RU2744593C2 - Векторы на основе аденоассоциированных вирусов для лечения мукополисахаридозов - Google Patents

Векторы на основе аденоассоциированных вирусов для лечения мукополисахаридозов Download PDF

Info

Publication number
RU2744593C2
RU2744593C2 RU2017142006A RU2017142006A RU2744593C2 RU 2744593 C2 RU2744593 C2 RU 2744593C2 RU 2017142006 A RU2017142006 A RU 2017142006A RU 2017142006 A RU2017142006 A RU 2017142006A RU 2744593 C2 RU2744593 C2 RU 2744593C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
seq
cag
aav9
nucleotide sequence
plasmid
Prior art date
Application number
RU2017142006A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017142006A (ru
RU2017142006A3 (ru
Inventor
ТУБЕРТ Мария Фатима БОШ
АУРИГОТ Вирджиния АРЕБА
МАЛЛОЛ Сандра МОТАС
Original Assignee
Эстев Фармасьютикалс, С.А.
Университат Аутонома Де Барселона
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эстев Фармасьютикалс, С.А., Университат Аутонома Де Барселона filed Critical Эстев Фармасьютикалс, С.А.
Publication of RU2017142006A publication Critical patent/RU2017142006A/ru
Publication of RU2017142006A3 publication Critical patent/RU2017142006A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2744593C2 publication Critical patent/RU2744593C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0016—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the nucleic acid is delivered as a 'naked' nucleic acid, i.e. not combined with an entity such as a cationic lipid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии и фармацевтике. Выделенная нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу, представленный в SEQ ID NO:1, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа. Представлены варианты плазмид, рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса серотипа 9 для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа. Фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты, плазмиду или рекомбинантный вектор для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа. Способ получения векторов включает следующие стадии. Обеспечивают первый вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, расположенную между первым концевым повтором AAV и вторым концевым повтором AAV, промотор CAG, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью; второй вектор, содержащий rep-ген AAV и cap-ген AAV из серотипа 9; и третий вектор, содержащий ген хелперного функционального элемента аденовируса. Осуществляют котрансфекцию компетентных клеток указанными векторами. Культивируют трансфицированные клетки и очищают векторы экспрессии от культуры. Способ получения плазмиды включает следующие стадии. Осуществляют эксцизию нуклеотидной последовательности из исходной плазмиды в результате переваривания при помощи Mlul/EcoRI. Клонируют нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, между двумя сайтами рестрикции базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG. Выделенная клетка содержит нуклеиновую кислоту для лечения мукополисахаридоза II типа. Группа изобретений обеспечивает новые последовательности, которые используют для лечения мукополисахаридоза II типа. 8 н. и 5 з.п. ф-лы, 14 пр., 47 ил.

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к векторам, пригодным для экспрессии представляющих интерес белков, и их применению в генной терапии. Настоящее изобретение также относится к векторам и последовательностям нуклеиновых кислот, пригодных для лечения мукополисахаридозов (MPS), и, в частности, для лечения мукополисахаридозов II типа или синдрома Хантера.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Лизосома представляет собой органеллу, присутствующую в цитоплазме животных клеток, которая содержит более 50 гидролаз, которые разрушают биомолекулы во время рециклинга отработанных клеточных компонентов или после поглощения вирусов и бактерий. Эта органелла содержит несколько типов гидролитических ферментов, в том числе протеаз, нуклеаз, гликозидаз, липаз, фосфолипаз, фосфатаз и сульфатаз. Все ферменты представляют собой кислые гидролазы.
Лизосомные болезни накопления (LSD) вызваны генетическими дефектами, которые затрагивают один или несколько лизосомальных ферментов. Эти наследственные заболевания, как правило, возникают в результате недостатка активности определенного фермента, присутствующего в лизосоме. В меньшей степени эти заболевания могут возникать в результате недостаточности белков, участвующих в биогенезе лизосом.
LSD по отдельности встречаются редко, однако как группа эти нарушения являются сравнительно распространенными в общей популяции. Сочетанная распространенность LSD составляет примерно 1 на 5000 живорожденных. См. Meikle Р., et al., JAMA 1999; 281:249-254. Однако некоторые группы в общей популяции особенно страдают от высокой частоты LSD. Например, болезни Гоше и Тэя-Сакса у потомков лиц еврейского происхождения из Центральной и Восточной Европы (ашкенази) составляет 1 на 600 и 1 на 3900 рождений соответственно.
Мукополисахаридоз II типа (MPSII), также известный как синдром Хантера и впервые описанный д-ром Чарльзом Хантером, представляет собой хроническую, прогрессирующую и полиорганную LSD, вызванную недостатком или отсутствием активности фермента идуронат-2-сульфатазы (IDS), кодируемого геном IDS, и участвующего в последовательном разрушении в лизосомах гликозаминогликанов (GAG) гепарансульфата (HS) и дерматансульфата (DS), приводя к их патологическому накоплению. См. Hunter, Proc R Soc Med. 1917; 10 (Sect Study Dis Child): 104-16. Вследствие Х-сцепленного рецессивного типа наследования почти все пациенты с синдромом Хантера являются мужчинами, хотя в литературе были описаны несколько женщин с синдромом Хантера. См. Mossman et al., Arch Dis Child. 1983; 58:911-915, Gullen-Navarro et al., Orphanet J Rare Dis. 2013; 25(8):92, Valstar et al., J. Inherit. Metab. Dis. 2008; 31(2):240-52.
MPSII характеризуется клинически как начинающаяся в детском возрасте прогрессирующая нейропатия центральной нервной системы (CNS). Дети с синдромом Хантера, как правило, при рождении являются нормальными, однако в возрасте до 2 лет у них появляются симптомы. См. Schwartz et al., Acta Paediatr Suppl. 2007; 96:63-70. Клиническое течение болезни, как правило, начинается с медленно прогрессирующего когнитивного нарушения с последующими когнитивными расстройствами и прогрессирующим ухудшением интеллекта. Потеря способности передвигаться наступает позже. Помимо неврологических симптомов, пациенты с MPSII страдают от изменений, которые не носят неврологический характер, в том числе рецидивирующих инфекций уха, горла, носа и дыхательных путей, частой диареи и запора, сердечной недостаточности, грубых черт лица, невысокого роста, прогрессирующей скованности и разрушения суставов, дефектов скелета, которые нарушают подвижность, а также гепато- и спленомегалии. См. Neufeld and Muenzer, "The Mucopolysaccharidoses" в Scriver С, et al., Eds., "The metabolic and molecular basis of inherited disease", McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452. Спектр клинических проявлений заболевания значительно варьирует в зависимости от остаточных уровней активности IDS, которую имеет пациент, которая в свою очередь определяется по лежащей в основе мутации гена IDS, при этом >300 мутаций гена IDS описано к настоящему времени (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=IDS). В целом были описаны две клинические формы MPSII. Наиболее тяжелая форма с началом болезни в возрасте от 18 месяцев до 4 лет встречается в три раза чаще, чем слабая форма, и характеризуется грубыми чертами лица, деформациями скелета, гепатоспленомегалией и неврологическим поражением, которое приводит к умственной отсталости. См. Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008; 167(3):267-277. Пациенты обычно умирают в течение второго десятилетия жизни в результате обструктивного заболевания дыхательных путей и сердечной недостаточности. См. Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008; 167(3):267-277, Neufeld and Muenzer, выше. Более медленно прогрессирующая форма заболевания, с более поздним началом, более продолжительной выживаемостью и минимальной неврологической дисфункцией, известная как аттенуированный фенотип, также была описана в подгруппе пациентов с MPSII. См. Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008; 167(3):267-277, Neufeld and Muenzer, выше.
До недавнего времени определенные виды терапии синдрома MPSII отсутствовали и единственным доступным лечением было симптоматическое с применением широкого диапазона неспецифических лекарственных препаратов для предупреждения и контроля осложнений заболевания. В последние несколько лет стали доступными два основных варианта терапии: ферментозаместительная терапия (ERT) и трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT). Схема обеих терапевтических стратегий основана на возможности перекрестной коррекции, исходя из того факта, что нормальные клетки секретируют значительные количества меченых манноза-6-фосфатом (М6Р) растворимых лизосомальных ферментов, таких как IDS, которые затем могут захватываться из внеклеточногого компартмента другими клетками с участием М6Р-рецепторов на плазматической мембране и направляться в лизосомы. См. Enns et al., Neurosurg Focus. 2008; 24(3-4):E12. Кроме того, существует пороговая величина остаточной ферментативной активности, как правило, очень низкая, выше которой клетка способна справляться с поступлением субстратов, а субъекты не поражены заболеванием, что указывает на то, что восстановление нормальной активности не является необходимым элементом изменения клинического течения болезни. См. Neufeld, Annu Rev Biochem. 1991; 60:257-80.
С момента разрешения Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA) в 2006 г. и Европейским агентством по лекарственным средствам (ЕМА) в 2007 г. рекомбинантная человеческая идуронат-2-сульфатаза (Идурсульфаза, ELAPRASE®, Shire Pharmaceuticals) была показана для лечения пациентов с MPSII. Препарат вводится еженедельно в дозе 0,5 мг/кг при помощи внутривенной инфузии со средним временем инфузии, составляющем 1-3 часа. См. Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010; 33(4):589-604. Препарат ELAPRASE® был разрешен после рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования 96 пациентов с синдромом Хантера без когнитивного ухудшения в начальный момент времени и при умеренно прогрессирующем заболевании. См. Muenzer et al., Genet Med. 2006; 8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101. Через один год после лечения пациенты, получавшие препарат ELAPRASE®, демонстрировали рост расстояния, проходимого за шесть минут (тест шестиминутной ходьбы) по сравнению с пациентами, получавшими плацебо. См. Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101. Также было показано, что ERT совместно с препаратом ELAPRASE® повышала диапазон подвижности суставов (ROM) и снижала объемы печени и селезенки. См. Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101. Кроме того, имеются доказательства улучшенной легочной функции в случае, когда нейтрализующие антитела к идурсульфазе не присутствуют; об образовании антител к IDS сообщалось у 50% пациентов, получавших продолжительное лечение. См. Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101.
В исследовании фазы 1/1 I у 31 пациента с MPSII сравнивали эффективность препарата ELAPRASE® и второго препарата на основе бета-изоформы идурсульфазы с предложенным коммерческим названием Хантераза® (NCT01301898, http://clinicaltrials.gov). Оба белка вводили внутривенно в дозе 0,5 мг/кг/неделя в случае препарата ELAPRASE® и 0,5 и 1,0 мг/кг/неделя в случае хантеразы® в течение 24 недель. Результаты в случае лечения хантеразой® отличались сниженной секрецией GAG в моче и улучшенными показателями теста 6-минутной ходьбы, однако ни одна из доз не смогла опосредовать терапевтическую эффективность легочной функции, сердечной функции или подвижности суставов. См. Sohn et al., Orphanet J Rare Dis. 2013;8:42. Инфузии хантеразы®, как правило, были безопасными и хорошо переносимыми, хотя сообщалось о немногих побочных эффектах, таких как крапивница и кожная сыпь. См. Sohn et al., Orphanet J Rare Dis. 2013; 8:42. Базовое исследование PIN недавно было завершено (http://clinicaltrials.gov, NCT01645189), однако результаты пока недоступны.
Вследствие гиперчувствительности к препарату ELAPRASE® во время введения препарата должно быть доступным медицинское обеспечение. Во время этого исследования самыми тяжелыми описанными нежелательными явлениями были анафилактические реакции, которые могли возникнуть в любой момент во время инфузии препарата ELAPRASE® или до 24 часов включительно после введения препарата. См. Muenzer et al., Genet Med. 2006; 8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101. Такие анафилактические реакции, которые могут угрожать жизни пациента, включают респираторный дистресс, гипоксию, гипотензию, крапивницу и/или ангиоэдему горла или языка (http://elaprase.com/) и могут требовать вмешательств, таких как реанимационная или экстренная трахеотомия, и лечение ингаляционными бета-адренергическими агонистами, эпинефрином или внутривенными кортикостероидами. См. Burton et al., Mol Genet Metab. 2011; 103(2): 113-20. Другие недостатки ERT включают: 1) сложность осуществления 1-3-часовых внутривенных инфузий у пациентов детского возраста, многие из которых страдают психическим заболеванием (http://elaprase.com/), 2) тот факт, что 50% пациентов, получавших препарат ELAPRASE® в клинических исследованиях, имели положительные результаты на антитела к идурсульфазе с неизвестной до настоящего времени клинической значимостью, однако которые могли ограничивать эффективность препарата при длительном применении согласно тестам легочных функций. См. Muenzer et al., Mol Genet Metab. 2007; 90(3):329-37, Muenzer et al., Genet Med. 2006; 8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011; 13(2):95-101, и 3) высокая стоимость терапии, которая включает также затраты на домашний уход. См. Wyatt et al., Health Technol Asses. 2012; 6(39):1-543.
Вне зависимости от опасений по поводу безопасности или стоимости введения препарата ELAPRASE®, неспособность внутривенно вводимой рекомбинантной IDS достигать ЦНС, по меньшей мере при рекомендуемой в настоящее время дозе 0,5 мг/кг в неделю, вероятно, ограничивает возможность применения ERT для лечения тяжелой нейродегенерации, наблюдаемой у пациентов с синдромом Хантера. Лишь частичное восстановление мозговой активности на фоне IDS достигали при еженедельном внутривенном введении 1,2 или 10 мг препарата ELAPRASE®/кг 2- или 7-месячным мышам с MPSII соответственно. См. Polito et al,, Hum Mol Genet. 2010; 19(24):4871-85. Кроме того, даже при этих высоких дозах активность IDS в кровотоке возвращалась к предшествующим лечению уровням через 72 часа после введения белка. См. Polito et al., Hum Mol Genet. 2010; 19(24):4871-85. Indeed, intravenous ERT failed to correct GAG accumulation in the brains of a murine model of MPSII. См. Garcia et al., Mol Genet Metab. 2007; 91(2):183-90. Таким образом, показание препарата ELAPRASE® ограничено лечением не относящихся к неврологическим симптомам заболевания.
Альтернативой внутривенной доставке ERT является введение экзогенного фермента непосредственно в ЦНС. Введение 20 мкг рекомбинантной человеческой IDS в латеральный желудочек 5-месячным мышам с MPSII каждые 3 недели повышало активность IDS в головном мозге, мозжечке и органах тела, таких как печень, сердце, почки и семенники. См. Higuchi et al., Mol Genet Metab. 2012; 107(1-2):122-8. Восстановление активности IDS приводило к восстановлению кратковременной памяти и двигательной активности и к снижению вакуолизации клеток и расширению лизосом в мозжечке, печени и семенниках. Однако терапевтическая эффективность была частичной, содержание GAG не было полностью нормализовано и некоторые поведенческие изменения остались устойчивыми к лечению. См. Higuchi et al., Mol Genet Metab. 2012; 107(1-2): 122-8. Недавнее исследование по безопасности и подбору доз при введении идурсульфазы в спинномозговую жидкость (CSF) при помощи устройства для интратекального введения лекарственных средств для прямого лечения патологии ЦНС у пациентов с синдромом Хантера показало снижение на примерно 80-90% от уровней GAG в CSF через 6 месяцев после лечения. См. Muenzer et al., Genet. Med. 2015; doi:10.1038/gim.2015.36 and www.clincialtrials.gov (NCT00920647). Однако имплантация перманентного устройства для интратекальной доставки, которую требует терапия, связано со значительными рисками и недостатками, а сама терапия имеет очень высокую стоимость на пациенто-год.
Другой способ достижения ЦНС при системном введении представляет собой молекулярного «троянского коня». Примером такого подхода является слитый белок на основе антитела к инсулиновому рецептору и идуронат-2-сульфатазы (HIRMAb-IDS), который может проникать через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) при помощи опосредованного рецепторами транспорта. Внутривенное введение 3, 10 и 30 мг/кг HIRMAb-IDS молодым самцам макак резус еженедельно в течение 26 недель приводило к захвату мозгом HIRMAb-IDS в количестве 1% от всей вводимой дозы. См. Boado et al., Biotechnol Bioeng. 2014; 111(11):2317-25. Исследование также показало безопасность слитого белка, поскольку никакой связанной с инфузией реакции или иммунного ответа не наблюдалось.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) с применением стволовых клеток костномозгового происхождения (трансплантация костного мозга, ВМТ) оказалась эффективной при лечении соматической и неврологической патологии у пациентов с другими MPS. См. Peters et al., Blood. 1996; 87(11):4894-902, Peters and Steward, Bone Marrow Transplant. 2003; 31(4):229-39, и Yamada et al., Bone Marrow Transplant. 1998; 21(6):629-34. Принцип, лежащий в основе коррекции при помощи HSCT, заключается в том, что моноциты донора способны проникать через капиллярную стенку, даже при гематоэнцефалическом барьере, после чего они дифференцируются в тканевые макрофаги, микроглию в случае ЦНС, и секретируют недостающий фермент для доставки в различные клетки. См. Krivit et al., Cell Transplant. 1995; 4(4):385-92. ВМТ, осуществляемая у мышей с MPSII, снижала накопление GAG в ряде тканей тела, в том числе печени, селезенке и легких, но не в ЦНС. См. Akiyama et al., Mol Genet Metab. 2014; 111(2):139-46. При комбинировании ВМТ с ERT (0,5 мг идурсульфазы/кг/еженедельно) дополнительный эффект на уровни GAG в сердце, почках и легких наблюдали через 7 месяцев после лечения мышей с MPSII, однако накопление GAG в ЦНС сохранялось при аномальных уровнях. См. Akiyama et al., Mol Genet Metab. 2014; 111(2): 139-46. Однако доказательство клинической эффективности не было очень сильным у пациентов с MPSII. Последующее наблюдение 10 пациентов с синдромом Хантера, которые получали ВМТ с 1982 по 1991 гг., показало очень варьирующие степени успехи. См. Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1999; 22(5):638-48. Четверо из этих пациентов умерло до наступления 100 дней после ВМТ, и еще 3 - до наступления 7 лет после процедуры. Из 3 пациентов, которые выжили в течение более 7 лет после ВМТ, один не отмечал клинического эффекта; у второго было минимальное повышение активности IDS в плазме, а третьему не удалось нормализовать содержание GAG, несмотря на наличие небольшого повышения активности IDS в плазме. См. Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1999; 22(5):638-48. Магнитно-резонансная томография (MRI) головного мозга показало незначительное уменьшение числа кистозных поражений через 2,5 года после ВМТ у пациента с фенотипом легкого MPSII. См. Seto et al., Ann Neurol. 2001; 50(1):79-92. Однако в этом же исследовании были получены данные по другому пациенту с легким фенотипом, у которого не проявилось никакого улучшения после MRI. См. Seto et al., Ann Neurol. 2001; 50(1):79-92. Клинические результаты очень различаются среди пациентов с синдромом Хантера, предположительно в результате различных факторов; генотип, возраст при HSCT, клинический статус пациента при HSCT, такой как степень неврологического поражения, статус доноров, химеризм доноров, источник стволовых клеток и ферментативная активность предположительно влияли на долговременный результат. См. Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010; 33(4):589-604, Valayannopoulos et al., Rheumatology. 2011; 5:v49-59.
В случае успешного проведения HSCT может способствовать некоторой степени клинического эффекта на соматическом уровне, снижению поведенческих проблем и лучшему характеру сна, однако может ли лечение опосредовать какое-либо значительное улучшение когнитивного нарушения, остается неясным. См. Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010; 33(4):589-604, Valayannopoulos et al., Rheumatology. 2011; 5:v49-59. Как правило, этот подход не рекомендуется пациентам с синдромом Хантера из-за высокой частоты заболеваемости и смертности и варьирующих нейрокогнитивных эффектов. См. Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010; 33(4):589-604.
Правдоподобным объяснением отсутствия эффективности HSCT является ограниченный синтез IDS в привитых клетках, приводящий к недостаточной перекрестной коррекции с участием IDS в ЦНС. Лентивирусные векторы, кодирующие человеческий ген IDS, использовали для трансдукции клеток костного мозга перед их трансплантацией в мышей с MPSII. Подвергшиеся обработке мыши с MPSII характеризовались улучшенными показателями теста Т-образного лабиринта через 14 недель после трансплантации. См. Podetz-Pedersen et al., Mol Ther. 2013; 21:s1-s285.
Принимая во внимание ограничения текущих видов лечения MPSII, требуются альтернативные подходы. Генная терапия in vivo дает возможность однократного лечения MPSII и других наследственных заболеваний с перспективой пожизненных благоприятных эффектов. Несколько подходов с использованием генной терапии, основанных на применении различных вирусных векторов в комбинации с различными путями введения, были исследованы в животных моделях заболевания MPSII.
В частности, опосредованный векторами на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) перенос генов, быстро распространяется в качестве тактики выбора для многих видов генной терапии in vivo, благодаря высокой эффективности трансдукции и отсутствию патогенности этих векторов. Векторы на основе AAV могут трансдуцировать постмитотические клетки и несколько доклинических и клинических исследований показали перспективу опосредованного векторами на основе AAV переноса генов с целью эффективного контроля длительной экспрессии лечебных трансгенов для различных заболеваний. См. Bainbridge et al., N Engl J Med. 2008; 358(21):2231-9, Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008; 19(10):979-90, Maguire et al., N Engl J Med. 2008; 358(21):2240-8, Niemeyer et al., Blood 2009; 113(4):797-806, Rivera et al., Blood 2005; 105(4):1424-30, Nathawani et al., N Engl J Med. 2011; 365(25):2357-65 and Buchlis et al., Blood 2012; 119(13):3038-41.
Системное введение векторов на основе AAV5-CMV с геном человеческой IDS в височную вену детенышам мышей с MPSII (р2) приводило к повышению активности IDS в сердце, почках, печени, легких, мышцах и селезенке, и умеренному повышению активности IDS в головном мозге, которое приводило к снижению GAG в соматических тканях и моче через 18 месяцев включительно после однократного введения вектора. См. Polito et al., Am J Hum Genet. 2009; 85(2):296-301. Кроме того, такое лечение препятствовало развитию патологии ЦНС в результате предупреждения нейродегенерации и коррекции астроглиоза и воспаления. Оценка мышей в тесте открытого поля через 18 месяцев после инъекции AAV показывала улучшение по мере лечения фенотипа крупной моторики мышей с MPSII. См. Polito et al., Am J Hum Genet. 2009; 85(2):296-301.
AAV серотипа 8, кодирующие человеческий ген IDS под контролем специфичного для печени промотора TBG также использовали для лечения MPSII. Через 7 месяцев включительно после внутривенного введения векторов 2-х-месячным мышам с MPSII наблюдалось повышение активности IDS в сыворотке, печени, селезенке, легких, сердце, почках и мышцах, приводящее к полной коррекции хранения GAG в этих соматических тканях. См. Cardone et al., Hum Mol Genet. 2006; 15(7): 1225-36. Однако требовались очень высокие дозы (4×1012 вирусных геномов/мышь) для достижения незначительного повышения активности IDS и частичного клиренса накопившихся GAG в головном мозге при внутривенном введении векторов. См. Cardone et al., Hum Mol Genet. 2006; 15(7): 1225-36. Аналогично, внутривенное введение векторов на основе AAV8, в которых человеческий ген IDS находится под контролем универсального промотора фактора элонгации 1-а (EF) взрослым мышам с MPSII показало повышение активности IDS в печени, сердце, селезенке и почках через 24 недели включительно после введения при полной коррекции накопления GAG в этих органах. См. Jung et al., Mol Cells. 2010; 30(1):13-8. Активность IDS в головном мозге была повышенной лишь в группе выведенных из эксперимента животных в течение короткого периода времени (через 6 недель после инъекции); однако этого было недостаточно для нормализации содержания GAG в ЦНС. См. Jung et al., Mol Cells. 2010; 30(1):13-8.
Ни один из вышеупомянутых подходов полностью не восстанавливал активность идуронат-2-сульфатазы, не приводил к полному устранению внутрицитоплазматических включений в ЦНС и соматических тканях или не корректировал все клинические признаки MPSII. Таким образом, существует потребность в новых подходах к лечению MPSII, которые характеризуются лучшими профилями эффективности и безопасности.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение предусматривает новые нуклеотидные последовательности для лечения мукополисахаридозов, в частности, мукополисахаридозов II типа (MPSII), или синдрома Хантера.
В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и на 75-90% идентичной SEQ ID NO: 2. В частности, выделенные нуклеотидные последовательности согласно этому первому аспекту настоящего изобретения выбраны из SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 8.
В соответствии со вторым аспектом настоящее изобретение относится к плазмиде, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и, в частности, нуклеотидную последовательность, на по меньшей мере 75% идентичную SEQ ID NO: 2, предпочтительно на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2.
В соответствии с третьим аспектом настоящее изобретение предусматривает новые рекомбинантные векторы для лечения мукополисахаридозов II типа. Указанные рекомбинантные векторы, в частности, векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV), содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и, в частности, нуклеотидную последовательность, на по меньшей мере 75% идентичную SEQ ID NO: 2, предпочтительно на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления векторы на основе аденоассоциированных вирусов представляют собой серотип 9 (AAV9). Векторы на основе AAV9 по настоящему изобретению могут дополнительно содержать промотор, связанный с кодирующей последовательностью, с целью контроля экспрессии IDS. Подходящий промотор представляет собой промотор СAG, SEQ ID NO: 14.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество нуклеотидной последовательности или плазмиды или рекомбинантного вируса, описанных в данном документе.
Еще один дополнительный аспект настоящего изобретения относится к нуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению или плазмиде, описанной в данном документе, или рекомбинантному вектору, описанному в данном документе для применения в качестве лекарственного препарата, в частности, для лечения мукополисахаридозов II типа.
Настоящее изобретение также предусматривает способ получения плазмид в соответствии с настоящим изобретением, а также способ получения рекомбинантных векторов в соответствии с настоящим изобретением.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к выделенным клеткам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую IDS, и, в частности, нуклеотидную последовательность, на по меньшей мере 75% идентичную SEQ ID NO: 2, предпочтительно на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Получение pAAV-CAG-hIDS и AAV-CAG-hIDS. (А) Схематическое представление плазмиды на основе pAAV-CAG-hIDS и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома вектора на основе аденоассоциированного вируса, содержащего кодирующую последовательность hIDS.
Фигура 2. Получение варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 1 AAV-CAG-ohIDS. (А) Схематическое представление плазмиды варианта 1 на основе pAAV-CAG-ohIDS и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома вектора на основе аденоассоциированного вируса, содержащего кодирующую последовательность варианта 1 ohIDS.
Фигура 3. Получение варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV-CAG-ohIDS. (А) Схематическое представление плазмиды варианта 2 на основе pAAV-CAG-ohIDS и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома вектора на основе аденоассоциированного вируса, содержащего кодирующую последовательность варианта 2 ohIDS.
Фигура 4. Получение pAAV-CAG-omIDS и AAV-CAG-omIDS. (А) Схематическое представление плазмиды на основе pAAV-CAG-omIDS и ее компонентов. (В) Схематическое представление генома вектора на основе аденоассоциированного вируса, содержащего кодирующую последовательность omIDS.
Фигура 5. Гидродинамическая доставка pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS здоровым мышам. Гистограммы обозначают активность идуронат-2-сульфатазы (IDS) в печени (А) и сыворотке (В), измеренную через 48 часов после введения 30 мкг кодирующих человеческую IDS плазмид на основе pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS. Активность IDS мышей WT с введенным солевым раствором принимали за 100%. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 5 мышей на группу. *Р<0,05.
Фигура 6. Гидродинамическая доставка pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS мышам с MPSII. (А, В) Гистограммы обозначают активность идуронат-2-сульфатазы (IDS) в печени (А) и сыворотке (В), измеренную через 1 неделю после введения кодирующих человеческую IDS плазмид на основе pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS. Мышей дикого типа и мышей с MPSII с введенным солевым раствором использовали в качестве контроля. Активность IDS мышей WT принимали за 100%. (С) Количественное определение содержания гликозаминогликана (GAG) в печени, селезенке, сердце, мочевом пузыре и семенниках через 1 неделю после введения различных кодирующих человеческую IDS плазмид. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 5 мышей на группу. *Р<0,05, ***Р<0,001, ****Р<0,0001.
Фигура 7. Внутрисосудистая доставка AAV9-CAG-hIDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII. Мышам с MPSII вводили внутривенно 1×1010 vg векторов на основе AAV9, кодирующих человеческую IDS дикого типа (AAV9-CAG-hIDS) или два различных варианта оптимизированных человеческих IDS (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS). Мышей дикого типа и не подвергшихся обработке мышей с MPSII использовали в качестве контроля. (А, В) Гистограммы обозначают активность идуронат-2-сульфатазы (IDS) в печени (А) и сыворотке (В). Активность IDS мышей WT принимали за 100%. (С) Количественное определение содержания гликозаминогликана (GAG) в печени у животных, которым вводили два различных кодирующих человеческую IDS вектора. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 5 мышей на группу. *Р<0,05, **Р<0,01 и ***Р<0,001.
Фигура 8. Доставка в CSF AAV9-CAG-hIDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII. Мышам в возрасте 2 месяцев с MPSII вводили в большую цистерну 1×1010 vg векторов на основе AAV9, кодирующих человеческую IDS дикого типа (AAV9-CAG-hIDS) или два различных варианта оптимизированных человеческих IDS (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS). Мышей дикого типа (WT), не подвергшихся обработке мышей с MPSII (MPSII) и мышей с MPSII, которым вводили некодирующие (Null) векторы на основе AAV9 (MPSII-Null) использовали в качестве контроля. (А) Активность идуронат-2-сульфатазы, анализируемая через 1,5 месяца после доставки в различные области головного мозга (отделы I-V, в которых отдел I представляет наиболее ростральную область головного мозга, а отдел V представляет наиболее каудальную область). Активность IDS мышей WT принимали за 100%. (В) Количественное определение содержания гликозаминогликанов (GAG) в тех же самых областях головного мозга, как и в (А). Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 5 мышей на группу. *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001 и ****Р<0,0001.
Фигура 9. Доставка в CSF AAV9-CAG-hIDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII. Мышам в возрасте 2 месяцев с MPSII вводили в большую цистерну 1×1010 vg векторов на основе AAV9, кодирующих человеческую IDS дикого типа (AAV-CAG-hIDS) или два различных варианта оптимизированных человеческих IDS (вариант 1 AAV-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV-CAG-ohIDS). Мышей дикого типа (WT), не подвергшихся обработке мышей с MPSII (MPSII) и мышей с MPSII, получающих некодирующие (Null) векторы на основе AAV9 (MPSII-Null) использовали в качестве контроля. (А, В) Активность идуронат-2-сульфатазы, выражаемая в виде % активности WT, в печени (А) и сыворотке (В), измеряемая через 1,5 месяца после лечения. (С) Количественное определение содержания гликозаминогликанов (GAG) в органах тела. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 5 мышей на группу. *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001 и ****Р<0,0001.
Фигура 10. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А) Активность идуронат-2-сульфатазы в различных частях головного мозга (отделы I-V) мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF при помощи интрацистернальной (IC) инъекции 5×1010 vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или AAV9-CAG-omIDS. Активность IDS WT принимали за 100%. Анализ выполняли через 4 месяца после доставки векторов. (В) Количественное определение гликозаминогликанов (GAG) в тех же самых областях головного мозга, как и в (А). Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 4-5 мышей на группу. ***Р<0,001, ****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.
Фигура 11. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А) Количественное определение интенсивности сигнала, получаемого в различных областях головного мозга после окрашивания на наличие лизосомального маркера LAMP2, у мышей дикого типа (здоровых) и мышей с MPSII, которым вводили в большую цистерну 5×1010 vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×1010 vg AAV9-CAG-omIDS. Анализ выполняли через 4 месяца после доставки векторов. (В) Активность других лизосомальных ферментов в экстрактах головного мозга. IDUA, идуронидаза, альфа-L-, SGSH, N-сульфоглюкозаминсульфогидролаза, NAGLU, N-ацетилглюкозаминидаза, альфа, HGSNAT, гепаран-альфа-глюкозаминид-N-ацетилтрансфераза, GALNS-галактозамин-(N-ацетил)-6-сульфатаза, GUSB, глюкуронидаза, бета, НЕХВ, гексозаминидаза В. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 4-5 мышей на группу. **Р<0,01, ***Р<0,001, ****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.
Фигура 12. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). Количественное определение интенсивности сигнала, получаемого в различных областях после окрашивания отделов головного мозга на наличие лизосомального маркера LAMP2. Анализ выполняли у мышей дикого типа (WT) и однопометных животных с MPSII через 8 месяцев после того, как последним вводили в CSF 5×1010 vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или r 5×1010 vg AAV9-CAG-omIDS. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 2-6 мышей на группу. *Р<0,05 и **Р<0,01 по отношению к MPSII-Null.
Фигура 13. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А, В) Гистограммы представляют интенсивность сигнала, измеряемого после иммуноокрашивания на наличие астроцитарного маркера GFAP (А) и на наличие микроглиального маркера BSI-B4 (В) в отделах лобной, теменной и затылочной коры, верхнего двухолмия и таламуса мышей дикого типа (здоровых), и мышей с MPSII, которым вводили за 4 месяца до этого в большую цистерну 5×1010 vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×1010 vg AAV9-CAG-omIDS. Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 5 мышей на группу. **Р<0,01, ***Р<0,001, ****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.
Фигура 14. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А, В) Гистограммы представляют интенсивность сигнала, измеряемого после иммуноокрашивания на наличие астроцитарного маркера GFAP (А) и на наличие микроглиального маркера BSI-B4 (В) в отделах головного мозга мышей дикого типа (WT) и однопометных животных с MPSII, которым вводили в CSF 5×1010 vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×1010 vg AAV9-CAG-omIDS. Анализ выполняли через 8 месяца после доставки векторов. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 2-6 мышей на группу. *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001 и ****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.
Фигура 15. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А, В) Активность идуронат-2-сульфатазы, выражаемая в виде % активности WT, в печени (А) и сыворотке (В) мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×1010 vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×1010 vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев и анализировали 4 месяца спустя. Активность IDS WT принимали за 100%. (С) Количественное определение гликозаминогликанов (GAG) в органах тела. Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 4-5 мышей на группу. **Р<0,01, ***Р<0,001, ****Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.
Фигура 16. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А, В) Активность идуронат-2-сульфатазы, выражаемая в виде % активности WT, в легких (А) и сердце (В) здоровых мышей дикого типа (WT), не подвергшихся обработке мышей с MPSII (MPSII) и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×1010 vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×1010 vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев и анализировали 4 месяца спустя. (С) Количественное определение числа копий векторных геномов/диплоидный геном (vg/dg) в печени, легких и сердце у мышей MPSII, которым вводили в CSF AAV9-CAG-omIDS. Полученные ткани не подвергшихся обработке мышей с MPSII использовали в качестве контроля. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM из 4-5 мышей на группу, как в А) и В). *Р<0,05, **Р<0,01 и ***Р<0,001 по отношению к MPSII-Null.
Фигура 17. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). (А) Влажный вес печени по отношению к весу всего тела мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×1010 vg контрольного (AAV9-Null) или 5×1010 vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 4 месяцев и анализировали 4 месяца спустя. (В) Активность других лизосомальных ферментов в экстрактах печени, полученных из тех же самых когорт животных, как и в (А). (С) Активность β-гексозаминидазы (β-НЕХО), выражаемая в виде % активности WT, в сыворотке тех же самых когорт животных, как и в (A). IDUA, идуронидаза, альфа-L-, SGSH, N-сульфоглюкозаминсульфогидролаза, NAGLU, N-ацетилглюкозаминидаза, альфа, HGSNAT, гепаран-альфа-глюкозаминид-N-ацетилтрансфераза, GALNA-галактозамин-(N-ацетил)-6-сульфатаза, GUSB, глюкуронидаза, бета, НЕХВ, гексозаминидаза В. Активности ферментов WT принимали за 100%. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 4-5 мышей на группу. *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001, **** Р<0,0001 по отношению к MPSII-Null.
Фигура 18. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). Оценка двигательной и исследовательской активности в тесте открытого поля у наивных мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×1010 vg контрольного (AAV9-Null) или 5×1010 vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 4 месяцев и анализировали 4 месяца спустя. (А) Время в центре, (В) время на периферии, (С) число вхождений в центр, (D) задержка при движении к центру, (Е) суммарное число передвижений, (F) число пересеченных линий. Значения представляют собой средние значения ± SEM из 17-22 мышей на группу. *Р<0,05, ** Р<0,01 по отношению к MPSII-Null.
Фигура 19. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS). Анализ выживаемости в соответствии с кривыми Каплана-Мейера у здоровых мышей дикого типа (WT), не подвергшихся обработке мышей с MPSII (MPSII) и мышей с MPSII, которым вводили в CSF 5×1010 vg контрольного некодирующего вектора (AAV9-Null) или 5×1010 vg вектора на основе AAV9-CAG-omIDS. N=24 в случае WT, N=22 в случае не подвергшихся обработке мышей с MPSII, N=27 в случае мышей с MPSII, которым вводили Null, и N=91 в случае мышей, получавших терапевтический вектор.
Фигура 20. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS), при различных дозах (1,58×109, 5×109, 1,58×1010 и 5×1010 vg/мышь). (А) Активность идуронат-2-сульфатазы в различных частях головного мозга (отделы I-V) мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF при помощи интрацистернальной (IC) инъекции различные дозы AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев и анализировали 1,5 месяца спустя. Активность IDS WT принимали за 100%. (В) Количественное определение гликозаминогликанов (GAG) в тех же самых областях головного мозга, как и в (А). Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 5 мышей на группу. *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001, ****Р<0,0001 по отношению к не подвергшимся обработке мышам с MPSII.
Фигура 21. Доставка в CSF векторов на основе AAV9, кодирующих оптимизированную мышиную идуронат-2-сульфатазу (AAV9-CAG-omIDS), при различных дозах (1,58×109, 5×109, 1,58×1010 и 5×1010 vg/мышь). (А, В) Активность идуронат-2-сульфатазы, выражаемая в виде % активности WT, в печени (А) и сыворотке (В) мышей дикого типа (здоровых), не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, которым вводили в CSF различные дозы вектора на основе AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев и анализировали 1,5 месяца спустя. Активность IDS WT принимали за 100%. (С) Количественное определение гликозаминогликанов (GAG) в органах тела. Результаты представлены в виде средних значений ± SEM из 5 мышей на группу. *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001, ****Р<0.0001 по отношению к не подвергшимся обработке мышам с MPSII.
Депонирование микроорганизмов
Плазмиды на основе pAAV-CAG-hIDS (SEQ ID NO: 3), вариант 1 pAAV-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 6) и вариант 2 pAAV-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 9) депонировали 18 декабря 2014 г. под номером доступа DSM 29866, DSM 29867 и DSM 29868 в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhostrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная Республика Германия.
Определения
Термин «нуклеотидная последовательность» или «выделенная нуклеотидная последовательность» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, содержащей дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды соответственно. Нуклеиновая кислота может быть двунитевой, однонитевой или содержать участки двунитиевой и однонитевой последовательности.
Термин «% идентичности последовательности» или «% идентичности» относится к проценту нуклеотидов кандидатной последовательности, которые являются идентичными нуклеотидам в эталонной последовательности, после выравнивания последовательностей с целью достижения максимального % идентичности последовательности. % идентичности последовательности можно определить при помощи любых способов или алгоритмов, утвержденных в данной области, таких как алгоритмы ALIGN, BLAST и BLAST 2.0. См. Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977; 25:3389-3402 и Altschul S, et al., J Mol Biol. 1990; 215:403-410.
В данном документе % идентичности последовательности или «% идентичности» рассчитывается путем деления числа нуклеотидов, которые являются идентичными после выравнивания эталонной последовательности и кандидатной последовательности, на общее число нуклеотидов в эталонной последовательности, и умножения результата на 100.
Термины «кодировать» или «кодирование» относятся к генетическому коду, который определяет то, как нуклеотидная последовательность транслируется в полипептид или белок. Порядок нуклеотидов в последовательности определяет порядок аминокислот в полипептиде или белке.
Термин «белок» относится к макромолекуле, состоящей из одной или нескольких линейных цепей аминокислот или полипептидов. Белки могут подвергаться посттрансляционным модификациями, например, превращению цистеинового остатка в 3-оксоаланин, гликозилированию или связыванию с металлами. Гликозилирование белка представляет собой добавление различных углеводов, которые ковалентно связываются с аминокислотной цепью.
Термин «эффективное количество» относится к количеству вещества, достаточного для достижения предполагаемой цели. Например, эффективное количество вектора на основе AAV9 для повышения активности идуронат-2-сульфатазы (IDS) представляет собой количество, достаточное для снижения накопления гликозаминогликанов. «Терапевтически эффективное количество» вектора экспрессии для лечения заболевания или нарушения представляет собой количество вектора экспрессии, достаточное для ослабления или устранения признаков и симптомов заболевания или нарушения. Эффективное количество конкретного вещества будет варьировать в зависимости от факторов, таких как природа вещества, путь введения, размер и вид животного, получающего вещество, а также цель введения вещества. Эффективное количество в каждом конкретном случае может быть определено эмпирически опытным специалистом в соответствии с принятыми в данной области способами.
Термин «индивидуум» относится к млекопитающему, предпочтительно человеку или млекопитающему помимо человека, более предпочтительно мыши, крысе, другим грызунам, кролику, собаке, кошке, свинье, корове, лошади или примату, еще более предпочтительно человеку.
Термин «функционально связанный» относится к функциональной связи и положению промоторной последовательности по отношению к представляющему интерес гену (например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности). Как правило, функционально связанный промотор является смежным по отношению к представляющему интерес гену. Однако энхансер не должен быть смежным по отношению к представляющей интерес последовательности для контроля ее экспрессии.
Термин «тропизм» относится к способу, при котором различные вирусы эволюционировали для предпочтительного целенаправленного воздействия на определенные виды хозяев или определенные типы клеток в этих видах.
Термин «генная терапия» относится к переносу представляющего интерес генетического материала (например, ДНК или РНК) в клетку для лечения или предупреждения наследственного или приобретенного заболевания или состояния. Представляющий интерес генетический материал кодирует продукт (например, белок, полипептид, пептид или функциональную РНК), образование которого in vivo является желательным. Например, представляющий интерес генетический материал может кодировать фермент, гормон, рецептор или полипептид терапевтического значения.
Термин «рекомбинантный вирусный вектор» или «вирусный вектор» относится к средству, полученному из встречающегося в природе вируса при помощи методик генной инженерии, способному переносить представляющий интерес генетический материал (например, ДНК или РНК) в клетку, что приводит к образованию продукта, кодируемого этим указанным генетическим материалом (например, белком, полипептидом, пептидом или функциональной РНК), в клетке-мишени.
Термин «рекомбинантная плазмида» или «плазмида» относится к небольшой кольцевой двунитевой самореплицирующейся молекуле ДНК, полученной при помощи методик генной инженерии, способной переносить представляющий интерес генетический материал в клетку, что приводит к образованию продукта, кодируемого этим указанным генетическим материалом (например, белком, полипептидом, пептидом или функциональной РНК), в клетке-мишени. Кроме того, термин «рекомбинантная плазмида» или «плазмида» также относится к небольшой кольцевой двунитевой самореплицирующейся молекуле ДНК, полученной при помощи методик генной инженерии, используемых во время получения вирусных векторов в качестве носителей генома рекомбинантного вектора.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение предусматривает новые нуклеотидные последовательности для лечения мукополисахаридозов, в частности, мукополисахаридозов II типа (MPSII), или синдрома Хантера.
Нуклеотидные последовательности в соответствии с настоящим изобретением кодируют белок идуронат-2-сульфатазу (обозначаемую как IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, фермента, участвующего в постадийном разложении гликозаминогликанов гепарансульфатаа и дерматансульфата. Термины «встречающаяся в природе IDS» или «IDS дикого типа» относятся в контексте настоящего изобретения к нуклеотидной последовательности, полученной или образованной из клеток-хозяев при помощи способов, известных специалисту в данной области, или альтернативно синтезированной при использовании в качестве исходного материала кодирующей последовательности (CDS) для IDS других видов. Предпочтительно «встречающаяся в природе IDS» или «IDS дикого типа» является химически синтезированной из мышиной CDS (обозначаемой как mIDS) или из человеческой CDS (обозначаемой как hIDS). Более предпочтительно нуклеотидная последовательность hIDS является химически синтезированной из человеческой CDS и соответствует SEQ ID NO: 2.
В соответствии с настоящим изобретением данные указывают на то, что модифицированные нуклеотидные последовательности, также обозначаемые как оптимизированные нуклеотидные последовательности, опосредуют образование большего количества представляющего интерес белка, вероятно, в результате эффективной транскрипции mRNA или транскриптона более стабильной mRNA, или более эффективного использования кодонов. Эти последовательности обозначаются в данном документе как «оптимизированные последовательности», omIDS и ohIDS при получении из мышиной и человеческой CDS соответственно. Предпочтительно оптимизированные последовательности в соответствии с настоящим изобретением представляют собой кодон-оптимизированные последовательности.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к выделенной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и на 75-90% идентичной SEQ ID NO: 2. В частности, выделанная нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентична SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления выделенные нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению выбраны из варианта 1 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 5, и варианта 2 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 8.
В соответствии с настоящим изобретением выделенные нуклеотидные последовательности, описанные выше в данном документе, можно вставить в сайт множественного клонирования (MCS) базовой плазмиды. В частности, базовая плазмида представляет собой плазмиду, которая содержит ITR аденоассоциированного вируса (AAV), обозначаемого в данном документе как pAAV.
Второй аспект настоящего изобретения предусматривает плазмиду, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере на 75% идентичную SEQ ID NO: 2. Предпочтительно плазмида в соответствии с настоящим изобретением на 75-90% идентична SEQ ID NO: 2. В частности, плазмида в соответствии с настоящим изобретением содержит выделенную нуклеотидную последовательность, на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентичную SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления плазмида по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность из hIDS, представленную в SEQ ID NO: 2, варианта 1 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 5, и варианта 2 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 8.
Помимо выделенных последовательностей, упомянутых выше, плазмиды в соответствии с настоящим изобретением также включают стандартные контрольные элементы, которые могут быть функционально связаны с нуклеотидной последовательностью таким образом, что обеспечивается ее транскрипция, трансляция и/или экспрессия в клетке, трансфицированной плазмидами. В частности, плазмиды в соответствии с настоящим изобретением, содержат промотор в качестве контрольного элемента, функционального связанного с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью. Большое число промоторов, которые являются нативными или химерными, конститутивными или индуцибельными, универсальными и/или тканеспецифичными, известны в данной области. Предпочтительно промотор, используемый в контексте настоящего изобретения, представляет собой промотор CAG, который относится к комбинации, содержащей ранний энхансерный элемент цитомегаловируса и промотор β-актина цыпленка. Он дополнительно включает участки интронов β-актина цыпленка и β-глобина кролика, которые придают придают стабильность mRNA, полученной из представляющей интерес нуклеотидной последовательности. См. Alexopoulou A., et al., ВМС Cell Biology 2008; 9(2): 1-11. Промотор CAG, включенный в плазмиды на основе pAAV по настоящему изобретению, имеет последовательность SEQ ID NO: 14. Этот конкретный промотор CAG обеспечивает длительную экспрессию отсутствующего фермента во всех областях головного мозга и в печени. Как следствие, лизосомальное накопление гликозаминогликана (GAG) корректируется, предупреждая таким образом неврологические и соматические изменения, характерные для MPSII.
В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления плазмида в соответствии с настоящим изобретением представляет собой плазмиду на основе pAAV-CAG-hIDS, представленного в SEQ ID NO: 3, с номером доступа DSM 29866.
В соответствии с другим особо предпочтительным вариантом осуществления плазмида в соответствии с настоящим изобретением представляет собой плазмиду варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS, представленную в SEQ ID NO: 6, с номером доступа DSM 29867.
В соответствии с другим особо предпочтительным вариантом осуществления плазмида в соответствии с настоящим изобретением представляет собой плазмиду варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS, представленную в SEQ ID NO: 9, с номером доступа DSM 29868.
Третий аспект настоящего изобретения относится к новым рекомбинантным векторам для лечения мукополисахаридозов II типа. Необходимо понимать, что вектор по настоящему изобретению представляет собой капсидный белок, а также векторный геном, содержащийся в нем, используемый для переноса представляющего интерес генетического материала в клетку. Кроме указанного представляющего интерес генетического материала, геном вектора может также содержать различные функциональные элементы, которые включают контрольные элементы, такие как промоторы или операторы, связывающие области транскрипционных факторов или энхансеры, а также контрольные элементы для инициации или терминации трансляции.
Векторы в соответствии с настоящим изобретением получают из аденоассоциированных вирусов (AAV) и используют для переноса представляющей интерес нуклеотидной последовательности в клетку-мишень. Было доказано, что они характеризуются высокой эффективностью трансдукции постмитотических клеток в широком диапазоне тканей. В контексте настоящего изобретения векторы используют для доставки кодирующей последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы (hIDS of SEQ ID NO: 2) или оптимизированного варианта кодирующей последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы, (варианта 1 ohIDS из SEQ ID NO: 5 или варианта 2 ohIDS из SEQ ID NO: 8). Вектор на основе аденоассоциированного вируса представляет собой вектор, полученный из аденоассоциированного вируса семейства парвовирусов. Геном аденоассоциированного вируса построен из однонитевой дезоксинуклеиновой кислоты (ssDNA). Эти вирусы инфицируют млекопитающих, но являются непатогенными (т.е. не вызывают заболевание). Они могут инфицировать делящиеся или неделящиеся клетки, и их тропизм изменяется в зависимости от серотипа. Серотип представляет собой классификацию групп вирусов в зависимости от их капсидных антигенов. Серотип аденоассоциированного вируса, определяемый по его капсидному белку, обозначает тропизм вируса и способствует его вхождению в определенный тип клеток. В контексте настоящего изобретения AAV имеет серотип 1, 2, 5, 7, 8, 9 или 10. Предпочтительно AAV представляет собой серотип 9 (AAV9), поскольку он характеризуется наилучшей способностью доставлять генетический материл в головной мозг, а также в периферические органы при однократном введении в CSF. Векторы на основе AAV9 по настоящему изобретению состоят из вирусного капсида серотипа 9 человеческого аденоассоциированного вируса и модифицированного генома, содержащего инвертированные концевые повторы (ITR) человеческого аденоассоциированного вируса серотипа 2, промотор CAG, кодирующую последовательность гена человеческой идуронат-2-сульфатазы (hIDS) или ее оптимизированный вариант (также обозначаемый как нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением), и поли-А из гена бета-глобина кролика.
Таким образом, в соответствии со вторым аспектом настоящее изобретение относится к рекомбинантному AAV, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере на 75% идентичную SEQ ID NO: 2. Предпочтительно рекомбинантный AAV в соответствии с настоящим изобретением на 75-90%) идентичен SEQ ID NO: 2. В частности, рекомбинантный AAV в соответствии с настоящим изобретением содержит нуклеотидную нуклеотидную последовательность в соответствии с настоящим изобретением, на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентичную SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления выделенные нуклеотидные последовательности в рекомбинантном AAV по настоящему изобретению выбраны из hIDS, представленного в SEQ ID NO: 2, варианта 1 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 5, и варианта 2 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 8.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному AAV9, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу IDS, представленный в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере на 75% идентичную SEQ ID NO: 2. Предпочтительно рекомбинантный AAV9 по настоящему изобретению содержит нуклеотидную последовательность, на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2. В частности, рекомбинантный AAV9 по настоящему изобретению содержит нуклеотидную нуклеотидную последовательность в соответствии с настоящим изобретением, на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентичную SEQ ID NO: 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления рекомбинантный AAV по настоящему изобретению содержит нуклеотидные последовательности из hIDS, представленного в SEQ ID NO: 2, варианта 1 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 5, и варианта 2 ohIDS, представленного в SEQ ID NO: 8.
Кроме того, неожиданным образом было обнаружено, что ассоциация в одной и то же структуре капсида AAV9 с нуклеотидной последовательностью, кодирующей идуронат-2-сульфатазу (IDS), совместно с выбранным промотором, особенно промотором CAG, способствует длительной экспрессии отсутствующего фермента во всех областях головного мозга, в частности, если структуру доставляют в спинномозговую жидкость (CSF) при помощи интрацистернальной инъекции. Как следствие, лизосомальное накопление гликозаминогликана (GAG) корректируется, предупреждая таким образом неврологические изменения, характерные для заболевания MPSII. Данный эффект наблюдали даже в обонятельной луковице, которая удалена от места введения векторов (большой цистерны). Дополнительно векторы на основе AAV9 в соответствии с настоящим изобретением, доставляемые в CSF, могли достигать системного кровотока с трансдукцией печени. Образование и секреция фермента клетками печени приводила к повышению активности идуронат-2-сульфатазы (IDS) в сыворотке, в конечном итоге приводя к снижению патологии лизосом во многих соматических тканях. Это представляет собой очевидное преимущество векторов в соответствии с настоящим изобретением над существующими подходами, которые лишь частично корректировали клинические признаки заболевания и, как правило, вызывают эффект в головном мозге или в системном кровотоке, но не в обеих.
Соответственно, настоящее изобретение относится к векторам на основе AAV9, содержащим промотор CAG, связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленной в SEQ ID NO: 1.
В частности, векторы на основе AAV9 по настоящему изобретению содержат промотор CAG, связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и по меньшей мере на 75% идентичную SEQ ID NO: 2. Предпочтительно векторы на основе AAV9 по настоящему изобретению содержат промотор CAG, связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2. В частности, нуклеотидная последовательность, содержащаяся в векторе на основе AAV9 в соответствии с настоящим изобретением на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентична SEQ ID NO: 2.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления рекомбинантный вектор по настоящему изобретению представляет собой AAV9-CAG-hIDS (SEQ ID NO: 4), содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, функционально связанную с промотором CAG из SEQ ID NO: 14.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления рекомбинантный вектор по настоящему изобретению представляет собой вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 7), содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, функционально связанную с промотором С AG из SEQ ID NO: 14.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления рекомбинантный вектор по настоящему изобретению представляет собой вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 10), содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, функционально связанную с промотором CAG из SEQ ID NO: 14.
Рекомбинантные векторы по настоящему изобретению, как определено выше в данном документе, можно получить из соответствующих плазмид, также описанных выше в данном документе, в результате трансфекции клеток HEK293 при помощи способов, известных в данной области.
Таким образом, настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения векторов на основе аденоассоциированых вирусов AAV в соответствии с настоящим изобретением, и, в частности, AAV9. Способ предусматривает стадии:
i) получения первой плазмиды, содержащей последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, расположенный между первым концевым повтором AAV и вторым концевым повтором AAV, промотор CAG, функционально связанный с последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок; второго вектора, содержащего rep-ген AAV и cap-ген AAV, и третьего вектора, содержащего ген хелперного функционального элемента аденовируса;
ii) котрансфекции компетентных клеток векторами из стадии i);
iii) культивирования трансфицированных клеток из стадии ii) в течение периода времени, достаточного для образования вирусных частиц; и
iv) очистки векторов экспрессии от культуры из стадии iii).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления первый AAV и вторые концевые повторы первого вектора представляют собой ITR из AAV серотипа 2. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления гер-гены AAV второго вектора происходят из AAV серотипа 2. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления компетентные клетки представляют собой клетки HEK293. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления cap-гены AAV второго вектора происходят из AAV серотипа 9.
Настоящее изобретение также предусматривает способ получения плазмиды в соответствии с изобретением, предусматривающий стадии:
i) эксцизии последовательности, кодирующей представляющий интерес белок из исходной плазмиды, в результате переваривания при помощи Mlul/EcoRI,
ii) клонирования последовательности, кодирующей представляющий интерес белок между двумя сайтами рестрикции базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG, тем самым получения соответствующей плазмиды, включающей последовательность, кодирующую представляющий интерес белок.
Настоящее изобретение предусматривает в соответствии с дополнительным аспектом фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество выделенных нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, плазмид, описанных в данном документе, или векторов на основе AAV, в частности, векторов на основе AAV9, описанных в данном документе.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержит выделенные нуклеотидные последовательности, описанные в данном документе, плазмиды, описанные в данном документе, или векторы на основе AAV, описанные в данном документе, в фармацевтически приемлемом носителе. Композиция также может содержать по меньшей мере одно вспомогательное вещество. Вспомогательные вещества можно выбрать из носителей, наполнителей, растворителей, разбавителей или адъювантов. Допустимые носители, разбавители или адъюванты являются нетоксичными, предпочтительно инертными в используемых дозе и концентрациях, и включают буферы, такие как фосфатные, цитратные, или буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты; низкомолекулярные полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры; аминокислоты; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства; саахроспирты, такие как маннит и сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как блок-сополимер полиэтилена и полиоксипропилена (Pluronic F68®) и полиэтиленгликоль (PEG).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению являются подходящими для парентерального введения. Примерами парентерального введения являются внутривенные, интрацистернальные и внутримышечные инъекции. Предпочтительно фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением является подходящей для внутривенного или интрацистернального введения. Композиции, подходящие для такого парентерального введения, включают стерильные водные растворы или дисперсии, стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий. Предпочтительно фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением защищают от загрязняющего действия бактерий и грибов.
Доза для человека и животных может варьировать в зависимости от факторов, которые имеют свое основание у соответствующих видов или других факторов, таких как возраст, пол, вес или степень заболевания и т.д.
Еще один дополнительный аспект настоящего изобретения относится к терапевтическому применению выделенных нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, плазмид, описанных в данном документе, или векторов на основе AAV, в частности, векторов на основе AAV9, описанных в данном документе. Как упомянуто выше, выделенные нуклеотидные последовательности, плазмиды, описанные в данном документе, или векторы на основе AAV, в частности, векторы на основе AAV9 в соответствии с настоящим изобретением, опосредуют экспрессию отсутствующего фермента IDS, таким образом корректируя лизосомальное накопление GAG. Это способствует коррекции всех клинических признаков мукополисахаридозов II типа (MPSII). В этом отношении настоящее изобретение также относится к выделенным нуклеотидным последовательностям, описанным в данном документе, плазмидам, описанным в данном документе, или векторам на основе AAV, в частности, векторам на основе AAV9, описанным в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата.
В частности, настоящее изобретение относится к выделенным нуклеотидным последовательностям, описанным в данном документе, плазмидам, описанным в данном документе, или векторам на основе AAV, в частности, векторам на основе AAV9, описанным в данном документе, для повышения активности идуронат-2-сульфатазы (IDS) в организме.
В соответствии с дополнительным предпочтительным аспектом настоящее изобретение относится к выделенным нуклеотидным последовательностям, описанным в данном документе, плазмидам, описанным в данном документе, или векторам на основе AAV, в частности, векторам на основе AAV9, описанным в данном документе, для лечения мукополисахаридозов II типа (MPSII).
В соответствии с еще одним дополнительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к выделенным нуклеотидным последовательностям, описанным в данном документе, плазмидам, описанным в данном документе, или векторам на основе AAV, в частности, векторам на основе AAV9, описанным в данном документе, для получения лекарственного препарата, пригодного для лечения мукополисахаридозов II типа (MPSII).
Другой вариант осуществления настоящего изобретения направлен на способ лечения мукополисахаридозов II типа (MPSII), предусматривает стадию введения по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности, описанной в данном документе, одной плазмиды, описанной в данном документе, или одного вектора на основе AAV, в частности, вектора на основе AAV9, описанного в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает выделенную клетку, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую идуронат-2-сульфатазу из SEQ ID NO: 1. В частности, клетка в соответствии с настоящим изобретением содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO: 1, и на по меньшей мере 75% идентичную SEQ ID NO: 2, предпочтительно на 75-90% идентичную SEQ ID NO: 2. В частности, нуклеотидная последовательность, содержащаяся в выделенной клетке в соответствии с настоящим изобретением на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 82%, 85%, 87% или 90% идентична SEQ ID NO: 2.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления клетки по настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 2, кодирующую идуронат-2-сульфатазу (IDS) SEQ ID NO: 1.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления клетки по настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 5, кодирующую идуронат-2-сульфатазу (IDS) SEQ ID NO: 1.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления клетки по настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 8, кодирующую идуронат-2-сульфатазу (IDS) SEQ ID NO: 1.
Следующие примеры носят только иллюстративный характер и ни в коем случае не могут считаться ограничивающими.
ОБЩИЕ ПРОЦЕДУРЫ
1. Рекомбинантные векторы на основе AAV
Векторы на основе AAV, описанные в данном документе, получали при помощи тройной трансфекции. Материалами, необходимыми для получения векторов, были клетки HEK293 (экспрессирующие гены аденовируса Е1), хелперная плазмида, обеспечивающая функционирование аденовирусов, плазмида, представляющая гер-гены AAV серотипа 2 и cap-гены серотипа 9 (AAV9) и, наконец, базовая плазмида с ITR AAV2 и представляющая интерес конструкция.
Для получения векторов на основе AAV, экспрессирующих идуронат-2-сульфатазу, оптимизированные или неоптимизированные кодирующие последовательности человеческой или мышиной идуронат-2-сульфатазы клонировали в базовую плазмиду на основе AAV под контролем универсального гибридного промотора CAG. Массовое получение плазмид выполняли при помощи набора EndoFree Plasmid Megaprep (Qiagen).
Векторы получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita Т, et al., Gene Ther. 1998; 5:938-945 и Wright J, et al., Mol. Ther. 2005; 12:171-178. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированной вирусными ITR AAV серотипа 2 (описанными выше); 2) плазмидой, несущей rep2-гены и сар9-гены AAV; и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовирусов. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso Е., et al., Gene Ther. 2010; 17:503-510. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения.
Векторы по настоящему изобретению разрабатывали в соответствии с методиками молекулярной биологии, известными в данной области.
2. Животные
Модельную мышь с недостаточностью идуронат-2-сульфатазы (MPSII) приобретали в Taconic (Germantown, NY 12526 USA, Stock TF1838). Пораженные MPSII и здоровые контрольные мыши были результатом инбридинга между гемизиготными самцами-основателями и гетерозиготными самками-основательницами. Генотипы определяли по геномным ДНК из образцов подрезанных хвостов при помощи ПЦР-анализа, в котором амплифицировали последовательность, охватывающую целевую мутацию. Последовательности соответствующих смысловых и антисмысловых праймеров были следующими: прямой праймер: 5'-ТТТ TGT GTA СТС САА ССС CG -3' (SEQ ID NO: 15), обратный праймер: 5'-TGT СТС CAT AAC AGC ССА GG -3' (SEQ ID NO: 16), мутация обрабтного праймера: 5'-GCC СТС АСА TTG ССА AAG GA -3' (SEQ ID NO: 17). Мышей содержали ad libitum на стандартной диете (Harlan, Tekland) и поддерживали цикл свет-темнота, равный 12 ч (включение света в 9.00 утра).
3. Гидродинамическая доставка IDS-кодирующих плазмид мышам
Для гидродинамической доставки плазмид на основе pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS 3-месячные животные с MPSII и животные дикого типа получали в хвостовую вену инъекцию в течение <5 секунд в суммарной дозе 30 мкг плазмид в объеме, равном 10% от веса тела животного. Эта методика приводила к экспрессии кодируемых плазмидами трансгенов главным образом в печени. См. Liu et al., Gene Ther. 1990; 6(7): 1258-66. В качестве контроля когорта мышей получала равный объем солевого раствора. Мышей разделяли на две когорты и выводили из эксперимента через 48 часов или 1 неделю после гидродинамической инъекции плазмид. Органы брали для анализа, как описано в следующем разделе.
4. Введение векторов мышам
В случае доставки в CSF векторов на основе AAV9-CAG-omIDS мышам суммарную дозу 5×1010 vg вводили в большую цистерну 2-месячным животным с MPSII. Аналогичной когорте животных вводили 5×1010 vg контрольного некодирующего (AAV9-Null) вектора. В возрасте 6 и 10 месяцев, т.е. через 4 и 8 месяцев после введения векторов, мышей анестезировали и ткани брали на анализ.
В случае внутривенной доставки векторов на основе AAV9, содержащих hIDS дикого типа или любой из оптимизированных вариантов кодирующей IDS последовательности мышам суммарную дозу 1×1010 vg вектора вводили в хвостовую вену 3,5-месячных животных с MPSII. Животные WT и не подвергшиеся обработке животные с MPSII выступали в качестве контроля. Через три недели после введения мышей анестезировали и ткани собирали на анализ.
5. Сбор образцов
При выведении из эксперимента животных глубоко анестезировали и затем транскаудально перфузировали 12 мл PBS для полного очищения крови от тканей. Весь головной мозг и несколько тканей тела (в том числе ткань печени, селезенки, поджелудочной железы, почек, легких, сердца, скелетных мышц, семенников, мочевого пузыря, кишечника и жировую ткань) собирали и замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С или погружали в формалин для последующих гистологических анализов.
6. Активность идуронат-2-сульфатазы и количественное определение гликозаминогликанов
Образцы головного мозга, печени легких и сердца подвергали действию ультразвука в воде Mili-Q. Сыворотку анализировали необработанной, активность идуронат-2-сульфатазы определяли при помощи флуорогенного субстрата на основе 4-метилумбеллиферона (Moscerdam Substrates, Угстгест, Нидерланды), как описано ранее. См. Voznyi et al., J Inner Metab Diss 2001; 24:675-680. Уровни активности в головном мозге, печени, легких и сердце нормализовали по отношению к суммарному количеству белка, определенного количественно при помощи метода Бредфорда (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). Сывороточную активность нормализовали по отношению к объему.
В случае количественного определения гликозаминогликанов (GAG) образцы тканей взвешивали и затем переваривали при помощи протеиназы K, а экстракты очищали при помощи центрифугирования и фильтрации. Уровни GAG определяли в экстрактах тканей при помощи набора для определения сульфатированных гликозаминогликанов BIyscan (Biocolor, Каррикфергус, графство Антрим, Великобритания) с использованием хондроитин-4-сульфата в качестве стандарта. Уровни GAG нормализовали по отношению к влажному весу тканей.
7. Активность других лизосомальных ферментов
Образцы головного мозга и печени подвергали действию ультразвука в 500 мкл воды Mili-Q и активность ферментов определяли в супернатантах с использованием флуорогенных субстратов на основе 4-метилумбеллиферона. Сыворотку анализировали необработанной. Активность IDUA анализировали в 15 мкг белка, инкубированного в течение 1 ч при 37°С с 4-метилумбеллиферил-α-L-идуронидом (Glycosynth). См. Barter et al., Blood 2002; 99(5)1857-9. Активность SGSH измеряли, как описано ранее. См. Karpova et al., J Inherit Metab Dis. 1996; 19(3):278-285, Haurigot et al., выше. Вкратце, 30 мкг белка сначала инкубировали с 4-MU-αGlcNS в течение 17 часов при 47°С. Вторую инкубацию проводили в присутствии 10 ЕД./мл а-глюкозидазы (Sigma-Aldrich) в 0,2% BSA в течение 24 часов при 37°С. В случае активности NAGLU 30 мкг экстракта тканевых белков инкубировали с 4-метилумбеллиферил-α-N-ацетил-D-глюкозаминидом (Moscerdam Substrates) в течение 3 ч при 37°С, как описано ранее. См. Marsh et al., Clin Genet. 1985; 27(3):258-62, Ribera et al., выше. Активность HGSNAT определяли на основе 30 мкг белкового экстракта, инкубированного с ацетилкоэнзимом А и 4-метилумбелиферрил-3-D-глюкозамином (MU-3GlcNH2, Moscerdam Substrates) в течение 17 ч при 37°С. См. Voznyi et al., J Inh Metab Dis 1993; 16:465-72. Активность GALNS анализировали с использованием 2-стадийного протокола с применением 10 мкг белкового экстракта и 4-метилумбеллиферил β-D-галактопиранозид-6-сульфат-натриевой соли (MU-3Gal-6S) во время первой инкубации в течение 17 ч при 37°С. Вторую стадию осуществляли при помощи добавления Pi-буфера (буфер 0,9 М Na2HPO4/0,9 М NaH2PO4, рН 4,3, + 0,02% (w/v) Na-азид) и β-галактозидазы (β-Gal-Ao, Sigma) и инкубации смеси в течение 2 ч при 37°С. См. van Diggelen et al., Clin Chim Acta 1990; 187:131-40. Активность фермента GUSB определяли на основе 10 мкг белкового экстракта, инкубированного с 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида (Sigma) при 37°С в течение 1 ч. Активность НЕХВ анализировали при помощи инкубации 0,1 мкг белкового экстракта с 4-метилумбеллиферил N-ацетил-β-D-глюкозаминидом (Sigma) в течение 1 ч при 37°С. После остановки реакций в результате повышения рН выделяемую флуоресценцию измеряли при помощи флуориметра FLx800 (BioTek Instruments). Все уровни активности в головном мозге и печени нормализовали по отношению к суммарному количеству белка, определенного количественно при помощи метода Бредфорда (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).
8. Гистологический анализ
Ткани фиксировали в течение 12-24 ч в формалине, заключали в парафин и выполняли срезы. С целью иммуногистохимического выявления LAMP2 в головном мозге парафиновые срезы подвергали высокотемпературной демаскировке антигена в цитратном буфере, рН 6, и затем инкубировали в течение ночи при 4°С с крысиным антителом к LAMP2 (Ab13524; Abeam, Кембридж, Великобритания), разведенным при 1:500, а затем инкубировали с биотинилированным кроличьим антителом к крысиному антителу (Dako, Глоструп, Дания) при 1:300. В случае иммуноокрашивания на наличие GFAP в образцах головного мозга парафиновые срезы инкубировали при 4°С с кроличьим антителом к GFAP (Ab6673; Abeam, Кембридж, Великобритания), разведенным при 1:1000, а затем инкубировали с биотинилированным козьим антителом к кроличьему антителу (31820; Vector Laboratories, Бурлингейм, Калифорния, США) при 1:300. Сигналы от LAMP2 и GFAP амплифицировали при помощи инкубации срезов с набором для окрашивания ABC-Peroxidase (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) при разведении 1:100 и визуализировали при помощи 3,3-диаминобензидина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве хромогена.
Для окрашивания микроглиальных клеток в образцах головного мозга парафиновые среды инкубировали в течение ночи при 4°С с лектином BSI-B4 (L5391; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), разведенным при 1:100. Сигнал от BSI-B4 визуализировали при помощи 3,3-диаминобензидина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве хромогена. Изображения в светлом поле получали при помощи оптического микроскопа (Eclipse 90i; Nikon, Токио, Япония).
Компьютерную программу NIS Elements Advanced Research 2.20 использовали для количественного определения сигналов от LAMP2, GFAP и BSI-B4 в 3-4 изображениях каждого отдела головного мозга (исходное увеличение, х20) на животное, при помощи одинаковых параметров порога пропускания сигнала для всех животных. Затем рассчитывали процент положительной площади, т.е. площади в пикселях с положительным сигналом на суммарной площади ткани в изображении.
9. Количественное определение числа копий векторных геномов в тканях
После переваривания тканей в течение ночи при помощи протеиназы K (0,2 мг/мл), полную ДНК выделяли при помощи набора MasterPureDNA Purification (Epicenter). Количественную ПЦР с праймерами и зондом, специфичным по отношению к последовательности НВВ2 (содержащейся в сегменте поли-А) использовали для количественного определения числа копий векторных геномов в 20 нг полной РНК. Прямой праймер: 5'-СТТ GAG CAT CTG ACT TCT GGC TAA T-3'; обратный праймер: 5'-GAT TTG CCC TCC CAT ATG TCC-3'; зонд: 5'-CCG AGT GAG AG А С AC AAA AAA TTC CAA CAC-3'. Кривую эталонного стандарта, построенную на основе серийных разведений линеаризованной плазмиды, содержащей последовательность поли-А, использовали для интерполяции конечных значений vg/образец.
10. Тест открытого поля
Поведение 6-месячных крыс анализировали при помощи теста открытого поля, выполняемого с 9.00 до 13.00. Животных помещали в нижний левый угол ярко-освещенной камеры (41×41×30 см), пересеченной 2 пучками лучей света (SedaCom32; Panlab), которые выявляли горизонтальные и вертикальные движения мышей. Поверхность разделяли на три разбитые на квадраты концентрические области: центральную (14×14 см), периферическую (27×27 см) и пограничную (41×41 см). Исследовательскую и двигательную активности фиксировали в течение первых 3 минут теста при помощи системы видеотелевизионного сопровождения целей (SmartJunior, Panlab).
11. Статистический анализ
Все результаты выражали в виде среднего значения ± SEM. Статистические сравнения проводили при помощи однофакторного ANOVA. Множественные сравнения между контрольными группами и группами обработки выполняли при помощи апостериорного критерия Даннета, а между всеми группами при помощи апостериорного критерия Тьюки. Статистическую значимость учитывали при Р<0,05. Кривые Каплана-Мейера использовали для оценки выживаемости, а логарифмический ранговый критерий использовали для сравнений.
Примеры
Пример 1. Конструирование pAAV-CAG-UDS
CDS для человеческой идуронат-2-сульфатазы использовали в качестве исходного материала (эталонная последовательность в NCBI: NM_000202.6) и химически синтезировали для данной цели (GenScript Inc). CDS получали клонированной в плазмиде pUC57 (AmpR), фланкированной сайтами рестрикции Swal.
CDS-фрагмент на основе Swal-Swal и человеческой идуронат-2-сульфатазы вырезали из плазмиды pUC57 и затем клонировали между сайтами рестрикции Mlul и EcoPI базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG после получения 5' и 3' выступающих концов, притупленных фрагментом Кленова (Fermentas). Полученную плазмиду назвали pAAV-CAG-hIDS (номер доступа DSM 29866). См. фиг. 1А и SEQ ID NO: 3.
Плазмиду на основе pAAV-CAG получали ранее, и она содержала ITR из генома AAV2, промотор CAG и сигнальную последовательность поли-А из β-глобина кролика, а также сайт множественного клонирования представляющих интерес CDS. Промотор CAG представляет собой гибридный промотор, состоящий из раннего/промежуточного энхансера CMV и промотора β-актина цыпленка. Этот промотор способен управлять выраженной экспрессией универсально. См. Sawicki J et al., Exper Cell Res. 1998; 244:367-369, Huang J et al., J Gene Med. 2003; 5:900-908, Liu Y ei al., Exp Mol Med. 2007; 39(2):170-175.
Пример 2. Конструирование варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS
Разрабатывали и получали кассеты экспрессии, включающие оптимизированный вариант последовательности cDNA человеческой идуронат-2-сульфатазы (ohIDS). Оптимизацию последовательности выполняли с целью повышения до максимума эффективности образования белка идуронат-2-сульфатазы у человека путем устранения криптических сайтов сплайсинга и дестабилизирующих РНК элементов последовательности с целью повышения стабильности РНК, добавления стабилизирующих РНК элементов последовательности, оптимизации кодонов и адаптации содержания G/C, избежания стабильных вторичных структур РНК среди других изменений. CDS для человеческой идуронат-2-сульфатазы (эталонная последовательность в NCBI: NM_000202.6) использовали в качестве исходного материала для оптимизации последовательности (DNA 2.0 Inc). Оптимизированные CDS получали клонированными в плазмиде pJ204:191476 (AmpR), фланкированной по сайтам рестрикции Mlul и EcoRI на 5' и 3' соответственно.
CDS-фрагмент, оптимизированный Mlul/EcoRI, на основе человеческой идуронат-2-сульфатазы вырезали из плазмиды pJ204:191476 и затем клонировали между сайтами рестрикции Mlul и EcoRI базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG. Полученную плазмиду назвали вариант 1 pAAV-CAG-ohIDS (номер доступа DSM 29867). См. фиг. 2А и SEQ ID NO: 6.
Пример 3. Конструирование варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS
CDS для человеческой идуронат-2-сульфатазы (эталонная последовательность в NCBI: NM_000202.6) подвергали оптимизации последовательности (GeneScript Inc). Оптимизированные CDS получали клонированными в плазмиде pUC57 (AmpR), фланкированной по сайтам рестрикции Mlul и EcoRI на 5' и 3' соответственно.
Плазмиду на основе pUC57-ohIDS переваривали при помощи Mlul и EcoRI с целью вырезания оптимизированной CDS идуронат-2-сульфатазы. Затем этот фрагмент клонировали между одинаковыми сайтами базовой плазмиды pAAV-CAG с целью получения плазмиды варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS (номер доступа DSM 29868). См. фиг. 3А и SEQ ID NO: 9.
Пример 4. Конструирование pAAV-CAG-omIDS
CDS для мышиной идуронат-2-сульфатазы (эталонная последовательность в NCBI: NM_010498.3) подвергали оптимизации последовательности (GeneArt; Life Technologies). Оптимизированные CDS получали клонированными в плазмиде pMA-RQ (AmpR), фланкированной по сайтам рестрикции Mlul и EcoRI на 5' и 3' соответственно.
CDS-фрагмент, оптимизированный Mlul/EcoRI, на основе мышиной идуронат-2-сульфатазы (SEQ ID NO: 11) вырезали из плазмиды pMA-RQ и затем клонировали между сайтами рестрикции Mlul и EcoRI базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG. Полученную плазмиду назвали pAAV-CAG-omIDS. См. фиг. 4А и SEQ ID NO: 12.
Пример 5. Получение AAV9-CAG-hIDS
Векторы на основе AAV9-CAG-hlDS (SEQ ID NO: 4) получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita et al., Gene Ther. 1998; 5(7):938-45, Wright et al., Mol Ther. 2005; 12(1)171-8. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-hIDS); 2) плазмидой, несущей rep-гены AAV2 и cap-гены AAV9 (pREP2CAP9); и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовируса. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso et al., Gene Ther. 2010; 17(4):503-10. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения. См. фиг. 1В.
Пример 6. Получение варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS
Векторы на основе варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 7) получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita et al., и Wright et al., выше. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированную ITR AAV2 (вариант 1 pAAV-CAG-ohIDS); 2) плазмидой, несущей rep-гены AAV2 и сар-гены AAV9 (pREP2CAP9); и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовируса. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso et al., выше. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения. См. фиг. 2В.
Пример 7. Получение варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS
Векторы на основе варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS (SEQ ID NO: 10) получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita et al., и Wright et al., выше. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированную ITR AAV2 (вариант 2 pAAV-CAG-ohIDS); 2) плазмидой, несущей rep-гены AAV2 и сар-гены AAV9 (pREP2CAP9); и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовируса. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso et al., выше. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения. См. фиг. 3В.
Пример 8. Получение AAV9-CAG-omIDS
Векторы на основе AAV9-CAG-omIDS (SEQ ID NO: 13) получали при помощи трансфекции клеток HEK293 без участия хелперных вирусов при помощи трех плазмид с модификациями. См. Matsushita et al., и Wright et al., выше. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) в DMEM с добавлением 10% FBS и затем контрансфицировали 1) плазмидой, несущей кассету экспрессии, фланкированную ITR AAV2 (вариант 2 pAAV-CAG-omIDS); 2) плазмидой, несущей rep-гены AAV2 и cap-гены AAV9 (pREP2CAP9); и 3) плазмидой, несущей хелперные функциональные элементы аденовируса. Векторы очищали при помощи двух последовательных градиентов плотности хлористого цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. См. Ayuso et al., выше. Векторы диализировали против PBS + 0,001% Pluronic® F68, фильтровали, титровали при помощи qPCR и хранили при -80°С до применения. См. фиг. 4В.
Пример 9. Гидродинамическая инъекция pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS здоровым мышам.
Суммарную дозу 30 мкг плазмид pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS, содержащую различные варианты кассеты экспрессии на основе идуронат-2-сульфатазы, вводили 2-месячным мышам WT при помощи гидродинамической инъекции в хвостовую вену. Эта методика целенаправленно воздействует на экспрессию доставленной плазмиды в печень. См. Liu et ai, Gene Ther. 1990; 6(7): 1258-66.
Через сорок восемь часов после доставки плазмид значительное повышение по отношению к исходным уровням активности идуронат-2-сульфатазы отмечали в печени и сыворотке всех животных, которым вводили кодирующие идуронат-2-сульфатазу плазмиды. В печени и сыворотке уровни активности, достигнутые при применении кассет экспрессии, содержащих оптимизированные варианты гена идуронат-2-сульфатазы, были выше полученных в случае гена дикого типа. Кроме того, животные, которые получали плазмиду варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS, характеризовались уровнями активности идуронат-2-сульфатазы в сыворотке, которые были статистически выше, чем описанные в случае других 2 плазмид. См. фиг. 5А и 5В.
Пример 10. Гидродинамическая инъекция pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 2 pAAV-CAG-ohIDS мышам с MPSII.
Суммарную дозу 30 мкг плазмид pAAV-CAG-hIDS, варианта 1 pAAV-CAG-ohIDS и варианта 3 pAAV-CAG-ohIDS, содержащую различные варианты кассеты экспрессии на основе идуронат-2-сульфатазы, вводили 2-месячным мышам, пораженным MPSII, при помощи гидродинамической инъекции в хвостовую вену.
Ткани собирали на анализ через 1 неделю после доставки плазмид. Все три содержащие идуронат-2-сульфатазу плазмиды, опосредовали значительное повышение активности идуронат-2-сульфатазы по отношению к животным с MPSII, которые получали инъекцию солевого раствора; активности варьировали от 1200% до 2200% от уровней WT в печени и от 2000% до 5700% от уровней WT в сыворотке. Уровни активности, достигнутые при применении кассет экспрессии, содержащих кодон-оптимизированные варианты гена идуронат-2-сульфатазы, были статистически выше опосредованных плазмидой, содержащей ген дикого типа. См. фиг. 6А и 6В.
Находясь в соответствии с высокими уровнями активности идуронат-2-сульфатазы, описанными в печени и сыворотке, содержание GAG полностью нормализовалось во всех анализируемых тканях со всеми плазмидными конструкциями. См. фиг. 6С.
Пример 11. Внутривенная доставка AAV9-CAG-MDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII
Мыши с MPSII (в возрасте 3,5 месяцев) получали внутривенную инъекцию в хвостовую вену 1×1010 vg векторов на основе AAV9, содержащих последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы дикого типа или оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы. Отдельные когорты сопоставимых по возрасту мышей WT и не подвергшихся обработке мышей с MPSII выступали в качестве контроля. Через три недели после лечения животных выводили из эксперимента и собирали и анализировали образцы крови и печени.
Внутривенное введение векторов на основе AAV9 в дозе 1×1010 vg/мышь целенаправленно воздействует на экспрессию трансгенов главным образом в печени. См. Wu et al., Mol. Ther. 2006; 14(3):316-27, Inagaki et al., Mol. Ther. 2006; 14(1):45-33. При измерении активности идуронат-2-сульфатазы в экстрактах печени через 3 недели после доставки векторов отчетливое повышение активности ферментов описывали у самцов с MPSII, которые получали любой из кодирующих человеческую IDS векторов. См. фиг. 7А. Однако повышение было значимо более высоким в случае животных с MPSII, которые получали векторы на основе AAV9, содержащие оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS). Уровни активности идуронат-2-сульфатазы, достигаемые у животных, которые получали векторы с последовательностью дикого типа, были примерно в два раза выше наблюдаемых у здоровых животных WT. См. фиг. 7А. В случае векторов, которые содержат оптимизированные последовательности человеческой IDS, уровни активности идуронат-2-сульфатазы были в несколько раз выше наблюдаемых у здоровых животных или у животных с MPSII, подвергшихся обработке векторов, содержащих последовательность IDS дикого типа. См. фиг. 7А.
Идуронат-2-сульфатаза представляет собой секретируемый лизосомальный фермент и поэтому его синтез в печени представляет собой источник циркулирующего фермента. См. Haurigot et al., выше. Аналогично наблюдениям, полученным в случае экстрактов печени, уровни активности идуронат-2-сульфатазы в крови животных с MPSII, подвергшихся обработке векторов на основе AAV9, содержащих оптимизированные последовательности человеческой IDS, были в несколько раз выше, чем наблюдаемые у здоровых животных, или у животных с MPSII, подвергшихся обработке векторов, содержащих последовательность человеческой IDS дикого типа. См. фиг. 7В.
Находясь в соответствии с высокими уровнями активности идуронат-2-сульфатазы, описанной в печени и сыворотке, содержание GAG полностью нормализовалось в печени мышей с MPSII, подвергшихся обработке вариантом 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариантом 2 AAV9-CAG-ohIDS. Однако уровни GAG лишь частично снижали в печени животных, подвергшихся обработке равной дозы векторов на основе AAV9, несущих кодирующую последовательность IDS дикого типа. См. фиг. 1С.
Пример 12. Интрацистернальная доставка AAV9-CAG-hIDS, варианта 1 AAV9-CAG-ohIDS и варианта 2 AAV9-CAG-ohIDS мышам с MPSII
Двухмесячные мыши с MPSII получали интрацистернальную инъекцию 5×1010 vg векторов на основе AAV9, содержащих последовательность человеческой идуронат-2-сульфатазы дикого типа или оптимизированную последовательность человеческой идуронат-2-сульфатазы в общем объеме 5 мкл. Отдельные когорты сопоставимых по возрасту мышей WT, не подвергшихся обработке мышей с MPSII и мышей с MPSII, получающих 5×1010 vg некодирующего вектора (AAV9-CAG-Null) выступали в качестве контроля. В возрасте 3,5 месяцев, т.е. через 1,5 месяца после лечения, животных выводили из эксперимента и собирали и анализировали образцы.
При измерении активности идуронат-2-сульфатазы в экстрактах головного мозга отчетливое повышение активности ферментов описывали у самцов с MPSII, которые получали любой из кодирующих человеческую IDS векторов. См. фиг. 8А. Однако повышение было в несколько раз выше в случае животных с MPSII, которые получали векторы на основе AAV9, содержащие оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS), чем у животных с MPSII, подвергшихся обработке векторами, содержащими последовательность IDS дикого типа. См. фиг. 8А. Уровни активности идуронат-2-сульфатазы у животных, которые получали векторы с оптимизированными последовательностями человеческой идуронат-2-сульфатазы, были почти такими же высокими, как таковые в случае WT или даже выше; в наиболее ростральной области головного мозга (отдел I) активность IDS, полученная в результате обработки векторами, содержащими оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы почти вдвое превышала уровни в случае WT. См. фиг. 8А.
Находясь в соответствии с повышением активности IDS в головном мозге, накопление субстрата, который характеризует заболевание, корректировалось в головном мозге подвергшихся обработке мышей с MPSII, о чем свидетельствовало значимое снижение содержания GAG. См. фиг. 8В. Полную нормализацию уровней GAG наблюдали в случае всех конструкций во всех анализируемых областях, за исключением отдела V, в котором эффект синтеза IDS, полученной из векторов, содержащих кодирующие IDS последовательности дикого типа, не был очевидным. См. фиг. 8В.
Векторы на основе AAV9, вводимые в CSF, распространяются к периферии и трансдуцируют печень. См. Haurigot et al., Clin Invest. 2013; 123(8):3254-3271, Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014; 24(7):2078-2095. Соответственно, повышение активности идуронат-2-сульфатазы описывали в печени и сыворотке мышей с MPSII, подвергшихся обработке любым из кодирующих человеческую IDS векторов. См. фиг. 9А и 9В. Снова повышение было значительно выше в случае животных с MPSII, которые получали векторы на основе AAV9, содержащие оптимизированные последовательности человеческой идуронат-2-сульфатазы (вариант 1 AAV9-CAG-ohIDS и вариант 2 AAV9-CAG-ohIDS), чем у животных с MPSII, подвергшихся обработке векторами, содержащими последовательность IDS дикого типа. См. фиг. 9А и 9В. При оценке эффективности терапии при помощи количественного определения содержания GAG в различных органах тела полную нормализацию уровней GAG наблюдали во всех тканях мышей с MPSII, подвергшихся обработке любым из кодирующих оптимизированную человеческую IDS векторов. См. фиг. 9С. Однако мыши с MPSII, которые получали последовательность человеческой IDS дикого типа, характеризовались полной нормализацией содержания GAG в печени, сердце, легких и селезенке, но лишь частичной коррекцией в семенниках, почках, мочевом пузыре и жировой ткани. См. фиг. 9С.
Пример 13. Интрацистернальная доставка AAV9-CAG-omIDS
Суммарную дозу 5×1010 векторных геномов вектора на основе AAV9-CAG-omIDS вводили в большую цистерну 2-месячных животных с MPSII в суммарном объеме 5 мкл. Вначале мыши анализировали в возрасте 6 месяцев, т.е. через 4 после введения векторов. Доставка в CSF векторов на основе AAV9-CAG-omIDS приводила к восстановлению активности идуронат-2-сульфатазы во всех областях головного мозга, достигая уровней, которые составляли в среднем 40% от наблюдаемых у здоровых животных в различных областях. См. фиг. 10А. Через четыре месяца после доставки векторов накопление субстрата, характерное для заболевания, полностью нормализовалось в головном мозге подвергнутых обработке мышей с MPSII, о чем свидетельствовала нормализация содержания GAG во всех анализируемых областях головного мозга. См. фиг. 10В. Аналогично, размер лизосомального компартмента полностью нормализовался, о чем свидетельствовало количественное определение интенсивности сигнала в случае иммунного выявления лизосомального маркера LAMP2. Сигнал от LAMP2 пропорционален размеру лизосомального компартмента, который, в свою очередь, зависит от количества накопленного нерасщепленного гепаран- и дерматансульфата. См. фиг. 11А. Кроме того, эффект лечения на расширение лизосом оставался стабильным через 8 месяцев после доставки AAV9-CAG-omIDS, указывая на длительную эффективность терапии. См. фиг. 12.
Нарушение нормального гомеостаза лизосом в результате накопления нерасщепленного субстрата может изменять активность других лизосомальных ферментов, отличных от того, который непосредственно нарушается в результате мутации. См. Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014; doi: 10.1093/hmg/ddu727. В мозге не подвергшихся обработке мышей с MPSII или мышей с MPSII, подвергшихся обработке контрольным вектором «Null», активности IDUA (идуронидазы, альфа-L-), SGSH (N-сульфоглюкозаминсульфогидролазы), NAGLU (N-ацетилглюкозаминидазы, альфа), HGSNAT (гепаран-альфа-глюкозаминид-N-ацетилтрансферазы), GALNS (галактозамин-(N-ацетил)-6-сульфатазы), GUSB (глюкуронидазы, бета), НЕХВ (гексозаминидазы В) были изменены, однако обработка AAV9-CAG-omIDS возвращала эти активности к уровням, наблюдаемым у здоровых животных WT, указывая на то, что вектор был способен восстанавливать гомеостаз лизосом. См. фиг. 11В.
Находясь в соответствии с коррекцией лизосомальной патологии, все признаки воспаления исчезали из головного мозга подвергшихся обработке мышей с MPSII. Через четыре месяца после лечения интенсивности сигналов в случае окрашивания, используемые для выявления астроцитоза (GFAP) и микроглиоза (BSI-B4), были подобными у подвергшихся обработке мышей с MPSII и у здоровых животных в различных областях головного мозга, в отличие от сигнала, описанного у мышей с MPSII, которым вводили контрольный вектор на основе AAV9 «Null», что показывало отчетливое повышение активации этих маркеров нейровоспаления. См. фиг. 13А и 13В. Кроме того, в возрасте 10 месяцев, т.е. через 8 месяцев после переноса генов, благоприятное влияние обработки AAV9-CAG-omIDS на нейровоспаление, оцениваемое при помощи окрашивания GFAP и BSI-B4, сохранялось, указывая на длительное устранение нейровоспаления. См. фиг. 14А и 14В.
Векторы на основе AAV9, вводимые в CSF, распространяются к периферии и трансдуцируют печень. См. Haurigot et al., Clin Invest. 2013; 123(8):3254-3271, Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014; doi: 10.1093/hmg/ddu727. Соответственно, повышение активности идуронат-2-сульфатазы описывали через 4 месяца после переноса генов в печени и сыворотке мышей с MPSII, подвергшихся обработке AAV9-CAG-omIDS, достигая уровней примерно 1700% и 700% от уровней, наблюдаемых у здоровых животных, соответственно. См. фиг. 15А и 15В. При оценке соматической эффективности терапии при помощи количественного определения содержания GAG в различных органах, полную нормализацию наблюдали в большинстве тканей, в том числе печени, сердце, легких, семенниках, селезенке и жировой ткани, за исключением почек и мочевого пузыря, в которых наблюдали >50% снижение GAG. См. фиг. 15С.
Через четыре месяца после лечения активность также повышалась в легких и была особенно высокой в сердце. См. фиг. 16А и 16В. Эти два органа, легкие и сердце, характеризовались очень низкими значениями числа копий векторных геномов/диплоидный геном, указывая на отсутствие эффективной трансдукции этих органов после доставки в CSF AAV9-CAG-omIDS в дозе 5×1010 vg. См. фиг. 16С. Этот результат свидетельствовал о перекрестной коррекции недостаточности IDS при помощи захвата IDS из кровотока.
Находясь в соответствии с данными о содержании GAG, вес печени нормализовался у 6-месячных мышей с MPSII, подвергшихся обработке AAV9-CAG-omIDS в возрасте 2 месяцев. См. фиг. 17А. Дополнительную демонстрацию возможности обработки AAV9-CAG-omIDS в CSF для противодействия лизосомальной патологии у мышей с MPSII, представляли при помощи измерения активности других лизосомальных ферментов в экстрактах печени. IDUA, SGSH, NAGLU, HGSNAT, GALNS, GUSB, НЕХВ были значительно изменены по отношению к уровням WT у не подвергшихся обработке мышей с MPSII или мышей с MPSII, подвергшихся обработке контрольным вектором «Null». Обработка AAV9-CAG-omIDS полностью нормализовала активности всех этих ферментов. См. фиг. 17В. Кроме того, активность НЕХВ также повышается как следствие лизосомальной патологии, и она полностью нормализовалась после обработки AAV9-CAG-omIDS. См. фиг. 17С, представляющую доказательство коррекции функционирования лизосом во всем организме.
Влияние введения в CSF AAV9-CAG-omIDS на поведение определяли в возрасте 6 месяцев при помощи теста открытого поля, который оценивает общую двигательную и исследовательскую активность мышей в неизвестной среде. Не подвергшиеся обработке и подвергшиеся обработке AAV9-null мыши с MPSII проявляли сниженную исследовательскую активность по сравнению с мышами с точки зрения времени, проведенного в центре и на периферии, числа вхождений в центр и на периферию и общего числа быстрых передвижений. Интрацистернальное введение AAV9-CAG-omIDS полностью корректировало поведенческие нарушения у мышей с MPSII. См. фиг. 18A-F.
В конечном итого, терапевтическую эффективность обработки в CSF AAV9-CAG-omIDS оценивали при сравнении выживания не подвергшихся обработке и подвергшихся обработке мышей с MPSII. Генная терапия на основе AAV9-CAG-omIDS значительно увеличивала продолжительно жизни мышей с MPSII. См. фиг. 19. Если в возрасте 17 месяцев все не подвергшиеся обработке или подвергшиеся обработке AAV9-CAG-Null мыши с MPSII погибали, 76% мышей с MPSII, получавших AAV9-CAG-omIDS, были живы. Кроме того, 65% не подвергшихся обработке животных по-прежнему были живы в возрасте 22 месяцев. % животных дикого типа, живых в этом возрасте, составил 79%. См. фиг. 19.
Пример 14. Интрацистернальная доставка различных доз AAV9-CAG-omIDS: исследование «доза-эффект»
Четыре различных дозы (1,58×109, 5×109, 1,58×1010 и 5×1010 vg/мышь) векторов на основе AAV9-CAG-omIDS вводили 2-месячным животным с MPSII при помощи интрацистернальной инъекции в суммарном объеме 5 мкл.
Через полтора месяца после введения векторов животных выводили из эксперимента и ткани собирали на анализ, активность идуронат-2-сульфатазы измеряли в различных областях головного мозга (отделы I-V). Активность повышалась в зависимости от дозы и находилась в диапазоне от 0,8 до 53% от активности WT в различных областях. См. фиг. 20А. Аналогичную зависимость «доза-эффект» наблюдали при анализе влияния лечения на накопление GAG. Однако полную коррекцию накопления GAG описывали только при двух максимальных дозах 1,58×1010 и 5×1010 vg/мышь. См. фиг. 20В.
В печени и сыворотке активность также повышалась в зависимости от дозы, находясь в диапазоне от 20% до 4300% в печени и от 0,4% до 1100% в сыворотке. Активность IDS не выявляли в сыворотке в случае 2 минимальных доз (1,58×109, 5×109 vg/мышь). См. фиг. 21А и 21В. Находясь в соответствии с данными об активности, измерение содержания GAG в периферических тканях характеризовалось снижением зависимости «доза-эффект» в случае содержания GAG в печени, сердце, легких, семенниках, селезенке, почках, мочевом пузыре и жировой ткани. Полное или почти полную нормализацию уровней GAG достигали почти во всех тканях в случае 2 максимальных доз (1,58×1010 и 5×1010 vg/мышь), за исключением легких и мочевого пузыря, в которых описывали >70% снижения, и почек, в которых наблюдали примерно 50% снижение. См. фиг. 21С.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Laboratorios del Dr. ESTEVE S. A.
Universitat Autтnoma de Barcelona
<120> ADENOASSOCIATED VIRUS VECTORS FOR THE TREATMENT OF
MUCOPOLYSACCHARIDOSES
<130> PCT2212.6
<150> EP15382297
<151> 2015-06-05
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 550
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser
20 25 30
Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg
35 40 45
Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile
50 55 60
Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln
65 70 75 80
Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His
100 105 110
Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr
115 120 125
Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn
130 135 140
His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro
145 150 155 160
Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly
165 170 175
Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro
180 185 190
Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu
195 200 205
Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly
210 215 220
Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys
225 230 235 240
Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro
245 250 255
Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln
260 265 270
Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile
275 280 285
Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val
290 295 300
Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp
305 310 315 320
Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly
325 330 335
Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp
340 345 350
Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala
355 360 365
Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe
370 375 380
Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu
385 390 395 400
Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu
405 410 415
Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys
420 425 430
Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu
435 440 445
Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser
450 455 460
Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro
465 470 475 480
Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp
485 490 495
Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala
500 505 510
Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp
515 520 525
Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu
530 535 540
Phe Gln Leu Leu Met Pro
545 550
<210> 2
<211> 1653
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60
tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120
ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180
tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240
caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300
cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360
cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420
atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480
tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540
aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600
agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660
ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720
ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780
cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840
atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900
tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960
cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020
gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080
ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140
ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200
gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260
cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320
cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380
attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440
agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500
gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560
gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620
ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga 1653
<210> 3
<211> 7900
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV-CAG-hIDS
<400> 3
aaatacgcgt atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct 60
gagctccgtc tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct 120
gaacgttctt ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa 180
gctggtgagg tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc 240
ctttgcgcag caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc 300
tgacaccacc cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc 360
caccatcccc cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt 420
tcaccctggg atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc 480
ttatcatcct tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga 540
actccatgcc aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc 600
tgacaaacag agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag 660
tcctttcttc ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga 720
atttcagaag ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga 780
tggcctaccc cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca 840
agccttaaac atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg 900
ccagagctac tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc 960
tttggacgat cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg 1020
ggctctaggt gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt 1080
tcccctgata ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct 1140
tttcccttac ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc 1200
catggacctt gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca 1260
ggttccacct cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa 1320
ccttctgaag cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc 1380
ccgtgaactg attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc 1440
tgacaagccg agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta 1500
taggtatact gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat 1560
ccatgcaggg gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa 1620
tgattcccaa ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tgagaattca tttaattcga 1680
gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg 1740
ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 1800
attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 1860
ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga 1920
gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc 1980
atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat atgaaacagc 2040
cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag atttttttta 2100
tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta catgttttac 2160
tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct cttctcttat 2220
ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 2280
ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 2340
tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcatt 2400
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 2460
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2520
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2580
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2640
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2700
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2760
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2820
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2880
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2940
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 3000
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 3060
acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 3120
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 3180
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 3240
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 3300
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 3360
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 3420
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 3480
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 3540
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 3600
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 3660
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 3720
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 3780
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 3840
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 3900
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 3960
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 4020
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 4080
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 4140
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 4200
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 4260
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 4320
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 4380
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 4440
cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 4500
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 4560
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 4620
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 4680
tcaggcgatt ccaacatcca ataaatcata caggcaaggc aaagaattag caaaattaag 4740
caataaagcc tcagagcata aagctaaatc ggttgtacca aaaacattat gaccctgtaa 4800
tacttttgcg ggagaagcct ttatttcaac gcaaggataa aaatttttag aaccctcata 4860
tattttaaat gcaatgcctg agtaatgtgt aggtaaagat tcaaacgggt gagaaaggcc 4920
ggagacagtc aaatcaccat caatatgata ttcaaccgtt ctagctgata aattcatgcc 4980
ggagagggta gctatttttg agaggtctct acaaaggcta tcaggtcatt gcctgagagt 5040
ctggagcaaa caagagaatc gatgaacggt aatcgtaaaa ctagcatgtc aatcatatgt 5100
accccggttg ataatcagaa aagccccaaa aacaggaaga ttgtataagc aaatatttaa 5160
attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 5220
tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 5280
gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 5340
gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 5400
tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 5460
cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 5520
aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 5580
cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtactatg gttgctttga cgagcacgta 5640
taacgtgctt tcctcgttag aatcagagcg ggagctaaac aggaggccga ttaaagggat 5700
tttagacagg aacggtacgc cagaatcctg agaagtgttt ttataatcag tgaggccacc 5760
gagtaaaaga gtctgtccat cacgcaaatt aaccgttgtc gcaatacttc tttgattagt 5820
aataacatca cttgcctgag tagaagaact caaactatcg gccttgctgg taatatccag 5880
aacaatatta ccgccagcca ttgcaacgga atcgccattc gccattcagg ctgcgcaact 5940
gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctgcgc gctcgctcgc 6000
tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 6060
tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tccttgtagt 6120
taatgattaa cccgccatgc tacttatcta ctcgacattg attattgact agttattaat 6180
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 6240
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 6300
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 6360
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 6420
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 6480
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg 6540
tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt 6600
atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg 6660
cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg 6720
cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc 6780
ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct tcgccccgtg 6840
ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca 6900
caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga 6960
cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga gggccctttg 7020
tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc 7080
ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc 7140
cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc 7200
gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc 7260
gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg 7320
gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg 7380
tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg 7440
gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat 7500
tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg 7560
gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc 7620
ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc 7680
cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg 7740
ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat 7800
gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 7860
catcattttg gcaaagaatt gattaattcg agcgaacgcg 7900
<210> 4
<211> 4319
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV9-CAG-hIDS
<400> 4
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgaaat acgcgtatgc cgccaccccg gaccggccga ggccttctct ggctgggtct 1980
ggttctgagc tccgtctgcg tcgccctcgg atccgaaacg caggccaact cgaccacaga 2040
tgctctgaac gttcttctca tcatcgtgga tgacctgcgc ccctccctgg gctgttatgg 2100
ggataagctg gtgaggtccc caaatattga ccaactggca tcccacagcc tcctcttcca 2160
gaatgccttt gcgcagcaag cagtgtgcgc cccgagccgc gtttctttcc tcactggcag 2220
gagacctgac accacccgcc tgtacgactt caactcctac tggagggtgc acgctggaaa 2280
cttctccacc atcccccagt acttcaagga gaatggctat gtgaccatgt cggtgggaaa 2340
agtctttcac cctgggatat cttctaacca taccgatgat tctccgtata gctggtcttt 2400
tccaccttat catccttcct ctgagaagta tgaaaacact aagacatgtc gagggccaga 2460
tggagaactc catgccaacc tgctttgccc tgtggatgtg ctggatgttc ccgagggcac 2520
cttgcctgac aaacagagca ctgagcaagc catacagttg ttggaaaaga tgaaaacgtc 2580
agccagtcct ttcttcctgg ccgttgggta tcataagcca cacatcccct tcagataccc 2640
caaggaattt cagaagttgt atcccttgga gaacatcacc ctggcccccg atcccgaggt 2700
ccctgatggc ctaccccctg tggcctacaa cccctggatg gacatcaggc aacgggaaga 2760
cgtccaagcc ttaaacatca gtgtgccgta tggtccaatt cctgtggact ttcagcggaa 2820
aatccgccag agctactttg cctctgtgtc atatttggat acacaggtcg gccgcctctt 2880
gagtgctttg gacgatcttc agctggccaa cagcaccatc attgcattta cctcggatca 2940
tgggtgggct ctaggtgaac atggagaatg ggccaaatac agcaattttg atgttgctac 3000
ccatgttccc ctgatattct atgttcctgg aaggacggct tcacttccgg aggcaggcga 3060
gaagcttttc ccttacctcg acccttttga ttccgcctca cagttgatgg agccaggcag 3120
gcaatccatg gaccttgtgg aacttgtgtc tctttttccc acgctggctg gacttgcagg 3180
actgcaggtt ccacctcgct gccccgttcc ttcatttcac gttgagctgt gcagagaagg 3240
caagaacctt ctgaagcatt ttcgattccg tgacttggaa gaggatccgt acctccctgg 3300
taatccccgt gaactgattg cctatagcca gtatccccgg ccttcagaca tccctcagtg 3360
gaattctgac aagccgagtt taaaagatat aaagatcatg ggctattcca tacgcaccat 3420
agactatagg tatactgtgt gggttggctt caatcctgat gaatttctag ctaacttttc 3480
tgacatccat gcaggggaac tgtattttgt ggattctgac ccattgcagg atcacaatat 3540
gtataatgat tcccaaggtg gagatctttt ccagttgttg atgccttgag aattcattta 3600
attcgagctc ggtacccggg aatcaattca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg 3660
tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg 3720
ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga 3780
aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat 3840
atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat 3900
atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga 3960
aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt 4020
tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg 4080
ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc 4140
tcttatggag atccctcgac ctgcagccca agctgtagat aagtagcatg gcgggttaat 4200
cattaactac aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc 4260
gctcactgag gccgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcag 4319
<210> 5
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ohIDS-version1
<400> 5
atgcccccac ctagaaccgg aagaggattg ctctggctcg gacttgtgct gtccagcgtg 60
tgtgtggccc tgggctcgga aacccaggcc aacagcacca ccgacgccct gaatgtgctg 120
ctgattatcg tggacgatct ccggccttcg ctgggctgct acggggataa gctggtccgc 180
tccccgaata tcgaccaact ggcttcacat agcctgcttt tccaaaacgc attcgcccaa 240
caagccgtgt gcgccccgag ccgcgtgtct ttcctcaccg gccggcgccc tgatactacc 300
cggctctacg acttcaacag ctactggaga gtgcacgcag gaaacttctc caccattcct 360
cagtacttta aggagaacgg ttacgtcacc atgagcgtgg ggaaggtgtt ccaccctgga 420
atttcctcca accacaccga cgactcgcca tactcctggt cctttccccc ttaccaccca 480
tcatccgaga agtacgagaa caccaagacg tgcaggggcc cagacgggga actgcacgcg 540
aacctcctct gcccggtcga tgtgctggat gtgcccgaag gcaccctccc tgacaaacag 600
agcaccgaac aggccatcca gctcctcgag aagatgaaaa cttcagcctc cccgttcttt 660
ctggccgtgg gataccacaa gccgcatatc cccttccggt acccaaagga gttccagaag 720
ctgtacccgc tggagaacat taccctggct cctgatcccg aagtgccgga cggcctgccg 780
cccgtggcat acaacccttg gatggacatc cgccagaggg aggatgtgca agccctgaac 840
atctccgtgc catacggtcc gatcccggtc gacttccagc ggaagattag gcagtcatat 900
ttcgcgtccg tgtcctactt ggacactcag gtcggacgcc tcctctccgc tctcgacgat 960
ctgcagctgg ccaactcgac cattatcgcg ttcacctcgg accatggttg ggctctgggc 1020
gaacacggag aatgggccaa gtacagcaat ttcgatgtcg cgactcacgt gcccctgatc 1080
ttctacgtgc ccggacgcac agccagcttg cctgaagcgg gggaaaagct gttcccttac 1140
ctggatccct tcgactccgc ctctcaactt atggagccag gcagacagtc gatggacctg 1200
gtggaactcg tgtcactgtt ccctaccctc gccggtctgg ccggacttca ggtcccgcct 1260
cggtgcccgg tgccgtcctt ccacgtggag ctgtgtcgcg agggaaagaa cctcctgaaa 1320
cacttccggt tccgcgacct ggaggaagat ccctacttgc cgggcaaccc gagagaactt 1380
atcgcatact cccagtaccc tcgcccctcc gacatcccgc agtggaactc cgacaagccg 1440
agcctgaagg acattaagat catggggtac tccatccgga ctattgacta tcggtacact 1500
gtgtgggtcg ggttcaaccc agatgagttt ctggccaact tctccgatat ccatgccgga 1560
gagctgtact tcgtggactc ggacccgctg caggaccaca acatgtacaa cgactcacag 1620
ggcggcgacc tgttccagtt gctgatgccc tga 1653
<210> 6
<211> 7888
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV-CAG-ohIDS-version1
<400> 6
cgcgtgccac catgccccca cctagaaccg gaagaggatt gctctggctc ggacttgtgc 60
tgtccagcgt gtgtgtggcc ctgggctcgg aaacccaggc caacagcacc accgacgccc 120
tgaatgtgct gctgattatc gtggacgatc tccggccttc gctgggctgc tacggggata 180
agctggtccg ctccccgaat atcgaccaac tggcttcaca tagcctgctt ttccaaaacg 240
cattcgccca acaagccgtg tgcgccccga gccgcgtgtc tttcctcacc ggccggcgcc 300
ctgatactac ccggctctac gacttcaaca gctactggag agtgcacgca ggaaacttct 360
ccaccattcc tcagtacttt aaggagaacg gttacgtcac catgagcgtg gggaaggtgt 420
tccaccctgg aatttcctcc aaccacaccg acgactcgcc atactcctgg tcctttcccc 480
cttaccaccc atcatccgag aagtacgaga acaccaagac gtgcaggggc ccagacgggg 540
aactgcacgc gaacctcctc tgcccggtcg atgtgctgga tgtgcccgaa ggcaccctcc 600
ctgacaaaca gagcaccgaa caggccatcc agctcctcga gaagatgaaa acttcagcct 660
ccccgttctt tctggccgtg ggataccaca agccgcatat ccccttccgg tacccaaagg 720
agttccagaa gctgtacccg ctggagaaca ttaccctggc tcctgatccc gaagtgccgg 780
acggcctgcc gcccgtggca tacaaccctt ggatggacat ccgccagagg gaggatgtgc 840
aagccctgaa catctccgtg ccatacggtc cgatcccggt cgacttccag cggaagatta 900
ggcagtcata tttcgcgtcc gtgtcctact tggacactca ggtcggacgc ctcctctccg 960
ctctcgacga tctgcagctg gccaactcga ccattatcgc gttcacctcg gaccatggtt 1020
gggctctggg cgaacacgga gaatgggcca agtacagcaa tttcgatgtc gcgactcacg 1080
tgcccctgat cttctacgtg cccggacgca cagccagctt gcctgaagcg ggggaaaagc 1140
tgttccctta cctggatccc ttcgactccg cctctcaact tatggagcca ggcagacagt 1200
cgatggacct ggtggaactc gtgtcactgt tccctaccct cgccggtctg gccggacttc 1260
aggtcccgcc tcggtgcccg gtgccgtcct tccacgtgga gctgtgtcgc gagggaaaga 1320
acctcctgaa acacttccgg ttccgcgacc tggaggaaga tccctacttg ccgggcaacc 1380
cgagagaact tatcgcatac tcccagtacc ctcgcccctc cgacatcccg cagtggaact 1440
ccgacaagcc gagcctgaag gacattaaga tcatggggta ctccatccgg actattgact 1500
atcggtacac tgtgtgggtc gggttcaacc cagatgagtt tctggccaac ttctccgata 1560
tccatgccgg agagctgtac ttcgtggact cggacccgct gcaggaccac aacatgtaca 1620
acgactcaca gggcggcgac ctgttccagt tgctgatgcc ctgagaattc gagctcggta 1680
cccgggaatc aattcactcc tcaggtgcag gctgcctatc agaaggtggt ggctggtgtg 1740
gccaatgccc tggctcacaa ataccactga gatctttttc cctctgccaa aaattatggg 1800
gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt 1860
gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa ggacatatgg gagggcaaat 1920
catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg caacatatgc ccatatgctg 1980
gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct 2040
gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt agattttttt tatattttgt 2100
tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct tacatgtttt actagccaga 2160
tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt atggagatcc 2220
ctcgacctgc agcccaagct gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg 2280
aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 2340
cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgca ttaatgaatc 2400
ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 2460
gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 2520
atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 2580
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 2640
cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2700
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2760
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 2820
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 2880
gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 2940
ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 3000
aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 3060
agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 3120
agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 3180
cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 3240
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 3300
atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 3360
gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 3420
tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 3480
gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 3540
ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 3600
actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 3660
ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 3720
tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 3780
cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 3840
ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 3900
ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 3960
tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 4020
agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 4080
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 4140
gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 4200
aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 4260
tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 4320
aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 4380
gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 4440
ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 4500
acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 4560
gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 4620
caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcga 4680
ttccaacatc caataaatca tacaggcaag gcaaagaatt agcaaaatta agcaataaag 4740
cctcagagca taaagctaaa tcggttgtac caaaaacatt atgaccctgt aatacttttg 4800
cgggagaagc ctttatttca acgcaaggat aaaaattttt agaaccctca tatattttaa 4860
atgcaatgcc tgagtaatgt gtaggtaaag attcaaacgg gtgagaaagg ccggagacag 4920
tcaaatcacc atcaatatga tattcaaccg ttctagctga taaattcatg ccggagaggg 4980
tagctatttt tgagaggtct ctacaaaggc tatcaggtca ttgcctgaga gtctggagca 5040
aacaagagaa tcgatgaacg gtaatcgtaa aactagcatg tcaatcatat gtaccccggt 5100
tgataatcag aaaagcccca aaaacaggaa gattgtataa gcaaatattt aaattgtaag 5160
cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca 5220
ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag 5280
tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg 5340
gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt 5400
tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag 5460
agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc 5520
gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc 5580
gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtacta tggttgcttt gacgagcacg tataacgtgc 5640
tttcctcgtt agaatcagag cgggagctaa acaggaggcc gattaaaggg attttagaca 5700
ggaacggtac gccagaatcc tgagaagtgt ttttataatc agtgaggcca ccgagtaaaa 5760
gagtctgtcc atcacgcaaa ttaaccgttg tcgcaatact tctttgatta gtaataacat 5820
cacttgcctg agtagaagaa ctcaaactat cggccttgct ggtaatatcc agaacaatat 5880
taccgccagc cattgcaacg gaatcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 5940
gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgc gcgctcgctc gctcactgag 6000
gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag 6060
cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg gttccttgta gttaatgatt 6120
aacccgccat gctacttatc tactcgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 6180
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 6240
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 6300
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 6360
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 6420
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 6480
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc 6540
acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 6600
attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc 6660
ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat 6720
cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat 6780
aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgttgc cttcgccccg tgccccgctc 6840
cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag 6900
cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt 6960
ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg 7020
gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc 7080
gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt 7140
gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa 7200
caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt 7260
cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 7320
tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 7380
ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 7440
cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 7500
atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 7560
atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 7620
caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 7680
tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 7740
ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 7800
cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 7860
tggcaaagaa ttgattaatt cgagcgaa 7888
<210> 7
<211> 4307
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV9-CAG-ohIDS-version1
<400> 7
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgcc accatgcccc cacctagaac cggaagagga ttgctctggc tcggacttgt 1980
gctgtccagc gtgtgtgtgg ccctgggctc ggaaacccag gccaacagca ccaccgacgc 2040
cctgaatgtg ctgctgatta tcgtggacga tctccggcct tcgctgggct gctacgggga 2100
taagctggtc cgctccccga atatcgacca actggcttca catagcctgc ttttccaaaa 2160
cgcattcgcc caacaagccg tgtgcgcccc gagccgcgtg tctttcctca ccggccggcg 2220
ccctgatact acccggctct acgacttcaa cagctactgg agagtgcacg caggaaactt 2280
ctccaccatt cctcagtact ttaaggagaa cggttacgtc accatgagcg tggggaaggt 2340
gttccaccct ggaatttcct ccaaccacac cgacgactcg ccatactcct ggtcctttcc 2400
cccttaccac ccatcatccg agaagtacga gaacaccaag acgtgcaggg gcccagacgg 2460
ggaactgcac gcgaacctcc tctgcccggt cgatgtgctg gatgtgcccg aaggcaccct 2520
ccctgacaaa cagagcaccg aacaggccat ccagctcctc gagaagatga aaacttcagc 2580
ctccccgttc tttctggccg tgggatacca caagccgcat atccccttcc ggtacccaaa 2640
ggagttccag aagctgtacc cgctggagaa cattaccctg gctcctgatc ccgaagtgcc 2700
ggacggcctg ccgcccgtgg catacaaccc ttggatggac atccgccaga gggaggatgt 2760
gcaagccctg aacatctccg tgccatacgg tccgatcccg gtcgacttcc agcggaagat 2820
taggcagtca tatttcgcgt ccgtgtccta cttggacact caggtcggac gcctcctctc 2880
cgctctcgac gatctgcagc tggccaactc gaccattatc gcgttcacct cggaccatgg 2940
ttgggctctg ggcgaacacg gagaatgggc caagtacagc aatttcgatg tcgcgactca 3000
cgtgcccctg atcttctacg tgcccggacg cacagccagc ttgcctgaag cgggggaaaa 3060
gctgttccct tacctggatc ccttcgactc cgcctctcaa cttatggagc caggcagaca 3120
gtcgatggac ctggtggaac tcgtgtcact gttccctacc ctcgccggtc tggccggact 3180
tcaggtcccg cctcggtgcc cggtgccgtc cttccacgtg gagctgtgtc gcgagggaaa 3240
gaacctcctg aaacacttcc ggttccgcga cctggaggaa gatccctact tgccgggcaa 3300
cccgagagaa cttatcgcat actcccagta ccctcgcccc tccgacatcc cgcagtggaa 3360
ctccgacaag ccgagcctga aggacattaa gatcatgggg tactccatcc ggactattga 3420
ctatcggtac actgtgtggg tcgggttcaa cccagatgag tttctggcca acttctccga 3480
tatccatgcc ggagagctgt acttcgtgga ctcggacccg ctgcaggacc acaacatgta 3540
caacgactca cagggcggcg acctgttcca gttgctgatg ccctgagaat tcgagctcgg 3600
tacccgggaa tcaattcact cctcaggtgc aggctgccta tcagaaggtg gtggctggtg 3660
tggccaatgc cctggctcac aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg 3720
gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca 3780
ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa 3840
atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc 3900
tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 3960
ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 4020
gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca 4080
gatttttcct cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat 4140
ccctcgacct gcagcccaag ctgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa 4200
ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 4260
cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcag 4307
<210> 8
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ohIDS-version2
<400> 8
atgcctcctc ctagaactgg aagggggctg ctgtggctgg ggctggtcct gtcatcagtg 60
tgtgtcgctc tgggctccga gactcaggca aactccacca cagacgccct gaatgtgctg 120
ctgatcattg tcgacgatct gcgaccttcc ctggggtgct acggcgacaa gctggtgagg 180
tctccaaaca tcgatcagct ggcttcacac agcctgctgt tccagaatgc ctttgctcag 240
caggcagtgt gtgcaccatc acgggtcagc ttcctgaccg gaaggagacc tgacactacc 300
aggctgtacg attttaactc atattggaga gtgcatgccg ggaatttcag caccatccca 360
cagtacttta aggagaacgg ctatgtgaca atgtccgtgg gaaaagtctt ccaccccggc 420
attagctcca atcatacaga cgattctcca tactcctggt cttttccccc ttatcacccc 480
tctagtgaga agtacgaaaa cacaaaaact tgcaggggac cagacgggga gctgcatgca 540
aatctgctgt gtcccgtgga cgtcctggat gtgcccgaag gcacactgcc tgataagcag 600
agcactgagc aggccattca gctgctggaa aagatgaaaa caagtgcttc acccttcttt 660
ctggcagtgg gatatcacaa accacatatc cccttcagat atcccaagga gtttcagaaa 720
ctgtaccctc tggaaaacat tactctggct cccgaccctg aggtgcctga tggactgcca 780
cccgtcgcat ataacccatg gatggacatc cggcagcgcg aggatgtgca ggccctgaat 840
atcagtgtcc cttacgggcc aattcccgtg gacttccaga gaaagattcg gcagtcttac 900
tttgccagcg tctcctatct ggatactcaa gtgggacgac tgctgagcgc tctggacgat 960
ctgcagctgg ccaacagcac catcattgct ttcacatccg accacggatg ggctctggga 1020
gagcatggag aatgggcaaa gtatagcaat ttcgatgtgg ccactcacgt cccactgatc 1080
ttttacgtgc ccggccgaac cgcatccctg ccagaggctg gagaaaaact gttcccttac 1140
ctggacccat ttgattctgc tagtcagctg atggagcctg gccgacagtc tatggacctg 1200
gtggaactgg tcagtctgtt ccctacactg gctggactgg caggactgca ggtgcctcca 1260
agatgccctg tgccatcttt tcacgtcgag ctgtgtcggg aaggcaagaa cctgctgaaa 1320
catttcaggt tcagggacct ggaggaagat ccttatctgc caggaaatcc cagggagctg 1380
atcgcctaca gtcagtatcc ccgcccttca gacattcctc agtggaactc cgacaagcca 1440
tctctgaagg atatcaaaat tatgggatac agcatccgca ctattgatta ccgatatacc 1500
gtgtgggtcg ggttcaaccc cgacgagttc ctggcaaatt ttagtgatat ccacgccggc 1560
gaactgtatt ttgtggactc agatcctctg caggaccata acatgtacaa tgacagccag 1620
ggcggagatc tgttccagct gctgatgcca tga 1653
<210> 9
<211> 7888
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV-CAG-ohIDS-version2
<400> 9
cgcgtgccac catgcctcct cctagaactg gaagggggct gctgtggctg gggctggtcc 60
tgtcatcagt gtgtgtcgct ctgggctccg agactcaggc aaactccacc acagacgccc 120
tgaatgtgct gctgatcatt gtcgacgatc tgcgaccttc cctggggtgc tacggcgaca 180
agctggtgag gtctccaaac atcgatcagc tggcttcaca cagcctgctg ttccagaatg 240
cctttgctca gcaggcagtg tgtgcaccat cacgggtcag cttcctgacc ggaaggagac 300
ctgacactac caggctgtac gattttaact catattggag agtgcatgcc gggaatttca 360
gcaccatccc acagtacttt aaggagaacg gctatgtgac aatgtccgtg ggaaaagtct 420
tccaccccgg cattagctcc aatcatacag acgattctcc atactcctgg tcttttcccc 480
cttatcaccc ctctagtgag aagtacgaaa acacaaaaac ttgcagggga ccagacgggg 540
agctgcatgc aaatctgctg tgtcccgtgg acgtcctgga tgtgcccgaa ggcacactgc 600
ctgataagca gagcactgag caggccattc agctgctgga aaagatgaaa acaagtgctt 660
cacccttctt tctggcagtg ggatatcaca aaccacatat ccccttcaga tatcccaagg 720
agtttcagaa actgtaccct ctggaaaaca ttactctggc tcccgaccct gaggtgcctg 780
atggactgcc acccgtcgca tataacccat ggatggacat ccggcagcgc gaggatgtgc 840
aggccctgaa tatcagtgtc ccttacgggc caattcccgt ggacttccag agaaagattc 900
ggcagtctta ctttgccagc gtctcctatc tggatactca agtgggacga ctgctgagcg 960
ctctggacga tctgcagctg gccaacagca ccatcattgc tttcacatcc gaccacggat 1020
gggctctggg agagcatgga gaatgggcaa agtatagcaa tttcgatgtg gccactcacg 1080
tcccactgat cttttacgtg cccggccgaa ccgcatccct gccagaggct ggagaaaaac 1140
tgttccctta cctggaccca tttgattctg ctagtcagct gatggagcct ggccgacagt 1200
ctatggacct ggtggaactg gtcagtctgt tccctacact ggctggactg gcaggactgc 1260
aggtgcctcc aagatgccct gtgccatctt ttcacgtcga gctgtgtcgg gaaggcaaga 1320
acctgctgaa acatttcagg ttcagggacc tggaggaaga tccttatctg ccaggaaatc 1380
ccagggagct gatcgcctac agtcagtatc cccgcccttc agacattcct cagtggaact 1440
ccgacaagcc atctctgaag gatatcaaaa ttatgggata cagcatccgc actattgatt 1500
accgatatac cgtgtgggtc gggttcaacc ccgacgagtt cctggcaaat tttagtgata 1560
tccacgccgg cgaactgtat tttgtggact cagatcctct gcaggaccat aacatgtaca 1620
atgacagcca gggcggagat ctgttccagc tgctgatgcc atgagaattc gagctcggta 1680
cccgggaatc aattcactcc tcaggtgcag gctgcctatc agaaggtggt ggctggtgtg 1740
gccaatgccc tggctcacaa ataccactga gatctttttc cctctgccaa aaattatggg 1800
gacatcatga agccccttga gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt 1860
gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcactcggaa ggacatatgg gagggcaaat 1920
catttaaaac atcagaatga gtatttggtt tagagtttgg caacatatgc ccatatgctg 1980
gctgccatga acaaaggttg gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct 2040
gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt agattttttt tatattttgt 2100
tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct tacatgtttt actagccaga 2160
tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt atggagatcc 2220
ctcgacctgc agcccaagct gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg 2280
aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 2340
cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgca ttaatgaatc 2400
ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 2460
gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 2520
atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 2580
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 2640
cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2700
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2760
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 2820
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 2880
gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 2940
ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 3000
aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 3060
agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 3120
agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 3180
cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 3240
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 3300
atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 3360
gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 3420
tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 3480
gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 3540
ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 3600
actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 3660
ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 3720
tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 3780
cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 3840
ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 3900
ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 3960
tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 4020
agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 4080
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 4140
gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 4200
aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 4260
tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 4320
aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 4380
gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 4440
ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 4500
acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 4560
gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 4620
caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcga 4680
ttccaacatc caataaatca tacaggcaag gcaaagaatt agcaaaatta agcaataaag 4740
cctcagagca taaagctaaa tcggttgtac caaaaacatt atgaccctgt aatacttttg 4800
cgggagaagc ctttatttca acgcaaggat aaaaattttt agaaccctca tatattttaa 4860
atgcaatgcc tgagtaatgt gtaggtaaag attcaaacgg gtgagaaagg ccggagacag 4920
tcaaatcacc atcaatatga tattcaaccg ttctagctga taaattcatg ccggagaggg 4980
tagctatttt tgagaggtct ctacaaaggc tatcaggtca ttgcctgaga gtctggagca 5040
aacaagagaa tcgatgaacg gtaatcgtaa aactagcatg tcaatcatat gtaccccggt 5100
tgataatcag aaaagcccca aaaacaggaa gattgtataa gcaaatattt aaattgtaag 5160
cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca 5220
ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag 5280
tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg 5340
gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt 5400
tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag 5460
agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc 5520
gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc 5580
gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtacta tggttgcttt gacgagcacg tataacgtgc 5640
tttcctcgtt agaatcagag cgggagctaa acaggaggcc gattaaaggg attttagaca 5700
ggaacggtac gccagaatcc tgagaagtgt ttttataatc agtgaggcca ccgagtaaaa 5760
gagtctgtcc atcacgcaaa ttaaccgttg tcgcaatact tctttgatta gtaataacat 5820
cacttgcctg agtagaagaa ctcaaactat cggccttgct ggtaatatcc agaacaatat 5880
taccgccagc cattgcaacg gaatcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 5940
gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgc gcgctcgctc gctcactgag 6000
gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtgagcgag 6060
cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg gttccttgta gttaatgatt 6120
aacccgccat gctacttatc tactcgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 6180
attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 6240
aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 6300
gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 6360
taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 6420
gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 6480
cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc 6540
acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 6600
attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc 6660
ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat 6720
cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat 6780
aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgttgc cttcgccccg tgccccgctc 6840
cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag 6900
cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt 6960
ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg 7020
gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc 7080
gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt 7140
gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa 7200
caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt 7260
cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 7320
tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 7380
ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 7440
cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 7500
atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 7560
atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 7620
caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 7680
tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 7740
ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 7800
cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 7860
tggcaaagaa ttgattaatt cgagcgaa 7888
<210> 10
<211> 4307
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV9-CAG-ohIDS-version2
<400> 10
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgcc accatgcctc ctcctagaac tggaaggggg ctgctgtggc tggggctggt 1980
cctgtcatca gtgtgtgtcg ctctgggctc cgagactcag gcaaactcca ccacagacgc 2040
cctgaatgtg ctgctgatca ttgtcgacga tctgcgacct tccctggggt gctacggcga 2100
caagctggtg aggtctccaa acatcgatca gctggcttca cacagcctgc tgttccagaa 2160
tgcctttgct cagcaggcag tgtgtgcacc atcacgggtc agcttcctga ccggaaggag 2220
acctgacact accaggctgt acgattttaa ctcatattgg agagtgcatg ccgggaattt 2280
cagcaccatc ccacagtact ttaaggagaa cggctatgtg acaatgtccg tgggaaaagt 2340
cttccacccc ggcattagct ccaatcatac agacgattct ccatactcct ggtcttttcc 2400
cccttatcac ccctctagtg agaagtacga aaacacaaaa acttgcaggg gaccagacgg 2460
ggagctgcat gcaaatctgc tgtgtcccgt ggacgtcctg gatgtgcccg aaggcacact 2520
gcctgataag cagagcactg agcaggccat tcagctgctg gaaaagatga aaacaagtgc 2580
ttcacccttc tttctggcag tgggatatca caaaccacat atccccttca gatatcccaa 2640
ggagtttcag aaactgtacc ctctggaaaa cattactctg gctcccgacc ctgaggtgcc 2700
tgatggactg ccacccgtcg catataaccc atggatggac atccggcagc gcgaggatgt 2760
gcaggccctg aatatcagtg tcccttacgg gccaattccc gtggacttcc agagaaagat 2820
tcggcagtct tactttgcca gcgtctccta tctggatact caagtgggac gactgctgag 2880
cgctctggac gatctgcagc tggccaacag caccatcatt gctttcacat ccgaccacgg 2940
atgggctctg ggagagcatg gagaatgggc aaagtatagc aatttcgatg tggccactca 3000
cgtcccactg atcttttacg tgcccggccg aaccgcatcc ctgccagagg ctggagaaaa 3060
actgttccct tacctggacc catttgattc tgctagtcag ctgatggagc ctggccgaca 3120
gtctatggac ctggtggaac tggtcagtct gttccctaca ctggctggac tggcaggact 3180
gcaggtgcct ccaagatgcc ctgtgccatc ttttcacgtc gagctgtgtc gggaaggcaa 3240
gaacctgctg aaacatttca ggttcaggga cctggaggaa gatccttatc tgccaggaaa 3300
tcccagggag ctgatcgcct acagtcagta tccccgccct tcagacattc ctcagtggaa 3360
ctccgacaag ccatctctga aggatatcaa aattatggga tacagcatcc gcactattga 3420
ttaccgatat accgtgtggg tcgggttcaa ccccgacgag ttcctggcaa attttagtga 3480
tatccacgcc ggcgaactgt attttgtgga ctcagatcct ctgcaggacc ataacatgta 3540
caatgacagc cagggcggag atctgttcca gctgctgatg ccatgagaat tcgagctcgg 3600
tacccgggaa tcaattcact cctcaggtgc aggctgccta tcagaaggtg gtggctggtg 3660
tggccaatgc cctggctcac aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg 3720
gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca 3780
ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa 3840
atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc 3900
tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 3960
ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 4020
gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca 4080
gatttttcct cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat 4140
ccctcgacct gcagcccaag ctgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa 4200
ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 4260
cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcag 4307
<210> 11
<211> 1665
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> omIDS
<400> 11
atgagcccac ctcccccacc cccaatctgg cggcagctga gcttcagcct gctgctgggc 60
agcttctgta tcgccctgga aagcgccaag cttgcccagg gcaacagcgc caccgacgcc 120
ctgaacatcc tgctgatcat cgtggacgac ctgaggccca gcctgggatg ctacggcgac 180
aagctggtcc gcagccccaa catcgaccag ctggcttctc acagcgtgct gttccagaac 240
gcattcgcac agcaggccgt gtgcgccccc agcagagtgt ctttcctgac cggcagaagg 300
cccgacacca ccagactgta cgacttcaac agctactggc gggtgcacag cggcaacttc 360
agcaccatcc cccagtactt caaagaaaac ggctacgtga ccatgagcgt gggcaaggtg 420
ttccaccccg gcatcagcag caaccacagc gacgactacc cctacagctg gtccttccca 480
ccctaccacc ccagcagcga gaagtacgag aacaccaaga cctgcaaggg ccaggacggc 540
aagctgcacg ccaacctgct gtgccctgtg gacgtggcag acgtgccaga gggaaccctg 600
cctgacaagc agagcaccga ggaagccatc agactgctgg aaaagatgaa gaccagcgcc 660
agccccttct tcctggccgt gggctaccac aagccccaca tccctttcag ataccccaaa 720
gagttccaga agctgtaccc cctggaaaac atcaccctgg cccccgaccc ccacgtgcca 780
gattctctgc cccccgtggc ctacaacccc tggatggata tccgcgagcg cgaggacgtg 840
caggctctga acatcagcgt gccctacggc cctatccccg aggacttcca gagaaagatc 900
agacagagct acttcgccag cgtgtcctac ctggacaccc aagtgggaca cgtgctgagc 960
gccctggacg atctgagact ggcccacaac accatcattg ccttcaccag cgaccacggc 1020
tgggctctgg gagagcacgg cgagtgggcc aagtacagca acttcgacgt ggccaccaga 1080
gtgcccctga tgctgtacgt gcccggcaga accgcccctc tgcctgccgc tggacagaag 1140
ctgttccctt accgggaccc cttcgacccc gccagcgatt ggatggacgc cggcagacac 1200
accgaggacc tggtggaact ggtgtccctg ttccccaccc tggccggact ggctggactg 1260
cctgtgcccc ccagatgccc catccctagc ttccacgtcg aactgtgcag agagggccag 1320
aacctgcaga aacatctgca gctgcacgac ctggaagagg aacccgacct gttcggcaac 1380
cccagagagc tgatcgccta cagccagtac cccagacccg ccgacttccc ccagtggaac 1440
agcgacaagc ccagcctgaa cgacatcaaa gtgatgggct acagcatcag gaccgtggac 1500
tacagataca ccgtgtgggt cggattcgac cccagcgagt tcctggccaa cttcagcgac 1560
atccacgccg gcgagctgta cttcgtggac agcgaccccc tgcaggacca caacgtgtac 1620
aacgacagcc agcacggcgg cctgctgcac agcctgaggc cttga 1665
<210> 12
<211> 7914
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAAV-CAG-omIDS
<400> 12
cgcgtgctag cgccaccatg agcccacctc ccccaccccc aatctggcgg cagctgagct 60
tcagcctgct gctgggcagc ttctgtatcg ccctggaaag cgccaagctt gcccagggca 120
acagcgccac cgacgccctg aacatcctgc tgatcatcgt ggacgacctg aggcccagcc 180
tgggatgcta cggcgacaag ctggtccgca gccccaacat cgaccagctg gcttctcaca 240
gcgtgctgtt ccagaacgca ttcgcacagc aggccgtgtg cgcccccagc agagtgtctt 300
tcctgaccgg cagaaggccc gacaccacca gactgtacga cttcaacagc tactggcggg 360
tgcacagcgg caacttcagc accatccccc agtacttcaa agaaaacggc tacgtgacca 420
tgagcgtggg caaggtgttc caccccggca tcagcagcaa ccacagcgac gactacccct 480
acagctggtc cttcccaccc taccacccca gcagcgagaa gtacgagaac accaagacct 540
gcaagggcca ggacggcaag ctgcacgcca acctgctgtg ccctgtggac gtggcagacg 600
tgccagaggg aaccctgcct gacaagcaga gcaccgagga agccatcaga ctgctggaaa 660
agatgaagac cagcgccagc cccttcttcc tggccgtggg ctaccacaag ccccacatcc 720
ctttcagata ccccaaagag ttccagaagc tgtaccccct ggaaaacatc accctggccc 780
ccgaccccca cgtgccagat tctctgcccc ccgtggccta caacccctgg atggatatcc 840
gcgagcgcga ggacgtgcag gctctgaaca tcagcgtgcc ctacggccct atccccgagg 900
acttccagag aaagatcaga cagagctact tcgccagcgt gtcctacctg gacacccaag 960
tgggacacgt gctgagcgcc ctggacgatc tgagactggc ccacaacacc atcattgcct 1020
tcaccagcga ccacggctgg gctctgggag agcacggcga gtgggccaag tacagcaact 1080
tcgacgtggc caccagagtg cccctgatgc tgtacgtgcc cggcagaacc gcccctctgc 1140
ctgccgctgg acagaagctg ttcccttacc gggacccctt cgaccccgcc agcgattgga 1200
tggacgccgg cagacacacc gaggacctgg tggaactggt gtccctgttc cccaccctgg 1260
ccggactggc tggactgcct gtgcccccca gatgccccat ccctagcttc cacgtcgaac 1320
tgtgcagaga gggccagaac ctgcagaaac atctgcagct gcacgacctg gaagaggaac 1380
ccgacctgtt cggcaacccc agagagctga tcgcctacag ccagtacccc agacccgccg 1440
acttccccca gtggaacagc gacaagccca gcctgaacga catcaaagtg atgggctaca 1500
gcatcaggac cgtggactac agatacaccg tgtgggtcgg attcgacccc agcgagttcc 1560
tggccaactt cagcgacatc cacgccggcg agctgtactt cgtggacagc gaccccctgc 1620
aggaccacaa cgtgtacaac gacagccagc acggcggcct gctgcacagc ctgaggcctt 1680
gagcggccgc gaattcgagc tcggtacccg ggaatcaatt cactcctcag gtgcaggctg 1740
cctatcagaa ggtggtggct ggtgtggcca atgccctggc tcacaaatac cactgagatc 1800
tttttccctc tgccaaaaat tatggggaca tcatgaagcc ccttgagcat ctgacttctg 1860
gctaataaag gaaatttatt ttcattgcaa tagtgtgttg gaattttttg tgtctctcac 1920
tcggaaggac atatgggagg gcaaatcatt taaaacatca gaatgagtat ttggtttaga 1980
gtttggcaac atatgcccat atgctggctg ccatgaacaa aggttggcta taaagaggtc 2040
atcagtatat gaaacagccc cctgctgtcc attccttatt ccatagaaaa gccttgactt 2100
gaggttagat tttttttata ttttgttttg tgttattttt ttctttaaca tccctaaaat 2160
tttccttaca tgttttacta gccagatttt tcctcctctc ctgactactc ccagtcatag 2220
ctgtccctct tctcttatgg agatccctcg acctgcagcc caagctgtag ataagtagca 2280
tggcgggtta atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct 2340
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2400
cgagcgcgca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 2460
ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 2520
cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 2580
gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 2640
tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 2700
agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 2760
tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 2820
cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 2880
ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 2940
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 3000
ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 3060
ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 3120
cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 3180
gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 3240
atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 3300
ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 3360
gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 3420
tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 3480
ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 3540
taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 3600
gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 3660
gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 3720
ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 3780
aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 3840
gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 3900
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 3960
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4020
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4080
gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4140
ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 4200
caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 4260
tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 4320
gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 4380
cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 4440
ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 4500
gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 4560
aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg 4620
catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 4680
taaggagaaa ataccgcatc aggcgattcc aacatccaat aaatcataca ggcaaggcaa 4740
agaattagca aaattaagca ataaagcctc agagcataaa gctaaatcgg ttgtaccaaa 4800
aacattatga ccctgtaata cttttgcggg agaagccttt atttcaacgc aaggataaaa 4860
atttttagaa ccctcatata ttttaaatgc aatgcctgag taatgtgtag gtaaagattc 4920
aaacgggtga gaaaggccgg agacagtcaa atcaccatca atatgatatt caaccgttct 4980
agctgataaa ttcatgccgg agagggtagc tatttttgag aggtctctac aaaggctatc 5040
aggtcattgc ctgagagtct ggagcaaaca agagaatcga tgaacggtaa tcgtaaaact 5100
agcatgtcaa tcatatgtac cccggttgat aatcagaaaa gccccaaaaa caggaagatt 5160
gtataagcaa atatttaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt 5220
tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca 5280
aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta 5340
aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta 5400
cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg 5460
aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga 5520
aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg 5580
ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtactatggt 5640
tgctttgacg agcacgtata acgtgctttc ctcgttagaa tcagagcggg agctaaacag 5700
gaggccgatt aaagggattt tagacaggaa cggtacgcca gaatcctgag aagtgttttt 5760
ataatcagtg aggccaccga gtaaaagagt ctgtccatca cgcaaattaa ccgttgtcgc 5820
aatacttctt tgattagtaa taacatcact tgcctgagta gaagaactca aactatcggc 5880
cttgctggta atatccagaa caatattacc gccagccatt gcaacggaat cgccattcgc 5940
cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 6000
agctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct 6060
ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca 6120
ctaggggttc cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta cttatctact cgacattgat 6180
tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 6240
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 6300
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 6360
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 6420
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 6480
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 6540
ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 6600
ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 6660
gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 6720
ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 6780
cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 6840
cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 6900
ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 6960
tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 7020
ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc 7080
gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc 7140
gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg 7200
cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg 7260
tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc ccctccccga 7320
gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc 7380
gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg 7440
gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc 7500
gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct 7560
ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg 7620
cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg 7680
tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc 7740
tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct 7800
agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg 7860
ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattga ttaattcgag cgaa 7914
<210> 13
<211> 4333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV9-CAG-omIDS
<400> 13
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgct agcgccacca tgagcccacc tcccccaccc ccaatctggc ggcagctgag 1980
cttcagcctg ctgctgggca gcttctgtat cgccctggaa agcgccaagc ttgcccaggg 2040
caacagcgcc accgacgccc tgaacatcct gctgatcatc gtggacgacc tgaggcccag 2100
cctgggatgc tacggcgaca agctggtccg cagccccaac atcgaccagc tggcttctca 2160
cagcgtgctg ttccagaacg cattcgcaca gcaggccgtg tgcgccccca gcagagtgtc 2220
tttcctgacc ggcagaaggc ccgacaccac cagactgtac gacttcaaca gctactggcg 2280
ggtgcacagc ggcaacttca gcaccatccc ccagtacttc aaagaaaacg gctacgtgac 2340
catgagcgtg ggcaaggtgt tccaccccgg catcagcagc aaccacagcg acgactaccc 2400
ctacagctgg tccttcccac cctaccaccc cagcagcgag aagtacgaga acaccaagac 2460
ctgcaagggc caggacggca agctgcacgc caacctgctg tgccctgtgg acgtggcaga 2520
cgtgccagag ggaaccctgc ctgacaagca gagcaccgag gaagccatca gactgctgga 2580
aaagatgaag accagcgcca gccccttctt cctggccgtg ggctaccaca agccccacat 2640
ccctttcaga taccccaaag agttccagaa gctgtacccc ctggaaaaca tcaccctggc 2700
ccccgacccc cacgtgccag attctctgcc ccccgtggcc tacaacccct ggatggatat 2760
ccgcgagcgc gaggacgtgc aggctctgaa catcagcgtg ccctacggcc ctatccccga 2820
ggacttccag agaaagatca gacagagcta cttcgccagc gtgtcctacc tggacaccca 2880
agtgggacac gtgctgagcg ccctggacga tctgagactg gcccacaaca ccatcattgc 2940
cttcaccagc gaccacggct gggctctggg agagcacggc gagtgggcca agtacagcaa 3000
cttcgacgtg gccaccagag tgcccctgat gctgtacgtg cccggcagaa ccgcccctct 3060
gcctgccgct ggacagaagc tgttccctta ccgggacccc ttcgaccccg ccagcgattg 3120
gatggacgcc ggcagacaca ccgaggacct ggtggaactg gtgtccctgt tccccaccct 3180
ggccggactg gctggactgc ctgtgccccc cagatgcccc atccctagct tccacgtcga 3240
actgtgcaga gagggccaga acctgcagaa acatctgcag ctgcacgacc tggaagagga 3300
acccgacctg ttcggcaacc ccagagagct gatcgcctac agccagtacc ccagacccgc 3360
cgacttcccc cagtggaaca gcgacaagcc cagcctgaac gacatcaaag tgatgggcta 3420
cagcatcagg accgtggact acagatacac cgtgtgggtc ggattcgacc ccagcgagtt 3480
cctggccaac ttcagcgaca tccacgccgg cgagctgtac ttcgtggaca gcgaccccct 3540
gcaggaccac aacgtgtaca acgacagcca gcacggcggc ctgctgcaca gcctgaggcc 3600
ttgagcggcc gcgaattcga gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc 3660
tgcctatcag aaggtggtgg ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga 3720
tctttttccc tctgccaaaa attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc 3780
tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc 3840
actcggaagg acatatggga gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta 3900
gagtttggca acatatgccc atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg 3960
tcatcagtat atgaaacagc cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac 4020
ttgaggttag atttttttta tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa 4080
attttcctta catgttttac tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat 4140
agctgtccct cttctcttat ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag 4200
catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct 4260
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 4320
agcgagcgcg cag 4333
<210> 14
<211> 646
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAG promoter
<400> 14
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgg 646
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer
<400> 15
ttttgtgtac tccaaccccg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer
<400> 16
tgtctgcata acagcccagg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer Mutation
<400> 17
gccctcacat tgccaaagga 20
<---

Claims (19)

1. Выделенная нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазу (IDS), представленный в SEQ ID NO:1, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.
2. Плазмида, которая представляет собой вариант 1 pAAV-CAG-оhIDS с номером доступа DSM 29867, представленный в SEQ ID NO:6, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1, имеющую нуклеотидную последовательность варианта 1 оhIDS, представленного в SEQ ID NO:5, функционально связанная с ранним энхансерным элементом цитомегаловируса и промотором CAG β-актина цыпленка для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.
3. Плазмида, которая представляет собой вариант 2 pAAV-CAG-оhIDS с номером доступа DSM 29868, представленный в SEQ ID NO:9, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1, имеющую нуклеотидную последовательность варианта 2 оhIDS, представленного в SEQ ID NO:8, функционально связанная с ранним энхансерным элементом цитомегаловируса и промотором CAG β-актина цыпленка для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.
4. Рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса серотипа 9, вектор AAV9, содержащий нуклеиновую кислоту по п.1, для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.
5. Рекомбинантный вектор по п.4, который представляет собой вариант 1 AAV9-CAG-оhIDS, содержащий нуклеотидную последовательность варианта 1 оhIDS, представленный в SEQ ID NO:5, функционально связанный с ранним энхансерным элементом цитомегаловируса и промотором CAG β-актина цыпленка CAG с SEQ ID NO:14.
6. Рекомбинантный вектор по п.4, который представляет собой вариант 2 AAV9-CAG-оhIDS, содержащий нуклеотидную последовательность варианта 2 оhIDS, представленный в SEQ ID NO:8, функционально связанный с ранним энхансерным элементом цитомегаловируса и промотором CAG β-актина цыпленка CAG с SEQ ID NO:14.
7. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты по п.1, плазмиду по любому из пп.2-3 или рекомбинантный вектор по любому из пп.4-6, для применения в качестве лекарственного средства для лечения мукополисахаридоза II типа.
8. Фармацевтическая композиция по п.7 для внутривенного или интрацистернального введения.
9. Нуклеиновая кислота по п.1, плазмида по любому из пп.2-3 или рекомбинантный вектор по любому из пп.4-6 для лечения мукополисахаридоза II типа.
10. Нуклеиновая кислота по п.1, плазмида по любому из пп.2-3 или рекомбинантный вектор по любому из пп.4-6 для повышения активности идуронат-2-сульфатазы.
11. Способ получения векторов, определенных в любом из пп.4-6, предусматривающий стадии:
i) обеспечения первого вектора, содержащего нуклеотидную последовательность по п.1, выбранную из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, расположенную между первым концевым повтором AAV и вторым концевым повтором AAV, промотора CAG, функционально связанного с нуклеотидной последовательностью по п.1; второго вектора, содержащего rep-ген AAV и cap-ген AAV из серотипа 9; и третьего вектора, содержащего ген хелперного функционального элемента аденовируса;
ii) котрансфекции компетентных клеток векторами из стадии i);
iii) культивирования трансфицированных клеток стадии ii); и
iv) очистки векторов экспрессии от культуры из стадии iii).
12. Способ получения плазмиды по любому из пп.2-3, предусматривающий стадии:
i) эксцизии нуклеотидной последовательности по п.1 из исходной плазмиды, в результате переваривания при помощи Mlul/EcoRI,
ii) клонирования нуклеотидной последовательности по п.1, выбранную из SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8, между двумя сайтами рестрикции базовой плазмиды на основе AAV pAAV-CAG, тем самым получения соответствующей плазмиды, включающей нуклеотидную последовательность по п.1.
13. Выделенная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.1, для лечения мукополисахаридоза II типа.
RU2017142006A 2015-06-05 2016-06-03 Векторы на основе аденоассоциированных вирусов для лечения мукополисахаридозов RU2744593C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15382297.8A EP3101125A1 (en) 2015-06-05 2015-06-05 Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses
EP15382297.8 2015-06-05
PCT/EP2016/062655 WO2016193431A1 (en) 2015-06-05 2016-06-03 Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017142006A RU2017142006A (ru) 2019-07-09
RU2017142006A3 RU2017142006A3 (ru) 2020-02-03
RU2744593C2 true RU2744593C2 (ru) 2021-03-11

Family

ID=53398018

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017142006A RU2744593C2 (ru) 2015-06-05 2016-06-03 Векторы на основе аденоассоциированных вирусов для лечения мукополисахаридозов

Country Status (21)

Country Link
US (1) US10617771B2 (ru)
EP (2) EP3101125A1 (ru)
JP (1) JP6850736B2 (ru)
KR (1) KR102609858B1 (ru)
CN (1) CN108138154B (ru)
AU (1) AU2016273343B2 (ru)
BR (1) BR112017025892A2 (ru)
CA (1) CA2988201C (ru)
CL (1) CL2017003096A1 (ru)
CO (1) CO2017012562A2 (ru)
ES (1) ES2790834T3 (ru)
IL (1) IL255939B (ru)
MX (1) MX2017015725A (ru)
MY (1) MY184586A (ru)
PH (1) PH12017502192A1 (ru)
PT (1) PT3303576T (ru)
RU (1) RU2744593C2 (ru)
TN (1) TN2017000506A1 (ru)
UA (1) UA125373C2 (ru)
WO (1) WO2016193431A1 (ru)
ZA (1) ZA201708039B (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023022629A1 (ru) * 2021-08-18 2023-02-23 Акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" Направленная доставка терапевтических ферментов
RU2811100C1 (ru) * 2022-12-29 2024-01-11 Акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" Соединение, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9309534B2 (en) 2010-07-12 2016-04-12 Universidad Autonoma De Barcelona Gene therapy composition for use in diabetes treatment
EP2692868A1 (en) 2012-08-02 2014-02-05 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue
WO2016041588A1 (en) 2014-09-16 2016-03-24 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral vectors for the gene therapy of metabolic diseases
US11085055B2 (en) 2014-12-05 2021-08-10 Universitat Autonoma De Barcelona Viral vectors for the treatment of diabetes
EP3978614A3 (en) 2015-01-07 2022-07-27 Universitat Autònoma de Barcelona Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes
IL262211B2 (en) * 2016-04-15 2024-01-01 Univ Pennsylvania Gene therapy for the treatment of type II mucositis
AU2018253303A1 (en) 2017-04-14 2019-10-31 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis II with recombinant human iduronate-2 sulfatase (IDS) produced by human neural or glial cells
BR112020005249A2 (pt) 2017-09-22 2020-09-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania terapia de gene para tratar mucopolissacaridose tipo ii
CN108715867A (zh) * 2018-05-31 2018-10-30 深圳市免疫基因治疗研究院 一种Sanfilippo B综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
CN108795985A (zh) * 2018-05-31 2018-11-13 深圳市免疫基因治疗研究院 一种黏多糖贮积症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
SG11202100781VA (en) * 2018-07-27 2021-02-25 Regenxbio Inc Treatment of mucopolysaccharidosis iva
WO2020099548A1 (en) * 2018-11-15 2020-05-22 Esteve Pharmaceuticals, S.A. Animal model of mucopolysaccharidoses type iva
TW202039856A (zh) * 2019-03-28 2020-11-01 西班牙商艾斯提夫製藥股份有限公司 製造重組病毒載體之方法
EP4072595A1 (en) * 2019-12-10 2022-10-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adeno associated virus vectors for the treatment of hunter disease
CA3173207A1 (en) * 2020-04-06 2021-10-14 Jacinthe GINGRAS Adeno-associated virus compositions for ids gene transfer and methods of use thereof
CN111718947B (zh) * 2020-06-18 2022-08-23 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 用于治疗ⅲa或ⅲb型粘多糖贮积症的腺相关病毒载体及用途
CN114480454B (zh) * 2020-10-27 2024-03-29 华东理工大学 用于治疗粘多糖贮积症ⅱ型的腺相关病毒载体、药物及其应用
WO2022173605A2 (en) 2021-02-10 2022-08-18 Regenxbio Inc. Treatment of mucopolysaccharidosis ii with recombinant human iduronate-2-sulfatase (ids)
WO2022221421A2 (en) * 2021-04-13 2022-10-20 Capsida, Inc. Aav compositions with high brain expression for treating mucopolysaccharidosis ii

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040084881A (ko) * 2004-09-08 2004-10-06 진동규 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주
WO2011108451A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 日本ケミカルリサーチ株式会社 遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体リソソーム酵素の製造方法
RU2010134412A (ru) * 2008-01-18 2012-02-27 Байомарин Фармасьютикал Инк. (Us) Изготовление активных высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатаз человека и их применение
US20130236442A1 (en) * 2010-11-12 2013-09-12 Green Cross Corporation Iduronate-2-sulfatase and use thereof
WO2013151666A2 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US20140004593A1 (en) * 2012-06-29 2014-01-02 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2725200T3 (es) * 2009-10-09 2019-09-20 Armagen Inc Métodos y composiciones para aumentar la actividad de iduronato 2-sulfatasa en el SNC
EP2394667A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-14 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Vectors and sequences for the treatment of diseases
WO2012101671A1 (en) * 2011-01-25 2012-08-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase
EP3460064B8 (en) * 2011-04-03 2024-03-20 The General Hospital Corporation d/b/a Massachusetts General Hospital Efficient protein expression in vivo using modified rna (mod-rna)
WO2015126729A1 (en) * 2014-02-19 2015-08-27 Bioasis Technologies, Inc. P97-ids fusion proteins

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040084881A (ko) * 2004-09-08 2004-10-06 진동규 동물 세포주를 이용한 이듀로네이트-설파타제의 발현 방법및 그 발현을 위한 세포주
RU2010134412A (ru) * 2008-01-18 2012-02-27 Байомарин Фармасьютикал Инк. (Us) Изготовление активных высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатаз человека и их применение
WO2011108451A1 (ja) * 2010-03-01 2011-09-09 日本ケミカルリサーチ株式会社 遺伝子ノックアウト細胞を用いた組換え体リソソーム酵素の製造方法
US20130236442A1 (en) * 2010-11-12 2013-09-12 Green Cross Corporation Iduronate-2-sulfatase and use thereof
WO2013151666A2 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US20140004593A1 (en) * 2012-06-29 2014-01-02 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOSEF MUENZER, Improved brain expression of iduronate sulfatase in the MPS II mouse after intravenous delivery of a self-complimentary adeno-associated viral (AAV) vector, Molecular genetics and metabolism, vol. 108, no.2, 2013, р.163. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023022629A1 (ru) * 2021-08-18 2023-02-23 Акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" Направленная доставка терапевтических ферментов
RU2811100C1 (ru) * 2022-12-29 2024-01-11 Акционерное общество "ГЕНЕРИУМ" Соединение, содержащее терапевтический фермент и транспортный элемент, соединенные друг с другом непосредственно или при помощи линкера

Also Published As

Publication number Publication date
IL255939A (en) 2018-01-31
AU2016273343B2 (en) 2022-04-28
US10617771B2 (en) 2020-04-14
WO2016193431A1 (en) 2016-12-08
MX2017015725A (es) 2018-08-15
RU2017142006A (ru) 2019-07-09
ZA201708039B (en) 2018-11-28
PH12017502192A1 (en) 2018-06-11
EP3303576A1 (en) 2018-04-11
MY184586A (en) 2021-04-06
JP6850736B2 (ja) 2021-03-31
AU2016273343A1 (en) 2017-12-21
KR20180012843A (ko) 2018-02-06
US20180169272A1 (en) 2018-06-21
PT3303576T (pt) 2020-05-08
ES2790834T3 (es) 2020-10-29
CL2017003096A1 (es) 2018-08-10
BR112017025892A2 (pt) 2018-08-14
RU2017142006A3 (ru) 2020-02-03
EP3303576B1 (en) 2020-02-12
CA2988201C (en) 2024-01-16
CN108138154A (zh) 2018-06-08
IL255939B (en) 2021-05-31
KR102609858B1 (ko) 2023-12-05
CN108138154B (zh) 2022-01-18
EP3101125A1 (en) 2016-12-07
JP2018517414A (ja) 2018-07-05
CO2017012562A2 (es) 2018-02-28
TN2017000506A1 (en) 2019-04-12
CA2988201A1 (en) 2016-12-08
UA125373C2 (uk) 2022-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2744593C2 (ru) Векторы на основе аденоассоциированных вирусов для лечения мукополисахаридозов
AU2018229561B2 (en) Recombinant adenoviruses and use thereof
AU2020205228B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
CN108495685B (zh) 针对艰难梭菌感染的基于酵母的免疫疗法
KR20180107155A (ko) Cpf1 또는 csm1을 사용하여 게놈을 변형하기 위한 조성물 및 방법
KR101633477B1 (ko) 개선된 단백질 발현계
US20230149566A1 (en) Compositions and methods for treating macular dystrophy
CN114026115A (zh) 用于溶酶体病症的基因疗法
KR20220121844A (ko) 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법
CN112534047A (zh) 经修饰的t细胞及其用途
JP2002302449A (ja) 成長ホルモン及び成長ホルモン放出ホルモン組成物
AU2019445928B2 (en) Construction method for mutant GABRG2 transgenic zebrafish epilepsy model and applications
KR20220112283A (ko) Hunter 질환 치료용 아데노-연합된 바이러스 벡터
KR102341583B1 (ko) 스플릿 인테인을 접목한 가용성 향상 이중 기능성 융합 태그를 이용한 재조합 섬유아세포 성장인자 수용체의 제조방법, 정제방법, 및 이의 용도
RU2731513C2 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов NOS2, NOS3, VIP, KCNMA1, CGRP, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NOS2, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NOS3, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VIP, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-KCNMA1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CGRP, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
KR20230051529A (ko) 리소좀 장애에 대한 유전자 요법
CN110819657B (zh) 一种减毒棒状病毒的制备方法及应用
CA2318664A1 (en) Nucleotide expression systems with reduced immunogenicity for use in gene therapy
KR101557974B1 (ko) 혈청형６ 재조합 아데노바이러스 제조용 벡터
CN111304251A (zh) 一种斑马鱼难治性癫痫模型的构建方法及应用
KR20240024172A (ko) 유전자의 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
KR20230007808A (ko) 재배열 레오바이러스과 바이러스를 제조하는 방법 및 이를 위한 벡터 라이브러리