석을 나타내었지만, T 세포 증대는 검출되지 않았다. 이들 결과는 상기 자극 과정 동안 추가적인 보조-자극 신호의 제공 없이, Bis-RNA T 세포가 여전히 T 세포 분열, 증식 및 생존을 유지하기에 충분한 자극 신호를 수용할 수 있는 반면, CAR-RNA T 세포에 의해 수용된 자극 신호는 상기 분열하는 세포의 대부분이 생존하기에 충분하지 않았음을 암시한다.
CD28 신호를 상기 보조-자극에 가함으로써, CD28 보조-자극은 CAR-RNA T 세포의 분열(모든 RNA 용량에 대해서) 및 증식(오직 10 ㎍의 RNA 용량에 대해서만) 모두를 크기 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 반면에, CD28 보조-자극은 모든 Bis-RNA 용량에서 증진된 세포 증식과 함께 Bis-RNA T 세포 분열을 약간 증가시켰다(도 41B, 48A 및 48B).
T 세포가 감소하는 양의 Bis-RNA 및 자극에 대한 T 세포 상태의 영향에 따라 효율적으로 활성화될 수 있는지를 추가로 시험하기 위해서, CFSE 희석 및 CD45RO+ 기억 또는 CD45RO- 나이브 T 세포의 세포 증식을 상이한 용량의 RNA에 의해 평가하였다. 2 ㎍ 정도로 낮은 RNA로 전기천공된 T 세포는, T 세포의 CFSE 희석 및 K562-CD86에 의해 동시-자극된 CD45 RO- 나이브 세포 또는 CD45RO+ 기억 세포(대부분의 경우에 5 ㎍ CD19BBZ RNA를 갖는 T 세포와 동등한)에 대한 세포 증대에 의해 입증되는 바와 같이, 효율적으로 활성화될 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 41C, 41D 및 48C). 이는 Bis-RNA를 갖는 T 세포가 T 세포 활성화에 더 민감하며 CAR RNA를 갖는 T 세포보다 보조-자극에 덜 의존성임을 추가로 입증한다.
흥미롭게, Bis-RNA T 세포와 CAR-RNA T 세포의 CFSE 희석 및 IFN-감마 수준간에 직접적인 상관성이 밝혀졌으나, CFSE 희석과 IL-2 수준간에는 역전된 상관성이 발견되었다. CFSE 표지된 T 세포의 자극 후 8일째에, 배양 상등액 중의 시토카인을 검사하였다(도 41A 및 48D). 그 결과, Bis-RNA T 세포는 보다 높은 IFN-감마 생성을 나타내었으며, 이는 보다 완전한 T 세포 활성화를 가리킨다. Bis-RNA T 세포는 또한 배지-보충된 IL-2(10IU/㎖)의 보다 높은 소비를 나타내었으며, 이는 보다 높은 수준의 T 세포 증식을 암시하였다(도 48E). Bis-RNA T 세포의 증가된 T 세포 활성화는 또한, 분극화 선호 없이 분석된 대부분의 시토카인 및 케모킨에서 전체적인 증가를 나타낸 시토카인 및 케모킨의 패널을 검사함으로써 입증되었다(도 49B).
CAR RNA T 세포의 CD28 보조-자극 의존성이 BBZ 배열(CD28 신호전달 부분이 존재하지 않는다)의 사용에 기인하였음을 배제하기 위해서, CD19-28Z CAR RNA를 가하여 CAR RNA 및 Bis-RNA 전기천공된 T 세포의 분열 및 증식을 평가하였다. CD19-28Z CAR RNA T 세포에 대한 CFSE 희석(도 48F) 및 T 세포 증대(도 48G)가 모두, 추가적인 CD28 보조-자극의 존재 또는 부재하에서 CD19+ 종양 세포주에 의한 자극시 CD19BBZ CAR RNA T 세포에 비해, 약간 증가하는 것으로 밝혀졌다.
상기 5 ug CD19-28BBZ CAR RNA T 세포의 CFSE 희석 및 세포 증대 평가는 모두 추가적인 CD28 보조-자극의 존재하에서조차 1 ug Bis-RNA T 세포보다 현저하게 더 낮았다. 4시간 세포독성 T 림프구 분석에서, CD19BBZ 및 CD19-28Z RNA 전기천공된 T 세포는 모두 유사한 용해 능력을 가졌지만, 블리나투모맵 RNA(Blina)를 갖는 T 세포는 CAR RNA T 세포보다 더 강한 살해 능력을 나타낸 것으로 밝혀졌다(도 48H).
백혈병 마우스 모델에서 Bis-RNA T의 증진된 항-종양 활성.
상기 발견은 Bis-RNA T 세포가 CAR RNA T 세포에 비해 증가된 CD107a 상향-조절, 시토카인 생성, 종양 용해 능력, 및 세포 분열 및 증식 능력에 의해 생체내에서 입증된 증진된 기능성을 가질 수 있음을 암시한다. NOD-SCID-?c-/-(NSG) 마우스가 녹색 루시페라제-형질도입된 Nalm6 세포(Nalm6-CBG)를 수용한 후 7일째에, 상기 마우스를 나타낸 바와 같이 CD19BBZ RNA CAR(RNA CAR) 및/또는 블리나투모맵 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포로 처리하였다(도 42A 및 42B).
단일 용량의 T 세포로 처리된 마우스에 대해서, CAR RNA T 세포는 대조군 CAR RNA T 세포(ss1BBZ)로 처리된 마우스에 비해 현저한 종양 부하(burden) 감소를 나타내었다. Bis-RNA T 세포, 또는 CAR RNA 및 Bis-RNA 모두로 동시-전기천공된 T 세포에 의해 처리된 마우스는 대략 1 내지 2 로그 종양 밀도 감소에 의해 입증된 바와 같이, 증진된 종양 퇴화를 나타내었다. 상기 종양을 갖는 마우스를 수회의 T 세포 용량 주사로 처리한 경우, CAR RNA T 세포 및 Bis-RNA T 세포로 처리된 두 그룹의 마우스 모두에 대한 종양 부하는 배경 수준으로 감소하였다.
생체내에서 Bis-RNA T 세포의 증진된 항-종양 활성이 상기 세포의 증진된 지속성에 기인하는 지의 여부를 평가하기 위해서, 인간 T 세포의 단일 주사를 제공받은 마우스를 안락사시키고 골수 및 비장으로부터의 세포를 기능 분석을 위해 정제하였다. T 세포를 CD19 양성 세포주, K562-CD19 자극 후 CD137 발현(도 42C), IFN-감마 생성(도 42D), 및 CD107a(도 42E) 발현에 대해 분석하였다. CD19BBZ CAR T 세포(CAR RNA T) 및 CD19 Bis-RNA T 세포(Bis-RNA T)는 3개의 기능 분석 모두에서 T 세포 주사 후 1일째에 특이적인 항원 자극에 대해 높은 반응성을 나타내었다. 주사 후 3일째에, CAR RNA T 세포는 약간의 항-종양 활성을 여전히 나타낸 반면, 주사 후 7일째에 CAR RNA 및 Bis-RNA T 세포 모두에 대해서 거의 모든 항-종양 활성이 존재하지 않았다.
상이한 종양 항원을 표적화하는 상이한 scFv를 사용하는 Bis-RNA의 생성.
마우스 scFv로부터 유래된 CAR의 면역원성은 CAR 요법을 위협하는 잠재적인 제한이다. 불리한 면역 반응이 발생하는 경우에, 종종 상기 면역 반응은 대개 마우스 단클론 항체로부터 유래되는 세포외 항원 인식 도메인에 대한 것이다(Lamer et al., Blood 117:72-82, 2011). 인간 항-CD19 scFv(21D4) 및 인간 항-CD3 scFv(28F11)는 완전인간 CD19-CD3 Bis-RNA가 생성되도록 선택되었다. 각 단쇄 가변 단편(scFv)의 VH 및 VL 쇄를 생성시키고자 하는 초기 시도는 상기 완전인간 CD19-CD3 Bis-RNA가 어떠한 검출 가능한 기능도 없음을 입증하였다. 상이한 VL/VH 서열, D4-F11HLHL을 갖는 새로운 구조물을 제조하였다.
도 43A에 나타낸 바와 같이, D4-F11HLHL Bis-RNA의 발현은 CD19 CAR RNA(CD19BB) 및 블리나투모맵 Bis-RNA(Blina-Bis-RNA)(CD107a를 각각 78.89% 및 80.96%로 상향조절하였다)로 전기천공된 T 세포에 비해, 90% 초과의 CD107a 상향-조절을 나타내었다.
상기 완전인간 D4-F11HLHL Bis-RNA의 기능성을 추가로 확인하기 위해서, 전기천공된 T 세포를 상이한 CD19 양성 세포주로 자극하였다. IFN-감마 및 IL-2 수준(도 49A)을 상기 CD19 세포와 밤새 동시-배양 후에 검출하였다. D4-F11 HLHL을 발현하는 T 세포는 CD19 CAR RNA 또는 블리나투모맵 Bis-RNA를 발현하는 T 세포에 비해, 현저하게 더 높은 수준의 IFN-감마를 생성시켰다(도 43B). 시토카인 생성 프로파일은 시토카인 생성의 약 2-5배 증가가 TNF-알파, IL-2, IL-10, IFN-감마 및 GM-CSF에 대해, CD19 CAR RNA T 세포에 비해 D4-F11 Bis-RNA T로부터 관찰됨을 보였다(도 49B). 이들 결과는 CD19-CD3 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포에 대한 T 세포 기능의 전체적인 증진를 가리켰다.
FMC63 항-CD19 scFv 기재 CAR을, CD19 CAR RNA와 블리나투모맵 기재 Bis-RNA간의 대부분의 비교에 사용하였다. FMC63 scFv로부터 Bis-RNA를 생성시킴에 있어서 어려움에도 불구하고, FMC63 scFv로부터 CAR RNA는 블리나투모맵 항-CD19 svFc(HD37)로부터 유래된 Bis-RNA보다 더 큰 기능성을 나타내었다.
CAR RNA T 세포와 Bis-RNA T 세포간의 기능 차이가 CAR 및 이중특이성 항체에 사용되는 상이한 scFv에 기인하는지의 여부를 측정하기 위해서, 완전인간 CAR, D4BBZ를 항-CD19 scFv(21D4)를 사용하여 생성시키고 1 ㎍ 및 10 ㎍의 RNA 용량에서 2개의 CD19 CAR(FMC63 CAR 및 21D4 CAR) 및 2개의 CD19-CD3 Bis-RNA(HD37 Bis-RNA 및 21D4 Bis-RNA)와 비교하였다. IFN-감마 및 IL-2의 시토카인 생성(도 49C) 및 CD107a 발현은 21D4 CAR이 상기 FMC63 CAR에 필적하고 이보다 약간 더 기능성임을 보였다. 21D4 Bis-RNA(D4-F11)를 갖는 T 세포는 특히 보다 낮은 RNA 용량에서 현저하게 증가된 시토카인 생성 및 CD107a 발현에 의해 입증된 훨씬 더 강한 항-종양 활성을 나타내었다(도 49D).
상기 완전인간 CD19 Bis-RNA(D4-F11)의 항-종양 활성을 시험하기 위해서, Nalm6-CBG 세포를 갖는 NSG 마우스(N=6)를 CD19BBZ 또는 D4F11 렌티바이러스 형질도입된 T 세포, 또는 19BBZ 또는 D4F11 RNA 전기천공된 T 세포로 처리하였다(도 43E). CD19BBZ 또는 D4F11 렌티바이러스 형질도입된 T 세포를 비교하는 경우, D4F11에 의한 렌티바이러스 형질도입이 CD19BBZ 렌티바이러스 형질도입보다 더 큰 항-종양 활성의 T 세포를 생성시켰다. CD19BBZ CAR RNA 및 D4F11 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포는 초기에 동물에서 종양 성장을 억제하였다(도 49E). 그러나, 상기 두 동물 그룹 모두에서 잔존 질병이 남아있는 반면, 렌티바이러스 형질도입된 T 세포를 받은 동물은 어떠한 잔존 질병도 없었다.
다른 종양 항원 특이성 scFv의 Bis-RNA로의 전환 가능성 및 Bis-RNA가 생성될 수 있는지의 여부를 시험하기 위해서, 메소텔린, cMet, PSCA 또는 GD2 CAR로부터의 scFv를 사용하여 Bis-RNA를 생성시켰다. 이들 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포상의 scFv에 대한 표면 염색은 메소텔린, cMet 및 PSCA(GD2는 아닌)에 대한 양성 염색을 나타내었다(도 43C). 유사하게, 관련된 CAR RNA를 갖는 T 세포뿐만 아니라 메소텔린, cMet 및 PSCA Bis-RNA(GD2 Bis-RNA는 아님)로 전기천공된 T 세포에서 항원특이성 CD107a 상향-조절이 관찰되었다(도 43D).
더욱 또한, EGFRviii(MR-1 및 139) 및 ErbB2(4D5)에 대한 3개의 기능성 Bis-RNA를 생성시켰다(도 49F, 49G 및 49H). 따라서, 8개의 CAR 중 7개를 Bis-RNA로 전환시킬 수 있었다.
더욱이, 메소텔린 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 메소텔린 음성 세포주, K562-PSCA, LY5Y 및 K562와 인큐베이션시켰을 때 비특이적인 T 세포 활성화는 거의 없는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 메소텔린 CAR RNA를 갖는 T 세포는 빈번한 비-특이적인 T 세포 활성화를 나타내었고 CD107a 발현은 음성 대조군에 비해 46% 내지 55%로 남아있었다(도 43D). 상기 데이터는 CAR의 Bis-RNA로의 전환이 잠재적인 치료학적 이점, 예를 들어 일부 CAR과 관련된 표적-상 또는 표적-외 독성의 방지를 가질 수 있음을 암시한다.
Bis-RNA T 세포에서 종양 관련된 억제에 대한 내성.
Bis-RNA T 세포는 CAR-RNA T 세포와 비교시, 보다 높은 시토카인 생성, 증가된 증식, 증가된 용해 능력 및 적은 보조-자극 의존성을 나타내었다. 상기와 같은 성질은 상기 Bis-RNA T 세포가 충분히 기능성이며 종양 관련 억제, 예를 들어 조절 T 세포에 의한 억제 및 프로그램화된 세포사 1(PD1) 수용체-리간드 상호작용으로부터의 영향이 덜한 경향을 가리킨다.
T 세포 기능에 대한 PD1의 영향을 시험하기 위해서, T 세포를 상이한 RNA 용량에서 CD19 Bis-RNA 또는 CAR RNA 및 PD1 RNA로 동시-전기천공시키고 CD19 양성 종양 세포로 자극하였다. 상기 결과는 5 ug 또는 10 ug PD1 RNA로 동시-전기천공된 T 세포가 특정한 항원 자극에 대한 CAR-RNA T 세포 반응을 현저하게 감소시키고, CD107a 발현(도 44A) 및 시토카인 생성(IFN-감마 및 IL-2)(도 44B 및 50)을 감소시킴을 보였다. 그러나, T 세포 기능은 10 ug PD1 RNA와 함께 1 ug 및 5 ug의 Bis-RNA에서 PD1에 의해 최소로 영향을 받았으며 10 ug의 Bis-RNA에서 T 세포 기능에 대한 명백한 부정적인 영향은 없었다.
Bis-RNA T 세포가 조절성 T 세포(Treg) 억제에 더 큰 내성을 나타낼 수 있는지를 시험하기 위해서, 정제된 Treg를 CFSE 표지된 T 효과기 세포에 가하였다. T 효과기 세포를 Bis-RNA 또는 CAR RNA로 전기천공시키고 상이한 T 효과기:Treg 비로 CD19 양성 세포주로 자극하였다. 증식의 억제는 시간에 걸쳐 CFSE 신호의 희석을 나타내는 비-Treg 억제된 세포에 비해, CFSE 표지된 세포의 유지로서 입증되었다(도 44D). CSFE 신호의 감소는 4:1 및 8:1 T 효과기:Treg 비 모두에서 CD19 CAR(19BBZ)로 전기천공된 T 세포의 Treg 억제된 증식을 가리켰다. 그러나, 블리나투모맵 Bis-RNA(Bis-RNA)(4:1 T 효과기:Treg 비)로 전기천공된 T 세포에 의해서는 보다 적은 Treg 억제가 명백하였다. Bis-RNA T 세포의 경우 8:1 T 효과기:Treg 비 이상에서 현저한 Treg 억제는 관찰되지 않았다(도 44C).
단일 분자에서 병행 자극(세포 표면상에서 발현된 항-CD3 scFv) 및 보조-자극(CD28 및 4-1BB)은 효율적인 T 세포 증대 및 활성화를 지지하는데 필수적인 성분들을 제공한다. 보조-자극 분자의 동시-도입에 의해, 강한 용해 능력과 함께 중심적인 기억 표현형을 갖는 신규의 T 세포 집단은 T 세포 치료 효능에 대한 2가지 중요한 특징이다(현행 T 세포 방법에서는 결여되어 있다).
종양 인식에 대한 블리나투모맵 RNA(Bis-RNA) T 세포의 민감성을 시험하기 위해서, T 세포를 상이한 용량의 Bis-RNA로 전기천공시키고 CD19 CAR RNA와 비교하였다. 유사한 결과가 CD107a 상향-조절로부터 수득되었다(도 51A).
IFN-감마/그랜자임 B 세포내 염색(도 51B) 및 ELISA에 의해 분석된 IFN-감마 생성(도 51C)을 사용하는 실험에서, 현저한 T 세포 활성화가, 단지 0.5 ㎍ Bis-RNA만이 전기천공된 경우에 조차 관찰되었다. 그러나, 1 내지 2 ㎍의 Bis-RNA는 상기 분석에서 5 내지 10 ㎍ CD19 CAR RNA에 필적하게 남아있었다. 0.5 ㎍의 낮은 양의 Bis-RNA에서조차, Bis-RNA T 세포 및 동시-인큐베이션된 GFP-RNA T 세포는 여전히 효율적인 항-종양 활성을 나타내었다.
4시간 세포독성 T 림프구 분석에서, 1, 5 및 10 ㎍의 Bis-RNA 또는 CD19BBZ CAR RNA의 용량에서 상이한 양의 RNA를 갖는 T 세포의 용해 능력을 비교하였다. 도 51D에 나타낸 바와 같이, T 세포의 살해 능력은 Bis-RNA 및 CAR RNA 모두에 대한 RNA 용량과 상관되었다.
bis-RNA로 전기천공된 T 세포의 기능성 지속성을 시험하기 위해서, CD19 CAR RNA에 비해, 증가하는 용량의 RNA를 상기 T 세포내에 전기천공시켰다. CD107a 상향-조절 수준을, 전기천공 후 상이한 시점들에서 CD19+ 종양 세포주에 의한 상기 T 세포의 항원 특이적 재활성화 후에 평가하였다. 전기천공 후 1일째에, RNA 용량이 1 ㎍을 초과하는 한, Bis-RNA T 세포는 5 내지 10 ㎍ CD19-CAR RNA로 전기천공된 T 세포만큼 효율적으로 활성화되었다(도 51A).
PD-L1(특허 AU2006265108A1로부터) 및 항-CD28 scFv(1412, US7,585,960 B2)를 차단하는 단쇄 가변 단편(scFv)을 갖는 4개의 이중특이성 항체의 구조물을 설계하고 PCR에 의해 합성하였다(도 52). 서열 확인된 DNA를 pGEM.64A 기재 RNA 시험관내 전사 벡터내에 적합하게 클로닝시켜 pGEM.10A5-1-1412, pGEM.13G4-1412, pGEM.1b12-1412 및 pGEM.12A4-1412를 생성시켰다(도 53을 참조하시오).
ELISA에 의해 검출된 시토카인(IL2, 도 54A, 및 IFN-감마, 도 54B)은 PD1-CD28 변환 수용체, 10A5-1412(aPDL1-aCD28 이중-RNA) 및 13G4-1412(aPDL1-aCD28 이중-RNA)가 IL-2 및 IFN-감마 모두의 분비를 증가시킴으로써 T 세포 기능을 현저하게 개선시킴을 보였다. 상기 기능이 변환은 PD1 음성 신호가 CD28 양성 신호로 변환되었음을 암시한다. Bis-RNA 변환 수용체, 10A5-1412(aPDL1-aCD28 이중-RNA) 및 13G4-1412(aPDL1-aCD28 이중-RNA)를 갖는 T 세포는 증가된 시토카인 생성을 나타내었으며, 이는 상기 조작된 T 세포가 T 세포 기능을 양으로 개선시키는 활성화 분자를 전달함을 암시하였다.
항-aTGFbRII-1, 항-aTGFbRII-3(미국특허 제 8,147,834로부터) 및 항-CD28 scFv(1412, 미국특허 제 7,585,960 호)를 포함하는 구조물을 설계하고 PCR에 의해 합성하였다. 서열 확인된 DNA를 pGEM.64A 기재 RNA 시험관내 전사 벡터내에 적합하게 클로닝시켜 pGEM.aTGFbR-1-1412 및 pGEM.aTGFbR-3-1412를 생성시켰다(도 55을 참조하시오).
도 56A는 4D5-CD3 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 반응성임을 나타내는 그래프이다. ErbB2 CAR 또는 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 높은 수준의 ErbB2, SK-OV3 및 N87, 또는 낮은 수준의 MFC-7, MDA-231, PC3 및 A549를 발현하는 종양 세포주들로 자극하였다. CD107a 분석은 4D5-6.CD3을 발현하는 T 세포가 ErbB 과발현 종양 세포에 유일하게 반응성임을 나타내었다. 도 56B는 도 56A의 실험의 반복 결과를 나타내는 그래프 패널이다.
도 57은 ErbB2 과발현 종양 세포에 대한, 4D5-CD3 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포의 용해 활성을 나타내는 그래프 패널이다. ErbB2 CAR 또는 Bis-RNA로 전기천공된 T 세포를 ErbB2 과발현 종양 세포, SK-OV3-CBG, 또는 ErbB2 저발현 종양 세포, mel624(624-CBG)에 대한 그들의 용해 활성에 대해 시험하였다. 루시페라제 기반 CTL 분석은, 친화성 조정된 BebB2 CAR, 4D5-5.BBZ 및 4D5-3.BBZ처럼, 4D5-6.CD3을 발현하는 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포, SK-OV3에 유일하게 반응성임을 나타내었다.
도 58은 4D5-CD3 Bis-RNA로 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 반응성임을 나타내는 그래프 패널이다. ErbB2 CAR 또는 Bis-RNA로 형질도입된 T 세포를 높은 수준의 ErbB2, SK-OV3 및 N87, 또는 낮은 수준의 MDA-231, PC3 및 A549를 발현하는 종양 세포주로 자극하였다. CD107a 분석은 4D5-CD3를 발현하는 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 유일하게 반응성임을 나타내었다.
도 59는 4D5-CD3 Bis-RNA로 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 반응성임을 나타내는 그래프 패널이다. 지시된 바와 같이 ErbB2 CAR 또는 Bis-RNA로 형질도입된 T 세포를 높은 수준의 ErbB2, SK-OV3 및 N87, 또는 낮은 수준의 MDA-231, PC3 및 A549를 발현하는 종양 세포주로 자극하였다. ELISA에 의해 분석된 바와 같은 시토카인 생성은 T4D5-CD3를 발현하는 T 세포가 ErbB2 과발현 종양 세포에 유일하게 반응성임을 가리킨다.
도 60A는 친화성-조정된 ErbB2 BiTE 세포가 마우스에서 치료 지수를 증가시키고 진행된 혈관 분포된 종양의 역행을 유도함을 나타내는 상들의 패널이다. 렌티바이러스 형질도입에 의해 상이한 친화성 ErbB2 CAR 또는 BiTE로 변형시킨 T 세포를 이중-종양 이식된 NSG 마우스에서 시험하였다. 마우스(n=4-5)에 0일째에 우측 옆구리에 PC3-CBG 종양 세포(1x106 세포/마우스, s.c.)를 이식하였다. 5일째에, 같은 마우스에게 좌측 옆구리에 SK-OV3-CBG 종양 세포(5x106 세포/마우스, s.c.)를 제공하였다. 상기 마우스를 PC3 종양 접종 후 23일째에 T 세포로 처리하였다(i.v.). T 세포를 1x107/마우스의 단일 주사로서 투여하였다. 형질도입되지 않은 T 세포(No TD)로 처리된 마우스를 대조군으로서 제공하였다. 동물을 PC3 종양 접종 후 지시된 시간에 영상화하였다. 도 60B는 이중-종양 이식된 NSG 마우스 모델에서 SK-OV3 종양 크기를 나타내는 그래프이다. 종양 크기를 측정하고, 상기 종양 부피를 계산하고 플롯팅하였다. 도 60C는 이중-종양 이식된 NSG 마우스 모델에서 PC3 종양 크기를 나타내는 그래프이다. 종양 크기를 측정하고, 종양 부피를 계산하고 플롯팅하였다.
도 61A는 PD1-CD28 변환 수용체 및 친화성 조정된 T4D5-6.CD3 BiTE를 동시-발현하기 위한 구조물의 예시이다. 도 61B는 PD1-CD28 및 T4D5-CD3 동시-발현 벡터로 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포의 PD1-CD28 변환 수용체의 검출을 나타내는 그래프 패널이다.
도 62A는 PD1-CD28 변환 수용체 및 T4D5-6.CD3 친화성 조정된 BiTE 모두를 동시-발현하는 T 세포의 증가된 용해 활성을 나타내는 그래프이다.
도 62B-62G는 정상적인 공여자로부터 직접 단리된 T 세포에 대해 변형된 고속 증대 프로토콜(REP)(Dudley et al., J. Immunol. 26(4):332-342, 2003)에 의해 생성된 Bis-RNA 전기천공된 T 세포를 나타내는 상들의 패널이다. Bis-RNA 전기천공된 T 세포는 생체내 백혈병 억제 활성을 더욱 개선시켰다. REP 조건하에서, 상기 T 세포를 하나 이상의 인자들, 예를 들어 flt-3, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드와 배양한다. REP 또는 항-CD3/항-CD28 비드 (Beads)에 의해 증대된 T 세포의 표현형을 평가하였다(도 62B). REP T 세포 또는 항-CD3/항-CD28 비드 T 세포를 상이한 양의 CAR RNA 또는 Bis-RNA로 전기천공시키고 상이한 세포주로 18시간 동안 자극하였다. CD137 상향-조절을 유식 세포측정(CD3+ T 세포상에서 게이트 처리됨)에 의해 분석하였다(도 62C). 용해 활성을 상이한 양의 CAR RNA 또는 블리나투모맵 Bis-RNA로 전기천공된 REP T 세포(도 62D, 좌측 패놀) 또는 항-CD3/항-CD28 비드 T 세포(도 62D, 우측 패널)에서 측정하였다. NSG 마우스를 1x106 Nalm6-CBG로 정맥내 주사하고 5일 후에 1차 처리를 위해 30x106 CAR RNA 또는 블리나투모맵 Bis-RNA(Blina) T 세포로 처리한 다음, Nalm6-CBG 주사 후 8일째에 시작하여 3주 동안 매주 2회, 각각 5x106으로 처리하였다. 생물발광 영상화(BLI)를 지시된 시간에 수행하고(도 62E) BLI 및 생존의 결과를 각각 도 62F 및 도 62G에 플롯팅하였다.
도 62H-62I는 막 결합된 OKT3을 발현하는 K562 기재 인공 항원 제시 세포(aAPC)의 생성을 나타내는 상들의 패널이다. CD8 힌지 및 막관통(OKT3.8) 또는 CD8 힌지 및 CD28 막관통(OKT3.8.28)을 갖는 OKT3의 막 형태에 대한 키메릭 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터(pLENS)를 도 62H에 예시한다. K562 기재 aAPC, K562-CD86-CD137L(KT) 또는 K562-CD137L(2D11) 세포주를 렌티바이러스 OKT3.8 또는 OKT3.8.28로 형질도입시키고 막 결합된 OKT3의 발현을 쥐 IgG Fab에 대한 항체를 사용하여 검출하였다(도 62I).
도 62J는 막 결합된 OKT3 형질도입된 K562 aAPC 클론의 특성화를 나타내는 상들의 패널이다. 제한 희석에 의한 상기 클론의 선택은 OKT3.8.28 형질도입된 KT aAPC로부터의 막 밴드 OKT3의 발현에 근거하였다.
도 62K-62M은 K562 기재 인공 aAPC에 의한 REP를 나타내는 그래프 패널이다. 도 62K는 OKT3 로딩된 K562-CD86-CD137L(KT) 또는 K562-CD137L(2D11), 또는 막 결합된 OKT3를 발현하는 KT(KT.OKT)가 조사되었고 1일(D1) 또는 2일(D2) 동안 배양한 후에 1:250의 T 세포:aAPC 비로 자극된 T 세포에 사용되었음을 나타내는 그래프이다. 도 62L은 REP에서 독립적으로 증대되고, CD62L 및 CD28에 대해 염색된, 증대된 T 세포를 나타내는 그래프 패널이다. 도 62M은 KT 세포와 비교된, REP 실험에서 상이한 B 세포주를 나타내는 그래프이다.
실시예 5: 변형된 TCR을 발현하는 T 세포.
렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터에 의해 항-종양 항원 TCR 재지시된 T 림프구로 치료된 암 환자는 유망한 결과를 보인다. 상기 연구에서, RNA를 T 세포에 전기천공시켜 암 입양 면역요법에 효율적인 요법을 개발할 수 있는지의 여부를 판정하였다. 상기 T 세포들을 비교하여 1) 야생형(wt) TCR 또는 종양 항원(NY-ESO-1)에 대한 높은 친화성 TCR을 발현하는 T 림프구 및 2) 야생형(wt) TCR 또는 Naml6 백혈병 및 A549 폐암 마우스 모델에서 높은 친화성 TCR을 발현하는 RNA 전기천공된 T 세포와 비교된 렌티바이러스 벡터 형질도입된 T 세포의 생체내 효능을 평가하였다.
TCR 재지시된 T 세포 입양 면역요법을 개선시키기 위해서, T 세포를 TCR RNA로 전기천공시키고 상기 세포를 백혈병 마우스 모델에 주사하였다. NOD/SCID(NSG) 마우스 모델에서, NY-EOS-1 야생형 TCR을 발현하는 렌티바이러스 형질도입된 및 RNA 전기천공된 T 세포는 모두 더 높은 친화성 TCR과 유사한 치료 효능을 갖는다(도 63, 64 및 65). 상기 HLA-A2+, CD19+ 백혈병 세포주, Naml6을 NY-ESO-1로 형질도입시켜 Naml6-ESO 종양 세포를 생성시켰다. 100만개의 Naml6-ESO 세포를 NSG 세포내에 주사하고 상기 마우스에게 종양 접종 후 5 또는 7일째에(지시된 바와 같이) T 세포를 주사하였다. 상기 종양을 갖는 마우스를 NY-ESO-1(1G4) 야생형 TCR RNA(wt1G4) 또는 그의 고 친화성 형태(LY95a)로 전기천공된 T 세포로 처리하였다. NY-ESO-1 야생형 TCR RNA로 전기천공된 T 세포는 효능 있는 항-종양 활성을 나타낸 반면, 고 친화성 NY-ESO-1 TCR을 갖는 T 세포는 효능이 훨씬 적은 것으로 밝혀졌다(도 63).
Naml6-ESO 백혈병 및 A549 폐암 NSG 모델 모두에서, TCR(고 친화성 또는 야생형) RNA 전기천공된 T 세포는 고 친화성 또는 야생형 TCR을 갖는 렌티-형질도입된 T 세포보다 현저하게 더 양호한 암 치료 효능을 나타내었다(도 64 및 65). TCR RNA 전기천공된 T 세포의 수회 주입은 고 친화성 TCR 또는 야생형 TCR을 발현하는 단일 용량의 렌티바이러스 형질도입된 T 세포보다 더 오래 종양 성장을 억제하였다. 이는 상기 전기천공된 T 세포가 단지 일시적인 치료 효과만을 가짐을 가리켰다(도 64). 렌티-형질도입 또는 RNA 전기천공에 의해 야생형 TCR 또는 고 친화성 TCR이 전달된 T 세포를 A549 폐 모델에서 시험하였다. 야생형 및 고 친화성 TCR RNA T 세포 모두 종양을 억제하였으나, 렌티바이러스 형질도입된 야생형 또는 고 친화성 TCR을 갖는 T 세포는 TCR RNA T 세포에 비해, 단지 가벼운 최소의 치료만을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 65). 도 66-68은 TCR RNA 전기천공된 T 세포가 렌티-형질도입된 T 세포보다 더 효율적으로 종양 세포 성장을 억제하였음을 추가로 나타낸다.
전-임상 동물 데이터를 근거로, 야생형 및 고 친화성의 렌티-TCR 형질도입된 T 세포들은 단일 용량의 RNA에서 발현하였으며(도 64 및 65), 이는 렌티-TCR RNA T 세포가 렌티-CAR T 세포만큼 효율적으로 증대되고 지속될 수 없음을 가리킨다. 이는 적합한 보조-자극 신호의 결여에 기인할 수 있다. CD3 RNA에 의한 TCR의 동시-전기천공은 도 69-80에 나타낸 바와 같이 T 세포 항-종양 활성을 더욱 증진시켰다. 도 69는 CD3 구조물의 예시를 나타내는 상들 및 TCR 및 CD3 RNA 전기천공된 T 세포에서 TCR 및 CD3 발현을 나타내는 그래프의 패널이다. 도 70 및 71은 TCR(vb13.1), CD3 및 TCR(vb13.1)/CD3의 발현 수준이 전기천공된 T 세포에서 검출됨을 나타내는 그래프이다. 도 72-74는 감염 효율을 나타내는 표를 나타낸다. 도 75-80은 CD3와 함께 또는 상기 없이 TCR RNA로 전기천공되고(y-축) 상이한 종양 세포주와 인큐베이션된(x-축) T 세포를 나타낸다.
CD3은 TCR 매개된 T 세포 기능에 매우 중요한 성분이다. 상기 CD3/TCR 복합체는 6개의 상이한 분자들로 구성된다. 상기 TCR 알파 및 베타쇄 외에, 4개의 CD3 단위: 감마, 델타, 입실론 및 제타가 존재한다. 293 세포에서 CD3 서브유닛들의 상이한 조합과 함께 항-NY-ESO-1 TCR(1G4)로부터의 TCR 알파 및 베타쇄를 암호화하는 RNA를 전기천공시킴으로써, 최대 TCR/CD3 발현이 4개의 CD3 서브유닛 모두의 도입에 의해 성취됨을 발견하였다. 도 81 및 82에 나타낸 바와 같이, 최대 T 세포 기능은 CD3의 4개 서브유닛 전부를 TCR RNA와 동시-도입시킴으로써 성취되었다. CD3 및 TCR 서브유닛의 다양한 조합들은 최고의 기능성을 갖는 입실론 및 제타와 함께 다소의 T 세포 기능 증진를 나타내었다. TCR RNA와 CD3 제타는 TCR 단독, 또는 다른 서브유닛과의 TCR에 비해 현저한 기능 증진를 나타내었다. 상기 CD3/TCR은 오직 3개 또는 2개의 서브유닛을 동시-전기천공시켰을 때, 예를 들어 델타+입실론+제타, 감마+입실론+제타, 및 입실론+제타일 때 발현되었으며, 이는 입실론 및 제타가 TCR/CD3 발현에 비교적 필수적임을 가리킨다(도 81 및 82). 종양 특이성 T 세포 기능을, 1G4 알파/베타 TCR을 CD3 서브유닛의 상이한 조합과 함께 도입시킴으로써 시험하였다. 도 83은 종양 세포로 자극된 TCR RNA 및 CD3 RNA 동시-전기천공된 T 세포에서 CD107a 상향-조절을 나타내는 흐름 그래프 패널이다. 도 84, 85 및 86은 상이한 종양 세포주들과 인큐베이션 후 TCR RNA 및 CD3 RNA의 상이한 조합들로 전기천공된 T 세포에서 IFN-감마 및 IL-2 발현을 나타낸다.
따라서, 4개의 서브유닛 전부 대신에, 최소한 CD3 입실론 및 제타의 동시-도입, 또는 제타 단독 도입은, 다중 RNA 가닥의 동시-전기천공에 기술적 도전이 제기되는 경우, 잠재적인 치료법일 수 있다.
1G4 TCR 알파-41BB, CD3 제타-41-BB 및 CD3 입실론-4-1BB 구조물을, 4-1BB 세포내 부분을 상기 1G4 TCR 알파, CD3 제타 또는 CD3 입실론의 C' 말단에 직접 융합시킴으로써 생성시켰다. 이들 변형된 TCR 또는 CD3 구조물의 RNA 전기천공은 4-1BB의 상기 TCR 복합체내로의 통합이 TCR 발현 및 기능성을 허용함을 나타내었다(도 87 및 88). 상기 TCR 알파 및/또는 베타쇄 또는 CD3 제타 및/또는 CD3 입실론의 C' 말단에 대한 보조-자극 신호의 부가는 T 세포 기능을 여전히 유지시켰으며(도 89-92) T 세포에 직접적인 보조-자극 신호를 잠재적으로 제공하였다.
상기 TCR에 대한 제2 디설파이드 결합의 부가 및 TCR 베타쇄로부터의 N-글리코실화 부위의 제거는 TCR RNA 전기천공된 T 세포의 시험관내 및 생체내 기능을 모두 추가로 증진시켰다(도 93 및 94). 도 93에 나타낸 바와 같이, 상기 TCR 알파 및/또는 베타쇄에 돌연변이를 수행하였으며 알파 및 베타의 상이한 조합들을 T 세포내에 전기천공시켰다. 최대 트랜스유전자 발현(도 93A) 및 기능성(용해 능력)(도 93C 및 93D)이 제2 디설파이드 결합의 부가 및 상기 베타쇄(Sa/S-Db)로부터 한정된 N-글리코실화 부위의 제거에 의해 발견되는 것으로 밝혀졌다(도 93B). 동물 실험에서, 상기 알파 또는 베타쇄(m1G4)에 제2 디설파이드 결합을 갖는 T 세포를 야생형 TCR(wt1G4) 또는 CD19 CART 세포로 전기천공된 T 세포와 비교하였다(도 94). 변형된 TCR(m1G4)을 갖는 T 세포는 야생형 TCR(wt1G4)을 갖는 T 세포보다 양호한 치료를 나타내었으며, 이는 제2 디설파이드 결합 및/또는 N-탈글리코실화에 의해 상기 TCR을 변형시킴으로써 치료를 개선시킬 수 있음을 암시한다.
흥미롭게, 상기 TCR 알파쇄에 디설파이드 결합의 부가는 T 세포 기능을 손상시켰다. 도 95는 상기 TCR 알파쇄의 N-탈글리코실화가 상기 TCR 또는 하이브리드 TCR에 디설파이드 결합의 부가에 비해 RNA 전기천공된 T 세포의 기능을 손상시킴을 나타내는 상들의 패널이다.
마우스 TCR 불변 영역으로부터 유래된 불변 영역을 갖는 하이브리드 TCR이 기능성에 영향을 미치는지를 판정하기 위해서, 쥐 불변 영역을 갖는 하이브리드 TCR을 T 세포에 전기천공시켰다. 도 96은 쥐 불변 영역을 함유하는 하이브리드 TCR을 암호화하는 RNA로 전기천공된 T 세포의 트랜스유전자 발현 및 기능성을 나타내는 상들의 패널이다. 도 97은 시간에 걸쳐 마우스 모델에서 주사된 종양 및 하이브리드 TCR T 세포의 형광을 나타내는 상들의 패널이다. 도 98은 상기 TCR 또는 하이브리드 TCR에 대한 디설파이드 결합 부가와 비교된, 전기천공된 T 세포의 상기 TCR 증진된 트랜스유전자 발현 및 기능에 대한, 알파 및 베타 쇄에 대한 디설파이드 결합의 부가, 또는 베타쇄의 N-탈글리코실화를 나타내는 상들의 패널이다.
TCR 또는 CD3 쇄의 C' 말단에 대한 보조-자극 신호의 부가는 T 세포 기능을 유지시켰으며 상기 T 세포에 CAR과 유사한, 보조-자극 신호를 제공하였다(도 99-101). 도 102는 CD27과 함께 또는 상기 없이 PD1-CD28 RNA 및 1G4 TCR RNA로 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포에서 PD1 및 vb13.1이 검출되었음을 나타낸다.
도 103은 5E6 A549-ESO(HLA-A2 및 NY-ESO-1 형질도입된 A549)를 0일째에 피하 주사함을 나타내는 그래프이다. 1x106 형질도입된 T 세포를 14일째에 주사하고 종양 크기를 측정하였다. 예비 결과는 TCR 단독은 효과가 없는 반면(1G4), CD27 보조-자극 신호(1G4.CD27) 또는 PD1-CD28 변환 수용체(PD1-CD28.1G4), 또는 CD27 보조-자극 신호 및 PD1-CD28 변환 수용체(PD1-CD28.1G4.CD27) 모두의 경우 종양 성장이 지연되었음을 가리켰다.
도 104는 기능성 동족 항원 인식과 함께 비-MHC 제한된 종양 항원 인식이 가능한 변형된 TCR의 도식적 도면을 나타낸다. 도 105 및 106은 상기 TCR이 Bis-RNA 기술과 병행시 HLA 제한 없이 동족 MHC/펩티드 및 표면 종양 항원(CAR 분자와 같은)을 모두 인식함을 나타낸다. 또한, IFN-감마(도 107) 및 IL-2(도 108) 분비가, bis-RNA가 동시-도입된 TCR로 변형된 T 세포에서 상승되었다.
Nalm6-ESO 주사되고(i.v.) 변형된 TCR로 전기천공된 T 세포로 처리된 마우스는 상기 변형된 TCR이 야생형 TCR(a+b), 야생형 TCR + HA1 변형된 CD3 입실론(a+b HA1-e) 또는 고 친화성 TCR(TCR ly95)에 비해, HA1 및 CD19(a+b/HA1-e/aHA1-aCD19, 또는 HA1-A+b/aHA1-aCD19)에 대한 bis-RNA와 함께-전달되었을 때 개선된 효능을 나타낸다(도 109).
T 세포를 TCR 알파(a) 및 베타(b), 또는 ErbB2 소분자(342, 342.15, 342 또는 342.4)와 동시-전기천공시켰다. 도 110에 나타낸 바와 같이, Vb13.1 TCR 및 His-태그가 소분자 재지시된 TCR(Affi-TCR) RNA 전기천공된 T 세포에서 검출되었다. 상기 전기천공된 T 세포를 종양 세포주, Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-), A549-ESO (NY-eso-1+, ErbB2+), SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+), A549 (NY-eso-1-, ErbB2+), 또는 Nalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-)로 자극하였다. 이어서, 상기 세포를 CD107a 발현에 대해 평가하였다. 상기 결과는 ErbB2 Affi-TCR을 갖는 T 세포가 Ny-ESO-1 및 ErbB2 양성 종양을 모두 특이적으로 인식하였음을 보인다(도 111). CD3 입실론에 특이적인 소분자의 부가는 도 112에 나타낸 바와 같이, NY-ESO-1 TCR 발현에 최소로 영향을 미쳤다. Affi-CD3 입실론 동시-전기천공된 T 세포는, 소분자 변형된 TCR T 세포에 대해 44.5%인 것과 비교하여, 76.5% 내지 82.9% CD8/vb13.1 이중 양성(EP3 내지 EP6)인 것으로 밝혀졌다. CD3 입실론에 특이적인 소분자의 부가는 도 113에 나타낸 바와 같이, NY-ESO-1 단일 양성 종양 Nalm6-ESO를 인식하는 NY-ESO-1 TCR 능력에 최소로 영향을 미쳤다. Affi-CD3 입실론 동시-전기천공된 T 세포는, 소분자 변형된 TCR T 세포에 대해 33.1%인 것과 비교하여, 49.5% 내지 53.3% CD8/CD107a 이중 양성(EP3 내지 EP6)인 것으로 밝혀졌다.
더욱이, 상기 Affi-CD3 입실론 동시-전기천공된 T 세포(EP3 내지 EP6)는 ErbB2 양성 종양 SK-OV3 및 MDA231에 대한 애피바디 변형된 TCR(EP2)보다 더 높은 항종양 활성을 나타내었다(도 113).
다른 실시태양들
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공보의 명세는 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다. 본 발명을 특정한 실시태양들을 참조하여 개시하였지만, 본 발명의 다른 실시태양 및 변화들이 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 당해 분야의 숙련가들에 의해 고안될 수 있음은 자명하다. 첨부된 특허청구범위를, 모든 상기와 같은 실시태양 및 동등한 변화를 포함하는 것으로 해석하고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> The trustees of the university of pennsylvania <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFIED T CELLS <130> IPA170359-CN <150> 62/073,144 <151> 2014-10-31 <150> 62/073,343 <151> 2014-10-31 <150> 62/073,467 <151> 2014-10-31 <150> 62/073,540 <151> 2014-10-31 <150> 62/073,681 <151> 2014-10-31 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> affinity antibody mimetic <400> 1 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Glu Lys Ala Tyr Asn Glu Ile 1 5 10 15 Arg Asn Leu Pro Asn Leu Asn Gly Trp Gln Met Thr Ala Phe Ile Ala 20 25 30 Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> affinity antibody mimetic <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Leu Ile Ala Met Glu Glu Ile 1 5 10 15 Gly Ser Leu Pro Asn Leu Asn Trp Gly Gln Glu Gln Ala Phe Ile Leu 20 25 30 Ser Leu Trp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala 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ggcggcggag gaagtgaggt gcagctgctg gagtcgggcg gaggcctggt gcagcctggg 480 gggtcactcc gactgagctg cgctgcatcc gggttcacct tcagctcgta taccatgagc 540 tgggtgcgcc aggcccccgg gaagggcctg gagtgggtgt ctgtgatcga ccacgggggc 600 gggtccacgc attatcccga tagcgtcaag ggccggttca cgatctcgcg cgacaactct 660 aagaatactc tgtacctgca gatgaactcc ctgcgcgccg aagacactgc ggtgtactat 720 tgtgccaggc accgcggcaa cccattcgac tactggggcc agggcaccct ggtcacagtc 780 tcctccggag gtggtggatc cgacatccag atgacacaga ctacatcctc cctgtctgcc 840 tctctgggag acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag taaatattta 900 aattggtatc agcagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacca tacatcaaga 960 ttacactcag gagtcccatc aaggttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 1020 accattagca acctggagca agaagatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 1080 cttccgtaca cgttcggagg ggggaccaag ctggagatca caggtggcgg tggctcgggc 1140 ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctgag gtgaaactgc aggagtcagg acctggcctg 1200 gtggcgccct cacagagcct gtccgtcaca tgcactgtct caggggtctc attacccgac 1260 tatggtgtaa 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Claims (214)

  1. 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 외인성 핵산 및 이중특이성 항체를 암호화하는 전기천공된 RNA를 포함하는 변형된 T 세포로서, 상기 T 세포의 표면상에 상기 TCR 및 이중특이성 항체를 발현하는 것인, 상기 변형된 T 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    TCR이 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함하는 변형된 T 세포.
  3. 제1항에 있어서,
    TCR이 TCR 알파 및 베타 쇄를 포함하는 변형된 T 세포.
  4. 제3항에 있어서,
    TCR이 쇄 중 적어도 하나의 쇄의 C' 말단에 보조-자극 신호전달 도메인을 포함하는 변형된 T 세포.
  5. 제4항에 있어서,
    보조-자극 신호전달 도메인이 4-1BB 보조-자극 신호전달 도메인인 변형된 T 세포.
  6. 제3항에 있어서,
    베타 쇄가 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함하는 변형된 T 세포.
  7. 제3항에 있어서,
    알파 쇄가 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함하는 변형된 T 세포.
  8. 제1항에 있어서,
    TCR이 적어도 하나의 쥐 불변 영역을 포함하는 변형된 T 세포.
  9. 제1항에 있어서,
    TCR이 야생형 TCR보다 표적 세포 항원에 대해 더 높은 친화성을 갖는 변형된 T 세포.
  10. 제1항에 있어서,
    표적 세포 항원이 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  11. 제1항에 있어서,
    이중특이성 항체가 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 이중특이성 항원 결합 도메인을 포함하는 변형된 T 세포.
  12. 제11항에 있어서,
    이중특이성 항원 결합 도메인이 제1 및 제2 단쇄 가변 단편(scFv) 분자를 포함하는 변형된 T 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    제1 scFv 분자가 표적 세포상의 적어도 하나의 항원에 특이적이고 제2 scFv 분자가 활성화 T 세포상의 항원에 특이적인 변형된 T 세포.
  14. 제13항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, TCR, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  15. 제1항에 있어서,
    보조자극 분자를 암호화하는 전기천공된 핵산을 추가로 포함하는 변형된 T 세포.
  16. 제15항에 있어서,
    보조-자극 분자가 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  17. 변형된 T 세포 생성 방법으로서, T 세포에 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산 및 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산을 도입시킴을 포함하고, 상기 T 세포가 상기 TCR 및 이중특이성 항체를 발현할 수 있는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    T 세포를 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단, 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득하는 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    핵산이 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    T 세포를 증대시킴을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    증대가, T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함하는 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    증대가, T 세포를 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    키메릭 막 단백질이 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 방법.
  24. 제17항에 있어서,
    T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    핵산을 T 세포에 도입시키기 전에 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제17항에 있어서,
    TCR을 암호화하는 핵산이 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    핵산의 도입이, TCR 알파 쇄를 암호화하는 RNA 및 TCR 베타 쇄를 암호화하는 별도의 RNA를 동시-전기천공시킴을 포함하는 방법.
  28. 제17항에 있어서,
    CD3를 암호화하는 RNA를 T 세포내에 전기천공시킴을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    CD3 RNA를 TCR 핵산과 동시-전기천공시키는 방법.
  30. 제17항에 있어서,
    TCR 핵산을 도입시킨 후에 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제17항에 있어서,
    막 단백질로서 이중특이성 항체를 발현시킴을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제17항에 있어서,
    이중특이성 항체 도입된 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  33. 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제1항의 T 세포의 용도.
  34. 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응의 자극 방법으로서, 상기 피험자에게 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA 및 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA로의 전기천공을 포함하는 변형된 T 세포의 유효량을 투여함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 상기 변형된 TCR 및 이중특이성 항체를 발현하는 것인, 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    표적 세포 또는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    유도된 용해가 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)인 방법.
  37. 입양 세포 전달 요법을 위한 방법으로서, 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA 및 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA로 전기천공된 것인, 방법.
  38. 피험자에서 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료 방법으로서, 상기 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA 및 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA로 전기천공된 것인, 방법.
  39. 피험자에게 치료 유효량의 제1항의 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    병증이 자가면역 질병인 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    자가면역 질병이 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  42. 제39항에 있어서,
    병증이 암인 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    암이 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  44. 제1항의 변형된 T 세포를 포함하는 조성물.
  45. 제1항의 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  46. 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산 및 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포로서, 상기 이중특이성 항체 및 CLEAR을 발현하는 것인, 변형된 T 세포.
  47. 제46항에 있어서,
    CLEAR이 세포내 활성화 도메인 및 세포외 도메인을 포함하는 변형된 T 세포.
  48. 제46항에 있어서,
    세포내 활성화 도메인이 CD3 제타의 세포내 활성화 도메인의 일부를 포함하는 변형된 T 세포.
  49. 제46항에 있어서,
    세포외 도메인이 항체의 항원 결합 도메인, 수용체의 리간드 결합 도메인, 항원, 및 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  50. 제46항에 있어서,
    세포외 도메인이 CD27, CD28, CD70, CD80, PD1, 및 PD-L1로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  51. 제46항에 있어서,
    세포외 도메인이 종양 항원에 결합할 수 있는 변형된 T 세포.
  52. 제46항에 있어서,
    CLEAR이 보조-자극 도메인을 추가로 포함하는 변형된 T 세포.
  53. 제52항에 있어서,
    보조-자극 도메인이 CD4, CD8 및 4-1BB로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  54. 제46항에 있어서,
    표적 세포 항원이 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  55. 제46항에 있어서,
    이중특이성 항체가 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 이중특이성 항원 결합 도메인을 포함하는 변형된 T 세포.
  56. 제55항에 있어서,
    이중특이성 항원 결합 도메인이 제1 및 제2 단쇄 가변 단편(scFv) 분자를 포함하는 변형된 T 세포.
  57. 제56항에 있어서,
    제1 scFv 분자가 표적 세포상의 적어도 하나의 항원에 특이적이고 제2 scFv 분자가 T 세포상의 항원에 특이적인 변형된 T 세포.
  58. 제46항에 있어서,
    이중특이성 항체가 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 CLEAR에 대한 이중특이성을 포함하는 변형된 T 세포.
  59. 제46항에 있어서,
    보조자극 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 변형된 T 세포.
  60. 제58항에 있어서,
    보조-자극 분자가 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  61. 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제45항의 T 세포의 용도.
  62. 변형된 T 세포의 생성 방법으로서, 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산 및 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산을 T 세포에 도입시킴을 포함하고, 상기 T 세포가 상기 이중특이성 항체 및 CLEAR을 발현할 수 있는 것인, 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    핵산 중 적어도 하나를, T 세포의 형질도입 (transduction), 상기 T 세포의 형질감염 (transfection), 및 상기 T 세포의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 도입시키는 방법.
  64. 제62항에 있어서,
    T 세포를 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단, 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득하는 방법.
  65. 제62항에 있어서,
    핵산 중 적어도 하나가 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 방법.
  66. 제62항에 있어서,
    T 세포를 증대시킴을 추가로 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    증대가, T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함하는 방법.
  68. 제66항에 있어서,
    증대가, T 세포를 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함하는 방법.
  69. 제68항에 있어서,
    키메릭 막 단백질이 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 방법.
  70. 제62항에 있어서,
    T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서,
    핵산을 T 세포에 도입시키기 전에 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함하는 방법.
  72. 제62항에 있어서,
    CLEAR 핵산을 도입시킨 후에 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  73. 제62항에 있어서,
    이중특이성 항체를 막 단백질로서 발현시킴을 추가로 포함하는 방법.
  74. 제62항에 있어서,
    이중특이성 항체 도입된 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  75. 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포 매개된 면역 반응의 자극 방법으로서, 상기 피험자에게 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산 및 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 상기 CLEAR에 대한 이중특이성을 갖는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포의 유효량을 투여함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 상기 CLEAR 및 이중특이성 항체를 발현하는 것인, 방법.
  76. 제75항에 있어서,
    표적 세포 또는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함하는 방법.
  77. 제76항에 있어서,
    유도된 용해가 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)인 방법.
  78. 입양 세포 전달 요법을 위한 방법으로서, 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산 및 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 상기 CLEAR에 대한 이중특이성을 갖는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 것인, 방법.
  79. 피험자에서 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료 방법으로서, 상기 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 키메릭 리간드 조작된 활성화 수용체(CLEAR)를 암호화하는 핵산 및 표적 세포상의 항원 및 T 세포상의 상기 CLEAR에 대한 이중특이성을 갖는 이중특이성 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 것인, 방법.
  80. 피험자에게 치료 유효량의 제46항의 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법.
  81. 제80항에 있어서,
    병증이 자가면역 질병인 방법.
  82. 제81항에 있어서,
    자가면역 질병이 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  83. 제80항에 있어서,
    병증이 암인 방법.
  84. 제83항에 있어서,
    암이 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  85. 제46항의 변형된 T 세포를 포함하는 조성물.
  86. 제46항의 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  87. 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포로서, 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 발현하는 것인 변형된 T 세포.
  88. 제87항에 있어서,
    표적 세포 항원이 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  89. 제87항에 있어서,
    소분자 세포외 도메인이 디설파이드 가교가 없는 나선 구조를 포함하는 변형된 T 세포.
  90. 제87항에 있어서,
    소분자 세포외 도메인이 약 10 kD 미만인 변형된 T 세포.
  91. 제87항에 있어서,
    친화성 분자 키메릭 수용체가 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 변형된 T 세포.
  92. 제91항에 있어서,
    세포내 신호전달 도메인이 CD3 신호전달 도메인인 변형된 T 세포.
  93. 제87항에 있어서,
    친화성 분자 키메릭 수용체가 보조-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 변형된 T 세포.
  94. 제93항에 있어서,
    보조-자극 신호전달 도메인이 4-1BB 보조-자극 신호전달 도메인인 변형된 T 세포.
  95. 제87항에 있어서,
    친화성 분자 키메릭 수용체가 막관통 도메인을 추가로 포함하는 변형된 T 세포.
  96. 제95항에 있어서,
    막관통 도메인이 CD8 막관통 도메인인 변형된 T 세포.
  97. 제87항에 있어서,
    친화성 분자 키메릭 수용체가 TCR 가변 도메인 및 TCR 불변 도메인을 추가로 포함하는 변형된 T 세포.
  98. 제87항에 있어서,
    보조자극 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 변형된 T 세포.
  99. 제98항에 있어서,
    보조-자극 분자가 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  100. 제99항에 있어서,
    CD3가 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄를 포함하는 변형된 T 세포.
  101. 제100항에 있어서,
    상이한 CD3 쇄가 CD3 제타 및 CD3 입실론 쇄인 변형된 T 세포.
  102. 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 세포로서, 적어도 하나의 친화성 도메인이 소분자 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 세포가 상기 이중특이성 친화성 분자를 발현하는 것인, 변형된 세포.
  103. 제102항에 있어서,
    표적 세포 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인이 소분자 항원 결합 도메인, 및 항체의 항원 결합 도메인으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 세포.
  104. 제102항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인이 소분자 항원 결합 도메인, 및 항체의 항원 결합 도메인으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 세포.
  105. 제102항에 있어서,
    소분자 항원 결합 도메인이 디설파이드 가교가 없는 나선 구조를 포함하는 변형된 세포.
  106. 제102항에 있어서,
    소분자 항원 결합 도메인이 각각 약 10 kDa 미만인 변형된 세포.
  107. 제102항에 있어서,
    표적 세포 항원이 종양 관련 항원(TAA), 세균 항원, 기생충 항원, 바이러스 항원 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 세포.
  108. 제102항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3, CD4, CD8, T 세포 수용체(TCR), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 보조-자극 분자인 변형된 세포.
  109. 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료 방법에 사용하기 위한 제87항의 변형된 세포.
  110. 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료 방법에 사용하기 위한 제102항의 변형된 세포.
  111. 제102항에 있어서,
    세포가 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 및 항원 제시 세포로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 세포.
  112. 변형된 T 세포의 생성 방법으로서, 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 T 세포의 집단에 도입시킴을 포함하고, 상기 T 세포가 상기 친화성 분자 키메릭 수용체를 발현할 수 있는 것인, 방법.
  113. 제112항에 있어서,
    핵산을, T 세포 집단의 형질도입, T 세포 집단의 형질감염, 및 T 세포 집단의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 도입시키는 방법.
  114. 제115항에 있어서,
    핵산의 도입이, 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 RNA를 전기천공시킴을 포함하는 방법.
  115. 제114항에 있어서,
    CD3를 암호화하는 RNA를 T 세포내에 전기천공시킴을 추가로 포함하는 방법.
  116. 제115항에 있어서,
    CD3 RNA를, 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산과 동시-전기천공시키는 방법.
  117. 제112항에 있어서,
    T 세포를 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단, 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득하는 방법.
  118. 제112항에 있어서,
    친화성 분자 키메릭 수용체 핵산을 도입시킨 후에 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  119. 제112항에 있어서,
    T 세포를 증대시킴을 추가로 포함하는 방법.
  120. 제119항에 있어서,
    증대가, T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함하는 방법.
  121. 제119항에 있어서,
    증대가, T 세포를 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함하는 방법.
  122. 제121항에 있어서,
    키메릭 막 단백질이 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 방법.
  123. 제112항에 있어서,
    T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  124. 제123항에 있어서,
    친화성 분자 키메릭 수용체 핵산을 T 세포에 도입시키기 전에 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함하는 방법.
  125. 변형된 세포의 생성 방법으로서, 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 세포의 집단에 도입시킴을 포함하고, 적어도 하나의 친화성 도메인이 소분자 항원 결합 도메인을 포함하고 상기 세포가 상기 이중특이성 친화성 분자를 발현하는 것인, 방법.
  126. 제125항에 있어서,
    핵산을, 세포 집단의 형질도입, 세포 집단의 형질감염, 및 세포 집단의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 도입시키는 방법.
  127. 제125항에 있어서,
    세포 집단이 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 또는 항원 제시 세포를 포함하는 방법.
  128. 제125항에 있어서,
    활성화 T 세포 및 표적 세포를 이중특이성 친화성 분자와 결합시킴을 추가로 포함하는 방법.
  129. 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제87항의 변형된 T 세포 또는 제102항의 변형된 세포의 용도.
  130. 입양 세포 전달 요법을 위한 방법으로서, 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 것인, 방법.
  131. 입양 세포 전달 용법을 위한 방법으로서, 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하고, 상기 변형된 세포가 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하며, 적어도 하나의 친화성 도메인이 소분자 항원 결합 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  132. 피험자에서 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료 방법으로서, 상기 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 것인, 방법.
  133. 피험자에서 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료 방법으로서, 상기 치료가 필요한 피험자에게 변형된 세포의 집단을 투여함을 포함하고, 상기 변형된 세포가 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하며, 적어도 하나의 친화성 도메인이 소분자 항원 결합 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  134. 피험자에게 치료 유효량의 제87항의 T 세포 또는 제102항의 변형된 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법.
  135. 제134항에 있어서,
    병증이 자가면역 질병인 방법.
  136. 제135항에 있어서,
    자가면역 질병이 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  137. 제134항에 있어서,
    병증이 암인 방법.
  138. 제137항에 있어서,
    암이 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  139. 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 피험자에게 유효량의 변형된 T 세포를 투여함을 포함하고, 상기 T 세포가 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 갖는 소분자 세포외 도메인을 포함하는 친화성 분자 키메릭 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 것인, 방법.
  140. 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응의 자극 방법으로서, 상기 피험자에게 유효량의 변형된 세포를 투여함을 포함하고, 상기 변형된 세포가 표적 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인 및 활성화 T 세포상의 항원에 결합할 수 있는 친화성 도메인을 포함하는 이중특이성 친화성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하며, 적어도 하나의 친화성 도메인이 소분자 항원 결합 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  141. 제139항 또는 제140항에 있어서,
    표적 세포 또는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함하는 방법.
  142. 제139항 또는 제140항에 있어서,
    유도된 용해가 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)인 방법.
  143. 제87항의 변형된 T 세포 또는 제102항의 변형된 세포를 포함하는 조성물.
  144. 제87항의 변형된 T 세포 또는 제102항의 변형된 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  145. 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 전기천공된 RNA를 포함하는 변형된 T 세포로서, 상기 BiTE 분자가 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 것인, 변형된 T 세포.
  146. 제145항에 있어서,
    표적 세포 항원이 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  147. 제145항에 있어서,
    이중특이성 항체가 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단쇄 가변 단편, 단일 도메인 항체, 그의 항원 결합 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 이중특이성 항원 결합 도메인을 포함하는 변형된 T 세포.
  148. 제147항에 있어서,
    이중특이성 항원 결합 도메인이 제1 및 제2 단쇄 가변 단편(scFv) 분자를 포함하는 변형된 T 세포.
  149. 제148항에 있어서,
    제1 scFv 분자가 표적 세포상의 적어도 하나의 항원에 특이적이고 제2 scFv 분자가 활성화 T 세포상의 항원에 특이적인 변형된 T 세포.
  150. T 세포의 집단을 증대시키고;
    상기 증대된 T 세포를 이중특이성 항체를 암호화하는 RNA로 전기천공시킴
    을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법으로서, 상기 전기천공된 T 세포가 상기 이중특이성 항체를 발현할 수 있는 것인, 방법.
  151. 제150항에 있어서,
    T 세포를 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단, 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득하는 방법.
  152. 제150항에 있어서,
    RNA가 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 방법.
  153. 제450항에 있어서,
    증대가, T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함하는 방법.
  154. 제150항에 있어서,
    증대가, T 세포를 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함하는 방법.
  155. 제154항에 있어서,
    키메릭 막 단백질이 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 방법.
  156. 제150항에 있어서,
    증대된 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  157. 제156항에 있어서,
    이중특이성 항체를 암호화하는 RNA에 의한 전기천공을 위해 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함하는 방법.
  158. 제150항에 있어서,
    이중특이성 항체를 막 단백질로서 발현시킴을 추가로 포함하는 방법.
  159. 제150항에 있어서,
    이중특이성 항체 전기천공된 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  160. 피험자에게 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 전기천공된 RNA를 포함하는 변형된 T 세포의 유효량을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극하는 방법.
  161. 제160항에 있어서,
    표적 세포 또는 상기 표적 세포를 포함하는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함하는 방법.
  162. 제160항에 있어서,
    유도된 용해가 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)인 방법.
  163. 입양 세포 전달 요법을 위한 방법으로서, 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 증대되었고 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 RNA로 전기천공된 것인, 방법.
  164. 피험자에서 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료 방법으로서, 상기 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 증대되었고 표적 세포상의 항원 및 CD3, CD4, CD8 및 TCR로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성화 T 세포상의 항원에 대한 이중특이성을 포함하는 이중특이성 T-세포 인게이저(BiTE) 분자를 암호화하는 RNA로 전기천공된 것인, 방법.
  165. 피험자에게 치료 유효량의 제145항의 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법.
  166. 제165항에 있어서,
    면역 반응이 자가면역 질병인 방법.
  167. 제166항에 있어서,
    자가면역 질병이 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  168. 제165항에 있어서,
    병증이 암인 방법.
  169. 제168항에 있어서,
    암이 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  170. 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제145항의 변형된 T 세포의 용도.
  171. 제145항의 변형된 T 세포를 포함하는 조성물.
  172. 제145항의 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  173. 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 외인성 핵산; 및 보조자극 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포로서, 상기 TCR 및 상기 보조-자극 분자를 발현하는 것인, 변형된 T 세포.
  174. 제173항에 있어서,
    TCR이 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함하는 변형된 T 세포.
  175. 제173항에 있어서,
    TCR이 TCR 알파 및 베타 쇄를 포함하는 변형된 T 세포.
  176. 제175항에 있어서,
    TCR이 쇄 중 적어도 하나의 쇄의 C' 말단에 보조-자극 신호전달 도메인을 포함하는 변형된 T 세포.
  177. 제176항에 있어서,
    보조-자극 신호전달 도메인이 4-1BB 보조-자극 신호전달 도메인인 변형된 T 세포.
  178. 제175항에 있어서,
    베타 쇄가 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함하는 변형된 T 세포.
  179. 제175항에 있어서,
    알파 쇄가 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함하는 변형된 T 세포.
  180. 제173항에 있어서,
    TCR이 적어도 하나의 쥐 불변 영역을 포함하는 변형된 T 세포.
  181. 제173항에 있어서,
    보조자극 분자를 암호화하는 핵산이 T 세포내에 전기천공된 변형된 T 세포.
  182. 제181항에 있어서,
    보조-자극 분자가 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  183. 제182항에 있어서,
    CD3이 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄를 포함하는 변형된 T 세포.
  184. 제183항에 있어서,
    상이한 CD3 쇄가 CD3 제타 및 입실론 쇄인 변형된 T 세포.
  185. 제173항에 있어서,
    TCR이 야생형 TCR보다 표적 세포 항원에 대해 더 높은 친화성을 갖는 변형된 T 세포.
  186. 제173항에 있어서,
    표적 세포 항원이 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 세포 관련 항원(TAA), 질병 세포 관련 항원, 및 이들의 임의의 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  187. 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 T 세포에 도입시키고;
    보조-자극 분자를 암호화하는 핵산을 상기 T 세포에 도입시킴
    을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법으로서, 상기 T 세포가 상기 TCR 및 상기 보조-자극 분자를 발현할 수 있는 것인, 방법.
  188. 제187항에 있어서,
    핵산 중 적어도 하나를, T 세포의 형질도입, 상기 T 세포의 형질감염, 및 상기 T 세포의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 방법에 의해 도입시키는 방법.
  189. 제187항에 있어서,
    T 세포를 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단, 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득하는 방법.
  190. 제187항에 있어서,
    핵산 중 적어도 하나가 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 방법.
  191. 제187항에 있어서,
    T 세포를 증대시킴을 추가로 포함하는 방법.
  192. 제191항에 있어서,
    증대가, T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-2, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함하는 방법.
  193. 제191항에 있어서,
    증대가, T 세포를 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함하는 방법.
  194. 제193항에 있어서,
    키메릭 막 단백질이 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 단편을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 방법.
  195. 제187항에 있어서,
    T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  196. 제195항에 있어서,
    TCR을 암호화하는 핵산을 T 세포에 도입시키기 전에 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함하는 방법.
  197. 제187항에 있어서,
    TCR을 암호화하는 핵산이 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 방법.
  198. 제198항에 있어서,
    핵산의 도입이, TCR 알파 쇄를 암호화하는 RNA 및 TCR 베타 쇄를 암호화하는 별도의 RNA를 전기천공시킴을 포함하는 방법.
  199. 제187항에 있어서,
    보조-자극 분자를 암호화하는 핵산의 도입이, CD3을 암호화하는 RNA를 T 세포내에 전기천공시킴을 포함하는 방법.
  200. 제199항에 있어서,
    CD3 RNA를 TCR 핵산과 동시-전기천공시키는 방법.
  201. 제187항에 있어서,
    TCR 핵산을 도입시킨 후에 T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  202. 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제173항의 변형된 T 세포의 용도.
  203. 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T-세포 매개된 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 피험자에게 유효량의 변형된 T 세포를 투여함을 포함하고, 상기 T 세포가 증대되었고 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA로 전기천공된 것인, 방법.
  204. 제203항에 있어서,
    표적 세포 또는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함하는 방법.
  205. 제204항에 있어서,
    유도된 용해가 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)인 방법.
  206. 입양 세포 전달 요법을 위한 방법으로서, 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 증대되었고 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA로 전기천공된 것인, 방법.
  207. 피험자에서 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료 방법으로서, 상기 치료가 필요한 피험자에게 변형된 T 세포의 집단을 투여함을 포함하고, 상기 변형된 T 세포가 증대되었고 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 RNA로 전기천공된 것인, 방법.
  208. 피험자에게 치료 유효량의 제173항의 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법.
  209. 제208항에 있어서,
    면역 반응이 자가면역 질병인 방법.
  210. 제209항에 있어서,
    자가면역 질병이 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  211. 제208항에 있어서,
    병증이 암인 방법.
  212. 제211항에 있어서,
    암이 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  213. 제173항의 변형된 T 세포를 포함하는 조성물.
  214. 제173항의 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.

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