JP6850736B2 - ムコ多糖症治療用のアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents
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Description
プラスミドpAAV−CAG−hIDS(配列番号3)、pAAV‐CAG‐ohIDS−version1(配列番号6)、およびpAAV‐CAG‐ohIDS−version2(配列番号9)は、2014年12月18日、それぞれアクセス番号DSM29866、DSM29867、およびDSM29868として、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, ドイツ連邦共和国)に寄託された。
用語「ヌクレオチド配列」または「単離されたヌクレオチド配列」は、DNAまたはRNAのいずれかの核酸分子(それぞれ、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を含んでいる)を指す。上記核酸は、二本鎖配列であっても、一本鎖配列であっても、または二本もしくは一本鎖配列の両方の一部分が含まれていてもよい。
i)第1のプラスミドと、第2のベクターと、第3のベクターとを提供する工程であって、上記第1のプラスミドは、第1のAAV末端反復と第2のAAV末端反復のあいだに挟まれた、所定のタンパク質をコードする配列と、当該所定のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されているCAGプロモーターとを含み、上記第2のベクターは、AAV rep遺伝子とAAV cap遺伝子とを含み、上記第3のベクターは、アデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む、工程と、
ii)工程i)の上記ベクターでコンピテント細胞を同時トランスフェクトする工程と、
iii)工程ii)の上記トランスフェクトされた細胞を、ウイルス粒子を産生するのに十分なだけの時間、培養する工程と、
iv)工程iii)の培養液からベクターを精製する工程と、を含む。
i)所定のタンパク質をコードする配列を、出発プラスミドから、消化によって、特にMluI/EcoRIを用いて、切り取る工程と、
ii)当該所定のタンパク質をコードする配列を、AAV骨格プラスミドpAAV‐CAGの2つの制限部位のあいだにクローニングし、それによって、当該所定のタンパク質をコードする配列を含む対応するプラスミドを得る工程と、を含む、方法を提供する。
[1.組み換えAAVベクター]
本明細書において説明されているAAVベクターは、3重のトランスフェクションによって得た。上記ベクターを作製するために必要な材料は、HEK293細胞(アデノウイルスE1遺伝子を発現している)、アデノウイルス機能を与えるヘルパープラスミド、血清型2のAAV rep遺伝子および血清型9(AAV9)のcap遺伝子を与えるプラスミド、そして最後に、AAV2 ITRを有する骨格プラスミドおよび所定のコンストラクトである。
イズロン酸−2−スルファターゼ欠損マウス(MPSII)モデルは、Taconic (Germantown, NY 12526 USA, Stock TF1838)から購入した。MPSII罹患マウスおよび健康なコントロールマウスは、ヘミ接合のオスおよびヘテロ接合のメスのファウンダーから近親交配により誕生した。テール・クリップサンプルをPCR分析し、目的の変異を含んでいる配列を増幅して、遺伝子型を決定した。それぞれのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの配列は、以下の通りであった。フォワードプライマー:5’- TTT TGT GTA CTC CAA CCC CG -3’(配列番号15)、リバースプライマー:5’- TGT CTC CAT AAC AGC CCA GG -3’ (配列番号16)、変異型リバースプライマー:5’- GCC CTC ACA TTG CCA AAG GA -3’(配列番号17)。標準食(Harlan, Tekland)で行動制限を設けずにマウスを飼育し、明暗周期を12時間に保った(午前9時に点灯)。
pAAV−CAG−hIDSプラスミド、pAAV−CAG−ohIDS−version1プラスミドおよびpAAV−CAG−ohIDS−version2プラスミドの流体力学的送達のために、3月齢のMPSII動物および野生型動物の尾静脈に注射を行った。上記注射は、5秒未満の間に行われ、総投与量は、上記動物の体重の10%に相当する体積中に30μgのプラスミドであった。この技法により、プラスミドにコードされている導入遺伝子を、主として肝臓において発現させる(Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66を参照)。コントロールとして、マウスの一群に同量の生理食塩水を注射した。マウスを2つの群に分け、プラスミドの流体力学的注射から48時間後または1週間後に殺処分した。以下の項目で説明する通りに、臓器を摘出した。
AAV9−CAG−omIDSベクターをマウスへCSF内送達するために、2月齢のMPSII動物の大槽に、総投与量5×1010vgを注射した。5×1010vgのコードしていないコントロールベクター(AAV9−Null)を、同種の動物の一群に注射した。6月齢および10月齢の時点(すなわちベクターの投与から4ヶ月後および8ヶ月後)で、マウスに麻酔を施し、組織を摘出した。
殺処分に際し、動物に深く麻酔を施し、その後、心臓を経由して12mLのPBSを潅流させて、組織から血液を完全に除去した。全脳および複数の体性組織(肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、肺、心臓、骨格筋、精巣、膀胱、腸、および脂肪組織を含む)を収集し、次の組織学的分析のために、液体窒素中で凍結させ−80℃にて保存するか、ホルマリン中に浸漬した。
脳サンプル、肝臓サンプル、肺サンプル、および心臓サンプルを、Mili−Q水中で超音波処理した。血清を、未処理で分析した。上述した通りに、4−メチルウンベリフェロン由来の蛍光源基質(Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL)によって、イズロン酸−2−スルファターゼ活性を決定した(Voznyi et al., J Inher Metab Diss 2001;24:675-680を参照)。タンパク質の全量に対して脳、肝臓、肺、および心臓の活性レベルを正規化し、Bradford protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA, US)を用いて定量した。血清の活性を、体積に対して正規化した。
脳サンプルおよび肝臓サンプルを、500μlのMili−Q水中で超音波処理した。酵素活性は、上澄み中で、4−メチルウンベリフェロン由来の蛍光源基質を用いて決定した。血清を、未処理で分析した。4−メチルウンベリフェリル−α−L−イズロニド(Glycosynth)とともに、37℃にて1時間インキュベートしたタンパク質15μgにおける、IDUA活性を測定した(Bacter et al., Blood 2002;99(5)1857-9を参照)。上述した通りに、SGSH活性を測定した(Karpova et al., J Inherit Metab Dis. 1996;19(3):278-285, Haurigot et al.の上記箇所を参照)。簡潔に述べると、30μgのタンパク質を、第1に、4−MU−αGlcNSとともに17時間、47℃でインキュベートした。第2のインキュベーションは、0.2%BSA中の10U/mlのα−グルコシダーゼ(Sigma-Aldrich)の存在下、24時間、37℃で行った。NAGLU活性のため、30μgの組織タンパク質抽出物を、上記したように、4‐メチルウンベリフェリル−α−N−アセチル−D−グルコサミニド(Moscerdam Substrates)とともに、3時間、37℃で培養した(Marsh et al., Clin Genet. 1985;27(3):258-62, Ribera et al.の上記箇所を参照)。アセチル補酵素Aおよび4−メチルウンベリフェリルβ−D−グルコサミン(MU−βGlcNH2、Moscerdam Substrates)とともに17時間、37℃で培養したタンパク質抽出物30μgから、HGSNAT活性を決定した(Voznyi et al., J Inh Metab Dis 1993;16:465-72を参照)。GALNS活性を、2段階プロトコルによって評価した。第1の培養は、10μgのタンパク質抽出物および4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトピラノシド−6−硫酸ナトリウム塩(MU−βGal−6S)を用いて、17時間、37℃で行った。第2段階は、Pi−緩衝液(0.9M Na2HPO4/0.9M NaH2PO4緩衝液、pH4.3+0.02%(w/v)Naアジド)およびβ−ガラクトシダーゼ(β−Gal−Ao、シグマ)を添加して、混合物を2時間、37℃で培養して行った(van Diggelen et al., Clin Chim Acta 1990;187:131-40を参照)。4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロニド(シグマ)とともに37℃で1時間インキュベートしたタンパク質抽出物10μgからGUSB酵素の活性を決定した。0.1μgのタンパク質抽出物を4−メチルウンベリフェリルN−アセチル−β−D−グルコサミニド(シグマ)とともに1時間、37℃で培養し、HEXB活性を評価した。pHを上昇させて反応を止めたあと、FLx800蛍光光度計(BioTek Instruments)を用いて、放出された蛍光を測定した。全脳および肝臓活性レベルをタンパク質の総量に対して正規化し、Bradford protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA, US)を用いて定量した。
組織をホルマリン中で12〜24時間固定し、パラフィンに包埋し、切片を作製した。脳におけるLAMP2の免疫組織化学的検出のために、クエン酸緩衝液(pH6)中で、パラフィン切片を熱誘導エピトープ賦活化した。次いで、上記パラフィン切片を、1:500に希釈したラット抗LAMP2抗体(Ab13524; Abcam, Cambridge, UK)とともに、4℃にて一晩インキュベートした。続いて、上記パラフィン切片を、1:300に希釈したビオチン化ウサギ抗ラット抗体(Dako, Glostrup, DK)とともにインキュベートした。脳サンプルにおけるGFAPの免疫染色のために、パラフィン切片を、1:1000に希釈したウサギ抗GFAP抗体(Ab6673; Abcam, Cambridge, UK)とともに、4℃にて一晩インキュベートした。続いて、上記パラフィン切片を、1:300に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体(31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)とともにインキュベートした。切片を、1:100に希釈したABC-Peroxidase staining kit(Thermo Scientific, Waltham, MA, US)とともにインキュベートすることにより、LAMP2およびGFAPの信号を増幅し、色原体として3,3−ジアミノベンジジン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US)を用いて可視化した。
組織をプロテイナーゼK(0.2mg/ml)中で一晩消化したあと、全DNAをMasterPureDNA精製キット(Epicenter)で単離した。HBB2配列に特異的なプライマーおよびプローブ(ポリA切片に含有)を用いた定量PCRを用いて20ngの全DNA中のベクターゲノムコピー数を定量した。フォワードプライマーは5’-CTT GAG CAT CTG ACT TCT GGC TAA T-3’、リバースプライマーは5’-GAT TTG CCC TCC CAT ATG TCC-3’、プローブは5’-CCG AGT GAG AGA CAC AAA AAA TTC CAA CAC-3’である。ポリA配列を含む直線化プラスミドの連続希釈により構成された参照標準曲線を用いて、vg/サンプルの最終的な値を補間した。
6月齢のマウスの行動を、午前9時から午後1時まで行ったオープンフィールド試験によって分析した。動物を、明るく照らされた部屋(41×41×30cm)の左下の角に配置した。当該部屋は、マウスの水平方向および垂直方向の動きを検知する光ビーム(SedaCom32; Panlab)の2つの束によって横切られていた。表面を、同心状の3つの正方形へと分割した(中央部(14×14cm)、周辺部(27×27cm)および境界部(41×41cm))。試験の最初の3分間における探索行動および自発運動を、ビデオ追跡システム(Smart Junior, Panlab)を用いて記録した。
すべての結果を平均±標準誤差として表した。一元配置分散分析を用いて統計比較を行った。ダネットの事後検定を用いてコントロール群と処置群との間の多重比較を行い、チューキーの事後検定を用いてすべての群の間の多重比較を行う。P<0.05の場合、統計的有意であると見なした。生存の分析のためにカプラン・マイヤー曲線を用い、比較のためにログランク検定を用いた。
ヒトのイズロン酸−2−スルファターゼのCDSを出発材料(NCBIの参照配列:NM_000202.6)として利用し、本実施例の目的のために化学的に合成した(GenScript Inc)。プラスミドpUC57(AmpR)内で、上記CDSをクローニングした。上記CDSは、SwaIの制限部位によって挟まれていた。
ヒトイズロン酸−2−スルファターゼcDNA配列の最適化バージョン(ohIDS)を含んでいる発現カセットを設計して得た。配列の最適化を実行して、ヒトにおけるイズロン酸−2−スルファターゼタンパク質の産生効率を最大化した。上記最適化は、短いスプライス部位およびRNA非安定化配列要素の削除(RNAの安定性を上げるため)、RNA安定化配列要素の付加、コドンの最適化およびG/Cの含有量の適応、種々の変化のうちRNAの安定二次構造の変化の回避によって行った。ヒトイズロン酸−2−スルファターゼのCDS(NCBI参照配列:NM_000202.6)を配列最適化(DNA 2.0 Inc)の出発点として用いた。最適化したCDSを、プラスミドpJ204:191476(AmpR)内でクローニングした。上記CDSは、MluIおよびEcoRIの制限部位によって、5’および3’がそれぞれ挟まれていた。
ヒトイズロン酸−2−スルファターゼのCDS(NCBI参照配列:NM_000202.6)を配列最適化した(GeneScript Inc)。最適化したCDSを、プラスミドpUC57(AmpR)内でクローニングした。上記CDSは、MluIおよびEcoRIの制限部位によって、5’および3’がそれぞれ挟まれていた。
マウスのイズロン酸−2−スルファターゼのCDS(NCBI参照配列:NM_010498.3)を配列最適化した(GeneArt; Life Technologies)。最適化したCDSを、プラスミドpMA−RQ(AmpR)内でクローニングした。上記CDSは、MluIおよびEcoRIの制限部位によって、5’および3’がそれぞれ挟まれていた。
3種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにHEK293細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターAAV9−CAG−hIDS(配列番号4)を産生した(Matsushita et al., Gene Ther. 1998;5(7):938-45, Wright et al., Mol Ther. 2005;12(1)171-8を参照)。10%FBSを添加したDMEMを入れたローラーボトル(RB;Corning, Corning, NY, US)中で、70%コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、1)AAV2のITRにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド(pAAV−CAG−hIDS);2)AAV2 rep遺伝子およびAAV9 cap遺伝子を有しているプラスミド(pREP2CAP9);および、3)アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述の最適化されたプロトコルを用いて、2回の連続した塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した(Ayuso et al., Gene Ther. 2010;17(4):503-10を参照)。ベクターをPBS+0.001%プルロニック(登録商標)F68で透析し、濾過し、qPCRで滴定し、使用まで−80℃にて保存した(図1Bを参照)。
3種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにHEK293細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターAAV9−CAG−ohIDS−version1(配列番号7)を産生した(Matsushita et al.およびWright et al.の上記箇所を参照)。10%FBSを添加したDMEMを入れたローラーボトル(RB;Corning, Corning, NY, US)中で、70%コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、1)AAV2のITRにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド(pAAV−CAG−ohIDS−version1);2)AAV2 rep遺伝子およびAAV9 cap遺伝子を有しているプラスミド(pREP2CAP9);および、3)アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述の最適化されたプロトコルを用いて、2回の連続した塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した(Ayuso et al.の上記箇所を参照)。ベクターをPBS+0.001%プルロニック(登録商標)F68で透析し、濾過し、qPCRで滴定し、使用まで−80℃にて保存した(図2Bを参照)。
3種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにHEK293細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターAAV9−CAG−ohIDS−version2(配列番号10)を産生した(Matsushita et al.およびWright et al.の上記箇所を参照)。10%FBSを添加したDMEMを入れたローラーボトル(RB;Corning, Corning, NY, US)中で、70%コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、1)AAV2のITRにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド(pAAV−CAG−ohIDS−version2);2)AAV2 rep遺伝子およびAAV9 cap遺伝子を有しているプラスミド(pREP2CAP9);および、3)アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述の最適化されたプロトコルを用いて、2回の連続した塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した(Ayuso et al.の上記箇所を参照)。ベクターをPBS+0.001%プルロニック(登録商標)F68で透析し、濾過し、qPCRで滴定し、使用まで−80℃にて保存した(図3Bを参照)。
3種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにHEK293細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターAAV9−CAG−omIDS(配列番号13)を産生した(Matsushita et al.およびWright et al.の上記箇所を参照)。10%FBSを添加したDMEMを入れたローラーボトル(RB;Corning, Corning, NY, US)中で、70%コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、1)AAV2のITRにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド(pAAV−CAG−omIDS);2)AAV2 rep遺伝子およびAAV9 cap遺伝子を有しているプラスミド(pREP2CAP9);および、3)アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述の最適化されたプロトコルを用いて、2回の連続した塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した(Ayuso et al.の上記箇所を参照)。ベクターをPBS+0.001%プルロニック(登録商標)F68で透析し、濾過し、qPCRで滴定し、使用まで−80℃にて保存した(図4Bを参照)。
総投与量30μgのプラスミドpAAV−CAG−hIDS、pAAV−CAG−ohIDS−version1、およびpAAV−CAG−ohIDS−version2(イズロン酸−2−スルファターゼの発現カセットの異なるバージョンを含んでいる)を、流体力学的尾静脈注射を介して、2月齢のWTマウスに対して投与した。この技法は、肝臓に送達されたプラスミドの発現を目的とする(Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66を参照)。
総投与量30μgのプラスミドpAAV−CAG−hIDS、pAAV−CAG−ohIDS−version1、およびpAAV−CAG−ohIDS−version2(イズロン酸−2−スルファターゼの発現カセットの異なるバージョンを含んでいる)を、流体力学的尾静脈注射を介して、3月齢のMPSII罹患マウスに投与した。
MPSIIマウス(3.5月齢)に、野生型ヒトイズロン酸−2−スルファターゼ配列または最適化ヒトイズロン酸−2−スルファターゼ配列を含むAAV9ベクターを1×1010vg、尾静脈を通して静脈内注射した。月齢が同じWTマウスおよび未処置のMPSIIマウスそれぞれの一群をコントロールとした。処置から3週間後、動物を殺処分し、血液サンプルおよび肝臓サンプルを回収して分析した。
2月齢のMPSIIマウスに、野生型ヒトイズロン酸−2−スルファターゼ配列または最適化ヒトイズロン酸−2−スルファターゼ配列のいずれかを含む、5×1010vgのAAV9ベクターを、総量で5μl、大槽内注射した。月齢が同じ、WTマウス、未処置のMPSIIマウス、および5×1010vgの非コードベクター(AAV9−CAG−Null)を注射されたMPSIIマウスそれぞれの群をコントロールとした。3.5月齢で、すなわち処置から1.5ヶ月後に、動物を殺処分しサンプルを回収して分析した。
総投与量が5×1010ベクターゲノムのAAV9−CAG−omIDSベクターを、2月齢のMPSII動物の大槽内に、総量5μl注射した。最初に、マウスは6月齢で、すなわちベクター投与から4ヶ月後に、分析された。AAV9−CAG−omIDSのCSF内送達により、分析した脳のすべての領域でイズロン酸−2−スルファターゼ活性が回復し、健康な動物のさまざまな領域において観察されるレベルの平均40%のレベルに達した(図10Aを参照)。ベクター送達から4ヶ月後、処置されたMPSIIマウスの脳内において、本疾患に特徴的な基質蓄積は完全に元に戻った。これは、分析された脳のすべての領域でのGAG含有量の正常化によって示される(図10Bを参照)。同様に、リソソーム区画のサイズも完全に正常化した。これは、リソソームマーカーLAMP2の免疫検知用の信号強度の定量によって示される。LAMP2信号は、リソソーム区画のサイズと比例しており、LAMP2信号は、未分解のヘパランおよびデルマタン硫酸の蓄積量に依存する(図11Aを参照)。さらに、リソソーム膨張に対する処置の効果は、AAV9−CAG−omIDS送達から8ヶ月後も安定したままであった。これは、上記治療が長期に渡って効果があることを示す(図12を参照)。
4つの異なる投与量(1.58×109、5×109、1.58×1010、および5×1010vg/匹)のAAV9−CAG−omIDSベクターを、2月齢のMPSIIマウスに、大槽内注射によって、総量5μl投与した。
Claims (14)
- 配列番号1に記載されたイズロン酸−2−スルファターゼ(IDS)タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、配列番号5および配列番号8から選択される、単離された核酸分子。
- 請求項1に記載の核酸分子を含む、プラスミド。
- 配列番号6に記載されたpAAV−CAG−ohIDS−version1(アクセッション番号:DSM29867)である、請求項2に記載のプラスミド。
- 配列番号9に記載されたpAAV−CAG−ohIDS−version2(アクセッション番号:DSM29868)である、請求項2に記載のプラスミド。
- 請求項1に記載の核酸分子を含み、血清型9、AAV9のアデノ随伴ウイルスベクターである、組み換えベクター。
- 配列番号14のCAGプロモーターに連結している核酸分子(配列番号5)を含むAAV9−CAG−ohIDS−version1である、請求項5に記載の組み換えベクター。
- 配列番号14のCAGプロモーターに連結している核酸分子(配列番号8)を含むAAV9−CAG−ohIDS−version2である、請求項5に記載の組み換えベクター。
- 請求項1に記載の核酸分子、または請求項2から4のいずれかに記載のプラスミド、または請求項5から7のいずれかに記載の組み換えベクターを、治療上効果的な量含む、薬学的組成物。
- 静脈内投与用または大槽内投与用である、請求項8に記載の薬学的組成物。
- ムコ多糖症II型の治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項1に記載の核酸分子、請求項2から4のいずれかに記載のプラスミド、または請求項5から7のいずれかに記載の組み換えベクターの使用。
- イズロン酸−2−スルファターゼ活性の上昇に用いられる薬剤の製造のための、請求項1に記載の核酸分子、請求項2から4のいずれかに記載のプラスミド、または請求項5から7のいずれかに記載の組み換えベクターの使用。
- 請求項5から7のいずれかに記載のベクターを製造する方法であって、
i)第1のベクターと、第2のベクターと、第3のベクターとを提供する工程であって、上記第1のベクターは、第1のAAV末端反復と第2のAAV末端反復との間に挟まれた、イズロン酸−2−スルファターゼをコードする配列に作動可能に連結されているCAGプロモーターを含み、上記第2のベクターは、血清型9に由来するAAV rep遺伝子とAAV cap遺伝子とを含み、上記第3のベクターは、アデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む、工程と、
ii)工程i)のベクターでコンピテント細胞を同時トランスフェクトする工程と、
iii)工程ii)のトランスフェクトされた細胞を培養する工程と、
iv)工程iii)の培養液から表現ベクターを精製する工程と、を含む、方法。 - 請求項2から4のいずれかに記載のプラスミドを調製する方法であって、
i)イズロン酸−2−スルファターゼタンパク質をコードする配列を、出発プラスミドから、消化によって、特にMluI/EcoRIを用いて、切り取る工程と、
ii)イズロン酸−2−スルファターゼタンパク質をコードする配列を、AAV骨格プラスミドpAAV‐CAGの2つの制限部位の間にクローニングし、それによって、イズロン酸−2−スルファターゼタンパク質をコードする配列を含む対応するプラスミドを得る工程と、を含む、方法。 - 請求項1に記載の核酸分子を含む、単離された細胞。
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